OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM...

of 63 /63
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015 Promotor Prof. Dr. C. Stove Commissarissen Dr. D. Borrey Dr. P. Colin OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM VAN Β-LACTAM ANTIBIOTICA Cyrielle VAN WEEHAEGHE 1 e master in de geneesmiddelontwikkeling

Embed Size (px)

Transcript of OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM...

  • UNIVERSITEIT GENT

    FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

    Vakgroep Bioanalyse

    Laboratorium voor Toxicologie

    Academiejaar 2014-2015

    Promotor

    Prof. Dr. C. Stove

    Commissarissen

    Dr. D. Borrey

    Dr. P. Colin

    OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM VAN

    Β-LACTAM ANTIBIOTICA

    Cyrielle VAN WEEHAEGHE

    1e master in de geneesmiddelontwikkeling

  • UNIVERSITEIT GENT

    FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

    Vakgroep Bioanalyse

    Laboratorium voor Toxicologie

    Academiejaar 2014-2015

    Promotor

    Prof. Dr. C. Stove

    Commissarissen

    Dr. D. Borrey

    Dr. P. Colin

    OPTIMALISATIE VAN EEN METHODE VOOR TDM VAN

    Β-LACTAM ANTIBIOTICA

    Cyrielle VAN WEEHAEGHE

    1e master in de geneesmiddelontwikkeling

  • Auteursrecht

    “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

    beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik

    valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

    verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze

    masterproef.”

  • Samenvatting

    In deze masterproef wordt een methode beschreven voor de kwantificatie van vijf β-

    lactam antibiotica (meropenem, ceftazidim, cetriaxon, piperacilline en flucloxacilline) in

    plasma of serum. Deze antibiotica worden toegediend aan patiënten met een sepsis op de

    afdeling intensieve zorgen. Aangezien de concentratie van dit soort geneesmiddelen sterk

    varieert bij ernstig zieke patiënten, is een individuele antibioticumtherapie noodzakelijk. De

    onderstaande analyse is gevalideerd en kan in de toekomst gebruikt worden om na te gaan

    of de toegediende dosis voldoende therapeutisch effect zal hebben bij een patiënt.

    Het is noodzakelijk dat deze analyse goed aansluit bij testen die reeds uitgevoerd worden

    in het AZ Sint-Jan te Brugge, opdat dit onderzoek in routine uitgevoerd zou kunnen worden.

    De staalvoorbereiding voor deze methode bestaat uit een eenvoudige methanol precipitatie.

    De scheiding gebeurt met behulp van hoge druk vloeistofchromatografie met gradiëntelutie.

    De kolom die hiervoor gebruikt wordt is een Nucleodur® RP C18 Pyramid kolom (150 × 4,6

    mm, 5 µm) en de mobiele fase bestaat uit een mengsel van fosfaatbuffer pH 3 en

    acetonitrile. Als interne standaard wordt gebruik gemaakt van cefoperazone. De golflengte

    waarbij het chromatogram wordt opgenomen is 300 nanometer voor meropenem, 240

    nanometer voor piperacilline en flucloxacilline en 290 nanometer voor ceftazidim en

    ceftriaxon.

    Ook de bewaarcondities van de vijf antibiotica worden bepaald. Meropenem en

    flucloxacilline breken binnen de vijf uur af, wanneer ze bewaard worden bij

    kamertemperatuur, de andere onderzochte antibiotica zijn stabieler. Licht heeft geen

    invloed op de stabiliteit van de β-lactam antibiotica.

  • Dankwoord

    In de eerste plaats zou ik graag Prof. Dr. C. Stove willen bedanken voor de kans mijn

    masterproef uit te voeren in het AZ Sint-Jan. Op deze manier heb ik kunnen kennismaken met

    het werk in een klinisch laboratorium. Verder wil ik hem ook bedanken voor het opvolgen van

    deze masterproef.

    Dr. D. Borrey wil ik bedanken voor de eindeloze steun en raad bij het uitvoeren van de

    proeven en het opstellen van de thesis. Ik wil haar ook graag bedanken voor de tijd die ze

    besteedde aan het verbeteren van mijn masterproef.

    Graag zou ik ook de laboranten bedanken die steeds klaar stonden om te helpen.

    Tot slot wil ik mijn ouders, zus en vriend bedanken om te geloven in mij, en mij te steunen

    wanneer het wat moeilijker ging.

  • Inhoudstabel

    1. INLEIDING ..................................................................................................................................... 1

    1.1. THERAPEUTISCHE DRUGMONITORING VAN BETA-LACTAM ANTIBIOTICA .................. 1

    1.2. SEPSIS EN SEPTISCHE SHOCK .............................................................................................. 2

    1.2.1 Algemeen en epidemiologie .......................................................................................... 2

    1.2.2 Definities ........................................................................................................................... 2

    1.2.3 Pathogenese (zie figuur 1.1) .......................................................................................... 2

    1.2.4 Diagnose ............................................................................................................................ 3

    1.2.5 Behandeling ...................................................................................................................... 4

    1.3. ANTIBIOTICA ......................................................................................................................... 5

    1.3.1 Werking ............................................................................................................................. 5

    1.3.2 Resistentie ........................................................................................................................ 6

    1.3.3 Bijwerkingen .................................................................................................................... 6

    1.4. Β-LACTAM ANTIBIOTICA ...................................................................................................... 7

    1.4.1 Meropenem (zie figuur 1.3) ........................................................................................... 8

    1.4.2 Ceftazidim en Ceftriaxon (zie figuur 1.4 en 1.5) ........................................................ 9

    1.4.3 Piperacilline en flucloxacilline (zie figuur 1.6 en 1.7) ........................................... 10

    1.5. ANALYSE VAN DE BETA-LACTAM ANTIBIOTICA ............................................................. 11

    1.5.1 Staalvoorbereiding ........................................................................................................ 11

    1.5.2 Chromatografie .............................................................................................................. 12

    1.5.3 Interne Standaard ......................................................................................................... 13

    2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................................. 14

    3. MATERIAAL EN METHODEN .................................................................................................... 15

    3.1. TOESTELLEN (tabel 3.1) ..................................................................................................... 15

    3.2. PRODUCTEN EN REAGENTIA (tabel 3.2) ........................................................................... 16

    3.3. METHODEN .......................................................................................................................... 16

    3.3.1 Analyse en kwantificatie van de β-lactam antibiotica met behulp van HPLC .... 16

    3.3.2 Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de kalibratie en de interne

    standaard .................................................................................................................................... 17

    3.3.3 Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de controle ........................... 19

    3.3.4 Extractie van de standaarden en kwaliteitscontroles ............................................ 19

    3.3.5 Validatie van de analyse van de β-lactam antibiotica ............................................ 19

    4. RESULTATEN .............................................................................................................................. 22

    4.1. VALIDATIE VAN DE METHODE .......................................................................................... 22

    4.1.1 Herhaalbaarheid ............................................................................................................ 22

  • 4.1.2 Reproduceerbaarheid .................................................................................................. 22

    4.1.3 De juistheid ..................................................................................................................... 23

    4.1.4 Lineariteit ....................................................................................................................... 24

    4.1.5 LLOQ ................................................................................................................................. 25

    4.1.6 De bewaarcondities van de stalen .............................................................................. 27

    4.1.7 De analytische specificiteit .......................................................................................... 33

    4.1.8 Besluit validatie ............................................................................................................. 35

    4.2. ANALYSE VAN PATIËNTSTAAL .......................................................................................... 35

    5. DISCUSSIE .................................................................................................................................... 40

    6. CONCLUSIE .................................................................................................................................. 42

    7. LITERATUURLIJST ..................................................................................................................... 43

  • Gebruikte afkortingen

    C: Concentratie

    CAP: Community acquired pneumonia

    DAD: Diode array detector

    ESI: Electrospray ionisatie

    HPLC: High performance/pressure liquid chromatography

    IM: Intramusculair

    IV: Intraveneus

    LOD: Limit of detection

    LLOQ: Lower limit of quantification

    MCDA: Monochoriaal Diamniotisch

    MIC: Minimaal inhiberende concentratie

    MS: Massaspectrometrie

    MSMS: Tandem Massaspectrometrie

    m/z: Massa op lading verhouding

    NEC: Necrotiserende Enterocolitis

    PCR: Polymerase Chain Reaction

    QC: Quality Control

    R2: Determinatiecoëfficiënt

    Rico: Richtingscoëfficiënt

    RP: Reversed Phase

    Rpm: Rotaties per minuut

    SD: Standaarddeviatie

  • S/N: Signal to noise ratio

    T1/2: Halfwaardetijd

    TTTS: Twin-to-Twin-Transfusion Syndroom

    UV: Ultraviolet

    VC: Variatiecoëfficiënt

    VIS: Visible

  • 1

    1. INLEIDING

    1.1. THERAPEUTISCHE DRUGMONITORING VAN BETA-LACTAM ANTIBIOTICA

    Therapeutische drugmonitoring is het meten van de plasmaconcentratie van een

    geneesmiddel. Hierbij wordt de totale plasmaspiegel van het geneesmiddel bepaald, dus

    naast de vrije concentratie eveneens de eiwitgebonden concentratie. De meting wordt

    uitgevoerd wanneer het medicijn verdeeld is over het lichaam. De concentratie in het

    effectororgaan moet dus in evenwicht zijn met de plasmaconcentratie. (1, 2)

    Er zijn een aantal voorwaarden verbonden aan therapeutische drugmonitoring. Zo moet

    de gemeten molecule het gewenste effect teweegbrengen, de meting van de concentratie

    moet nauwkeurig zijn, het farmacodynamisch effect zelf moet moeilijk te bepalen en

    onmiddellijk gerelateerd zijn aan de aanwezige plasmaspiegel, het effect moet stabiel zijn, er

    mag geen resistentie of tachyfylaxie optreden en als laatste mag de farmacodynamische

    variabiliteit niet te groot zijn.

    Therapeutische drugmonitoring wordt meestal toegepast voor medicijnen met een nauw

    therapeutisch interval waarvan het effect moeilijk te meten is, of bij patiënten waarbij er

    een vrijwel zekere variabiliteit van de plasmaspiegel is bij de normale therapeutische dosis.

    Dit laatste is het geval bij zwaar zieke patiënten met een sepsis wanneer ze β-lactam

    antibiotica toegediend krijgen. (1-4)

    De dosering van de β-lactam antibiotica wordt vaak gebaseerd op farmacokinetische data,

    verkregen via studies op gezonde vrijwilligers of niet-kritisch zieke patiënten. Deze dosissen

    zijn natuurlijk niet automatisch therapeutisch/niet-toxisch voor mensen met een sepsis. Bij

    een ernstige sepsis en septische shock is er een groter verdelingsvolume en cardiale output

    van de β-lactam antibiotica. Vaak wordt ook een gestegen klaring opgemerkt, alhoewel deze

    ook gedaald kan zijn wanneer er reeds orgaanschade aanwezig is. De veranderde klaring kan

    tot gevolg hebben dat de plasmaconcentratie daalt. Anderzijds kan een gedaalde proteïne

    binding en metabolisatie of excretie zorgen voor een hogere plasmaconcentratie. Kritisch

    zieke patiënten met een sepsis worden vaak behandeld met een combinatie van een β-

    lactam antibioticum en/of een aminoglycoside. (1, 4-7)

  • 2

    1.2. SEPSIS EN SEPTISCHE SHOCK

    1.2.1 Algemeen en epidemiologie

    Ernstige sepsis en septische shock zijn even dodelijk als een hartinfarct en een ‘transient

    ischemic attack’. De mortaliteit van ernstige sepsis en septische shock bedraagt ongeveer

    50%. Bovendien is 2% van alle ziekenhuisopnames te wijten aan sepsis. Ongeveer 9% van de

    patiënten met een sepsis ontwikkelen een ernstige sepsis en 3% van deze ontwikkelen een

    septische shock. Factoren die zorgen voor een groter risico zijn kanker, immunodeficiëntie,

    chronisch orgaanfalen, iatrogene factoren en ook genetische factoren. (8, 9)

