Pepper mild mottle virus - ikee.lib.auth.gr

1

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ

ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Βιολογικός και μοριακός χαρακτηρισμός του ιού της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς

(Pepper mild mottle virus, PMMoV)

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Μπούτσικα Αναστασία

Πτυχιούχος Γεωπόνος

ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2020

2

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ

ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Βιολογικός και μοριακός χαρακτηρισμός του ιού της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς

(Pepper mild mottle virus, PMMoV)

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Μπούτσικα Αναστασία

Πτυχιούχος Γεωπόνος

ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ

Κατής Ι. Νικόλαος

Καθηγητής

ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ (Απόφαση 3/3/2020)

1. Κατής Ι. Νικόλαος, Καθηγητής, Τμήμα Γεωπονίας Α.Π.Θ. (Επιβλέπων)

2. Μαλιόγκα Βαρβάρα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Γεωπονίας Α.Π.Θ.

(Μέλος)

3. Καραογλανίδης Γεώργιος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Γεωπονίας

Α.Π.Θ. (Μέλος)

ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2020

3

© ΜΠΟΥΤΣΙΚΑ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ, 2020

© ΑΠΘ, 2020

Βιολογικός και μοριακός χαρακτηρισμός του ιού της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της

πιπεριάς (Pepper mild mottle virus, PMMoV)

ISBN

Η έγκριση της παρούσης μεταπτυχιακής διατριβής από το Τμήμα Γεωπονίας δεν

υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών και απόψεων του συγγραφέως (Ν. 5343/1932,

άρθρο 202, παρ. 2)

4

Ευχαριστίες

Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη 2017-2019 στο Εργαστήριο

Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου

Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.) στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος

Σπουδών του τομέα Φυτοπροστασίας.

Ολοκληρώνοντας την προσπάθεια αυτή, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους

συνέβαλαν στην πραγματοποίησή της. Ιδιαίτερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον

επιβλέποντα καθηγητή κ. Νικόλαο Ι. Κατή για την ανάθεση του θέματος, τη

συνεργασία του, τη καθοδήγηση, το ενδιαφέρον, την υποστήριξη και την

κατανόηση καθ’ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Θερμές

ευχαριστίες αρμόζουν στην αναπληρώτρια καθηγήτρια Βαρβάρα Μαλιόγκα, για

τη συνεχή βοήθεια καθ’ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών.

Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω και την εταιρία Agris για την αποστολή

φυτικού υλικού, καθ’ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής μου. Επιπλέον,

θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την διδάκτορα Ορφανίδου Χρυσούλα για την

άνευ όρων βοήθειά της σε οποιαδήποτε δυσκολία προέκυπτε στην πορεία των

μεταπτυχιακών μου σπουδών, καθώς και την πολύτιμη βοήθεια της στην

εκπόνηση της πειραματικής διαδικασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω

όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του

εργαστηρίου για το φιλικό κλίμα που μοιραστήκαμε όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος,

θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια και τους φίλους μου, για την αμέριστη

κατανόηση και ψυχολογική υποστήριξη που έλαβα αυτά τα χρόνια.

5

Περίληψη

Ο ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς (Pepper mild mottle virus,

PMMoV) ανήκει στο γένος Tobamovirus (οικογένεια Virgaviridae), και

προσβάλλει κυρίως την καλλιέργεια της πιπεριάς. Η μετάδοση του ιού γίνεται

μηχανικά καθώς και με το σπόρο. Ο σκοπός της διατριβής ήταν ο βιολογικός

καθώς και ο μοριακός χαρακτηρισμός απομονώσεων του PMMoV από

καλλιέργειες πιπεριάς της χώρας μας. Τα έτη 2012-2019 συλλέχθηκαν 281

δείγματα από 12 νομούς της Ελλάδας, από φυτά πιπεριάς, τα οποία εμφάνιζαν

τυπικά συμπτώματα ιών του γένους Tobamovirus. Τα δείγματα ελέγχθηκαν στη

συνέχεια με RT-PCR για την παρουσία του ιού με εκκινητές που

πολλαπλασιάζουν την καψιδιακή πρωτεΐνη, καθώς και την πρωτεΐνη

διακυτταρικής μετακίνησης. Ο PMMoV ανιχνεύτηκε σε 79 από τα 281 δείγματα

(27,8%), κυρίως σε περιοχές της Κρήτης (97,5%) αλλά και στις περιοχές της

Ημαθίας (1,25%) και της Αττικής (1,25%). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν

μηχανικές μολύνσεις στους φυτοδείκτες N. glutinosa, N. benthamiana, N.

tabacum var. xanthi. N. tabacum var. samsun, N. rustica και Physalis floridana,

καθώς και σε επτά υβρίδια τομάτας (VP1, Bella alma, Linnea, Lenora, Clx,

Cabrera). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ιός μόλυνε όλους τους φυτοδείκτες,

ενώ δεν μόλυνε κανένα φυτό τομάτας. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση

του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης και της πρωτεΐνης διακυτταρικής

μετακίνησης 15 απομονώσεων του ιού από 3 περιοχές της χώρας (Ημαθία,

Κρήτη, Αθήνα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομοιότητα μεταξύ των

ελληνικών απομονώσεων σε επίπεδο νουκλεοτιδίων κυμαίνεται από 95 έως

100%, ενώ η ομοιότητά τους με τις κατατεθειμένες στη βάση δεδομένων NCBI

απομονώσεις κυμαίνεται από 94 έως 100%. Περαιτέρω φυλογενετική ανάλυση

ταξινόμησε τις ελληνικές απομονώσεις όσον αφορά την καψιδιακή και την

πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης σε τρεις κλάδους. Επιπλέον,

πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος τριών

ελληνικών απομονώσεων από δύο περιοχές της Ελλάδας (Κρήτη, Αττική) για

περαιτέρω αναλύσεις της γενετικής παραλλακτικότητας του PMMoV.

6

Abstract

The Pepper mild mottle virus (PMMoV) belongs to the genus Tobamovirus

(Virgaviridae family) and mainly affects pepper cultivars. The virus is

transmitted mechanically and with the seed. The purpose of the study was the

biological as well as the molecular characterization of the PMMoV isolates from

peppers of our country. In the years 2012-2019, 281 pepper samples from 12

localities of Greece were gathered, showing typical symptoms of the genus

Tobamovirus. The samples were then tested by RT-PCR for the presence of the

virus with primers that amplify the capsid and the movement protein. PMMoV

was detected in 79 of 281 samples (27,8%), mainly in regions of Crete (97,1%)

in Imathia (1,25%) and in Attiki (1,25%). Also, mechanical transmissions took

place in the plant indicators N. glutinosa, N. benthamiana, N. tabacum var.

xanthi, N. tabacum var. samsun, N. rustica and Physalis floridana and in seven

tomato hybrids (VP1, Bella alma, Linnea, Lenora, Clx, Cabrera). The results

showed that all the indicator plants were infected, contrary to the tomato

hybrids, that were not infected. Finally, sequencing of the capsid and movement

protein of 15 virus isolates from 3 regions of Greece (Crete, Imathia, Attiki) was

carried out. The results showed that the identity between Greek isolates at

nucleotide level ranges from 95 to 100%, while their homology with the isolates

deposited in the NCBI ranges from 94 to 100%. Further phylogenetic analysis

of the capsid and movement proteins, clustered the Greek isolates in three

different branches. In addition, full sequencing of three isolates from two

localities (Crete, Attiki) was carried out in order to further analyze the genetic

diversity of PMMoV.

7

Συντομογραφίες ιών

AMV Iός του μωσαϊκού της μηδικής, (Αlfalfa mosaic virus, Alfamovirus)

BPeMV Ιός του μωσαϊκού της πιπεριάς (Bell pepper mosaic virus, Tobamovirus)

CMV Ιός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber mosaic virus, Cucumovirus)

ObPV Ιός ομπούντα της πιπεριάς (Obuda pepper virus, Tobamovirus)

PaMMV Ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πάπρικας (Paprika mild mottle

virus, Tobamovirus)

PMMoV Ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς (Pepper mild mottle virus,

Tobamovirus)

PVMV Ιός της νευρωτικής ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς (Pepper veinal mottle

virus, Potyvirus)

PVY Iός Y της πατάτας (Potato Y virus, Potyvirus)

TMGMV Ιός του ήπιου πράσινου μωσαϊκού του καπνού (Tobacco mild green

mosaic virus, Tobamovirus)

TMV Ιός του μωσαϊκού του καπνού (Tobacco mosaic virus, Tobamovirus)

TEV Iός της διάβρωσης του καπνού (Tobacco etch virus, Potyvirus)

ToMV Iός του μωσαϊκού της τομάτας (Tomato mosaic virus, Tobamovirus)

TSWV Iός του κηλιδωτού μαρασμού της τομάτας (Tomato spotted wilt virus,

Tospovirus)

8

Άλλες συντομογραφίες

Aa Άμινοξέα (amino acids)

Bp Ζεύγη Βάσεων (ζβ) (base pair)

Bx Βαθμός μέτρησης σακχάρων (Brix)

cDNA Συμπληρωματικό DNA (complementary DNA)

CP Καψιδιακή πρωτεΐνη (Coat Protein)

DEPC Διαίθυλοπυροανθρακικός εστέρας (Diethylpyrocarbonate)

DMSO Διμέθυλοσουλφοξίδιο (Dimethyl sulfoxide)

DNA Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (Deoxyribonucleic acid)

dNTPs

5΄τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (Deoxynucleotides

triphosphate)

dsRNA Δίκλωνο RNA (double stranded RNA)

EDTA

Αιθύλενο‐διάμινο‐τετραοξικό οξύ (Εthylenediaminetetraacetic

acid)

ELISA Ανοσοενζυμική δοκιμή (Enzyme-linked immunosorbent assay)

ICTV

Διεθνής Επιτροπή της Συστηματικής Ταξινόμησης των Ιών

(International Committee on Taxonomy of Viruses)

Kb Χιλιάδες βάσεων (kilo base)

kDa Χιλιάδες Dalton (kilo Dalton)

MB Μοριακό βάρος

mM Χιλιοστομοριακότητα (Millimolar)

Nm Νανόμετρα (nanometer)

Nt Νουκλεοτίδια (nucleotide)

ORF Ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης, ΑΠΑ (Open Reading Frame)

PCR

Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain

Reaction)

Rcf Σχετική φυγόκεντρος δύναμη (Relative centrifugal force)

RdRp

RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (RNA-dependent-RNA-

polymerase)

RNA Ριβονουκλεικό οξύ (Ribonucleic acid)

Rpm Στροφές ανά λεπτό (Revolutions per minute)

9

RT-PCR Αντίστροφη μεταγραφή‐PCR (Reverse Transcription‐PCR)

ssRNA Μονόκλωνο RNA (single stranded RNA)

TRIS

2‐άμινο‐2‐υδροξυμέθυλο‐1,3‐προπανοδιόλη [2‐Amino‐2‐

(hydroxymethyl)‐1,3‐propanediol]

U Ενεργότητα ενζύμου (Enzyme unit)

aa Αμινοξέα (amino acids)

AlkB Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase -

WHO World Health Organization (Παγκόσμιος οργανισμός υγείας)

ΕΕ Ευρωπαική Ένωση

EPPO

Ευρωπαϊκός και Μεσογειακός Οργανισμός Προστασίας Φυτών

European and Mediterranean Plant Protection Organisation

€ ευρώ (Euro)

FAO

Διεθνής Οργάνισμός Τροφίμων και Γεωργίας

(Food and Agriculture Organization of the United Nations)

Hel Ελικάση (Helicase)

LAMP

Ισοθερμική ενίσχυση μέσου βρόγχου( Loop-mediated

Isothermal Amplification)

MP Πρωτεϊνη μετακίνησης (Movement protein)

Μt Μεθυλτρανσφεράση (methyltransferase)

NGS Αλληλούχηση Νέας Γενιάς (Next generation sequencing )

nm νανόμετρα (Nanometers)

ΕΛΣΤΑΤ Ελληνική Στατιστική Αρχή

mPCR PCR πολλαπλών στόχων

NCBI National Center for Biotechnology Information

10

Ευρετήριο εικόνων

Εικόνα 1.1 Γονιδίωμα ιού του γένους Tobamovirus. Αριστερά: στο 5’ άκρο η

RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση. Μέση: η πρωτεΐνη διακυτταρικής

μετακίνησης. Δεξιά: η καψιδιακή πρωτεΐνη, επίσης απεικονίζονται και τα 4

ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης.

Εικόνα 1.2 Καρποί πιπεριάς, με συμπτώματα παραμόρφωσης, μωσαϊκού,

χλώρωσης και συρρίκνωσης, τυπικά του PMMoV. Πηγή: Εργαστήριο

φυτοπαθολογίας, 2018.

Εικόνα 1.3 Παγκόσμια κατανομή του PMMoV. Πηγή:

http://www.fao.org/statistics/en/.

Εικόνα 2.1 Α. Φωτογραφία ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης προϊόντος

PCR μεγέθους 747 ζευγών βάσεων. Με L σημειώνεται ο δείκτης μοριακού

βάρους ανά 100 ζβ. Τα δείγματα 1, 2, 3, 4 είναι θετικά στον PMMoV και

συμβολίζονται με (+), ενώ το δείγμα 5 είναι αρνητικό και συμβολίζεται με (-).

Β. Φωτογραφία ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης προϊόντος PCR μεγέθους

400 ζευγών βάσεων. Με L σημειώνεται ο δείκτης μοριακού βάρους ανά 100 ζβ.

Τα δείγματα 1, 2 είναι θετικά σε ιούς του γένους Tobamovirus και συμβολίζονται

με (+), ενώ τα δείγματα 3, 4, 5, 6, 7, 8 είναι αρνητικά και συμβολίζονται με (-

).

Εικόνα 3.1 Α. Φυτοδείκτης Physalis floridana. Αριστερά: Μάρτυρας χωρίς

συμπτώματα. Δεξιά: Μολυσμένο φυτό με συμπτώματα παραμορφώσεων και

συστροφής στα κορυφαία φύλλα καθώς και έντονης μεσονέυριας χλώρωσης. Γ.

Φυτοδείκτης N. benthamiana. Αριστερά: Μάρτυρας χωρίς συμπτώματα. Δεξιά:

Μολυσμένο φυτό με συμπτώματα παραμορφώσεων και συστροφής στα

κορυφαία φύλλα. Δ. Φυτοδείκτης N.rustica. Αριστερά και δεξιά: Μολυσμένα

φυτά με σύμπτωμα τοπικών χλωρωτικών κηλίδων. Ε. Φυτοδείκτης N. glytinosa.

Μολυσμένα φύλλα με συμπτώματα τοπικών χλωρωτικών κηλίδων.

Εικόνα 4.1 Φυλογενετικό δένδρο που κατασκευάστηκε με ανάλυση μέγιστης

πιθανοφάνειας χρησιμοποιώντας την ομάδα ομόλογων αλληλουχιών που

αντιστοιχούν στην CP, MP και ολόκληρο το γονιδίωμα του PMMoV. Οι τιμές

αριστερά στον κάθε κλάδο υποδεικνύουν το ποσοστό 1000 επαναλήψεων της

ανάλυσης bootstrap, η οποία υποστηρίζει την ομαδοποίηση σε κάθε ομάδα. Η

11

κλίμακα αντιπροσωπεύει τον αριθμό αντικατάστασης των νουκλεοτιδίων ανά

θέση. Το μήκος των βραχιόνων είναι ανάλογο με τις γενετικές αποστάσεις που

υπολογίστηκαν. Με πράσινο βέλος σημειώνονται οι ελληνικές απομονώσεις που

αλληλουχήθηκαν.

12

Ευρετήριο πινάκων

Πίνακας 1.1 Συμπτώματα ιολογικών ασθενειών της πιπεριάς.

Πίνακας 1.2 Κατηγορίες από γένη ιών που προσβάλλουν την πιπεριά, ανάλογα

με το τρόπο μετάδοσης τους.

Πίνακας 1.3 Ιοί της πιπεριάς που ανήκουν στο γένος Tobamovirus.

Πίνακας 2.1 Περιοχές δειγματοληψίας και αριθμός φυτών που ελέγχθηκαν τα

έτη 2012-2019.

Πίνακας 2.2 Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση

του PMMoV (PMMoV-F, PMMoV-R). Πηγή: Rialch et al., 2015.

Πίνακας 2.3 Αλληλουχίες εκκινητών για την ανίχνευση ιών του γένους

Tobamovirus (PepTob F, PepTob R).

Πίνακας 3.1 Φυτοδείκτες και ποικιλίες/υβρίδια τομάτας που χρησιμοποιήθηκαν

για τεχνητές μολύνσεις για την διερεύνηση του εργαστηριακού εύρους του

PMMoV.

Πίνακας 3.2 Συμπτώματα φυτοδεικτών, ύστερα από μηχανική μόλυνση με τον

PMMoV.

Πίνακας 4.1 Προέλευση, ονομασία ποικιλίας/υβριδίου και κωδικός πρόσβασης

των απομονώσεων που χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη της γενετικής

παραλλακτικότητας του PMMoV.

Πίνακας 4.2 Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τoν

πολλαπλασιασμό του γονιδίου της MP (PMMoV-Fm, PMMoV-Rm). Πηγή:

Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας, 2018.

Πίνακας 4.3 Αλληλουχίες από τα 10 ζεύγη εκκινητών που πολλαπλασιάζουν

ολόκληρο το γονιδίωμα του PMMoV (Πηγή: Εργαστήριο φυτοπαθολογίας,

2018).

Πίνακας 4.4 Χώρες προέλευσης και κωδικοί αλληλουχιών που

χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του φυλογενετικού δένδρου της CP, της

MP και ολόκληρου του γονιδιώματος.

13

Περιεχόμενα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Εισαγωγή.......................................................................16

1.1 Καταγωγή πιπεριάς και καλλιεργούμενα είδη.........................................17

1.2 Ιολογικές ασθένειες της πιπεριάς παγκοσμίως και στην Ελλάδα...............17

1.3 Ιοί του γένους Tobamovirus στην πιπεριά παγκοσμίως και στην Ελλάδα...21

1.4 Ο ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς (Pepper mild mottle virus,

PMMoV) ..................................................................................................22

1.4.1 Ιστορικό..........................................................................................22

1.4.2 Γονιδιακή οργάνωση.........................................................................22

1.4.3 Συμπτωματολογία............................................................................24

1.4.4 Εύρος ξενιστών................................................................................25

1.4.5 Γεωγραφική εξάπλωση .....................................................................25

1.4.6 Τρόπος μετάδοσης...........................................................................26

1.4.7 Γενετική παραλλακτικότητα...............................................................27

1.4.8 Τρόπος ανίχνευσης...........................................................................28

1.4.9 Τρόπος αντιμετώπισης......................................................................30

1.5 Σκοπός της εργασίας...........................................................................32

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2ο Παρουσία του PMMoV σε καλλιέργειες πιπεριάς και

έλεγχος σπορομερίδων ορισμένων ποικιλιών......................................33

2.1 Εισαγωγή...........................................................................................34

2.2 Υλικά και μέθοδοι................................................................................35

2.2.1 Φυτικό υλικό και σπορομερίδες..........................................................35

2.2.2 Εκχύλιση ολικού RNA........................................................................36

2.2.3 RT-PCR για την ανίχνευση του PMMoV...............................................36

2.2.4 RT-PCR για την ανίχνευση ιών του γένους Tobamovirus στο σπόρο......37

2.2.5 Ανάλυση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή

αγαρόζης.................................................................................................38

2.2.6 Σπορομετάδοση...............................................................................39

2.2.7 Αλληλούχηση προϊόντων PCR............................................................39

2.3 Αποτελέσματα....................................................................................40

2.3.1 Παρουσία του PMMoV σε καλλιέργειες πιπεριάς ..................................40

2.3.2 Έλεγχος σπορομερίδων για παρουσία του PMMoV και σπορομετάδοση...42

14

2.4 Συζήτηση...........................................................................................42

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3o Μελέτη του εργαστηριακού εύρους ξενιστών του

PMMoV..................................................................................................44

3.1 Εισαγωγή...........................................................................................45


3.2.1 Φυτικό υλικό....................................................................................46

3.2.2 Διαδικασία μηχανικών μολύνσεων......................................................46

3.2.3 Εκχύλιση ολικού RNA........................................................................46

3.2.4 RT-PCR για ανίχνευση του PMMoV.....................................................47


αγαρόζης.................................................................................................47

3.3 Αποτελέσματα....................................................................................47

3.4 Συζήτηση...........................................................................................58

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4o Μοριακός χαρακτηρισμός απομονώσεων και γενετική

παραλλακτικότητα του PMMoV............................................................51

4.1 Εισαγωγή...........................................................................................52


4.2.1 Απομονώσεις του PMMoV..................................................................53

4.2.2 Εκχύλιση ιικού RNA και προσδιορισμός της αλληλουχίας των γονιδίων CP,

MP..........................................................................................................53

4.2.3 Ανάπτυξη εξιδεικευμένης RT-PCR για τον πολλαπλασιασμό των γονιδίων

CP, MP....................................................................................................53

4.2.4 Προσδιορισμός της πλήρους αλληλουχίας..........................................54

4.2.5 Ανάπτυξη εξιδεικευμένης RT-PCR για τον πολλαπλασιασμό ολόκληρου του

γονιδιώματος...........................................................................................54

4.2.6 Καθαρισμός προϊόντων PCR-Αλληλούχηση κατά Sanger......................55

4.2.7 Ανάλυση των αλληλουχιών και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων.....55

4.3 Αποτελέσματα....................................................................................56

4.3.1 Ενίσχυση του γονιδίου της CP, MP και ολόκληρου του γονιδιώματος....56

4.3.2 Συγκριτική ανάλυση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών........................57

4.3.3 Φυλογενετική ανάλυση.....................................................................58

4.4 Συζήτηση...........................................................................................60

15

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5ο Γενική Συζήτηση/Συμπεράσματα..................................62

Βιβλιογραφία ...........................................................................................65

Παράρτημα..............................................................................................78

16

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Εισαγωγή

17

1.1 Καταγωγή πιπεριάς και καλλιεργούμενα είδη

Η καλλιεργούμενη πιπεριά (Capsicum annuum var. annuum L.) ανήκει

στο γένος Capsicum της οικογένειας Solanaceae. spp. Αναφορά του καρπού ως

τροφή από τους ανθρώπους πραγματοποιείται γύρω στα 7500 π.Χ. (McNeish,

1964) αλλά η καλλιέργειά της ξεκίνησε πιο νωρίς, περίπου το 5000 π.Χ. στο

Περού και το Μεξικό. Το “άγριο” είδος από το οποίο προήλθαν τα

καλλιεργούμενα είδη είναι το Capsicum annuum var. aviculare (Bosland, 1994).

