1

MYCOTOXINES en DIERGEZONDHEID

Siska Croubels

Laboratorium voor Farmacologie en Toxicologie

Salisburylaan 133 – 9820 Merelbeke

WVPA België - Agriflanders - 10.01.2013

Vakgroep Pathologie,

Bacteriologie en Pluimveeziekten

Labo voor Farmacologie &

Toxicologie

“μυκης + τοξικόν” (schimmel – toxine)

toxinen gevormd door schimmels behorend tot de genera

Aspergillus, Penicillium en Fusarium

toxinevorming afhankelijk van factoren zoals subspecies van de plant,

heersend klimaat en landbouwpraktijk

historisch probleem

(Pieter Bruegel, 1568) (H. Bosch, 1495-1515)

MYCOTOXINES

Claviceps purpurea: ergotisme

2

OVERZICHT

Deel I: Meest voorkomende mycotoxines

bron

preventie

toxiciteit

toxicokinetiek

pathogenese

symptomen en letsels

- Aflatoxines

- Trichothecenen: DON en T2-toxine

- Zearalenone

- Fumonisines

- Ochratoxines

OVERZICHT

Deel II: Onderzoeksresultaten

Invloed van Fusarium mycotoxines op de darmgezondheid bij vleeskippen

(Ann Osselaere)

Invoed van Fusarium mycotoxines op aviaire macrofagen en hun interactie

met Aspergillus fumigatus

(Shaoji Li)

Het mycotoxine deoxynivalenol (DON) als predisponerende factor voor

necrotische enteritis bij vleeskuikens

(Gunther Antonissen)

ONDERZOEKSPROJECTEN

• Assistentenmandaat Virginie Vandenbroucke, 2006-2012

Invloed van deoxynivalenol op de darmgezondheid en het verloop van een

Salmonella Typhimurium infectie bij het varken

• IWT project, 2008-2012

Invloed van Fusarium toxines op de darmgezondheid bij het varken in het

kader van de ontwikkeling van bestrijdingsmaatregelen

Doctoraatsbursalen Joline Goossens en Elin Verbrugghe

• UGent project, 2009-2013

Invloed van Fusarium toxines op de orale resorptie en biotransformatie

mechanismen bij de kip

Doctoraatsbursaal Ann Osselaere

• IWT specialisatiebeurs Mathias Devreese, 2010-2014

Ontwikkeling van in vitro en in vivo modellen voor veiligheid- en

efficaciteitsstudies van mycotoxine binders en modifiers

3

ONDERZOEKSPROJECTEN

• Sector gesponsord project, 2011-2015

Interacties tussen deoxynivalenol, Clostridium perfringens en Salmonella

Enteritidis in vleeskippen

Doctoraatsbursaal Gunther Antonissen

• FOD Volksgezondheid, 2012-2015

Onderzoek naar de invloed van mycotoxine binders op de orale

biologische beschikbaarheid, farmacokinetiek en weefselresiduen van

geneesmiddelen aangewend bij pluimvee en varkens

Doctoraatsbursaal Thomas De Mil

• UGent project, 2012-2016

Intestinale toxiciteit en orale resorptie van geconjugeerde Fusarium

mycotoxines, frequent voorkomend in de (dier)voeding

Doctoraatsbursaal Nathan Broekaert

• Assistentenmandaat Sophie Fraeyman, 2013-2019

Toxiciteit en toxicokinetiek van Alternaria mycotoxines bij varkens en

pluimvee

acute intoxicaties

1. effect van lage concentraties

2. effect van co-contaminanten

3. nieuwe mycotoxines

4. merkers voor toxiciteit

5. gemaskeerde mycotoxines

3- en 15a-DON, DON-3-glucoside

6. mycotoxine binders

www.mytox.be

?

