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1 CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C. MONITOREO DE LA PRODUCCIÓN DE β-FRUCTOFURANOSIDASAS A PARTIR DE LA LEVADURA Kluyveromyces marxianus SLP1 TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIA Y TECNONOLOGÍA EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA PRESENTA I.Q. EDWIN JARET BARBOSA HERNÁNDEZ GUADALAJARA, JALISCO JUNIO 2017.

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

MONITOREO DE LA PRODUCCIÓN DE

β-FRUCTOFURANOSIDASAS A PARTIR DE LA

LEVADURA Kluyveromyces marxianus SLP1

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRO EN CIENCIA Y

TECNONOLOGÍA

EN LA ESPECIALIDAD DE

BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA

PRESENTA

I.Q. EDWIN JARET BARBOSA HERNÁNDEZ

GUADALAJARA, JALISCO JUNIO 2017.

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TÍTULO

MONITOREO DE LA PRODUCCIÓN DE β-FRUCTOFURANOSIDASAS A

PARTIR DE LA LEVADURA Kluyveromyces marxianus SLP1

Presenta: I.Q. Edwin Jaret Barbosa Hernández

Tutor Académico: Dr. Enrique Jaime Herrera López

Tutor en planta: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis

Asesor: M. en C. y T. Alejandro Arana Sánchez

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, agradezco a mis padres, que han estado siempre ahí brindándome su apoyo y

consejo, a quienes debo y dedico todo cuanto soy. Mi madre, fuente infinita de cariño y

comprensión, y a quien debo mi parte más humana. Mi padre, la persona que más admiro, pues

con el ejemplo me ha demostrado que las metas propuestas se pueden lograr con inteligencia,

esfuerzo y dedicación, y siempre seguir mirando más allá. Ambos son mi respuesta a las

preguntas: ¿Quién es tu héroe? ¿Qué quieres ser de grande? Madre… Padre… GRACIAS.

A Kika y a Rodo, mis hermanos. Mis eternos cómplices y mis mejores amigos. Para quienes no

busco ser un ejemplo, sino quien camina a su lado para celebrar sus triunfos y apoyar en los

fracasos; y quizá de vez en vez, atreverme a ofrecerles un consejo. Ellos, mi motor para ser la

mejor versión de mí mismo. GRACIAS.

A mi novia Martha, quien me ha dado su apoyo incondicional y me ha motivado a crecer siempre

personal y profesionalmente.

A Richie, infatigable oído de mis logros y frustraciones durante esta etapa, y quien siempre tuvo

para mí unas palabras de aliento.

Al Dr. Enrique Herrera, quien tuvo fe en mí. Cuya personalidad sencilla, afable y práctica, así

como su apoyo y consejo me permitieron llegar a buen puerto en esta etapa de mi desarrollo

profesional.

Al Dr. Alejandro Arana, quien tuvo la paciencia de transmitirme sus conocimientos y de quien

adopté la forma de trabajo y pensamiento analítico. No habría avanzado tanto en mi proyecto de

tesis sin su incondicional asesoría dentro y fuera de CIATEJ, y cuya amistad atesoraré por

siempre.

A la Dra. Anne Gschaedler, por sus oportunos consejos que me permitieron crecer en mi

formación académica.

Al Dr. Jorge Pliego, cuyo apoyo en el diseño del sistema de control automático de nivel para el

biorreactor y su atenta disponibilidad para enseñarme a usar el SIA fueron decisivos en el logro

de los objetivos de este proyecto.

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A los miembros del jurado, el Dr. Melchor Arellano Plaza y el Dr. Javier Placido Gaviño; por

sus acertados consejos para la corrección de este trabajo de investigación.

A todos mis compañeros y amigos de CIATEJ, con quieres compartí alegrías, frustraciones y

una que otra bebida espirituosa, y que sin duda hicieron más amena mi estadía en el laboratorio

y cuyas amistades deseo seguir cultivando. Agradecimiento especial para mis amigos Hazael y

Luis Jorge, que siempre estuvieron a bien resolver mis dudas y ayudarme con los problemas de

software y electrónica que se me presentaron en este proyecto.

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ)

y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el financiamiento de mis

estudios de maestría con la beca 407127.

