Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Ιατρικής

Εργαστήριο Βιοχημείας

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι

Ωρολόγιο Πρόγραμμα

Αναλυτικό Διάγραμμα Μελέτης

Οδηγός Εργαστηριακών Ασκήσεων

Σ. Μπονάνου–Τζεδάκη, Γ. Σίμος, Ε. Γεωργάτσου, Π. Λιάκος

Λάρισα 2010

0

1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Πληροφορίες 1 Ωρολόγιο Πρόγραμμα 2 Διάγραμμα Μελέτης 4 Βιβλιογραφία 15 Κανόνες Ασφάλειας Εργαστηρίου 17 Άσκηση 1 18 Ανάλυση Αμινοξέων & Πρωτεϊνών

Άσκηση 2 25 Προσδιορισμός και Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρινών

Ασκήσεις 3-5 32 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων

Άσκηση 3 37 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Α

Άσκηση 4 40 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Β

Άσκηση 5 49 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Γ

Άσκηση 6 54 Προσδιορισμός Τρανσαμινασών - Ουρίας

Ευχαριστίες 62

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

ΓΙΑ ΤΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΤΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Η διδασκαλία των μαθημάτων Βιοχημείας Ι και ΙΙ συνίσταται από διαλέξεις και

εργαστηριακές ασκήσεις. Οι διαλέξεις αναπτύσσουν την ύλη που περιγράφεται γενικά στον οδηγό σπουδών και με λεπτομέρεια στην Αναλυτική Ύλη που επισυνάπτεται σε αυτό το Φυλλάδιο μαζί με το Πρόγραμμα των διαλέξεων.

Οι εργαστηριακές ασκήσεις αποτελούν την πρακτική άσκηση των φοιτητών και είναι απαραίτητο συμπλήρωμα των διαλέξεων. Σκοπός τους είναι να σας εξοικειώσουν με την χρήση διαφόρων τεχνικών, την λειτουργία διαφόρων οργάνων και την διεξαγωγή διαφόρων δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται συχνά στην Βιοχημεία, καθώς και στο να σας βοηθήσουν να κατανοήσετε μερικές έννοιες που δεν γίνονται σαφώς αντιληπτές θεωρητικά.

Τις ασκήσεις θα τις κάνετε σε ομάδες τριών φοιτητών. Οι ομάδες σχηματίζονται

στην αρχή του εξαμήνου και παραμένετε στην ίδια ομάδα όλο το εξάμηνο. Η συμμετοχή στις ασκήσεις καθώς και η γραπτή αναφορά των αποτελεσμάτων των ασκήσεων, η οποία γίνεται από τους φοιτητές στην διάρκεια των εργαστηρίων στο φυλλάδιο του εργαστηρίου, είναι υποχρεωτική.

Οι φοιτητές πρέπει να προσέρχονται στα εργαστήρια κατάλληλα προετοιμασμένοι

(έχοντας διαβάσει το Φυλλάδιο) και εξοπλισμένοι (μολύβια, χάρακες, κομπιουτεράκια κλπ) για να εκτελέσουν σωστά τα πειράματα και να επεξεργαστούν τα αποτελέσματα συμπληρώνοντας με επιτυχία την αναφορά των αποτελεσμάτων. Η αναφορά περιλαμβάνει τις μετρήσεις (παρουσιασμένες σε πίνακες, σχεδιαγράμματα κ.λ.π.), και τα συμπεράσματα που βγάζετε (π.χ. αν πήρατε τα αναμενόμενα αποτελέσματα, αν όχι γιατί όχι, πηγές πιθανών λαθών στα πειράματα κ.λ.π) όπως ζητά κάθε άσκηση. Στο τέλος κάθε άσκησης, η γραπτή αναφορά ελέγχεται από τους διδάσκοντες και υπογράφεται, εφόσον έχει συμπληρωθεί σωστά. Η επιτυχής συμμετοχή στην άσκηση πιστοποιείται από την υπογραφή του διδάσκοντος στη γραπτή αναφορά των αποτελεσμάτων.

Στο τέλος του εξαμήνου οι φοιτητές εξετάζονται γραπτά στο περιεχόμενο των Εργαστηρίων. Στις εξετάσεις του Εργαστηρίου εξεταστέα ύλη είναι η θεωρία, η μεθοδολογία και οι τρόποι επεξεργασίας αποτελεσμάτων που περιλαμβάνονται στο Φυλλάδιο ή αναπτύσσονται από τους διδάσκοντες κατά την διάρκεια των εργαστηρίων. Δικαίωμα συμμετοχής στις εξετάσεις του Εργαστηρίου έχουν μόνον όσοι συμμετείχαν με επιτυχία στις εργαστηριακές ασκήσεις.

Οι εξετάσεις του μαθήματος είναι γραπτές, διάρκειας 3 ωρών, και αποτελούνται από θέματα προς ανάπτυξη ή πολλαπλής επιλογής. Εξεταστέα ύλη αποτελεί η Αναλυτική Ύλη που επισυνάπτεται σε αυτό το Φυλλάδιο. Δικαίωμα συμμετοχής σε αυτές τις εξετάσεις έχουν μόνον όσοι φοιτητές πέρασαν τις εξετάσεις του Εργαστηρίου. Ο τελικός βαθμός του μαθήματος υπολογίζεται κατά 80% από τον βαθμό των γραπτών εξετάσεων του μαθήματος και κατά 20% από τον βαθμό των γραπτών εξετάσεων του Εργαστηρίου.

1

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι

Πρόγραμμα Διδασκαλίας Εαρινού Εξαμήνου

Ακαδ. Έτους 2009-2010

Τα Εργαστήρια και τα Φροντιστήρια είναι υποχρεωτικά

Ημερομηνία Ώρα Θέμα Αίθουσα

Πέμπτη 25/2 13-15 Εισαγωγή στη Βιοχημεία – Βιοχημική εξέλιξη ΜΑ1 Παρασκ. 26/2 11-13 Δομή & βιολογικός ρόλος αμινοξέων και πεπτιδίων Αίθ. 1 Τετ. 3/3 9-11 Δομή & βιολογικός ρόλος πρωτεϊνών ΜΑ1 Πέμπτη 4/3 13-15 Μέθοδοι απομόνωσης & μελέτης πρωτεϊνών ΜΑ1 Παρασκ. 5/3 11-13 Χημική & ανοσολογική ανάλυση πρωτεϊνών Αίθ. 1 Τετ. 10/3 9-11 Ένζυμα: Εισαγωγή ΜΑ1 Πέμπτη 11/3 13-15 Εργαστήριο 1ο: Ανάλυση Αμινοξέων & Πρωτεϊνών -Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 12/3 11-12 Ένζυμα: Κινητική ΜΑ1 Παρασκ. 12/3 12-14 Εργαστήριο 1ο: Ανάλυση Αμινοξέων & Πρωτεϊνών -Β Εργ. ΒΧ Τετ. 17/3 9-11 Ένζυμα: Στρατηγικές κατάλυσης Ι ΜΑ1 Πέμπτη 18/3 13-15 Ένζυμα: Στρατηγικές κατάλυσης ΙΙ ΜΑ1 Παρασκ. 19/3 11-13 Ένζυμα: Ρύθμιση ενεργότητας Αίθ. 1 Τετ. 24/3 9-11 Πρωτεΐνες μεταφοράς οξυγόνου-αιμοσφαιρίνη ΜΑ1 Πέμπτη 25/3 13-15 --- - Παρασκ. 26/3 11-12 Πρωτεΐνες συνδετικού ιστού-κολλαγόνο ΜΑ1 ΔΙΑΚΟΠΕΣ ΠΑΣΧΑ Τετ. 14/4 9-11 Εργαστήριο 2ο: Ανάλυση Αιμοσφαιρινών - Α Εργ. ΒΧ Πέμπτη 15/4 13-15 Εργαστήριο 2ο: Ανάλυση Αιμοσφαιρινών – Β Εργ. ΒΧ Παρασκ. 16/4 - Συνέδριο Φοιτητών Ιατρικής - Τετ. 21/4 9-11 Δομή και λειτουργία υδατανθράκων & λιπιδίων ΜΑ1 Πέμπτη 22/4 13-15 Εργαστήριο 3ο : Κινητική Ενζύμων Ι - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 23/4 11-12 Σύσταση και λειτουργία βιολογικών μεμβρανών ΜΑ1 Παρασκ. 23/4 13-15 Εργαστήριο 3ο : Κινητική Ενζύμων Ι - Β Εργ. ΒΧ Τετ. 28/4 9-11 Εισαγωγή στο Μεταβολισμό ΜΑ1 Πέμπτη 29/4 13-15 Εργαστήριο 4ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙ - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 30/4 11-12 Πέψη και αποικοδόμηση υδατανθρακών - Γλυκόλυση ΜΑ1 Παρασκ. 30/4 12-14 Εργαστήριο 4ο: Κινητική Ενζύμων ΙΙ - Β Εργ. ΒΧ Τετ. 5/5 9-11 Ρύθμιση Γλυκόλυσης - Γλυκονεογένεση ΜΑ1 Πέμπτη 6/5 13-15 Εργαστήριο 5ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙΙ - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 7/5 11-12 Ο Κύκλος του Krebs MA1 Παρασκ. 7/5 12-14 Εργαστήριο 5ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙΙ - Β Εργ. ΒΧ

2

Τετ. 12/5 9-11 Οξειδωτική φωσφορυλίωση: Αναπνευστική Αλυσίδα ΜΑ1 Πέμπτη 13/5 13-15 Οξειδωτική φωσφορυλίωση: Σύνθεση ATP ΜΑ1 Παρασκ. 14/5 11-13 Οδός φωσφορικών πεντοζών Αίθ. 1 Τετ. 19/5 9-11 Μεταβολισμός γλυκογόνου ΜΑ1 Πέμπτη 20/5 13-15 Πέψη και αποικοδόμηση λιπιδίων ΜΑ1 Παρασκ. 21/5 11-13 Σύνθεση λιπαρών οξέων Αίθ. 1 Τετ. 26/5 9-11 Πέψη και αποικοδόμηση πρωτεϊνών & αμινοξέων ΜΑ1 Πέμπτη 27/5 13-15 Εργαστήριο 6ο : Τρανσαμινάσες – Ουρία - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 28/5 11-12 Ολοκλήρωση μεταβολισμού ΜΑ1 Παρασκ. 28/5 12-14 Εργαστήριο 6ο : Τρανσαμινάσες – Ουρία - Β Εργ. ΒΧ Τετ. 2/6 9-11 Ολοκλήρωση μεταβολισμού ΜΑ1 Πέμπτη 3/6 13-15 Φροντιστήριο: Επανάληψη Πρωτεΐνες-Ένζυμα ΜΑ1 Παρασκ. 4/6 11-13 Φροντιστήριο: Επανάληψη Καταβολισμού ΜΑ1 Τετ. 9/6 9-11 Φροντιστήριο: Επανάληψη Ύλης Εργαστηρίων ΜΑ1 Πέμπτη 10/6 13-15 - Παρασκ. 11/6 11-13 ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΑ1/2

3

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι

Β’ ΕΞΑΜΗΝΟ

Διάγραμμα Μελέτης – Αναλυτική ύλη μαθήματος – Οδηγός

2009-2010

4

Σκοποί του μαθήματος

Η κατανόηση των βασικών κυτταρικών λειτουργιών σε μοριακό επίπεδο με την μελέτη:

της δομής και των ιδιοτήτων των πρωτεϊνών και ενζύμων

των τρόπων παραγωγής και αποθήκευσης ενέργειας

του ενδιάμεσου μεταβολισμού των κυρίων βιομορίων και των μηχανισμών ρύθμισής

τους.

Στα πλαίσια του Προγράμματος Αναμόρφωσης των Προπτυχιακών Σπουδών του Τμήματος

Ιατρικής του Π. Θ., η ύλη του μαθήματος Βιοχημεία Ι έχει διαμορφωθεί ως εξής:

Α. Οι δεξιότητες που πρέπει να αποκτήσουν οι φοιτητές για να θεωρείται επιτυχημένη η

παρακολούθηση τους.

Β. Η ύλη που πρέπει να γνωρίζουν καλά οι φοιτητές για να επιτύχουν στο μάθημα καθώς και

το υλικό που πρέπει να έχουν ακούσει οι φοιτητές για να είναι ολοκληρωμένη η διδασκαλία

του μαθήματος.

5

Α. Δεξιότητες που απαιτούνται στα Εργαστήρια της Βιοχημείας Ι Γενικές δεξιότητες

Οι δεξιότητες αποκτώνται κατά την υποχρεωτική παρακολούθηση των εργαστηριακών ασκήσεων

και φροντιστηρίων. Ο φοιτητής που θα ολοκληρώσει με επιτυχία τα παραπάνω θα πρέπει να έχει

αποκτήσει

την ικανότητα να παρατηρεί φαινόμενα στο εργαστήριο, να καταγράφει και να

αναλύει δεδομένα

την ικανότητα να βγάζει συμπεράσματα από δεδομένα

την ικανότητα να λύνει προβλήματα

την ικανότητα να κατασκευάζει γραφικές παραστάσεις από δεδομένα

την ικανότητα να εξάγει πληροφορίες από γραφικές παραστάσεις

την ικανότητα να χειρίζεται τον βασικό εξοπλισμό εργαστηρίου Κλινικής Χημείας

και Βιοχημείας

την ικανότητα να εργάζεται αποτελεσματικά σε μια ομάδα

την ικανότητα να εργάζεται με ασφάλεια σε εργαστηριακό περιβάλλον

την ικανότητα να ακολουθεί οδηγίες

την ικανότητα να αντιλαμβάνεται τα εργαστηριακά λάθη και να αναγνωρίζει τις

πηγές τους

Ειδικές δεξιότητες

Ο φοιτητής θα πρέπει να είναι σε θέση να

αναλύσει ένα μίγμα αμινοξέων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας

βρίσκει το ισοηλεκτρικό σημείο μιας πρωτεΐνης με βάση τη διαλυτότητά της σε

διαφορετικά pH.

προσδιορίζει την επίδραση της θερμοκρασίας, του pH και της συγκέντρωσης του

υποστρώματος στην ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης.

υπολογίζει πειραματικά τις ενζυμικές κινητικές παραμέτρους Km και Vmax.

να χρησιμοποιεί την κινητική ανάλυση για να προσδιορίσει το είδος της ενζυμικής

ρύθμισης.