Η πρώτη αναφορά για την καλλιέργεια πιπεριάς στην Ευρώπη έγινε από τον

Peter Martyr, ο οποίος αναφέρει ότι μεταφέρθηκε στην Ευρώπη από τον

Κολόμβο η οποία και έγινε άμεσα αποδεκτή. Πλέον η πιπεριά καλλιεργείται σε

πολλές χώρες ως ετήσιο φυτό (Δημητρακάκη, 1998). Υπάρχουν πολλά είδη και

ποικιλίες στο γένος Capsicum, το οποίο συντελεί στη μεγάλη διαφοροποίηση

που υπάρχει στο σχήμα, μέγεθος, χρώμα αλλά και στο βαθμό καυστικότητας

στους καρπούς (Ντόγρας, 1998). Το είδος με τη μεγαλύτερη οικονομική

σημασία είναι το Capsicum annuum L. στο οποίο ανήκουν οι περισσότερες

καλλιεργούμενες ποικιλίες. Σε μικρότερη κλίμακα καλλιεργούνται τα είδη

Capsicum frutescens L., Capsicum chinense L., Capsicum pubescens L. και

Capsicum baccatum L. (IBPGR, 1983, Ολύμπιος, 2001).

1.2 Ιολογικές ασθένειες της πιπεριάς παγκοσμίως και στην Ελλάδα

Πολλοί είναι οι ιοί, που προκαλούν δυσμενείς επιπτώσεις στην

καλλιέργεια της πιπεριάς παγκοσμίως. Οι ιοί μπορούν να χωριστούν σε δύο

κατηγορίες ανάλογα με τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων τους (Πίνακας 1.1).

Η πρώτη κατηγορία αποτελείται από τους πιο σημαντικούς ιούς, ενώ η δεύτερη

από τους λιγότερο (Zitter T.A. et al., 1984). Στην πρώτη κατηγορία βρίσκεται ο

ιός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber mosaic virus, CMV) ο οποίος, ανήκει

στο γένος Cucumovirus της οικογένειας Bromoviridae και μεταδίδεται με αφίδες

και με το σπόρο. Ο ιός κατανέμεται σε όλο το κόσμο, στην Αφρική (Αλγερία,

Ζιμπάμπουε κ.ά.), στην Ασία (Κίνα, Ινδία κ.ά.), στην Ευρώπη (Κύπρος. Bέλγιο

κ.ά.), στην Ωκεανία (Αυστραλία, Νέα Ζηλανδία κ.ά), στη Βόρεια και Νότια

Αμερική (Καναδάς, Αργεντινή), (CABI and EPPO, 2002) και στην Ανταρκτική

(Polischuk et al., 2007). Η δεύτερη κατηγορία, αποτελείται από τον ιό του

18

μωσαϊκού του καπνού (Tobacco mosaic virus, TMV), ο οποίος ανήκει στο γένος

Tobamovirus, στην οικογένεια Virgaviridae και μεταδίδεται μηχανικά και με το

σπόρο. Ο ιός έχει βρεθεί στην Αφρική [Αίγυπτο (Othman, 1991) κ.ά.], την Ασία

[Ταϊβάν (Green et al., 1991) κ.ά.], την Ευρώπη [Ισπανία (Tenllado et al., 1997)

κ.ά.], και τη Βόρεια και Ανατολική Αμερική [Βρετανική Κολομβία (Beczner et al.,

1997), Βραζιλία (Βrioso, 1996) κ.ά.]. Έπειτα, στην ίδια κατηγορία βρίσκεται ο

ιός Y της πατάτας (Potato virus Y, PVY), του γένους Potyvirus, της οικογένειας

Potyviridae. Η κατανομή του ιού είναι ευρεία, στην Αφρική (Αλγερία κ.ά.), στην

Ασία (Κίνα κ.ά.), στην Ευρώπη (Γερμανία, Ιταλία κ.ά.), στη Βόρεια και

Ανατολική Αμερική (Ν. Υόρκη, Χιλή κ.ά.) και στην Ωκεανία (Παπούα Νέα Γουινέα

κ.ά), (CABI and EPPO, 2005). Εν συνεχεία, ο ιός της διάβρωσης του καπνού

(Tobacco etch virus, TEV), του γένους Potyvirus και της οικογένειας Potyviridae,

μεταδίδεται με αφίδες και βρίσκεται κυρίως στο δυτικό ημισφαίριο.

Συγκεκριμένα, εμφανίζεται στη Βόρεια και Κεντρική Αμερική (Cerkauskas,

2004), αλλά και σε χώρες της Αφρικής και της Μεσογείου. Ο ιός του κηλιδωτού

μαρασμού της τομάτας (Tomato spotted wilt virus, TSWV), της οικογένειας

Bunyaviridae, ο οποίος παρουσίασε έντονη έξαρση από τα τέλη της δεκαετίας

του '80 με την παγκόσμια διασπορά του με τον φορέα/θρίπα Frankliniella

occidentalis έχει και αυτός παγκόσμια κατανομή. Εμφανίζεται στην Αφρική

(Αλγερία κ.ά.), στην Ασία (Αρμενία κ.ά.), στην Ευρώπη (Φινλανδία κ.ά.), στη

Βόρεια και Ανατολική Αμερική (Οκλαχόμα, Βολιβία κ.ά.) και στην Ωκεανία

(Αυστραλία κ.ά.), (EPPO, 2014). Ο ιός του μωσαϊκού της μηδικής (Alfalfa mosaic

virus, AMV) που ανήκει στο γένος Alfamovirus και στην οικογένεια

Bromoviridae, βρίσκεται σε πολλές χώρες της Αφρικής (Αλγερία κ.ά.), της Ασίας

(Κίνα κ.ά.), της Ευρώπης (Αυστρία κ.ά.), της Βόρειας και Ανατολικής Αμερικής

(Καναδά, Αργεντινή κ.ά.) και της Ωκεανίας (Ν. Ζηλανδία κ.ά.), (CABI and EPPO,

2002). Τέλος, στην δεύτερη κατηγορία βρίσκεται ο ιός του μωσαϊκού της

πιπεριάς (Pepper mosaic virus, PeMV), που ανήκει στο γένος Potyvirus και στην

οικογένεια Potyviridae. Οι πρώτες εμφανίσεις του ιού, έγιναν στην Αριζόνα

(Nelson et al., 1972) και την Φλόριντα (Zitter et al., 1972), ενώ έχει αναφερθεί

και στην Καλιφόρνια, το Νέο Μεξικό κ.α.

19

Όσον αφορά χώρες της Μεσογείου, οι Green et al., το 1991,

απαρίθμησαν 35 διαφορετικά είδη ιών, ικανά να μολύνουν πιπεριές. Δώδεκα

χρόνια αργότερα, ο κατάλογος είχε αυξηθεί σε 68 είδη (Pernezny et al., 2003).

Κατά την ανασκόπηση των σημαντικότερων ιών που επηρεάζουν τις

καλλιέργειες πιπεριάς στην περιοχή της λεκάνης της Μεσογείου και τις μεθόδους

που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο τους, οι Moury et al., το 2012, πρότειναν

ότι περίπου 20 είδη ιών προκαλούσαν ζημιά στις καλλιέργειες αυτές. Ανάλογα

με το τρόπο μετάδοσής τους, οι ιοί κατατάσσονται σε πέντε κατηγορίες

(Πίνακας 1.2).

Οι σημαντικότεροι ιοί που προσβάλλουν την πιπεριά στην Ελλάδα είναι

οι εξής: O CMV, ο οποίος από το 1990, έχει παρουσιάσει έξαρση σε όλη την

Ελλάδα σε κηπευτικά φυτά, με την τομάτα να κατέχει την πρώτη θέση (Katis

et al., 1991, Kyriakopoulou et al., 1991, Varveri et al., 1997). Βρέθηκε σε

δείγματα πιπεριάς (1995-1996) στο Ν. Ηλίας, τα οποία εμφάνισαν συμπτώματα

μωσαϊκού (Varveri et al., 1999). O PVY, στην Ελλάδα έχει βρεθεί ότι μολύνει

φυτά πιπεριάς (Varveri, 2006) τόσο στο βόρειο, όσο και στο κεντρικό μέρος της

και συγκεκριμένα στη Μελίκη του Ν. Ημαθίας και στην Τιθορέα του Ν. Φθιώτιδας

(Margaritopoulos et al., 2009). Όσον αφορά τον TSWV, τo 1989, εμφανίστηκαν

οι πρώτες προσβολές στην πιπεριά στη Βόρεια Ελλάδα και συγκεκριμένα στη

Μακεδονία, τη Θράκη και την Κρήτη (Katis et al., 1991; Vovlas et al., 1994).

Έκτοτε, έχει βρεθεί στην επικράτεια της Ελλάδας (Δράμα, Θεσσαλονίκη,

Ημαθία) (Katis et al., 1991, Livieratos et al., 1994, Chatzivassiliou et al., 1996).

Εν συνεχεία, ο TMV εμφανίζεται κυρίως σε περιοχές της Κρήτης (Avgelis, 1982,

1987). Ο ιός του μωσαϊκού της τομάτας (Tomato mosaic virus, ToMV), ο οποίος

ανήκει στο γένος Tobamovirus της οικογένειας Virgaviridae και μεταδίδεται

μηχανικά και με το σπόρο, αποτελεί ένα στέλεχος του TMV το οποίο προκαλεί

έντονα συμπτώματα στα φυτά πιπεριάς. Η πρώτη αναφορά του έγινε στην

Κρήτη (Avgelis, 1986). Τέλος, ο ιός του ικτέρου της πιπεριάς (Pepper yellows

virus, PeYV), ο οποίος ανήκει στο γένος Polerovirus και στην οικογένεια

Luteoviridae εμφανίστηκε στην Ελλάδα (σποραδικά), κατά τη διάρκεια της

τελευταίας δεκαετίας σε φυτά πιπεριάς, τα οποία παρουσίασαν συμπτώματα

20

τυπικά του PeYV. Ωστόσο, την άνοιξη του 2013, παρατηρήθηκε έξαρση του ιού

αυτού σε θερμοκήπια της Κρήτης (Λασίθι, Χανιά), (Lotos et al., 2014, 2017).

Πίνακας 1.1 Συμπτώματα ιολογικών ασθενειών της πιπεριάς.

Ακρωνύμιο Συμπτώματα

CMV Νεκρωτικά ή σχήματος δακτυλίου σημεία, μωσαϊκό σε φύλλα,

καρπούς

PVY Μωσαϊκό κατά μήκος των νεύρων σε φύλλα, καρπούς

TEV Σκούρο πράσινο μωσαϊκό κατά μήκος των νεύρων στα φύλλα

PeMV Μωσαϊκό κατά μήκος των νεύρων και ποικιλοχλώρωση στα φύλλα

TSWV Καστανοκίτρινο χρώμα στα νεαρά φύλλα, νεκρωτικές κηλίδες σε

καρπούς

AMV Λευκό ή έντονο κίτρινο χρώμα, λεία/γυαλιστερή επιφάνεια φύλλων

TMV Νεκρωτικές κηλίδες, μωσαϊκό σε φύλλα και καρπούς

ToMV Ποικιλοχλώρωση, συστροφή φύλλων, παραμορφώσεις,

νεκρωτικές/χλωρωτικές κηλίδες σε καρπούς

PeYV Μεσονέυριες χλωρώσεις, κιτρίνισμα νεύρων, συστροφή φύλλων,

παραμορφώσεις καρπών

Πίνακας 1.2 Γένη ιών που προσβάλλουν την πιπεριά, ανάλογα με το τρόπο μετάδοσής τους (Moury et

al., 2012)

Αφιδο-

μεταδιδόμενοι

Αλευροδω-

μεταδιδόμενοι

Μεταδιδόμενοι

με θρίπες

Μηχανικά/

Σπόρο

Με άλλο

τρόπο

Potyviruses Criniviruses

Tospoviruses

Tobamoviruses

Ilarviruses

Cucumoviruses

Poleroviruses

Begomoviruses Alfamoviruses

Fabaviruses

21

1.3 Σημαντικότεροι ιοί του γένους Tobamovirus στην πιπεριά

παγκοσμίως και στην Ελλάδα

Την πιπεριά προσβάλλουν 7 ιοί του γένους Tobamovirus (Πιν. 1.2). Η

σοβαρότητα των συμπτωμάτων ποικίλλει όμως, ανάλογα με το είδος και το

στέλεχος του ιού, καθώς και τον γενότυπο της πιπεριάς που μολύνεται. Τα

συμπτώματα των ιών αυτών, επηρεάζουν τόσο την ποσότητα όσο και την

ποιότητα της παραγωγής. Οι σημαντικότεροι και πιο συχνά απαντώμενοι

παγκοσμίως, είναι οι CMV και TMV. Τα συμπτώματα του πρώτου, εμφανίζονται

κυρίως στα κάτω ώριμα φύλλα και συνήθως δημιουργούν νεκρωτικά

σημεία/κηλίδες και μεταχρωματισμούς. Ο δεύτερος, περιλαμβάνει

παραμόρφωση, μωσαϊκό, χλωρωτικές/νεκρωτικές κηλίδες στα φύλλα και

μικρούς αποχρωματισμένους, με μωσαϊκό καρπούς.

Όσον αφορά την Ελλάδα, οι σημαντικότεροι ιοί του γένους Tobamovirus,

που προσβάλλουν την πιπεριά είναι οι CMV, TMV και ΤοΜV. Τα συμπτώματα

του CMV και TMV είναι ίδια με αυτά που αναφέρθηκαν παραπάνω, ενώ αυτά

του ToMV περιλαμβάνουν ποικιλοχλώρωση, συστροφή φύλλων, παραμόρφωση

και νεκρωτικές/χλωρωτικές κηλίδες στους καρπούς (Πίνακας 1.1).

Πίνακας 1.3 Ιοί της πιπεριάς που ανήκουν στο γένος Tobamovirus.

Ακρωνύμιο Ξενική ονομασία Ελληνική ονομασία

BPeMV Bell pepper mottle virus Ιός της ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς

ObPV Obuda pepper virus Ιός ομπούντα της πιπεριάς

PaMMV Paprika mild mottle virus Ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της

πάπρικας

PMMoV Pepper mild mottle virus Ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της

πιπεριάς

TMV Tobacco mosaic virus Ιός του μωσαϊκού του καπνού

ToMV Tomato mosaic virus Ιός του μωσαϊκού της τομάτας

22

1.4 Ο ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της πιπεριάς (Pepper mild mottle

virus, PMMoV)

1.4.1 Ιστορικό

Η πρώτη αναφορά του ιού έγινε στη Νότια Καρολίνα της Αμερικής από

τον McKinney το 1952 σε C. annuum L., όπου θεωρήθηκε ένα στέλεχος του

TMV. Δώδεκα χρόνια αργότερα, απομονώθηκε ένα στέλεχος του TMV

(Greenleaf et al., 1964), το οποίο ήταν παρόμοιο με το στέλεχος που είχε

απομονωθεί από τον McKinney. Τα συμπτώματα παρατηρήθηκαν με

ηλεκτρονική μικροσκοπία σε φυτά καπνού (Nicotiana spp.) και πιπεριάς (C.

spp.). Το στέλεχος αυτό, ονομάστηκε ‘’Samsun latent TMV’’, το οποίο διέφερε

από άλλα στελέχη του TMV, αφού απέτυχε η μηχανική μόλυνση σε φυτά

τομάτας. Ωστόσο, προκάλεσε έντονα δισυστηματικά συμπτώματα (νεκρωτικοί

καρποί, ανάσχεση αύξησης φυτού) σε φυτά C. frutescens και σε C. annuum,

ενώ προκάλεσε τοπικές κηλίδες σε φυτά Nicotiana sylvestris.

Εν τέλη, η ταυτοποίηση του ιού έγινε το 1984, από απομονώσεις του ιού

σε φυτά πιπεριάς στην Ιταλία και συγκεκριμένα στη Σικελία (Wetter et al.,

1984). Αρχικά, ο ιός μπορούσε να διακριθεί από τους υπόλοιπους ιούς του

γένους Tobamovirus, μέσω των συμπτωμάτων που προκαλούσε, αλλά και του

εύρους ξενιστών που μόλυνε. Ο τελικός διαχωρισμός από τους άλλους ιούς του

γένους Tobamovirus πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της ενζυμικής δοκιμής,

ELISA, όπου και επισημοποιήθηκε το νέο αυτό είδος του ιού, με την ονομασία

Pepper mild mottle virus, PMMV. Έκτοτε, έχει αναφερθεί σε πολλές χώρες

παγκοσμίως.

1.4.2 Γονιδιακή οργάνωση

Όπως και όλοι οι ιοί του γένους Tobamovirus τα ιοσωμάτια του PMMoV

είναι ραβδόμορφα, πολύ σταθερά στο περιβάλλον (King et al., 2011). Το

γονιδίωμα του ιού αποτελείται από 6356-6357 νουκλεοτίδια, με μάζα 210.000

(Xiang et al., 1994) και είναι ένα μονόκλωνο, θετικής πολικότητας RNA το οποίο

κωδικοποιεί τουλάχιστον τέσσερις πρωτεΐνες. Tο γονιδίωμα του έχει τέσσερα

ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (Open reading frames, ORFs), τα οποία

κωδικοποιούν μία πρωτεΐνη 126-kDa και μία 183-kDa (νουκλεοτίδια: 70-4908),

23

μία πρωτεΐνη 28-kDa (4909-6582) και μία πρωτεΐνη 17.5-kDa (5685-6158)

(Εικόνα 1.1).

Οι πρωτεΐνες 126-kDa και η 183-kDa συμμετέχουν στην αντιγραφή

(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) του ιικού γονιδιώματος, ενώ η 30-

kDa είναι η πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης (Movement Protein, MP)

καθώς βοηθάει στην μετακίνηση του ιού από κύτταρο σε κύτταρο και η 17.5-

kDa είναι η καψιδιακή πρωτεΐνη (Capsid protein, CP) και συμμετέχει στην

καψιδίωση των ιοσωματίων (King et al., 2011). Οι πρωτεΐνες 30-kDa και η 17.5-

kDa μεταφράζονται μέσω υπογενωμικών RNA (Alonso et al., 1991, Mizumoto

et al., 2014, Han et al., 2017). Η πρωτεΐνη των 126 kDa λειτουργεί ως

καταστολέας της σίγησης RNA (Tsuda et al., 2007, Souza et al., 2013).

Η CP έχει μάζα που εκτιμάται από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή

πολυακριλαμιδίου στα 17-21-kDa (Othman, 1991, Xiang et al., 1994).

Αποτελείται από 158 αμινοξέα και η σύνθεσή της διαφέρει από τις υπόλοιπες

άλλων ιών του γένους Tobamovirus (Wetter et al., 1984, Creaser et al., 1987,

Xiang et al., 1994). Θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο ως παράγοντας

αντοχής που προκαλείται από τα τέσσερα γονίδια L (L1, L2, L3 και L4) στα φυτά

Capsicum (Matsumoto et al., 2008). O PMMoV έχει ταυτοποιηθεί με την PCR

βασιζόμενη στο γονίδιο που εκφράζει την CP (Jarret et al., 2008) Επιπλέον, το

γονίδιο της CP είναι ένας από τους συνηθέστερα χρησιμοποιούμενους δείκτες

για εξελικτικές αναλύσεις ιών στην οικογένεια Virgaviridae (Adams et al., 2009,

Fraile et al., 2011) και άλλων φυτικών ιών (Gao et al., 2016). Φαίνεται ότι η CP

εξελίσσεται πιο αργά από τα άλλα γονίδια στο γονιδίωμα του PMMoV, αν και

αυτό το μοτίβο δεν ισχύει για όλους τους ιούς του γένους Tobamovirus (Pagan

et al., 2010).