    1.2.2 Definities

    Sepsis is een combinatie van zowel een infectie als een systemisch inflammatoir respons

    syndroom. De diagnose systemisch inflammatoir respons syndroom wordt gebruikt als twee

    of meer van volgende symptomen aanwezig zijn: hypothermie of hyperthermie, tachycardie,

    tachypneu en een groot aantal witte bloedcellen (>12.000/mm3) of juist een zeer klein

    aantal (

  • 3

    Bij de aanwezigheid van een infectie in het menselijk lichaam worden monocyten,

    macrofagen en neutrofielen geactiveerd. Deze zullen interageren met het endotheel op de

    plaats van de infectie. Door de activatie van de bovengenoemde cellen en de beschadiging

    van het endotheel, de cascade van het complement systeem en de beginnende coagulatie

    worden cytokines aangetrokken naar de plaats van de infectie. Naast de destructie van

    micro-organismen, zijn cytokines verantwoordelijk voor de inflammatiereactie. Toxines

    geproduceerd door micro-organismen kunnen ook aanleiding geven tot sepsis. De

    inflammatie zorgt voor verhoogde permeabiliteit van de bloedvatwand, trombose en micro

    vasculaire stoornissen. De diffuse verstoring van de endotheliale integriteit geeft aanleiding

    tot weefselhypoxie en orgaandysfunctie. (8, 10, 13)

    In het beginstadium is er vooral een verhoging aan inflammatoire stoffen, maar na

    verloop van tijd ontstaat een anti-inflammatoire immunosuppressieve status. Mensen met

    een sepsis zijn dus ook gevoeliger voor nieuwe infecties. (9, 10, 14)

    1.2.4 Diagnose

    Het is belangrijk een sepsis zo vroeg mogelijk te diagnosticeren. Concreet betekent dit dat

    de infectie die de sepsis veroorzaakt zo vlug mogelijk moet herkend worden. De infectie is in

    sommige gevallen heel duidelijk, bijvoorbeeld bij cellulitis, toxisch shock syndroom,

    community acquired pneumonia (CAP). Veel ziektes zoals hyperthyroïdie, arteriosclerose en

    cirrose mimeren de tachycardie die ook aanwezig is bij sepsis. (9)

    Figuur 1.1: Pathogenese van sepsis (8)

  • 4

    Een bloed- en urinekweek of weefselcultuur is noodzakelijk om de onderliggende oorzaak

    van de mogelijke sepsis te identificeren. Op deze manier is het ook mogelijk de correcte

    antibiotica toe te dienen. De klassieke bloed- of weefselculturen zullen in de toekomst

    waarschijnlijk vervangen worden door screening op tien bacteriële species die vaak

    voorkomen bij sepsis via polymerase chain reaction (PCR) of via de snelle detectie via een

    DNA-microarray. Er is reeds onderzoek uitgevoerd voor selectieve en specifieke bio merkers,

    maar tot nu toe zijn deze niet ontdekt. (9)

    Tekens van hypoperfusie zijn oligurie, mentale verwardheid, vlekjes op de huid,

    vertraagde capillaire refill en hyperlactatemie. Oligurie wordt meestal pas na enkele uren

    opgemerkt en mentale verwardheid is moeilijk in te schatten bij een overgrote meerderheid

    van patiënten. Scores voor orgaanfalen houden vaak geen rekening met reeds vooraf

    bestaande orgaanschade en er bestaan ook veel verschillende definities voor. (9)

    Een definitieve diagnose van septische shock kan gesteld worden wanneer een infectie

    klinisch schijnbaar aanwezig is en microbiologisch bevestigd wordt zonder andere acute

    ziekte. Septische shock is waarschijnlijk wanneer een infectie klinisch schijnbaar aanwezig is

    zonder dat deze microbiologisch aantoonbaar is. Wanneer een andere acute ziekte mogelijks

    de oorzaak is van het falen van organen en er geen microbiologisch gedocumenteerde

    infectie aangetoond is, is het onwaarschijnlijk dat het om een septische shock gaat. (9)

    1.2.5 Behandeling

    Hoewel cytokines zoals TNF-alfa en interleukine-1 beschouwd worden als de veroorzakers

    van een inflammatie hebben zij ook positieve effecten, aangezien tijdens de infectie een

    inhibitie van de receptoren voor deze stoffen de genezingskans vermindert. (14)

    Preventie van sepsis bestaat uit het geven van vaccins en immunoglobulines, de glycemie

    spiegel tussen 4 mmol/l en 6 mmol/l in stand houden, risicopatiënten profylactisch

    antibiotica geven, preventie van iatrogene infecties en selectieve decontaminering van het

    spijsverteringskanaal en de orofarynx. Enterale nutritionele supplementering, vooral van L-

    arginine, kan zorgen voor een daling van de infecties in kritisch zieke patiënten en na

    electieve operaties, maar kunnen ook zorgen voor een stijging van de mortaliteit. (14, 15)

  • 5

    Patiënten die gediagnosticeerd worden met een septische shock, worden onmiddellijk

    overgebracht naar de intensieve zorgen van een ziekenhuis. Verpleging, ogenblikkelijke

    controle van infectie en de hemodynamische status, ondersteuning van het immuunsysteem

    en de preventie van orgaanfalen is essentieel. (14-16)

    Snelle verwijdering van het geïnfecteerd weefsel via chirurgie en/of toediening van

    antibiotica is levensreddend. Rehydratie moet zo vroeg mogelijk opgestart worden samen

    met de monitoring van de centraal veneuze zuurstofsaturatie en de klinische symptomen.

    Als de hypotensie afkomstig is van een verminderde myocardiale output, kunnen eerst

    inotropica gebruikt worden in plaats van vasopressors. Eventueel kan het nodig zijn om de

    hemodynamische status te herstellen met behulp van bloedtransfusie, of zeldzamer

    vasodilatoren. De patiënten moeten daarnaast ook behandeld worden met zuurstof. Nadat

    de patiënt ontslaan is uit het ziekenhuis blijft opvolging noodzakelijk. (14, 15)

    1.3. ANTIBIOTICA

    1.3.1 Werking

    Antibiotica worden gebruikt bij bacteriële infecties. Antibiotica inhiberen specifieke

    cruciale processen van een bacterie. De groei van de bacterie wordt dus geremd, dit kan

    tijdelijk of definitief zijn. Als de groei van de bacterie definitief geïnhibeerd wordt, spreekt

    men van bactericide antibiotica. In het andere geval is het een bacteriostatisch antibioticum.

    Een bacteriostatisch middel is meestal evenwaardig aan een bactericide bij een volwaardig

    immuunsysteem, het immuunsysteem zal bij een bacteriostatisch antibioticum de overige

    bacteriën uitschakelen.

    Een antibioticum is slechts werkzaam boven de minimaal inhiberende concentratie (MIC).

    Er zijn concentratie-afhankelijke antibiotica en tijdsafhankelijke antibiotica.

    Bij tijdsafhankelijke antibiotica hangt de werkzaamheid af van de tijd dat de

    plasmaconcentratie zich boven de MIC bevindt. Het is dus beter om deze geneesmiddelen

    vaker te doseren. Concentratieafhankelijke antibiotica worden gekenmerkt door een post-

    antibiotisch effect. Naargelang de hoogte van de piekconcentratie hebben deze antibiotica

    een langere werkingsduur. (17)

  • 6

    1.3.2 Resistentie

    Resistentie tegen bepaalde antibiotica kan oorspronkelijk aanwezig zijn in de bacterie,

    maar kan ook verworven zijn. Verworven resistentie ontstaat spontaan door een mutatie in

    de bacterie of door overdracht van genetisch materiaal van een resistente bacterie naar een

    niet-resistente bacterie.

    Als een antibioticum toegediend wordt in een concentratie die zich maar net boven de

    MIC bevindt, dan worden enkel de zeer gevoelige bacteriën gedood. Hierdoor ontstaat een

    meer resistente bacteriekloon. Het is dus noodzakelijk de antibiotica in voldoende hoge

    dosis te doseren. Resistentie ontstaat ook door het onzorgvuldig gebruik van antibiotica,

    bijvoorbeeld onvolledig uitnemen van de medicatie. (17-19)

    1.3.3 Bijwerkingen

    In het menselijk lichaam bevinden zich op vele plaatsen bacteriën, bijvoorbeeld de

    bacteriën in de darmen, die essentieel zijn. De antibacteriële geneesmiddelen beïnvloeden

    ook deze bacteriën. Diarree, gist- en schimmelinfecties zijn dus frequente bijwerkingen van

    een antibioticatherapie. (17)

  • 7

    1.4. Β-LACTAM ANTIBIOTICA

    Deze groep antibiotica wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een β-lactam ring. Er

    bestaan verschillende subgroepen β-lactam antibiotica, de penicillines, de cefalosporines, de

    carbapenems en de monobactams. Deze subgroepen verschillen in hun basisstructuur, zie

    figuur 1.2. (17, 19, 20)

    β-lactam antibiotica zijn tijdsafhankelijke antibiotica, enkel de carbapenems worden

    gekenmerkt door een post-antibiotisch effect. Deze antibiotica zorgen ervoor dat de

    biosynthese van het peptidoglycaan van de bacteriën geïnhibeerd wordt. Zowel

    grampositieve als gramnegatieve bacteriën bevatten een laag peptidoglycanen als onderdeel

    van hun celwand. Deze laag zorgt ervoor dat de bacterie zijn vorm behoudt, en zorgt

    daarnaast ook voor stevigheid. Wanneer deze laag ontbreekt, zal de bacterie afsterven. (17)

    Sommige bacteriën produceren β-lactamasen. β-lactamase hydrolyseert de β-lactam ring

    van het antibioticum. Het antibioticum wordt dus inactief. Vaak worden deze antibiotica dus

    samen gegeven met een β-lactamase inhibitor. (17)

    Meropenem, ceftazidim, piperacilline, ceftriaxon en flucloxacilline worden in dit eindwerk

    bestudeerd.

    Figuur 1.2: Structuren van de β-lactam antibiotica (http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/contents/v75/full/75130303.html)

    Penicilline

    Cefalosporine

    Monobactam

    Carbapenem

  • 8

    1.4.1 Meropenem (zie figuur 1.3)

    1.4.1.1. Plaatsbepaling

    Meropenem behoort tot de klasse van de carbapenems. Het is een breedspectrum

    antibioticum dat intraveneus (IV) wordt toegediend bij bacteriële infecties. Om resistentie te

    voorkomen is het aanbevolen meropenem enkel bij ernstige infecties te gebruiken waarbij

    cefalosporines of penicillines onvoldoende werkzaam zijn. Meropenem kan ook worden

    gebruikt bij ernstige nierfunctiestoornissen mits dosisaanpassing. (17, 21)

    1.4.1.2. Interacties en bijwerkingen

    De carbapenems zorgen voor bijwerkingen ter hoogte van het centrale zenuwstelsel,

    zoals convulsies, hallucinaties, myoclonieën en verwardheid. Ze zorgen ook voor een daling

    van de plasmaconcentratie van het anti-epilepticum valproïnezuur en voor een verlaging van

    de drempel voor convulsies.

    Meropenem zelf veroorzaakt vaak trombocytopenie. (17)

    1.4.1.3. Farmacokinetiek en dosering

    Meropenem dringt goed door in de meeste weefsels en in lichaamsvloeistoffen. Het

    geneesmiddel heeft een lage proteïne binding (2%). 70% van het geneesmiddel wordt

    onveranderd geëlimineerd via de nieren. De halfwaardetijd (T1/2) bedraagt ongeveer 1 uur.

