Presentazione tesi magistrale

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Valutazione del potenziale alterante di ceppi di Pseudomonas fluorescens Relatore: Dott.ssa Barbara Cardazzo Correlatore: Dott.ssa Nadia Andrea Andreani Laureando: Andrea Di Giuseppe Matricola n. 1062678

Transcript of Presentazione tesi magistrale

Valutazione del potenziale alterante di ceppi di Pseudomonas fluorescens

 Relatore:Dott.ssa Barbara CardazzoCorrelatore: Dott.ssa Nadia Andrea Andreani Laureando:

Andrea Di GiuseppeMatricola n. 1062678

Il genere Pseudomonas

Phylum: Proteobacteria

Classe: γ-Proteobacteria

Ordine: Pseudomonadales

Famiglia: Pseudomonadaceae

Gram negativoDimensioni (0.5-1.0×1.5-5.0 μm)Uno o più flagelli polariAerobioAsporigenoMesofilo e psicrotolleranteCatalasi e Ossidasi positivoUbiquitario

Specie patogene per l’uomo:Ex. Pseudomonas aeruginosaSpecie fitopatogene:Ex. Pseudomonas syringaeSpecie alteranti per gli alimenti:Ex. Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas spp.

1) Produzione di enzimi:

proteasi, lipasi, lecitinasi

2) Produzione di pigmenti:

Piorubina

Piomelanina

Pioverdina

Piocianina

Scopo della tesi

• Caratterizzazione fenotipica e genotipica mediante MLST di ceppi Pseudomonas fluorescens.

Su sette nuovi ceppi isolati da matrici alimentari

• Saggio TNBS e dell’azocaseina per la valutazione del potenziale proteolitico rispettivamente in latte e ricotta di P. fluorescens.

• Analisi del trascritto del gene aprX .

Su ceppi Type Strains

Screening sulla presenza/assenza del gene aprX su ceppi di campo

Campionamento dei ceppi• 18 Type Strains

(ceppoteca tedesca DSMZ, ceppoteca spagnola CECT)

• 86 ceppi di campo isolati da matrici alimentari

Caratterizzazione fenotipica

Pseudomonas Agar Base – CFC Supplement

Potato Dextrose Agar

CeppoCrescita in CFC PAB

Produzione pigmento in

PDA

SAL1 + +

BU3 + +

PCA3 + +

EL1 + +

ML1 + +

811/2 + +

811/1 + -

Caratterizzazione genotipicaPrimers Genes

glnS glutamyl-tRNA synthetase

gyrB DNA gyrase subunit B

ileS isoleucyl-tRNA synthetase

nuoD NADH dehydrogenase I chain D

recA recombinase A

rpoD RNA polymerase σ-subunit

rpoB RNA polymerase β-subunit

•Identificazione dei Sequence Type (ST) tramite il software DataMonkey

•Costruzione di un albero filogenetico di tipo Maximum Likelihood (PhyML)

Proteasi AprX

P. fluorescens

Trattamento termicoAlterazione del prodotto

1. Valutazione della capacità proteolitica mediante il saggio 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)

2. Studio del trascritto del gene aprX

3. Valutazione della capacità proteolitica mediante il test dell’azocaseina

1. Valutazione del potenziale proteolitico (saggio TNBS)

Sospensione batterica 108 UFC/ml

100μl

10 ml latte UHT 10 ml latte UHT 103 UCF/ml10 ml latte UHT

100μl

24 h a 22°C 24 h a 22°C 5 giorni a 5°C

diluizioni seriali

Trattamento termico

2 settimane a 37°C

Lettura spettrofotometrica alla ʎ di 420 nm

DSM1

DSM2

DSM3

DSM4

DSM5

DSM6

DSM7

DSM8

DSM9

DSM10

DSM11

DSM12

DSM13

CECT1

CECT2

CECT3

CECT4

CECT5

-0.15

-0.1

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

-0.18-0.16-0.14-0.12

-0.1-0.08-0.06-0.04-0.02

00.02

1) 24 ore a 22 °C

2) 5 giorni a 5 °C

3) 15 giorni a 37 °C

Ceppi analizzati

Specie batterica

DSM1 Pseudomonas gessardii

DSM2 Pseudomonas brenneri

DSM3 Pseudomonas mandelii

DSM4 Pseudomonas jessenii

DSM5 Pseudomonas koreensis

DSM6 Pseudomonas orientalis

DSM7 Pseudomonas synxantha

DSM8 Pseudomonas azotoformans

DSM9 Pseudomonas ludensis

DSM10 Pseudomonas rhodesiae

DSM11 Pseudomonas veronii

DSM12 Pseudomonas libanensis

DSM13 Pseudomonas lemonnieri

CECT1 Pseudomonas corrugata

CECT2 Pseudomonas marginalis

CECT3 Pseudomonas fluorescens

CECT4 Pseudomonas fragi

CECT5 Pseudomonas chlororaphis

DSM1

DSM2

DSM3

DSM4

DSM5

DSM6

DSM7

DSM8

DSM9

DSM10

DSM11

DSM12

DSM13

CECT1

CECT2

CECT3

CECT4

CECT5

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

2. Analisi del trascritto del gene aprX

Ceppi analizzati

Specie battericaEspressione aprX a 22 °C

Espressione aprX a 5 °C

DSM6 Pseudomonas orientalis + +DSM9 Pseudomonas ludensis - -DSM10 Pseudomonas rhodesiae + -DSM12 Pseudomonas libanensis + -CECT2 Pseudomonas marginalis - -CECT3 Pseudomonas fluorescens + -CECT4 Pseudomonas fragi + -

mRNA aprX cDNA PCR-end point

TNBS a 22 °C

TNBS a 5 °C

- -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

TNBS a 37 °C

+

+

+

-

-

+

-

Ceppi analizzati Specie batterica Estrazione RNA

a 22 °C

Estrazione RNA a 5 °C TNBS a

22 °CTNBS a 5 °C

TNBS a 37 °C

Azocaseina

DSM6 Pseudomonas orientalis + + - - + +DSM9 Pseudomonas ludensis - - - - + +DSM10 Pseudomonas rhodesiae + - - - + +DSM12 Pseudomonas libanensis + - - - - +CECT2 Pseudomonas marginalis - - - - - -CECT3 Pseudomonas fluorescens + - - - + +CECT4 Pseudomonas fragi + - - - - +

3. Test dell’azocaseina

cect2 cect3 cect4 dsm6 dsm9 dsm10 dsm12 bianco0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.7000

0.8000

0.9000

1.0000

1 ml di sospensione batterica 108 UFC/ml

5 °C per una settimana

125 µl di azocaseina

37 °C overnight

Lettura spettrofotometrica alla ʎ di 450 nm

Screening sulla presenza/assenza del gene aprX

92.64%

7.36%positivo negativo

•PCR-end point sul gene aprX su 68 ceppi di campo

Molte specie nonostante posseggano il gene aprx non hanno attività proteolitica

Conclusioni• Dei sette ceppi analizzati sei sono produttori di

blu riscontrabile sia da analisi fenotipiche che genotipiche.

• La tecnica MLST è un buon metodo per clusterizzare i ceppi produttori di blu.

• L’attività dall’AprX è specie specifica e temperatura specifica.

• Pseudomonas ludensis è in grado di produrre probabilmente proteasi alternative all’AprX.

Grazie per l’attenzione