Multidisciplinair kenniscentrum: www.mytox.be

4

MYcotoxines enTOXigene schimmels

associatie onderzoeksgroep

• Preventie en controle van schimmels in voedsel en voeder

• Mycotoxine analyse en methode ontwikkeling

• Classificatie en identificatie van schimmels

• Effect van mycotoxines op dier- en humane gezondheid

www.mytox.be

10

2009-2010 LEVER - LEVERFUNCTIE 12

Mycotoxine Fungus Contaminant

Fumonisines F. moniliforme maïs

Trichothecenen:

Deoxynivalenol (DON),

T2-toxine

F. graminearum

F. sporotrichioides

maïs, tarwe, gerst

Aflatoxines B1, B2, G1,G2 A. parasiticus

A. flavus

maïs, droge vruchten en noten,

oliehoudende granen en zaden

Ochratoxine A A. ochraceus

P. verrucosum

granen, wijn, bier,

koffiebonen

Zearalenone F. graminearum maïs, tarwe, gerst

5

1. Varken verminderde gewichtsaanzet

verhoogde voederconversie

fertiliteitsstoornissen

huidaandoeningen

2. Pluimvee groeivertraging

“vette lever” syndroom

verminderde eischaalkwaliteit

slechte karkaskwaliteit

3. Rundvee verminderde melkgifte

fertiliteitsstoornissen

mastitis

ketonurie

4. Paard neurotoxisch syndroom

OPNAME VAN LAGE GEHALTES GEEFT IMMUNOSUPPRESSIE

Voornaamste klinische verschijnselen t.g.v. mycotoxicosis

Voornaamste klinische verschijnselen t.g.v. mycotoxicosis TOXISCHE EFFECTEN BIJ PLUIMVEE

Animal feed contamination, effects on livestock and food safety, 2012

DS nov. 2010

6

afhankelijk van

- type en concentratie mycotoxine

- duur van blootstelling

- diersoort, geslacht, leeftijd, gezondheidsstatus

- bedrijfsmanagement

- synergistisch effect tussen diverse mycotoxinen

± 25% van alle grondstoffen besmet

75% met meer dan één toxine (Monbaliu et al., 2010)

http://www.efsa.eu.int

Voornaamste klinische verschijnselen t.g.v. mycotoxicosis

Kwaliteitsbeoordeling van voeder (cfu/g)

Kwaliteit bacteriën fungi

goed < 2.106 3.104

aanvaardbaar 2-4.106 3-10.104

zwak 4-10.106 1-2.105

bedorven >107 >2.105

Staalname en analyse

-best bij laden of lossen in graanstroom: sub-samples

-of op elke 2 m hoogte, nooit homogeen verdeeld !

-totaal 10-20 kg voor grote granen, 3-5 kg kleine granen

-eventueel drogen voor transport

-in papieren of katoenen zakken, invriezen stopt schimmelgroei

-drietal subsamples voor analyse

-ELISA (screening) of LC-MS/MS (bevestiging)

VOEDER

STAALNAME VOEDER

7

Multi-mycotoxine methode UGent (LC-MS/MS)

Varieteit Bemesting

Rotatie Irrigatie

Zaaitijdstip Insectenbestrijding

Gewas densiteit Oogsttijdstip

Onkruidbestrijding Apparatuur oogsten ECB

PREVENTIE voor de oogst

8

Bewaaromstandigheden

-vochtgehalte < 14%

-minimale graanbeschadiging, gebroken of afwijkende korrels

-risico’s eigen producten (eigen kuil)

Mycotoxine binders

- diatomeeën aarde

- aluminiumsilicaat klei

- bentoniet, zeoliet, sepioliet

- geactiveerde kool

- gistcelwand gluco-mannanen

PREVENTIE na de oogst

Toxine % binding

Aflatoxine B1 95

DON 10

ZEA 52

FB1 45

Mycotoxine modifiers

- enzymen: epoxidase, lactonase, etc

9

Percentage positieve stalen, BEMEFA monitoring: www.bemefa.be

2012

2011

EU Commissie 2006/576

deoxynivalenol

Deoxynivalenol

ppm (mg/kg)

10

EU Commissie 2006/576

zearalenone

ppm (mg/kg)

EU Commissie 2006/576

fumonisine B1+B2

ppm (mg/kg)

EU Commissie 2006/576

ochratoxine A

ppm (mg/kg)

11

FAVV

T2 en HT2-toxine

“Inventaris acties en actiegrenzen en voorstellen voor harmonisering in het kader van de officiële

controles - Chemische contaminanten, residuen en additieven”: 200 ppb in mengvoeders voor biggen / kalveren