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RESUMEN

Este proyecto de tesis tuvo como objetivo principal encontrar las condiciones apropiadas para

obtener la máxima producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura Kluyveromyces

marxianus SLP1; así como el desarrollo de estrategias para el monitoreo de la actividad β-

fructofuranosidasa en la misma levadura.

Primeramente, se realizó un estudio para determinar los parámetros cinéticos del crecimiento de

la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1, así como estudiar la producción de las β-

fructofuranosidasas en dependencia de la complejidad de las cadenas de monosacáridos de la

fuente de carbono, desde glucosa y fructosa hasta sacarosa, inulina y fructanos de agave (FA).

La mayor actividad enzimática se logró con inulina y FA.

Se llevó a cabo un análisis por superficie de respuesta sobre dos cultivos en estado continuo con

el objetivo de determinar las mejores condiciones del proceso de fermentación que favorezcan

la producción de las β-fructofuranosidasas. Los factores del primer cultivo en continuo fueron

temperatura (26, 30 y 34 °C), velocidad especifica de crecimiento (0.05, 0.225 y 0.4 h-1) y

concentración de glucosa de alimentación (20, 40 y 60 g/L). Para el segundo continuo se

consideró la temperatura (30, 34 y 38 °C) y la velocidad específica de crecimiento (0.05 y 0.09

h-1). Las mejores condiciones fueron 34 °C, 0.05 h-1 y 20 g/L, donde se consiguió un valor de

actividad enzimática de hasta 800 U/ml, que es la máxima producción reportada en la literatura

con glucosa como fuente de carbono.

Un par de cultivos en lote alimentado fueron diseñados para producir β-fructofuranosidasas bajo

condiciones limitadas de glucosa. Se observó que la actividad fue mayor a una velocidad

específica de crecimiento de 0.05 h-1, y se redujo por la falta de oxigenación a µ < 0.05 h-1.

Finalmente, se desarrolló una metodología para la determinación de actividad β-

fructofuranosidasas en un sistema de análisis de inyección secuencial (SIA, por sus siglas en

inglés). Además, se empleó el método desarrollado para monitorear la actividad enzimática en

línea durante el segundo cultivo en estado continuo, acoplando el biorreactor y el sistema SIA.

Aunque se presentó una alta variabilidad en el análisis, el sistema SIA tiene el potencial de ser

un sistema fiable para el monitoreo de la actividad en línea.

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ABSTRACT

The main objective of this project was to find appropriate conditions to obtain the maximum β-

fructofuranosidases production using the yeast strain Kluyveromyces marxianus SLP1; as well

as the development of strategies for monitoring β-fructofuranosidase activity during the culture.

First, it was carried out a study to evaluate the behavior and growth kinetics of Kluyveromyces

marxianus SLP1, as well as the production of the β-fructofuranosidases changing the carbon

source with increasing molecular complexity like glucose, fructose, sucrose, inulin and agave

fructan (AF). The highest enzymatic activity was achieved using inulin and AF.

A response surface analysis was carried out for two chemostats in order to determine the best

conditions process to maximize the β-fructofuranosidases production. The factors of the first

chemostat were temperature (26, 30 and 34 °C), specific growth rate (0.05, 0.225 and 0.4 h-1)

and glucose concentration in media feed (20, 40 and 60 g/l). The temperature (30, 34 and 38 °C)

and the specific growth rate (0.05 and 0.09 h-1) were considered for the second chemostat. The

best conditions obtained were 34 °C, 0.05 h-1 of specific growth rate and 20 g/l of sugar

concentration feed, achieving an enzymatic activity value up to 800 U/ml, which is the highest

value reported in the literature with glucose as a carbon source.

Fed batch cultures were carried out to produce β-fructofuranosidases under limited glucose

conditions. The highest enzymatic production was observed at a specific growth rate of 0.05 h-

1, and decreased when it was limited by oxygen and μ < 0.05 h-1.

Finally, a methodology for the determination of the β-fructofuranosidases activity was

developed using a sequential injection analysis system (SIA). In addition, the developed method

to monitor the enzymatic activity in line during the second chemostat was used, coupling the

bioreactor and the SIA system. Although there was high variability in the analysis, the SIA

system has the potential to be a reliable system for monitoring on-line activity.