προσδιορίσει την συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης στο αίμα με την αντίδραση Drabkin

αναλύσει τις αιμοσφαιρίνες δείγματος αίματος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή και να

διαγνώσει την ύπαρξη μεταλλαγμένων αιμοσφαιρινών

να προσδιορίσει τα επίπεδα τρανσαμινασών και ουρίας στο ορό αίματος

6

Β. Αναλυτική ύλη της θεωρίας του μαθήματος Βιοχημεία Ι Δομή και λειτουργία των πρωτεϊνών Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

την γενική χημική δομή των L-α-αμινοξέων και τις ιοντικές τους ιδιότητες (Zwitterion)

την χημική δομή των 20 πρωτεϊνογόνων αμινοξέων και τις φυσικοχημικές ιδιότητες (υδροφοβικοτητα, πολικότητα, φορτίο κλπ) που απορρέουν από αυτή

τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, τις δομές συντονισμού του και την σημασία τους για τις στερεοχημικές ιδιότητες των πεπτιδίων

τις συμβάσεις για την αναπαράσταση και ονοματολογία ενός πεπτιδίου τον βιολογικό ρόλο και τις βασικές ιδιότητες των πρωτεϊνών (αμφολυτικο

χαρακτήρα, ισοηλεκτρικο σημείο, διαλυτότητα, οπτική απορρόφηση). τις έννοιες της πρωτοταγούς, δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των πρωτεϊνών τους δεσμούς που σταθεροποιούν την τρισδιάστατη διαμόρφωση των πρωτεϊνών για τις κύριες δευτεροταγείς δομές: α-έλικα, β-πτυχωτή επιφάνεια για τη τριτοταγή και τεταρτοταγή δομή και τη στερεοδιάταξη των πρωτεϊνών για τη σχέση πρωτοταγούς δομής και τελικής τρισδιάστατης διαμόρφωσης για την αποδιάταξη–μετουσίωση, αναδίπλωση πρωτεϊνών

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για το διάγραμμα Rachamandran και τις δυνατές τιμές των γωνιών φ και ψ του

πεπτιδικού δεσμού o για τις υπερδευτεροταγείς δομές (μοτίβα) και δομικές επικράτειες των πρωτεϊνών o για τις δομές των πρωτεϊνών: ινσουλίνη, λυσοζύμη, φερρτίνη, κερατίνη,

κυτόχρωμα b, μυοσφαιρίνη o για τις τράπεζες πληροφοριών των πρωτεϊνών o για τους μοριακούς συνοδούς και τη δράση τους

Μεθοδολογία ανάλυσης των πρωτεϊνών Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τις βασικές αρχές των μεθόδων απομόνωσης, καθαρισμού και ανάλυσης πρωτεϊνών: διαφορική φυγόκεντρηση, κλασματική καθίζηση, διαπίδυση, χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, χρωματογραφία στήλης, ηλεκτροφόρηση, ισοηλεκτρική εστίαση, υπερφυγοκέντρηση, φασματοσκοπία μαζών.

τις βασικές αρχές της μεθοδολογίας προσδιορισμού της αμινοξικής αλληλουχίας τις βασικές αρχές των ανοσολογικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση

πρωτεϊνών (ELISA, ανοσοαποτύπωση, μικροσκοπία ανοσο-φθορισμού).

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τον ορισμό και σημασία του πρωτεώματος και τη σχέση του με το γονιδίωμα o για την βασική δομή και ιδιότητες των αντισωμάτων o για την σημασία και τον τρόπο παρασκευής μονοκλωνικών αντισωμάτων o για την μεθοδολογία σύνθεσης πεπτιδίων o για την μεθοδολογία προσδιορισμού της δομής με κρυσταλλογραφία μέσω

ακτίνων Χ και NMR..

7

Ένζυμα: Αρχές κατάλυσης και κινητική Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τις διαφορές μεταξύ ένζύμων και τους απλούς καταλύτες ως προς την εξειδίκευση και τους μηχανισμούς κατάλυσης

το ρόλο των συνενζύμων και των συμπαραγόντων σε ορισμένα ένζυμα. το μοντέλο των Michaelis-Menten και την εξήγηση των κινητικών ιδιοτήτων των

ενζύμων. τι αποκαλύπτουν οι τιμές των σταθερών Km και Vmax για ένα ένζυμο. για την ενζυμική αναστολή και ενζυμικούς στόχους: Αντιστρεπτή και μη αντιστρεπτή

αναστολή. Συναγωνιστική και μη συναγωνιστική. Παραδείγματα αναστολέων. για τις στρατηγικές κατάλυσης από τάξεις ενζύμων:

Βασικές αρχές κατάλυσης Πρωτεάσες - αργή ταχύτητα κατάλυσης Ανθρακικές ανυδράσες - υψηλή ταχύτητα αντίδρασης Περιοριστικά ένζυμα – κατάλυση υψηλής εξειδίκευσης Κινάσες μονοφωσφορικών νουκλεοζιτών - μεταφορά φωσφορικών

ομάδων μεταξύ νουκλεοτιδίων Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει

o για το ενεργό κέντρο (σημασία τριτοταγούς δομής πρωτεϊνών), σύνδεση υποστρώματος (μοντέλα) και στερεοειδικότητα.

o για θερμοδυναμικές έννοιες (ενεργειακό διάγραμμα, σχέση ΔGo’ και Κeq’) o ότι οι περισσότερες βιοχημικές αντιδράσεις περιλαμβάνουν πολλαπλά υποστρώματα

Ένζυμα: Ρυθμιστικοί μηχανισμοί Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

για τους μηχανισμούς ρύθμισης της ενζυμικής δραστικότητας: Αλλοστερικά ένζυμα : τα χαρακτηριστικά τους, ομότροπες και ετερότροπες

επιδράσεις, συνεργατική σύνδεση υποστρώματος με το ένζυμο (μοντέλα), σιγμοειδή διαγράμματα.

Αλλοστερική ρύθμιση της ασπαραγινικής τρανσκαρβαμοϋλάσης Ισοένζυμα

Ομοιοπολική τροποποίηση-φωσφορυλίωση

Πρωτεολυτική ενεργοποίηση - πεπτικά ένζυμα Πρωτεΐνες μεταφοράς οξυγόνου Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

την γενική δομή της αίμης τα χαρακτηριστικά και τα κύρια αμινοξέα του θύλακα της αίμης για την καμπύλη σύνδεσης Ο2 της μυοσφαιρίνης για τη δομή και τις υπομοναδες της αιμοσφαιρινης για τη καμπύλη σύνδεσης Ο2 της αιμοσφαιρίνης για τη μοριακή βάση και σημασία του αλλοστερικού φαινόμενου της αιμοσφαιρίνης για την επιδραση του 2,3-ΒPG και το φαινόμενο BOHR

8

για τη μοριακή βάση και ανίχνευση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας γενικά για τις θαλασσαιμίες.

Πρωτεΐνες του συνδετικού ιστού Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τα συστατικά του συνδετικού ιστού τη δομή, χαρακτηριστική σύσταση, τροποποιήσεις, βιοσύνθεση και ρόλο του

κολλαγόνου τη δομή, χαρακτηριστική σύσταση, τροποποιήσεις και ρόλο της ελαστίνης τη δομή, χαρακτηριστική σύσταση και ρόλο των πρωτεογλυκανών και των

γλυκοζαμινογλυκανών τη δομή και ρόλο της ινοσυνδετίνης τις γενετικές και παθολογικές ανωμαλίες του συνδετικού ιστού (σκορβούτο,

λαθυρισμός, σύνδρομα Ehlers-Danlos, ατελή οστεογένεση)

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τους διαφορετικούς τύπους κολλαγόνου o για τον ρόλο των κολλαγόνων μη-ινώδους τύπου o για τον ρόλο του κολλαγόνου στη κατανομή και κίνηση των ινοβλαστών o για τον ρόλο και τη σύσταση του βασικού υμένα (κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη) o για τη δομή και ρόλο των ιντεγκρινών

Λιπίδια, βιολογικές μεμβράνες και μεμβρανική μεταφορά Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τα δομικά χαρακτηριστικά και την ονοματολογία των λιπιδίων τα δομικά χαρακτηριστικά, τη χημική σύσταση και τις ιδιότητες των βιολογικών

μεμβρανών τον ρόλο πρωτεϊνών και λιπιδίων στη δομή και λειτουργία των μεμβρανών. τους παράγοντες που επηρεάζουν τη ρευστότητα των μεμβρανών για την κίνηση λιπιδίων και πρωτεϊνών μέσα στις μεμβράνες παραδείγματα δομής μεμβρανικών πρωτεϊνών. για την παθητική και ενεργό μεταφορά διαμέσου των μεμβρανών. για αντλίες ιόντων, συζευγμένους μεταφορείς, μεμβρανικά κανάλια,

χασματοσυνδέσεις (δομικά χαρακτηριστικά, τρόπος λειτουργίας, διαφορές και ομοιότητες μεταξύ τους).

για τη λειτουργία των καρδιοτονωτικών μέσω της αντλίας καλίου-νατρίου το παράδειγμα της δράσης της ασπιρίνης μέσω αναστολής της μεμβρανικής

συνθάσης-1 της προσταγλανδίνης Η2.

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o παραδείγματα σύστασης μεμβρανών σε λιπίδια o ότι τα λιπίδια έχουν και εξειδικευμένες κυτταρικές λειτουργίες o για τις υδρόφοβες προσθετικές ομάδες πρωτεϊνών o για τις μεθόδους FRAP και FLIP παρακολούθησης της κίνησης των πρωτεϊνών

στη μεμβράνη.

9

Εισαγωγή στο Mεταβολισμό Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τις βασικές έννοιες του μεταβολισμού, τη σχέση μεταξύ αναβολισμού και καταβολισμού, τα κοινά μοτίβα αντιδράσεων.

για την ελεύθερη ενέργεια αντίδρασης και τη σημασία της για την έννοια της σύζευξης αντιδράσεων.

για τον ρόλο του ATP και τους τρόπους παραγωγής του τον ρόλο των οξειδοαναγωγικών συνενζύμων (NAD, νιασίνη, FAD, NADP) και του

ακέτυλο-συνένζυμου Α. για το ρόλο της φωσφορικής κρεατίνης στους μυς για τους τρόπους ρύθμισης μεταβολικών πορειών και για το ενεργειακό φορτίο του

κυττάρου.

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τους διαφόρους τύπους βασικών αντιδράσεων του μεταβολισμού

Γλυκόλυση ` Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τον βιολογικό ρόλο και τη χημική φύση της γλυκόζης τις αντιδράσεις της γλυκόλυσης και τα ένζυμα που τις καταλύουν την ενεργειακή απόδοση της γλυκόλυσης τις μεταβολικές τύχες πυροσταφυλικού και τη διατήρηση του ισοζυγίου

οξειδοαναγωγής τη σημασία της γλυκόλυσης ως αναερόβιας οδού, τη σημασία των ισοενζύμων της

γαλακτικής δεϋδρογονάσης και την διαχείριση του γαλακτικού από τον ανθρώπινο οργανισμό

τον μεταβολισμό της φρουκτόζης και γαλακτόζης για τη γαλακτοζαιμία και τη δυσανεξία σε φρουκτόζη και λακτόζη τη ρύθμιση της γλυκόλυσης:

ρύθμιση της φωσφοφρουκτοκινάσης και ο ρόλος της 2,6, διφωσφορικής φρουκτόζης

σημασία των ισοενζύμων για την ιστική μεταβολική εξειδίκευση (εξοκινάση/γλυκοκινάση, φωσφοφρουκτοκινάση, κινάση του πυροσταφυλικού)

ρύθμιση κατά την μυϊκή ηρεμία και την έντονη μυϊκή άσκηση για τους μεταφορείς γλυκόζης GLUT για τη σημασία της γλυκόλυσης στον καρκίνο

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την σημασία της υποξίας και του παραγοντα HIF-1 στην ανάπτυξη και

καταπολέμηση των συμπαγών όγκων Γλυκονεογένεση Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τα πρόδρομα μόρια σύνθεσης της γλυκόζης

10

τις αντιδράσεις τις γλυκονεογένεσης και το ενεργειακό της κόστος τη ρύθμιση των μη αντιστρεπτών αντιδράσεων για την αντίρροπη ρύθμιση γλυκόλυσης-γλυκονεογένεσης τον κύκλο του Cori και τον κύκλο της αλανίνης.

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει

o για τους κύκλους υποστρωμάτων και τη φυσιολογική τους σημασία. Κύκλος του κιτρικού οξέος (Κrebs) Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

για την μετατροπή του πυροσταφυλικού σε ακέτυλο-συνένζυμο Α στα μιτοχόνδρια και τη ρύθμιση της αντίδρασης

τις αντιδράσεις του κύκλου του Krebs και τα ένζυμα που τις καταλύουν, τη ρύθμιση των κομβικών ενζύμων και την ενεργειακή απόδοση

την ρύθμιση του κύκλου από το ενεργειακό φορτίο και τις ορμόνες τις αναπληρωτικές αντιδράσεις του κύκλου για τα ενδιάμεσα του κύκλου που είναι βιοσυνθετικά πρόδρομα τη βιοχημική βάση της νόσου Μπέρι-μπέρι και της δηλητηρίαση από υδράργυρο ή

αρσενικό

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την σχέση μεταξύ της πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης και της α-κετο-

γλουταρικής αφυδρογονάσης. o για την ακονιτάση ως πρωτεΐνη σιδήρου-θείου o για τον κύκλο του γλυοξυλικού οξέος

Αναπνευστική αλυσίδα – οξειδωτική φωσφορυλίωση Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τα σύμπλοκα, τους κινητούς μεταφορείς ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας και τις προσθετικές ομάδες μεταφοράς ηλεκτρονίων

για τη δομή και εξέλιξη του κυτόχρωματος c για την δημιουργία ριζών οξυγόνου (ROS) και την καταπολέμηση τους τι είναι και πως δημιουργείται το χημειοσμωτικό φαινόμενο (υπόθεση Mitchel). τη γενική δομή και λειτουργία της F0F1-ATPάσης για την πρωτονιοκίνητη δύναμη και τη σύζευξη της αναπνευστικής αλυσίδας με την

οξειδωτική φωσφορυλίωση τη ρύθμιση της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (αναπνευστικός έλεγχος). την αναστολή και αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. τους τρόπους μεταφοράς των ηλεκτρονίων του κυτταροπλασματικού NADH στο

μιτοχόνδριο (συστήματα φωσφορικής γλυκερόλης και μηλικού/ασπαρτικού) για τη μεταφορά του ΑΤΡ μέσα και έξω από το μιτοχόνδριο. την ενεργειακή απόδοση της αναπνευστικής αλυσίδας και της πλήρους καύσης της

γλυκόζης

11

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του μιτοχονδρίου o για τα δυναμικά οξειδοαναγωγής o για τον μηχανισμό μοριακού κινητήρα της F0F1-ATPάσης o για τις μιτοχονδριακές νόσους και τον ρόλο των μιτοχονδρίων στην απόπτωση, τον καρκίνο και τη γήρανση

Οδός των φωσφορικών πεντοζών Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τη σημασία της οδού των φωσφορικών πεντοζών στην παραγωγή NADPH και πεντοζών και τον συντονισμό της με την γλυκόλυση

σε ποιους ιστούς είναι ενεργή, πότε και γιατί τις γενικές αντιδράσεις οξειδωτικού και μη οξειδωτικού κλάδου. τις επιπτώσεις και βιοχημική βάση της ανεπάρκειας G6PD (φαρμακοεπαγόμενη

αιμολυτική αναιμία, φαβισμός) για την ανεπάρκεια θειαμίνης και το σύνδρομο Wernicke-Korsakoff

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει

o τις ειδικές αντιδράσεις της οδού των φωσφορικών πεντοζών Μεταβολισμός γλυκογόνου Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τη δομή, φυσικές και χημικές ιδιότητες του γλυκογόνου. για το ρόλο του γλυκογόνου ως αποθήκη γλυκόζης για την αποικοδόμηση του γλυκογόνου και τη ρύθμιση της φωσφορυλάσης του

γλυκογόνου αλλοστερικά και ορμονικά τον ρόλο του κυκλικού ΑΜΡ ως ενδοκυττάριου μηνύματος κα τη σημασία του

«καταρράκτη αντιδράσεων» για τη σύνθεση γλυκογόνου και τη ρύθμιση της συνθάσης του γλυκογόνου. για τη σημασία της γλυκογονόλυσης και γλυκογονογένεσης στο ήπαρ και τους μυς για τις νόσους αποθήκευσης γλυκογόνου (γενικά και ειδικά για τις νόσους Von

