ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and...

22
1 ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ MASS SPECTROMETRY (μέρος 2) Πηγές Πηγές Ιόντων Ιόντων Πηγή Ιόντων Ανιχνευτής Αναλυτής m/z ιόντα ιόντα Στερεά με MALDI ή LSIMS Κενό Computer / υπολογιστικό σύστημα Στερεά ή Υγρά με ESI, APCI, AP-MALDI Αέρια ή πτητικά υγρά με EI, CI, ή FI Σύστημα Εισαγωγής δείγματος 10 -3 έως 10 -10 Torr Στο τμήμα αυτό λαμβάνει χώρα ο ιοντισμός του δείγματος

Transcript of ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and...

Page 1: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

1

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ

MASS SPECTROMETRY(μέρος 2)

ΠηγέςΠηγές ΙόντωνΙόντων

Πηγή Ιόντων ΑνιχνευτήςΑναλυτήςmzιόντα ιόντα

Στερεά μεMALDI ήLSIMS Κενό

Computer υπολογιστικόσύστημα

Στερεά ήΥγρά μεESI APCIAP-MALDI

Αέρια ή πτητικάυγρά με EI CIή FI

ΣύστημαΕισαγωγήςδείγματος

10-3 έως 10-10 Torr

Στο τμήμα αυτό λαμβάνει χώραο ιοντισμός του δείγματος

2

ΠηγέςΠηγές ΙόντωνΙόντωνΠηγές Αέριας Φάσης Το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεταιbullΠρόσκρουσης ηλεκτρονίων (Electron Impact EI)bull Χημικού ιοντισμού (Chemical Ionization CI)

Πηγές εκρόφησηςΤο δείγμα σε υγρή ή στερεά κατάσταση μετατρέπεται σε αεριώδηιόντα

bull Βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment FAB)

bull Ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας (Matrix Assisted Desorption Ionization MALDI)

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization ESI)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

M+

Τα e- παράγονται από ένα θερμαινόμενο νήμα (W ή Re) καιεπιταχύνονται με μια τάση 70 V (σταθερή ενέργεια επιτάχυνσης)

M + e- rarr M+ + 2e-

M

3

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

Ιοντισμός

Μ + e- rarr Mbull+ + 2e-

Θραυσματοποίηση EE+ + Rbull

EVEN ION ΡΙΖΑ

ΟE+ + NODD ION ΜΟΡΙΟ

Mbull+

ΜΟΡΙΑΚΟΙΟΝ

EE+ ιόν με άρτιο αριθμό e

OE+ ιόν με περιττό αριθμό eΘυγατρικάιόντα

ΦάσματαΦάσματα ΕΙΕΙ -- MSMS

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

4

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης

Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104

CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS

CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS

5

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

CH2

CH3

C3H5 H+

CH4 + e- CH4 + 2e-

CH2 + H2 CH3+ + Hand

CH4 + CH4 CH5+

+ CH3

CH4+

+ C2H5+

+ H2

+ 2CH4 2H2++

+

+

+

+

Ισχυρός πρωτονιοδότης

Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ

CH4+ bull

+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ

CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2

+ + CH4 [M + 1]+ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4

ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ

CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+

C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+

C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+

Interpretation of Mass Spectra

O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA

6

(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

100149

156

184201

229

241

(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

130 154 184

201

MH+

[M+C2H5]+

[M+C3H5]+

MH+

No Visible Peak at mz 200

EI

Methane CI Ammonia CI

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

41

55 69

85

98

114

130

142

156

183

Pentobarbital

NH2C

C

C NH2

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3

C

NHC

C

C NH

O

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3 + CO32-

+ 2 HOndash

MM 200 Da

Σκληρή Πηγή

Μαλακή Πηγή

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS

bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 2: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

2

ΠηγέςΠηγές ΙόντωνΙόντωνΠηγές Αέριας Φάσης Το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεταιbullΠρόσκρουσης ηλεκτρονίων (Electron Impact EI)bull Χημικού ιοντισμού (Chemical Ionization CI)

Πηγές εκρόφησηςΤο δείγμα σε υγρή ή στερεά κατάσταση μετατρέπεται σε αεριώδηιόντα

bull Βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment FAB)

bull Ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας (Matrix Assisted Desorption Ionization MALDI)

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization ESI)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

M+

Τα e- παράγονται από ένα θερμαινόμενο νήμα (W ή Re) καιεπιταχύνονται με μια τάση 70 V (σταθερή ενέργεια επιτάχυνσης)