    Meropenem dient IV te worden toegediend gedurende 15-30 minuten. (17, 20-22)

    Figuur 1.3: Structuur van meropenem (http://cenblog.org/the-haystack/2011/06/front-line-antibiotics-to-fight-e-coli/)

  • 9

    1.4.2 Ceftazidim en Ceftriaxon (zie figuur 1.4 en 1.5)

    1.4.2.1. Plaatsbepaling

    Ceftazidim en ceftriaxon zijn breedspectrum, semisynthetische antibiotica. Ze behoren tot

    de derde groep cefalosporines. De cefalosporines van de derde groep mogen enkel gebruikt

    worden bij de behandeling van ernstige infecties waarbij ziekenhuisopname noodzakelijk is.

    (17)

    1.4.2.2. Interacties en bijwerkingen

    De cefalosporines kunnen mogelijks hematologische stoornissen veroorzaken, zoals

    hemolytische anemie, nefrotoxiciteit en eerder zeldzaam hepatische stoornissen. Ceftazidim

    kan neurotoxiciteit veroorzaken bij hoge plasmaconcentraties. Bij IV toediening ontstaat

    vaak flebitis, na intramusculaire (IM) toediening pijn en lokale infectie. Een nevenwerking

    van ceftriaxon is de complexvorming met calcium, ter hoogte van de galblaas, wat kan

    zorgen voor galblaaskolieken. (17)

    1.4.2.3. Farmacokinetiek en dosering

    Ceftazidim wordt voornamelijk onveranderd geëxcreteerd via de nieren en heeft een lage

    proteïnebinding (17%). Het verspreidt zich voldoende in lichaamsvochten. De T1/2 bedraagt

    ongeveer 2 uur. Het kan zowel IM als IV worden toegediend. IM toediening is enkel

    aangewezen wanneer IV toediening ongeschikt of niet mogelijk is. Ceftazidim dient

    Figuur 1.4: Structuur van ceftazidim (http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceftazidime.png)

    Figuur 1.5: Structuur van ceftriaxon (http://de.wikipedia.org/wiki/Ceftriaxon)

  • 10

    intermittent, om de acht uur, te worden toegediend. Bij ernstige infecties is het mogelijk de

    dosis of de doseerfrequentie te verhogen. (17, 20, 23)

    Ceftriaxon verspreidt zich snel in het weefselvocht en heeft een lange halfwaardetijd (8

    uur). De halfwaardetijd is verlengd bij patiënten met een gecombineerde lever- en

    nierfunctiestoornis. Het heeft een hoge proteïnebinding, die afhankelijk is van de

    concentratie, voor concentraties lager dan 100 µg/ml heeft ceftriaxon een proteïne binding

    van ongeveer 95%, voor hogere concentraties ligt de proteïnebinding merkelijk lager. Het

    geneesmiddel wordt gedeeltelijk onveranderd geëxcreteerd via de urine en gedeeltelijk via

    de feces. Ceftriaxon kan IV of IM over 30 minuten of langer worden toegediend. De dosering

    moet aangepast worden indien er een nierfunctiestoornis of leverfunctiestoornis aanwezig is.

    (17, 20)

    1.4.3 Piperacilline en flucloxacilline (zie figuur 1.6 en 1.7)

    1.4.3.1. Plaatsbepaling

    Piperacilline is een breedspectrum penicilline. Het wordt aanbevolen piperacilline enkel

    te gebruiken in hospitaalmilieu. Flucloxacilline is een penicillinase resistent small-

    spectrumpenicilline en wordt voornamelijk gebruikt voor de behandeling van huidinfecties

    zoals cellulitis wanneer een antibioticakuur noodzakelijk is. (17)

    Figuur 1.6: Structuur van piperacilline (http://www.pharmawiki.ch/wiki/index.php?wiki=Piperacillin&Spez=True)

    Figuur 1.7: Structuur van flucloxacilline (http://rissubscontchel.nazuka.net/q.php?n=699-amoxicillin-vor-dem-essen)

  • 11

    1.4.3.2. Interacties en bijwerkingen

    Penicillines kunnen aanleiding geven tot allergische reacties, eventueel zelfs tot een

    anafylactische shock. Flucloxacilline kan zorgen voor cholestatische hepatitis. (17)

    1.4.3.3. Farmacokinetiek en dosering

    Piperacilline wordt voornamelijk onveranderd geëxcreteerd via de nieren. Het wordt

    samen toegediend met tazobactam, dit zorgt ervoor dat het antibioticum niet wordt

    afgebroken door β-lactamase. Piperacilline heeft een T1/2 van ongeveer 1 uur en een

    proteïnebinding van 30%. Het geneesmiddel verspreidt zich goed naar andere weefsels.

    Piperacilline wordt best via een langzame IV injectie (3-5 min) of via een IV infuus met een

    inlooptijd van 30 min toegediend. (17, 20, 24)

    Flucloxacilline kan oraal, parenteraal, intra-pleuraal, of intra-articulair worden toegediend.

    Oraal moet het geneesmiddel op een lege maag worden ingenomen. Het heeft een zeer

    hoge plasma-eiwitbinding (95%). Ondanks de hoge proteïnebinding verspreidt flucloxacilline

    zich wel goed naar andere weefsels. Ongeveer de helft wordt onveranderd geëlimineerd via

    de urine. Bij ernstige nierfunctiestoornissen is een dosisverlaging of een verhoging van het

    doseerinterval aangewezen. Flucloxacilline heeft een T1/2 van ongeveer 1 uur. (17, 20, 25)

    1.5. ANALYSE VAN DE BETA-LACTAM ANTIBIOTICA

    1.5.1 Staalvoorbereiding

    1.5.1.1. Vaste fase extractie

    Vaste fase extractie geeft redelijk goede terugvindbaarheden (‘recoveries’), voor deze

    methode zijn echter grote plasmavolumes noodzakelijk. Deze methode is ook duur. Twee

    extractiekolommen worden vaak beschreven in de literatuur, C-18 kolommen en Oasis® HLB

    kolommen. Van der Waalskrachten weerhouden het analyt bij de C-18 kolommen, terwijl

    verschillende polaire en apolaire interacties zorgen voor de weerhouding bij de Oasis® HLB

    kolommen. (26-30)

  • 12

    1.5.1.2. Ultrafiltratie

    Ultrafiltratie is een goede extractiemethode met goede ‘recoveries’. Nadeel van deze

    methode is dat deze zeer duur is. Ultrafiltratie vereist materialen die niet standaard in elk

    laboratorium aanwezig zijn. (26, 31-33)

    1.5.1.3. Methanol/Acetonitrile precipitatie

    Deze methode wordt vaak toegepast voor de staalvoorbereiding van β-lactam antibiotica.

    Deze methode is geschikt voor alle β-lactam antibiotica die onderzocht worden in dit

    eindwerk. Methanol/acetonitrile precipitatie is de meest reproduceerbare methode en geeft

    ook de beste recovery. Daarnaast is deze ook een stuk goedkoper dan ultrafiltratie en vaste

    fase extractie. (26, 34-38)

    1.5.2 Chromatografie

    High performance/pressure liquid chromatography (HPLC) in combinatie met een diode

    array detector (DAD) wordt in de farmaceutische industrie zeer vaak gebruikt voor de

    scheiding, identificatie en gehaltebepaling van componenten. Stoffen kunnen

    geïdentificeerd worden door de retentietijd te vergelijken met de retentietijd van

    referentiestoffen en aan de hand van spectra. Voor analyse van de β-lactam antibiotica

    wordt normaal gebruik gemaakt van reversed-phase C18P-kolommen. Deze hebben licht

    polaire eigenschappen. Een normale C18-kolom wordt gefabriceerd door de silica van een

    kolom te derivatiseren met C18-ketens, de resterende vrije silanol-groepen ondergaan

    vervolgens een end-capping met methyl ketens. Op deze manier zijn alle silanol-groepen

    afgeschermd en worden polaire interacties tussen de stationaire fase en de te analyseren

    componenten vermeden. Bij een C18P-kolom wordt de silica gecontroleerd gederivatiseerd,

    zodat een vast percentage vrije silanol-groepen overblijft. De niet gederivatiseerde silanol-

    groepen kunnen polaire interacties ondergaan met de te analyseren componenten. Door

    deze wijziging wordt de elutietijd voor polaire componenten verlengd en voor apolaire

    verkort. (34, 37, 39)

  • 13

    De mobiele fase bestaat meestal uit fosfaatbuffer en acetonitrile. Het gebruik van een

    zure pH zorgt voor de beste scheiding. De gradiëntelutie met acetonitrile zorgt voor een

    kortere elutietijd van de meest apolaire β-lactam antibiotica. (34, 39)

    Als detector wordt een DAD zeer veel gebruikt; afhankelijk van het absorptiemaximum

    van het specifieke β-lactam antibioticum wordt een bepaalde golflengte geselecteerd voor

    weergave van het chromatogram. Soms wordt massaspectrometrie of tandem

    massaspectrometrie (MS of MSMS) gebruikt als detector. De ionen worden gevormd via

    electrospray ionisatie (ESI) en de scheiding volgens de m/z waarde gebeurt via MS of MSMS.

    (29, 34, 36, 38, 40)

    1.5.3 Interne Standaard

    Aangezien de β-lactam antibiotica een extractie ondergaan voordat ze geïnjecteerd worden

    op de HPLC is het nauwkeuriger een inwendige standaard te gebruiken. Deze inwendige

    standaard wordt toegevoegd voor de extractie, zo wordt gecorrigeerd voor eventuele

    verliezen.

    Cefoperazone is een β-lactam antibioticum, dat behoort tot de derde groep cefalosporines

    (zie figuur 1.8). Dit geneesmiddel is niet beschikbaar in België. (17)

    Het antibioticum heeft een retentietijd gelijkaardig aan de onderzochte β-lactam antibiotica.

    Deze stof wordt bovendien reeds gebruikt als interne standaard in andere analyses in het

    laboratorium.

    Figuur 1.8: Structuur van cefoperzone (http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB4752040.htm)

  • 14

    2. OBJECTIEVEN

    β-lactam antibiotica worden vaak gebruikt bij sepsis. Er bestaat veel onenigheid over de

    concentraties waarbij de β-lactam antibiotica werkzaam zouden zijn. Vaak is het voor de

    dokters niet duidelijk welke dosis zij moeten toedienen aan patiënten met sepsis, aangezien

    deze patiënten ernstig ziek zijn en de plasmaconcentraties bij toediening van standaard

    dosissen anders kunnen liggen dan bij gezonde mensen.

    Er is dus de noodzaak een methode te ontwikkelen die voldoende specifiek en selectief

    meropenem, piperacilline, flucloxacilline, ceftriaxon en ceftazidim kan kwantificeren. Deze β-

    lactam antibiotica worden namelijk vaak gebruikt in het ziekenhuis. De methode moet een

    eenvoudige staalvoorbereiding hebben en de analysetijd moet zo beperkt mogelijk zijn,

    opdat de dosis voor elke patiënt snel geoptimaliseerd kan worden. In de literatuur worden al

    vele methoden beschreven hoe zulke analyses uitgevoerd kunnen worden. Toch is dit

    onderzoek zeker nuttig aangezien de analyse goed moet aansluiten bij de routinemethodes

    die reeds uitgevoerd worden. Op deze manier is het mogelijk tussen de andere routinetesten

    een staal te analyseren.

    In deze thesis worden ook de bewaarcondities van de onderzochte β-lactam antibiotica

    getest bij verschillende omstandigheden -kamertemperatuur, koelkast, diepvries-, zodat de

    te volgen procedure voor de preanalytische fase kan uitgewerkt worden met duidelijke

    richtlijnen betreffende de staalname, de temperatuur bij transport en de bewaarcondities

    tot analyse. Dit laatste is belangrijk aangezien er vaak een tijdspanne is tussen de

    staalafname en de analyse.

    Ten slotte worden enkele farmacokinetische parameters van meropenem bij een

    premature neonaat bepaald aan de hand van een patiëntmodel.