Gierke και McArdle)

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τη γλυκογενίνη o για τη φωσφορυλάση a ως αισθητήριο σύστημα της γλυκόζης στο ήπαρ o για τον ρόλο της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 1 (PP1) στη ρύθμιση του

μεταβολισμού του γλυκογόνου Πέψη και αποικοδόμηση λιπιδίων Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τη δομή και ονοματολογία των λιπιδίων για τη πέψη των λιπιδίων της τροφής και τη κινητοποίηση τους από το λιπώδη ιστό για τη σύγκριση της απόδοσης αποθήκευσης ενέργειας σε μορφή

τριακυλογλυκερολών ή γλυκογόνου για την αξιοποίηση της γλυκερόλης των λιπιδίων

12

για την ενεργοποίηση των λιπαρών οξέων και την μεταφορά τους στο μιτοχόνδριο (ρόλος καρνιτίνης)

για τη β-οξείδωση των λιπαρών οξέων και την ενεργειακής της απόδοση τη σημασία και ρόλο της βιταμίνης Β12 (κοβαλαμίνης) γιατί από λιπαρά οξέα δεν μπορούμε να συνθέσουμε γλυκόζη (εκτός από εκείνα με

περιττό αριθμό ατόμων άνθρακα) για τα κετονοσώματα: παραγωγή, ρόλος, μεταβολισμός και σημασία τους στη

νηστεία και το διαβήτη για τη διαβητική κετοξέωση

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει

o για την αποικοδόμηση μονοακόρεστων και πολυακόρεστων λιπαρών οξέων o για τον ρόλο των υπεροξειδοσωματίων και το σύνδρομο Zellweger

Σύνθεση λιπαρών οξέων Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τις βασικές αντιδράσεις και ενεργειακό κόστος της βιοσύνθεσης λιπαρών οξέων (διαφορές με την αποικοδόμηση)

την προέλευση του ακετυλο-CoA και του NADPH για την σύνθεση για τη ρύθμιση και συντονισμό της αποικοδόμησης και σύνθεσης λιπαρών οξέων σαν

απόκριση στη διατροφή μέσω της καρβοξυλάσης του ακετυλο-CoΑ για τα απαραίτητα λιπαρά οξέα, τη κυκλοοξυγενάση και τη βιοχημική βάση της

δράσης των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την επιμήκυνση και δημιουργία διπλών δεσμών κατά τη σύνθεση λιπαρών

οξέων o για τη βιολογική δράση του αραχιδονικού και των παράγωγων του

Αποικοδόμηση πρωτεϊνών και αμινοξέων – κύκλος ουρίας Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τη διαδικασία της πέψης των πρωτεϊνών τη διαδικασία ενδοκυττάριας αποικοδόμησης των πρωτεϊνών τις γενικές αρχές και ιστοειδικότητα του καταβολισμού των αμινοξέων τις αντιδράσεις μεταφοράς και απελευθέρωσης αζώτου: τρανσαμίνωση, οξειδωτική

και υδρολυτική απαμίνωση, υδρόλυση γλουταμίνης. τη σημασία και ρόλο της βιταμίνης Β6 και της φωσφορικής πυριδοξάλης την κλινική σημασία των τρανσαμινασών το ρόλο της αλανίνης και γλουταμίνης στη μεταφορά αμινομάδων στο ήπαρ τις γενικές αρχές της απέκκρισης του αζώτου τις αντιδράσεις του κύκλου της ουρίας τη μοριακή βάση, σημασία και αντιμετώπιση των υπεραμμωνιαιμιών τις γενικές αρχές καταβολισμού του ανθρακικού σκελετού των αμινοξέων. για τις γενετικές ασθένειες του μεταβολισμού των αμινοξέων τη μοριακή βάση, διάγνωση και αντιμετώπιση της φαινυλκετονουρίας.

13

Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει

o για τον μηχανισμό της αντίδρασης τρανσαμίνωσης o για τη δομή της αμινομεταφοράσης του ασπαραγινικού o για τα μονοπάτια καταβολισμού των ομάδων C3, C4 και C5 των αμινοξέων o για τα μονοπάτια καταβολισμού της φαινυλαλανίνης και τυροσίνης

Σύνοψη και ολοκλήρωση του μεταβολισμού Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά

τα επαναλαμβανόμενα μοτίβα στη μεταβολική ρύθμιση τις κύριες μεταβολικές πορείες, τις διασυνδέσεις και τις θέσεις ελέγχου τους για τα μόρια σημαντικούς κόμβους: 6-φωσφορική γλυκόζη, πυροσταφυλοκό και

ακετυλο-CoA τις κύριες μεταβολικές διεργασίες του εγκεφάλου, των μυών (σκελετικών και

καρδιακών), του λιπώδους ιστού, των νεφρών και του ήπατος για τις κύριες ορμόνες του μεταβολισμού για τις μεταβολικές αλλαγές σε επίπεδο οργανισμού κατά τη μεταγευματική

κατάσταση και τη κατάσταση νηστείας τις μεταβολικές διαταραχές στον σακχαρώδη διαβήτη για τις μεταβολικές αλλαγές κατά την άσκηση και την κατανάλωση αλκοόλ

14

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Α. ΘΕΩΡΙΑΣ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ Προτεινόμενα συγγράμματα: Berg J. M., Tymoczko J. L. & L. Stryer: ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Τόμος Ι & II Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης Γεωργάτσου Ι. Γ.: Εισαγωγή στη Βιοχημεία (5η Έκδοση) Εκδόσεις Γιαχούδη-Γιαπούλη Άλλα συγγράμματα στα Ελληνικά: Baynes J. W. & M. H. Dominiczak: Ιατρική Βιοχημεία (2η Έκδοση) Επιστημονικές Εκδόσεις ΠΑΡΙΣΙΑΝΟΥ Α.Ε. Branden C. & J. Tooze: Εισαγωγή στη Δομή των Πρωτεϊνών Ακαδημαϊκές Εκδόσεις Devlin Τ. Μ.: Βιοχημεία - Κλινικοί Συσχετισμοί Τόμος Ι & II Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Koolman J. & K.-H. Roehm: Εγχειρίδιο Βιοχημείας Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Loeffler G.: Βασικές Αρχές Βιοχημείας με στοιχεία παθοβιοχημείας Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Nelson D. L. & M. M. Cox : Lehninger, Βασικές Αρχές Βιοχημείας, Τόμος 1, 2 & 3 Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Γεωργάτσου Ι. Γ. & Π. Ι. Αρζόγλου: Αρχές Κλινικής Χημείας Εκδόσεις Megatype

Γεωργάτσου Ι. Γ., Γιουψάνη Τ. Α. & Δ. Α. Κυριακίδη: Ενζυμολογία Εκδόσεις ΖΗΤΗ

Τρακατέλλη Α.: Βιοχημεία Εκδόσεις Αφοί Κυριακίδη

15

Β. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Alexander R. R. & J. M. Griffiths: Basic Biochemical Methods Wiley-Liss Anderson S. C. & S. Cockayne: Clinical Chemistry - Concepts and Applications W. Saunders Co Clark J. M., Jr & R. L. Switzer: Πειραματική Βιοχημεία Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης Dryer R. L. & F. G. Lata: Experimental Biochemistry Oxford University Press

Holme D. J. & H. Peck: Analytical Biochemistry Longman Scientific & Technical Marshall W. J.: Clinical Chemistry - Illustrated Textbook Lippincott / Gower

Plummer D. Τ.: Practical Biochemistry - An Introduction McGraw-Hill Tietz N. W. (editor): Textbook of Clinical Chemistry W. B. Saunders Co

Wilson U. & K. H. Goulding: Principles and Techniques of Practical Biochemistry Edward Arnold

16

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ

Για την ασφάλεια όλων πρέπει να ακολουθούνται πάντα οι κάτωθι κανόνες:

1) Κανείς δεν πρέπει να εργάζεται μόνος του στο εργαστήριο χωρίς την παρουσία κάποιου μέλους του προσωπικού.

2) Αφήστε εξωτερικά ενδύματα και ογκώδη αντικείμενα (π.χ. σάκους) έξω από το εργαστήριο ή σε ειδικό χώρο του εργαστηρίου. Σκόρπια πράγματα σε πάγκους και πατώματα μπορεί να προκαλέσουν ατύχημα και υπάρχει κίνδυνος να καταστραφούν και τα ίδια.

3) Φοράτε πάντα ποδιά μόλις μπείτε στο εργαστήριο.

4) Απαγορεύεται να καπνίζετε, να τρώτε ή να πίνετε στο εργαστήριο.

5) Διαβάστε το φυλλάδιο που περιγράφει την άσκηση πριν μπείτε στο εργαστήριο και ακολουθήστε προσεκτικά τις οδηγίες που σας δίνονται για την εκτέλεση κάθε άσκησης. Επειδή συχνά δίνονται επιπλέον προφορικές εξηγήσεις στην αρχή του εργαστηρίου, είναι απαραίτητο να προσέρχεστε εγκαίρως. Αργοπορημένοι φοιτητές δεν θα γίνονται δεκτοί.

Γενική αρχή κάθε πειραματικής δουλειάς: Σκεφθείτε και προγραμματίσετε πριν ενεργήσετε.

6) Μη ρουφάτε τοξικά αντιδραστήρια με το στόμα - χρησιμοποιείστε τις pi-pumps ή poire που σας δίνονται για χρήση με τα σιφώνια. Αν δεν ξέρετε αν κάτι είναι τοξικό ρωτήστε. Ακόμα καλύτερα: Μη ρουφάτε τίποτα με το στόμα.

7) Χρησιμοποιείστε την απαγωγό εστία και φορέστε γυαλιά ασφαλείας κάθε φορά που χειρίζεστε πολύ καυστικά αντιδραστήρια, π.χ. πυκνά οξέα ή βάσεις, διαλύματα με αποπνικτικούς ατμούς κ.λ.π.

8) Στρέψετε το στόμιο σωλήνων που θερμαίνονται μακριά από σας και άλλα πρόσωπα. Προσοχή πώς πιάνετε θερμά γυαλικά. Μη φέρετε ποτέ εύφλεκτα υλικά (π.χ. αιθανόλη, αιθέρα) κοντά σε γυμνή φλόγα.

9) Αν χύσετε κάτι σκουπίστε το αμέσως με χαρτοπετσέτα - βρεγμένοι πάγκοι και πατώματα είναι επικίνδυνα. Αν χύσετε κάτι τοξικό αναφέρετέ το αμέσως στον υπεύθυνο του εργαστηρίου.

10) Προσοχή στην χρήση βιολογικών υγρών, (αίμα, οροί, κ.λ.π.) - μη ρουφάτε τίποτε με το στόμα, φοράτε γάντια και τοποθετείστε τα μεν αναλώσιμα (π.χ. χαρτικά, πλαστικά) που ήρθαν σε επαφή μαζί τους σε ειδικό σάκο απορριμμάτων, τα δε γυαλικά σε ειδικό δοχείο με απολυμαντικό.

11) Εξοικειωθείτε με την λειτουργία κάθε οργάνου και ακολουθήστε τις οδηγίες χρήσης του. Αν δεν είστε σίγουροι πώς να χρησιμοποιήσετε ένα όργανο ή μία συσκευή συμβουλευτείτε ένα μέλος του προσωπικού - έτσι προλαμβάνεται τυχόν βλάβη που μπορεί να προξενηθεί στο όργανο και εσείς έχετε εμπιστοσύνη στα αποτελέσματα που παίρνετε.

12) Βεβαιωθείτε ότι ξέρετε πού βρίσκονται στο εργαστήριο και πώς χρησιμοποιούνται ο πυροσβεστήρας, το κουτί πρώτων βοηθειών και τα δοχεία για πλύσιμο ματιών. Γρήγορη αντιμετώπιση ενός μικρού ατυχήματος μπορεί να εμποδίσει την δημιουργία ενός μεγάλου.

13) Στο τέλος κάθε άσκησης αφήστε τον πάγκο σας καθαρό και τακτικό. Ξεπλύνετε όλα τα βρώμικα γυαλικά και τοποθετείστε τα στα δοχεία για πλύσιμο και ακολουθήστε ό,τι οδηγίες σας δοθούν σχετικά με τα αντιδραστήρια.

17

ΑΣΚΗΣΗ 1

ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ & ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Εισαγωγή

Οι πρωτεΐνες έχουν καθοριστικούς ρόλους σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες και είναι κυρίως υπεύθυνες για τον φαινότυπο των διαφόρων ειδών. Ο ανθρώπινος οργανισμός εκφράζει πάνω από 30.000 διαφορετικές πρωτεΐνες, που είναι πολυμερή των ίδιων 20 L-αμινοξέων σε διαφορετικούς συνδυασμούς.

Στις πρωτεΐνες τα αμινοξέα συνδέονται με πεπτιδικούς δεσμούς, που σχηματίζονται ανάμεσα στην α-αμινομάδα και στην α-καρβοξυλομάδα διαδοχικών αμινοξέων. Τα χαρακτηριστικά των διαφόρων πρωτεϊνών εξαρτώνται από την πρωτοταγή δομή (αλληλουχία αμινοξέων) και τη διαμόρφωση (τρισδιάστατη διάταξη) των πολυπεπτιδικών αλυσίδων που τις αποτελούν και που καθορίζονται από την γενετική πληροφορία του οργανισμού.

Τα αμινοξέα κατατάσσονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, που σε μεγάλο βαθμό καθορίζονται από τις πλευρικές τους αλυσίδες (υδρόφοβα, υδρόφιλα, φορτισμένα, αφόρτιστα κλπ) και βάσει των οποίων είναι δυνατός ο διαχωρισμός τους. Οι πρωτεΐνες επίσης κατατάσσονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με τον βιολογικό ρόλο που επιτελούν (π.χ. ένζυμα, δομικές, μεταφορικές, αποθηκευτικές, αμυντικές, ρυθμιστικές πρωτεΐνες), το σχήμα τους (π.χ. ινώδεις, σφαιρικές), την προσθετική ομάδα που τυχόν περιέχουν (π.χ. λιπο-, γλυκο-, νουκλεο-, φωσφο-, μεταλλο- πρωτεΐνες) και άλλα κριτήρια. Οι πρωτεΐνες επίσης διαφέρουν στο μέγεθος (Μοριακό Βάρος) και στο ισοηλεκτρικό σημείο (pI), ανάλογα με τον αριθμό και το είδος των αμινοξέων που περιέχουν.

Οι μέθοδοι απομόνωσης, διαχωρισμού, ταυτοποίησης και μελέτης των αμινοξέων και των πρωτεϊνών είναι παρόμοιες και έχουν πολύ μεγάλη σημασία στην Βιοχημεία και στην κλινική πράξη. (Βλέπε Stryer, κεφάλαια 3 και 4).

Σκοπός της σημερινής άσκησης είναι να δούμε: Ι) τον διαχωρισμό αμινοξέων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και την ανίχνευση τους με την χρωστική δοκιμή της νινυδρίνης ΙΙ) πώς επηρεάζεται η διαλυτότητα πρωτεϊνών από α) το pH και β) τη θερμοκρασία Ι. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Διαχωρισμός αμινοξέων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography – TLC) και ταυτοποίηση τους μέσω της τιμής Rf Στη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας η στατική φάση είναι ένα προσροφητικό όπως ξηροπηκτή του διοξειδίου του πυριτίου, το οξείδιο του αργιλίου ή η γη των διατόμων, που εφαρμόζεται σε λεπτή στρώση πάνω σε γυάλινη πλάκα η ένα φύλλο αλουμινίου (σαν στατική φάση λειτουργεί και το νερό που ενυδατώνει σε μεγάλο βαθμό τα υλικά αυτά). Μετά την εναπόθεση των δειγμάτων (π.χ. μίγμα αμινοξέων), η πλάκα χρωματογραφίας τοποθετείται σε δοχείο (θάλαμος ανάπτυξης), το οποίο περιέχει ποσότητα μίγματος οργανικών διαλυτών (κινητή φάση) και το επίπεδο του οποίου βρίσκεται κάτω από το σημείο εφαρμογής του προς διαχωρισμό μίγματος των ουσιών.

