ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and...
Transcript of ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΜΑΖΩΝ€¦ · Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and...
1
ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ
MASS SPECTROMETRY(μέρος 2)
ΠηγέςΠηγές ΙόντωνΙόντων
Πηγή Ιόντων ΑνιχνευτήςΑναλυτήςmzιόντα ιόντα
Στερεά μεMALDI ήLSIMS Κενό
Computer υπολογιστικόσύστημα
Στερεά ήΥγρά μεESI APCIAP-MALDI
Αέρια ή πτητικάυγρά με EI CIή FI
ΣύστημαΕισαγωγήςδείγματος
10-3 έως 10-10 Torr
Στο τμήμα αυτό λαμβάνει χώραο ιοντισμός του δείγματος
2
ΠηγέςΠηγές ΙόντωνΙόντωνΠηγές Αέριας Φάσης Το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεταιbullΠρόσκρουσης ηλεκτρονίων (Electron Impact EI)bull Χημικού ιοντισμού (Chemical Ionization CI)
Πηγές εκρόφησηςΤο δείγμα σε υγρή ή στερεά κατάσταση μετατρέπεται σε αεριώδηιόντα
bull Βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment FAB)
bull Ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας (Matrix Assisted Desorption Ionization MALDI)
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization ESI)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
M+
Τα e- παράγονται από ένα θερμαινόμενο νήμα (W ή Re) καιεπιταχύνονται με μια τάση 70 V (σταθερή ενέργεια επιτάχυνσης)
M + e- rarr M+ + 2e-
M
3
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
Ιοντισμός
Μ + e- rarr Mbull+ + 2e-
Θραυσματοποίηση EE+ + Rbull
EVEN ION ΡΙΖΑ
ΟE+ + NODD ION ΜΟΡΙΟ
Mbull+
ΜΟΡΙΑΚΟΙΟΝ
EE+ ιόν με άρτιο αριθμό e
OE+ ιόν με περιττό αριθμό eΘυγατρικάιόντα
ΦάσματαΦάσματα ΕΙΕΙ -- MSMS
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
4
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης
Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104
CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS
CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS
5
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
CH2
CH3
C3H5 H+
CH4 + e- CH4 + 2e-
CH2 + H2 CH3+ + Hand
CH4 + CH4 CH5+
+ CH3
CH4+
+ C2H5+
+ H2
+ 2CH4 2H2++
+
+
+
+
Ισχυρός πρωτονιοδότης
Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ
CH4+ bull
+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ
CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2
+ + CH4 [M + 1]+ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4
ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ
CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+
C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+
C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+
Interpretation of Mass Spectra
O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA
6
(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
100149
156
184201
229
241
(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
130 154 184
201
MH+
[M+C2H5]+
[M+C3H5]+
MH+
No Visible Peak at mz 200
EI
Methane CI Ammonia CI
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
41
55 69
85
98
114
130
142
156
183
Pentobarbital
NH2C
C
C NH2
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3
C
NHC
C
C NH
O
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3 + CO32-
+ 2 HOndash
MM 200 Da
Σκληρή Πηγή
Μαλακή Πηγή
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS
bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
2
ΠηγέςΠηγές ΙόντωνΙόντωνΠηγές Αέριας Φάσης Το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεταιbullΠρόσκρουσης ηλεκτρονίων (Electron Impact EI)bull Χημικού ιοντισμού (Chemical Ionization CI)
Πηγές εκρόφησηςΤο δείγμα σε υγρή ή στερεά κατάσταση μετατρέπεται σε αεριώδηιόντα
bull Βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment FAB)
bull Ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας (Matrix Assisted Desorption Ionization MALDI)
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization ESI)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
M+
Τα e- παράγονται από ένα θερμαινόμενο νήμα (W ή Re) καιεπιταχύνονται με μια τάση 70 V (σταθερή ενέργεια επιτάχυνσης)
M + e- rarr M+ + 2e-
M
3
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
Ιοντισμός
Μ + e- rarr Mbull+ + 2e-
Θραυσματοποίηση EE+ + Rbull
EVEN ION ΡΙΖΑ
ΟE+ + NODD ION ΜΟΡΙΟ
Mbull+
ΜΟΡΙΑΚΟΙΟΝ
EE+ ιόν με άρτιο αριθμό e
OE+ ιόν με περιττό αριθμό eΘυγατρικάιόντα
ΦάσματαΦάσματα ΕΙΕΙ -- MSMS
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
4
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης
Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104
CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS
CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS
5
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
CH2
CH3
C3H5 H+
CH4 + e- CH4 + 2e-
CH2 + H2 CH3+ + Hand
CH4 + CH4 CH5+
+ CH3
CH4+
+ C2H5+
+ H2
+ 2CH4 2H2++
+
+
+
+
Ισχυρός πρωτονιοδότης
Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ
CH4+ bull
+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ
CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2
+ + CH4 [M + 1]+ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4
ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ
CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+
C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+
C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+
Interpretation of Mass Spectra
O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA
6
(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
100149
156
184201
229
241
(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
130 154 184
201
MH+
[M+C2H5]+
[M+C3H5]+
MH+
No Visible Peak at mz 200
EI
Methane CI Ammonia CI
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
41
55 69
85
98
114
130
142
156
183
Pentobarbital
NH2C
C
C NH2
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3
C
NHC
C
C NH
O
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3 + CO32-
+ 2 HOndash
MM 200 Da
Σκληρή Πηγή
Μαλακή Πηγή
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS
bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
3
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
Ιοντισμός
Μ + e- rarr Mbull+ + 2e-
Θραυσματοποίηση EE+ + Rbull
EVEN ION ΡΙΖΑ
ΟE+ + NODD ION ΜΟΡΙΟ
Mbull+
ΜΟΡΙΑΚΟΙΟΝ
EE+ ιόν με άρτιο αριθμό e
OE+ ιόν με περιττό αριθμό eΘυγατρικάιόντα
ΦάσματαΦάσματα ΕΙΕΙ -- MSMS
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
4
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης
Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104
CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS
CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS
5
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
CH2
CH3
C3H5 H+
CH4 + e- CH4 + 2e-
CH2 + H2 CH3+ + Hand
CH4 + CH4 CH5+
+ CH3
CH4+
+ C2H5+
+ H2
+ 2CH4 2H2++
+
+
+
+
Ισχυρός πρωτονιοδότης
Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ
CH4+ bull
+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ
CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2
+ + CH4 [M + 1]+ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4
ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ
CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+
C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+
C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+
Interpretation of Mass Spectra
O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA
6
(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
100149
156
184201
229
241
(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
130 154 184
201
MH+
[M+C2H5]+
[M+C3H5]+
MH+
No Visible Peak at mz 200
EI
Methane CI Ammonia CI
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
41
55 69
85
98
114
130
142
156
183
Pentobarbital
NH2C
C
C NH2
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3
C
NHC
C
C NH
O
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3 + CO32-
+ 2 HOndash
MM 200 Da
Σκληρή Πηγή
Μαλακή Πηγή
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS
bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
4
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνικήbullΜπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόριαbull Επαναλήψιμο φάσμα μαζώνbull Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομήςbull Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζώνπου περιέχουν το laquoαποτύπωμαraquo κάθε ένωσης
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζει ή αν έχει χαμηλή αφθονία
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΗ πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ήIT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακήςμάζας (lt 1000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε πρόσκρουσηπρόσκρουση ηλεκτρονίωνηλεκτρονίων-- ΕΙΕΙ --