  • 15

    3. MATERIAAL EN METHODEN

    3.1. TOESTELLEN (tabel 3.1)

    Soort toestel Toestel Labonummer Leverancier

    Weegschaal Mettler Toledo AT261 Balans LOPCTBA00001

    Mettler Toledo

    (Zaventem,

    België)

    Droogdamper VLM EC2 CSCHTVE00004

    Thermo Fisher

    Scientific

    (Erembodegem,

    België)

    Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417C CSCHTCE00002 VWR (Leuven,

    België)

    HPLC

    HITACHI

    LaChrom

    ULTRA

    L-2455U Fotodiode

    array detector

    CSCHTAP00021 VWR (Leuven,

    België)

    L-2300 Kolomoven

    L-2200U

    autosampler

    L-2160U Pomp

    Data acquisitie

    HPLC EZChrom Elite

    Kolom HPLC

    Nucleodur® RP C18 Pyramid

    column

    Lengte: 150 mm

    Interne diameter: 4,6 mm

    Partikelgrootte: 5 µm

    CSR00215 Filter Service

    (Eupen, België)

    Tabel 3.1: gebruikte toestellen

  • 16

    3.2. PRODUCTEN EN REAGENTIA (tabel 3.2)

    3.3. METHODEN

    3.3.1 Analyse en kwantificatie van de β-lactam antibiotica met behulp van HPLC

    In deze methode wordt gebruik gemaakt van een NUCLEODUR® RP C18 Pyramid-kolom.

    Dit is ‘reversed phase’ chromatografie, waarbij de stationaire fase apolair, en de mobiele

    fase polair is. Toch heeft de kolom ook licht polaire eigenschappen, waardoor de elutietijd

    van de meest polaire β-lactam antibiotica langer is en er minder piekverbreding optreedt

    voor de apolaire β-lactam antibiotica. De detector is hier een fotodiode array detector (DAD),

    deze meet de absorptie in functie van de tijd over het gehele UV/VIS spectrum, maar geeft

    een chromatogram weer bij een bepaalde golflengte. De golflengte die weergegeven wordt

    kan zelf gekozen worden, meestal wordt gekozen voor de maximale absorptiegolflengte. De

    absorptie van meropenem wordt bepaald bij 300 nm, van cefoperazone, piperacilline en

    flucloxacilline bij 240 nm en van ceftazidim en ceftriaxon bij 290 nm. De mobiele fase bestaat

    uit twee oplossingen, fosfaatbuffer pH 3 en acetonitrile. Er wordt een lineaire gradiënt

    gebruikt, weergegeven in tabel 3.3.

    Fysiologische oplossing Huisbereiding: CSCHRIB00113

    Fosfaatbuffer pH 3 Huisbereiding: CSCHRIB00049

    Methanol HPLC grade Panreac (Barcelona, Spain)

    Acetonitrile HPLC grade (Scharlau, TMC, België)

    Meropenem Meropenem® 500 mg

    Ceftriaxon Ceftriaxone Sandoz® 1 g

    Ceftazidim Glazidim® 1 g

    Flucloxacilline Floxapen® 1 g

    Piperacilline Tazocin® 2 g

    Cefoperazone CSR00195-Sigma Aldrich BVBA

    Tabel 3.2: Gebruikte producten en reagentia

  • 17

    Tijd (min) % solvent A (fosfaatbuffer pH 3) % solvent B (acetonitrile)

    0 95 5

    20 50 50

    20,2 95 5

    30 95 5

    De totale looptijd van elk staal is 30 minuten bij een flow van 1 ml/min. De temperatuur

    van de oven bedraagt 35°C. Het injectievolume is 20 µl per staal.

    Het gehalte van de stoffen wordt in deze proef bepaald via interne standaardisatie, zoals

    beschreven onder 1.5.3.

    3.3.2 Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de kalibratie en de

    interne standaard

    3.3.2.1. Aanmaken van de stockoplossingen (50mg/ml) van de β-lactam antibiotica

    500 mg meropenem (Meropenem® 500 mg) wordt opgelost in gedestilleerd water en

    aangelengd tot 10,00 ml.

    1 g ceftazidim (Glazidim® 1 g), ceftriaxon (Ceftriaxone Sandoz® 1 g) en flucloxacilline

    (Floxapen® 1 g) worden elk apart opgelost in gedestilleerd water en aangelengd tot 20,00 ml.

    2 g piperacilline (Tazocin® 2 g) wordt opgelost in gedestilleerd water en aangelengd tot

    40,00 ml.

    Deze stockoplossingen hebben dus een concentratie van 50 mg/ml.

    3.3.2.2. Aanmaken van de werkoplossingen en standaarden van de β-lactam antibiotica

    Werkoplossing 10 mg/ml

    Van elke stockoplossing wordt 200 µl genomen en gemengd.

    Werkoplossing 2 mg/ml

    200 µl van de werkoplossing van 10 mg/ml wordt toegevoegd aan 800 µl fysiologische

    oplossing.

    Werkoplossing 200 µg/ml

    100 µl van de werkoplossing van 2 mg/ml wordt samengevoegd met 900 µl fysiologische

    oplossing.

    Tabel 3.3: samenstelling mobiele fase

  • 18

    Werkoplossing 20 µg/ml

    100 µl van de werkoplossing van 200 µg/ml wordt gemengd met 900 µl fysiologische

    oplossing.

    Deze werkoplossingen worden gebruikt voor het aanmaken van de kalibratoren zoals

    weergegeven in tabel 3.4. Het werkgebied wordt gekozen in functie van gegevens uit de

    literatuur. (26, 39)

    Werkoplossing

    20 µg/ml (µl)

    Werkoplossing

    200 µg/ml (µl)

    Werkoplossing

    2 mg/ml (µl)

    Serum

    (µl)

    Concentratie

    (µg/ml)

    / / / 1000 0

    100 / / 900 2

    / 25 / 975 5

    / 50 / 950 10

    / 125 / 875 25

    / / 25 975 50

    / / 50 950 100

    / / 75 925 150

    / / 100 900 200

    De kalibratoren worden verdeeld in volumes van 200 µl en in de diepvries geplaatst bij

    -80°C.

    3.3.2.3. Aanmaken van de methanol + cefoperazone (25 µg/ml) oplossing

    2,5 mg cefoperazone wordt opgelost in methanol en aangelengd tot 100 ml met

    methanol.

    Tabel 3.4: aanmaak standaardoplossingen

  • 19

    3.3.3 Bereiding van de stock- en werkoplossingen voor de controle

    Net zoals in 3.3.2.2. worden werkoplossingen aangemaakt van 10 mg/ml, 2 mg/ml en 200

    µg/ml. De kwaliteitscontroles worden aangemaakt zoals in tabel 3.5. Wanneer de HPLC alle

    standaarden en kwaliteitscontroles heeft geanalyseerd, kunnen de concentraties van de

    kwaliteitscontroles berekend worden via de ijklijn.

    Werkoplossing

    20 µg/ml (µl)

    Werkoplossing

    200 µg/ml (µl)

    Werkoplossing

    2 mg/ml (µl)

    Serum (µl) Concentratie

    (µg/ml)

    / 20 / 980 4

    / 100 / 900 20

    / / 40 960 80

    / / 80 920 160

    Zoals de standaarden, worden de kwaliteitscontroles na aanmaak ook verdeeld in

    volumes van 200 µl en in de diepvries bij -80°C geplaatst.

    3.3.4 Extractie van de standaarden en kwaliteitscontroles

    Van elke standaard en kwaliteitscontrole wordt een hoeveelheid van 200 µl uit de

    diepvries gehaald. Aan elk van deze stalen wordt 400 µl methanol + cefoperazone

    toegevoegd. Na kort mengen worden de stalen onmiddellijk gecentrifugeerd voor 5 minuten

    aan 14000 rotaties per minuut (rpm). De bovenstaande vloeistof wordt overgebracht in een

    proefbuis en ingedampt onder N2. Nadien wordt het residu heropgelost in 100 µl

    fosfaatbuffer pH 3. Deze oplossing wordt overgebracht in een vial met insert, en 20 µl wordt

    geïnjecteerd op de HPLC-DAD.

    3.3.5 Validatie van de analyse van de β-lactam antibiotica

    De methodevalidatie wordt uitgevoerd volgens de standaard richtlijnen voor

    methodevalidatie van chromatografische analysemethoden zoals beschreven door F. Peters

    (For. Sci. Int. 165 (2007) 216-224; Validation of new methods). De parameters die bepaald

    worden zijn de herhaalbaarheid, de reproduceerbaarheid, de juistheid, de lineariteit, de

    detectielimiet en de kwantificatielimiet, de bewaarcondities van de stalen en de analytische

    specificiteit.

    Tabel 3.5: aanmaak kwaliteitscontroles

  • 20

    3.3.5.1. De herhaalbaarheid

    De herhaalbaarheid of de intra-assay precisie wordt gedefinieerd als de nauwkeurigheid

    wanneer dezelfde parameters, solventen, reagentia en materialen worden gebruikt. Er

    worden zes verschillende stalen voor kwaliteitscontroles aangemaakt en geanalyseerd. Voor

    elk concentratieniveau wordt vervolgens het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD) en de

    variatiecoëfficiënt (VC) berekend. De variatiecoëfficiënt mag maximaal 10% zijn,

    uitgezonderd voor de LLOQ, hierbij mag de VC 15% zijn.

    3.3.5.2. De reproduceerbaarheid

    De reproduceerbaarheid of de inter-assay precisie wordt gedefinieerd als de

    nauwkeurigheid onder verschillende omstandigheden. Hiervoor worden 6 verschillende

    stalen voor kwaliteitscontroles aangemaakt op verschillende dagen en geanalyseerd. Voor

    elk concentratieniveau wordt vervolgens het gemiddelde, de SD en de VC bepaald. De

    variatiecoëfficiënt mag maximaal 15 % zijn, met uitzondering van de LLOQ, hierbij mag de VC

    20% zijn.

    3.3.5.3. De lineariteit

    De ijklijn wordt met behulp van de standaardreeks, zoals beschreven in 3.3.2. opgesteld.

    De concentraties zijn verdeeld over het gehele werkgebied en de kalibratoren worden

    opgemaakt in de blanco matrix die geschikt bevonden werd op basis van preliminaire

    experimenten. Er wordt ook een nulstandaard met interne standaard geanalyseerd ter

    controle.

    3.3.5.4. LOD en LLOQ

    De ‘limit of detection’ of LOD is de concentratie van een component die net nog met

    genoeg zekerheid kan geïdentificeerd worden in een plasmastaal. De signaal tot

    ruisverhouding (S/N) van de LOD is minimaal gelijk aan drie. De ‘lower limit of quantification’

    of LLOQ is de laagste concentratie van een component die gekwantificeerd kan worden in

    een plasmastaal. De S/N waarde van de LLOQ is minimaal gelijk aan 10. De LLOQ wordt

    geanalyseerd op twee verschillende dagen in drievoud.

    3.3.5.5. De bewaarcondities van de stalen

    De chemische stabiliteit van de stalen wordt gedefinieerd in een bepaalde matrix, onder

    specifieke condities en voor een gegeven tijdsinterval. De stabiliteit van de geanalyseerde

    component in een bepaalde matrix moet verzekerd zijn tijdens de pre-analytische fase en

  • 21

    tijdens de analytische procedure, opdat het resultaat betrouwbaar zou zijn. Voor deze test

    worden de kwaliteitscontroles geanalyseerd nadat ze drie vries-dooi cycli hebben ondergaan,

    of nadat ze 5 uur en 24 uur bij kamertemperatuur in het donker en in het licht geplaatst zijn.

    Daarnaast wordt nagegaan of de stalen gedurende een dag stabiel zijn in de koelkast of

    diepvries. Ten slotte wordt getest of de extracten in de lader stabiel blijven. Er wordt

    gesproken van significante afbraak wanneer de bias van de stalen groter is dan 10% voor een

    bepaalde component.

    3.3.5.6. De analytische specificiteit

    10 plasmastalen van verschillende patiënten worden geprecipiteerd zonder toevoeging

    van een interne standaard. Hierna worden ze geïnjecteerd en geanalyseerd. De bedoeling

    van de test is om interferenties op de retentietijd van de onderzochte β-lactam antibiotica

    en de interne standaard op te sporen.

