Genomi vegetaliIl DNA nella cellula non è contenuto solo nel nucleoma anche all’interno di:

Mitocondri DNA mitocondriale MtDNA

Plastidi (classificabili in base alla loro colorazione):verdi cloroplastidi altri colori (rossi, arancioni e gialli) cromoplasti incolori leucoplasti

mitocondri: struttura…

Dimensioni: 1-2μm cioè la grandezza media di un batterio

1 membrana esterna presenza di porina(passaggio di molecole < 10 KDa)

2 membrana interna (impermeabile,presenza di trasportatori specifici)

3 spazio intermembrana (risulta più acidodello matrice, gradiente chemio-osmitoco)

4 matrice (matrice acquosa colloidale contenente numerosi enzimi, ribosomi emolecole di DNA mitocondriale (mtDNA)

Il numero di mitocondri/cellula è correlato con l’attività metabolica cellulare

….e funzione!Centrale energetica della cellula

trasformazione del piruvato in acetilCoAciclo delll’acido citrico (Krebs)catena respiratoria accoppiata alla sintesi di ATPcatabolismo degli acidi grassi (β ossidazione) parte del ciclo dell’ureadeposito di calcio…omeostasi del calcio citoplasmatico

Complesso I: NADH deidrogenasiComplesso II: succinato deidrogenasiComplesso III: ubichinolo-citocromo c reduttasiComplesso IV: citocromo c ossidasiComplesso V: ATP sintasi

DNA mitocondriale mtDNALa maggior parte dei genomi mitocondriali sono molecole di DNA circolare,a doppia elica e superavvolte

mtDNA non è associato a istoni o a proteine simili

Alcuni mtDNA sono lineari (protozoi ciliati, alga verde unicellulareChlamydomonas reinhardtii )

Anche per le Angiosperme si ritiene che mtDNA sia circolare, tuttaviai genomi mitocondriali vegetali sono fisicamente eterogenei e caratterizzati da una particolare complessità strutturale.

Presenza di diversi nucleoidi all’interno della cellula

Dimensioni del mtDNA

Dimensioni: mtDNA animale 14-42 Kbp, funghi 17-176 Kbp, piante 187-2400 Kbp

Dimensioni dei DNA mitocondrialiOrganismo Kbp

Homo sapiens 16,6

Saccharomyces cerevisiae 65-85

Arabidopsis thaliana 372

Oriyza sativa (riso) 492

Merchantia polyorpha (epatica) 187 (minimo)

Cucumis melo (melone) 2400

Non c’è correlazione tra le dimensioni dei genomi nucleari e mitocondrialinelle piante: Arabidopsis possiede uno dei genomi nucleari più piccoli, ma il suo genoma mitocondriale è di dimensioni medie

Geni identificati in DNA mitocondriali1 RNA ribosomale

Subunità grandeSubunità piccola5S

2 RNA transfer

3 proteine della catena respiratoriaComplessoI Complesso IIIComplesso IVComplesso V

4 proteine ribosomali

5 biogenesi del citocromo c: geni presenti solo nelle piante

Contenuto di geni del mtDNA di Chlamydomonas

Gene Prodotto genico

Geni che codificano per proteine

cob Apocitocromo

coxI Subunità I della citocromo ossidasi

Nad1, nad2, nad4, nad5, nad6

Subunità della NADH deidrogenasi

Geni di rRNA L1-L8 Segmenti che codificano subunità grandi di rRNA

S1-S4 Segmenti che codificano subunità piccole di rRNA

Geni di tRNA W tRNA del triptofano

Q tRNA della glutammina

M tRNA della metionina (di allungamento, non di inizio)

Complessità fisica e instabilità strutturale del genoma mitocondriale vegetale

Profili di restrizione con endonucleasi dell’mtDNA sono caratterizzati da un elevato numero di frammenti, alcuni dei quali presenti in quantità moltopiccole rispetto agli altri

Studi di mappaggio e di sequenziamento hanno rivelato sequenze ripetutepresenti in poche copie nel genoma

Queste sequenze ripetute hanno un’importante funzionenel produrre gran parte dell’eterogeneità che caratterizza mtDNA vegetale

Plant mitochondrial genome organization

I e II rappresentano le sequenze ripetute

One Master Circle or Several Smaller Circles?

sublimons

RestrictedmtDNA

One master circle?

Vs.

Several smaller circle?

Multipartite organization!

La complessità globale dell’intero mtDNA può essere riassunta all’interno di una singola molecola circolare detta cromosoma principale (master circle).

All’interno del cromosoma principale si possono distinguere le zone ripetute.