Εικόνα 1.1 Γονιδίωμα ιού του γένους Tobamovirus. Αριστερά: στο 5’ άκρο η πρωτεΐνη RdRp. Μέση: η πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης. Δεξιά: η καψιδιακή πρωτεΐνη, καθώς επίσης απεικονίζονται και τα 4 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης.

24

1.4.3 Συμπτωματολογία

Τα συμπτώματα του ιού εξαρτώνται από τον γενότυπο του φυτού τον

οποίο προσβάλλουν. Παρ’ όλα αυτά, τα συμπτώματα στους διάφορους ξενιστές

δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές. Έχουν τα τυπικά συμπτώματα των ιών

του γένους Tobamovirus όπως μωσαϊκό, χλώρωση και συρρίκνωση, καθώς

επίσης παραμόρφωση σε φύλλα και νεκρώσεις στους καρπούς (Haramoto et al.,

2013, Peng et al., 2015, Shirasaki et al., 2018). Οι καρποί είναι μικροί,

παραμορφωμένοι και εμφανίζουν ποικιλοχλωρώσεις, έχοντας βυθισμένα ή

υπερυψωμένα σημεία με νεκρωτικές κηλίδες (Petrov, 2014) (Εικόνα 1.2).

Πολλές φορές εμφανίζονται καφέ νεκρωτικές ραβδώσεις ή πτυχές στα φύλλα

και στους καρπούς. Τέλος, τα συμπτώματα μπορούν εύκολα να παρατηρηθούν

στην βλαστική φάση των φυτών, ενώ είναι πιο έντονα εάν αυτά μολυνθούν

όταν είναι νεαρά.

Εικόνα 1.2 Καρποί πιπεριάς, με συμπτώματα παραμόρφωσης, μωσαϊκού, χλώρωσης και συρρίκνωσης, τυπικά του PMMoV. Πηγή: Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας.

25

1.4.4 Εύρος ξενιστών

Το εύρος των ξενιστών του PMMoV βρέθηκε ότι είναι παρόμοιo, αλλά όχι

ίδιο, με άλλους ιούς του γένους Tobamovirus (Wetter et al., 1984). Τα

περισσότερα είδη και ποικιλίες του Capsicum spp., είναι ευπαθή στον PMMoV

και αποτελούν τον φυσικό ξενιστή του (Wetter et al., 1984, Jarret et al., 2008).

Ελάχιστες είναι οι μελέτες που αποδεικνύουν ότι ο PMMoV προσβάλλει κάποιες

ποικιλίες τομάτας, όπως είναι η Solanum lycopersicum cv. Stryama (Petrov,

2014). Επιπλέον, αυτοφυή φυτά, συμπεριλαμβανομένου του Brugmansia

suaveolens (νυχτολούλουδο), μπορούν να μολυνθούν από τον PMMoV και ως

εκ τούτου θα πρέπει να καταστρέφονται, σε περίπτωση που βρίσκονται κοντά

σε καλλιέργειες πιπεριάς (Παραπομπή ηλεκτρονική

https://agric.wa.gov.au/n/7520).

1.4.5 Γεωγραφική εξάπλωση

Ο ιός πρωτοεμφανίστηκε στη Νότια Καρολίνα το 1952, όπως

αναφέρθηκε στην παράγραφο 1.4, αλλά ταυτοποιήθηκε στην Ιταλία το 1984.

Έκτοτε, έχει εμφανιστεί σε πολλές χώρες παγκοσμίως και ως εκ τούτου, η

εξάπλωσή του είναι ευρεία (Lamb et al., 2001) (Εικόνα 1.3). Συγκεκριμένα,

αναφορές έχουν γίνει για αυτόν στη Βόρεια και Ανατολική Αμερική (Beczner et

al., 1997, Adkins et al., 2001), στην Ωκεανία [Αυστραλία (Pares, 1985) κ.ά.],

στην Ασία [Ιαπωνία, (Ikegashira et al., 2004), Κίνα (Xiang et al., 1994, Wang

et al. 2006), Ταϊβάν (Green et al., 1991)], στην Ευρώπη (Wetter et al., 1984,

Marte et al., 1986, Alonso et al., 1989) και στην Αφρική [Τυνισία (Mnari-Hattab

et al., 2006) κ.ά.]. Από το 1997, ο PMMoV υπήρξε αιτία πολλών σημαντικών

εξάρσεων στις νοτιοανατολικές πολιτείες των ΗΠΑ, συγκεκριμένα στη Γεωργία

και τη Φλόριδα. Επίσης, ο PMMoV έχει προκαλέσει δυσμενείς οικονομικές

καταστροφές σε θερμοκηπιακές και υπαίθριες καλλιέργειες της Ιαπωνίας

(Hagiwara et al., 2002), αλλά και της Κίνας (Wang et al., 2006).

26

1.4.6 Τρόπος μετάδοσης

Ο PMMoV μεταδίδεται μηχανικά και με τον σπόρο, ενώ δε μεταδίδεται

μέχρι τώρα με κάποιο φορέα. O ιός παραμένει μολυσματικός για αρκετούς μήνες

έως και χρόνια (Ikegashira et al., 2010, Roberts, 2014) στο έδαφος, στα

υπολείμματα της καλλιέργειας και στο νερό της άρδευσης (Moury et al., 2012),

ενώ μπορεί να εισέλθει στο φυτό/σπόρο, μέσω μικροσκοπικών εκδορών ή

τραυμάτων. Τα φύλλα, οι βλαστοί και οι ρίζες αποτελούν εστίες, οι οποίες

λειτουργούν ως πηγές μολύσματος σε ευπαθείς ποικιλίες/είδη (Lamb et al.,

2001). Η μετάδοσή του είναι εύκολη με καλλιεργητικούς χειρισμούς νεαρών

φυτών, ειδικά κατά τη μεταφύτευση (Ozaslan et al., 2006). Επίσης, μεταδίδεται

πολύ γρήγορα σε υγιή φυτά μέσω του εμβολιασμού, αλλά και με την απλή

επαφή των φυτών και ως εκ τούτου, με επαφή του ίδιου του παραγωγού κατά

την εκτέλεση διαφόρων καλλιεργητικών εργασιών (με τα χέρια, γάντια, ρούχα,

δέσιμο των φυτών, συγκομιδή καρπών). Είναι αξιοσημείωτο να αναφερθεί, ότι

τα ιοσωμάτια του ιού έχουν βρεθεί σε σάλτσα πιπεριάς (Peng et al., 2015) και

στο νερό άρδευσης καλλιεργειών πιπεριάς στην Ιαπωνία, το οποίο ήταν

Εικόνα 1.3 Παγκόσμια διασπορά του PMMoV. Πηγή: http://www.fao.org/statistics/en/.

http://www.fao.org/statistics/en/

27

μολυσματικό για ένα μέρος αυτών (Haramoto et al., 2013). Τέλος, όπως και

στην περίπτωση του ToMV αλλά και άλλων ιών του γένους Tobamovirus (Pares

et al., 1992), ο ιός είναι πιθανό να διασπαρθεί πολύ γρήγορα σε υδροπονικές

καλλιέργειες, εάν τα θρεπτικά διαλύματα επιμολυνθούν με αυτόν.

Όσον αφορά τη σπορομετάδοση του ιού, ελάχιστες είναι οι εργασίες που

έχουν δημοσιευτεί. Ο PMMoV βρίσκεται στο εξωτερικό περίβλημα του σπόρου,

σπανίως στο ενδοσπέρμιό του (Moury et al., 2012), και παραμένει

μολυσματικός για παρατεταμένες περιόδους (Ikegashira et al., 2004, Genda et

al., 2005). Μελέτες έχουν αποδείξει, ότι ο ιός έχει μεταδοθεί σε φυτά C. annuum

σε ποσοστό της τάξης του 32% (Jarret et al., 2008). Ταυτόχρονα, οι Genda et

al., προσπάθησαν να κατανοήσουν τους μηχανισμούς στους οποίους βασίζεται

η σπορομετάδοση του PMMoV, ώστε να βοηθήσουν στην δημιουργία νέων

μεθόδων μείωσης/αποτροπή αυτής.

1.4.7 Γενετική παραλλακτικότητα

Αρκετές μελέτες έχουν δημοσιευτεί σχετικά με την γενετική

παραλλακτικότητα του ιού, ώστε να αποσαφηνιστεί το εξελικτικό μονοπάτι του

στην πάροδο των χρόνων. Έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες για τα γονίδια της

RdRp, της MP, της CP, καθώς και για ολόκληρο το γονιδίωμα του.

Οι έρευνες που έχουν εκπονηθεί για το γονίδιο της RdRp, αποδεικνύουν

την χαμηλή παραλλακτικότητα του ιού, αφού το ποσοστό ομοιότητας σε

επίπεδο νουκλεοτιδίων κυμαίνεται μεταξύ 94 και 100% και το ποσοστό

ομοιότητας σε επίπεδο αμινοξέων από 93 έως 100%. Επιπλέον, οι

φυλογενετικές αναλύσεις κατηγοριοποιούν τις απομονώσεις σε δύο μεγάλες

ομάδες (Wang et al., 2006, Çağlar et al., 2012, Milosevic et al., 2015). Εν

συνεχεία, μελέτες για το γονίδιο της MP, καταδεικνύουν και εδώ το υψηλό

ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και αμινοξέων, το οποίο

ανέρχεται από 99,73 έως 100% και 99% αντίστοιχα (Han et al., 2017),

αποδεικνύοντας τη χαμηλή παραλλακτικότητα του ιού. Αναλύσεις του ιού στο

γονίδιο της CP από απομονώσεις ανά τον κόσμο, δείχνουν την υψηλή ομοιότητα

σε επίπεδο νουκλεοτιδίων (90,8-100%) αλλά και αμινοξέων (92-100%), ενώ

βάση αυτών, δημιουργούνται δύο μεγάλοι κλάδοι στα φυλογενετικά δέντρα

28

(Wang et al. 2006, Peng et al., 2015, Han et al., 2017 και Yu et al., 2019).

Τέλος, μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε ολόκληρο το γονιδίωμα του

PMMoV από τους Velasco et al., 2002, Han et al., 2017 και Yu et al., 2019,

καταδεικνύουν την κοντινή συγγένεια των απομονώσεων μεταξύ περιοχών ανά

τον κόσμο, αφού το ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο νουκλεοτιδίων ανέρχεται

από 91 έως 99,7%, ενώ η φυλογενετική ανάλυση κατατάσσει τις απομονώσεις

σε δύο έως πέντε κλάδους.

Μέσω της ανάλυσης των γενετικών αποστάσεων, μεταξύ ιών του γένους

Tobamovirus, φαίνεται ότι οι διαφορές είναι μεγαλύτερες όταν συγκρίνονται οι

πρωτεΐνες CP και MP σε αντίθεση με την RdRp. Το γεγονός αυτό, αποδεικνύει

την διαφορετικη πίεση επιλογής μεταξύ των γονιδίων που κωδικοποιούν τις

τρεις πρωτεΐνες. Ωστόσο, μεταξύ των απομονώσεων του PMMoV, δε φαίνεται

να υπάρχουν ιδιαίτερες διαφορές στην εξέλιξη αυτών των γονιδίων (Velasco et

al., 2002).

1.4.8 Τρόπος ανίχνευσης

Για την ανίχνευση του ιού, έχουν πραγματοποιηθεί πολλές μελέτες μέχρι

σήμερα, ενώ παράλληλα, κρίνεται απαραίτητη η χρήση εξειδικευμένων

διαγνωστικών μεθόδων για το σκοπό αυτό. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται

είναι οι εξής:

1. Μηχανικές μολύνσεις φυτοδεικτών: Ο ιός μεταδίδεται μηχανικά

σε πληθώρα φυτών-ξενιστών, αλλά μόνο μερικοί χρησιμεύουν για τη διάγνωσή

του. Τα φυτά-ξενιστές που χρησιμοποιούνται για την διάγνωση του PMMoV

είναι τα Capsicum annuum, C. chacoense, C. frutescens, C. praetermissum,

Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Datura stramonium, Lycopersicon

esculentum, Nicotiana clevelandii, N. debneyi, N. glauca, N. glutinosa, N.

sylvestris και N. tabacum L. var Xanthi-nc (Wetter et al., 1984, Kalman et al.,

2001, Ikegashira et al., 2004, Yoon et al., 2006, Genda et al., 2007, Çağlar et

al., 2013).

2. Ορολογικές μέθοδοι: Ανοσοενζυμική δοκιμή (ΕLISA, Enzyme-

linked immunosorbent assay): Για την αξιόπιστη ανίχνευση του ιού

χρησιμοποιείται επιτυχώς η ELISA. Η μέθοδος είναι ευαίσθητη, αξιόπιστη, καθώς

https://www.cabi.org/isc/datasheet/43826#AFE73FEB-63E6-45A2-9179-D80DF15FA095

29

και οικονομική, πλεονεκτήματα που την κατατάσσουν υψηλά στις προτιμήσεις

των ερευνητών για την διάγνωση του PMMoV [Wetter et al., 1984, Tsuda et al.

1998, Beckman Coulter (Marseille, France), BIO-RAD Phytodiagnostics

(France), Bioreba, Loewe Biochemica (Germany), Promega Corp.].

3. Μοριακές μέθοδοι: Αντίστροφη μεταγραφή-Αλυσιδωτή

αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR, Reverse transcription-Polymerase

chain reaction): Η πιο κοινή μοριακή μέθοδος ανίχνευσης είναι η RT-PCR,

λόγω του ότι είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και έχει τη δυνατότητα ανίχνευσης ενός

μόνο RNA μορίου σε ένα δείγμα. Για τα πρωτόκολλα ανίχνευσης

χρησιμοποιούνται εκκινητές, οι οποίοι στοχεύουν κυρίως στα γονίδια της CP,

της MP και της RdRp (Chen et al., 2001, Velasco et al., 2002, Ikegashira et al.,

2004, Colson et al., 2006, Çağlar et al., 2013, Rialch et al., 2015, New England

Biolabs, NEB).

Ανοσοδέσμευση-Αντίστροφη μεταγραφή-Αλυσιδωτή αντίδραση

πολυμεράσης (IC-RT-PCR: Immunocapture-reverse transcription-

polymerase chain reaction): Αναφέρεται πως είναι πιο ευαίσθητη μέθοδος

ταυτοποίησης, σε σχέση με την ELISA και την RT-PCR. Η διαφορά έγκειται στο

ότι αρχικά έχουμε την απομόνωση των σωματιδίων του ιού από τον ιστό του

φυτού δια μέσου της ανοσοδέσμευσης και έτσι καθίσταται δυνατή η

επακόλουθη χρήση της ενίσχυσης της RT-PCR για τον πολλαπλασιασμό των ιών

[BIO-RAD Phytodiagnostics (France)] .

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real-

time PCR): Η real-time PCR, γνωστή και ως ποσοτικοποιημένη αλυσιδωτή

αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (quantitative polymerase chain

reaction, qPCR), είναι μία τεχνική μοριακής βιολογίας βασισμένη στην PCR.

Ελέγχει την ενίσχυση ενός μορίου DNA-στόχου κατά την διαδικασία της PCR

(σε πραγματικό χρόνο και όχι στο τέλος της, όπως συμβαίνει με την συμβατική

PCR). Η real-time PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί ποσοτικά (quantitative real-

time PCR) και ημιποσοτικά (semi-quantitative real-time PCR). Η μέθοδος αυτή

έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του PMMoV από τους (Zhang et al.,

2006, Haramoto et al., 2013).

30

4. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία (ΗΜ, Electron microscopy): Η ΗΜ

διαθέτει την ικανότητα ταυτοποίησης του γένους Tobamovirus, αλλά όχι των

ιών του. Για τον λόγο αυτό, η παραπάνω μέθοδος, δε μπορεί να χρησιμοποιηθεί

από μόνη της ως εργαλείο ταυτοποίησης του PMMoV (Ikegashira et al., 2004,

Alwabli et al., 2017).

1.4.9 Τρόπος αντιμετώπισης

Η αντιμετώπιση του PMMoV όπως και όλων των ιών στηρίζεται στη λήψη

προληπτικών μέτρων καθώς δεν είναι δυνατή η χημική τους καταπολέμηση.

Παρακάτω σχολιάζονται διάφοροι τρόποι μείωσης του κινδύνου μόλυνσης από

τον PMMoV, καθώς επίσης και κάποια είδη κατασταλτικών μέτρων που έχουν

εφαρμοστεί μέχρι σήμερα.

1. Μείωση των εστιών μόλυνσης: Για να επιτευχθεί αυτό το μέτρο,

θα πρέπει να καταπολεμηθούν τα ζιζάνια, ιδιαίτερα εκείνα που ανήκουν στην

οικογένεια των Solanaceae, οι εναλλακτικοί ξενιστές του ιού, να

απομακρυνθούν τα ασθενή φυτά, καθώς επίσης και τα φυτά ‘’εθελοντές’’ της

καλλιέργειας, ώστε να μειωθούν πιθανές πηγές μόλυνσης.

2. Αποφυγή των εστιών μόλυνσης: Για να αποφευχθούν οι εστίες

μόλυνσης στην καλλιέργεια, θα πρέπει να εφαρμοστούν συγκεκριμένα

καλλιεργητικά μέτρα, να ληφθούν μέτρα υγιεινής και ο σπόρος να είναι υγιής.

Συγκεκριμένα, τα υπολείμματα των καλλιεργειών μπορεί να χρησιμεύσουν ως

πηγές μόλυνσης για τις επόμενες καλλιέργειες, οπότε καλό είναι να ασκείται η

αμειψισπορά. Η αποτελεσματική αποστείρωση με ατμό του εδάφους μπορεί

μερικές φορές να μειώσει τα επακόλουθα επίπεδα μόλυνσης σε υγιή φυτά

πιπεριάς. Ωστόσο, είναι εξαιρετικά δύσκολο να αποστειρωθεί το έδαφος σε

βάθος που να εξαλείψει τον ιό που υπάρχει στα υπολείμματα. Επίσης, η χωρική

απομόνωση είναι σημαντική, ώστε να μην υπάρχει περίπτωση επιμόλυνσης από

ενναλακτικό ξενιστή του ιού. Ο εξοπλισμός των καλλιεργειών, η υπερβολική

άρδευση και οι υψηλές θερμοκρασίες αυξάνουν τη διασπορά του φυτικού

υλικού στο έδαφος. Έτσι, για να αποφευχθεί η εξάπλωση του, θα πρέπει να

χρησιμοποιούνται μέτρα υγιεινής που ελαχιστοποιούν την επαφή των φυτών με

τους εργαζόμενους και τον εξοπλισμό. Οι καλλιεργητές θα πρέπει επίσης να

31

προσέχουν στο χειρισμό των φυτών, καθώς τα φυτά με εκδορές ή τραύματα

βοηθούν την είσοδο του ιού. Ταυτόχρονα, θα πρέπει να γίνεται επιμελής

καθαρισμός των εργαλείων και τα χέρια των καλλιεργητών να απολυμαίνονται

με φωσφορικό νάτριο (3%) (Beczner, 1997). Τέλος, συνίσταται ο σπόρος να

είναι πιστοποιημένος και απαλλαγμένος από τον ιό, το οποίο επιτυγχάνεται με

την εξυγίανση του (Wang et al., 2006, Lamb et al., 2001). Οι σπόροι θα πρέπει

να απολυμαίνονται με 2% NaOH ή με 10% Na3PO4 (Salamon et al., 2000).

Ωστόσο, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν ότι η εφαρμογή αυτή, πιθανώς να

προκαλέσει μείωση της φυτρωτικής ικανότητας του σπόρου (Svoboda et al.,

2006).

3. ‘’Σταυροειδής προστασία’’: Τα φυτά που είναι μολυσμένα με έναν

ιό δεν επαναμολύνονται με συγγενική φυλή του ίδιου ιού (McKinney 1929).

Έχουν αναπτυχθεί διάφορα στελέχη του PMMoV με μειωμένη μολυσματικότητα,

όμως, κανένα δεν παρείχε σημαντικά επίπεδα σταυροειδούς προστασίας (Tsuda

et al., 2007). Παρ’ όλα αυτά, στην Ιαπωνία (Nagai, 1987) και στην Ιταλία (Tanzi

et al., 1986, Betti et al., 1991) τα μη μολυσματικά στελέχη του ιού

χρησιμοποιούνται αποτελεσματικά και μπορούν να μετριάσουν τις επιπτώσεις

της μόλυνσης στα μηχανικώς εμβολιασμένα φυτά πιπεριάς. Ωστόσο, ακόμη και

τα ήπια στελέχη, μπορούν να προκαλούν μείωση στην παραγωγή στα

σπορόφυτα ή να μην προσφέρουν κανένα σημαντικό όφελος.

4. Ανθεκτικές ποικιλίες/υποκείμενα: Η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών

είναι ο πλέον αποτελεσματικός τρόπος για την αντιμετώπιση του PMMoV. Η

ανθεκτικότητα στον PMMοV, αν και δεν έχει ακόμη χρησιμοποιηθεί εμπορικά

στην πιπεριά, εμφανίζεται σε ορισμένα υβρίδια των ειδών C. chilense και C.

chacoense και έχει αποδοθεί σε ένα γονίδιο που βρίσκεται στη θέση L. Τέλος,

το υποκείμενο cv Dai-Power, εμφανίζει αντοχή στον ιό και χρησιμοποιείται

επιτυχώς σε καλλιέργειες πιπεριάς στην Ιαπωνία (Saito et al., 2011).