    3.3.5.7. De juistheid

    Op basis van de 6 waarden verkregen bij het testen van de reproduceerbaarheid wordt

    voor elk concentratieniveau de fout van de gemiddelde waarde ten opzichte van de

    werkelijke waarde berekend. De bias mag maximaal 10 procent zijn met uitzondering van de

    LLOQ, waar een bias van 15% toegestaan wordt.

  • 22

    4. RESULTATEN

    4.1. VALIDATIE VAN DE METHODE

    4.1.1 Herhaalbaarheid

    In tabel 4.1. worden de resultaten weergegeven voor de herhaalbaarheid. Hieruit kan

    besloten worden dat de methode voldoet aan de voorwaarden voor de herhaalbaarheid.

    Target 4 µg/ml 20 µg/ml 80 µg/ml 160 µg/ml

    VC QC1 (%) VC QC2(%) VC QC3 (%) VC QC4 (%)

    Meropenem 5,41 6,81 4,91 3,23

    Piperacilline 3,67 3,33 6,33 3,83

    Flucloxacilline 8,91 2,89 5,94 2,82

    Ceftazidim 6,57 6,39 6,46 3,26

    Ceftriaxon 5,71 1,78 9,13 2,81

    4.1.2 Reproduceerbaarheid

    De resultaten voor de reproduceerbaarheid worden weergegeven in tabel 4.2, 4.3, 4.4 en

    4.5. De variatiecoëfficiënt van elke component voor elke kwaliteitscontrole ligt lager dan

    15%. Deze methode is dus conform met de reproduceerbaarheid.

    Gemiddelde (µg/ml) Standaarddeviatie VC (%) Bias (%)

    Meropenem 3,90 0,24 6,05 -2,51

    Piperacilline 4,24 0,25 5,94 6,09

    Flucloxacilline 3,73 0,41 11,08 -6,86

    Ceftazidim 3,94 0,44 11,18 -1,60

    Ceftriaxon 3,83 0,52 13,58 -4,22

    Tabel 4.2: Resultaten reproduceerbaarheid QC1 (4 µg/ml)

    Tabel 4.1: Resultaten herhaalbaarheid

  • 23

    4.1.3 De juistheid

    In tabel 4.2, 4.3, 4.4 en 4.5 wordt de bias weergegeven van de kwaliteitscontroles die

    geanalyseerd worden bij de inter-assay precisie. De bias ligt lager dan 10% voor elke

    component op elk concentratieniveau. De methode voldoet aan dit criterium.

    Gemiddelde (µg/ml) Standaarddeviatie VC (%) Bias (%)

    Meropenem 19,52 1,16 5,94 -2,42

    Piperacilline 21,85 0,76 3,49 9,24

    Flucloxacilline 20,91 1,63 7,81 4,55

    Ceftazidim 21,71 1,57 7,25 8,53

    Ceftriaxon 20,74 0,91 4,37 3,72

    Gemiddelde (µg/ml) Standaarddeviatie VC (%) Bias (%)

    Meropenem 83,16 12,36 14,87 3,95

    Piperacilline 84,17 5,29 6,29 5,21

    Flucloxacilline 79,00 6,22 7,87 -1,25

    Ceftazidim 78,77 4,22 5,36 -1,54

    Ceftriaxon 78,54 7,44 9,48 -1,83

    Gemiddelde (µg/ml) Standaarddeviatie VC (%) Bias (%)

    Meropenem 151,94 7,70 5,07 -5,03

    Piperacilline 174,70 1,88 1,08 9,19

    Flucloxacilline 156,50 6,50 4,16 -2,19

    Ceftazidim 174,63 8,43 4,83 9,14

    Ceftriaxon 162,96 12,95 7,94 1,85

    Tabel 4.4: Resultaten reproduceerbaarheid QC3 (80 µg/ml)

    Tabel 4.5: Resultaten reproduceerbaarheid QC4 (160 µg/ml)

    Tabel 4.3: Resultaten reproduceerbaarheid QC2 (20 µg/ml)

  • 24

    y = 0,0325x + 0,0566R² = 0,9985

    0

    2

    4

    6

    8

    0 50 100 150 200

    Rel

    atie

    ve p

    iekh

    oo

    gte

    mer

    op

    enem

    Concentratie meropenem

    Ijklijn meropenem

    y = 0,0233x + 0,0172R² = 0,9984

    0

    1

    2

    3

    4

    5

    0 50 100 150 200

    Rel

    atie

    ve p

    iekh

    oo

    gte

    ceft

    azid

    im

    Concentratie ceftazidim

    Ijklijn ceftazidim

    y = 0,0177x - 0,005R² = 0,9987

    0

    1

    2

    3

    4

    0 50 100 150 200

    Rel

    atie

    ve p

    iekh

    oo

    gte

    ceft

    riax

    on

    Concentratie ceftriaxon

    Ijklijn ceftriaxon

    y = 0,0127x + 0,0205R² = 0,9996

    0

    1

    2

    3

    0 50 100 150 200

    Rel

    atie

    ve p

    iekh

    oo

    gte

    flu

    clo

    xaci

    llin

    e

    Concentratie flucloxacilline

    Ijklijn flucloxacilline

    y = 0,0141x - 0,0033R² = 0,9998

    0

    1

    2

    3

    0 50 100 150 200

    rela

    tiev

    e p

    iekh

    oo

    gte

    pip

    erac

    illin

    e

    Concentratie piperacilline

    Ijklijn piperacilline

    4.1.4 Lineariteit

    Elke dag werd een ijklijn opgesteld voor meropenem, ceftazidim, piperacilline, ceftriaxon

    en flucloxacilline, deze worden weergegeven in figuur 4.1-4.5. In tabel 4.6 worden de

    richtingscoëfficiënten (rico) en de determinatiecoëfficiënten (R2) weergegeven voor elke

    ijklijn.

    Figuur 4.1: Ijklijn Meropenem

    Figuur 4.1: Kalibratielijn Meropenem

    Figuur 4.2: Ijklijn Ceftazidim

    Figuur 4.2: Kalibratielijn Ceftazidim

    Figuur 4.3: Ijklijn Ceftriaxon

    Figuur 4.3: Kalibratielijn Ceftriaxon

    Figuur 4.4: Ijklijn Flucloxacilline

    Figuur 4.4: Kalibratielijn Flucloxacilline

    Figuur 4.5: Ijklijn Piperacilline

    Figuur 4.5: Kalibratielijn Piperacilline

  • 25

    De determinatiecoëfficiënt is voor elke component minimaal 0,9983. De standaarddeviatie

    op de helling is maximaal 8,8437%.

    Voor meer dan 75% van de kalibratoren is de bias van de teruggerekende concentratie

    kleiner dan 20%. Volgens het European Medicines Agency mag het lineair model aanvaard

    worden wanneer hieraan voldaan wordt. Het lineair model wordt dus aanvaard.

    (http://www.ema.europa.eu/ema/)

    4.1.5 LLOQ

    In tabel 4.7 worden de resultaten voor de LLOQ’s weergegeven, bekomen bij de analyses

    op de eerste dag. In tabel 4.8 worden de resultaten voor de tweede analyse van de LLOQ’s

    getoond. De VC is steeds kleiner dan 15%. In tabel 4.9 worden de zes resultaten

    samengevoegd, de bias van de LLOQ’s ligt lager dan 15% en de VC lager dan 20%. De LLOQ

    mag dus vastgelegd worden op 2 µg/ml.

    Meropenem Ceftazidim Ceftriaxon Piperacilline Flucloxacilline

    rico R² rico R² rico R² rico R² rico R²

    Dag 1 0,0325 0,9985 0,0234 0,9983 0,0176 0,9987 0,0141 0,9999 0,0127 0,9996

    Dag 2 0,0333 0,9998 0,0251 0,9986 0,0185 0,9994 0,0140 0,9984 0,0130 0,9984

    Dag 3 0,0320 0,9997 0,0259 0,9997 0,0182 0,9984 0,0139 0,9991 0,0130 0,9992

    Dag 4 0,0398 0,9998 0,0281 0,9999 0,0217 0,9998 0,0138 0,9997 0,0112 0,9993

    Dag 5 0,0376 0,9997 0,0273 0,9997 0,0184 0,9984 0,0143 0,9992 0,0131 0,9992

    Dag 6 0,0348 0,9993 0,0257 0,9995 0,0180 0,9992 0,0148 0,9989 0,0137 0,9991

    VC

    (%)

    8,8437 0,0499 6,3559 0,0640 7,9165 0,0586 2,5418 0,0531 6,7183 0,0403

    Tabel 4.6: Resultaten kalibratie

    http://www.ema.europa.eu/ema/

  • 26

    LLOQ

    (µg/ml)

    LLOQ

    (µg/ml)

    LLOQ

    (µg/ml)

    Gemiddelde

    (µg/ml)

    SD VC

    (%)

    Meropenem 1,95 2,18 2,34 2,16 0,20 9,15

    Piperacilline 1,82 1,93 1,85 1,87 0,06 3,21

    Flucloxacilline 1,59 1,52 1,67 1,59 0,07 4,55

    Ceftazidim 1,80 1,87 1,78 1,81 0,05 2,59

    Ceftriaxon 1,79 1,94 2,05 1,93 0,13 6,79

    LLOQ

    (µg/ml)

    LLOQ

    (µg/ml)

    LLOQ

    (µg/ml)

    Gemiddelde

    (µg/ml)

    SD VC (%)

    Meropenem 1,92 2,38 2,33 2,21 0,25 11,31

    Piperacilline 2,40 2,16 2,15 2,24 0,14 6,33

    Flucloxacilline 2,36 1,94 2,19 2,16 0,21 9,91

    Ceftazidim 1,61 1,76 1,80 1,72 0,10 6,02

    Ceftriaxon 1,86 1,88 1,86 1,87 0,01 0,47

    Gemiddelde

    (µg/ml)

    SD VC (%) Bias (%)

    Meropenem 2,18 0,20 9,33 9,22

    Piperacilline 2,05 0,23 11,00 2,62

    Flucloxacilline 1,88 0,34 18,23 -6,08

    Ceftazidim 1,77 0,09 4,95 -11,59

    Ceftriaxon 1,90 0,09 4,70 -5,15

    Tabel 4.7: Resultaten LLOQ’s dag 1 (2 µg/ml)

    Tabel 4.8: Resultaten LLOQ’s dag 2 (2 µg/ml)

    Tabel 4.9: Resultaten LLOQ’s (2 µg/ml)

  • 27

    4.1.6 De bewaarcondities van de stalen

    Uit de analyse van de kwaliteitscontroles blijkt dat de stalen niet significant afbreken door

    een vries-dooi cyclus. Na drie cycli liggen de concentraties van de antibiotica nog steeds

    binnen de grenzen van de doelconcentratie, zie tabel 4.10.

    In tabel 4.11 worden de resultaten getoond wanneer de stalen 5 uur bij

    kamertemperatuur bewaard worden. Meropenem blijkt voor drie van de vier

    kwaliteitscontroles significant afgebroken te zijn in het donker, en voor twee in het licht.

    Flucloxacilline is significant afgebroken voor twee kwaliteitscontroles in het donker, en voor

    drie onder invloed van licht. Er kan besloten worden dat meropenem en flucloxacilline

    afbraak vertonen wanneer ze 5 uur bij kamertemperatuur bewaard worden. De stalen zijn

    niet lichtgevoelig.