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH4 ΝΗ3 ή Ν2) με e- υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντωντου αντιδραστηρίου Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματοςσυγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και ταιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου προσθήκης ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης
Προϋπόθεση ο λόγος [αντιδραστηρίου][δείγματος]= 103-104
CI Χαμηλής πίεσης 10-3 ndashndash 10-4 Torr ιδανική για GC-MS
CI Ατμοσφαιρικής πίεσης APCI ιδανική για LC-MS
5
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
CH2
CH3
C3H5 H+
CH4 + e- CH4 + 2e-
CH2 + H2 CH3+ + Hand
CH4 + CH4 CH5+
+ CH3
CH4+
+ C2H5+
+ H2
+ 2CH4 2H2++
+
+
+
+
Ισχυρός πρωτονιοδότης
Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ
CH4+ bull
+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ
CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2
+ + CH4 [M + 1]+ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4
ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ
CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+
C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+
C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+
Interpretation of Mass Spectra
O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA
6
(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
100149
156
184201
229
241
(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
130 154 184
201
MH+
[M+C2H5]+
[M+C3H5]+
MH+
No Visible Peak at mz 200
EI
Methane CI Ammonia CI
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
41
55 69
85
98
114
130
142
156
183
Pentobarbital
NH2C
C
C NH2
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3
C
NHC
C
C NH
O
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3 + CO32-
+ 2 HOndash
MM 200 Da
Σκληρή Πηγή
Μαλακή Πηγή
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS
bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
5
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
CH2
CH3
C3H5 H+
CH4 + e- CH4 + 2e-
CH2 + H2 CH3+ + Hand
CH4 + CH4 CH5+
+ CH3
CH4+
+ C2H5+
+ H2
+ 2CH4 2H2++
+
+
+
+
Ισχυρός πρωτονιοδότης
Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεωνκαι παραγωγής συμπλόκων
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
ΤύποιΤύποι ΧημικούΧημικού ΙοντισμούΙοντισμούΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ
CH4+ bull
+ RH ⎯⎯⎯rarr RH+ bull + CH4 M+ bull ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ
CH5+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2
+ + CH4 [M + 1]+ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr RH2+ + C2H4
ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ
CF3+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + CF3H [M minus 1]+
C2H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr R+ + C2H6
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C2H5
+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C2H5RH)+ [M + 29]+
C3H5+ + RH ⎯⎯⎯rarr (C3H5RH)+ [M + 41]+
Interpretation of Mass Spectra
O D SPARKMAN AND J T WATSONCopyright 1978 -2004 USA
6
(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
100149
156
184201
229
241
(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
130 154 184
201
MH+
[M+C2H5]+
[M+C3H5]+
MH+
No Visible Peak at mz 200
EI
Methane CI Ammonia CI
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
41
55 69
85
98
114
130
142
156
183
Pentobarbital
NH2C
C
C NH2
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3
C
NHC
C
C NH
O
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3 + CO32-
+ 2 HOndash
MM 200 Da
Σκληρή Πηγή
Μαλακή Πηγή
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS
bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
6
(Text File) Metane CI of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
100149
156
184201
229
241
(Text File) NH3 CI Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
130 154 184
201
MH+
[M+C2H5]+
[M+C3H5]+
MH+
No Visible Peak at mz 200
EI
Methane CI Ammonia CI
Interpretation of Mass SpectraO D SPARKMAN AND J T WATSON
Copyright 1978 -2004 USA
(Text File) EI Spectrum of Malomamide40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
0
50
100
41
55 69
85
98
114
130
142
156
183
Pentobarbital
NH2C
C
C NH2
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3
C
NHC
C
C NH
O
O
O
CH2H3C
HC
CH3CH2H2C
CH3 + CO32-
+ 2 HOndash
MM 200 Da
Σκληρή Πηγή
Μαλακή Πηγή