Το δοχείο κλείνει ερμητικά ώστε ο θάλαμος να κορεστεί με τους ατμούς της κινητής φάσης. Ο διαλύτης ανέρχεται με τριχοειδή δράση και συμπαρασύρει τις εναποτεθείσες ουσίες. Η ταχύτητα κίνησης της κάθε ουσίας εξαρτάται από την συγγένεια της προς τις δυο φάσεις. Δηλαδή, μια ουσία υδρόφιλη κινείται σχετικά αργά (διότι αλληλεπιδρά ισχυρότερα με την πολική-υδρόφιλη στατική φάση) ενώ μια ουσία υδρόφοβη

18

κινείται σχετικά γρήγορα (διότι αλληλεπιδρά ισχυρότερα με την οργανική-υδρόφοβη κινητή φάση). Η χρωματογραφία σταματά όταν το μέτωπο του διαλύτη φθάσει κοντά στο πάνω άκρο της πλάκας. Μετά από κατάλληλη επεξεργασία ανιχνεύουμε τη θέση των ουσιών επάνω στην πλάκα και προσδιορίζεται η τιμή του Rf που είναι χαρακτηριστική παράμετρος για κάθε ουσία κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες διαχωρισμού. Rf = (απόσταση της ουσίας από την αρχή)/(απόσταση μετώπου διαλύτη από την αρχή).

Η ταυτοποίηση των αμινοξέων γίνεται με την βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων αμινοξέων που χρωματογραφούνται ταυτόχρονα με το δείγμα. Η ανίχνευση των αμινοξέων γίνεται με το αντιδραστήριο νινυδρίνης. Αντίδραση Νινυδρίνης. Διάφορες χρωστικές αντιδράσεις χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ελευθέρων αμινοξέων ή αυτών που βρίσκονται συνδεδεμένα στις πρωτεΐνες. Αυτές οι αντιδράσεις είναι γενικές ή ειδικές. Γενική αντίδραση είναι η αντίδραση νινυδρίνης (βλέπε παρακάτω) στην οποία είναι δυνατόν να δώσουν σχεδόν όλα τα ελεύθερα αμινοξέα γιατί για την αντίδραση αυτή είναι σημαντική η γενική χημική δομή των αμινοξέων. Οι ειδικές αντιδράσεις αντίθετα γίνονται στην πλάγια αλυσίδα αμινοξέων (R ομάδα) επομένως την δίνουν τόσο τα ελεύθερα όσο και τα συνδεμένα στις πρωτεΐνες αντίστοιχα αμινοξέα.

Όλα τα ελεύθερα α-αμινοξέα αντιδρούν με νινυδρίνη και δίνουν CO2, μία αλδεΰδη που περιέχει ένα άτομο άνθρακα λιγότερο από το αμινοξύ και μια κυανοϊώδη χρωστική. O O O NH2 C OH C C H R C COOH + 2 C C N=C + CO2 + R C=O H C OH C C O OH O

Νινυδρίνη

Η αντίδραση αυτή είναι γενική και δίνεται σε pΗ 5-7 από όλα τα α-αμινοξέα που έχουν ελεύθερη αμινομάδα. Η αντίδραση είναι επίσης θετική και για τις πρωτοταγείς αμίνες και την αμμωνία, αλλά χωρίς την παραγωγή CO2. Τα αμινοξέα προλίνη και υδροξυπρολίνη αντιδρούν με την νινυδρίνη αλλά δίνουν ένα παράγωγο που έχει κίτρινο χρώμα. Η αντίδραση νινυδρίνης είναι πολύ ευαίσθητη και ιδανική για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό αμινοξέων που βρίσκονται ελεύθερα στο αίμα και στα ούρα ή που προέρχονται από υδρόλυση πρωτεϊνών και διαχωρισμό με χρωματογραφικές μεθόδους. Με την αντίδραση νινυδρίνης ανιχνεύεται έως 1μg αμινοξέος, αλλά ο προσδιορισμός ng ποσοτήτων είναι δυνατός με την αντίδραση της φθορεσκαμίνης που δημιουργεί ένα φθορίζον προϊόν. Αντιδραστήρια Πρότυπα διαλύματα αλανίνης, μεθειονίνης και σερίνης (0,25 mg/ml) και μείγμα των τριών αμινοξέων. Διάλυμα προπανόλης : νερού (7:3) (κινητή φάση) Διάλυμα νινυδρίνης (2% σε αλκοόλη)

19

Υλικά-Σκεύη Πλάκες χρωματογραφίας (Silica gel 60), θάλαμος ανάπτυξης, τριχοειδείς σωλήνες, στεγνωτήρας, θερμαντικός θάλαμος. Πρακτικό Μέρος Τοποθετούμε το διαλύμα προπανόλης:νερού μέσα στο γυάλινο δοχείο χρωματογραφίας. Κλείνουμε ερμητικά το δοχείο και περιμένουμε για 30 min ώστε η ατμόσφαιρα του θαλάμου να κορεσθεί από τους ατμούς του διαλύτη. Στην πλάκα χρωματογραφίας και με τη βοήθεια ενός μαλακού μολυβιού χαράσσουμε ελαφρά σε μια απόσταση 1.5 cm από το ένα άκρο της μια γραμμή. Πάνω σε αυτήν την γραμμή και σε κανονικές αποστάσεις σημειώνουμε τις θέσεις εφαρμογής των προτύπων διαλυμάτων των αμινοξέων και του μίγματος. Για την εφαρμογή των διαλυμάτων συνήθως χρησιμοποιούμε τριχοειδείς σωλήνες. Η εφαρμογή γίνεται με μεγάλη προσοχή και σε δυο-τρεις δόσεις, ξηραίνοντας με την βοήθεια του στεγνωτήρα μεταξύ των δόσεων το σημείο εφαρμογής (η διάμετρος της κηλίδας του υγρού πρέπει να παραμείνει μικρή και το στρώμα του υλικού δεν πρέπει να διαταραχθεί). Στη συνέχεια, με μεγάλη προσοχή, τοποθετούμε την πλάκα λεπτής στιβάδας μέσα στο δοχείο κατά τέτοιο τρόπο, ώστε η σειρά των κηλίδων να είναι παράλληλη προς την επιφάνεια του υγρού, και οπωσδήποτε πάνω από αυτήν.

Όταν το μέτωπο του διαλύτη φθάσει τα 2 εκ. περίπου από το τέλος της πλάκας σταματά η χρωματογράφηση και μεταφέρουμε την πλάκα στον απαγωγό. Σημειώνουμε προσεκτικά με μολύβι το μέτωπο του διαλύτη και ξηραίνουμε την πλάκα με τη βοήθεια του στεγνωτήρα ή την αφήνουμε για λίγα λεπτά στον απαγωγό.

Για να αναγνωριστούν τα σημεία στα οποία βρίσκονται τα αμινοξέα, η πλάκα εμβαπτίζεται στιγμιαία σε διάλυμα νινυδρίνης, στεγνώνεται και τοποθετείται στον θερμαντικό θάλαμο στους 110 οC μέχρι να εμφανιστούν οι σκουρόχρωμες κηλίδες των αμινοξέων. Μετά την εμφάνιση των κηλίδων σημειώνουμε με το μολύβι το κέντρο των κηλίδων και υπολογίζουμε τις αποστάσεις μετακίνησης από την αρχή. ΙΙ. ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Α. Επίδραση του pH στην διαλυτότητα των πρωτεϊνών Οι πλευρικές αλυσίδες (R) μερικών αμινοξικών καταλοίπων καθώς και το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό κατάλοιπο των πρωτεϊνών φέρουν ομάδες που μπορούν να ιονισθούν (Πίνακας Ι). Η ιονισμένη μορφή προκύπτει είτε από την απώλεια Η+ (για τις όξινες ομάδες), οπότε η πρωτεΐνη αποκτά ένα αρνητικό φορτίο, είτε από την πρόσληψη Η+ (για τις βασικές ομάδες), οπότε η πρωτεΐνη αποκτά ένα θετικό φορτίο. Επειδή οι ομάδες που μπορούν να ιονισθούν έχουν διαφορετική pΚα είναι φανερό ότι αν μια ομάδα είναι ιονισμένη ή όχι, και επομένως αν η πρωτεΐνη φέρει ένα φορτίο ή όχι, εξαρτάται από το pΗ του διαλύματος σύμφωνα με την εξίσωση Henderson – Hasselbalch. μη πρωτονιωμένη μορφή pH = pKα + log ----------------------------------------- πρωτονιωμένη μορφή

Από την εξίσωση αυτή προκύπτει ότι η pKα ισούται με την τιμή του pH, στην οποία η πρωτονιωμένη και μη πρωτονιωμένη μορφή μιας ομάδας βρίσκονται σε ίσα ποσά στο διάλυμα. Σε τιμές pH που ισούνται με pKα 1 μιας ομάδας, η ομάδα αυτή δρα σαν ρυθμιστής του pH του διαλύματος.

20

Σημειώστε ότι οι όξινες ομάδες είναι ιονισμένες σε pΗ > από την pΚα τους, ενώ οι βασικές ομάδες είναι ιονισμένες σε pΗ < από την pΚα τους. Πίνακας 1. Ομάδες αμινοξέων που ιονίζονται σε πρωτεΐνες

Ομάδα Οξύ Βάση Χαρακτηριστική pKα

Τελική -COOH -COOH -COO- ~ 3,0 -NH2 -NH3

+ -NH2 ~ 8,0 Πλευρική –COOH Asp, Glu -COOH -COO- ~ 4,0 -SH Cys -SH -S- ~ 8,5 -OH Tyr -OH -O- ~10,0 =N His =NH+ =N ~ 6,5 -NH2 Lys -NH3

+ -NH2 ~ 10,0 =NH Arg =NH2

+ =NH ~ 12,0

Οι πρωτεΐνες φέρουν πολλά φορτία αλλά, ανάλογα με το pΗ, το καθαρό φορτίο τους μπορεί να είναι θετικό ή αρνητικό. Τo pΗ στο οποίο ο ολικός αριθμός θετικών φορτίων μιας πρωτεΐνης είναι ίσος με τον ολικό αριθμό αρνητικών φορτίων (καθαρό φορτίο πρωτεΐνης = 0) ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο (pI). Σε pΗ = pΙ, μια πρωτεΐνη έχει την μικρότερή διαλυτότητα γιατί τα μόριά της συσσωματώνονται και καθιζάνουν ευκολότερα.

Παράδειγμα: Στο κανονικό pΗ του γάλατος (6,3 - 6,6) η καζεΐνη, μια πρωτεΐνη που βρίσκεται στο γάλα, είναι διαλυμένη σε κολλοειδή μορφή. Όταν όμως το pΗ του γάλατος ελαττωθεί, λόγω ανάπτυξης βακτηριδίων που ελευθερώνουν οξέα, και φτάσει γύρω στο 4,7 που είναι το pΙ της καζεΐνης, τότε η καζεΐνη θρομβώνεται και το γάλα πήζει. Πρακτικό Μέρος Καθίζηση στο ισοηλεκτρικό σημείο. Σε μια σειρά από 5 πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρου τοποθετείστε τα κάτωθι αντιδραστήρια και σημειώστε σε ποιο σωλήνα παρατηρείτε το περισσότερο θόλωμα ή ίζημα:

Αντιδραστήρια σωλήνας σωλήνας σωλήνας σωλήνας σωλήνας (ml) 1 2 3 4 5

0,5Μ CH3COOH 7,8 7,2 5,0 1,8 0,8 0,5M CH3COONα 0,2 0,8 3,0 6,2 7,2

0,5% διάλυμα καζεΐνης

2 2 2 2 2

Υπολογίστε το pΗ του διαλύματος κάθε σωλήνα από την εξίσωση Henderson-Hasselbalch (pΚα CH3COOH=4,75). Σε ποια τιμή pH παρατηρείτε το περισσότερο ίζημα; Ποια είναι η τιμή pΙ της καζεΐνης που βρήκατε;

21

Β. Επίδραση της θερμοκρασίας στην διαλυτότητα των πρωτεϊνών Οι περισσότερες πρωτεΐνες αρχίζουν να μετουσιώνονται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 40οC και η μετουσίωση είναι συνήθως πλήρης στους 60-70οC. Με την θέρμανση καταστρέφεται η φυσική διαμόρφωση (δευτεροταγής και τριτοταγής δομή) των πρωτεϊνών και αυτό έχει συνήθως σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της διαλυτότητας και την καταβύθισή τους, λόγω της δημιουργίας τυχαίων συσσωματωμάτων που είναι αδιάλυτα (Παράδειγμα η πήξη της λευκωματίνης του αυγού). Πρακτικό Μέρος Καθίζηση με θέρμανση. Σε 3 δοκιμαστικούς σωλήνες βάλετε από 2ml 2% διαλύματος λευκωματίνης και προσθέσετε στον σωλήνα 1, 0,2 ml Η2Ο, στον σωλήνα 2, 0,2 ml 1N HCl και στο σωλήνα 3, 0,2 ml 1N NαΟΗ. Θερμάνετε τους σωλήνες σε υδατόλουτρο σε 100οC για 10 λεπτά και κρυώστε σε θερμοκρασία δωματίου. Τι παρατηρείτε;

22

ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 1

Ι. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ TLC

Επισυνάψτε την TLC ή φωτοτυπία της. Σημειώστε με βέλη την θέση κάθε αμινοξέος και υπολογίστε τις τιμές Rf στα πρότυπα διαλύματα και στο μίγμα. Βρείτε την σύσταση του μίγματος. TLC:

Rf αλανίνης (Ala, A): Rf μεθειονίνης (Met, M): Rf σερίνης (Ser, S) Rf αμινοξέων στο μίγμα: Σύσταση μίγματος: Γράψτε τις χημικές δομές των τριών αμινοξέων που χρησιμοποιήσατε και βάσει αυτών δικαιολογήστε τις διαφορές στις τιμές Rf. Αλανίνη: Μεθειονίνη: Σερίνη: Δικαιολόγηση Rf:

23

ΙΙ. ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Α. Επίδραση του pH στη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. 1. Υπολογίστε το pH του διαλύματος κάθε σωλήνα από την εξίσωση Henderson Hasselbach

(pKa CH3COOH = 4,75). 2. Σε ποια τιμή pH παρατηρείτε το περισσότερο ίζημα; Ποια είναι η τιμή pI της καζεΐνης; Β. Επίδραση της θερμοκρασίας στη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Τι παρατηρείτε; Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας.