    Target 4

    µg/ml

    20

    µg/ml

    80

    µg/ml

    160

    µg/ml

    Bias

    QC1

    (%)

    Bias

    QC2

    (%)

    Bias

    QC3

    (%)

    Bias

    QC4

    (%)

    Meropenem -7,53 -7,06 -2,63 -3,58

    Piperacilline 2,95 9,36 -2,90 3,83

    Flucloxacilline -3,68 -9,38 -6,49 -9,41

    Ceftazidim 7,83 4,54 -5,28 8,73

    Ceftriaxon 7,61 8,53 -5,03 -3,74

    Tabel 4.10: resultaten na 3 vries-dooi cycli

  • 28

    Aangezien er bij de stabiliteitsstudie duidelijk afbraak te zien is bij meropenem en

    flucloxacilline na 5 uur, werd ook de stabiliteit getest van de β-lactam antibiotica wanneer

    deze 2,5 uur bewaard worden bij kamertemperatuur. Deze testen werden meermaals

    uitgevoerd. Enkele kwaliteitscontroles vertoonden significante afbraak voor meropenem en

    flucloxacilline, terwijl andere kwaliteitscontroles stabiel bleken voor deze componenten. Op

    basis van deze resultaten was het dus moeilijk een correct besluit te vormen. Omdat de

    resultaten niet reproduceerbaar waren, werd nagegaan wat de stabiliteit voor deze

    antibiotica in de literatuur was. In de literatuur zijn er ook veel tegenstrijdige resultaten. (28,

    32, 35, 39)

    Wanneer de stalen 24 uur bij kamertemperatuur bewaard worden (tabel 4.12) breken alle

    antibiotica behalve ceftriaxon significant af. Het wordt opnieuw duidelijk dat licht geen

    invloed heeft op de stabiliteit van de onderzochte antibiotica in de stalen.

    Target 4

    µg/ml

    20

    µg/ml

    80

    µg/ml

    160

    µg/ml

    Donker Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Meropenem -46,55 -16,60 -1,90 -13,36

    Piperacilline 6,08 8,97 -3,44 1,84

    Flucloxacilline -19,73 -7,90 -5,42 -18,24

    Ceftazidim -2,65 0,04 6,07 -2,10

    Ceftriaxon 4,48 9,25 3,88 -3,11

    Licht

    Meropenem -33,58 -23,27 2,75 -9,95

    Piperacilline -2,08 7,75 -2,43 -9,33

    Flucloxacilline -6,15 -10,64 -10,60 -12,38

    Ceftazidim 6,60 -2,26 6,79 -0,87

    Ceftriaxon 7,93 6,08 4,92 -0,40

    Tabel 4.11: Resultaten na 5u bij kamertemperatuur

  • 29

    Uit tabel 4.13 en 4.14 blijkt dat de onderzochte antibiotica in de stalen stabiel zijn

    wanneer ze een dag in de koelkast (6°C) of diepvries (-20°C) geplaatst worden. De extracten

    van de kalibratoren kunnen 24 uur in de staallader geplaatst worden (zie figuur 4.6-4.8),

    uitgezonderd voor meropenem, voor deze component treedt lichte afbraak op.

    Target 4

    µg/ml

    20

    µg/ml

    80

    µg/ml

    160

    µg/ml

    Donker Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Meropenem -18,78 -23,41 -22,36 -18,38

    Piperacilline -17,80 -3,22 -31,63 -24,03

    Flucloxacilline -58,13 -27,87 -28,63 -24,92

    Ceftazidim -17,08 -10,01 -12,84 -5,25

    Ceftriaxon -4,60 0,62 -6,98 -5,40

    Licht

    Meropenem -11,68 -28,51 -25,74 -24,46

    Piperacilline -32,73 -6,52 -28,84 -27,69

    Flucloxacilline -52,60 -27,79 -23,13 -25,91

    Ceftazidim -18,88 -15,36 -14,94 -7,05

    Ceftriaxon -7,00 1,09 -0,60 -5,14

    Tabel 4.12: Resultaten na 24u bij kamertemperatuur

  • 30

    Target 4

    µg/ml

    20

    µg/ml

    80

    µg/ml

    160

    µg/ml

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Meropenem -6,50 9,58 -4,86 -8,89

    Piperacilline 0,68 -4,29 7,03 4,83

    Flucloxacilline 7,50 3,36 -3,25 -10,31

    Ceftazidim -2,50 8,36 5,14 10,88

    Ceftriaxon -5,18 -4,00 1,50 -3,32

    Target 4

    µg/ml

    20

    µg/ml

    80

    µg/ml

    160

    µg/ml

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Bias

    (%)

    Meropenem -8,75 2,53 -6,22 -4,10

    Piperacilline -1,30 -1,05 1,73 -0,97

    Flucloxacilline -0,08 6,72 -9,07 9,21

    Ceftazidim 10,48 8,14 9,90 -8,78

    Ceftriaxon 0,80 2,72 1,27 11,12

    Tabel 4.14: Resultaten na 24u bij -20°C

    Tabel 4.13: Resultaten na 24u bij 6°C

  • 31

    Piek extract van kalibrator 7

    Piek extract van kalibrator 7 na 24

    uur in staallader

    Figuur 4.6: Chromatogram van de extracten van

    kalibrator 7 bij 300 nm: het blauwe chromatogram is het

    oorspronkelijke, het groene chromatogram is na 24 uur

    in de staallader

    Figuur 4.7: Chromatogram van de extracten van kalibrator 7 bij

    240 nm: het blauwe chromatogram is het oorspronkelijke, het

    groene chromatogram is na 24 uur in de staallader

    Meropenem

    IS

    (cefoperazone)

    Piperacilline Flucloxacilline

  • 32

    Ceftazidim

    Ceftriaxon

    Figuur 4.8: Chromatogram van de extracten van kalibrator 7 bij

    290 nm: het blauwe chromatogram is het oorspronkelijke, het

    groene chromatogram is na 24 uur in de staallader

  • 33

    4.1.7 De analytische specificiteit

    Bij 300 nm worden in de verschillende plasmastalen componenten gevonden met

    ongeveer dezelfde retentietijd als meropenem, maar bij uitvoering van een overlay, wordt

    duidelijk dat meropenem later elueert dan de componenten uit de verschillende

    plasmastalen (figuur 4.9).

    In het chromatogram van 240 nm worden kleine pieken opgemerkt met ongeveer

    dezelfde retentietijd als de interne standaard en flucloxacilline. Een overlay brengt opnieuw

    duidelijkheid. Er kan besloten worden dat er geen interfererende componenten zijn voor

    zowel de interne standaard als flucloxacilline (zie figuur 4.10). Bij piperacilline wordt echter

    een grote piek opgemerkt met dezelfde retentietijd als piperacilline. Het spectrum van deze

    interfererende piek komt overeen met het spectrum van piperacilline. Het plasmastaal bevat

    dus piperacilline.

    Figuur 4.9: Chromatogram bij 300 nm

    Meropenem

  • 34

    Op de golflengte waarbij ceftazidim en ceftriaxon bepaald worden, worden geen

    interfererende componenten opgemerkt voor ceftriaxon. Op de retentietijd van ceftazidim

    wordt wel een piek waargenomen (figuur 4.11). Wanneer het spectrum van de storende

    component bekeken wordt, kan besloten worden dat deze component ceftazidim is. Dus de

    patiënt van wie het plasmastaal afkomstig is, krijgt ceftazidim.

    Figuur 4.10: Chromatogram bij 240 nm

    Flucloxacilline

    Cefoperazone (IS)

    Piperacilline

  • 35

    4.1.8 Besluit validatie

    De geoptimaliseerde methode voldoet aan alle vooropgestelde criteria van de validatie.

    Op basis van de stabiliteitsgegevens kunnen richtlijnen opgesteld worden voor de staalname

    en de temperatuur bij transport van het staal. Dit laatste is vooral belangrijk wanneer het

    staal afkomstig is van externe laboratoria. Om een geïndividualiseerd doseringsschema

    (doseringsinterval en toedieningsduur) op te stellen is het nodig om de farmacokinetische

    parameters van het toegediende antibioticum te bepalen. Dit kan voortaan door meerdere

    bloedstalen tijdens en na infusie van het geneesmiddel bij de patiënt af te nemen. De

    concentratie van het antibioticum kan gemeten worden met de geoptimaliseerde methode

    zoals beschreven in de volgende casus.

    4.2. ANALYSE VAN PATIËNTSTAAL

    Een vrouw, spontaan zwanger van een eeneiige monochoriale diamniotische (MCDA)

    tweeling, wordt opgenomen, na 30 weken zwangerschap, op de maternale intensive care

    unit met de complicatie twin-to-twin-transfusion syndroom (TTTS). Aangezien de foetussen

    een placenta en chorion delen, kunnen de twee foetale circulaties met elkaar verbonden zijn

    (figuur 4.12). Meestal is de uitwisseling van bloed tussen beide foetussen in evenwicht, maar

    bij TTTS is dat niet zo. TTTS ontstaat wanneer er een verbinding gevormd wordt tussen de

    Figuur 4.11: Chromatogram bij 290 nm

    Ceftazidim

    Ceftriaxon

  • 36

    slagader van de ene foetus, en de ader van de andere foetus. De balans tussen de

    bloedvolumes van de beide foetussen wordt dan verstoord, waardoor de donorfoetus

    groeiretardatie vertoont, anemie en uitdroging, terwijl de acceptorfoetus oedeem en

    hartfalen vertoont. (41)

    Opdat de bevalling zo snel mogelijk zou kunnen worden ingeleid, worden corticosteroïden

    toegediend ter bevordering van de longrijping van de beide foetussen. Na 32 weken en vijf

    dagen wordt de tweeling uiteindelijk geboren, met behulp van een keizersnede.

    Deze casus handelt over de donorfoetus, J. Bij zijn geboorte weegt J. 1140 gram en is hij

    39 cm lang. Ondanks de groeirestrictie door TTTS, doet hij het oorspronkelijk goed. (42)

    Figuur 4.12: Verschillende types tweelingen

    (http://accessmedicine.mhmedical.com/ViewLarge.aspx?figid=59796965)

  • 37

    Ten gevolge van herpesletsels, die op dag 25 worden opgemerkt ter hoogte van de

    borsten bij de moeder, en omdat het broertje bewezen genitale herpes heeft, wordt J. ook

    behandeld met aciclovir. Een PCR reactie wordt bij hem uitgevoerd om na te gaan of hij wel

    herpes heeft, maar deze test is negatief.

    Op dag 29 heeft J. een opgezet abdomen, gepaard gaande met algemene malaise. Klinisch

    en radiologisch komt dit overeen met necrotiserende enterocolitis (NEC). NEC komt het

    meest frequent voor bij prematuren. Dit is mogelijk te wijten aan het feit dat bij prematuren

    het gastro-intestinaal systeem onvoldoende ontwikkeld is, en daarnaast ook de gastro-

    intestinale motiliteit onvoldoende is. De mortaliteit van NEC is ongeveer 10%. J. wordt

    hiervoor behandeld met tritherapie antibiotica (vancomycine, cefotaxime, metronidazol). Na

    een week is er echter nog geen verbetering en wordt besloten om hem te opereren. Tijdens

    de operatie wordt duidelijk dat er zich vier perforaties bevinden in het colon. Het colon

    wordt weggenomen tot het sigmoïd en er wordt een stoma aangelegd. Door deze

    perforaties is er veel feces vrijgekomen en is de buik geïnfecteerd geraakt met Enterobacter

    cloacae. Enterobacter cloacae is een commensale gram negatieve bacterie die

    opportunistisch pathogeen is en een MIC heeft van 2 µg/ml. Deze bacterie wordt behandeld

    met meropenem en amikacine. (43)

    De dosis meropenem die moet toegediend worden aan J. is moeilijk in te schatten omdat het

    enerzijds gaat om een neonaat en anderzijds is hij ernstig ziek. Volgens de literatuur is een

    dosis van 20 mg/kg tot 40 mg/kg het meest geschikt en is de T1/2 verlengd ten opzichte van

    volwassen personen. In eerste instantie wordt 55 mg IV (± 30 mg/kg) gegeven met een

    interval van acht uur en een inlooptijd van 30 minuten. Er worden bloedstalen afgenomen

    onmiddellijk na stopzetting van het infuus (T0), na 10 minuten (T10) en na 20 minuten (T20).