400 ppb in mengvoeders voor pluimvee

500 ppb in mengvoeders voor mestvarkens

Acute toxiciteit van mycotoxines

Penicillium, Aspergillus en Fusarium spp

Orale LD50 in muizen (mg/kg)

? fumonisines, zearalenone

500 penicilliumzuur, mycophenolzuur

200 sterigmatocystine, luteoskyrine, sporidesmine, tenuazonzuur

100 rubratoxine B, citrinine

60 PR toxine

50 deoxynivalenol, ochratoxine A, gliotoxine

25 patuline, verruculogen, cyclopiazonzuur, citreoviridine

10 penitrem, aflatoxine B 1 muis, hamster

7 diacetoxyscirpenol, T - 2 toxine rat

5 fusarenon X aap

2 cavia

1 schaap, hond, kat

0.5 varken, konijn, eendekuiken

Etiologie Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus

Aspergillus niger

Toxine productie vnl. bij 30-37 °C, o.a. schade ECB

voornaamste bronnen:

aardnoten, maïs, oliehoudende zaden en veevoedergrond-

stoffen afkomstig uit tropische en subtropische gebieden

AFLATOXINES

12

B1: meest toxische

en carcinogeen (o.a. ratten, eenden, forellen)

IARC klasse 1A - Ames test en mutatie p53 gen

B2: dihydroderivaat (minder toxisch, 20%), potentialiseert B1

G1 en G2: groen fluorescerend, minder toxisch (resp. 50% en 10%)

Toxicokinetiek

Orale resorptie: 100%

Biotransformatie: 8,9 epoxidatie LEVER

Eliminatie: urinair, biliair en melk (1-6%)

Typische letsels

MEGALOCYTOSE HEPATOCYTEN

CENTROLOBULAIRE NECROSE

GALGANGENPROLIFERATIE

BLOEDSTOLLINGSSTOORNISSEN

‘Pale bird’ syndroom

Prof. J. Fink

Diagnose

Mycologisch onderzoek op voeder

Scheikundig onderzoek op aflatoxines

Probleem van correcte staalname!

max. 20 µg/kg AFLB1

Melk geeft gevaren voor de gezondheid: max. 0,05 µg/kg AFLM1

Behandeling

Vit K1 en eiwitrijke voeding, cysteine

13

COMMISSIE DIRECTIEVE 2003/100/EC

bijkomende factor

cyclopiazonzuur: sterke inhibitor van CYP450

verantwoordelijk voor neurotoxische symptomen en chondro-

toxiciteit

Deze worden bijna uitsluitend waargenomen bij acute aflatoxicosis

www.thepoultrysite.com

Fusarium graminearum, F. sporotrichioides, F. poae, F. equiseti

Type B trichothecenen:

deoxynivalenol (DON)

(=vomitoxine)

nivalenol (NIV)

Type A trichothecenen:

T2-toxine, HT2-toxine

diacetoxyscirpenol (DAS)

Bron: tarwe, maïs (wereldwijd vooral in gematigde streken 5 – 15 – 25 °C),

mout, T2-toxine in stro/stof

DEOXYNIVALENOL en TRICHOTHECEEN TOXICOSE

14

Fusarium “head blight”

Toxicokinetiek

Orale resorptie: 55-80% (bij het varken)

Biotransformatie: de-epoxidatie, glucuronidatie

Excretie: urinair en biliair

Toxiciteit

Inhibitie proteïnesynthese

Vrijstelling IL-6, toename IgA

Afname IgG, IgM

IARC klasse 3

DON

T2-toxine

Symptomen

varkens “Abdominal distress syndrome”

DON of vomitoxine

braken en/of gebrek aan eetlust (vanaf 2000 µg/kg)

weigeren van voeder (vanaf 1200 µg/kg)

verminderde voederopname (vanaf 1000 µg/kg)

immunosuppressie (vanaf 100 µg/kg?)