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός-- CCΙΙ --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταψευδομοριακά ιόντα [Μ+1]+ ή [Μ-1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικόbull Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS
bull Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου την πίεση ήτον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμόμη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (lt 1000 Da)
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
7
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση(A) (A) ndashndash ΜΜALDIALDI
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
Πριν την εκρόφησημε laser
Μετά την εκρόφησημε laser
Ακτίνες παλμικούlaser
-- ΜΜALDIALDI --Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
8
-- ΜΜALDIALDI --
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης παράγοντας συνήθως ταμονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ+1]+
bull Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματαbull Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Χαμηλή επαναληψιμότηταbullΟ αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερbull Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TOF IT)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται στην τεχνική TOF-MS για τον προσδιορισμόπολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (gt 10000 Da)
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε εκρόφησηεκρόφηση((ΒΒ) ) ndashndash FABFAB
Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic CompoundsW HENDERSON AND J S McINDOE
Wiley 2005
(Xe ή Cs)
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
9
-- FABFAB --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Γρήγορη και απλή τεχνικήbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίωνbullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Απλά φάσματα με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα οπότεείναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρουbullΟ αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτραbull Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά mz (lt200 Da)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τονπροσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάληςμοριακής μάζας (gt200 Da) καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS)
ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ατμοσφαιρικήατμοσφαιρική πίεσηπίεση-- ΑΡΙΑΡΙ --
bull Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό(Electrospray Ionization ESI)Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίοεφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kV) και σχηματίζεται αερόλυμαφορτισμένων σταγονιδίων
bull Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(Atmospheric Pressure CI APCI)Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα(450degC) και εξατμίζεται παράγοντας αεριώδη μόρια Πλησίον τηςεξόδου του σωλήνα υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τοναέριο διαλύτη ή το N2 (N2
+) το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόριατου αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου)
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
10
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
ESI
ΙοντισμόςΙοντισμός μεμε ηλεκτροψεκασμόηλεκτροψεκασμό-- ESESΙΙ --
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
11
-- ESIESI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζαbull Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών καιπολικών)
bullΟι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτηθερμικά ασταθών μορίων
bull Καλή ευαισθησία εύκολη ποσοτικοποίησηbull Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσηςbull Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάσηbull Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτραbull Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions)
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίωνμεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλαβιομόρια)
ΧημικόςΧημικός ΙοντισμόςΙοντισμός σεσε ΑΑΠΠ-- APCAPCΙΙ --
H2O + e- rarr H2O+ +2e-
H2O+ + H2O rarr H3O+ + OH
H3O+ + M rarr [M+H]+ + H2O
OH + M rarr [M-H]- + H2O+Θετικός
ΑρνητικόςAPCI
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
12