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MARCO

Este trabajo se llevó a cabo bajo el proyecto SPECTRE (spectroscopies for the evaluation and

control in real time of biological cells physiological state), que fue un desarrollo de colaboración

entre Francia y México con el objetivo de desarrollar un sistema en línea capaz de monitorear

el estado fisiológico de los microorganismos durante fermentaciones o cultivos celulares. El

responsable del proyecto SPECTRE en México fue la Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis,

actual directora de CIATEJ Unidad Zapopan.

En el estudio de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 para la producción de β-

fructofuranosidasas participaron como estudiante de Doctorado el M. en C. Alejandro Arana

Sánchez y como estudiante de Maestría Edwin Jaret Barbosa Hernández. Vale la pena

mencionar que ambos estudiantes trabajaron en paralelo en sus proyectos de tesis, por lo que

comparten parte de los datos experimentales, pero enfocándolos a sus objetivos particulares y

concluyendo de manera independiente.

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ÍNDICE DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 16

2. ANTECEDENTES ........................................................................................................... 18

2.1. Levaduras .................................................................................................................. 18

2.1.1. Generalidades de las levaduras ............................................................................ 18

2.2. Kluyveromyces marxianus ............................................. ¡Error! Marcador no definido.

2.2.1. Generalidades de la Kluyveromyces marxianus ................................................... 19

2.2.2. Metabolismo de Kluyveromyces marxianus ......................................................... 20

2.2.3. Crecimiento y termotolerancia de Kluyveromyces marxianus ............................. 21

2.2.4. Aplicaciones biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus ............................... 22

2.3. β-fructofuranosidasas ............................................................................................... 23

2.4. Producción de β-fructofuranosidasas en Kluyveromyces marxianus .................... 24

2.5. Sistemas de cultivo .................................................................................................... 25

2.5.1. Sistemas de cultivo en lote (batch) ...................................................................... 26

2.5.2. Sistemas de cultivo en lote alimentado (fed-batch) ............................................. 28

2.5.3. Sistemas de cultivo en estado continuo ................................................................ 30

2.6. Monitoreo de bioprocesos ........................................................................................ 32

2.6.1. Espectroscopia dieléctrica .................................................................................... 33

2.6.2. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®) ................................................ 34

2.6.3. Sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) ............................................. 35

2.7. Optimización estadística de bioprocesos, MSR. ..................................................... 37

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 39

4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 40

5. HIPÓTESIS ...................................................................................................................... 41

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6. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 42

6.1. Objetivo principal ..................................................................................................... 42

6.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 42

7. METODOLOGÍA ............................................................................................................ 43

7.1. Microorganismo ........................................................................................................ 43

7.2. Medios de cultivos ..................................................................................................... 43

7.3. Banco de trabajo del microorganismo .................................................................... 45

7.4. Activación de cepa .................................................................................................... 45

7.5. Preparación del inóculo ............................................................................................ 46

7.6. Preparación del biorreactor e instrumentación ..................................................... 46

7.7. Técnicas analíticas .................................................................................................... 47

7.7.1. Monitoreo de biomasa .......................................................................................... 47

7.7.2. Consumo de sustrato ............................................................................................ 50

7.7.3. Actividad β-fructofuranosidasa ............................................................................ 51

7.8. Cultivos en lote en biorreactor ................................................................................ 52

7.9. Cultivos en estado continuo en biorreactor ............................................................ 53

7.10. Cultivos en lote a temperatura óptima ................................................................... 55

7.11. Cultivos en lote alimentado ...................................................................................... 56

7.12. Monitoreo de actividad β-fructofuranosidasa en línea .......................................... 57

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 60

8.1. Cultivos en lote en biorreactor y pruebas con diferentes fuentes de carbono ..... 60

8.1.1. Cultivo en lote con glucosa como fuente de carbono ........................................... 60

8.1.2. Cultivo en lote con fructosa como fuente de carbono .......................................... 63

8.1.3. Cultivo en lote con sacarosa como fuente de carbono ......................................... 65

8.1.4. Cultivo en lote con inulina como fuente de carbono ............................................ 67

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8.1.5. Cultivo en lote con fructanos de agave como fuente de carbono ......................... 70