24

ΑΣΚΗΣΗ 2

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ

Ι. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΑΙΜΑΤΟΣ (Αντίδραση Drabkin) Εισαγωγή

Η αιμοσφαιρίνη περιέχεται στα ερυθροκύτταρα και είναι ο κύριος μεταφορέας οξυγόνου στο αίμα. Αποτελείται από 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες, κάθε μία από τις οποίες φέρει από ένα μόριο αίμης. Ο σίδηρος της αίμης βρίσκεται στην Fe2+ μορφή και συνδέει αντιστρεπτά ένα μόριο οξυγόνου. Στις δύο ακραίες μορφές της η αιμοσφαιρίνη απαντάται σαν δεοξυαιμοσφαιρίνη (Hb), όταν δεν περιέχει κανένα μόριο Ο2, ή σαν οξυαιμοσφαιρίνη (HbΟ2), όταν περιέχει τέσσερα μόρια Ο2. Το άτομο του Fe2+ στην δεοξυαιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε πεντασυναρμοσμένο σύμπλοκο (κατάσταση υψηλού spin), ενώ στην οξυαιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε εξασυναρμοσμένο σύμπλοκο (κατάσταση χαμηλού spin). H αιμοσφαιρίνη είναι μία αλλοστερική πρωτεΐνη (παρουσιάζει την χαρακτηριστική σιγμοειδή καμπύλη αποσύνδεσης Ο2 που οφείλεται στο ότι η σύνδεση κάθε μορίου οξυγόνου είναι συνεργατική) και η συγγένειά της για οξυγόνο επηρεάζεται από τις μεταβολικές συνθήκες (την συγκέντρωση Η+, CO2 και 2,3 ΒPG).

Εκτός από το οξυγόνο, σύμπλοκα συναρμογής με το Fe2+ της αίμης σχηματίζουν και το μονοξείδιο του άνθρακα, κυανιούχα κ.α., και επειδή τα σύμπλοκα αυτά είναι σταθερότερα, η αιμοσφαιρίνη γρήγορα χάνει την ικανότητά της να μεταφέρει οξυγόνο. Oξείδωση του σιδήρου της αίμης σε Fe3+ (μεθαιμοσφαιριναιμία), είτε λόγω κατάχρησης οξειδωτικών ουσιών, είτε λόγω κληρονομικών παθήσεων, οδηγεί σε απώλεια της ικανότητας της αιμοσφαιρίνης να συνδέει οξυγόνο και συνήθως χαρακτηρίζεται από κυάνωση.

Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αιμοσφαιρίνης στο αίμα είναι μία από τις πιο συνήθεις κλινικές εξετάσεις. Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης μπορεί να μειωθεί σαν αποτέλεσμα αιμορραγίας, αιμόλυσης ή ελαττωματικής ερυθροποίησης ή να αυξηθεί λόγω ελαττωματικής πνευμονικής λειτουργίας ή ύπαρξης άλλων παθήσεων.

Όλες οι αιμοπρωτεΐνες, λόγω της αίμης που περιέχουν, έχουν ένα μέγιστο απορροφητικότητας στα 400-440nm (ζώνη Soret). Επιπλέον οι διάφορες μορφές αιμοσφαιρίνης παρουσιάζουν και άλλα μέγιστα στα 480-630nm (πίνακας I).

Πίνακας Ι Παράγωγα αιμοσφαιρίνης Μέγιστα απορροφήσεως (nm) Δεοξυαιμοσφαιρίνη 428-430 555 Οξυαιμοσφαιρίνη 412-415 541 576-578 Καρβοξυαιμοσφαιρίνη 417-418 537 568-572 Μεθαιμοσφαιρίνη (pH 7,0) 404-407 500 540 578 630 Κυανομεθαιμοσφαιρίνη 413-418 480 541 580-590 Έχει επικρατήσει να υπολογίζεται η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης στο αίμα

φασματοφωτομετρικά μετά την μετατροπή όλων των μορφών της (οξυ-, δεοξυ-, καρβοξυ-, μεθαιμοσφαιρίνη) σε κυανομεθαιμοσφαιρίνη.

25

Η αρχή της μεθόδου είναι: το Fe2+ της αιμοσφαιρίνης οξειδώνεται από σιδηροκυανιούχο κάλιο προς Fe3+ της μεθαιμοσφαιρίνης, η οποία μετατρέπεται στην σταθερή ένωση της κυανομεθαιμοσφαιρίνης με την προσθήκη κυανιούχου καλίου. Hb (Fe2+) + [ (Fe3+) (CN)6 ]

3- Hb (Fe3+) + [ (Fe2+) (CN6) ]4-- Μεθαιμοσφαιρίνη (Met-Hb) Hb (Fe3+) + CN- Hb(Fe3+)CN

Κυανομεθαιμοσφαιρίνη (CN-Met-Hb)

Η απορροφητικότητα της κυανομεθαιμοσφαιρίνης μετριέται στα 540 nm (λmax). Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης σε g/100ml υπολογίζεται από την απορροφητικότητα ενός πρότυπου δείγματος αιμοσφαιρίνης ή από την πρότυπη καμπύλη. Οι φυσιολογικές τιμές για ενήλικες είναι 14-18 g/100 ml για άνδρες και 12-16 g/100 ml για γυναίκες.

Στη σημερινή άσκηση θα υπολογίσετε τη συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης σε ένα άγνωστο δείγμα και στο δικό σας αίμα. Υλικά Δείγμα αίματος 10ml αντιδραστήριο Drabkin 3 σωλήνες (Νο 2, 3, 4) που περιέχουν πρότυπα διαλύματα CN-Met-Hb σε αντιδραστήριο Drabkin: A=6g%, B=12g%, Γ=18g% 3 άδειους σωλήνες 6 άδειες πλαστικές κυψελίδες φωτόμετρου 1 ml 1 μικροπιπέτα με πλαστικές μύτες. (Βεβαιωθείτε ότι είναι ρυθμισμένη στο σωστό όγκο και ότι γνωρίζετε τον χειρισμό της) ΠΡΟΣΟΧΗ: Το αντιδραστήριο DRABKIN και επομένως το περιεχόμενο όλων των σωλήνων περιέχει CN-. Xύσετε τα αντιδραστήρια στο τέλος του προσδιορισμού σε ένα ειδικό νεροχύτη όπου δεν χύνετε οξέα και όπου τρέχει συνεχώς νερό για να αποφευχθεί η δημιουργία θανατηφόρου HCN. Τεχνική

Το δικό σας αίμα το παίρνετε ως εξής: απολυμάνετε με οινόπνευμα ένα δάκτυλό σας, πιέστε το δάκτυλο ώστε να μαζευτεί το αίμα στο άκρο, τρυπήστε με ένα ξυραφάκι, περιμένετε να σχηματισθεί μια μεγάλη σταγόνα και πάρτε προσεκτικά με την μικροπιπέτα 5 μl αίματος. Ξεπλύνετε επανειλημμένα την πιπέτα, με την οποία πάρθηκε κάθε δείγμα αίματος, με το αντιδραστήριο Drabkin.

Στους τρεις άδειους σωλήνες (Νο 1, 5 και 6) προσθέστε Drabkin και δείγμα αίματος σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα (1=τυφλό, 2,3,4=πρότυπο, 5,6=δείγμα).

26

Σωλήνες

Αντιδραστήρια 1 2 3 4 5 6

Drabkin(περιέχει Κ3[Fe(CN)6], KCN(ml)

1 - - - 1 1

Πρότυπο διάλυμα CN-Met-Hb A(ml)

- 1 - - - -

Πρότυπο διάλυμα CN-Met-Hb B(ml)

- - 1 - - -

Πρότυπο διάλυμα CN-Met-Hb Γ(ml)

- - - 1 - -

Αίμα (ολικό) άγνωστο (ml) - - - - 0,005 -

Αίμα (ολικό) δικό σας (ml) - - - - - 0,005

Αναδεύσατε τους σωλήνες και αφήστε τους σε ηρεμία για 10 min. Μεταφέρετε το

περιεχόμενο στις κυψελίδες και φωτομετρήστε στα 540 nm έναντι του τυφλού. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη σημειώνετε τις πλαστικές κυψελίδες

.

ΙΙ. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΟΣ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Εισαγωγή

Περίπου 350 μεταλλαγμένες αιμοσφαιρίνες είναι γνωστές και μερικές απ' αυτές, όπως π.χ. η HbS, είναι υπεύθυνες για σοβαρές αιμοσφαιρινοπάθειες (διαταραχές στις οποίες η παραγωγή της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης του ενήλικα, HbA, αναστέλλεται μερικά ή ολικά, ή αντικαθίσταται από μία ή περισσότερες μη φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες). Η ανίχνευση και η ταυτοποίηση των διαφόρων αιμοσφαιρινών έχει μεγάλη σημασία στην κλινική βιοχημεία. Η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται αρχικά είναι η ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικό pH, με την οποία διαχωρίζονται οι αιμοσφαιρίνες Α,F,S,C, καθώς και άλλες αιμοσφαιρίνες. Υπενθυμίζεται ότι η σύσταση των φυσιολογικών αιμοσφαιρινών είναι: HbA=α2β2, ΗbA2= α2δ2, ΗbF=α2γ2. Οι αλλαγές που παρατηρούνται στις συνηθέστερες μεταλλαγμένες αιμοσφαιρίνες είναι: HbS=β6 GluVal, HbC=β6 GluLys, HbD(Punjab)=β121 GluGln, HbO(Arab)=β121 GluLys, HbE=β26 GluLys, HbG=β42

GluAla, HbH=β4, HbLepore= δβ σύντηξη. Στη σημερινή άσκηση θα χρησιμοποιήσετε τις γνωστές συσκευές ηλεκτροφόρησης

Beckman-Paragon και τις έτοιμες πηκτές αγαρόζης, με δείγματα αίματος που θα σας δοθούν. Αιωρείστε τα ερυθρά αιμοσφαίρια σε 2ml φυσιολογικού ορού και ξαναφυγοκεντρήστε. Με μια πλαστική μικροπιπέτα τοποθετείστε 15 σταγόνες του αντιδραστηρίου αιμόλυσης σ' ένα καθαρό σωληνάριο και προσθέσετε 1 σταγόνα από τα πλυμένα, φυγοκεντρημένα ερυθροκύτταρα και αναδεύσετε στο Vortex για 15 sec. Το δείγμα σας (αιμόλυμα) είναι έτοιμο! Τεχνική ηλεκτροφόρησης 1) Βγάλτε την πηκτή από το περικάλυμμα της και πατήστε την ελαφρά με διηθητικό χαρτί

(gel blotter).

27

2) Ευθυγραμμίστε προσεκτικά την μήτρα (sample template) με τα σημεία C της πηκτής και πατήστε ελαφρά.

3) Χρησιμοποιώντας κάθε φορά μια διαφορετική μύτη για την μικροπιπέτα τοποθετείστε ~ 5μl από τα διάφορα δείγματα αίματος στις εγκοπές και αφήστε ~ 5 min για να απορροφηθούν.

4) Πατήστε ελαφρά με διηθητικό χαρτί και μετά αφαιρέστε και το χαρτί και την μήτρα. 5) Βάλτε 45ml ρυθμιστικού διαλύματος pH=8,6 σε κάθε διαμέρισμα του μπάνιου

ηλεκτροφόρησης και τοποθετείστε την πηκτή πάνω στην γέφυρα (προσέχοντας ώστε το + άκρο της πηκτής να βρίσκεται στο + άκρο του μπάνιου).

6) Ηλεκτροφορήστε στα 150 Volt για 25 min. 7) Αφαιρέστε την πηκτή από το μπάνιο και βάλτε την στο πλαίσιο πηκτής (gel frame). 8) Τοποθετείστε την πηκτή στο μονιμοποιητικό διάλυμα 1 (30% μεθανόλη - 20% οξικό)

για 3-5 min. 9) Στεγνώστε την πηκτή στο στεγνωτήρα (gel drier) για ~ 15 min. 10) Τοποθετείστε την πηκτή στην μπλέ χρωστική (διάλυμα 2) για 3-5 min. 11) Τοποθετείστε την πηκτή με την σειρά στα εξής διαλύματα: διάλυμα 3 (5% οξικό) για 1-

2 min, διάλυμα 4 (μεθανόλη - οξικό) για 2 min, διάλυμα 5 (5% οξικό) για 2 min. 12) Στεγνώστε την πηκτή (που τώρα θα πρέπει να εμφανίζει μπλέ ζώνες σε ένα διαυγές

υπόστρωμα) στο στεγνωτήρα για ~5-10 min. Ερμηνεύστε τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό αιμοσφαιρινών που πήρατε σύμφωνα με τα κάτωθι πρότυπα: Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός αιμοσφαιρινών σε:

28

ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 2 Ι. Προσδιορισμός Hb Αίματος α) Πίνακας αποτελεσμάτων Σωλήνες

Αριθμός Περιεχόμενο Α 540

1

2

3

4

5

6

β) Πρότυπη καμπύλη CN-Met-Hb

29

γ) Χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμπύλη που κατασκευάσατε υπολογίστε τη συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης στα άγνωστα δείγματα αίματος: Σωλήνας 5 Σωλήνας 6 δ) Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας. ΙΙ. Ηλεκτροφορητικός Διαχωρισμός Αιμοσφαιρινών α) Επισυνάψτε το ηλεκτροφόρημα που πήρατε ή μια φωτοτυπία σημειώνοντας την αιμοσφαιρίνη που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη.

30

β) Αναφέρατε το είδος και την ένταση των ζωνών που παρατηρείτε σε κάθε δείγμα και ερμηνεύστε τα ευρήματά σας. Δείγμα Ζώνες Ερμηνεία 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 γ) Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας.

31

ΑΣΚΗΣΗ 3-4-5

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ

Εισαγωγή

Τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες που δρουν ως βιολογικοί καταλύτες επειδή έχουν την ικανότητα να προάγουν ειδικές χημικές αντιδράσεις κάτω από τις ήπιες συνθήκες που επικρατούν στους περισσότερους ζωντανούς οργανισμούς. Τα ένζυμα δεν αλλάζουν τη θέση της ισορροπίας σε μια αντιστρεπτή αντίδραση, αλλά επιταχύνουν την επίτευξή της χαμηλώνοντας την ενέργεια ενεργοποίησης, που απαιτείται κατά την μετατροπή υποστρώματος σε προϊόν, με το να διευκολύνουν τη δημιουργία της μεταβατικής κατάστασης. Τα ένζυμα έχουν τρία διακριτικά χαρακτηριστικά: Υψηλή ειδικότητα, υψηλή ταχύτητα αντίδρασης και μεγάλη ικανότητας ρύθμισης.

Όλα τα ένζυμα συνδέουν αντιστρεπτά το υπόστρωμά τους σε μια ειδική περιοχή δέσμευσης γνωστής ως το ενεργό κέντρο, που δημιουργείται από την τριδιάστατη δομή του πρωτεϊνικού μορίου. Το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος υφίσταται μια καταλυτική αντίδραση, που προάγεται από ειδικά κατάλοιπα αμινοξέων στο ενεργό κέντρο, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό του προϊόντος. Οι καταλυτικές ιδιότητες ενός ενζύμου συχνά εξαρτώνται από την ύπαρξη μη-πεπτιδικών μορίων, γνωστών ως συμπαράγοντες ή συνένζυμα, τα οποία συνδέονται με το ένζυμο και προάγουν την αντίδραση. Ορισμένα ένζυμα (αλλοστερικά) μπορεί να περιέχουν, εκτός από το ενεργό κέντρο, ξέχωρες ρυθμιστικές ή αλλοστερικές περιοχές για την σύνδεση άλλων μορίων, τα οποία, όταν συνδεθούν, τροποποιούν την καταλυτική δράση του ενζύμου επειδή επάγουν αλλαγές στη διαμόρφωση του ενεργού κέντρου. Αυτά τα ρυθμιστικά μόρια ονομάζονται τροποποιητές και μπορεί να ενεργοποιούν ή να καταστέλλουν το ένζυμο.