-- APCIAPCI --ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB)bull Εύκολη στη χρήση με πολύ καλή επαναληψιμότηταbull Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI)bullΜεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (02 ndash 2 mlmin)bull Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI
ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑbull Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒgt2000 Δεν σχηματίζει σειρέςπολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιαπροσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων
bullΟι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικάασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων)
bull Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές mzbull Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων
ΕΦΑΡΜΟΓΗΕΦΑΡΜΟΓΗΧρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίωςπολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών
Μη-Πολικά Πολικά
Μορ
ιακή
μάζα
ESI ESI καικαιHESIHESI
APCIAPPI
100000
1000
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
13
ΣύγκρισηΣύγκριση ESI ESI ndashndash APCAPCΙΙ
0001 ndash 1 mLmin (κυρίως lt04 mLmin)
02-2 mLminΡοή κινητήςφάσης
Μονοφορτισμένα καιπολλαπλών φορτίων
ΜονοφορτισμέναΙόντα
Μικρά και μεγάλαμόρια κυρίως πολικά
ΜΒlt1000Μέτριας πολικότητας
Αναλύτες
laquoΜαλακόςraquo ιοντισμός λιγότερα θραύσματα
Πιο laquoσκληρήraquoτεχνική περισσότερα
θραύσματα
Θραυσματοποίηση
Εφαρμόζεται στοντριχοειδή σωλήνα
Εφαρμόζεται στηακίδα
Δυναμικό
Στο διάλυμαΣτην αέρια φάσηΙοντισμός
ESIAPCI
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Συζευγμένη τεχνικήΧρησιμοποιείται στον1 Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγήπαραγωγοποιήσης και χρήσης GC)
2 Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δενμπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS
3 Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικήςκορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστωνενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων πεπτιδίων πρωτεϊνών κά)
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
14
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Προβλήματα Σύζευξης1 Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκωνδιαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από τοMS
2 Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματατης κινητής φάσης της HPLC
3 Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών καιθερμοευαίσθητων ενώσεων
ΣύζευξηΣύζευξη HPLC HPLC μεμε MSMS
Επίλυση προβλημάτων σύζευξης1 Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (μεταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων τουπληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρούόγκου
2 Διαχωρισμός ροής κινητής φάσης ώστε ένα μόνο μικρόκλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων
3 Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων(HCOOHHCOONH4) και ρυθμιστών pH της κινητήςφάσης της HPLC (HCOOH CH3COOH τριαιθυλαμίνη)
4 Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού ESI APCI MALDI
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
15
LC LC ndashndash MSMS
ΘετικόςΘετικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Βάσεις (-ΝΗ2) [Μ+Η]+ M+1
[M+NH4]+ M+18[M+Na]+ M+23[M+K]+ M+39[M+MeOH+H]+ M+32[M+CH3CN+H]+ M+42
ΑρνητικόςΑρνητικός ιοντισμόςιοντισμόςbull Οξέα (-COOH -OH) [M-H]- M-1
[M+CH3COOH-H]- M+59[M+HCOOH-H]- M+45
Linuron
NH
N
O
Cl
Cl OCH3
CH3
Ιόνταπροσ
θήκης
(Addu
cts)
Ibuprofen
O
OH
CH3
CH3
CH3
ΔιαδοχικήΔιαδοχική ΦασματομετρίαΦασματομετρία ΜαζώνΜαζώνTandem Mass Spectrometry (MSMS)Tandem Mass Spectrometry (MSMS)
MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων(Collision Cell)
MS2
1 Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion)παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1οτετράπολο (MS1)
2 Οδηγείται στο 2ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπουσυγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He) παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions)
3 Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεταιστο 3ο τετράπολο (MS2)
Τριπλό Τετράπολο
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
16
+
+ +
+
+ +
Ar
ArAr
Ar
ΘραυσματοποίησηΘραυσματοποίηση μέσωμέσω συγκρούσεωνσυγκρούσεων
Collision Induced DissociationCollision Induced Dissociation ((CID)CID)ήή
Collision Activated DissociationCollision Activated Dissociation ((CAD)CAD)