Le sequenze ripetute:

non sono conservate tra le diverse speciepossono avere lo stesso orientamento oppure direzione oppostapossono generare inversionipossono generare anche molecole sub-genomiche in seguito a delezioni, alcune delle molcole generate sono presenti in quantità molto esigue (sublimoni)determinano infine una struttura genomica multi partita

Recombination across inverted repeats leads to inversions

1 2 3 4

1’ 2’ 3’4’

1 2

3

4’

1’ 2’

3’

4

Recombination across direct repeats leads to deletions

12

3’4’

1 2 3 4

4’ 3’ 2’1’

43

2’

1’

Various Sizes of DNA molecules in Plant Mitochondria

mtDNA molecules in Chenopodium album

Dato che il cromosoma principale e le molecole sub-genomiche circolari sarebbero di notevoli dimensioni, è probabile che non resistanoall’isolamento in forma integra, e ciò può spiegare l’elevata proporzionedi molecole lineari eterogenee, rispetto alle circolari, che vengono isolatedall’mtDNA vegetale.

Il modello multipartito spiega l’esistenza e i rapporti strutturali di molte sequenze ripetute che sono state identificate negli mtDNA mitocondriali,tuttavia apre una serie di quesiti:

come si replica il DNA mitocondriale vegetale?

come segrega durante la divisione cellulare?

Geni del DNA mitocondriale delle Angiosperme

RNA ribosomali e relativi geni

I ribosomi dei mitocondri vegetali sedimentano a circa 78S e contengonorRNA 18S (subunità piccole) e rRNA 26S (subunità grande).

Queste dimensioni sono più vicine a quelle degli rRNA eucariotici che aquelle degli omologhi batterici (12S e 23S) e molto maggiori rispetto agli rRNA dei mitocondri animali (12S e 16S).

I mitocondri vegetali inoltre contengono un particolare rRNA 5S che è assente dai ribosomi di quasi tutti gli eucarioti.

organizzazione insolita dei geni per rRNA mitocondriale vegetale:

18S-5S a una certa distanza… 26S

solitamente, in eubatteri e coloroplasti si ha:

16S-23S-5S……….organizzati in cluster

RNA transfer e i relativi geni

il numero di geni per tRNA non è sufficiente a produrre tutti i tRNA necessari alla lettura del codice

il numero e il tipo di tRNA varia da specie a specie, tuttavia è sempreinferiore a quello di mammiferi e funghi dove sono presenti 22-25 geniper tRNA

alcuni tRNA sono codificati da geni nucleari e successivamenteimportati nel mitocondrio (meccanismo sconosciuto)

vi è somiglianza tra tRNA mitocondriali e cloroplastici: ipotesi di loroderivazione da DNA promiscuo plastidico e successiva perdita del gene originale mitocondriale

i tRNA mitocondriali delle angiosperme possono avere 3 derivazioni

1. tRNA “nativi” codificati dall’mtDNA

1. tRNA di tipo plastidico codificati da DNA promiscuo

1. tRNA di tipo citosolico codificati dal genoma nucleare e importatidal citosol nel mitocondrio

geni che codificano per proteine

introni in geni mitocondriali di angiosperme:

presenza di introni nella stessa posizione in geni di piante “vicine”esempio monocotiledoni e gene della citocromo ossidasi

introni spesso autocatalitici

presenza di una RNA maturasi che consente lo splicing

la struttura primaria dei geni dei mitocondri vegetali che codificano per proteine è molto conservata, la somiglianza cala drasticamente al di fuori delle sequenze codificanti.

Codice genetico universale e mitocondriale

Differenze tra i codici genetici nucleari e mitocondriali di uomo e lievito

Codone aminoacidoCodice nucleare Codice

mitocondriale mammiferi

Codice mitocondriale

lievitoUGA Terminazione Triptofano TriptofanoAUA Isoleucina Metionina IsoleucinaCUN Leucina Leucina TreoninaAGG,AGA Arginina Terminazione ArgininaCGN Arginina Arg Terminazione

?

NB attenzione nella produzione eterologa di proteine mitocondriali

Meno del 10% delle proteine che compongono un mitocondrio sono sintetizzate dal DNA mitocondriale

Vi sono meccanismi di importazione di proteineverso il mitocondrio e i suoi comparti interni

Cloroplasti:

La famiglia dei plastidi

Buchannan et al. Fig. 1.44

Funzione del cloroplasto:

sede della fotosintesi negli organismi vegetalisede, non unica, della biosintesi di amminoacidi fenilpropanoidi,sito di azione di erbicidi, incluso il glifosatesede, non unica, della biosintesi degli acidi grassi

Foglia

DNA cloroplastico ctDNA

Il numero di copie di cpDNA per cloroplasto dipende dalla specieci sono molte copie di cpDNA per cloroplasto, generalmente distribuite in un certo numero di regioni nucleoidi.I cloroplasti crescono e si dividono come i mitocondri.

Plant Plastid Genome Organization

Physical map (e. g. restriction map or DNA sequence) indicates a 120-160 kb circular genome

Large inverted repeat (LIR) commonly 20-30 kb divides genome into large single copy (LSC) region and small single copy (SSC) region

Inversion of genome segments indicates active recombination within the LIR

Expansion and contraction of LIR is the primary length polymorphism in land plants (10-76 kb)

Conifers and some legumes have no LIR

LIR

LIR

LSClong single copy

SSCshort single copy

DNA cloroplastico di riso

Le regioni invertite contribuiscono all’eterogeneità dei cpDNA

Il genoma cloroplastico contiene i geni per tutti gli rRNA cloroplastici (16S, 23S, 4,5S e 5S).