32

1.5 Σκοπός της εργασίας

Σκοπός της παρούσας διατριβής, είναι ο βιολογικός και μοριακός

χαρακτηρισμός του PMMoV. Συγκεκριμένα, η μελέτη της συχνότητας εμφάνισης

του PMMoV σε καλλιέργειες πιπεριάς, η διερεύνηση της παρουσίας του ιού σε

σπορομερίδες πιπεριάς, καθώς επίσης, η μελέτη του εργαστηριακού εύρους

ξενιστών του ιού και της γενετικής παραλλακτικότητας ελληνικών και μη

απομονώσεων. Τέλος, στόχος της μελέτης αυτής, είναι η ανάλυση των

φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ ελληνικών και ξένων απομονώσεων του ιού

παγκόσμιας προέλευσης, ώστε να αποσαφηνιστεί η εξελικτική του πορεία.

33

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2ο Παρουσία του PMMoV σε καλλιέργειες πιπεριάς και

έλεγχος σπορομερίδων ορισμένων ποικιλιών

34

2.1 Εισαγωγή

Οι ιολογικές ασθένειες, αποτελούν την κύρια αιτία μείωσης της

παραγωγής της πιπεριάς παγκοσμίως (Green et al., 1991, Yoon et al., 1989).

Ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι ιοί του γένους Tobamovirus. Η

μετάδοση του ιού με το σπόρο είναι σημαντική αιτία μετάδοσης των ιών αυτών

σε παγκόσμιο επίπεδο, μέσω του εμπορίου σπόρων πιπεριάς και τομάτας.

Οι ιοί του γένους Tobamovirus, δημιουργούν συμπτώματα χλώρωσης,

μωσαϊκού και ποικιλοχλώρωσης, παραμόρφωση φύλλων, μείωση της επιφάνειας

τους, μεταχρωματισμούς και ακανόνιστους σχηματισμούς σε φύλλα και

καρπούς με αποτέλεσμα την αδυναμία εμπορευσιμότητάς τους. Τόσο η

απόδοση, όσο και η ποιότητα της παραγωγής στις καλλιέργειες πιπεριάς,

μπορούν να μειωθούν σημαντικά μετά από επιδημίες/εξάρσεις ιών του γένους

αυτού. H κατανομή των ιών είναι παγκόσμια, ενώ τέτοιες καταστροφικές για

την παραγωγή επιδημίες, έχουν συμβεί σε τρεις χώρες της Φλόριδα από το

1995, αλλά και σε πολλές χώρες της Ασίας και της Ευρώπης, στις οποίες, η

μείωση της παραγωγής έφτανε μέχρι και το 50% (Nagai et al., 1981, Kucharek

et al., 1998, Li et al., 2016). Στη χώρα μας, ιοί του γένους Tobamovirus έχουν

προκαλέσει σοβαρές οικονομικές ζημίες από το 1990 στην επικράτεια της και

κυρίως στο νησί της Κρήτης (Avgelis, 1986, 1987, Varveri et al., 1999).

Ο PMMoV ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στην Ιταλία το 1984 (Wetter

et al., 1984) και έκτοτε έχει εξαπλωθεί και έχει γίνει ένα σημαντικό παθογόνο

των καλλιεργειών της πιπεριάς σε όλο τον κόσμο (στην Βόρεια και Κεντρική

Αμερική, στην Αφρική, στην Ασία, στην Αυστραλία και στην Ευρώπη).

Επιδημικές εκρήξεις του ιού έχουν πραγματοποιηθεί σε πολλές χώρες

παγκοσμίως, όπως αυτή στην Ισπανία και τη Σικελία τη δεκαετία του 1980

(Rodríguez-Cerezo et al., 1989). Στην Ελλάδα, ο PMMoV, έκανε την εμφάνιση

του κατά το 2012, σε δείγματα που παρελήφθησαν στο Εργαστήριο

Φυτοπαθολογίας ΑΠΘ, ωστόσο μέχρι σήμερα, καμία έρευνα δεν έχει

δημοσιευτεί για αυτόν.

Ο PMMoV μεταδίδεται με το σπόρο (Jarret et al., 2007), ωστόσο

ελάχιστες είναι οι μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί για την ικανότητα

35

σπορομετάδοσής του (Genda et al., 2005, Jarret et al., 2008). Στην Ελλάδα,

δεν υπάρχουν δεδομένα για αυτήν, σε εγχώριες ποικιλίες.

Για το λόγο αυτό, στην παρούσα μελέτη κρίθηκε απαραίτητη η

διερεύνηση της παρουσίας του PMMoV σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές

της ελληνικής επικράτειας, καθώς οι πληροφορίες για τη διασπορά του ιού είναι

περιορισμένες, ενώ ταυτόχρονα, μελετήθηκε η πιθανότητα σπορομετάδοσης σε

περιορισμένο αριθμό ποικιλιών πιπεριάς.

2.2 Υλικά και μέθοδοι

2.2.1 Φυτικό υλικό και σπορομερίδες

Για την διερεύνηση της παρουσίας του PMMoV στην Ελλάδα,

πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες φύλλων και καρπών από φυτά πιπεριάς

από διαφορετικές περιοχές της χώρας (Πίνακας 2.1). Η συλλογή των δειγμάτων

έγινε από την Κ. Μακεδονία, τη Θράκη, την Ήπειρο, τη Θεσσαλία, τη Στερεά

Ελλάδα, την Κρήτη και την Πελοπόννησο. Συνολικά συλλέχθηκαν 281 δείγματα

η πλειονότητα των οποίων έφεραν τυπικά συμπτώματα προσβολής από ιούς

του γένους Tobamovirus όπως ποικιλοχλώρωση, μωσαϊκό και παραμορφώσεις

των φύλλων καθώς και νεκρώσεις στους καρπούς. Από το σύνολο των

δειγμάτων, τα 163 (2012-2016) προέρχονταν από τη συλλογή του εργαστηρίου

Φυτοπαθολογίας του ΑΠΘ, τα οποία είχαν ενταχθεί στο πλαίσιο παλιότερων

ερευνών και εμφάνιζαν τα κλασσικά συμπτώματα των ιών του γένους

Tobamovirus (μωσαϊκό, ποικιλοχλώρωση, νέκρωση, συστροφή φύλλων). Τα

δείγματα μετά την μεταφορά τους στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας,

τοποθετήθηκαν στο ψυγείο (0-4°C) σε ειδικές πλαστικές σακούλες, με σκοπό

να αποφευχθεί η αλλοίωσή τους. Στη συνέχεια, ταξινομήθηκαν και

διατηρήθηκαν σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης (-80°C). Για μακροχρόνια

αποθήκευση λυοφιλοποιήθηκε ιστός από όλα τα δείγματα.

Για την διερεύνηση της παρουσίας του ιού σε σπορομερίδες πιπεριάς

εξετάστηκαν οι εξής σπορομερίδες:

1. Πιπεριά τύπου Μακεδονικό από την περιοχή της Καλαμπάκας.

2. Πιπεριά τύπου Καρδούλα από την περιοχή της Καλαμπάκας.

3. Πιπεριά τύπου LOBARDO από το Καρποχώρι Καρδίτσας.

36

Πίνακας 2.1 Περιοχές δειγματοληψίας και αριθμός φυτών που ελέγχθηκαν τα έτη 2012-2019.

Γεωγραφικό Διαμέρισμα

Περιοχές Δειγματοληψίας Έτος συλλογής

Αριθμός δειγμάτων που

ελέγχθηκαν

Κεντρική Μακεδονία

Λάκωμα Θεσσαλονίκης, Άγιος Γεώργιος Ημαθίας, Πτολεμαΐδα

2015-2018 25

Θράκη Ορεστιάδα 2016 4

Ήπειρος Πλατάνια Ιωαννίνων 2016 27

Θεσσαλία Τρίκαλα, Καρδίτσα, Καλαμπάκα,

Βελεστίνο

2016-2019 26

Στερεά Ελλάδα

Δομοκός, Αθήνα 2012-2016 21

Κρήτη Ηράκλειο, Ιεράπετρα, Μεσσαρά, Τυμπάκι

2013-2019 174

Πελοπόννησος Σκουροχώρι, Αρκαδία,

Κυπαρισσία

2018 4

Σύνολο: 281

2.2.2 Εκχύλιση ολικού RNA

H εκχύλιση ολικού RNA από τον φυτικό ιστό, πραγματοποιήθηκε

σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Chatzinasiou et al.(2010). (Παράρτημα). Οι

σπόροι των τριών ποικιλιών, κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες των 5, 10 και 50

σπόρων, από τρεις επαναλήψεις η καθεμία (585 σπόροι). Το πρωτόκολλο που

χρησιμοποιήθηκε ήταν των Chatzinasiou et al. (2010), με την διαφορά ότι 0,1

gr φυτικού δείγματος, ομογενοποιείται σε 1 ml διαλύματος lysis (ομάδα 5

σπόρων), 0,2 gr σε 2 ml (ομάδα 10 σπόρων) και 1 gr σε 5 ml (ομάδα 50

σπόρων).

2.2.3 RT-PCR για την ανίχνευση του PMMoV

Για την ανίχνευση του PMMoV βελτιστοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο RT-

PCR το οποίο λαμβάνει χώρα στον ίδιο μικροσωλήνα. Κάθε μικροσωλήνας

περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα 1xbuffer [50mM Tris – HCl (pH=8,3), 75mM KCl,

3mM MgCl2], 0,25 mM από κάθε dNTP, 1 μM από τον ανοδικό εκκινητή PMMoV-

F και 1 μM από τον καθοδικό εκκινητή PMMoV-R (Rialch, et al., 2015, Πίνακας

2.2). Επίσης, περιείχε 1,5U M‐MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, The

Netherlands), 1,5U QIAGEN HotStarTaq DNA πολυμεράσης, και νερό που είχε

υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι να φτάσει το διάλυμα τα 25μl. Όλες οι

37

αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στον θερμοκυκλοποιητή LabCycler

(SensoQuest, GmbH, Germany). Το πρωτόκολλο θερμοκυκλοποίησης

περιλάμβανε: Για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής: για 45’ στους

47°C, για 15’ στους 95°C. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR, ένα

σύνθετο προφίλ 40 κύκλων αποτελούμενοι από τρία στάδια:

1. αποδιάταξη του εκμαγείου στους 95 °C για 30’’,

2. υβριδοποίηση των εκκινητών με το εκμαγείο στους 58 °C για 30’’,

3. επέκταση των αλυσίδων στους 72 °C για 30’’.

Πίνακας 2.2 Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του PMMoV (PMMoV-F, PMMoV-R). (Rialch et al., 2015).

Εκκινητής Αλληλουχία Εκκινητή (5’-3’)

F ανοδικός R καθοδικός

Γονίδιο-στόχος

Προϊόν (μέγεθος)

PMMoV-F CCA ATG GCT GAC AGA TTA CG

F CP

747 ζεύγη

βάσεων PMMoV-R CAA CGA CAA CCC TTC GAT TT

R

2.2.4 RT-PCR για την ανίχνευση ιών του γένους Tobamovirus

Για τη μοριακή ανίχνευση του ιού στο σπόρο χρησιμοποιήθηκε η ίδια

μέθοδος RT-PCR σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε μια

γενική RT-PCR σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα, η οποία ανιχνεύει το σύνολο των

ιών του γένους Tobamovirus. Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε,

δημιουργήθηκε για την ανάγκη ελαχιστοποίησης του χρόνου ανίχνευσης των

ιών του γένους Tobamovirus, εξειδικευμένα για το φυτό της πιπεριάς. Κάθε

μικροσωλήνας περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα 1xbuffer [50mM Tris – HCl

(pH=8,3), 75mM KCl, 3mM MgCl2], 0,25 mM από κάθε dNTP, 1 μM από τον

ανοδικό εκκινητή PepTob F και 1 μM από τον καθοδικό εκκινητή PepTob R

(Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας, Πίνακας 2.3.). Επίσης περιείχε, 1,5U M‐MLV

αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, The Netherlands), 1,5U QIAGEN

HotStarTaq DNA πολυμεράσης, και νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC

μέχρι να φτάσει το διάλυμα τα 25μl. Το πρωτόκολλο θερμοκυκλοποίησης

περιλάμβανε: Για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής: για 45’ στους

38

30° C, για 15’ στους 94° C. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR, ένα

σύνθετο προφίλ 40 κύκλων αποτελούμενοι από τρία στάδια:

1. αποδιάταξη του εκμαγείου στους 94 °C για 30’’ και στους 60°C για 15’’,

2. υβριδοποίηση των εκκινητών με το εκμαγείο στους 55 °C για 15’’,

3. επέκταση των αλυσίδων στους 72 °C για 20’’ και 72°C για 5’.

Πίνακας 2.3 Αλληλουχίες εκκινητών για την ανίχνευση ιών του γένους Tobamovirus (PepTob F, PepTob R). Πηγή: Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας 2018.

Εκκινητής Αλληλουχία

Εκκινητή (5’-3’)

F ανοδικός

R καθοδικός

Γονίδιο-

στόχος

Προϊόν

(μέγεθος)

PepTob F GAA GTK TGG AAR CAM GGG

CA

F

RdRp

400 ζεύγη

βάσεων PepTob R ATY CTT GAT RTG TTT WGC

MCC R


αγαρόζης

Η ανάλυση των προϊόντων της PCR πραγματοποιήθηκε σε συσκευή

οριζόντιας ηλεκτροφόρησης με μέσο διαχωρισμού πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v

σε διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x TAE (Tris Acetate EDTA: 0,04M Tris‐Acetate,

0,001M EDTA). Η πηκτή παρασκευάστηκε με τη διάλυση UltraPure™ αγαρόζης

(Invitrogen, The Netherlands) σε 1x ΤΑΕ και θέρμανση μέχρι βρασμού. Στη

συνέχεια, το διάλυμα αποχύθηκε στην τράπεζα ηλεκτροφόρησης και αφέθηκε

να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου. Στα φρεάτια της πηκτής τοποθετήθηκαν

10 μl προϊόντος της PCR, τα οποία αναμείχθηκαν με 1μl διαλύματος φόρτωσης

[loading buffer: 50% γλυκερόλη, 0,01Μ NaH2PO4 (pH 7,0), 0,4% κυανούν της

βρωμοφαινόλης]. Για τον προσδιορισμό του μεγέθους των προϊόντων της PCR

συμπεριλήφθηκε στην ηλεκτροφόρηση και ένας δείκτης μοριακού βάρους (Μ.Β)

(100bp DNA Ladder, New England Biolabs). Η τάση που εφαρμόστηκε ήταν

περίπου 5 volt για κάθε εκατοστό απόστασης των ηλεκτροδίων, ενώ αφέθηκε

να «τρέχει» έως ότου η χρωστική μεταναστεύσει (η ταχύτητα μετανάστευσής

της σε πηκτή αγαρόζης 1,5% είναι παρόμοια με DNA μεγέθους 200bp) κοντά

στην άκρη της πηκτής αγαρόζης. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η πηκτή

εμβαπτίστηκε σε υδατικό διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (0,5 mg/ml) για 10 έως

15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, η πηκτή τοποθετήθηκε σε τράπεζα

39

φθορισμού υπεριώδους ακτινοβολίας (UV transiluminator) για να απεικονιστούν

οι φθορίζουσες ζώνες (bands) του DNA (Εικόνα 2.1).

2.2.6 Σπορομετάδοση

Προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανότητα σπορομετάδοσης των ιών του

γένους Tobamovirus, που ανιχνεύτηκαν στο σπόρο, πραγματοποιήθηκε σπορά

των 3 ποικιλιών (25 σπόροι ανά ποικιλία) και τα φυτά ελέγχθηκαν τόσο οπτικά

έλεγχο, όσο και με τη μέθοδο RT PCR (Παράγραφος 2.2.) στο στάδιο του

δεύτερου πραγματικού φύλλου.

2.2.7 Αλληλούχηση προϊόντων PCR

Λόγω της επιτυχούς ανίχνευσης ιών του γένους Tobamovirus στο σπόρο,

πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση δύο δειγμάτων, τα οποία βρέθηκαν θετικά σε

αυτούς (από ποικιλία Μακεδονικό και LOBARDO). Οι εκκινητές που

χρησιμοποιήθηκαν για την αλληλούχηση των δύο δειγμάτων αναφέρονται στον

πίνακα 2.3.

Για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδίου της RdRp,

πραγματοποιήθηκε PCR, όπου πολλαπλασιάστηκε η αλληλουχία-στόχος σε 4

διαφορετικούς μικροσωλήνες. Μετά από τη διαδικασία πολλαπλασιασμού, τα

Εικόνα 2.1

Α. Φωτογραφία ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης προϊόντος PCR μεγέθους 747 ζευγών βάσεων. Με L

σημειώνεται ο δείκτης μοριακού βάρους ανά 100 ζβ. Τα δείγματα 1, 2, 3, 4 είναι θετικά στον PMMoV και

συμβολίζονται με (+), ενώ το δείγμα 5 είναι αρνητικό και συμβολίζεται με (-). Β. Φωτογραφία

ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης προϊόντος PCR μεγέθους 400 ζευγών βάσεων. Με L σημειώνεται ο

δείκτης μοριακού βάρους ανά 100 ζβ. Τα δείγματα 1, 2 είναι θετικά σε ιούς του γένους Tobamovirus και

συμβολίζονται με (+), ενώ τα δείγματα 3, 4, 5, 6, 7, 8 είναι αρνητικά και συμβολίζονται με (-).

40

80μl του προϊόντος της PCR τοποθετήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης και

ηλεκτροφορήθηκαν. Το DNA του ενισχυμένου προϊόντος καθαρίστηκε από την

πηκτή αγαρόζης ακολουθώντας το πρωτόκολλο Gene-Kleen, προερχόμενο από

τη μέθοδο των Vogelstein και Gillespie (1979). Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή,

το τμήμα της πηκτής που αντιστοιχεί στο ενισχυμένο προϊόν, κόπηκε με τη

βοήθεια αποστειρωμένης λαβίδας νυστεριού μιας χρήσης και τοποθετήθηκε σε

μικροσωλήνα 2ml.

Στη συνέχεια, στον ίδιο μικροσωλήνα προστέθηκε το διάλυμα ΝΤ1 (5 M

NaI, 0,1% Na2S2O3), σε όγκο τριπλάσιο του βάρους του κομματιού της πηκτής.

Ο μικροσωλήνας τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία 50°C για

περίπου 10 λεπτά, ώστε να διαλυτοποιηθεί η πηκτή και να μεταφερθεί στη

στήλη πυριτίου (silica) (Glass microfibers filters, GF/F-Whatman). Αρχικά,

φυγοκεντρήθηκε στις 5000 rcf για 3 λεπτά, με σκοπό τη δέσμευση του DNA. Η

στήλη μεταφέρθηκε σε νέο μικροσωλήνα και ακολούθησε πλύση με 500μl

διαλύματος ΝΤ2 (4,5M NaI, 0,1% Na2S2O3) και φυγοκέντρηση στις 10.000 rcf

για 1’. Στη συνέχεια, ακολούθησαν δυο διαδοχικές πλύσεις με 500μl ΝΤ3 (1xTE

pH 7.5, 200mM NaCl, 60% αιθανόλη) και φυγοκέντρηση στις 10.000 rcf για 1’

και 3 λεπτά, αντίστοιχα. Για να επιτευχθεί η εξάτμιση της αιθανόλης από τη

silica, η στήλη αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά.

Τέλος, προστέθηκαν 60 μl Tris, το οποίο προηγουμένως είχε θερμανθεί

στους 95°C για 10 λεπτά. Το δείγμα αφέθηκε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία

δωματίου και ακολούθησε η τελική φυγοκέντρηση στις 5000 rcf για 3’. Το

προϊόν που προέκυψε στάλθηκε στην εταιρεία Eurofins Genomics (Ebersberg,

Germany) για αλληλούχηση με τη μέθοδο Sanger.

2.3 Αποτελέσματα

2.3.1 Παρουσία του PMMoV σε καλλιέργειες πιπεριάς

Από τα 281 δείγματα που συλλέχθηκαν από διαφορετικές ποικιλίες και

από διάφορες γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδος, ο PMMoV ανιχνεύτηκε σε 79

δείγματα (27,8%) (Πίνακας 2.4). Από τα 79 δείγματα τα 77 προέρχονταν από

την Κρήτη (97,5%), το ένα από την Αττική (1,25%) και ένα από την Ημαθία

(1,25%). Τα δείγματα από την Κρήτη προέρχονταν από τις περιοχές του

41

Ηρακλείου, της Ιεράπετρας, του Τυμπακίου και της Μεσσαράς των νομών

Ηρακλείου και Λασιθίου αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον να αναφερθεί, ότι η

ανίχνευση του ιού αφορούσε στο μεγαλύτερο μέρος της δείγματα της συλλογής

του εργαστηρίου (2012-2016), σε αντίθεση με τα προσφάτως συλλεχθέντα

(2017-2019). Ωστόσο παρατηρήθηκε, ότι το ποσοστό των δειγμάτων του

εργαστηρίου στα οποία ανιχνεύτηκε ο PMMoV, σε σχέση με το συνολικό αριθμό

τους, είναι σημαντικά μικρότερο (31,9%) από το αντίστοιχο εκείνων που

συλλέχθηκαν τα έτη 2017-2019 (68,1%). Τα αρνητικά στον PMMoV δείγματα,

πιθανόν να είχαν άλλους ιούς του γένους Tobamovirus, αφού όπως έχει ειπωθεί

στο Κεφάλαιο 1, τα συμπτώματα των ιών του γένους αυτού (TMV, ToMV) αλλά

και του CMV στο φυτό της πιπεριάς, είναι παρόμοια.