Η κινητική των ενζυμικών αντιδράσεων, όπως διατυπώθηκε κυρίως από τους Michaelis – Menten, ασχολείται με την μέτρηση των δύο χαρακτηριστικών σταθερών του κάθε ενζύμου, Vmax και ΚΜ, και με την μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την ενζυμική αντίδραση. Οι κυριότεροι από τους παράγοντες αυτούς είναι: η συγκέντρωση του ενζύμου, η συγκέντρωση του υποστρώματος και άλλων ουσιών που μπορούν να συνδεθούν με το ένζυμο (προϊόντα αντιδράσεως, συνένζυμα, ενεργοποιητές, αναστολείς), το pH, η θερμοκρασία και η ιοντική ισχύς. Η ενεργότητα ενός ενζύμου, E, εκφράζεται με την ταχύτητα της αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο. Για την απλούστερη περίπτωση, όπου ένα υπόστρωμα μετατρέπεται μη αντιστρεπτά σε ένα προϊόν, στην αντίδραση k1 k3 k

Ε + S ΕS Ε + P (1) 2

(και όπου k1, k2 και k3 οι σταθερές της ταχύτητας των επιμέρους αντιδράσεων) η ταχύτητα, V, ορίζεται σαν το ποσό του υποστρώματος, S, που καταναλώνεται ή το ποσό των προϊόντων, P, που δημιουργούνται στην μονάδα του χρόνου (V=-d[S]/dt = d[P]/dt) και υπολογίζεται από την εξίσωση Michaelis - Menten:

32

[S] Vo=Vmax (2) KΜ + [S] Οπου Vo η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης, [S] η αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, Vmax η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης για την συγκέντρωση του ενζύμου που χρησιμοποιήθηκε και k2 + k3 (3) KΜ (σταθερά Michaelis) = k1

Για να ισχύει η κινητική Michaelis - Menten απαιτείται ο προσδιορισμός της αρχικής ταχύτητας, Vo, γιατί μόνο τότε ισχύει η υπόθεση ότι η μετατροπή αντιδρώντων σε προϊόντα δεν είναι αντιστρεπτή και [P]=0. Η αρχική ταχύτητα, Vo, προσδιορίζεται από την καμπύλη προόδου της αντίδρασης, δηλαδή το διάγραμμα μεταβολής της συγκέντρωσης του υποστρώματος ή προϊόντος με το χρόνο και δίνεται από την εφαπτομένη των καμπυλών σε χρόνο t=0.

Δεδομένου ότι η Vo = k3[ES] και Vmax = k3[EΤ] (όπου ΕΤ το ολικό ποσό του ενζύμου) είναι φανερό ότι η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου που χρησιμοποιήθηκε. Για την εκτίμηση της επίδρασης της συγκέντρωσης του ενζύμου στην Vo χρειάζεται η αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος να είναι μεγάλη, ώστε να μην αποτελεί περιοριστικό παράγοντα (η αντίδραση να είναι μηδενικής τάξεως ως προς το υπόστρωμα). (Για περισσότερες εξηγήσεις για την θεωρία της κινητικής των ενζυμικών αντιδράσεων αναφερθείτε σε βιβλία, π.χ. Βιοχημεία Stryer, κεφάλαιο 8).

Από την εξίσωση Michaelis - Menten προκύπτει ότι η αρχική ταχύτητα μιας αντίδρασης εξαρτάται από την συγκέντρωση του υποστρώματος. Για πολλές ενζυμικές αντιδράσεις, όπου ένα υπόστρωμα μετατρέπεται σε ένα προϊόν, το διάγραμμα μεταβολής της αρχικής ταχύτητας, V0, με τη συγκέντρωση του υποστρώματος, [S], είναι μια ορθογώνια υπερβολή. Παρατηρούμε ότι σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος η αρχική ταχύτητα αυξάνει γραμμικά με τη συγκέντρωση του υποστρώματος (κινητική πρώτης τάξεως, V0=k[S]), ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος η αρχική ταχύτητα γίνεται σταθερή και ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του υποστρώματος (κινητική μηδενικής τάξεως ή κινητική κορεσμού, V0=k) και πλησιάζει την οριακή τιμή της μέγιστης ταχύτητας, Vmax. Η σταθερά Michaelis είναι η συγκέντρωση υποστρώματος στην οποία έχουμε το ήμισυ της μέγιστης ταχύτητας. Από τις εξισώσεις 1 και 3 προκύπτει ότι, όταν η k3 είναι πολύ μικρή, η KΜ πλησιάζει τη σταθερά διαστάσεως του συμπλόκου ES, μας δίνει επομένως μια εκτίμηση της συγγένειας του ενζύμου προς το συγκεκριμένο υπόστρωμα.

Επειδή ο προσδιορισμός των KM και Vmax είναι δύσκολος από την ορθογώνια υπερβολή, προτιμώνται γραμμικοί μετασχηματισμοί της εξίσωσης Michaelis – Menten. Ο γνωστότερος από αυτούς είναι η εξίσωση Lineweaver – Burk ή διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου: (4) 1/V0 = KM/ Vmax * 1/[S] + 1/ Vmax

Έτσι το διάγραμμα 1/V0 προς 1/[S] είναι ευθεία γραμμή, η οποία τέμνει τον κάθετο

άξονα στο σημείο 1/Vmax, , τον οριζόντιο άξονα στο σημείο –1/KM και έχει κλίση KM/Vmax

33

Οι καταλυτικές σταθερές KM και Vmax είναι χαρακτηριστικές μιας ενζυμικής αντίδρασης. Η τιμή KM είναι σταθερή για ένα ένζυμο με ένα ορισμένο υπόστρωμα κάτω από καθορισμένες συνθήκες pH, θερμοκρασίας και ιοντική ισχύος, εκφράζεται ως συγκέντρωση και συνήθως κυμαίνεται σε 10

ς

:

-1 με 10-7 Μ. Αντιθέτως η Vmax εξαρτάται από το ποσό του ενζύμου που χρησιμοποιείται και γι’ αυτό εκφράζεται ως ταχύτητα σχηματισμού Ρ ανά μονάδα ενζύμου (πχ μmoles/min/mg πρωτείνης)

Μια άλλη πολύ χρήσιμη σταθερά είναι ο αριθμός ανακύκλωσης ή kcat, ο οποίος ορίζεται ως kcat = Vmax / [ET ]. Η kcat αντιστοιχεί στον μέγιστο αριθμό moles υποστρώματος που μπορούν να μετατραπούν σε προϊόν ανά mole ενζύμου ανά μονάδα χρόνου σε συνθήκες ενζυμικού κορεσμού, αντιπροσωπεύει δηλαδή τη μοριακή ενεργότητα του ενζύμου και εκφράζεται σε sec-1. Η kcat ισούται με την k3 όταν [S]>>KΜ και έχει τιμές που κυμαίνονται ανάμεσα στο 1-107 Τέλος η σταθερά εξειδίκευσης, kcat/KΜ, ο λόγος δυο σταθερών, εκφράζεται σε Μ-1 sec-1 και είναι ενδεικτική της κινητικής αποδοτικότητας του ενζύμου. Αντιστοιχεί στην σταθερά της ταχύτητας k1 ανάμεσα στο υπόστρωμα και στο ελεύθερο ένζυμο, όταν [S] <<KΜ και [ΕT]=[Εελεύθερο]

Η ενζυμική ενεργότητα επηρεάζεται από την ύπαρξη αναστολέων. Οι αναστολείς ενζύμων (Ι) είναι συνδέτες που ενώνονται ειδικά με ένα ένζυμο με ένα τέτοιο τρόπο ώστε να μειώνουν την ικανότητα του να συνδέει το υπόστρωμα και να το μετατρέπει σε προϊόν. Διακρίνονται σε διάφορα είδη.

Οι μή- αντιστρεπτοί αναστολείς, όπως είναι οι οργανικές ενώσεις φωσφόρου και υδράργυρου, τα κυανιούχα, το μονοξείδιο του άνθρακα και το υδρόθειο, συνδέονται στενά, συχνά με ομοιοπολικούς δεσμούς, με δραστικές ομάδες όπως –ΟΗ, -SH ή άτομο μετάλλου, στο ενεργό ή αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου. Έτσι το DIPF (διϊσoπροπυλο-φωσφοφθορίδιο) ή το παραθείο αντιδρά με ομάδες σερίνες στο κέντρο εστερασών όπως η ακετυλοχολινεστεράση, το ιωδοακεταμίδιο με ομάδες κυστείνης, ενώ το CN- με το Fe κυτοχρωμάτων. Τέτοιοι αναστολείς είναι πολύ χρήσιμοι στην μελέτη των ενεργών κέντρων ενζύμων και η έκταση της μη-αντιστρεπτής αναστολής που προκαλούν εξαρτάται από το χρόνο και την ποσότητα του αναστολέα.

Οι αντιστρεπτοί αναστολείς συνδέονται μή – ομοιοπολικά με το ένζυμο και γι’ αυτό μπορεί να απομακρυνθούν εύκολα με διαπίδυση. Οι συναγωνιστικοί αντιστρεπτοί αναστολείς συνδέονται στην ίδια περιοχή όπως το υπόστρωμα, με το οποίο μοιάζουν δομικά, μειώνοντας ουσιαστικά τα ενεργά κέντρα του ενζύμου που είναι διαθέσιμα για σύνδεση υποστρώματος. Αντιθέτως, ένας μή-συναγωνιστικός αναστολέας συνδέεται με μια περιοχή διαφορετική από αυτή του υποστρώματος και οδηγεί στη δημιουργία ενός συμπλόκου αδιεξόδου, το οποίο δεν μπορεί να μετατρέψει υπόστρωμα σε προϊόν. Όλα τα είδη αντιστρεπτών αναστολέων χαρακτηρίζονται από την σταθερά διαστάσεως του αναστολέα Ki , η οποία αφορά τη διάσταση του συμπλόκου EI ή ESI και επηρεάζουν την KΜ ή την Vmax του ενζύμου με τον όρο 1+[I]/Ki.

Στη συναγωνιστική αναστολή, όπου και το υπόστρωμα και ο αναστολέας συνδέονται στην ίδια περιοχή, αυξάνεται η ΚM (φαινομενική Κ M = KM (1+[Ι] / Κi) αλλά δεν επηρεάζεται η Vmax του ενζύμου και η δράση του αναστολέα μπορεί να υπερνικηθεί με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος. Παρουσία συναγωνιστικού αναστολέα η εξίσωση Lineweaver – Burk γίνεται

(5) 1 / V0 = KM / Vmax * 1/ [S] (1+[I]/Ki) + 1/Vmaχ

Στη μή-συναγωνιστική αναστολή, δεδομένου ότι ο αναστολέας συνδέεται σε

διαφορετική περιοχή από αυτήν του υποστρώματος, η αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος δεν ωφελεί. Η KM δεν επηρεάζεται αλλά ελαττώνεται η Vmax.

34

Η κινητική Michaelis-Menten, όπως έχει τροποποιηθεί και επεκταθεί για να περιλαμβάνει και αντιστρεπτές αντιδράσεις και αντιδράσεις δύο ή περισσοτέρων υποστρωμάτων, ισχύει για πάρα πολλές ενζυμικές αντιδράσεις. Δεν ισχύει όμως για τα αλλοστερικά ένζυμα.

Πολλά αλλοστερικά ένζυμα είναι ολιγομερή, αποτελούνται δηλαδή από αρκετές ίδιες ή διαφορετικές πρωτεϊνικές υπομονάδες και, αντί για ορθογώνια υπερβολή, δίνουν μια σιγμοειδή σχέση ανάμεσα στην αρχική ταχύτητα και στη συγκέντρωση του υποστρώματος. Σε ένα αλλοστερικό ένζυμο η σύνδεση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο μιας υπομονάδας αλλάζει τη μοριακή του διαμόρφωση. Η αλλαγή αυτή μεταδίδεται στις άλλες υπομονάδες συνεργατικά και μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη ή μειωμένη δραστικότητα των άλλων υπομονάδων για τη σύνδεση άλλων μορίων υποστρώματος. Η σύνδεση μορίων, διαφορετικών από το υπόστρωμα (θετικοί ή αρνητικοί τροποποιητές), σε διαφορετικές από το ενεργό κέντρο αλλοστερικές περιοχές επίσης μπορεί να επηρεάσει την ενζυμική ενεργότητα. Συνήθως οι αλλοστερικοί τροποποιητές επηρεάζουν την τάση σύνδεσης της ενεργής περιοχής με το υπόστρωμα, υπάρχουν ωστόσο και αλλοστερικά συστήματα στα οποία αλλάζει η ταχύτητα μετατροπής του συμπλόκου ES σε προϊόντα. Η σταθερά Michaelis ΚΜ δεν χρησιμοποιείται με αλλοστερικά ένζυμα. Αντ’ αυτής χρησιμοποιείται ο όρος [S]0,5, δηλαδή η συγκέντρωση του υποστρώματος που απαιτείται για να παρατηρηθεί 50% ενζυμικός κορεσμός. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ύπαρξη σιγμοειδούς κινητικής δεν αποδεικνύει την ύπαρξη αλλοστερικών φαινομένων και ότι κάποια αλλοστερικά ένζυμα δεν έχουν σιγμοειδή κινητική. Γενικά, οι αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις είναι πολύπλοκες και διάφορα μοντέλα έχουν προταθεί για την εξήγησή τους.

35

Στόχος των Ασκήσεων 3-5: Να παρατηρήσετε γιατί χρειάζεται να προσδιορίζουμε την αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης και τι επίδραση έχει η συγκέντρωση του ενζύμου και του υποστρώματος σ' αυτή την αρχική ταχύτητα. Επίσης την επίδραση αναστολέα στις κινητικές σταθερές του ενζύμου.

Η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης (Vo) θα υπολογιστεί από την κλίση της καμπύλης της μεταβολής της απορροφητικότητας (Α) που εμφανίζει το προϊόν της αντίδρασης σε σχέση με τον χρόνο (όπου μετρήσεις απορροφητικότητας γίνονται συνεχώς σε μικρά χρονικά διαστήματα).

Αντιδραστήρια: Θα σας δοθούν τα κάτωθι διαλύματα: 1. Ρυθμιστικό διάλυμα, pH 9,5: 0,1Μ Τris - HCl Buffer, pH 9,5 / 10mM MgCl2 . 2. π-νιτροφαινόλη (pNP): 0,05mM και 0,5mM 3. π-νιτροφαινυλ-φωσφορικό (pNPP) (δινατρικό άλας διαλυμένο σε Buffer):

10mM, 2,0mM, 1,0mM, 0,5mM. 4. Αλκαλική φωσφατάση: 0,25mg/ml H2Ο (εμπορικό παρασκεύασμα ενζύμου από την

εντερική βλεννογόνο βοός). Το διάλυμα αυτό, καθώς και δύο αραιώσεις του (0,10mg/ml και 0,025mg/ml), διατηρούνται στους 4οC. Το τέταρτο δείγμα περιέχει το αρχικό διάλυμα ενζύμου (0,25mg/ml) το οποίο έχει θερμανθεί στους 90οC για 5 λεπτά.