    De plasmaspiegels worden bepaald en zijn weergegeven in tabel 4.15. (20, 44)

    Tijdstip staalname Plasmaspiegel meropenem

    T0 (stopzetting infuus) 54 µg/ml

    T10 (10 min. na infuus) 32 µg/ml

    T20 (20 min. na infuus) 28 µg/ml

    Tabel 4.15: Plasmaspiegel meropenem bij infuus met inlooptijd van 30 minuten en dosis van 55

    mg

  • 38

    Uit figuur 4.13 en onderstaande vergelijking kan de halfwaardetijd bepaald worden. De

    T1/2 bedraagt 21 minuten.

    rico =−𝑘𝑒

    2,303

    Halfwaardetijd = 0,693/𝑘𝑒

    waarin: 𝑘𝑒: de eliminatieconstante (min−1)

    Na 6 halfwaardetijden, of ongeveer 2 uur, valt de plasmaconcentratie onder de MIC

    waarde (2 µg/ml). Deze veronderstelling is correct wanneer de farmacokinetiek van

    meropenem wordt weergegeven via een één-compartimenteel model. Dit is echter niet het

    geval, ook in de literatuur wordt beschreven dat de farmacokinetiek van meropenem beter

    beschreven wordt met een twee-compartimenteel model. De snelle daling van de

    plasmaspiegel kort na stopzetting van het infuus is dus te wijten aan de combinatie van

    distributie en eliminatie. De eliminatie T1/2 is dus wellicht een stuk langer. (26)

    Omdat J. het geneesmiddel goed blijkt te verdragen, wordt de dosis verhoogd naar 40

    mg/kg en de inlooptijd van het infuus wordt verlengd van 30 minuten naar 4 uur. Het

    interval tussen twee toedieningen blijft acht uur. Tabel 4.16 en figuur 4.14 tonen de

    plasmaconcentraties die hiermee bekomen worden. De eliminatiehalfwaardetijd bedraagt

    Figuur 4.13: Grafiek van de log(C) van meropenem in functie van de tijd bij een dosis

    van 55 mg

    y = -0,0143x + 1,7042R² = 0,895

    1

    1,1

    1,2

    1,3

    1,4

    1,5

    1,6

    1,7

    1,8

    0 5 10 15 20 25

    Log(C)(µg/ml)

    Tijd (minuten)

    Log(C) in functie van de tijd

  • 39

    551 minuten, berekend op de gemeten spiegels 30 minuten, 2 uur en 4 uur na stop van het

    infuus.

    De plasmaconcentraties die bekomen worden door 40 mg/kg toe te dienen via een infuus

    met een inlooptijd van 4 uur zijn dus zeker hoog genoeg om het maximale therapeutische

    effect te verkrijgen. Aangezien de T1/2 551 minuten bedraagt en er 80 mg om de 240

    minuten wordt toegediend, kan het eventueel nuttig zijn om de dosis opnieuw te verlagen.

    Tijdstip staalname Plasmaspiegel meropenem

    T0 (voor start infuus) 15 µg/ml

    T120 30 µg/ml

    T240 (stopzetting infuus) 36 µg/ml

    T270 29 µg/ml

    T360 25 µg/ml

    T480 22 µg/ml

    0

    10

    20

    30

    40

    0 100 200 300 400 500 600

    C (µg/ml)

    Tijd (minuten)

    Figuur 4.14: Grafiek van de concentratie (C) van meropenem in functie van de tijd bij

    een dosis van 80 mg

    Tabel 4.16: Plasmaspiegel meropenem bij infuus met inlooptijd van 240 minuten en

    dosis van 80 mg

  • 40

    5. DISCUSSIE

    De resultaten tonen duidelijk aan dat deze methode toepasbaar is voor de kwantitatieve

    bepaling van β-lactam antibiotica in humaan serum/plasma. Deze methode is niet de meest

    optimale methode voor het bepalen van β-lactam antibiotica, maar sluit goed aan bij andere

    analyses die in het laboratorium in routine worden uitgevoerd. Uit literatuuronderzoek blijkt

    dat de methode zeer vergelijkbaar is met de reeds beschreven methodes. Dankzij deze

    methode is het in de toekomst ook mogelijk om uniforme richtlijnen op te stellen in het AZ

    Sint-Jan voor de therapeutisch werkzame plasmaconcentraties van de β-lactam antibiotica.

    De methodevalidatie toont aan dat meropenem en flucloxacilline afbraak vertonen

    wanneer ze 5 uur bij kamertemperatuur bewaard worden. De beste methode om dus zeker

    geen afbraak van de stalen te hebben is om de stalen af te nemen op ijs. Op deze manier

    worden ze snel gekoeld, en worden de enzymen onmiddellijk geïnactiveerd.

    Deze methode kent een aantal voordelen. Ten eerste bestaat de staalvoorbereiding uit

    een eenvoudige methanol precipitatie, waardoor de HPLC-analyse snel gestart kan worden.

    De methanol precipitatie vereist ook een laag staalvolume.

    Een tweede voordeel is de gelijktijdige scheiding en kwantificatie van de verschillende β-

    lactam antibiotica die vaak gebruikt worden in het AZ Sint-Jan. Ook al is het zeer

    onwaarschijnlijk dat een patiënt meerdere β-lactam antibiotica gelijktijdig toegediend krijgt,

    op deze manier is het in routine eenvoudiger om verschillende β-lactam antibiotica van

    meerdere patiënten gelijktijdig te kwantificeren.

    Een nadeel is de relatief lange duur van de analyse, terwijl het bij patiënten met sepsis

    net noodzakelijk is om de antibioticumtherapie zo snel mogelijk te optimaliseren. In deze

    methode wordt gebruik gemaakt van gradiëntelutie. Nadat de gradiënt doorlopen is, is het

    noodzakelijk de kolom te laten equilibreren bij de standaardcondities van de run vooraleer

    het volgende staal wordt geïnjecteerd. Alle componenten zijn geëlueerd na 20 minuten maar

    de runtijd bedraagt 30 minuten. Naast deze lange runtijd zorgen ook de kalibratoren en

    kwaliteitscontroles voor een lange analysetijd. Een mogelijke oplossing hiervoor is dat de

    kalibratoren en een kwaliteitscontrole reeds geanalyseerd worden wanneer gemeld wordt

    dat er een β-lactam antibioticum dient gekwantificeerd te worden. Wanneer het staal dan

    beschikbaar is, is het enkel nodig een tweede kwaliteitscontrole samen met het staal te

    analyseren.

  • 41

    Een tweede nadeel is dat deze methode naast de vrije plasmaconcentratie, ook de

    eiwitgebonden concentratie bepaalt. Voor de meeste onderzochte β-lactam antibiotica is de

    eiwitgebonden fractie laag, maar ceftriaxon en flucloxacilline hebben een zeer hoge

    proteïnebinding (± 95%). Aangezien enkel de vrije concentratie een therapeutisch effect

    heeft, is het dus noodzakelijk de bekomen concentraties te vermenigvuldigen met de vrije

    fractie. Bij zwaar zieke personen kan de proteïnebinding echter gewijzigd zijn, het is dan ook

    niet correct om de bekomen concentratie zomaar te vermenigvuldigen met de theoretische

    vrije fractie.

    In toekomstig onderzoek zou het nuttig zijn deze methode te verfijnen naar de bepaling

    van de vrije concentratie van de β-lactam antibiotica.

    Wanneer er veel patiëntenstalen ter beschikking worden gesteld, zou het ook mogelijk

    zijn om farmacokinetische modellen op te stellen van de β-lactam antibiotica. Het

    uiteindelijke doel hiervan is om een zogenaamde ‘limited sampling strategy’ toe te passen.

    Hierbij zijn slechts twee staalnames in de eliminatiefase nodig van de patiënt om de AUC van

    het β-lactam antibioticum te berekenen voor de specifieke patiënt.

  • 42

    6. CONCLUSIE

    De methode voor de gelijktijdige kwantitatieve bepaling van de β-lactam antibiotica

    meropenem, ceftriaxon, ceftazidim, flucloxacilline en piperacilline is gevalideerd. Als

    precipitatiesolvent wordt gebruik gemaakt van methanol, waarna de stalen gedroogd

    worden met behulp van stikstof. De chromatografische scheiding gebeurt via gradiëntelutie

    met fosfaatbuffer en acetonitrile op een Nucleodur® RP C18 Pyramid kolom (150 mm × 4,6

    mm; 5 µm). De methode maakt gebruik van de interne standaard cefoperazone.

    De validatie toont aan dat de methode voldoet aan de vooropgestelde criteria voor

    reproduceerbaarheid, herhaalbaarheid, juistheid, specificiteit en lineariteit. De LLOQ is

    vastgelegd op 2 µg/ml.

    De β-lactam antibiotica zijn niet gevoelig aan afbraak wanneer ze vries-dooi cycli

    ondergaan of blootgesteld worden aan licht. Na een dag bij kamertemperatuur zijn alle

    componenten significant afgebroken, uitgezonderd ceftriaxon. Wanneer de stalen een dag

    bewaard worden in de koelkast (6°C) of diepvries (-20°C), breken de bestudeerde β-lactam

    antibiotica niet af. Na 24 uur in de staallader, kunnen de extracten nogmaals geanalyseerd

    worden, enkel voor meropenem wordt hierbij afbraak vastgesteld. Uit de onderzoeken blijkt

    dat de stalen best worden afgenomen op ijs en ingevroren worden tot het moment van de

    analyse, om zo een correct resultaat te bekomen.

    Aan de hand van een patiëntstaal van een neonaat werd aangetoond dat het zeker nuttig

    is om β-lactam antibiotica te kwantificeren bij ernstig zieke patiënten op de intensieve

    zorgen. Het is daarbij belangrijk om meerdere bloedafnames uit te voeren op verschillende

    tijdstippen tijdens en na toediening van een β-lactam antibioticum. De plasma-concentratie-

    tijdscurve kan zo opgesteld worden en hieruit kan de halfwaardetijd van het β-lactam

    antibioticum berekend worden alsook de AUC en de tijd dat de plasmaspiegel van het

    geneesmiddel de MIC waarde overschrijdt, wat de efficiëntie van de β-lactam

    antibioticumtherapie voorspelt.

  • 43

    7. LITERATUURLIJST

    1. Balant-Gorgia EA, Balant LP. Ther. drug monitor. Drugs. 1995;4(6):432-53.

    2. Petty BG. Chapter 11. Principles of Evidence-Based Prescribing. In: McKean SC, Ross JJ,

    Dressler DD, Brotman DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital Medicine.

    New York, NY: The McGraw-Hill Companies; 2012.

    3. Taccone FS, Laterre PF, Dugernier T, Spapen H, Delattre I, Wittebole X, et al.

    Insufficient β-lactam concentrations in the early phase of severe sepsis and septic shock. Crit.

    Care. 2010;14(4):R126.

    4. Roberts JA, Lipman J. Pharmacokinetic issues for antibiotics in the critically ill patient.

    Crit. care med. 2009;37(3):840-51; quiz 59.

    5. Pea F. Plasma pharmacokinetics of antimicrobial agents in critically ill patients. Curr.

    clin. pharmacol. 2013;8(1):5-12.

    6. Roberts J, Lipman J. Antibacterial Dosing in Intensive Care. Clin Pharmacokinet.

    2006;45(8):755-73.

    7. De Paepe P, Belpaire FM, Buylaert WA. Pharmacokinetic and pharmacodynamic

    considerations when treating patients with sepsis and septic shock. Clin Pharmacokinet.

    2002;41(14):1135-51.

    8. Nguyen HB, Rivers EP, Abrahamian FM, Moran GJ, Abraham E, Trzeciak S, et al.

    Severe sepsis and septic shock: review of the literature and emergency department

    management guidelines. Ann. Emerg. Med. 2006;48(1):28-54.

    9. Annane D, Bellissant E, Cavaillon J-M. Septic shock. The Lancet. 2005;365(9453):63-78.

    10. Felner K, Smith RL. Chapter 138. Sepsis. In: McKean SC, Ross JJ, Dressler DD, Brotman

    DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital Medicine. New York, NY: The

    McGraw-Hill Companies; 2012.