Πίνακας 2.4 Παρουσία του ιού σε δείγματα πιπεριάς που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές της χώρας.

Γεωγραφικά διαμερίσματα Αριθμός δειγμάτων όπου ανιχνεύτηκε

ο ιός/Συνολικός αριθμός που

ελέγχθηκε

Κεντρική Μακεδονία (Λάκωμα Θεσσαλονίκης,

Άγιος Γεώργιος Ημαθίας, Πτολεμαΐδα)

1/25

Θράκη (Ορεστιάδα) 0/4

Ήπειρος (Πλατάνια Ιωαννίνων) 0/27

Θεσσαλία (Τρίκαλα, Καρδίτσα, Καλαμπάκα,

Βελεστίνο)

0/26

Στερεά Ελλάδα (Δομοκός, Αθήνα) 1/21

Κρήτη (Ηράκλειο, Ιεράπετρα, Μεσσαρά,

Τυμπάκι)

77/174

Πελοπόννησος (Σκουροχώρι, Αρκαδία,

Κυπαρισσία)

0/4

Σύνολο: 79/281

42

2.3.2 Έλεγχος σπορομερίδων για παρουσία του PMMoV και

σπορομετάδοση

Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι στις σπορομερίδες των τριών ποικιλιών

ανιχνεύτηκαν ιοί του γένους Tobamovirus, ενώ σε καμιά σπορομερίδα δεν

ανιχνεύτηκε ο PMMoV. Οι ιοί που ανιχνεύτηκαν, ήταν ο ToMV από την ποικιλία

Μακεδονικό, με ομοιότητα 99% με μία απομόνωση της Αμερικής και ο TMV από

την ποικιλία LOBARDO, με ομοιότητα 99% με μία απομόνωση της Κίνας. Τέλος,

κανένα από τα φυτά των σπορομερίδων δεν εμφάνισε συμπτώματα προσβολής,

καθώς επίσης, βρέθηκαν αρνητικά με τη μέθοδο RT-PCR.

2.4 Συζήτηση

Ο ιός PMMoV έχει βρεθεί σε πολλές χώρες παγκοσμίως. Συγκεκριμένα,

στην περιοχή της Μεσογείου, και ιδιαίτερα στην Τουρκία, ο ιός ανιχνεύτηκε σε

27/3000 πιπεριές στις περιοχές των Αδάνων, της Ατάλιας, του Καχραμάνμαρας,

της Μερσίνας και της Σανλιούρφας (Çağlar et al., 2013), οι οποίες είναι όλες

επαρχιακές πόλεις της Νότιας Τουρκίας με αυξημένη παραγωγή πιπεριάς. Ακόμη

ένα παράδειγμα γεωγραφικής εξάπλωσης του ιού, είναι της Ιαπωνίας, στην

οποία πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες στις περιοχές του Χοκάιντο,

Τοχοκού, Καντό, Τσούμπου, Κίνκι, Τσουγκόκου-Σικόκου και Κιούσου-Οκινάουα.

Ελέγχθηκαν 185 φυτά τα έτη 2008-2011, εκ των οποίων τα 140 βρέθηκαν

θετικά στον PMMoV (76%) (Haramoto et al., 2013).

Ο ιός, με τα μέχρι τώρα δεδομένα, φαίνεται να έχει εμφανιστεί στην

Ελλάδα την τελευταία δεκαετία (από το 2012). Παλαιότερες μελέτες, είχαν

αναφέρει την ανίχνευση ενός ιού στην Κρήτη, με παρόμοια συμπτώματα στην

πιπεριά, ο οποίος θεωρήθηκε στέλεχος του TMV (Avgelis, 1986). Παρόλα αυτά,

καμία περαιτέρω έρευνα δεν πραγματοποιήθηκε, ώστε να ταυτοποιηθεί το

στέλεχος αυτό με τον PMMoV. Συμπερασματικά, οι μελέτες που αφορούν τη

συχνότητα εμφάνισης, τη γεωγραφική κατανομή και την εξάπλωσή του ιού στη

χώρα μας εκλείπουν, με την παρούσα μελέτη να αποτελεί την πρώτη επίσημη

αναφορά του PMMoV στην Ελλάδα.

Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ο ιός ανιχνεύτηκε σχεδόν εξ

ολοκλήρου, στην Κρήτη. Οι πιθανοί λόγοι, για τους οποίους παρατηρείται

43

εντονότερα ο ιός εκεί είναι, ότι η πιπεριά καλλιεργείται πολύ περισσότερο, σε

σχέση με άλλες περιοχές της Ελλάδας. Η διακίνηση ξενικών ποικιλιών/υβριδίων

σπόρου είναι μεγάλη και ως εκ τούτου, υπάρχει μεγάλη πιθανότητα εισαγωγής

μολυσμένου σπόρου από το εξωτερικό. Έχει μεγάλη σημασία, ότι το ποσοστό

ανίχνευσης του ιού τα τελευταία χρόνια (2017-2019), είναι εμφανώς

μεγαλύτερο από ότι στο παρελθόν, το οποίο μπορεί να σημαίνει την ταχύτατη

διάδοση του. Ωστόσο, λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων που ελέγχθηκαν

από την Ηπειρωτική Ελλάδα, υπάρχει η πιθανότητα ύπαρξης του PMMoV σε

μεγαλύτερο ποσοστό από αυτό που αναφέρεται στην παρούσα εργασία.

Μέσω της πιθανής διακίνησης μολυσμένου σπόρου πιπεριάς, όπως

ειπώθηκε παραπάνω, έχει διευκολυνθεί η ακούσια διασπορά του ιού στην

Κρήτη. Στην παρούσα εργασία, βρέθηκαν αρνητικοί οι σπόροι πιπεριάς που

ελέγχθηκαν για τον PMMoV. Ωστόσο, δεν πρέπει να παραλειφθεί, ότι οι ποικιλίες

που ελέγχθηκαν, δεν αφορούσαν ποικιλίες που καλλιεργούνται στην Κρήτη. Οι

ιοί που βρέθηκαν στις σπορομερίδες, ήταν οι TMV και ToMV. Όταν ο σπόρος

βλαστάνει, ο ιός μπορεί να εισέρχεται από το εξωτερικό περίβλημα στο

σπορόφυτο, μέσω μικρών εγκοπών/τραυμάτων, που προκαλούνται από τους

καλλιεργητικούς χειρισμούς/μεταφύτευση. Με την απουσία επαφής

περιβλήματος-ενδοσπερμίου, καθώς και με τον διαχωρισμό του περιβλήματος

από τα φυτάρια κατά την βλάστησή του, υπάρχει το ενδεχόμενο αδυναμίας

μόλυνσης του σποροφύτου. Αυτή ίσως είναι η πιθανή αιτία που τα σπορόφυτα

στην παρούσα εργασία, βρέθηκαν αρνητικά στους TMV και ToMV.

Συμπερασματικά, δεν αποκλείεται και η παρουσία άλλων ιών του γένους

Tobamovirus σε ποικιλίες/υβρίδια πιπεριάς στη Ελλάδα. Ωστόσο, η παρουσία

τους χρήζει περεταίρω διερεύνηση. Ως συμπέρασμα, συνετό θα ήταν να

ελεγχθεί επιπλέον φυτικό υλικό και σπορομερίδες από ποικιλίες και υβρίδια που

καλλιεργούνται στην Κρήτη, καθώς και περισσότερα φυτά πιπεριάς από την

υπόλοιπη Ελλάδα, ώστε να υπάρχει μια πιο ολοκληρωμένη και σαφής εικόνα για

το εύρος διασποράς του ιού.

44

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3o Μελέτη του εργαστηριακού εύρους ξενιστών του

PMMoV

45


Από την απαρχή της μελέτης ιολογικών ασθενειών των φυτών, οι

ερευνητές έχουν αναζητήσει εναλλακτικά φυτά ξενιστές, όταν μελετούσαν

νέους ιούς, ιδιαίτερα εκείνων που είναι μεταδιδόμενοι με φυτικό εκχύλισμα. Οι

χρήσεις των φυτοδεικτών είναι πολλές και έχουν καταστεί ένα σημαντικό

εργαλείο στην έρευνα. Πρώτον, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να

επιβεβαιώσουν την παρουσία ενός ιού σε άλλο φυτό, που έχει ασαφή ή

απροσδιόριστα συμπτώματα. Δεύτερον, είναι χρήσιμοι για την ανίχνευση

λανθάνουσας μόλυνσης από ιούς. Τρίτον, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον

διαχωρισμό στελεχών του ίδιου ιού, τα οποία εμφανίζονται μαζί σε ένα φυτό

(Matthews, 1949). Τέταρτον, είναι δυνατόν να εντοπιστεί ένας ιός, ο οποίος

μπορεί να είναι ήδη γνωστός, αλλά να αποκρύπτεται με την μόλυνση σε έναν

ασυνήθιστο φυτό ξενιστή. Τέλος, ένα φυτοδείκτης μπορεί να επιτρέπει την

ποσοτική μελέτη ενός ιού, λόγω του σχηματισμού τοπικών κηλίδων, χωρίς

διασυστηματική μετακίνηση.

H πιπεριά (Capsicum spp.) είναι ο κύριος φυσικός ξενιστής του PMMoV.

Μέχρι σήμερα πληθώρα μελετητών έχουν πραγματοποιήσει μολύνσεις, σε

τουλάχιστον 24 είδη της οικογένειας των Solanaceae (από 6 γένη) και σε πέντε

είδη φυτών, που ανήκουν στις οικογένειες Chenopodiaceae, Cucurbitaceae,

Labiatae και Plantaginaceae. Συγκεκριμένα, τα φυτά που έχουν χρησιμοποιηθεί

για τη μελέτη του εργαστηριακού εύρους του ιού, είναι τα: Chenopodium

amaranticolor, Nicotiana spp., C. quinoa, Ocimum basilicum, Petunia hybridia

κ.ά. (Wetter et al., 1984, Kalman et al., 2001, Toyoda et al., 2004, Hattab et

al., 2006, Velasco et al., 2002).

Οι περισσότερες μελέτες, που έχουν πραγματοποιηθεί, ώστε να

μελετηθεί η πιθανότητα μόλυνσης φυτών της οικογένειας των Solanaceae και

συγκεκριμένα της τομάτας από τον PMMoV, αποδεικνύουν, ότι ο ιός δεν έχει

την ικανότητα να σπάσει την ανθεκτικότητα των γονιδίων της έναντι σε αυτόν

(Wetter et al., 1984, Garcia-Luque et al., 1990, Alonso et al., 1991, Kirita et al.,

1997, Hattab et al., 2006, Hudcovicova et al., 2015, Milosevic et al., 2015).

Ωστόσο, ελάχιστες είναι οι μελέτες που καταδεικνύουν το αντίθετο (Mizumoto

et al., 2014, Petrov, 2014, Huseynova et al., 2018, USDA, 2018, DPIRD, 2019).

46

Σκοπός του κεφαλαίου αυτού, ήταν η πραγματοποίηση μηχανικής

μόλυνσης σε ήδη γνωστούς φυτοδείκτες, αλλά και η αξιολόγηση της

πιθανότητας μόλυνσης ορισμένων ποικιλιών/υβριδίων τομάτας, που

καλλιεργούνται στην Ελλάδα.


3.2.1 Φυτικό υλικό

Για την διερεύνηση του εργαστηριακού εύρους των ξενιστών του PMMoV

έγιναν μολύνσεις σε συνθήκες εργαστηρίου σε διάφορα είδη φυτοδεικτών,

καθώς και σε ορισμένα ποικιλίες/υβρίδια τομάτας. Ιδιαίτερα, οι μολύνσεις έγιναν

στους φυτοδείκτες: Nicotiana benthamiana, N. rustica, N. tabacum var.

samsun, N. tabacum var. xanthi, Physalis floridana καθώς και στα υβρίδια

τομάτας VP1, Bella alma, Linnea, Lenora, Clx και Cabrera. Μολύνθηκαν 8 φυτά

από κάθε φυτοδείκτη/υβρίδιο τομάτας, ενώ οι ποικιλίες/υβρίδια τομάτας που

μολύνθηκαν προσφέρθηκαν από την Εταιρία Agris.

3.2.2 Διαδικασία μηχανικών μολύνσεων

Οι δοκιμές μηχανικής μετάδοσης του ιού πραγματοποιήθηκαν όταν τα

φυτά ήταν στο στάδιο των πρώτων πραγματικών φύλλων. Ως μόλυσμα

χρησιμοποιήθηκε ιστός πιπεριάς μολυσμένος με τον PMMoV σε φωσφορικό

διάλυμα pH 7,0 σε αναλογία 1:10 (1 gr φυτικού ιστού σε 10 gr διαλύματος).

Ακολούθησε επίπαση των φύλλων με σκόνη carborundum και η μόλυνση των

φυτών. Αμέσως μετά, τα φυτά ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια,

μεταφέρθηκαν σε θάλαμο (θερμοκρασίες ημέρας/νύχτας κατά μέσο όρο

25/18°C αντίστοιχα) για χρονικό διάστημα 4 έως 5 εβδομάδων για αξιολόγηση.

3.2.3 Εκχύλιση ολικού RNA

Για τη μοριακή ανίχνευση του ιού, η εκχύλιση ολικού RNA

πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το τροποποιημένο πρωτόκολλο των

Chatzinasiou et al., (2010). (Παράρτημα).

47

3.2.4 RT-PCR για ανίχνευση του PMMoV

Για τη μοριακή ανίχνευση του ιού χρησιμοποιήθηκε μέθοδος RT-PCR

όπως περιεγράφηκε στο Κεφάλαιο 2.


αγαρόζης

Για την ανάλυση των προϊόντων της PCR, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος

ανάλυσης με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως περιεγράφηκε στο

Κεφάλαιο 2.


Ο ιός μόλυνε το σύνολο των φυτοδεικτών και προκάλεσε συμπτώματα

όπως τοπικές χλωρωτικές κηλίδες, παραμόρφωση, συστροφή κορυφαίων

φύλλων και μεσονεύρια χλώρωση (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.1). Ωστόσο, ο ιός δεν

μόλυνε κανένα υβρίδιο τομάτας.

Πίνακας 3.1 Συμπτώματα φυτοδεικτών, ύστερα από μηχανική μόλυνση με τον PMMoV.

Φυτικό είδος Συμπτώματα

Nicotiana benthamiana

Παραμόρφωση και συστροφή κορυφαίων φύλλων

N.glutinosa Τοπικές χλωρωτικές κηλίδες

N.rustica Τοπικές χλωρωτικές κηλίδες

N.tabacum var. samsun

Μεσονεύρια χλώρωση

N.tabacum var. xanthi Τοπικές χλωρωτικές κηλίδες

Physalis floridana Παραμόρφωση και συστροφή κορυφαίων φύλλων, έντονη μεσονεύρια χλώρωση

48


Πολλές μελέτες έχουν γίνει μέχρι σήμερα παγκοσμίως, ώστε να

διαπιστωθεί το εργαστηριακό εύρος του ιού σε φυτοδείκτες, (Kirita et al., 1997,

Velasco et al., 2002, Adkins et al., 2003, Hattab et al., 2006, Çağlar et al., 2012,

Mizumoto et al., 2014, Milosevic et al., 2015). Όσον αφορά την ανθεκτικότητα

της τομάτας στον PMMoV, τα αποτελέσματα των ερευνητών διίστανται.

Ορισμένες μελέτες έδειξαν ότι η τομάτα είναι άνοση/ανθεκτική στον ιό (Wetter

et al., 1984, Garcia-Luque et al., 1990, Alonso et al., 1991, Kirita et al., 1997,

Hattab et al., 2006, Hudcovicova et al., 2015, Milosevic et al., 2015), ενώ άλλες,

έδειξαν ότι ορισμένα στελέχη του ιού είναι ικανά να μολύνουν τη τομάτα

Εικόνα 3.1

Φυτοδείκτης Physalis floridana. Αριστερά: Μάρτυρας χωρίς συμπτώματα. Δεξιά: Μολυσμένο φυτό με

συμπτώματα παραμορφώσεων και συστροφής στα κορυφαία φύλλα καθώς και έντονης μεσονέυριας

χλώρωσης. Γ. Φυτοδείκτης N. benthamiana. Αριστερά: Μάρτυρας χωρίς συμπτώματα. Δεξιά: Μολυσμένο

φυτό με συμπτώματα παραμορφώσεων και συστροφής στα κορυφαία φύλλα. Δ. Φυτοδείκτης N.rustica.

Αριστερά και δεξιά: Μολυσμένα φυτά με σύμπτωμα τοπικών χλωρωτικών κηλίδων. Ε. Φυτοδείκτης N.

glytinosa. Μολυσμένα φύλλα με συμπτώματα τοπικών χλωρωτικών κηλίδων.

49

(Mizumoto et al., 2014, Petrov, 2014, Huseynova et al., 2018, USDA, 2018,

DPIRD, 2019).

Στην παρούσα έρευνα, μελετήθηκε εργαστηριακά το εύρος ξενιστών του

PMMoV σε φυτοδείκτες αλλά και σε φυτά τομάτας. Ιδανικός, είναι ο

φυτοδείκτης, ο οποίος έχει εύκολη και γρήγορη ανάπτυξη, διαθέτει μεγάλα

φύλλα για μηχανική μόλυνση, αλλά κυρίως αντιδρά γρήγορα και με

χαρακτηριστικά συμπτώματα τοπικών κηλίδων στα μολυσμένα φύλλα. Είναι

σημαντικό, οι κηλίδες που θα σχηματιστούν να παραμένουν ευδιάκριτες, ενώ

δεν θα πρέπει να εμφανιστεί διασυστηματική μόλυνση. Τα φυτά του καπνού

είναι πιο ευαίσθητα σε περισσότερους ιούς, σε σχέση με άλλα. Εδώ και χρόνια,

χρησιμοποιείται σαν φυτοδείκτης, το Nicotiana glutinosa, το οποίο είναι

κατάλληλο για μηχανικές μολύνσεις ιών του γένους Tobamovirus. Αντιδρά με

ξεκάθαρες, ευδιάκριτες τοπικές κηλίδες, οι οποίες είναι εύκολα μετρήσιμες, ενώ

δεν εκτείνονται παραπάνω. Τη θέση του σταδιακά παίρνουν τα φυτά καπνού,

N. tabacum και ιδιαίτερα ποικιλίες αυτής, όπως είναι το N. tabacum xanthi.

(Smith, 1977). Για αυτούς τους λόγους επιλέχθηκαν τα φυτά N. benthamiana,

N. glutinosa, N. rustica, N. tabacum var. samsun, N. tabacum var. xanthi και

Physalis floridana στην συγκεκριμένη εργασία, ενώ έγιναν παράλληλα μηχανικές

μολύνσεις στα υβρίδια/ποικιλίες τομάτας: Amarylis, VP1, Bella alma, Lenora, Clx

και Cabrera.

Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν, ότι όλοι οι φυτοδείκτες

μολύνθηκαν σε ποσοστό 100%, με συμπτώματα είτε νεκρωτικών κηλίδων, είτε

μωσαϊκών στα φύλλα, είτε χλωρώσεων. Συγκεκριμένα, το φυτό N. benthamiana

εμφάνισε παραμόρφωση και συστροφή, ενώ σε άλλες μελέτες εμφανίζει και

ρυτίδωση. Τα N. glutinosa, N. rustica και N. tabacum var. xanthi, εμφάνισαν

τυπικά συμπτώματα τοπικών κηλίδων στα μολυσμένα φύλλα, όπως ακριβώς

επιβεβαιώνεται και από την βιβλιογραφία. Το N. tabacum var. samsun, ενώ στην

παρούσα εργασία εμφάνισε μεσονεύρια χλώρωση στα μολυσμένα φύλλα, η

βιβλιογραφία αναφέρει συμπτώματα ξηρών νεκρωτικών κηλίδων. Τέλος, το

Physalis floridana, εμφάνισε συμπτώματα παραμορφώσεων και συστροφής στα

κορυφαία φύλλα καθώς και ύπαρξη έντονης μεσονέυριας χλώρωσης, ενώ στην

βιβλιογραφία αναφέρονται συμπτώματα διασυστηματικής ποικιλοχλώρωσης και

50

παραμόρφωσης στα εμβολιασμένα φύλλα. Σε αντίθεση με τους φυτοδείκτες,

κανένα φυτό τομάτας δεν μολύνθηκε, αλλά ούτε υπήρξε κάποια λανθάνουσα

μόλυνση σε αυτές. Το αποτέλεσμα αυτό, έρχεται σε αντίθεση με μέρος της

βιβλιογραφίας, όπου μηχανικώς μολυσμένα φυτά τομάτας, διαφορετικών

ωστόσο υβριδίων/ποικιλιών, εμφάνισαν συμπτώματα στα φύλλα και στους

καρπούς. Εύλογο είναι το ερώτημα που προκύπτει, εάν οι ποικιλίες/υβρίδια

τομάτας, που έχουν μολυνθεί μέχρι σήμερα με ξενικό στέλεχος του PMMoV,

μπορούν επίσης να μολυνθούν με ελληνικές απομονώσεις του.