Αντίδραση OP OH Αλκαλική φωσφατάση

+ H2O + Pi

(Mg2+) NO2 NO2

(pNPP) (pNP) άχρωμο κίτρινο

Σε αλκαλικό pH η αλκαλική φωσφατάση καταλύει την παραπάνω αντίδραση. Παρόλο που το pNPP δεν είναι το φυσικό υπόστρωμα γι' αυτό το ένζυμο, αυτή η αντίδραση είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό της ενζυμικής ενεργότητας διότι το προϊόν π-νιτροφαινόλη (pNP) είναι κίτρινο και απορροφά έντονα φως μήκους κύματος 400nm. Ετσι η ταχύτητα του σχηματισμού του προϊόντος (δηλαδή η ταχύτητα της αντίδρασης) μπορεί να υπολογιστεί φασματοφωτομετρικά με την μέτρηση της απορροφητικότητας του διαλύματος στα 400nm σαν συνάρτηση του χρόνου.

Για την καλύτερη διεξαγωγή του εργαστηριακού μέρους της Κινητικής Ενζυμικών Αντιδράσεων, στην Άσκηση 3 θα εκτελέσετε το Πείραμα Ι, στην Άσκηση 4 θα εκτελέσετε τα Πειράματα ΙΙ και ΙΙΙ και στην Άσκηση 5 θα εκτελέσετε το Πείραμα IV. Στο τέλος κάθε άσκησης θα επεξεργαστείτε τα αποτελέσματά σας και θα υπολογίσετε τις κινητικές σταθερές του ενζύμου, απουσία και παρουσία αναστολέα.

36

ΑΣΚΗΣΗ 3

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ A

ΠΕΙΡΑΜΑ I :

Κατασκευή πρότυπης καμπύλης απορροφητικότητας της π-νιτρο-φαινόλης στα 400nm

Για να υπολογίσετε την συγκέντρωση της π-νιτροφαινόλης που παράγεται στην

ενζυμική αντίδραση από τις τιμές απορροφητικότητας που θα λάβετε, είναι ανάγκη να κατασκευάσετε προηγουμένως μια πρότυπη καμπύλη από τις μετρήσεις της απορροφητικότητας στα 400nm (Α400) διαφόρων πρότυπων συγκεντρώσεων π-νιτροφαινόλης. Ετοιμάστε τα ακόλουθα διαλύματα σε 7 σωλήνες του φασματοφωτόμετρου:

Τ 1 2 3 4 5 6 Απιονισμένο νερό (ml) 0,5 0,0 0,2 0,4 0,0 0,2 0,4 Buffer pH 9,5 (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 π-νιτροφαινόλη 0,5mM (ml)

_ 0,5 0,3 0,1 _ _ _

π-νιτροφαινόλη 0,05mM (ml)

_ _ _ _ 0,5 0,3 0,1

Χρησιμοποιώντας τον σωλήνα Τ σαν τυφλό φωτομετρήστε τους σωλήνες 1-6 στα 400nm.

Στη αναφορά των αποτελεσμάτων: Υπολογίστε την τελική συγκέντρωση (μΜ) της π-νιτροφαινόλης σε κάθε διάλυμα και καταγράψτε τα αποτελέσματά σας (Α400) στον Πίνακα Ι. Κατασκευάστε την πρότυπη καμπύλη απορροφητικότητας της pNP (Διάγραμμα 1) τοποθετώντας τις τιμές απορροφητικότητας που βρήκατε (ψ άξονα) έναντι των γνωστών συγκεντρώσεων π-νιτροφαινόλης που υπολογίσατε (χ άξονα).

37

ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 3

ΠΕΙΡΑΜΑ Ι : ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΗΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ Π-ΝΙΤΡΟΦΑΙΝΟΛΗΣ. Πίνακας 1

Αριθμός σωλήνα

Απορροφητικότητα 400nm

π-Νιτροφαινόλη μΜ

1

2

3

4

5

6

Κατασκευάστε την πρότυπη καμπύλη απορροφητικότητας της pNP (Διάγραμμα 1) τοποθετώντας τις τιμές απορροφητικότητας που βρήκατε (ψ άξονα) έναντι των γνωστών συγκεντρώσεων π-νιτροφαινόλης που υπολογίσατε (χ άξονα). Διάγραμμα 1 Α(nm) π-νιτροφαινόλη(μΜ)

38

Διάγραμμα 1

39

ΑΣΚΗΣΗ 4

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ B

ΠΕΙΡΑΜΑ II:

Επίδραση της συγκέντρωσης του ενζύμου στην ταχύτητα της αντίδρασης

Σε 5 σωλήνες του φασματοφωτόμετρου προσθέστε τα ακόλουθα διαλύματα: - Buffer, pH 9,5: 2,4ml - 10mM π-νιτροφαινυλ-φωσφορικό (pNPP): 0,5ml Στον πρώτο σωλήνα προσθέστε 0,1ml απιονισμένο νερό και χρησιμοποιείστε τον σαν

τυφλό για να μηδενίσετε το φασματοφωτόμετρο σε Α400 . Στη συνέχεια, στο δεύτερο σωλήνα προσθέστε 0,1ml αλκαλικής φωσφατάσης

(0,25mg/ml), ανακινείστε και, αρχίζοντας συγχρόνως την μέτρηση του χρόνου (to) με λεπτοδείκτη, φωτομετρήστε αμέσως στα 400nm (Αo). Παρακολουθείστε και σημειώστε την μεταβολή της απορροφητικότητας κάθε 30''(Α1, Α2 κλπ) τουλάχιστον για 4-5 λεπτά.

Μηδενίστε ξανά το φασματοφωτόμετρο με το τυφλό και επαναλάβετε το παραπάνω πείραμα χρησιμοποιώντας 0,1ml αλκαλικής φωσφατάσης δυο διαφορετικών συγκεντρώσεων (0,10mg/ml, 0,025mg/ml) και στη συνέχεια το θερμανθέν δείγμα (0,25mg/ml). Κάθε φορά προσθέστε το ένζυμο στον σωλήνα που ήδη περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα και υπόστρωμα και μετρήστε την μεταβολή της Α400 για 5 λεπτά.

Στη αναφορά των αποτελεσμάτων του Πειράματος ΙΙ: Παρουσιάστε τα κινητικά δεδομένα της αντίδρασης (t σε sec έναντι Α400), που πήρατε με τους σωλήνες 2-5 που περιέχουν διαφορετικές συγκεντρώσεις ενζύμου, στον Πίνακα ΙΙΑ.

Κατασκευάστε τις καμπύλες προόδου της αντίδρασης (Διάγραμμα 2) τοποθετώντας τις τιμές απορροφητικότητας που πήρατε (Α400) στον ψ άξονα έναντι του χρόνου της αντίδρασης (min) στον χ άξονα. Υπολογίστε την αρχική ταχύτητα της αντίδρασης (Vo) από την κλίση της εφαπτομένης της καμπύλης που σχεδιάσατε στο to και εκφράστε την σαν μεταβολή Α400/min και μΜ/min. (Χρησιμοποιήστε την πρότυπη καμπύλη απορροφητικότητας της π-νιτροφαινόλης που κατασκευάσατε στο πείραμα 1 για να μετατρέψετε την ταχύτητα από Α400/min σε μΜ pNP/min).

Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας στον Πίνακα ΙΙΒ, δείχνοντας την τελική συγκέντρωση του ενζύμου (mg/ml) σε κάθε αντίδραση για την οποία υπολογίσατε την αρχική ταχύτητα Vo (A400/min και μΜ/min). Τι παρατηρείτε;

40

ΠΕΙΡΑΜΑ ΙΙΙ: Επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος στην ταχύτητα της αντίδρασης

Το υπόστρωμα (pNPP) σας έχει δοθεί σε 4 συγκεντρώσεις. Για κάθε αντίδραση θα χρησιμοποιήσετε σαν τυφλό ένα διάλυμα που περιέχει την ίδια συγκέντρωση υποστρώματος. Σε 8 σωλήνες του φασματοφωτόμετρου προσθέστε τα κάτωθι αντιδραστήρια:

1 2 3 4 5 6 7 8 (Τ) (Δ) (Τ) (Δ) (Τ) (Δ) (Τ) (Δ) Buffer pH 9,5 (ml) 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 pNPP 10mM (ml) 0,5 0,5 -- -- -- -- -- -- pNPP 2mM (ml) -- -- 0,5 0,5 -- -- -- -- pNPP 1mM (ml) -- -- -- -- 0,5 0,5 -- -- pNPP 0,5mM (ml) -- -- -- -- -- -- 0,5 0,5 Απιονισμένο νερό (ml) 0,1 -- 0,1 -- 0,1 -- 0,1 --

Μηδενίστε το φασματοφωτόμετρο με το διάλυμα του σωλήνα 1 (τυφλό). Προσθέστε

0,1ml ενζύμου (0,25mg/ml) στο διάλυμα του σωλήνα 2 (δείγμα) και προσδιορίστε την πρόοδο της αντίδρασης, όπως κάνατε προηγουμένως, για 5 λεπτά. Επαναλάβετε το πείραμα, προσθέτοντας κάθε φορά 0,1ml ενζύμου στους σωλήνες δειγμάτων 4, 6 και 8, χρησιμοποιώντας σαν τυφλό τους σωλήνες 3, 5 και 7 αντιστοίχως.

Στην αναφορά των αποτελεσμάτων του Πειράματος ΙΙΙ: Παρουσιάστε τα κινητικά

δεδομένα της αντίδρασης (t σε sec έναντι Α400) που πήρατε για τους σωλήνες 2, 4, 6 και 8, που περιέχουν διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος, στον Πίνακα IΙΙΑ.

Σχεδιάστε την πρόοδο της αντίδρασης (Διάγραμμα 3Α) για κάθε συγκέντρωση υποστρώματος και μετρήστε την εκάστοτε αρχική ταχύτητα, όπως στο πείραμα 2. Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας στον Πίνακα ΙΙΙΒ, δείχνοντας την τελική συγκέντρωση του υποστρώματος (μM) σε κάθε αντίδραση για την οποία υπολογίσατε την αρχική ταχύτητα Vo (σε A400/min και μΜ/min).

Κατασκευάστε ένα διάγραμμα (Διάγραμμα 3Β) που να δείχνει την μεταβολή της ταχύτητας Vo σε μΜ/min (ψ άξονας) σε σχέση με την μεταβολή της συγκέντρωσης του υποστρώματος S (χ άξονας). Σχεδιάστε ένα άλλο διάγραμμα (Διάγραμμα 3Γ) χρησιμοποιώντας τις τιμές 1/Vo και 1/(S) (Διάγραμμα LINEWEAVER-BURK ή του διπλού αντιστρόφου) και από αυτό υπολογίστε την Vmax και ΚΜ της αλκαλικής φωσφατάσης. (Εάν ο χρόνος δεν επαρκεί, μπορείτε να ολοκληρώσετε την κατασκευή των διαγραμμάτων κατά την επεξεργασία των αποτελεσμάτων του Πειράματος IV, στην 6η Άσκηση)

41

ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 4

ΠΕΙΡΑΜΑ ΙΙ. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ

Πίνακας ΙΙΑ

Χρόνος t (sec)

Απορροφητικότητα στα 400nm σωλήνας 2 σωλήνας 3 σωλήνας 4 σωλήνας 5

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

Κατασκευάστε τις καμπύλες προόδου της αντίδρασης τοποθετώντας τις τιμές απορροφητικότητας που πήρατε (Α400) στον ψ άξονα έναντι του χρόνου της αντίδρασης (min) στον χ άξονα. Διάγραμμα 2 A400

42

t (sec)

Διάγραμμα 2

43

Υπολογίστε την αρχική ταχύτητα Vo σαν μεταβολή Α400/min και μΜ/min (χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμοπύλη – Διάγραμμα 1) για κάθε συγκέντρωση ενζύμου που χρησιμοποιήσατε και καταγράψτε τα αποτελέσματά σας στον Πίνακα ΙΙΒ Πίνακας ΙΙΒ

Αρχική ταχύτητα Vo Α400/min μΜ/min

Τελική συγκέντρωση ενζύμου (mg / ml)

Τι παρατηρείτε;

44

ΠΕΙΡΑΜΑ ΙΙΙ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ

Πίνακας ΙΙΙΑ (χωρίς αναστολέα)

Χρόνος t (sec)

Απορροφητικότητα στα 400nm σωλήνας 2 σωλήνας 4 σωλήνας 6 σωλήνας 8

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

Σχεδιάστε την πρόοδο της αντίδρασης για κάθε συγκέντρωση υποστρώματος (διάγραμμα Α) και μετρήστε την αρχική ταχύτητα Vo ως Α400/min και μΜ/min. Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας στον Πίνακα ΙΙΙΒ. Διάγραμμα 3Α A400

45

t (sec)

Διάγραμμα 3Α

46

Πίνακας ΙΙΙΒ Αριθμός σωλήνα

Τελική συγκέντ. υποστρώμ.

(mM)

Αρχική ταχύτητα Vo

Α400/min μΜ/min

1

Vo

1

[S]

2

4

6

8

Σε ένα διάγραμμα (3Β) βάλτε στον ψ άξονα την αρχική ταχύτητα Vo και στον χ άξονα τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις του υποστρώματος.

Διάγραμμα 3Β

47

Σε άλλο διάγραμμα (3Γ) βάλτε στην τεταγμένη τις τιμές του αντιστρόφου κάθε ταχύτητας (1/V) και στην τετμημένη τις τιμές του αντιστρόφου της κάθε συγκέντρωσης (1/[S]) που υπολογίσατε στον Πίνακα ΙΙΙΒ. Διάγραμμα 3Γ

48

ΑΣΚΗΣΗ 5

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Γ ΠΕΙΡΑΜΑ ΙV: Επίδραση συναγωνιστικού αναστολέα στην ταχύτητα της αντίδρασης

Στο πείραμα αυτό θα μελετήσετε την επίδραση των φωσφορικών ιόντων (προϊόντων της αντίδρασης που δρουν σαν συναγωνιστικός αναστολέας του ενζύμου). Η συγκέντρωση του Pi θα διατηρηθεί σταθερά (0,001Μ), ενώ θα μεταβάλλεται η συγκέντρωση του υποστρώματος.

Αριθμείστε 8 δοκιμαστικούς σωλήνες όπως στο πείραμα ΙΙΙ στην 4η Άσκηση και προσθέσετε τις ίδιες ποσότητες αντιδραστηρίων, με τη διαφορά ότι αντί για το ρυθμιστικό διάλυμα pH 9,5 θα χρησιμοποιήσετε Buffer που περιέχει 1,3 mM KH2PO4. Εκτελείτε το πείραμα όπως προηγουμένως. Τα κινητικά δεδομένα της αντίδρασης παρουσία αναστολέα τα παρουσιάζετε στον πίνακα IV (αντίστοιχο του πίνακα IΙΙ απουσία αναστολέα).

Στη αναφορά των αποτελεσμάτων: Σχεδιάστε την πρόοδο της αντίδρασης

παρουσία αναστολέα (Διάγραμμα 4) και υπολογίστε την Vο (σε μΜ/min) που αντιστοιχεί σε κάθε συγκέντρωση υποστρώματος (μΜ).

Τις τιμές Vo που βρήκατε παρουσία του αναστολέα τις βάζετε σαν μια δεύτερη καμπύλη στα Διαγράμματα 3Β (Vο έναντι [S]) και 3Γ (1/ Vο έναντι 1/ [S ]) που ετοιμάσατε στο πείραμα ΙΙΙ (θα έχετε δηλαδή δύο καμπύλες μία χωρίς και μία με αναστολέα). Υπολογίστε την Vmax και ΚΜ του ενζύμου παρουσία των φωσφορικών ιόντων. Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας.