Φασματομετρία Μαζών Πλήρους ΣάρωσηςFull-Scan Mass Spectrometry
ΠλεονέκτημαΠληροφορία για το ΜΒ
Μειονεκτήματα- Αργή σάρωση- Όχι ποσοτικοποίηση
Σάρωση Διέλευση Διέλευση(RF only)
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
17
Full-Scan MS της Buspirone
NN
N
N
NO
O
BuspironeC21H31N5O2
MW = 385
150 200 250 300 350 400 450 500mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
386
408
[Μ+Η]+
[Μ+Na]+
ΠαρακολούθησηΠαρακολούθηση επιλεγμένουεπιλεγμένου ιόντοςιόντοςSingle Ion Monitoring (SIM)Single Ion Monitoring (SIM)
bull Πλεονεκτήματαndash Παρακολούθησησυγκεκριμένου αναλύτη
ndash Γρήγορη σάρωσηndash Απλότητα
bull Μειονεκτήματαndash Παρεμποδίσειςndash Όχι τόσο ευαίσθητο όσοη SRM λειτουργία
Επιλεγμένοmz
Διέλευση Διέλευση
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
18
MSMS MSMS θυγατρικώνθυγατρικών ιόντωνιόντωνProduct Ion ScanningProduct Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Παρέχει πληροφορίεςγια τη δομή
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωσηndash Όχι ποσοτικοποίηση
Επιλεγμένοmz
Θραυσματοποίηση Σάρωση
Φάσμα θυγατρικώνιόντων
Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone
NH
N
N
N
O
O
NHN
O
O
100 150 200 250 300 350 400mz
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
122
386
222150265
180
NN
N
NH
NO
O
(M+H)+
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
19
ΜΜSMS SMS επιλεγμένουεπιλεγμένου μητρικούμητρικού ιόντοςιόντοςPrecursor Ion ScanningPrecursor Ion Scanning
bull Πλεονέκτημαndash Ταυτοποίηση ενώσεων πουδίνουν ένα συγκεκριμένοθυγατρικό ιόν (πχ PO3
minus ταφωσφοπεπτίδια)
bull Μειονέκτημαndash Αργή σάρωση
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΣάρωση
Φάσμα μητρικώνιόντων
Precursor Ion Scan Το Q3 παρακολουθεί μόνο το mz 122
NN
N
N
NO
O
OH
9 10 11 12 13 14 15 16Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
1162
1384
1316
1440
12131045
1545
NN
N
N
NO
O
MSMS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών τηςBuspirone
100 200 300 400 500mz
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
402
386
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
20
ΠαρακολούθησηςΠαρακολούθησης επιλεγμένηςεπιλεγμένης αντίδρασηςαντίδρασηςSelected Reaction Monitoring (SRM)Selected Reaction Monitoring (SRM)
bullΠλεονεκτήματαndashΠαρακολούθησηεπιλεγμένου αναλύτη
ndashΓρήγορη σάρωσηndashldquoΤαυτόχρονηrdquoπαρακολούθηση πολλώνμεταπτώσεων (MRM)
bullΜειονέκτημαndashΟι πληροφορίες για τη δομή τηςένωσης είναι περιορισμένες
Επιλεγμένοmz
ΘραυσματοποίησηΕπιλεγμένοmz
Μετάπτωση ή laquoαντίδρασηraquo m1z rarr m2z
Εκλεκτικότητα MSMS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
21
American Society for Mass Spectrometry (ASMS) httpwwwasmsorgΓενική εισαγωγή στην τεχνική MS httpwwwasmsorgwhatismsindexhtmlΕκπαιδευτικές πηγές httpwwwasmsorgwhatismsedu_resourceshtml
University of Arizona ndash Dept of Chemistryhttpwwwchemarizonaedumassspec
Michigan State University - Dept of Chemistryhttpwwwcemmsuedu~reuschVirtualTextSpectrpyMassSpecmasspec1htm
Isotope Pattern Calculatorhttpwwwshefacukchemistrychemputerisotopeshtml
Χρήσιμοι ιστότοποι για MS
Συγγράμματα
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές της ΕνόργανηςΑνάλυσηςraquo Μτφ ΜΙ Καραγιάννης ΚΗ Ευσταθίου Ν Χανιωτάκης Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 20 27Δ-3και 28Γ-6 (σελ859)
bull J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo 4th Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Ε De Hoffmann and V Stroobant ldquoMass Spectrometry Principles and Applicationsrdquo 3rd Edition John Wiley amp Sons 2007
bull Κ Downard ldquoMass Spectrometry ndash A Foundation Courserdquo 2nd
Edition RSC 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007
22
Σχήματα
Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγέςbull Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof O David
Sparkman (από το βιβλίο του J Throck Watson and O David Sparkman ldquoIntroduction to Mass Spectrometry 4th Edition Instrumentation Applications and Strategies for Data Interpretationrdquo John Wiley amp Sons 2007)
bull DA Skoog FJ Holler TA Nieman laquoΑρχές τηςΕνόργανης Ανάλυσηςraquo Eκδόσεις Kωσταράκη Αθήνα 2002 Κεφ 11 και 20
bull W Henderson J S McIndoe ldquoMass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compoundsrdquo Wiley 2005
bull Thermo ldquoQuantum TSQ Training courserdquo 2007