pewarnaan lengkap

Pewarnaan Bakteri Praktikum Mikrobiologi

XI-4/α

Kementrian Perindustrian Republik Indonesia

Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri

Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor

2011

XI-4/α

Arrovi Septian


XI-4/α

PEWARNAAN BAKTERI

Pewarnaan bakteri adalah proses mewarnai sel bakteri dengan suatu zat warna untuk memperjelas

morfologi sel bakteri.

Tujuan Pewarnaan Bakteri :

Melihat struktur, bentuk dan ukuran sel mikroorganisme

Memperjelas bentuk dan ukuran sel mikroorganisme

Mempermudah melihat bentuk dan ukuran sel mikroorganisme

Melihat sifat fisik dan kimia m.o berdasarkan reaksinya terhadap zat warna

Teknik Pewarnaan :

Pewarnaan Sederhana : Pewarnaan sel bakteri dengan menggunakan 1 zat warna saja.

Contoh :

1. Pewarnaan positif (badan sel yang diwarnai)

2. Pewarnaan negatif (lapang pandang yang diwarnai)

Pewarnaan Bertingkat/Differensial : Pewarnaan sel bakteri dengan menggunakan >1 zat warna.

Contoh :

1. Pewarnaan Gram

2. Pewarnaan Spora

3. Pewarnaan BTA/BTTA

Zat Pewarna

Zat pewarna adalah zat yang digunakan untuk mewarnai sel bakteri agar dapat lebih mudah

diamati di bawah mikroskop. Macam-macam zat warna : Kristal violet, karbol fuchsin, metilena biru,

malasit hijau, safranin, nigrosin (tinta cina), metil lembayung, dll. Zat warna yang memiliki daya

afinitas (daya gabung) paling kuat yaitu : Kristal violet, metilena biru, dan karbol fuchsin.

Zat Warna menurut Erchlich :

Zat Warna Basa : karbol fuchsin, safranin, metilena biru, metil lembayung, malasit hijau, Kristal

violet.

Zat Warna Asam : fuchsin asam, eosin, merah congo, nigrosin.

Zat Warna Netral : campuran eosin dan metilena biru.

Zat Warna Indifferent : Sudan III (merah).


XI-4/α

Pewarnaan Positif Sederhana

Dasar: Pewarnaan positif sederhana menggunakan salah satu zat warna untuk mewarnai sel,

sedangkan lapang pandangnya transparan. Perlakuan ini menggunakan mikroskop dengan

pembesaran 1000x.

Bagan Kerja:

Fungsi Tahapan:

1. Kaca alas dibersihkan dengan kapas beralkohol untuk menghilankan kotoran dan lemak.

2. Dikeringkan di atas pembakar spiritus agar kaca alas cepat kering.

3. Dibagi 3 bagian dengan pencil glass untuk mempermudah pengamatan.

4. Diberi suspensi bakteri 24 jam sebagai bakteri yang akan diamati.

5. Difiksasi untuk mematikan bakteri dan melekatkan bakteri pada kaca alas.

6. Diwarnai dengan kristal violet untuk memberikan warna pada bakteri.

7. Dibilas dengan air suling untuk membilas kelebihan kristal violet

8. Dikeringkan dengan kertas saring untuk mengeringkan kaca alas agar tidak menganggu

pengamatan.

9. Ditetesi minyak imersi untuk mempermudah pengamatan.

LF suspensindikeringka

difiksasi

lberalkolho kapas

dengann dibersihka

glass pencildengan

bagian 3 dibagi

menit 1diamkan

tetes2-1Violet

Kristaldengan diwarnai sulingair

dengan bilas

saring kertas di

ndikeringka imersiminyak ditetesi 1000x pembesaran

mikroskopdengan

pengamatan


XI-4/α

Pewarnaan Gram Metode Preston dan Morrel

Dasar: Pewarnaan ini dilakukan untuk menentukan sifat bakteri, apakah termasuk segolongan

bakteri Gram positif atau Gram negatif. Yang termasuk golongan Gram positif adalah segolongan

bakteri yang menahan persenyawaan iodine compleks yang terbentuk dari KI dan I2 dan zat Kristal

violet sewaktu dicuci (zat pengawawarna). Sedangkan Gram negatif adalah segolongan bakteri yang

melepaskan persenyawaan iodine compleks dan mengikat zat warna berikutnya yaitu karbol fuchsin

encer.