51

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4o Μοριακός χαρακτηρισμός απομονώσεων και γενετική

παραλλακτικότητα του PMMoV

52


Ο ιοί του γένους Tobamovirus εμφανίζουν μικρή παραλλακτικότητα λόγω

του γεγονότος ότι έχουν πολύ σταθερό γονιδίωμα, (Dombrovsky et al., 2017).

Η μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας του PMMoV αποτέλεσε το

αντικείμενο πολλών ερευνητών τα τελευταία χρόνια (Rodriguez-Cerezo et al.,

1989, Wang et al., το 2006, Kraft et al., 2014, Milosevic et al., το 2015, Han et

al., το 2017, Guan et al., 2018, Yu et al., το 2019) και έχει διαπιστωθεί ότι ο

PMMoV παρουσιάζει ταχεία δυναμική εξέλιξης, ενώ αναδύεται ως ένα από τα πιο

καταστροφικά παθογόνα της πιπεριάς.

Τα γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αναλύσεις του ιού είναι η RdRp, η

MP και η CP. Στη βάση δεδομένων NCBI, αρκετές είναι οι διαθέσιμες

αλληλουχίες απομονώσεων του ιού (Hagiwara et al., 2002, Velasco et al., 2002,

Antignus et al., 2008, Han et al., 2017, Choi et al., 2016). Οι φυλογενετικές

αναλύσεις για τα γονίδια της CP και της MP κατατάσσουν τις απομονώσεις του

ιού σε 2 έως 4 υπερομάδες (Rodriguez-Cerezo et al., 1989, Wang et al., 2006,

2010, Guan et al., 2018, Milosevic et al., 2015), ενώ για ολόκληρο το γονιδίωμα

του, σε 2 (Oliveira et al., 2010, Guardado, 2017, Han et al., 2017, Yu et al.,

2019) ή 3 (Tena et al., 2012). Τέλος, από τη σύγκριση των νουκλεοτιδικών

αλληλουχιών, αλλά και από τη δημιουργία φυλογενετικών δέντρων στο σύνολο

των ερευνών, προκύπτει η χαμηλή γενετική παραλλακτικότητα του ιού μέσα

στα χρόνια.

Στη χώρα μας μέχρι σήμερα, δεν έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες που να

αφορούν τη γενετική παραλλακτικότητα του PMMoV. Ως εκ τούτου, στο

Κεφάλαιο 4, διερευνήθηκε η γενετική παραλλακτικότητα απομονώσεων του ιού,

που προέρχονταν από ποικιλίες/υβρίδια πιπεριάς, οι οποίες συλλέχθηκαν από

ορισμένες περιοχές της χώρας. Για το μοριακό χαρακτηρισμό των απομονώσεων

του ιού και για τη φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα γονίδιο της CP,

της MP καθώς και ολόκληρο το γονιδίωμα.

53


4.2.1 Απομονώσεις του PMMoV

Για τη μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας του PMMoV

χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 15 απομονώσεις του ιού, οι οποίες προέρχονταν

από δείγματα που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές της χώρας μας (Πίνακας

4.1).

Πίνακας 4.1 Προέλευση, ονομασία ποικιλίας/υβριδίου και κωδικός πρόσβασης των απομονώσεων που χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας του PMMoV.

Κωδικός απομόνωσης

Προέλευση Ονομασία ποικιλίας/υβριδίου

Έτος συλλογής

Πι3131 Ημαθία Άγνωστη 2016

Πι528 Ηράκλειο Άγνωστη 2016

Πι563 Λασίθι Lyra 2017

Πι565 Λασίθι Ντολμά 2017

Πι571 Λασίθι Φλωρίνης 2017

Πι574 Ηράκλειο Βelissa 2017

Πι610 Λασίθι Άγνωστη 2017

Πι614 Λασίθι Odisseo 2017


Πι620 Λασίθι Zannet 2018

Πι632 Ηράκλειο Belissa 2018


Πι665 Αττική Άγνωστη 2018

Πι674 Ηράκλειο Belissa 2018

Πι700 Λασίθι Zannet 2019

4.2.2 Εκχύλιση ιικού RNA και προσδιορισμός της αλληλουχίας των

γονιδίων CP, MP

Επιλέχθηκαν δείγματα πιπεριάς (φύλλα και καρποί), 15 απομονώσεων

του ιού και στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση ολικού RNA, σύμφωνα

με το τροποποιημένο πρωτόκολλο των Chatzinasiou et al., (2010).

(Παράρτημα).

4.2.3 Ανάπτυξη εξιδεικευμένης RT-PCR για τον πολλαπλασιασμό των

γονιδίων CP, MP

Για τον πολλαπλασιασμό του γονιδίου της CP χρησιμοποιήθηκε η

μέθοδος RT-PCR, που αναπτύχθηκε στο Κεφάλαιο 2. Για την ανίχνευση και την

αλληλούχηση του γονιδίου της MP σχεδιάστηκαν εκκινητές (Πίνακας 4.2) που

54

πολλαπλασιάζουν ολόκληρο το γονίδιο της MP. Η ευθυγράμμιση και στοίχιση

των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος MEGA

έκδοση 7 (Tamura et al., 2016). Για τον πολλαπλασιασμό του γονιδίου της MP

χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος RT-PCR, που αναπτύχθηκε στο Κεφάλαιο 2 με τις

εξής διαφορές: Η υβριδοποίηση των εκκινητών με το εκμαγείο,

πραγματοποιήθηκε στους 58 °C για 30’’ και η επέκταση των αλυσίδων στους 72

°C για 30’’.

Πίνακας 4.2 Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό του γονιδίου της ΜΡ (PMMoV-Fm, PMMoV-Rm). Πηγή: Παρούσα εργασία.

Εκκινητής Αλληλουχία

Εκκινητή (5’-3’)

F ανοδικός

R καθοδικός

Γονίδιο-

στόχος

Προϊόν

(μέγεθος)

PMMoV-Fm CGT TGA ACA ATT GTG CGT AC F

MP

946

ζεύγη βάσεων

PMMoV-Rm CAG AAC CTA AAT ACA CTA ATT

GAT T

R

4.2.4 Προσδιορισμός της πλήρους αλληλουχίας

Για το σκοπό αυτό, επιλέχθηκαν τρεις απομονώσεις του ιού, οι οποίες

προέρχονταν από το Ηράκλειο (απομόνωση Πι528), την Αττική (απομόνωση

Πι665) και το Λασίθι (απομόνωσηΠι620). Οι απομονώσεις αυτές επιλέχθηκαν,

λόγω της μεγαλύτερης παραλλακτικότητας τους, σε σχέση με τις υπόλοιπες, το

οποίο προέκυψε από την φυλογενετική ανάλυση του συνόλου των

απομονώσεων (Παράγραφος 4.3.3).

4.2.5 Ανάπτυξη εξιδεικευμένων δοκιμών RT-PCR για τον

πολλαπλασιασμό ολόκληρου του γονιδιώματος

Για την ανίχνευση και αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος

σχεδιάστηκαν 10 ζεύγη εκκινητών (Πίνακας 4.3) που πολλαπλασιάζουν το

σύνολο του γονιδιώματος του ιού. Η ευθυγράμμιση και στοίχιση των

νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος MEGA

έκδοση 7 (Tamura et al., 2016). Το πρωτόκολλο θερμοκυκλοποίησης

περιλάμβανε τα ίδια στάδια που αναλύθηκαν στο Κεφάλαιο 2, με την διαφορά

στην επέκταση των αλυσίδων, η οποία πραγματοποιήθηκε στους 72 °C για 35’’.

55

Πίνακας 4.3 Αλληλουχίες των 10 εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την πλήρη αλληλούχηση του

γονιδιώματος του PMMoV Πηγή: Παρούσα εργασία.

Εκκινητής Αλληλουχία Εκκινητή (5’-3’)

F ανοδικός R καθοδικός

Μέγεθος προϊόντος

(ζεύγη βάσεων)

F1 GTA AAT TTT TCA CAA TTT AAC AAC

AAC

F

800

R812 GCG CCT ATG TCG TCA AG R

F709 GCA GCA CTT CTG AGG AGA AAT GTT

CAT G

F

799

R1508 GAT TTG GAA TGC ACT TGG AAT TT R

F1243 GAG GTC ATG GTC AGC AAG GAC F 1018 R2261 TTG ATT ATC TTC TTC AGG TTT GA R

F2146 CAG ATG CAT GCG ATG GTG F

772 R2918 GGA TAG GGA AAA GTT GCA ACT R

F2724 GAC GGT AGA CTC TTT CTT AAT GAA TTA

F 810

R3534 GTT TCC CGG CAA ACA CTT R

F3376 AGT AGT TAC CTG TTA GAT ATG TAC AAA G

F 803

R4179 AAA TTC TTC GAT CTG TGT AGG C R

F4024 TAC CCG GCT TTG CAA AC F

760 R4784 TAG TAC GCA CAA TTG TTC AAC G R

F4577 ATT TTG AAG CCA AGT TGT TTA GG F 864 R5441 ATT TTC TCT CTC AAG CCT AAT TTT AT R

F5260 GCC TTC AAA TTG ATC CCG AAT TA F 834 R6094 GTG CCA CGA ACT AAC TCA TT R

F5939 CGG AGC CTT TGA TAC TAG G F

418 R6357 TGG GCC GCT ACC CGC R

4.2.6 Καθαρισμός προϊόντων PCR-Αλληλούχηση κατά Sanger

Η διαδικασία που ακολουθήθηκε, ήταν ίδια με αυτήν που περιγράφηκε

στην Παράγραφο 2.2.7, με την διαφορά, ότι εδώ προσδιορίστηκαν οι

αλληλουχίες των γονιδίων της CP και της MP.

4.2.7 Ανάλυση των αλληλουχιών και κατασκευή φυλογενετικών

δέντρων

Οι αλληλουχίες των ελληνικών απομονώσεων του PMMoV, που προήλθαν

από την παρούσα έρευνα, συγκρίθηκαν με τις κατατεθειμένες στη διαδικτυακή

βάση δεδομένων του NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), μέσω εφαρμογής

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

56

του αλγόριθμου BLAST. Η παραλλακτικότητα μεταξύ των απομονώσεων, που

αλληλουχήθηκαν στην παρούσα μελέτη, προσδιορίστηκε σε επίπεδο

νουκλεοτιδίων, αλλά και σε επίπεδο αμινοξέων, με το πρόγραμμα GeneDoc

(http://www.psc.edu/biomed/genedoc).

Για την μελέτη της φυλογενετικής συγγένειας, των γονιδίων της CP και

της MP των απομονώσεων του PMMoV, πραγματοποιήθηκε σύγκριση των

ελληνικών απομονώσεων, με αντίστοιχες δημοσιευμένες αλληλουχίες από τη

βάση δεδομένων NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), χρησιμοποιώντας τις

τιμές παραλλακτικότητας κατά ζεύγη που υπολογίστηκαν με την παράμετρο p‐

distance του λογισμικού MEGA έκδοση 7.0 (Tamura et al., 2016) όπου έγινε και

η φυλογενετική ανάλυση. Η στοίχιση πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο

CRUSTALW του προγράμματος MEGA έκδοση 7.0 (Tamura et al., 2016). Τα

κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης νουκλεοτιδίων βρέθηκαν χρησιμοποιώντας

το ίδιο πρόγραμμα.

Για την κατασκευή των φυλογενετικών δένδρων, επιλέχθηκε το μοντέλο

εξέλιξης GTR, General time Reversible Model (Nei et al., 2000). Ο υπολογισμός

των φυλογενετικών σχέσεων, έγινε με τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας

(Maximum Likelihood, ML), στο πρόγραμμα MEGA version 7 (Tamura et al.,

2016), ενώ η αξιοπιστία της φυλογενετικής υπόθεσης αξιολογήθηκε με τη

χρησιμοποίηση της μη παραμετρικής ανάλυσης (Non Parametric Bootstrap,

NPB), (1000 επαναλήψεις).


4.3.1 Ενίσχυση του γονιδίου της CP, MP και ολόκληρου του

γονιδιώματος

Με την εφαρμογή της εστιασμένης RT-PCR που αναπτύχθηκε στην

παρούσα εργασία, πολλαπλασιάστηκαν και προσδιορίστηκαν οι αλληλουχίες της

CP και της MP 15 απομονώσεων του ιού από διάφορες περιοχές της χώρας,

καθώς επίσης προσδιορίστηκε και το σύνολο του γονιδιώματος 3 απομονώσεων

του, που προέρχονταν από 2 περιοχές της χώρας (Κρήτη, Αττική). Με τη

βοήθεια των κατάλληλων προγραμμάτων οι αλληλουχίες στοιχήθηκαν και

απομονώθηκαν τα γονίδια της CP και MP. Οι αλληλουχίες των 15 απομονώσεων

http://www.psc.edu/biomed/genedoc


57

που προσδιορίστηκαν αναφέρονται στο Παράρτημα 3. Με τη μέθοδο Sanger

αποκτήθηκαν οι αλληλουχίες του γονιδίου της CP και MP με μήκος 747 ζευγών

βάσεων και 946 ζευγών βάσεων αντίστοιχα, αλλά και οι αλληλουχίες ολόκληρου

του γονιδιώματος (αφαιρέθηκαν τμήματα αλληλουχιών που προέρχονταν από

τις αμετάφραστες περιοχές).

4.3.2 Συγκριτική ανάλυση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών

Τα αποτελέσματα της συγκριτικής ανάλυσης των αλληλουχιών των

ελληνικών απομονώσεων, αναδεικνύουν την ύπαρξη χαμηλή γενετικής

παραλλακτικότητας στο γονίδιο της CP του PMMoV. Τα ποσοστά

παραλλακτικότητας μεταξύ των ελληνικών απομονώσεων ήταν 94,3-100% σε

επίπεδο νουκλεοτιδίων και 96,8-100% σε επίπεδο αμινοξέων, ενώ τα ποσοστά

ομοιότητας μεταξύ ελληνικών και ξένων απομονώσεων ήταν 94,1-100% σε

επίπεδο νουκλεοτιδίων και 96,8-100% σε επίπεδο αμινοξέων.

Τα αποτελέσματα της συγκριτικής ανάλυσης των αλληλουχιών των

ελληνικών απομονώσεων αναδεικνύουν την ύπαρξη χαμηλής γενετικής

παραλλακτικότητας και στο γονίδιο της MP. Τα ποσοστά παραλλακτικότητας

μεταξύ των ελληνικών απομονώσεων για τον PMMoV ήταν 93,6-100% σε

επίπεδο νουκλεοτιδίων και 95-100% σε επίπεδο αμινοξέων, ενώ τα ποσοστά

ομοιότητας μεταξύ ελληνικών και ξένων απομονώσεων ήταν 93,6-100% σε

επίπεδο νουκλεοτιδίων και 95-100% σε επίπεδο αμινοξέων.

Τα αποτελέσματα της συγκριτικής ανάλυσης των πλήρων αλληλουχιών

των 3 ελληνικών απομονώσεων αναδεικνύουν την ύπαρξη χαμηλής γενετικής

παραλλακτικότητας στο σύνολο του γονιδιώματος του ιού. Τα ποσοστά

παραλλακτικότητας μεταξύ των ελληνικών απομονώσεων για τον PMMoV ήταν

93,9-97% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και 96,5-98,2% σε επίπεδο αμινοξέων, ενώ

τα ποσοστά ομοιότητας μεταξύ ελληνικών και ξένων απομονώσεων ήταν 93,8-

99,8% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και 96,4-99,6% σε επίπεδο αμινοξέων.

58

4.3.3 Φυλογενετική ανάλυση

Η φυλογενετική ανάλυση της CP, κατέταξε τις ελληνικές απομονώσεις σε

τρείς ομάδες. Στον πρώτο κλάδο 9 ελληνικές απομονώσεις βρίσκονται μαζί με

απομονώσεις από τη Βραζιλία (AB550911), τη Κίνα (KU646837, MG515725),

την Ισπανία (KX063611), τις ΗΠΑ (MH063882, NC003630), την Ιαπωνία

(AB113117), τη Ν. Κορέα (KX399390) και τη Βενεζουέλα (KU312319). Ο

δεύτερο κλάδος περιλαμβάνει 6 ελληνικές απομονώσεις τους, ενώ ο τρίτος

περιλαμβάνει 3 ελληνικές και μια από τη Νότια Κορέα (LC082100). Η

φυλογενετική ανάλυση της MP κατέταξε τις ελληνικές απομονώσεις σε τρεις

ομάδες, επίσης. Στον πρώτο κλάδο, κατατάχθηκαν 6 ελληνικές μαζί με ξένες

από την Ιαπωνία (AB000709), την Αμερική (NC003630, MH063882), τη

Βενεζουέλα (KU312319), τη Κίνα (MG515725, KU646837), τη Βραζιλία

(AB550911) και τη Νότια Κορέα (KX399390). Στον δεύτερο κλάδο, 5 ελληνικές

απομονώσεις κατατάχθηκαν μαζί με απομονώσεις από την Ιαπωνία (AB276030)

και τη Νότια Κορέα (LC082099). Στον τρίτο κλάδο, εκτός από τις ελληνικές,

κατατάχθηκε και μία από την Ν. Κορέα (LC082100). Η φυλογενετική ανάλυση

ολόκληρου του γονιδιώματος κατέταξε τις τρεις ελληνικές απομονώσεις σε τρεις

κλάδους. Οι τρεις αυτές απομονώσεις, επιλέχθηκαν με το κριτήριο ότι η καθεμία

ανήκει στους 3 διαφορετικούς κλάδους της φυλογενετικής ανάλυσης της CP και

της MP. Στον πρώτο κλάδο, η απομόνωση από την Αττική (Αθήνα) κατατάχθηκε

μαζί με απομονώσεις από την Ισπανία (KX063611), τη Κίνα (MG515725), την

Αμερική (MH063882), τη Βενεζουέλα (KU312319), τη Βραζιλία (AB550911), την

Ινδία (KJ631123), τη Ν. Κορέα (KX399390) και την Ιαπωνία (AB000709). Στον

δεύτερο κλάδο, η απομόνωση από την Κρήτη (Ιεράπετρα) κατατάχθηκε μόνη

της, ενώ στον τρίτο κλάδο η απομόνωση από την Κρήτη (Τυμπάκι) κατατάχθηκε

μαζί με την απομόνωση της Ν. Κορέας (LC082100) (Εικόνα 4.1, Πίνακας 4.4).

59

Εικόνα 4.1 Φυλογενετικό δένδρο που κατασκευάστηκε με ανάλυση μέγιστης πιθανοφάνειας

χρησιμοποιώντας την ομάδα ομόλογων αλληλουχιών της CP (A), της MP (B) και ολόκληρου του

γονιδιώματος (Γ) του PMMoV. Οι τιμές αριστερά στον κάθε κλάδο υποδεικνύουν το ποσοστό 1000

επαναλήψεων της ανάλυσης bootstrap, η οποία υποστηρίζει την ομαδοποίηση σε κάθε ομάδα. Η κλίμακα

αντιπροσωπεύει τον αριθμό αντικατάστασης των νουκλεοτιδίων ανά θέση. Το μήκος των βραχιόνων είναι

ανάλογο με τις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν. Με μπλε βέλος σημειώνονται οι ελληνικές

απομονώσεις που αλληλουχήθηκαν για τα γονίδια της CP και MP. Με πράσινο βέλος σημειώνονται οι

ελληνικές απομονώσεις που αλληλουχήθηκαν για ολόκληρο το γονιδίωμα. Με κόκκινο σημειώνονται οι

ομάδες που δημιουργήθηκαν κατά τη φυλογενετική ανάλυση.

60

Πίνακας 4.4 Χώρες προέλευσης και κωδικοί που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του φυλογενετικού δένδρου της CP, MP και ολόκληρου του γονιδιώματος.


Κατά το παρελθόν, έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες, για την

εξελικτική πορεία του PMMoV (Wang. et al., 2006, Milosevic et al., 2015, Han

et al., 2017, Yu et al., 2019). Τα αποτελέσματα αυτών των ερευνών, έδειξαν

τη χαμηλή γενετική παραλλακτικότητα του ιού, ενώ ταυτόχρονα την υψηλή

ομοιότητα σε επίπεδο νουκλεοτιδίων/αμινοξέων. Eίναι προφανής η υψηλή

ομοιογένεια μεταξύ των αλληλουχιών, τόσο στο σύνολο του γονιδιώματος

(Velasco et al., 2002, Kraft et al., 2014, Han et al., 2017, Yu et al., 2019) όσο

και στα γονίδια της CP (Wang et al. 2006, Matsumoto et al., 2008, Haramoto

et al., 2013, Mizumoto. et al., 2012, Peng et al., 2015, Milosevic et al., 2015,

Han et al., 2017, Guan et al., 2018 και Yu et al., 2019) της MP (Wang et al.,

2006, Han et al., 2017, Yu et al., 2019) και της RdRp (Tenllado et al., 2001,

Wang et al., 2006, Çağlar et al., 2012, Milosevic et al., 2015 και Guardado

2017). Τέλος, από την ανάλυση των φυλογενετικών δέντρων, προκύπτει ότι ο

αριθμός των ομάδων, και στις τρεις περιπτώσεις, κυμαίνεται από δύο έως

τέσσερις (Wang et al., 2006, Tena et al., 2012, Guan et al., 2018, Milosevic et

al., 2015).

Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκαν οι γονιδιακές περιοχές CP και

MP 15 ιικών απομονώσεων, ενώ αλληλουχήθηκε και το πλήρες γονιδίωμα 3

απομονώσεων, δύο από την Κρήτη και μίας από την Αττική, ώστε να

CP MP Ολόκληρο γονιδίωμα

Χώρα

Προέλευσης

Κωδικός Χώρα


Κωδικός Χώρα


Κωδικός

Αμερική MH063882 Αμερική MH063882 Αμερική MH063882

Αμερική NC003630 Αμερική NC003630 Κίνα MG515725

Κίνα MG515725 Κίνα MG515725 Ιαπωνία AB000709

Κίνα KU646837 Κίνα KU646837 Ισπανία KX063611

Ιαπωνία AB000709 Ιαπωνία AB000709 Ν. Κορέα KX399390

Ισπανία KX063611 Ισπανία KX063611 Βενεζουέλα KU312319

Ν. Κορέα KX399390 Ν. Κορέα KX399390 Ινδία KJ631123

Βενεζουέλα KU312319 Βενεζουέλα KU312319 Βραζιλία AB550911

Βραζιλία AB550911 Βραζιλία AB550911

Ν. Κορέα

LC082100 Ν. Κορέα LC082100 Ν. Κορέα LC082100

Ιαπωνία AB276030

61

αποκτήσουμε μια πιο ευρεία εικόνα για την προέλευση συγκεκριμένων

αλληλουχιών.

Η ανάλυση των αλληλουχιών ανέδειξε την ύπαρξη χαμηλής γενετικής

παραλλακτικότητας στο γονίδιο της CP, της MP και ολόκληρου του

γονιδιώματος, αφού παρατηρήθηκε ομοιότητα μεταξύ των ελληνικών και των

ξενικών απομονώσεων τόσο σε επίπεδο νουκλεοτιδίων, όσο και σε επίπεδο

αμινοξέων. Από τη δημιουργία των φυλογενετικών δέντρων, προκύπτει ότι οι

ελληνικές απομονώσεις κατατάσσονται σε 3 ομάδες. Στην περιοχή του Λασιθίου

απ’ όπου αλληλουχήθηκαν αρκετές απομονώσεις του ιού υπάρχουν τρεις

διαφορετικοί γενότυποι που κατατάσσονται στις αντίστοιχες φυλογενετικές

ομάδες και που πιθανώς υποδηλώνουν διαφορετικές προελεύσεις του ιού μέσω

του μολυσμένου σπόρου. Αντίστοιχα, οι απομονώσεις του Ηρακλείου

κατατάσσονται σε δυο διαφορετικές γενετικές ομάδες.

Συγκρίνοντας τις φυλογενετικές αναλύσεις της CP και της MP

παρατηρούμε ότι ομοιάζουν σε πολύ μεγάλο βαθμό. Ωστόσο διαπιστώθηκε

διαφορετική ταξινόμηση στην περίπτωση της απομόνωσης από την Ημαθία

(pi3131), η οποία στη φυλογενετική ανάλυση της CP κατατάσσεται στο 2ο

κλάδο, ενώ στην ανάλυση της MP κατατάσσεται στον 3ο κλάδο και στην

περίπτωση της απομόνωσης από την Αττική (pi665), η οποία εμφανίζει

διαφορετικές φυλογενετικές σχέσεις εντός της πρώτης ομάδας. Αυτά, μπορεί να

οφείλονται είτε σε πιθανότητα ενδογενούς ανασυνδυασμού, είτε σε μικτή

μόλυνση για την πρώτη απομόνωση και στην μεγάλη ομοιότητα των

αλληλουχιών στην δεύτερη. Ωστόσο, τα γεγονότα αυτά χρήζουν περαιτέρω

διερεύνησης.

Συμπερασματικά, κρίνεται απαραίτητη η ανάλυση ενός μεγαλύτερου

αριθμού απομονώσεων του ιού, που θα μας επιτρέψει να αποκτήσουμε

περισσότερες πληροφορίες, ώστε να κατανοήσουμε καλύτερα τον τρόπο με τον

οποίο η παραλλακτικότητα του PMMoV αντανακλά τη γενετική δομή, την

επιδημιολογία και την εξέλιξη των πληθυσμών του.

62

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5ο Γενική Συζήτηση/Συμπεράσματα

63

Γενική συζήτηση/Συμπεράσματα

Οι ασθένειες που οφείλονται σε ιούς του γένους Tobamovirus, είναι

αναμφισβήτητα σοβαρές, λόγω του ότι ο έλεγχός τους είναι δύσκολος έως

αδύνατος, αφού δεν υπάρχει αποτελεσματική χημική αντιμετώπιση. Οι

οικονομικές απώλειες είναι εντονότερες σε αυτούς τους ιούς, επειδή τα

συμπτώματα γίνονται εμφανή κατά τη διάρκεια της καρποφορίας πριν από τη

συγκομιδή των καλλιεργειών. Επιπλέον, οι συγκεκριμένοι ιοί, εξαπλώνονται

ευρέως μέσω του σπόρου, αλλά και μέσω της μηχανικής μετάδοσης τους

(Broadbent et al., 1965, Ozaslan, 2006).

Τα αποτελέσματα για τον PMMoV στην περιοχή της Κρήτης φαίνεται να

είναι ιδιαίτερα απειλητικά, διότι η έξαρση του ιού αναπτύχθηκε σε θερμοκήπια.

Η Κρήτη πέραν του ότι είναι σταθμός που ενώνει με το εμπόριο πολλές χώρες

της Μεσογείου, είναι και μέρος όπου ανθίζει η καλλιέργεια λαχανοκομικών, λόγω

και του ευεργετικού της κλίματος. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το δυσανάλογο

ποσοστό θετικών δειγμάτων στην Κρήτη σε σχέση με την υπόλοιπη Ελλάδα. Η

εμφάνιση του PMMoV στην υπόλοιπη Ελλάδα φαίνεται περιορισμένη, ωστόσο

τα δείγματα, τα οποία ελέγχθηκαν ήταν εμφανώς λίγα και ως εκ τούτου δεν

μπορούμε να γνωρίζουμε το πραγματικό ποσοστό μόλυνσης του ιού στην

Ηπειρωτική Ελλάδα. Οι εισαγωγές και οι εξαγωγές σπόρων έχουν γίνει

συχνότερες σε όλο τον κόσμο, καθιστώντας πολύ πιο εύκολη την μετάδοση του

PMMoV μέσω μολυσμένων σπόρων πιπεριάς. Έτσι, ο ιός μπορεί να προήλθε από

μολυσμένες εισαγόμενες σπορομερίδες. Δεδομένου ότι υπάρχει μεγάλος

κίνδυνος να παρουσιαστούν και να εξαπλωθούν περισσότεροι μολυσμένοι

σπόροι, οι μελλοντικές προσπάθειες στο φυτοϋγειονομικό σύστημα θα ήταν

συνετό να επικεντρωθούν στην έγκαιρη ανίχνευση και διάγνωση, καθώς και

στην παροχή απαραίτητων προϋποθέσεων για την επιτυχή παραγωγή πιπεριάς

στην Ελλάδα.

Περαιτέρω μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε σπορομερίδες πιπεριάς,

μας επέτρεψε να ανιχνεύσουμε τους TMV και ToMV σε αυτές, όχι όμως τον

PMMoV. Το γεγονός αυτό δεν είναι απίθανο, αφού στην Ελλάδα ενδημούν και

άλλοι ιοί του γένους Tobamovirus με τους TMV και ToMV να προϋπάρχουν εδώ

και χρόνια.

64

Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ο βιολογικός χαρακτηρισμός του ιού.

Απομονώσεις του ιού από τα φυτά πιπεριάς ήταν ικανές να προκαλέσουν

συμπτώματα σε φυτoδείκτες σε μικρό χρονικό διάστημα. Τα συμπτώματα που

εμφανίζονται στα φυτά, ως αποτέλεσμα μηχανικού εμβολιασμού με μολυσμένο

φυτικό υλικό, ανέδειξαν και εξακρίβωσαν την ύπαρξη του PMMoV από τα

δείγματα που συλλέχθηκαν. Θα πρέπει να τονιστεί ωστόσο, ότι οι φυτοδείκτες

δεν έχουν την ικανότητα ταυτοποίησης του είδους, παρά μόνο του γένους του

ιού. Τα αρνητικά αποτελέσματα των μολύνσεων σε τομάτα, συμφωνούν με ένα

μέρος της υπάρχουσας βιβλιογραφίας (Mnari-Hattab et al., 2006), εντούτοις

υφίσταται και η αντίθετη άποψη. Οι αλληλεπιδράσεις ιού-ξενιστή οφείλονται

στην έκφραση των γονιδίων του ιού, τα οποία είναι υπεύθυνα για την αντιγραφή

και τη σταθερότητα του, την ικανότητα πολλαπλασιασμού και συσσώρευσης

του σε φυτοδείκτες, την ικανότητά του να ξεπερνά τα γονίδια αντοχής της

πιπεριάς και την ανικανότητα του να μολύνει φυτά τομάτας.

Τέλος, προχωρήσαμε σε μοριακό χαρακτηρισμό της RdRp, της MP, της

CP και ολόκληρου του γονιδιώματος, ώστε να αποσαφηνιστούν οι εξελικτικές

σχέσεις και η γενετική σύσταση των απομονώσεων του ιού. Η φυλογενετική

ανάλυση κατέταξε τις ελληνικές απομονώσεις σε 3 κλάδους με την ύπαρξη

χαμηλής γενετικής παραλλακτικότητας και άρα υψηλής συγγένειας μεταξύ τους.

Οι ιοί του γένους Tobamovirus εμφανίζουν γενικά χαμηλή γενετική

παραλλακτικότητα, λόγω του πολύ σταθερού γονιδιώματος τους, το οποίο

παραμένει σχεδόν αναλλοίωτο στα χρόνια.

Η παρούσα έρευνα αποτελεί την πρώτη επιδημιολογική μελέτη στη χώρα

μας. Ως εκ τούτου, ενδιαφέρον θα είχε στο μέλλον, να μελετηθούν περισσότερα

δείγματα πιπεριάς από περιοχές της ηπειρωτικής Ελλάδας, καθώς και να

ελεγχθούν οι σπόροι και η ικανότητα σπορομετάδοσης από ποικιλίες/υβρίδια της

Κρήτης. Επιπλέον, η αλληλούχηση περισσότερων απομονώσεων του ιού από

διάφορες περιοχές της Ελλάδας θα βοηθούσε, ώστε να πραγματοποιηθεί μια πιο

λεπτομερής ανάλυση της γενετικής δομής των πληθυσμών του PMMoV.

65

Βιβλιογραφία

Ελληνική

• Δημητρακάκης Κ.Γ. (1982). Πρακτική λαχανοκομία. Potamitis Press.

• Ελληνική Στατιστική Αρχή. (2016).

• Ντόγρας, Κ. (1998). Σημειώσεις Ειδικής Λαχανοκομίας I. Μέρος Α’.

Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Υπηρεσία Δημοσιευμάτων.

Θεσσαλονίκη.

• Ολυμπίου Μ. Χρήστος. (2001). Η τεχνική της καλλιέργειας των

κηπευτικών στα θερμοκήπια. Εκδόσεις Σταμούλη.

Ξενόγλωσση

• Adams M.J., Antoniw J.F., Kreuze J. (2009). Virgaviridae: a new family

of rod-shaped plant viruses. Archives of Virology 154: 1967–1972.

• Adkins S., Lamb E.M., Roberts P.D., Gooch M.D., Breman L., Shuler K.D.

(2001). Identification of Pepper mild mottle virus in commercial bell

pepper in Florida. Plant Disease 85: 679.

• Almeida J.E.M., Figueira A.R., Duarte P.G., Lucas M.A., Alencar N.E.

(2018). Procedure for detecting Tobamovirus in tomato and pepper

seeds decreases the cost analysis. Bragantia 77: 590-598.

• Alwabli A.S., Khattab E.A.H., Farag A.G. (2017). Biological, Serological

and Molecular Characterization of Papper MildMottle Virus Isolated from

Weast Region of Kingdom of Saudi Arabia. Research Journal of Infectious

Diseases 5: 1.

• Alonso E., Garcia-Luque I., Avila-Rincon M.J., Wicke B., Serra M.T., Diaz

Ruiz J.R. (1989). A Tobamovirus causing heavy losses in protected

pepper crops in Spain. Journal of Phytopathology 125: 67–76.

• Alonso E., García-Luque I., de la Cruz A., Wicke B., Avila-Rincón

M.J., Serra M.T., Castresana C., Díaz-Ruíz J.R. (1991). Nucleotide

sequence of the genomic RNA of Pepper mild mottle virus, a resistance-

breaking Tobamovirus in pepper. Journal of General Virology 72: 2875-

2884.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Alonso%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Garc%C3%ADa-Luque%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20la%20Cruz%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wicke%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Avila-Rinc%C3%B3n%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Avila-Rinc%C3%B3n%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Serra%20MT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Castresana%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=D%C3%ADaz-Ru%C3%ADz%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1765765

66

• Antignus Y., Lachman O., Pearlsman M., Maslenin L., Rosner A. (2008).

New Pathotype of Pepper mild mottle virus (PMMoV) Overcomes the L4

Resistance Genotype of Pepper Cultivars. Plant Disease 92: 1033-1037.

• Avgelis A.D. (1982). Tobacco mosaic virus (TMV) in seed of commercial

pepper cultivars. 2nd Conference Protected Vegetables Flowers,

Heraklion, Greece 52 (Abstr.).

• Avgelis A.D. (1986). A pepper strain of TMV who is new in Crete

(Greece). Phytopathologia Mediterranea 25: 33-38.

• Avgelis, A.D. (1986). Viruses of tomato in plastic houses in Crete.

Netherlands Journal of Plant Pathology 92: 147.

• Avgelis A.D. (1987). Viruses of pepper in plastic houses in Crete.

Netherland Journal of Plant Pathology 93: 153-158.

• Avila‐Rincón M.J., Ferrero M.L., Alonso E., García-Luque I., Díaz-Ruíz J.R.

(1989). Nucleotide sequences of 5' and 3' non-coding regions of pepper

mild mottle virus strain S RNA Journal of General Virology 70: 3025-303.

• AVRDC. 2004. Pepper mild mottle virus. Fact Sheet. AVRDC Publication

04-596.

• Beczner J., Hamilton R.L., Rochon D.M. (1997). Characterization of an

isolate of Pepper mild mottle Tobamovirus occurring in Canada.

Canadian Journal of Plant Pathology 19: 83-88.

• Betti L., Tanzi M., Canova A. (1991). Multiplication and translocation of

the PepMV mild mutant M-1 in pepper (Capsicum annuum L.).

Phytopathologia Mediterranea 30: 137-139.

• Bosland P.W., Iglesias J., and Gonzalez M.M. (1994). 'NuMex Centennial'

and 'NuMex Twilight' ornamental chiles. HortScience 29: 1090.

• Brioso P.S.T. (1996). Diseases caused by viruses in Capsicum. Informe

Agropecua^acute~rio (Belo Horizonte), 18: 74-80.

• Broadbent L., Read W.H., Last F.T. (1965). The epidemiology of tomato

mosaic X. Persistence of TMV-infected debris in soil and the effects of

soil partial sterilization. Annals of Applied Biology 55: 471-483.

• CABI/EPPO. (2002). Cucumber mosaic virus. Distribution Maps of Plant

Diseases, No. 866. Wallingford, UK: CAB International.

67

• CABI/EPPO. (2005). Potato virus Y. Distribution Maps of Plant Diseases.

No. 970. Wallingford, UK: CAB International.

• Çağlar B.C., Fidan H., Elbeaino T. (2013). Detection and Molecular

Characterization of Pepper Mild Mottle Virus from Turkey. Journal of

Phytopathology 161: 434-438.

• Çağlar K.C., Hakan F., Toufic E. (2013) Detection and molecular

characterization of Pepper mild mottle virus from Turkey. Journal of


• Cerezo E.R., Arenal F.G. (1989). Genetic heterogeneity of the RNA

genome population of the plant virus U5-TMV. Virology 170: 418-423.

• Cerkauskas R. (2004). Alfalfa mosaic virus. AVRDC-The World Vegetable.

• Chatzinasiou E., Dovas C.I., Papanastassopoulou M., Georgiadis M.,

Psychas V., Bouzalas I., Koumbati M., Koptopoulos G. and Papadopoulos

O. (2010). Assessment of bluetongue viraemia in sheep by real-time PCR

and correlation with viral infectivity. Journal of Virological Methods 169:

305-315.

• Chatzivassiliou E., Livieratos J., Avgelis A., Katis N., Lykouressis D.

(1996). Occurrence of tomato spotted wilt virus in vegetable and

ornamental crops in Greece. Acta Horticulturae 431: 49-54.

• Chen J., Adams M.J. (2001) A universal PCR primer to detect members

of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several

members of the family. Archives of Virology 146: 757–766

• Chen P., Lott J.N.A. (1992). Studies of Capsicum annuum seeds:

structure, storage reserves, and mineral nutrients. Canadian Journal of

Botany. 70: 518–529.

• Cheng Y.H., Zheng Y.X, Tai C.H., Yen J.H., Chen Y.K., Jan F.J. (2013).

Identification, characterization and detection of a new tospovirus on

sweet pepper. Annals of Applied Biology 164: 107-115.

• Choi S.K., Choi G.S., Kwon S.J., Yoon J.Y. (2016). Complete Nucleotide

Sequences and Genome Organization of Two Pepper Mild Mottle Virus

Isolates from Capsicum annuum in South Korea. Genome

Announcements 4: 411–416.

68

• Creaser E.H., Gibbs A.J., Pares R.D. (1987). The amino acid composition

of the coat protein of a Tobamovirus from an Australian Capsicum crop.

Australasian Plant Pathology 16: 85-87.

• Colson P., Tamalet C., Raoult D. (2006). SVARAP and aSVARAP: simple

tools for quantitative analysis of nucleotide and amino acid variability

and primer selection for clinical microbiology. BMC Microbiology 6: 21.

• Dombrovsky A., Smith E. (2017). Seed Transmission of Tobamoviruses:

Aspects of Global Disease Distribution. Advances in Seed Biology Chapter

6 234-260.

• Conti M., Marte M. (1983). Virus, virosi e micoplasmosi del peperone.

Italiano Agriculture 120: 132-152.

• Dovas I.C., Efthimiou K., Katis I.N. (2004). Generic detection and

differentiation of Tobamoviruses by a spot nested RT-PCR-RFLP using

dI-containing primers along with homologous dG-containing primers.

Journal of Virological Methods 117: 137-144.

• EPPO. (2014). EPPO Global database (available online). Paris, France:

EPPO. https://gd.eppo.int/

• Fraile A., Pagán I., Anastasio G., Sáez E., García-Arenal F. (2011). Rapid

genetic diversification and high fitness penalties associated with

pathogenicity evolution in a plant virus. Molecular Biology and Evolution.

28: 1425-1437.

• Gadagkar S.R., Rosenberg M.S., Kumar S. (2005). "Inferring species

phylogenies from multiple genes: Concatenated sequence tree versus

consensus gene tree". Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular

and Developmental Evolution 304B: 64–74.

• Gao W., Wang Y., Zhang C.X., Zhang A.S., Zhu X.P. (2016). Investigation

and pathogen preliminary identification of pepper virus disease in

Tianjin. Shandong Agricultural Science 48: 91–94 (in Chinese).

• Garcia-Luque, I., Ferrero M.L., Rodriguez J.M., Alonso E., de la Cruz A.,

Sanz A.I., Vequero C., Serra M.T., and Diaz-Ruiz J.R. (1990). The

nucleotide sequence of the coat protein genes and 3′ noncoding regions

https://www.cabi.org/isc/abstract/19881157119



69

of two resistance-breaking tobamoviruses in pepper shows that they are

different viruses. Archives of Virology 131: 75-88.

• Genda Y., Sato K., Nunomura O., Hirabayashi T., Ohnishi J., Tsuda S.

(2005). Immunolocalization of Pepper mild mottle virus in Capsicum

annuum seeds. Journal of General Plant Pathology 71: 238-242.

• Genda Y, Kanda A, Hamada H, Sato K, Ohnishi J, Tsuda S. (2007). Two

Amino Acid Substitutions in the Coat Protein of Pepper mild mottle virus

Are Responsible for Overcoming the L (4) Gene-Mediated Resistance in

Capsicum spp. Phytopathology 97: 787-93.

• Green S.K., Kim J.S. (1991). Characteristics and control of viruses

infecting peppers: a literature review. Asian Vegetable Research and

Development Centre 18: 60.

• Green S.K., Wu S.F. (1991). Characteristics and control of viruses

infecting peppers: a literature review. Tobamoviruses on Capsicum

annuum in Taiwan. Plant Disease 75: 1186.

• Green S.K. (2003). Pepper mild mottle virus. In Pernezny et al. (eds)

Compendium of pepper diseases. American Phytopathological Society St.