8.1.6. Comparativa entre actividad enzimática y fuente de carbono .............................. 72

8.2. Cultivos en estado continuo en biorreactor ............................................................ 73

8.2.1. Primer cultivo en continuo ................................................................................... 73

8.3. Cultivos en lote a 34 °C en biorreactor ................................................................... 82

8.4. Cultivos en lote alimentado en biorreactor ............................................................ 85

8.4.1. Primer cultivo en lote alimentado ........................................................................ 86

8.4.2. Segundo cultivo en lote alimentado ..................................................................... 90

8.5. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa ..................................... 94

8.5.1. Metodología para la curva de calibración en el sistema SIA ............................... 94

8.5.2. Metodología para la determinación de actividad β-fructofuranosidasa en el sistema

SIA……………………………………………………………………………………….98

8.5.3. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa de un cultivo en

continuo…………………………………………………………………………………105

9. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 108

10. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 109

11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 110

12. ANEXOS ......................................................................................................................... 119

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 2.1. Parámetros de crecimiento de algunas cepas de Kluyveromyces. ............................ 22

Tabla 2.2. Lista resumen de cepas de K. marxianus productoras de fructanasa/inulinasa. ....... 25

Tabla 7.1. Composición del medio YPD ................................................................................... 43

Tabla 7.2. Composición del medio químicamente definido ...................................................... 44

Tabla 7.3. Compuestos del reactivo DNS.................................................................................. 50

Tabla 7.4. Combinación de factores para el diseño experimental 23. ........................................ 54

Tabla 7.5. Condiciones de los experimentos aplicados en el segundo cultivo en continuo. ..... 55

Tabla 8.1. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática

para el cultivo en lote utilizando glucosa como fuente de carbono .......................... 62

Tabla 8.2. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática

para el cultivo en lote utilizando fructosa como fuente de carbono.......................... 64

Tabla 8.3. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática

para el cultivo en lote utilizando sacarosa como fuente de carbono ......................... 66

Tabla 8.4. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática

para el cultivo en lote utilizando inulina como fuente de carbono ........................... 68

Tabla 8.5. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática

para el cultivo en lote utilizando FA como fuente de carbono ................................. 71

Tabla 8.11. Resultados de biomasa y actividad enzimática del primer cultivo en estado continuo.

................................................................................................................................... 74

Tabla 8.12. Análisis de varianza para la actividad enzimática .................................................. 76

Tabla 8.13. Condiciones y resultados para el segundo cultivo en continuo. ............................. 80

Tabla 8.14. Protocolo para un punto de la curva de calibración en el SIA ............................... 95

Tabla 8.15. Protocolo para el blanco de la muestra en el SIA ................................................... 98

Tabla 8.16. Protocolo para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en el SIA .. 99

Tabla 8.17. Protocolo para el módulo de dilución 1:10........................................................... 100

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Tabla 8.18. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA............................................. 103

Tabla 8.19. Protocolo para succión de sobrenadante desde biorreactor .................................. 106

Tabla 8.20. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA en línea. .............................. 107

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Filogenia de la levadura Kluyveromyces marxianus ............................................... 20

Figura 2.2 Levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 ............................................................. 20

Figura 2.3. Estructura general de los fructanos ......................................................................... 24

Figura 2.4. Fases de crecimiento microbiano ............................................................................ 27

Figura 2.5. Comportamiento de la biomasa en un cultivo en lote alimentado .......................... 29

Figura 2.6. Coeficiente de mantenimiento a alta concentración de biomasa ............................ 30

Figura 2.7. Concentración de biomasa y sustrato limitante en estado estacionario a distintos

valores de D .......................................................................................................... 31

Figura 2.8. Sistemas de cultivo .................................................................................................. 32

Figura 2.9. Esquema de la medición de la viabilidad y sonda de espectroscopia dieléctrica. .. 34

Figura 2.10. Sistema de análisis y conteo celular (CASY®) ..................................................... 35

Figura 2.11. Esquema de un sistema de análisis por inyección secuencial ............................... 36

