Presentazione tesi magistrale
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Valutazione del potenziale alterante di ceppi di Pseudomonas fluorescens
Relatore:Dott.ssa Barbara CardazzoCorrelatore: Dott.ssa Nadia Andrea Andreani Laureando:
Andrea Di GiuseppeMatricola n. 1062678
Il genere Pseudomonas
Phylum: Proteobacteria
Classe: γ-Proteobacteria
Ordine: Pseudomonadales
Famiglia: Pseudomonadaceae
Gram negativoDimensioni (0.5-1.0×1.5-5.0 μm)Uno o più flagelli polariAerobioAsporigenoMesofilo e psicrotolleranteCatalasi e Ossidasi positivoUbiquitario
Specie patogene per l’uomo:Ex. Pseudomonas aeruginosaSpecie fitopatogene:Ex. Pseudomonas syringaeSpecie alteranti per gli alimenti:Ex. Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas spp.
1) Produzione di enzimi:
proteasi, lipasi, lecitinasi
2) Produzione di pigmenti:
Piorubina
Piomelanina
Pioverdina
Piocianina
Scopo della tesi
• Caratterizzazione fenotipica e genotipica mediante MLST di ceppi Pseudomonas fluorescens.
Su sette nuovi ceppi isolati da matrici alimentari
• Saggio TNBS e dell’azocaseina per la valutazione del potenziale proteolitico rispettivamente in latte e ricotta di P. fluorescens.
• Analisi del trascritto del gene aprX .
Su ceppi Type Strains
Screening sulla presenza/assenza del gene aprX su ceppi di campo
Campionamento dei ceppi• 18 Type Strains
(ceppoteca tedesca DSMZ, ceppoteca spagnola CECT)
• 86 ceppi di campo isolati da matrici alimentari
Caratterizzazione fenotipica
Pseudomonas Agar Base – CFC Supplement
Potato Dextrose Agar
CeppoCrescita in CFC PAB
Produzione pigmento in
PDA
SAL1 + +
BU3 + +
PCA3 + +
EL1 + +
ML1 + +
811/2 + +
811/1 + -
Caratterizzazione genotipicaPrimers Genes
glnS glutamyl-tRNA synthetase
gyrB DNA gyrase subunit B
ileS isoleucyl-tRNA synthetase
nuoD NADH dehydrogenase I chain D
recA recombinase A
rpoD RNA polymerase σ-subunit
rpoB RNA polymerase β-subunit
•Identificazione dei Sequence Type (ST) tramite il software DataMonkey
•Costruzione di un albero filogenetico di tipo Maximum Likelihood (PhyML)
Proteasi AprX
P. fluorescens
Trattamento termicoAlterazione del prodotto
1. Valutazione della capacità proteolitica mediante il saggio 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)
2. Studio del trascritto del gene aprX
3. Valutazione della capacità proteolitica mediante il test dell’azocaseina
1. Valutazione del potenziale proteolitico (saggio TNBS)
Sospensione batterica 108 UFC/ml
100μl
10 ml latte UHT 10 ml latte UHT 103 UCF/ml10 ml latte UHT
100μl
24 h a 22°C 24 h a 22°C 5 giorni a 5°C
diluizioni seriali
Trattamento termico
2 settimane a 37°C
Lettura spettrofotometrica alla ʎ di 420 nm
DSM1
DSM2
DSM3
DSM4
DSM5
DSM6
DSM7
DSM8
DSM9
DSM10
DSM11
DSM12
DSM13
CECT1
CECT2
CECT3
CECT4
CECT5
-0.15
-0.1
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
-0.18-0.16-0.14-0.12
-0.1-0.08-0.06-0.04-0.02
00.02
1) 24 ore a 22 °C
2) 5 giorni a 5 °C
3) 15 giorni a 37 °C
Ceppi analizzati
Specie batterica
DSM1 Pseudomonas gessardii
DSM2 Pseudomonas brenneri
DSM3 Pseudomonas mandelii
DSM4 Pseudomonas jessenii
DSM5 Pseudomonas koreensis
DSM6 Pseudomonas orientalis
DSM7 Pseudomonas synxantha
DSM8 Pseudomonas azotoformans
DSM9 Pseudomonas ludensis
DSM10 Pseudomonas rhodesiae
DSM11 Pseudomonas veronii
DSM12 Pseudomonas libanensis
DSM13 Pseudomonas lemonnieri
CECT1 Pseudomonas corrugata
CECT2 Pseudomonas marginalis
CECT3 Pseudomonas fluorescens
CECT4 Pseudomonas fragi
CECT5 Pseudomonas chlororaphis
DSM1
DSM2
DSM3
DSM4
DSM5
DSM6
DSM7
DSM8
DSM9
DSM10
DSM11
DSM12
DSM13
CECT1
CECT2
CECT3
CECT4
CECT5
-0.3
-0.2
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
2. Analisi del trascritto del gene aprX
Ceppi analizzati
Specie battericaEspressione aprX a 22 °C
Espressione aprX a 5 °C
DSM6 Pseudomonas orientalis + +DSM9 Pseudomonas ludensis - -DSM10 Pseudomonas rhodesiae + -DSM12 Pseudomonas libanensis + -CECT2 Pseudomonas marginalis - -CECT3 Pseudomonas fluorescens + -CECT4 Pseudomonas fragi + -
mRNA aprX cDNA PCR-end point
TNBS a 22 °C
TNBS a 5 °C
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
TNBS a 37 °C
+
+
+
-
-
+
-
Ceppi analizzati Specie batterica Estrazione RNA
a 22 °C
Estrazione RNA a 5 °C TNBS a
22 °CTNBS a 5 °C
TNBS a 37 °C
Azocaseina
DSM6 Pseudomonas orientalis + + - - + +DSM9 Pseudomonas ludensis - - - - + +DSM10 Pseudomonas rhodesiae + - - - + +DSM12 Pseudomonas libanensis + - - - - +CECT2 Pseudomonas marginalis - - - - - -CECT3 Pseudomonas fluorescens + - - - + +CECT4 Pseudomonas fragi + - - - - +
3. Test dell’azocaseina
cect2 cect3 cect4 dsm6 dsm9 dsm10 dsm12 bianco0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0.8000
0.9000
1.0000
1 ml di sospensione batterica 108 UFC/ml
5 °C per una settimana
125 µl di azocaseina
37 °C overnight
Lettura spettrofotometrica alla ʎ di 450 nm
Screening sulla presenza/assenza del gene aprX
92.64%
7.36%positivo negativo
•PCR-end point sul gene aprX su 68 ceppi di campo
Molte specie nonostante posseggano il gene aprx non hanno attività proteolitica
Conclusioni• Dei sette ceppi analizzati sei sono produttori di
blu riscontrabile sia da analisi fenotipiche che genotipiche.
• La tecnica MLST è un buon metodo per clusterizzare i ceppi produttori di blu.
• L’attività dall’AprX è specie specifica e temperatura specifica.
• Pseudomonas ludensis è in grado di produrre probabilmente proteasi alternative all’AprX.