Paul MN 32-33.

• Greenleaf W., Cook A., Heyn A. (1964). Resistance to Tobacco mosaic

virus in capsicum, with reference to the Samsun latent strain.

Phytopathology 54: 1367–1371.

• Guan X., Yang C., Fu J., Du Z., Ho S.Y.W., Gao F. (2018). Rapid

evolutionary dynamics of Pepper mild mottle virus. Virus Research 256:

96-99.

• Guldur M.E., Çağlar B.K. (2006). Outbreaks of Pepper mild mottle virus

in greenhouses in Sanliurfa, Turkey. Journal of Plant Pathology 88: 339-

342.

• Guardado C.E. (2017). Comparison of two Near-Isogenic Lines of Bell

Pepper (Capsicum annuum): One Endornavirus Infected and the Other

Endornavirus-Free. Master Thesis. Luisiana State Univesity.

• Hagiwara K., Ichiki T.U., Ogawa Y., Omura T., and Tsuda S. (2002). A

single amino acid substitution in 126 kDa protein of Pepper mild mottle

https://www.cabdirect.org/cabdirect/search/?q=au%3a%22Green%2c+S.+K.%22

https://www.cabdirect.org/cabdirect/search/?q=au%3a%22Kim%2c+J.+S.%22




https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Guan%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30096412

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30096412

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fu%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30096412

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Du%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30096412

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ho%20SYW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30096412

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gao%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30096412

70

virus associates with symptom attenuation in pepper; the complete

nucleotide sequence of an attenuated strain, C-1421. Archives of

Virology 147: 833-840.

• Han S.H., Park J.S., Han J.Y., Gong J.S, Park C.H., Kim J.K., Seo E.Y.,

Domier L.L., Hammond J., Lim H.S. (2017). New Korean isolates of

Pepper mild mottle virus (PMMoV) differ in symptom severity and

subcellular localization of the 126 kDa protein. Virus Genes 53: 434–445.

• Haramoto E., Kitajima M., Kishida N., Konno Y., Katayama H., Asami M.,

Akibac M. (2013). Occurrence of Pepper Mild Mottle Virus in Drinking

Water Sources in Japan. Applied and Environmental Microbiology 79:

7413–7418.

• Hattab M.M. and Ezzaier K. (2006). Biological, Serological, and Molecular

Characterization of Pepper mild mottle virus (PMMoV) in Tunisia.

Tunisian Journal Plant Protection 1: 1-12.

• Hudcovicova M., Korbelova E., Slicova S., Klcova L., Mihalik D., Kraic J.

(2015). Molecular selection of tomato and pepper breeding lines

possessing resistance alleles against Tobamoviruses. Agriculture

(Pol’nohospodarstvo) 61: 33-35.

• Huseynova I.M., Mirzayeva S.M., Sultanova N.F., Aliyeva D.R.,

Mustafayev N.SH., Aliyev J.A. (2018). Virus-induced changes in

photosynthetic parameters and peroxidase isoenzyme contents in

tomato (Solanum lycopersicum L.) plants. Photosynthetica 56: 841–850

• IBPGR. (1983). Genetic resources of Capsicum. Int. Board for Plant

Genetic Resources, Rome.

• Ikegashira, Y., Ohki T., Ichiki U., Higashi T., Hagiwara K., Omura T.,

Honda Y., and Tsuda S. (2004). An immunological system for the

detection of Pepper mild mottle virus in soil from green pepper fields.

Plant Disease. 88: 650-656.

• Jarret R.L., Gillaspie A.G., Barkley N.A., Pinnow D.L. (2008). The

Occurrence and Control of Pepper mild mottle virus (PMMoV) in the

USDA/ARS Capsicum Germplasm Collection. Seed Technology Journal

30: 26–36.

71

• Kalman D., Palkovics L., Gaborjanyi R. (2001). Serological, Pathological

and Molecular Characterisation of Hungarian Pepper Mild Mottle

Tobamovirus (PMMoV) Isolates. Acta Phytopathologica et Entomologica

Hungarica 36: 31–42.

• Katis N.I., Avgelis A.D. (1991). Tomato fruit necrosis caused by

cucumber mosaic virus. Geotechnical Scientific Issues 4: 17–22.

• Katis N., Avgelis A. (1991). [Tomato spotted wilt virus: New threat for

tomato and pepper crops in Northern Greece.] Abstr. 15th Scientific

Meeting of the Greek Society of Horticulture (Thessaloniki, Greece), p.

69 (in Greek).

• King A.M., Lefkowitz E., Adams M.J., Carstens E.B. (2011). Virus

Taxonomy, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy

of Viruses. Elsevier Academic Press, Amsterdam.

• Kirita M., Akutsu K., Watanabe Y., Tsuda S. (1997). Nucleotide sequence

of the Japanese isolate of pepper mild mottle Tobamovirus (TMV-P) RNA.

Annals of the Phytopathological society of Japan 63: 373-376.

• Kraft K.H., Brown C.H., Nabhan G.P., Luedeling E., Luna Ruiz J.d.J.,

Coppens d’Eeckenbrugge G., Hijmans R.J., Gepts P. (2014). Multiple

lines of evidence for the origin of domesticated chili pepper, Capsicum

annuum, in Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences

U.S.A. 111: 6165-6170.

• Kucharek T.A., Purcifull D.E., Christie R.G., Perkins K.D. (1998). The

Association of Severe Epidemics of Cucumber Mosaic in Commercial

Fields of Pepper and Tobacco in North Florida with Inoculum in

Commelina benghalensis and C. communis. Plant Disease 2: 1172.

• Kumar A., Jailani A.A.K., Roy A., Mandal B. (2017). The Occurrence,

Biology and Genomic Properties of Tobamoviruses Infecting Crop Plants

in India. A Century of Plant Virology in India Chapter 19 429-444.

• Kyriakopoulou P.E., Bem F., Varveri C. (1991). Tomato shrinkage and

tomato fruit toughness, two new diseases in Greece probably related to

cucumber mosaic virus. Annales de l’ Institut Phytopathologique Benaki

16: 151–6.

72

• Lamb E.M., Adkins S., Shuler K.D. and Roberts P.D. (2001). Pepper mild

mottle virus. H S-808 Document, Horticultural Sciences Department,

Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agriculural

Sciences, University of Florida.

• Li X., An M., Wu Y. (2016). First report of Pepper mild mottle virus in

Northeast China. Plant Disease 100: 541.

• Li Y., Guanlin T., Pinxiu L., Ansheng Z., Yong L., Ruhui L., Fan L. (2018).

Detection of tobamoviruses by RT-PCR using a novel pair of degenerate

primers. Journal of Virological Methods 259:122-128.

• Livieratos I.C., Lykouressis D., Katis N.I. (1994). Studies on the genus

Tospovirus in Northern Greece. Proceedings of the 7th Panhellenic

Phytopathological Congress, Athens 41.

• Lotos L., Efthimiou K., Maliogka V.I., & Katis N.I. 2014. Generic detection

of poleroviruses using an RT-PCR assay targeting the RdRp coding

sequence. Journal of Virological Methods 198: 1-11.

• Lotos L., Olmos A., Orfanidou C., Efthimiou K., Avgelis A., Katis N.I. and

Maliogka V.I. (2017). Insights into the etiology of polerovirus-induced

pepper yellows disease. Phytopathology 107: 1567-1576.

• Margaritopoulos J.T., Dovas C.I, Gounaris J., Skouras P.J., Kanavaki

O.M., Katis N.I. and Tsitsipis J.A. (2009). Molecular Analysis of the Coat

Protein of Potato virus Y Isolates in Greece Suggests Multiple

Introduction from Different Genetic Pools. Journal of Phytopathology

158: 73-80.

• Marte M. and C. Wetter. (1986). Occurrence of Pepper mild mottle virus

in pepper cultivars from Italy and Spain. J. Plant Dis. Protect. 93: 37-43.

• Matsumoto K., Sawada H., Matsumoto K., Hamada H., Yoshimoto E., Ito

T., Takeuchi S., Tsuda S., Suzuki K., Kobayashi K., Kiba A, Okuno T,

Hikichi Y. (2008). The coat protein gene of tobamovirus P 0 pathotype is

a determinant for activation of temperature-insensitive L 1a-gene-

mediated resistance in Capsicum plants. Archives of Virology 53: 645-

650.

73

• Matthews R.E.E. (1949). Studies on potato virus X. I. Types of change

in potato virus X infections. Annals of Applied Biology 36: 448-459.

• McKinney H.H. (1952). Pepper mild mottle virus. Plant Disease Reporter

36: 184.

• McNeish R.S. (1964). Ancient Mesoamerican civilization. Science 143:

531–537.

• Milošević D., Stankovic I., Bulajić A., Ignjatov M., Nikolic Z., Petrović G.,

Branka K. (2015). Detection and molecular characterization of Pepper

mild mottle virus in Serbia. Genetika 47: 651-663.

• Mizumoto H., Morikawa Y., Ishibashi K., Kimura K., Matsumoto K.,

Tokunaga M., Kiba A., Ishikawa M., Okuno T. and Hikichi Y. (2014).

Functional characterization of the mutations in Pepper mild mottle virus

overcoming tomato tm‐1‐mediated resistance, Molecular Plant Pathology

15: 479-487.

• Moury B. & Verdin E. (2012). Viruses of Pepper Crops in the

Mediterranean Basin: A Remarkable Stasis. Advances in virus research

Chapter 4 127-162.

• Nagai Y., Takeuchi T., Tochihara H. (1981). A new mosaic disease of

sweet pepper caused by pepper strain of tobacco mosaic virus. Annals

of the Phytopathological Society of Japan 47: 541-546.

• Nei M. & Kumar S. (2000). Molecular Evolution and Phylogenetics.

Oxford University Press, New York.

• Nelson M.R. and Wheeler R.E. (1972). A new virus disease of pepper in

Arizona. Plant Disease 56: 731.

• Oliveira L.M., Nagata A.K.I., Nagata T. (2010). Complete genome

nucleotide sequence of Pepper mild mottle virus isolated in the Federal

District, Brazil. Tropical Plant Pathology 35: 373-376.

• Othman B.A.A. (1991). Occurrence of Pepper mild mottle virus in

protected cultivations in Egypt. Annals of Agricultural Science. 36:85-89.

• Ozaslan M., Bas B., Aytekin T., Sigirci Z., (2006). Identification of Pepper

Viruses by Das-elisa Assays in Gaziantep-Turkey. Plant Pathology

Journal 5: 11-14.

74

• Pares R.D. (1985). A Tobamovirus infecting Capsicum in Australia.

Annals of Applied Biology 106: 469-474.

• Pares R.D., Gunn L.V., Cresswell G.C. (1992). Tomato mosaic virus

infection in a recirculating nutrient solution. Journal of Phytopathology

135: 192-198.

• Peng J., Shi B., Zheng H., Lu Y., Lin L., Jiang T., Chen J., Yan F. (2015).

Detection of Pepper mild mottle virus in pepper sauce in China. Archives

of Virology 160: 2079-2082.

• Petrov N. (2014). Effect of Pepper mild mottle virus infection on pepper

and tomato plants. Science & Technology IV 6: 61-64.

• Pernezny K.L., Roberts P.D., Murphy J.F., & Goldberg N.P. (Eds.).

(2003). Compendium of pepper diseases. St. Paul, MN: APS Press.

• Polischuk V., Budzanivska I., Shevchenko T., Oliynik S., (2007). Evidence

for plant viruses in the region of Argentina Islands, Antarctica. FEMS

Microbiology Ecology [Microorganisms in cold environments.

International conference on alpine and polar microbiology, Innsbruck,

Austria, 27-31 March 2006.] 59: 409-417.

• Rast A.B., Stijger C.C.M.M. (1987). Disinfection of pepper seed with

different strains of capsicum mosaic virus by trisodium phosphate and

dry heat treatment. Plant Pathology 36: 583.

• Rialch N., Sharma V., Sharma A., Sharma N.P. (2015). Characterization

and complete nucleotide sequencing of Pepper mild mottle virus

infecting Bell Pepper in India. Phytoparasitica. 43: 327-337.

• Roberts A.G. (2014). Plant Viruses: Soil-borne. eLS. Encyclopedia of Life

Sciences. John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net.

• Saito T., Yamanaka K. and Okada Y. (1990). Long-distance movement

and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology 176: 329–

336.

• Salamon P., Kaszta M. (2000): Investigation on the transmission of some

Tobamoviruses by pollen and seed in pepper (Capsicum annuum L.). In:

8th International Pollination Symposium, Mosonmagyarovar, Hungary,

10–14 July. International Journal of Horticultural Science 6: 127–131.

75

• Sevik M.A. (2011). Occurrence of Pepper mild mottle virus in

greenhouse-grown pepper (Capsicum annuum L.) in the West

Mediterranean region of Turkey. African Journal of Biotechnology 10:

4976-4979.

• Shirasaki N., Matsushita T., Matsui Y., Yamashita R. (2018). Evaluation

of the suitability of a plant virus, pepper mild mottle virus, as a surrogate

of human enteric viruses for assessment of the efficacy of coagulation-

rapid sand filtration to remove those viruses. Water Research. 129: 460-

469.

• Souza A.C., Vasques R.M., Inoue-Nagata A.K., Lacorte C., Maldaner F.C.,

Noronha E.F., Nagata T. (2013). Expression and assembly of Norwalk

virus-like particles in plants using a viral RNA silencing suppressor gene.

Applied Microbiology and Biotechnology 97: 9021.

• Svoboda J., Cervena G., Rodova J., Jokes M. (2006). First report of

Pepper mild mottle virus in pepper seeds produced in the Czech

Republic. Plant Protection Science 42: 34–37.

• Tanzi M., Betti L., Canova A. (1986). Mild mutant M-1 protecting pepper

crops under glass. Rivista della Ortoflorofrutticoltura Italiana 70: 145-

153.

• Tena F., Molina G.M., Serra M.T., Garcia-Luque I. (2012). A single amino

acid in the helicase domain of PMMoV-S is responsible for its enhanced

accumulation in C. chinense (L3L3) plants at 32oC. Virology 427: 34–43.

• Tenllado F., Garcia L.I., Serra M.T., Diaz R.J.R. (1997). Pepper

resistance-breaking tobamoviruses: can they co-exist in single pepper

plants? European Journal of Plant Pathology 103: 235-243.

• Tenllado F., Dıaz-Ruız J.R. (2001). Double-Stranded RNA-Mediated

Interference with Plant Virus Infection 75: 12288–12297.

• Toyoda K., Yasufumi H., Shigeharu T., Tomohisa K., Ako O., Yoshiko N.

Okuno, Tetsuro O., Kazumi S. (2004). Epidemiological Aspects of the

Japanese Tobamovirus Strain, Pepper Mild Motte Virus (PMMoV)

Infecting the L2 resistance Genotype of Green Pepper (Capsicum

annuum L.) Scientific reports of the Faculty of Agriculture 93: 19-27.

76

• Tsuda S., Kirita M., and Watanabe Y. (1998). Characterization of a

pepper mild mottle tobamovirus strain capable of overcoming the L3

genemediated resistance, distinct from the resistance-breaking Italian

isolate. Molecular Plant-Microbe Interactions 11: 327-331.

• Tsuda S., Kubota K., Kanda A., Ohki T., and Meshi T. (2007).

Pathogenicity of Pepper mild mottle virus Is Controlled by the RNA

Silencing Suppression Activity of Its Replication Protein but Not the

Viral Accumulation. Phytopathology 97: 412-420.

• Varveri C. (2006). Biological, serological and molecular characterization

of Potato virus Y isolates in Greece. Annals of the Benaki

Phytopathological Institute 20: 67-81.

• Varveri C., Avgelis A.D., Bem F. (1997). Spread of the most important

aphid-borne viruses of tomato and potato in Greece. Geotechnical

Scientific Issues 8: 7–13 (in Greek).

• Varveri C., Boutsika K. (1999). Characterization of cucumber mosaic

cucumovirus isolates in Greece. Plant Pathology 48: 95-100.

• Velasco L., Janssen D., Ruiz G.L., Segundo E., and Cuadrado I.M.,

(2002). The complete nucleotide sequence and development of a

differential detection assay for a Pepper mild mottle virus (PMMoV)

isolate that overcomes L3 resistance in pepper. Journal of Virological

Methods 106: 135-140.

• Vinayarani G., Madhusudhan K.N., Deepak S.A., Niranjand S.R., Prakash

H.S. (2011). Detection of mixed infection of Tobamoviruses in tomato

and bell pepper by using RT-PCR and duplex RTR-PCR. International

Journal of Plant Pathology 2: 89-95.

• Vogelstein B., Gillepsie D. (1979). Preparative and analytical purification

of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences

of the Unithed States of America 76: 615-619.

• Vovlas C., Avgelis A. (1994). Infezione da TSWV Tospovirus su

pomodoro e peperone nell’ isola di Creta. Infomatore Fitopatologico 1:

55-56.

77

• Wang X., Liu F., Zhou G., Li X.-H., Li Z. (2006). Detection and Molecular

Characterization of Pepper mild mottle virus in China. Journal of


• Wetter C., Conti M., Altschuh D., Tabillion R., Van Regenmortel M.H.V.

(1984). Pepper mild mottle virus, a Tobamovirus infecting pepper

cultivars in Sicily. Phytopathology 74: 405– 410.

• Xiang B.C., Xie H., Cui X.M., Li C., Liu S.P., Xi D.H., Yin Y.Q. (1994).

Isolating and identification of Pepper mild mottle Tobamovirus in

Xinjiang. Chinese Journal of Virology 10: 240–244.

• XiaoDong L., MengNan A., GuanZhong W., XiuXiang Z., YuanHua W.

(2016). Journal of Shenyang Agricultural University 47: 29-34.

• Yoon J.Y., Ahnb H., Kima M., Tsuda S., Ryua K.H. (2006). Pepper mild

mottle virus pathogenicity determinants and cross protection effect of

attenuated mutants in pepper Virus Research 118: 23-30.

• Yu M., Liu H., Zheng H., Yan F., Zhao X., Xia Z., An M., Wu Y. (2019).

Viral sequences required for efficient viral infection differ between two

Chinese Pepper mild mottle virus isolates. Virus Research 267: 9-15.

• Zhang T., Breitbart M., Lee W.H., Rum J.Q., Wei C.L., Soh S.W., Hibberd

M.L., Liu E.T., Rohwer F., Ruan Y. (2006). RNA viral community in human

feces: prevalence of plant pathogenic viruses. PLoS Biology 4: 0108-

0118

• Zitter Τ.Α. (1972). Naturally occurring pepper virus strains in South

Florida. Plant Disease 56: 586-590.

• Zitter T.A., Florini D. (1984). Virus Diseases of Pepper. Vegetable MD

Online, Vegetable Crops, Fact Sheet, Cornell University, New York State:

736.

Διαδικτυακή

• https://avrdc.org/

• https://viralzone.expasy.org/51?outline=all_by_species

• https://www.cabi.org/isc/datasheet/43826

• http://www.statistics.gr/

https://avrdc.org/

https://viralzone.expasy.org/51?outline=all_by_species

https://www.cabi.org/isc/datasheet/43826

http://www.statistics.gr/

78

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

• http://www.psc.edu/biomed/genedoc

• https://www.agric.wa.gov.au/viruses-virus/pepper-mild-mottle-virus-

pmmov

Παράρτημα

1. Πρωτόκολλο εκχύλισης ολικού RNA των Chatzinasiou et al.,

(2010): 0,2gr φυτικού δείγματος ομογενοποιείται σε 2ml διαλύματος

lysis (8M GuHCl, 25mM EDTA, 1% Sarcosyl, 2% Triton X-100, 25mM

sodium citrate, 0.2M sodium acetate, ρύθμιση pH στο 5.2 με acetic acid).

Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 14.000 rpm για 1΄. Στη συνέχεια 700 μl

από το υπερκείμενο μεταφέρονται σε νέο μικροσωλήνα. Ακολουθεί

φυγοκέντρηση στις 16.000 rcf για 1΄. Στη συνέχεια 500μl από το

υπερκείμενο μεταφέρονται σε νέο μικροσωλήνα που περιέχει 625μl

αιθανόλης (100%) και όλο μαζί μεταφέρεται σε στήλη silica (Glass

microfibers filters, GF/F-Whatman) για δέσμευση του RNA, με

φυγοκέντρηση για 10΄ σε 2000 rcf, Στη συνέχεια γίνεται μια πρώτη

πλύση με 700μl διαλύματος “wash buffer 1” (4M GuHCl, 50mM Tris–HCl

pH 6.6, και 60% ethanol) και φυγοκέντρηση σε 8000 rcf για 1΄.

Ακολουθούν δυο πλύσεις με 700μl και 400μl διαλύματος “wash buffer 2”

(2mM Tris–HCl pH 7.0, 20mM NaCl, και 80% ethanol) και φυγοκέντρηση

σε 8000 rcf για 1΄ και 12000 rcf για 2΄, αντίστοιχα. Τέλος, η παραλαβή

του RNA πραγματοποιείται με 80 μl διαλύματος (10mM Tris–HCl, pH 8.0)

θερμοκρασίας 95°C. Τοποθέτηση στους -20°C.


http://www.psc.edu/biomed/genedoc

Pepper mild mottle virus - ikee.lib.auth.gr

Documents

Transcript of Pepper mild mottle virus - ikee.lib.auth.gr