Alat dan Bahan:

1. Mikroskop

2. Kapas steril

3. Pipet

4. Kaca alas datar

5. Pembakar spirtus

6. Tabung reaksi

7. Ose

8. Kertas Saring

9. Pensil gelas

10. Piala gelas

1. Alkohol 70%

2. Larutan fisiologis (LF)

3. Suspensi bakteri 24 jam

4. Minyak imersi

5. Zat warna kristal violet

6. Zat warna karbol fuchsin

7. Air suling

8. Decolorizer (aseton : alkohol = 1:3)

9. Larutan lugol


XI-4/α

Bagan Kerja:

Fungsi Tahapan:






6. Diwarnai dengan kristal violet untuk memberikan warna pada bakteri terutam Gram +

7. Ditetesi lugol untuk menghasilkan KI dan I2 yang mengintensifkan zat warna.

8. Dicelupkan pada decolorizer sebagai pemucat dan pembilas pada bakteri Gram –

9. Ditetesi karbol fuchsin untuk mewarnai Gram –

10. Dibilas dengan air suling untuk membilas kelebihan karbol fuksin


pengamatan.



difiksasi

lberalkolho kapas

dengann dibersihka

glass pencildengan

bagian 3 dibagi

menit2

1diamkan

menit2

1diamkan

tetes2-1 lugol +

dibuangViolet Kristalkelebihan

3):1 alkolhol(aseton

rdecolorize pada3x celupkan

sulingair dengan bilas

sulingair

dengan bilas

tetes2-1Violet

Kristaldengan diwarnai

menit2

1diamkan

tetes2-1fuksin

karboldengan diwarnai

sulingair

dengan bilas

saring kertas di


mikroskopdengan

pengamatan


XI-4/α

Perbedaan bakteri Gram positif dengan Gram negative :

Peptidoglikan (lapisan pada dinding sel bakteri yang menahan zat warna)

Lapisan peptidoglikan bakteri (+) >tebal bakteri (-)

Lapisan lemak bakteri (-) >tebal bakteri (+), sedangkan decolorizer mengandung

alcohol sehingga lapisan lemak larut dalam alcohol dan zat warna pada bakteri Gram

negative mudah dilepas.

Perbedaan kecepatan lepasnya zat warna

Gram positif menunjukkan sifat seperti gram negative apabila :

o Faktor umur biakan yang terlalu tua, sehingga kemampuan mengikat zat

warna pada dinding sel (permeabilitas) menjadi lemah.

o Decolorizing yang terlalu lama

o Ulasan suspense bakteri yang terlalu tebal


XI-4/α

Pewarnaan Kapsul Metode Anthony

Dasar: Pada umumnya sel bakteri mengandung air 80-85%, protein, karbohidrat, lemak, dan enzim.

Sel bakteri terdiri dari sel endoplasma/cytoplasma/protoplasma. Cytoplasma ini dikelilingi

membrane cytoplasma dimana didalamnya terdapat granule-granule inti sel. Granul-granul ini

merupakan persediaan makanan. Kapsul seluruh sel dibungkus oleh suatu substansi semacam

slym/gelatin. Kapsul ini befungsi untuk melindungi bakteri terhadap serangan luar.

Alat dan Bahan:

1. Mikroskop

2. Kapas steril

3. Pipet

4. Kaca alas datar

5. Pembakar spirtus

6. Tabung reaksi

7. Ose

8. Kertas Saring

9. Pensil gelas

10. Piala gelas

1. Alkohol 70%



4. Minyak imersi

5. Zat warna kristal violet

6. Air suling

7. Larutan terusi 20%

Bagan Kerja:


XI-4/α

Fungsi Tahapan:




4. Diberi suspensi bakteri sebagai bakteri yang akan diamati.

5. Tidak difiksasi agar kapsul bakteri tidak rusak.

6. Diberi kristal violet untuk mewarnai sel bakteri.

7. Dibilas larutan terusi 20% untuk peluntur warna + mencuci kelebihannya.


pengamatan.



lberalkolho kapas

dengann dibersihka

glass pencildengan

bagian 3 dibagi

menit2

1diamkan

20% terusi

larutandengan bilas

tetes2-1Violet

Kristaldengan diwarnai

saring kertas di


mikroskopdengan

pengamatan


XI-4/α

Pewarnaan Spora Metode Schaeffer-Fulton

Dasar: Spora adalah mekanisme pertahanan dari bakteri dimana keadaan lingkungannya ekstrim.

Spora dilapisi oleh lilin sehingga ketika dipanaskan lilin akan meleleh dan zat warna akan masuk,

ketika didinginkan lilin kembali mengeras dan membeku. Zat warna akan terperangkap dalam

lapisan tersebut sedangkan bentuk sel vegetatifnya diwarnai oleh zat warna kedua.

Alat dan Bahan:

1. Mikroskop

2. Kapas steril

3. Pipet

4. Kaca alas datar

5. Pembakar spirtus

6. Tabung reaksi

7. Ose

8. Kertas Saring

9. Pensil gelas

1. Alkohol 70%



4. Minyak imersi

5. Zat warna malasit hijau

6. Zat warna safranin

7. Air suling


XI-4/α

Bagan Kerja:

Fungsi Tahapan:






6. Ditetesi zat warna malasit hijau dan dipanaskan untuk membuk dinding spora agar zat warna

dapat masuk ke dalam bakteri dan mewarnai spora.