Scheikundige analyse: voeder, gal

15

Kip: minder gevoelig aan DON

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

we

igh

t (g

ram

)

days

Gewichtstoename

blank

adsorb.

low

low + detox. 1

low + detox. 2

high

high + detox. 1

high + detox. 2

< 5 ppm

> 5 ppm

Osselaere et al., 2012

Toxicokinetiek studie DON

• 8 vleeskippen

orale bolus van 5 ppm DON

n=4

intraveneuze bolus van 5 ppm DON

n=4

Bloedstaalname tot 8 u erna

Plasma DON

0

50

100

150

200

250

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

DO

N c

on

c (n

g/m

l)

Tijd (uur)

ORAAL/IV

mean OR

mean IV

Orale biologische

beschikbaarheid ≈ 20%

16

immunosuppressie, leukopenie (ALTA), locale necrose

(dermatitis, conjuncitivitis en gastro-enteritis)

hemorrhagische diathese

TRICHOTHECEEN TOXICOSE

Prof. J. Fink

4. Zearalenone

Fusarium graminearum, F. culmorum

Toxine: zearalenone, < 25°C en 16% RV

Bron: maïs, tarwe, maïsglutenvoer

Symptomen

hyperoestrogenisme, gezwollen vulva, prolaps van de uterus,

prolaps van het rectum, vulvovaginitis, geatrofieerde ovaria,

verminderde hoeveelheid follikels

gevolg: voornamelijk reproductiestoornissen

gevoelige diersoorten: varken, schaap, hond, rund

ZEARALENONE

ZEARALENONE SYNDROOM

17

Toxicokinetiek

Orale resorptie: 80-85%

Biotransformatie: reductie tot ,-zearalenol, verder tot -zearalanol

(zeranol) en -zearalanol (taleranol)

Excretie: urinair en biliair

Binden op ER en ER

-zearalenol factor 138 uterotropisme

-zearalenol factor 0.5

IARC klasse 3

Fusarium moniliforme

Fusarium proliferatum

Fusarium subglutinans

Toxinen: fumonisine B1, B2 en B3, moniliformine

Bron: maïs

FUMONISINEN

Pathogenese

1. Inhibitie sfinganine N-acyltransferase

2. Toename sfinganine en sfinganine /sfingosine ratio

IARC klasse 2B, oesofagus kanker

Orale resorptie: 3-6% (varken)

Scheikundige analyse: voeder, Sa/So in serum en weefsels

18

Symptomen

1. paard

equine leucoencephalomalacie (ELEM)

necrose in cerebrum

(ataxie, paresis, apathie, coma)

+ leveraandoeningen

2. varken

longaandoening zonder koorts, porcine pulmonary oedema (PPE)

longoedeem, hydrothorax,

lever- en pancreasaandoeningen

3. kippen

bewegingsstoornissen, immunosuppressie

LOAEL: 2 mg/kg LG/dag voor broilers

2009-2010 LEVER - LEVERFUNCTIE 53

6. Ochratoxinen

Aspergillus ochraceus (Z)

Aspergillus carbonarius

Penicillium verrucosum (N)

Toxinen: ochratoxine A, B en C

toxiciteit toxine A > B

citrinine

Bron: granen, druiven, noten, vlees (mondiaal, vooral Noord-Europa)

Symptomen

NIERaandoeningen

atrofie van renale tubuli, interstitiële renale fibrose,

polyurie, immunosuppressie

leverdegeneratie

embryotoxiciteit en teratogeniteit

OCHRATOXINES

19

Toxicokinetiek

Orale resorptie: +/- 65%

96 tot 99,8% plasma eiwitbinding

OTA is substraat voor oatp (accumulatie nier) en voor ABC transporters

Biotransformatie: hydroxylatie, conjugatie via glutathione en

glucuronidatie

Excretie: urinair en biliair, melk bij monogastrica

gevoelige diersoorten

varken (MPN = mycotoxic porcine nephropathy), kip,

forel, hond, konijn, mestkalf

inhibitie proteïnesynthese

- Ochratoxine A is carcinogeen en is betrokken

bij humane nierziekten, IARC klasse 2B

b.v. Balkan endemische nefropathie

niet mutageen, wel genotoxisch

- Citrinine

veroorzaakt nieraandoeningen, immunosuppressie

is niet carcinogeen, wel mutageen

OVERDRACHTSFACTOREN RESIDUEN

20

www.efsa.eu.int

www.knowmycotoxins.com

www.thepoultrysite.com

www.mytox.be

veterinaire.farmacotoxico@ugent.be

Tel 09/264 73 46