Il genoma contiene anche i geni che codificano per i tRNA e per alcune ma non tutte le proteine necessarie per la trascrizione e la traduzione dei geni codificati dal cpDNA (quali proteine ribosomali, subunità della RNA polimerasi e fattori di traduzione) o per la fotosintesi.

In alcuni geni che codificano proteine e per quelli dei tRNA ci sono introni.

Altre proteine che si trovano nel cloroplasto sono codificate da geni nucleari

L’organizzazione genica del DNA cloroplastico

Una caratteristica del genoma del cloroplasto è quella di contenere2 copie di ciascuno dei geni per l’rRNA.

Le due serie di geni ribosomali del cloroplasto si trovano in dueidentiche sequenze ripetute di 20-30 Kb, orientate nel genoma in sensoinverso.

In queste due sequenze ripetute ci sono altri geni che così risultanoduplicati.

La presenza di queste 2 regioni ripetute individua una breve regione

a DNA a singola copia (short single copy, SSC)

e una regione lunga a singola copia (long single copy, LSC).

Tabacco e riso hanno entrambi 30 geni per tRNA mentre in Marchantia , una epatica, ce ne sono 32.

L’analisi al calcolatore delle sequenze dei cpDNA ha evidenziato circa 100 ORF.

Una sessantina di queste sono state correlate con geni che codificanoper proteine a funzione nota, mentre per le altre la funzione deve essereancora definita.

Le ORF sono piuttosto conservate nelle piante, almeno per quelle delle quali sono disponibili dati di sequenza.

Geni codificati dal DNA plastidico

geni di decodificazione del DNAtrascrizione: subunità della RNA polimerasitraduzione: RNA ribosomali, tRNA, fattori di inizio

geni implicati nella fotosintesisubunità grande della Rubiscosubunità del PSIsubunità del PSIIcomplessso citocromo b6-fsubunità della ATP sintetasisintesi della clorofilla

altri geniNADH ossido-reduttasi

Per la sintesi delle proteine cloroplastiche sono utilizzati ribosomi 70Sspecifici dei cloroplasti, che sono composti da una subunità 50S ed una subunità 30S.

La subunità 50S contiene una copia per ciascuno degli rRNA 23S, 4,5S e 5S.

La subunità 30S è costituita da una copia di rRNA 16S.

ll numero delle proteine ribosomali di ciascuna subunità è meno definito, ma è noto che solo alcune sono codificate nel nucleo, mentre altre sono codificate dal cloroplasto.

La traduzione nei cloroplasti

La sintesi proteica nei cloroplasti assomiglia al processo di sintesi proteica nei procarioti.

Il tRNA per la formil-metionina usato per cominciare la sintesi di tuttele proteine e il cloroplasto utilizza fattori di inizio(IF), fattori di allungamento (EF) e di rilascio (RF) specifici del cloroplasto.

Per la sintesi proteica è usato il codice genetico universale.

I ribosomi cloroplastici, come quelli mitocondriali, sono sensibili a tuttigli inibitori della sintesi proteica nei procarioti mentre risultano resistenti alla cicloesimide che colpisce selettivamente i ribosomi citoplasmatici.

La RUBISCO, il più importante enzima plastidiale coinvolto nella fotosintesi è formata da 8 subunità proteiche grandi e 8 subunità piccole.

L’informazione genica per costruire la subunità grande è contenuta nel DNA dei cloroplasti mentre quella per costruire la subunità piccola nel DNA del nucleo.

Importazione di proteine dal citoplasma al cloroplasto

DNA promiscuoL’origine degli organelli sarebbe riconducibile all’ipotesi dell’endosimbionte:un cianobatterio per il cloroplasto e un proteobatterio per i mitocondri.

Entrambi hanno mantenuto caratteristiche del loro genoma batterico, ma hanno mantenuto più della loro biochimica che del loro DNA.

Trasferimento genico endosimbiontico: i geni sono stati trasferitidall’endosimbionte al nucleo, ma le proteine codificate sono poi reimportate nell’organulo tramite segnali di transito e un apparato di import.

La regolazione dei due sistemi non è autonoma, anche l’organulo èsoggetto a meccanismi di regolazione nucleari.

Quali geni?

I geni cloroplastici sono da 60 a 200 (i cianobatteri non simbionti unicellulariarrivano a 3200) Le proteine nel cloroplasto sono circa 2000.

Quanti geni nucleari sono chiaramente derivati dal cloroplasto?al momento ne sono stati identificati solo 44.

Il genoma dei mitocondri vegetali è più grande del genoma mitocondrialeanimale.

Questa espansione non significa un maggior numero di geni.

Sono noti almeno 11 casi di chiara derivazione mitocondriale