M + e- rarr M+ + 2e-

M

3

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

Ιοντισμός

Μ + e- rarr Mbull+ + 2e-

Θραυσματοποίηση EE+ + Rbull

EVEN ION ΡΙΖΑ

ΟE+ + NODD ION ΜΟΡΙΟ

Mbull+

ΜΟΡΙΑΚΟΙΟΝ

EE+ ιόν με άρτιο αριθμό e

OE+ ιόν με περιττό αριθμό eΘυγατρικάιόντα

ΦάσματαΦάσματα ΕΙΕΙ -- MSMS

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

4

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης

Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104

CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS

CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS

5

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

CH2

CH3

C3H5 H+

CH4 + e- CH4 + 2e-

CH2 + H2 CH3+ + Hand

CH4 + CH4 CH5+

+ CH3

CH4+

+ C2H5+

+ H2

+ 2CH4 2H2++

+

+

+

+

Ισχυρός πρωτονιοδότης

Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ

CH4+ bull

+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ

CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2

+ + CH4 [M + 1]+ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4

ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ

CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+

C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+

C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+

Interpretation of Mass Spectra

O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA

6

(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

100149

156

184201

229

241

(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

130 154 184

201

MH+

[M+C2H5]+

[M+C3H5]+

MH+

No Visible Peak at mz 200

EI

Methane CI Ammonia CI

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

41

55 69

85

98

114

130

142

156

183

Pentobarbital

NH2C

C

C NH2

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3

C

NHC

C

C NH

O

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3 + CO32-

+ 2 HOndash

MM 200 Da

Σκληρή Πηγή

Μαλακή Πηγή

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS

bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 3: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

3

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

Ιοντισμός

Μ + e- rarr Mbull+ + 2e-

Θραυσματοποίηση EE+ + Rbull

EVEN ION ΡΙΖΑ

ΟE+ + NODD ION ΜΟΡΙΟ

Mbull+

ΜΟΡΙΑΚΟΙΟΝ

EE+ ιόν με άρτιο αριθμό e

OE+ ιόν με περιττό αριθμό eΘυγατρικάιόντα

ΦάσματαΦάσματα ΕΙΕΙ -- MSMS

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

4

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης

Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104

CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS

CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS

5

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

CH2

CH3

C3H5 H+

CH4 + e- CH4 + 2e-

CH2 + H2 CH3+ + Hand

CH4 + CH4 CH5+

+ CH3

CH4+

+ C2H5+

+ H2

+ 2CH4 2H2++

+

+

+

+

Ισχυρός πρωτονιοδότης

Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ

CH4+ bull

+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ

CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2

+ + CH4 [M + 1]+ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4

ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ

CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+

C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+

C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+

Interpretation of Mass Spectra

O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA

6

(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

100149

156

184201

229

241

(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

130 154 184

201

MH+

[M+C2H5]+

[M+C3H5]+

MH+

No Visible Peak at mz 200

EI

Methane CI Ammonia CI

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

41

55 69

85

98

114

130

142

156

183

Pentobarbital

NH2C

C

C NH2

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3

C

NHC

C

C NH

O

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3 + CO32-

+ 2 HOndash

MM 200 Da

Σκληρή Πηγή

Μαλακή Πηγή

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS

bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 4: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

4

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης

Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104

CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS

CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS

5

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

CH2

CH3

C3H5 H+

CH4 + e- CH4 + 2e-

CH2 + H2 CH3+ + Hand

CH4 + CH4 CH5+

+ CH3

CH4+

+ C2H5+

+ H2

+ 2CH4 2H2++

+

+

+

+

Ισχυρός πρωτονιοδότης

Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ

CH4+ bull

+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ

CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2

+ + CH4 [M + 1]+ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4

ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ

CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+

C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+

C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+

Interpretation of Mass Spectra

O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA

6

(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

100149

156

184201

229

241

(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

130 154 184

201

MH+

[M+C2H5]+

[M+C3H5]+

MH+

No Visible Peak at mz 200

EI

Methane CI Ammonia CI

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

41

55 69

85

98

114

130

142

156

183

Pentobarbital

NH2C

C

C NH2

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3

C

NHC

C

C NH

O

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3 + CO32-

+ 2 HOndash

MM 200 Da

Σκληρή Πηγή

Μαλακή Πηγή

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS

bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 5: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