Figura 2.12. Sistema SIA ........................................................................................................... 37

Figura 2.13. Visión gráfica de la metodología por superficie de respuesta .............................. 38

Figura 7.1. Rejilla de conteo de la cámara de Neubauer y recuadros contados ........................ 48

Figura 7.2. Descripción del sistema de análisis de inyección secuencial (SIA). ....................... 59

Figura 8.1. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con glucosa.......... 61

Figura 8.2. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con glucosa. ....... 62

Figura 8.3. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con fructosa. ........ 63

Figura 8.4. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con fructosa. ...... 64

Figura 8.5. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con sacarosa. ....... 65

Figura 8.6. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con sacarosa. ..... 66

Figura 8.7. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con inulina. .......... 68

Figura 8.8. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con inulina. ........ 69

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Figura 8.9. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con FA. ................ 70

Figura 8.10. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con FA. ............ 71

Figura 8.11. Comparativa de actividad enzimática según la fuente de carbono. ...................... 72

Figura 8.12. Gráfico de efectos principales. .............................................................................. 77

Figura 8.13. Gráfica de interacciones entre factores. ................................................................ 77

Figura 8.14. Superficie de respuesta para la actividad enzimática en función de los factores

probados. .............................................................................................................. 78

Figura 8.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática a µ = 0.05 h-1. ................ 81

Figura 8.16. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 1 a 34 °C. .......... 82

Figura 8.17. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 1 a 34 °C. ......... 83

Figura 8.18. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 2 a 34 °C. .......... 84

Figura 8.19. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 2 a 34 °C. ......... 84

Figura 8.20. Actividad enzimática de muestras dializadas vs no dializadas. ............................ 85

Figura 8.21. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 1. ..... 86

Figura 8.22. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 1. ............................. 87

Figura 8.23. Biomasa vs actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 1.88

Figura 8.24. Actividad enzimática y velocidad específica de crecimiento para el cultivo en lote

alimentado 1. ........................................................................................................ 89

Figura 8.25. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 2. ..... 90

Figura 8.26. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 2. ............................. 91

Figura 8.27. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 2. ... 92

Figura 8.28. Actividad enzimática y velocidad específica de crecimiento para el cultivo en lote

alimentado 2. ........................................................................................................ 94

Figura 8.29. Respuestas generadas por el SIA para la curva de calibración. ............................ 97

Figura 8.30. Curva de calibración SIA. ..................................................................................... 97

Figura 8.31. Respuesta SIA para la actividad β-fructofuranosidasa de una muestra. ............. 101

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Figura 8.32. Respuesta SIA con y sin generación de burbujas espontaneas para la misma

muestra. .............................................................................................................. 102

Figura 8.33. Repetibilidad en actividad enzimática para la muestra B2. ................................ 102

Figura 8.34. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras A. ............ 104

Figura 8.35. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras B. ............ 104

Figura 8.36. Sistema de cultivo en continuo ........................................................................... 105

Figura 8.37. Biorreactor, sistema SIA y línea de acoplamiento. ............................................. 106

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1. INTRODUCCIÓN

El monitoreo y control de parámetros en un proceso es de gran importancia a nivel laboratorio

e industrial para garantizar un alto rendimiento y una adecuada productividad. Un método de

monitoreo apropiado podría permitir obtener información de un cultivo, pudiéndose aplicar

estrategias para desarrollar, optimizar y controlar el proceso, garantizando la máxima eficiencia

y la calidad posible de un producto de interés [1].

Los procesos biotecnológicos han sido utilizados desde los inicios de la civilización para la

elaboración de alimentos y bebidas, aún con el desconocimiento de los individuos de esa época.

Actualmente, la biotecnología se emplea para producir una gran variedad de productos, tales

como metabolitos primarios y secundarios, células, tejidos, vacunas y proteínas terapéuticas;

empleando deferentes sistemas de células huésped. Por ejemplo, células bacterianas, células

vegetales y células eucariotas, como las levaduras; con requisitos específicos para el diseño de

biorreactores, composición de medios y control de procesos [2].