7. Dibilas dengan air suling untuk menghilangkan atau membilas kelebihan zat warna.

8. Ditetesi safranin untuk mewarnai sel vegetatif yang belum terwarnai.


pengamatan.



difiksasi

lberalkolho kapas

dengann dibersihka

glass pencildengan

bagian 3 dibagi

berlebihhijau

Malasitdengan diwarnai

menit 2diamkan

tetes2-1safranin

dengan diwarnai

sulingair

dengan bilas

1000x pembesaran

mikroskopdengan

pengamatan

permukaan di uap

timbulnyadari

menit 2 dipanaskan

sulingair

dengan bilas

saring kertas di

ndikeringkaimersiminyak ditetesi


XI-4/α

Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) dan Bakteri Tidak Tahan Asam (BTTA)

Metode Ziehl Neelsen

Dasar: Beberapa bakteri seperti Mycrobacterium tuberculosis, M. paratuberculose, tidak dapat

diwarnai dengan cara sederhana. Ini disebabkan lapisan paling luar (dinding sel) dari bakteri terdiri

dari lapisan lilin yang tebal dan sulit ditembus zat warna. Tetapi, dengan larutan fuchsin pekat yang

mengandung phenol, disertai dengan pemanasan, lapisan akan terbentuk kembali dan tidak akan

terpengaruh bahan pencuci warna sekalipun itu adalah asam encer. Bakteri tersebut adalah bakteri

tahan asam sedangkan bakteri yang apabila terkena asam encer saja akan melepaskan kembali zat

warna sebelumnya disebut bakteri tidak tahan asam.

Alat dan Bahan:

1. Mikroskop

2. Kapas steril

3. Pipet

4. Kaca alas datar

5. Pembakar spirtus

6. Tabung reaksi

7. Ose

8. Kertas Saring

9. Pensil gelas

10. Piala gelas

1. Alkohol 70%



4. Minyak imersi

5. Zat warna metylene blue

6. Zat warna karbol fuchsin

7. Air suling

8. Asam alkohol (3 ml HCl 36% dan 97

ml alkohol 96%)


XI-4/α

Bagan Kerja:

Fungsi Tahapan:





5. Diberi karbol fuksin sambil dipanaskan untuk melelehkan lapisan lilin yang tebal dan sulit

ditembus zat warna.

6. Dicuci dengan asam alcohol agar bakteri yang tidak tahan asam dapat melepaskan zat warna

karbol fuksin.

7. Ditetesi metilena blue untuk mewarnai bakteri tidak tahan asam.

8. Dibilas air suling untuk membilas kelebihan zat warna metilena blue.


pengamatan.



difiksasi

lberalkolho kapas

dengann dibersihka

glass pencildengan

bagian 3 dibagi

Fuchsin Karbol

dengan diwarnai

menit 2diamkan

blue metilena

dengan diwarnai

sulingair

dengan bilas

1000x pembesaran

mikroskopdengan

pengamatan

menit 7-5

dipanaskan

sulingair

dengan bilas

saring kertas di

ndikeringka


XI-4/α

Gram Kapsul Spora BTA/BTTA

Metode Preston dan Morrel Anthony Schaeffer-Fulton Ziehl Neelsen Sumber Bahan Suspensi bakteri 24 jam Suspensi bakteri 48 jam Suspensi bakteri 48 jam Suspensi bakteri 24 jam Umur Bakteri 24 jam 48 (hasil inokulasi 24 jam +

litmus milk 24 jam) 48 jam 24 jam

Zat Warna Kristal Violet Karbol Fuchsin

Kristal Violet Malasit Hijau Safranin

Karbol Fuchsin Metilena Blue

Tujuan 1. Mengetahui bentuk sel bakteri Gram positif dan Gram negatif

2. Menentukan sifat bakteri Gram positif atau Gram negatif

1. Mengetahui kapsul yang mengelilingi sel bakteri.

2. Melakukan teknik pewarnaan kapsul dengan benar.

1. Mengetahui macam-macam bentuk spora

2. Membedakan spora dengan sel vegetatifnya

1. Menentukan bateri termasuk ke golongan BTA/BTTA

2. Mampu membedakan antara BTA dengan BTTA

Hasil Pengamatan

Identifikasi Warna Ungu: Gram Positif Merah: Gram Negatif

Ungu: Sel Bakteri Tidak berwarna di sekeliling ungu: Kapsul Bakteri

Hijau: Spora Merah: Sel Vegetatif

Merah: BTA Biru: BTTA

Contoh Bakteri + : Bacillus subtilis, Propionibacterium sp. - : E. coli, Enterobacter

aerogenes

Staphylococcus pyogenik Bacillus antrachis Bacillus cereus

BTA: Mycobacterium tuberculosis, M. Paratuberculose BTTA: Bacillus okhensis

pewarnaan lengkap

Documents

Transcript of pewarnaan lengkap