    11. Stearns-Kurosawa DJ, Osuchowski MF, Valentine C, Kurosawa S, Remick DG. The

    Pathogenesis of Sepsis. Ann. rev. pathol. 2011;6:19-48.

    12. Chen CL, Cooper MA, Shapiro ML, Angood PB, Makary MA. Patient Safety. In: Billiar

    TR, Dunn DL, Hunter JG, Matthews JB, Pollock RE, editors. Schwartz's Principles of Surgery,

    10e. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2014.

  • 44

    13. Bloch KC. Infectious Diseases. In: Hammer GD, McPhee SJ, editors. Pathophysiology

    of Disease: An Introduction to Clinical Medicine, 7e. New York, NY: McGraw-Hill Education;

    2013.

    14. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med.

    2003;348(2):138-50.

    15. Carpenter TC, Czaja AS, Exo J, Grayck EN, Gunville CF, Zebuhr C. Critical Care. In: Hay

    WW, Levin MJ, Deterding RR, Abzug MJ, editors. CURRENT Diagnosis & Treatment:

    Pediatrics, 22e. New York, NY2013.

    16. Ferris LK, English JC. Chapter 181. The Skin in Infective Endocarditis, Sepsis, Septic

    Shock, and Disseminated Intravascular Coagulation. In: Goldsmith LA, Katz SI, Gilchrest BA,

    Paller AS, Leffell DJ, Wolff K, editors. Fitzpatrick's Dermatology in General Medicine, 8e. New

    York, NY: The McGraw-Hill Companies; 2012.

    17. T. Christiaens GDL, J.M. Maloteaux. Gecommentarieerd Geneesmiddelenrepertorium.

    27 ed. Gent: Thierry Christiaens; 2014. 572 p.

    18. Ryan KJ, Ray CG. Antibacterial Agents and Resistance. Sherris Medical Microbiology,

    Sixth Edition. New York, NY2014.

    19. Falagas ME, Bliziotis IA. Chapter 185. Fundamentals of Antibiotics. In: McKean SC,

    Ross JJ, Dressler DD, Brotman DJ, Ginsberg JS, editors. Principles and Practice of Hospital

    Medicine. New York, NY: The McGraw-Hill Companies; 2012.

    20. J.E. de Boer MDB, F. Broekhuijsen, P.K. Cheung, M. Danz, D.R. Dokter, T. Douma, V.

    Kloet, M.H.A. van Oppenraay, M.K. Schutte. Farmacotherapeutisch Kompas 2015.

    21. Moon YS, Chung KC, Gill MA. Pharmacokinetics of meropenem in animals, healthy

    volunteers, and patients. Clin. Inf. Dis. 1997;24 Suppl 2:S249-55.

    22. Hellinger WC, Brewer NS. Carbapenems and Monobactams: Imipenem, Meropenem,

    and Aztreonam. Mayo Clinic Proc. 1999;74(4):420-34.

    23. Leroy A, Leguy F, Borsa F, Spencer GR, Fillastre JP, Humbert G. Pharmacokinetics of

    ceftazidime in normal and uremic subjects. Antimicrob. Agents Chemother. 1984;25(5):638-

    42.

    24. Lodise TP, Lomaestro B, Rodvold KA, Danziger LH, Drusano GL. Pharmacodynamic

    Profiling of Piperacillin in the Presence of Tazobactam in Patients through the Use of

  • 45

    Population Pharmacokinetic Models and Monte Carlo Simulation. Antimicrob. Agents

    Chemother. 2004;48(12):4718-24.

    25. Bergan T, Engeset A, Olszewski W, Ostby N, Solberg R. Extravascular penetration of

    highly protein-bound flucloxacillin. Antimicrob Agents Chemother. 1986;30(5):729-32.

    26. Wolff F, Deprez G, Seyler L, Taccone F, Hites M, Gulbis B, et al. Rapid quantification of

    six β-lactams to optimize dosage regimens in severely septic patients. Talanta.

    2013;103:153-60.

    27. Nemutlu E, Kır S, Katlan D, Beksaç MS. Simultaneous multiresponse optimization of

    an HPLC method to separate seven cephalosporins in plasma and amniotic fluid: Application

    to validation and quantification of cefepime, cefixime and cefoperazone. Talanta.

    2009;80(1):117-26.

    28. Denooz R, Charlier C. Simultaneous determination of five β-lactam antibiotics

    (cefepim, ceftazidim, cefuroxim, meropenem and piperacillin) in human plasma by high-

    performance liquid chromatography with ultraviolet detection. J. Chromatogr. B.

    2008;864(1–2):161-7.

    29. Ohmori T, Suzuki A, Niwa T, Ushikoshi H, Shirai K, Yoshida S, et al. Simultaneous

    determination of eight β-lactam antibiotics in human serum by liquid chromatography–

    tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2011;879(15–16):1038-42.

    30. Samanidou VF, Hapeshi EA, Papadoyannis IN. Rapid and sensitive high-performance

    liquid chromatographic determination of four cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals

    and body fluids. J. Chromatogr. B. 2003;788(1):147-58.

    31. Ikeda K, Ikawa K, Morikawa N, Kameda K, Urakawa N, Ohge H, et al. Quantification of

    doripenem in human plasma and peritoneal fluid by high-performance liquid

    chromatography with ultraviolet detection. J. Chromatogr. B. 2008;867(1):20-5.

    32. Briscoe SE, McWhinney BC, Lipman J, Roberts JA, Ungerer JP. A method for

    determining the free (unbound) concentration of ten beta-lactam antibiotics in human

    plasma using high performance liquid chromatography with ultraviolet detection. J.

    Chromatogr. B. 2012;907:178-84.

    33. Musson DG, Birk KL, Kitchen CJ, Zhang J, Hsieh JY, Fang W, et al. Assay methodology

    for the quantitation of unbound ertapenem, a new carbapenem antibiotic, in human plasma.

    J. Chromatogr. B. 2003;783(1):1-9.

  • 46

    34. Pickering M, Brown S. Quantification and validation of HPLC-UV and LC-MS assays for

    therapeutic drug monitoring of ertapenem in human plasma. Biomed. Chromatogr.

    2013;27(5):568-74.

    35. Legrand T, Chhun S, Rey E, Blanchet B, Zahar J-R, Lanternier F, et al. Simultaneous

    determination of three carbapenem antibiotics in plasma by HPLC with ultraviolet detection.

    J. Chromatogr. B. 2008;875(2):551-6.

    36. Carlier M, Stove V, Roberts JA, Van de Velde E, De Waele JJ, Verstraete AG.

    Quantification of seven β-lactam antibiotics and two β-lactamase inhibitors in human plasma

    using a validated UPLC-MS/MS method. Int. J. Antimicrob. Agents. 2012;40(5):416-22.

    37. McWhinney BC, Wallis SC, Hillister T, Roberts JA, Lipman J, Ungerer JPJ. Analysis of 12

    beta-lactam antibiotics in human plasma by HPLC with ultraviolet detection. J. Chromatogr.

    B. 2010;878(22):2039-43.

    38. Colin P, De Bock L, T'Jollyn H, Boussery K, Van Bocxlaer J. Development and validation

    of a fast and uniform approach to quantify beta-lactam antibiotics in human plasma by solid

    phase extraction-liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Talanta.

    2013;103:285-93.

    39. Verdier M-C, Tribut O, Tattevin P, Le Tulzo Y, Michelet C, Bentué-Ferrer D.

    Simultaneous determination of 12 β-lactam antibiotics in human plasma by high-

    performance liquid chromatography with UV detection: Application to therapeutic drug

    monitoring. Antimicrob. Agents Chemother. 2011;55(10):4873-9.

    40. Yoon K-H, Lee S-Y, Kim W, Park J-S, Kim H-J. Simultaneous determination of

    amoxicillin and clavulanic acid in human plasma by HPLC–ESI mass spectrometry. J.

    Chromatogr. B. 2004;813(1–2):121-7.

    41. Cunningham FG, Leveno KJ, Bloom SL, Spong CY, Dashe JS, Hoffman BL, et al.

    Multifetal Pregnancy. Williams Obstetrics, 24e. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2013.

    42. Cunningham FG, Leveno KJ, Bloom SL, Spong CY, Dashe JS, Hoffman BL, et al. Preterm

    Labor. Williams Obstetrics, 24e. New York, NY: McGraw-Hill Education; 2013.

    43. Rosenberg AA, Grover T. The Newborn Infant. In: Hay WW, Levin MJ, Deterding RR,

    Abzug MJ, editors. CURRENT Diagnosis & Treatment: Pediatrics, 22e. New York, NY2013.

  • 47

    44. van den Anker JN, Pokorna P, Kinzig-Schippers M, Martinkova J, de Groot R, Drusano

    G, et al. Meropenem pharmacokinetics in the newborn. Antimicrob. Agents Chemother.

    2009;53(9):3871-9.

    http://accessmedicine.mhmedical.com/ViewLarge.aspx?figid=59796965 (28/05/2015)

    http://cenblog.org/the-haystack/2011/06/front-line-antibiotics-to-fight-e-coli/ (31/03/2015)

    http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceftazidime.png (31/03/2015)

    http://de.wikipedia.org/wiki/Ceftriaxon (31/03/2015)

    http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/contents/v75/full/75130303.html (31/03/2015)

    http://rissubscontchel.nazuka.net/q.php?n=699-amoxicillin-vor-dem-essen (31/03/2015)

    http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB4752040.htm (28/05/2015)

    http://www.ema.europa.eu/ema/ (28/05/2015)

    http://www.pharmawiki.ch/wiki/index.php?wiki=Piperacillin&Spez=True (31/03/2015)

    http://accessmedicine.mhmedical.com/ViewLarge.aspx?figid=59796965http://cenblog.org/the-haystack/2011/06/front-line-antibiotics-to-fight-e-coli/http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceftazidime.pnghttp://de.wikipedia.org/wiki/Ceftriaxonhttp://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/contents/v75/full/75130303.htmlhttp://rissubscontchel.nazuka.net/q.php?n=699-amoxicillin-vor-dem-essenhttp://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB4752040.htmhttp://www.ema.europa.eu/ema/http://www.pharmawiki.ch/wiki/index.php?wiki=Piperacillin&Spez=True

  • LEZING 1: RESEARCH ON THE CAUSES OF HUMAN CANCER AND SCIENTIFIC

    STRATEGIES FOR CANCER PREVENTION AND CONTROL

    Kanker kan niet beschouwd worden als een ziekte op zich, er bestaan namelijk 200

    verschillende soorten kankers. Bij de man komt longkanker het meeste voor, terwijl dit bij de

    vrouw borstkanker is. Kanker ontstaat wanneer cellen differentiëren naar kankercellen.

    Kankercellen kunnen oneindig veel delen en zich mogelijks ook verspreiden naar andere

    delen van het lichaam via het bloed- of lymfvatenstelsel. Wanneer dit gebeurt, spreken we

    van metastasen. De wereldwijde mortaliteit door kanker is hoog. 70% van alle sterfgevallen

    van kanker kan gesitueerd worden in landen met een gemiddelde tot laag inkomen. Dit komt

    voornamelijk door de late diagnose, de onwetendheid over kanker en de nood aan

    behandeling ervan, de onmogelijkheid om het te behandelen en het stoppen van de

    therapie.

    De prevalentie van kanker wordt momenteel geschat op 25 miljoen mensen, maar er

    wordt voorspeld dat dit in 2030 zal oplopen tot 75 miljoen mensen. Drie redenen zijn

    hiervoor verantwoordelijk, de steeds groeiende en vergrijzende populatie, de ongezonde

    levensstijl en de verbetering van de screening naar kanker.

    Er zijn twee grote groepen van risicofactoren voor kanker, enerzijds is er de genetische

    predispositie, anderzijds zijn er de omgevingsfactoren. Tabakgebruik is de grootste

    risicofactor, maar ook Heliobacter pylori, overmatig alcoholgebruik, te weinig groenten en

    fruit, hepatitis B en h