Los nuevos retos en la biotecnología demandan que el investigador cuente con los

conocimientos necesarios que le permitan favorecer la producción de metabolitos manipulando

las condiciones operacionales y nutricionales del cultivo. Este conocimiento se puede obtener

en especial a través del monitoreo de variables claves en el bioproceso. De modo que la

información obtenida con el registro de las variables pueda ser utilizada para convertirlas en

estrategias de optimización; por ejemplo, mediante el cribado de alto rendimiento y el diseño de

experimentos.

Dentro de la amplia gama de productos y subproductos de origen vegetal destaca la inulina y el

interés por producirla a nivel mundial se ha incrementado debido a la creciente demanda de

productos alimenticios ricos en fibra y suplementos dietéticos; aumentando la inversión en la

industria de alimentos y bebidas para la innovación y el desarrollo de nuevos productos

alimenticios enriquecidos con prebióticos. Se prevé que el mercado mundial de inulina

experimente un crecimiento significativo en los próximos años, con un crecimiento anual de

9.1% hasta 2020. Se estima que su valor en el mercado global sea de $ 2.35 mil millones USD

para ese año [3].

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En México, también existe un marcado interés en la obtención de fructanos a través de plantas

endémicas. En especial los fructanos proveniente del agave, pues de las 310 especies de agave

reportadas, 272 se pueden encontrar en México, que es considerado como el centro de origen y

de biodiversidad de este género. Los fructanos de agave son muy importantes para la

agroindustria mexicana, específicamente en la producción de tequila, que hoy en día es una de

las bebidas alcohólicas más importantes del mundo [4]. La familia de enzimas que hidrolizan

los fructanos de agave, denominadas β-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26), son capaces de

hidrolizar moléculas complejas como la inulina en fructosa prácticamente pura, la cual es

ampliamente usada en la industria de alimentos como edulcorante dietético con un poder de

dulzor de 1.5 a 2 veces la sacarosa [5]. De ahí el interés por su estudio para producirla, purificarla

y caracterizarla a partir de cultivos microbianos en medios sintéticos, siendo Kluyveromyces

marxianus una excelente productora de β-fructofuranosidasas y una de las levaduras más

estudiadas [6].

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2. ANTECEDENTES

2.1. Levaduras

Las levaduras han beneficiado a la humanidad por milenios. Tienen una gran importancia

industrial en áreas científicas, alimentarias, médicas, agrícolas, medio ambiente, entre otras. Han

sido usadas ampliamente en la biotecnología tradicional y moderna para la producción de

alimentos, bebidas, enzimas, productos químicos finos y reactivos farmacéuticos. Las levaduras

se encuentran a la vanguardia de la investigación en genética moderna, biología molecular y

biología celular [7].

Las levaduras son los mayores generadores de productos biotecnológicos a nivel mundial,

excediendo en producción, capacidad e ingresos económicos a cualquier otro microorganismo

industrial. Un claro ejemplo lo encontramos en la levadura Saccharomyces cerevisiae y especies

afines, que son las principales levaduras empleadas en fermentaciones alimenticias (pan,

cerveza, vino) y otros procesos industriales (producción de metabolitos); además, es el modelo

más importante para organismos eucariontes que se utiliza en investigación científica [8].

Últimamente, la levadura Kluyveromyces marxianus ha cobrado importancia debido a su

potencial impacto en la industria biotecnológica [9].

2.1.1. Generalidades de las levaduras

Una levadura se puede considerar como "hongos, basidiomicetos o ascomicetos, cuya fase

vegetativa es unicelular, que se multiplican por gemación o fisión, que pueden o no formar

esporas durante una etapa sexual y que no han sido nombrados como algún tipo específico de

hongo" [10].

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levadura más explotada comercialmente, y pertenece

al reino de los hongos y a la subdivisión Ascomycotina. Otras levaduras se clasifican bajo el

género Basidiomycotina (i.e., Cryptococcus spp. y Rhodotorula spp.) y Deuteromycotina (por

ejemplo, Candida spp. y Brettanomyces spp.). Sin embargo, existen alrededor de 100 géneros

de levadura reconocidos [11].