5

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

CH2

CH3

C3H5 H+

CH4 + e- CH4 + 2e-

CH2 + H2 CH3+ + Hand

CH4 + CH4 CH5+

+ CH3

CH4+

+ C2H5+

+ H2

+ 2CH4 2H2++

+

+

+

+

Ισχυρός πρωτονιοδότης

Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ

CH4+ bull

+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ

CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2

+ + CH4 [M + 1]+ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4

ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ

CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+

C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5

+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+

C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+

Interpretation of Mass Spectra

O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA

6

(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

100149

156

184201

229

241

(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

130 154 184

201

MH+

[M+C2H5]+

[M+C3H5]+

MH+

No Visible Peak at mz 200

EI

Methane CI Ammonia CI

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

41

55 69

85

98

114

130

142

156

183

Pentobarbital

NH2C

C

C NH2

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3

C

NHC

C

C NH

O

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3 + CO32-

+ 2 HOndash

MM 200 Da

Σκληρή Πηγή

Μαλακή Πηγή

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS

bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 6: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

6

(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

100149

156

184201

229

241

(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

130 154 184

201

MH+

[M+C2H5]+

[M+C3H5]+

MH+

No Visible Peak at mz 200

EI

Methane CI Ammonia CI

Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON

Copyright 1978 -2004 USA

(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

50

100

41

55 69

85

98

114

130

142

156

183

Pentobarbital

NH2C

C

C NH2

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3

C

NHC

C

C NH

O

O

O

CH2H3C

HC

CH3CH2H2C

CH3 + CO32-

+ 2 HOndash

MM 200 Da

Σκληρή Πηγή

Μαλακή Πηγή

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS

bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 7: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

7

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

Πριν την εκρόφησημε laser

Μετά την εκρόφησημε laser

Ακτίνες παλμικούlaser

-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 8: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

8

-- ΜΜALDIALDI --

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+

bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB

Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE

Wiley 2005

(Xe ή Cs)

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 9: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

9

-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)

ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --

bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων

bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2

+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 10: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

10

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

ESI

ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 11: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

11

-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)

bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων

bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)

ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --

H2O + e- rarr H2O+ +2e-

H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH

H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O

OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός

ΑρνητικόςAPCI

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 12: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

12

-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων

bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)

bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων

ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών

Μη-Πολικά Πολικά

Μορ

ιακή

μάζα

ESI ESI καικαιHESIHESI

APCIAPPI

100000

1000

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 13: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

13

ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ

0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)

02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης

Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων

ΜονοφορτισμέναΙόντα

Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά

ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας

Αναλύτες

laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα

Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα

θραύσματα

Θραυσματοποίηση

Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα

Εφαρμόζεται στηακίδα

Δυναμικό

Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός

ESIAPCI

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)

2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS

3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 14: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

14

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS

2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC

3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων

ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS

Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου

2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων

3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)

4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 15: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

15

LC LC ndashndash MSMS

ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1

[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42

ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1

[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45

Linuron

NH

N

O

Cl

Cl OCH3

CH3

Ιόνταπροσ

θήκης

(Addu

cts)

Ibuprofen

O

OH

CH3

CH3

CH3

ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)

MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)

MS2

1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)

2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)

3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)

Τριπλό Τετράπολο

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 16: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

16

+

+ +

+

+ +

Ar

ArAr

Ar

ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων

Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή

Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)

Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry

ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ

Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση

Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 17: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

17

Full-Scan MS της Buspirone

NN

N

N

NO

O

BuspironeC21H31N5O2

MW = 385

150 200 250 300 350 400 450 500mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

386

408

[Μ+Η]+

[Μ+Na]+

ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)

bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη

ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα

bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία

Επιλεγμένοmz

Διέλευση Διέλευση

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 18: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

18

MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση

Επιλεγμένοmz

Θραυσματοποίηση Σάρωση

Φάσμα θυγατρικώνιόντων

Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone

NH

N

N

N

O

O

NHN

O

O

100 150 200 250 300 350 400mz

25

50

75

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

122

386

222150265

180

NN

N

NH

NO

O

(M+H)+

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 19: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

19

ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning

bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3

minus ταφωσφοπεπτίδια)

bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΣάρωση

Φάσμα μητρικώνιόντων

Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122

NN

N

N

NO

O

OH

9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)

25

50

75

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

1162

1384

1316

1440

12131045

1545

NN

N

N

NO

O

MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone

100 200 300 400 500mz

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

402

386

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 20: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

20

ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)

bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη

ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)

bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες

Επιλεγμένοmz

ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz

Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z

Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 21: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

21

American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml

University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec

Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm

Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml

Χρήσιμοι ιστότοποι για MS

Συγγράμματα

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)

bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007

bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd

Edition RSC 2007

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007

Page 22: ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation” 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 • Ε.

22

Σχήματα

Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David

Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)

bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20

bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005

bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007