49

ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 5

ΠΕΙΡΑΜΑ IV: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ

ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ Παρουσιάστε τα κινητικά αποτελέσματα της αντίδρασης που πήρατε παρουσία αναστολέα στον Πίνακα ΙVΑ. Πίνακας ΙVΑ (παρουσία αναστολέα)

Χρόνος t (sec)

Απορροφητικότητα στα 400nm σωλήνας 2 σωλήνας 4 σωλήνας 6 σωλήνας 8

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

Σχεδιάστε την πρόοδο της αντίδρασης παρουσία αναστολέα (διάγραμμα 4Α) και

δείξτε τη Vo που βρήκατε παρουσία αναστολέα σε συνάρτηση του υποστρώματος στον Πίνακα ΙVΒ.

A

Διάγραμμα 4Α 400

50

t (sec)

Διάγραμμα 4Α

51

Πίνακας IVΒ (παρουσία αναστολέα)

Αριθμός σωλήνα

Τελική συκέντ.

Υποστρώμ. (mM)

Αρχική ταχύτητα Vo

Α400/min μΜ/min

1

Vo

1

[S]

2

4

6

8

Στο διάγραμμα 3Β που φτιάξατε χωρίς αναστολέα στην 4η Άσκηση προσθέστε τα αποτελέσματά σας με αναστολέα (βάλτε στον ψ άξονα την αρχική ταχύτητα Vo που βρήκατε από το πείραμα IV και στον χ άξονα τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις του υποστρώματος).

Στο άλλο διάγραμμα (3Γ) βάλτε στην τεταγμένη τις τιμές του αντιστρόφου κάθε ταχύτητας (1/V) και στην τετμημένη τις τιμές του αντιστρόφου της κάθε συγκέντρωσης (1/[S]) που υπολογίσατε παρουσία αναστολέα στον Πίνακα IVΒ. Υπολογίστε και για τις δύο περιπτώσεις: Αλκαλική Φωσφατάση Χωρίς αναστολέα Με αναστολέα

Vmax: Vmax:

Km: Km:

52

Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας.

53

ΑΣΚΗΣΗ 6

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΡΑΝΣΑΜΙΝΑΣΩΝ - ΟΥΡΙΑΣ

ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΙΜΑΤΟΣ Θεωρητικό μέρος Τρανσαμινάσες

Οι τρανσαμινάσες (ή αμινοτρανσφεράσες ή αμινομεταφοράσες) είναι μία κατηγορία ενζύμων που καταλύουν την μεταφορά μιας αμινομάδας από ένα α-αμινοξύ σε ένα α-κετoξύ, παράγοντας το αντίστοιχο α-κετοξύ και α-αμινοξύ κατά την αντίδραση:

R1 R2 R1 R2

| | | | H - C - NH2 + C = O C = O + H - C - NH2

| | | | COOH COOH COOH COOH

Είναι γνωστός ένας μεγάλος αριθμός τρανσαμινασών. Όλες χρησιμοποιούν σαν συνένζυμο την φωσφορική πυριδοξάλη (βιταμίνη Β6) και οι περισσότερες χρησιμοποιούν το α-κετογλουταρικό ως δέκτη των αμινομάδων. Δύο ένζυμα παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον από την σκοπιά της κλινικής χημείας: Η ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (αμινομεταφοράση) ή γλουταμινική-οξαλοξική τρανσαμινάση (GOT ή AST) και η αμινοτρανσφεράση (αμινομεταφοράση) της αλανίνης ή γλουταμινική-πυροσταφυλική τρανσαμινάση (GPT ή ALT). Τα ένζυμα αυτά βρίσκονται σε όλους τους ιστούς αλλά σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στο ήπαρ, καρδιακούς και σκελετικούς μύς και νεφρούς. Όταν ένας ιστός υποστεί βλάβη η νέκρωση των κυττάρων επιτρέπει την είσοδο των τρανσαμινασών αυτών στο αίμα κι έτσι η συγκέντρωσή τους στον ορό αυξάνεται πάνω από τα φυσιολογικά επίπεδα (3-20 IU/l). Σύγκριση της αύξησης SGOT/SGPT (S: Serum) είναι ενδεικτική του οργάνου που υπέστη βλάβη.

Η GOT καταλύει την αντίδραση: COOH COOH COOH | | | COOH CH2 CH2 CH2

| | GOT | | CH2 + CH2 C=O + CH2 | | | | CHNH2 C=O COOH CHNH2

| | | COOH COOH COOH L-ασπαρτικό α-κετογλουταρικό οξαλοξικό L-γλουταμινικό

Η ενεργότητα του ενζύμου αυτού στον ορό αυξάνεται σε ηπατικές παθήσεις (οξεία

ηπατίτιδα, κίρρωση, καρκίνωμα, αποφρακτικός ίκτερος), καρδιακές παθήσεις (έμφραγμα του μυοκαρδίου, αρρυθμία, περικαρδίτιδα) και σε άλλες περιπτώσεις (νεφρική ή πνευμονική

54

εμβολή, μυϊκή δυστροφία κλπ). Χαρακτηριστική είναι η αύξηση της συγκέντρωσης της GOT στον ορό 24-48 ώρες μετά από έμφραγμα, καθώς και η αύξηση της GOT και της GPT στην οξεία ηπατίτιδα.

Η GPT καταλύει την αντίδραση:

CH3 COOH CH3 COOH | | GPT | | CHNH2 + C=O C=O + CHNH2 | | | | COOH CH2 COOH CH2 | | CH2 CH2

| | COOH COOH L-αλανίνη α-κετογλουταρικό πυροσταφυλικό L-γλουταμινικό

Η ενεργότητα του ενζύμου αυτού στο ορό αυξάνει κυρίως σε ηπατοχολικές παθήσεις. Ουρία

Η ουρία είναι το τελικό προϊόν του μεταβολισμού του αζώτου στον άνθρωπο και στους άλλους ουριοτελικούς οργανισμούς. Η ουρία συντίθεται στο ήπαρ σε ένα κυκλικό δρόμο (κύκλος ουρίας) όπου δύο αμινομάδες, που προέρχονται από αμινοξέα (με την μορφή αμμωνίας και ασπαρτικού), ενώνονται με ένα μόριο CO2 και εξέρχεται ένα μόριο ουρίας. Έτσι η αμμωνία, μια τοξική ένωση που παράγεται κατά τον καταβολισμό αζωτούχων ενώσεων, μετατρέπεται σε μία μη τοξική, υδατοδιαλυτή ένωση που μεταφέρεται με την κυκλοφορία από το ήπαρ στους νεφρούς και αποβάλλεται με τα ούρα.

Η συγκέντρωση της ουρίας στον ορό του αίματος είναι φυσιολογικά 15-40mg/dl, αλλά αυξάνεται σε διάφορες προνεφρικές (καρδιακή ανεπάρκεια, shock), νεφρικές, ή μετανεφρικές παθήσεις (απόφραξη ουρητήρων). Όταν υπάρχει βαριά βλάβη των ηπατοκυττάρων τότε παρατηρείται ελάττωση της ουρίας στον ορό του αίματος. Επομένως τα επίπεδα της ουρίας στο αίμα αντικατοπτρίζουν την λειτουργικότητα διαφόρων οργάνων (ήπατος, νεφρών κτλ). Εργαστηριακό μέρος

Θα προσδιορίσετε την ενεργότητα των δύο τρανσαμινασών (GOT και GPT) και την συγκέντρωση ουρίας σε δείγμα ορού που σας δίνεται.

1) Χρωματομετρικός προσδιορισμός της GOT

Αρχή: Η δραστικότητα του ενζύμου θα προσδιοριστεί με τη χρήση δύο συζευγμένων αντιδράσεων και την μέτρηση της ελάττωσης της ανηγμένης μορφής του συνενζύμου ΝΑD+. Στις συζευγμένες αντιδράσεις το προϊόν του πρώτου ενζύμου αποτελεί το υπόστρωμα του δεύτερου. Το οξαλοξικό, που παράγεται από το ασπαρτικό με την δράση της GOT, μετατρέπεται σε μηλικό με την δράση της μηλικής δεϋδρογονάσης, παρουσία NADH. Στις

55

συζευγμένες αυτές αντιδράσεις η ταχύτητα μετατροπής του NADH σε NAD+ είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της GOT στο δείγμα. GOT ασπαρτικό + α-κετογλουταρικό οξαλοξικό + γλουταμινικό ΜΔΥ οξαλοξικό + NADH + H+ μαλικό + NAD+

Η ποσότητα του NAD+ μπορεί να υπολογιστεί από την μείωση της απορρόφησης του NADH στα 340nm.

Τεχνική:

Σε ένα φωτομετρικό σωλήνα τοποθετήστε 0,3 ml ορού και 3,0 ml αντιδραστηρίου. Ως τυφλό χρησιμοποιήστε απεσταγμένο νερό. (Το αντιδραστήριο, που έρχεται έτοιμο σε kit, περιέχει σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα τα υποστρώματα ασπαρτικό και α-κετογλουταρικό, το ένζυμο μηλική δεϋδρογονάση και το NADH). Αναδεύστε το περιεχόμενο του σωλήνα και μετρήστε την απορροφητικότητα του δείγματος στα 340 nm ακριβώς μετά από 1, 2, 3 και 4 λεπτά. Υπολογίστε την ΔΑ 340nm/min. (Αν είναι μεγαλύτερη από 0,16 αραιώστε τον ορό 1:5 με 0,9% NaCl και επαναλάβετε την μέτρηση).

Υπολογισμός ενεργότητας GOT U/l= 1746 x ΔΑ 340 nm/min μKat/l = 29,11 x ΔΑ 340 nm/min Φυσιολογικές τιμές (στους 25oC) Ανδρες: έως 18 U/l ή έως 0,3 μKat/l Γυναίκες: έως 15 U/l ή έως 0,25 μKat/l Σημείωση: U(IU) = Διεθνής μονάδα = ποσό ενζύμου που προκαλεί την μετατροπή 1,0 μmole υποστρώματος ανά λεπτό στους 25oC. 1 μικρό – katal (μk) = ποσό ενζυμικής ενεργότητας που μετατρέπει ένα μmole υποστρώματος σε ένα δευτερόλεπτο, κάτω από συνθήκες ενζυμικού κορεσμού. Εκφράζεται σε μmole*sec-1

2) Χρωματομετρικός προσδιορισμός της GPT

Είναι παρόμοιος της GOT με την διαφορά ότι το πυροσταφυλικό, που παράγεται από την αλανίνη με την δράση της GPT, μετατρέπεται σε γαλακτικό με την δράση της γαλακτικής δεϋδρογονάσης παρουσία NADH. Ακολουθήστε την ίδια τεχνική (προσθήκη 3,0 ml αντιδραστηρίου σε 0,3 ml ορού και μέτρηση της Α στα 340 nm μετά από 1, 2, 3 και 4 λεπτά) και υπολογίστε την ενεργότητα της GPT όπως πριν.

Φυσιολογικές τιμές (στους 25oC) Ανδρες: έως 22 U/l ή έως 0,36 μKat/l Γυναίκες: έως 17 U/l ή έως 0,28 μ Kat/l

56

3) Ποσοτικός προσδιορισμός της ουρίας στον ορό (Μέθοδος Berthelot)

Για τον προσδιορισμό της ουρίας χρησιμοποιούνται δύο είδη μεθόδων, χημικές ή ενζυμικές. Η χημική μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση των αμινομάδων της ουρίας με τις κετομάδες της διακετυλομονοξίμης και τη δημιουργία ενός έγχρωμου προϊόντος. Επειδή η αντίδραση αυτή δεν είναι ειδική για την ουρία προτιμάται η μέθοδος κατά την οποία το ένζυμο ουρεάση υδρολύει την ουρία προς ανθρακικό αμμώνιο: ουρεάση NH2CONH2 + 2H2O (NH4)2CO3

Τα ιόντα αμμωνίου αντιδρούν με υποχλωριώδες νάτριο και φαινόλη, παρουσία νιτροπρωσσικού νατρίου, παράγοντας ινδοφαινόλη. Η ένωση αυτή σε αλκαλικό περιβάλλον έχει μπλέ χρώμα, η ένταση του οποίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουρίας στον ορό. Οι αντιδράσεις είναι οι ακόλουθες: NH3 + HOCl NH2Cl NH2Cl + HO O= =N Cl O= =N Cl + OH Ο= =Ν Μέθοδος: Σε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες φωτομέτρου τοποθετήστε τα κάτωθι:

Αντιδραστήρια σωλήνας σωλήνας σωλήνας 1 2 3

(ml) (T) (Π) (Δ) Η2Ο 0,1 ml -- 0,1 ml

Πρότυπο ουρίας 4 mg % -- 0,1 ml -- Ορός -- -- 0,01 ml

Ουρεάση 50 μl 50 μl 50 μl

Ανακινήστε τα σωληνάρια και επωάστε για 10΄ σε θερμοκρασία δωματίου.

Στη συνέχεια τοποθετήστε τα εξής αντιδραστήρια:

(ml) 1 2 3 Φαινόλη - NaOH 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

NaOCl 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

ΟΗ

57

Ανακινήστε μετά την προσθήκη του τελευταίου διαλύματος και επωάστε τα σωληνάρια άλλα 15΄(λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου. Μετρήστε την Α του δείγματος και του προτύπου έναντι του τυφλού σε μήκος κύματος 550nm. Υπολογισμός: Οι τιμές της ουρίας στον ορό υπολογίζονται ως εξής Α550 δείγμα x 40 = mg ουρίας/100ml (mg %) Α550 πρότυπο Φυσιολογικές τιμές: 15-40 mg/dL (2,5-6,6 mmol/L)

58

ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 6

1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ GOT

min Α340 ορού

1

2

3

4

ΔΑ340 / min = Ενεργότητα GOT: U / ml = μKat / l = Ερώτηση: Ποιος είναι ο ρόλος της μηλικής δεϋδρογονάσης σ’ αυτή την αντίδραση;

59

2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ GPT

min Α340 ορού

1

2

3

4

ΔΑ340 / min = Ενεργότητα GPT: U / ml = μKat / l = Ερώτηση: Ποιος είναι ο ρόλος της γαλακτικής δεϋδρογονάσης σ’ αυτή την αντίδραση; 3. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΥΡΙΑΣ (Μέθοδος Berthelot)

Α550

Ορός

Υπολογισμός: mg % = mmol / L =

60

ΠΙΝΑΚΑΣ:

GOT GPT Ουρία

U/l μKat/l U/l μKat/l mg % mmol/L

ορός

Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας:

61

62

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Στην συγγραφή των εργαστηριακών ασκήσεων μας βοήθησε η πρόσβαση σε παρόμοιες ασκήσεις των κάτωθι εργαστηρίων, τους διευθυντές των οποίων και ευχαριστούμε.

Εργ. Βιολογικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικής, Αριστ. Παν. Θεσσαλονίκης (Καθ. Α. Τρακατέλλης)

Εργ. Βιολογικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικής, Παν. Ιωαννίνων (Καθ. Ο. Τσόλας)

Εργ. Βιολογικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικής, Κ. Παν. Αθηνών (Δρ Θ. Κεφαλάς και Δρ Γ. Παλαιολόγος)

Εργ. Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, Παν. Πατρών (Καθ. Κ. Τσίγγανος)

Dept. of Biochemistry, King's College, University of London (Profs. H. Arnstein M. Scrutton & B. Halliwell)