Las células de levadura varían en tamaño entre 1-8 µm, resultando una de las más grandes

Saccharomyces cerevisiae, especialmente cuando se presenta una morfología hexaploide. Bajo

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el microscopio óptico, la mayoría de estas células presentan algunas de las siguientes formas:

redondeadas, elipsoidales y alargadas con formas cilíndricas. Trigonopsis variabilis es una

excepción, puesto que sus células tienen estructura triangular, brotando en las esquinas, que se

presenta bajo ciertas condiciones nutricionales [11].

Saccharomyces cerevisiae es la levadura más estudiada y utilizada a nivel laboratorio e

industrial. Sin embargo, el avance de la tecnología y en específico uso de herramientas

moleculares modernas han permitido identificar, comprender y mejorar algunas de las llamadas

levaduras no-Saccharomyces, también llamadas no convencionales. Una levadura de especial

interés es Kluyveromyces marxianus [7].

2.2. Kluyveromyces marxianus

Kluyveromyces marxianus es una levadura homotálica (que se autofertiliza) y pertenece a la

clase hemiascomycetes. Esta filogenéticamente relacionada con la levadura Saccharomyces

cerevisiae [12], [13].

2.2.1. Generalidades de la Kluyveromyces marxianus

La figura 2.1 muestra la filogenia de K. marxianus dentro del género Kluyveromyces y el orden

Saccharomycetales. Se incluyen las seis especies de Kluyveromyces y otras especies de interés

industrial [9]. Desde 1994 K. marxianus ha sido clasificada como "generalmente considerada

como segura" (GRAS) por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en EE. UU.,

y desde 2005 ha sido catalogada como un microorganismo con "presunción de seguridad

calificada" (QPS) por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) [14]. De tal

manera que existen pocas restricciones en su uso en bioprocesos, incrementando en gran medida

su potencial para la producción de metabolitos de interés industrial [15].

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Figura 2.1. Filogenia de la levadura Kluyveromyces marxianus.

a) b)

Figura 2.2 Levadura Kluyveromyces marxianus SLP1, a) en cultivo en medio líquido y b) en cultivo en

medio sólido YPD.

2.2.2. Metabolismo de Kluyveromyces marxianus

Las cepas pertenecientes a la especie de levadura Kluyveromyces marxianus han sido aisladas

de una gran variedad de hábitats, por lo que exhiben una alta diversidad metabólica y un grado

sustancial de polimorfismo intraespecífico [15]. Al considerar el metabolismo, es importante

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destacar que K. marxianus tiene una de las tasas más rápidas de crecimiento de cualquier otro

microorganismo eucariota [7].

Aunque los componentes centrales de la glucólisis y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos están

conservadas entre especies de levaduras, la regulación los mismos difiere considerablemente

[16]. K. marxianus es una levadura aeróbica y su capacidad para generar energía mediante la

respiración mixta y la fermentación se describe como metabolismo respiro-fermentativo, siendo

más eficiente en S. cerevisiae [17]. Varios procesos regulatorios contribuyen a la eficiente

capacidad de fermentación de S. cerevisiae, especialmente el efecto “Crabtree", que parece ser

en gran parte debido a la represión de catabolitos de carbono (glucosa) de genes que codifican

enzimas respiratorias, y el débil efecto “Pasteur", que corresponde a la inhibición del

metabolismo fermentativo por oxígeno [18]. K. marxianus tradicionalmente se clasifica como

una levadura "Crabtree negativa", implicando una incapacidad para fermentar efectivamente los

azúcares al etanol. Sin embargo, diversos reportes publicados sobre K. marxianus en la

producción de etanol sugieren una clasificación imprecisa. Estudios recientes han procurado

avanzar en la comprensión del metabolismo respiro-fermentativo de levaduras hemiascomicetas

[19]–[22].

Una de las características más notables de esta especie es su capacidad de consumir lactosa como

fuente de carbono, que es un rasgo ausente en S. cerevisiae. La utilización de lactosa ha sido

ampliamente estudiada en K. lactis y se asume que los aspectos fundamentales se conservan en

K. marxianus [23], [24]. La capacidad para utilizar lactosa es conferida por dos genes, LAC12,

que codifica una permeasa de lactosa que es requerida para la absorción de lactosa en la célula,

y LAC4, que codifica a una ß-galactosidasa que hidroliza la lactosa a monómeros de glucosa y

galactosa. Al igual que en S. cerevisiae, la galactosa se metaboliza a glucosa-6-P a través de la

vía de Leloir [25].

2.2.3. Crecimiento y termotolerancia de Kluyveromyces marxianus

Un aspecto importante en la fisiología de K. marxianus es el hecho de que se han reportado

parámetros de crecimiento significativamente diferentes, tales como la velocidad específica de

crecimiento y el coeficiente de rendimiento biomasa/sustrato, no sólo para diferentes cepas

dentro de la especie sino también para la misma cepa cuando se investiga en diferentes

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22

laboratorios [26]; es decir, dependerá de la cepa con la que se trabaje. En la tabla 2.1 se muestran

algunos de los parámetros cinéticos reportados para algunas cepas de Kluyveromyces.

K. marxianus posee características deseables para aplicaciones biotecnológicas como son:

capacidad de asimilar sustratos como lactosa y la inulina que no todas las levaduras pueden

metabolizar; además de presentar altas tasas de crecimiento, termotolerancia, y una gran

capacidad secretora de metabolitos [15]. Se ha reportado que K. marxianus produce alcohol a

temperaturas superiores a 40 °C, inclusive a 52 °C [29].

Tabla 2.1. Parámetros de crecimiento de algunas cepas de Kluyveromyces.

Levadura Modo de cultivo µ, h-1 Yx/s qO2, mmol/g-h Ref.

K. marxianus

ATCC 26548

Lote 0.56 0.51 11.05 [26]

Continuo 0.1 0.45 2.67 [26]

Continuo 0.25 0.48 6.65 [26]

Continuo 0.5 0.48 11.09 [26]

K. marxianus

CBS 6556

Lote 0.44 0.49 --- [30]

Continuo 0.1 0.43 --- [31]

Continuo 0.2 0.48 --- [32]

K. lactis

CBS 2359

Continuo 0.1 0.48 3.7 [33]

Continuo 0.2 0.49 6.2 [33]

Continuo 0.4 0.49 11.3 [33]

2.2.4. Aplicaciones biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus

El número de especies de levaduras descritas aumenta cada año, actualmente se reportan más de

700 especies diferentes pertenecientes a 100 géneros. A pesar de este inmenso espectro, las

aplicaciones industriales o biotecnológicas todavía se limitan a un número pequeño de especies,

pertenecientes principalmente a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia

y Yarrowia [34]. De estos géneros, destaca Saccharomyces cerevisiae, debido entre otras cosas,

a su alta capacidad de convertir azúcares en etanol, tanto en condiciones anaeróbicas como

aeróbicas [26]. No obstante, hay otras levaduras no-Saccharomyces en cuanto a la producción

de metabolitos de interés biotecnológico y que pudieran ser una alternativa a S. cerevisiae.

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Dentro de las levaduras no-Saccharomyces destaca K. marxianus. Esta levadura presenta una

amplia diversidad metabólica en la que se han reportado una extensa cantidad de investigaciones

donde se han explorado aplicaciones como: producción de enzimas (β-galactosidasa [35]–[38],

poligalacturonasas [39], inulinasa [40]–[43], entre otras), proteína unicelular [44], [45],

producción de componentes aromáticos [46], [47] y etanol (al presentar termotolerancia, puede

realizar procesos de sacarificación y fermentación simultánea) [15]; reducción del contenido de

lactosa en productos alimenticios; producción de bioingredientes a partir de suero de leche;

biorremedición [48], [49]; como un agente anticolesterolémico [50]; y como hospedero para la

producción de proteínas recombinantes [51]. Se han estudiado algunos cultivos de cepas de K.

marxianus donde se han identificado beneficios adicionales al perfil organoléptico del agave

fermentado, como una mayor variedad de compuestos volátiles, probablemente debido a la

producción de ésteres de acetato afrutados [52]–[54].

2.3. β-fructofuranosidasas

Las β-fructofuranosidasas, también conocidas como fructosidasas o simplemente fructanasas,

pertenecen a la familia 32 de las glicosilhidrolasas. Las fructanasas son las enzimas responsables

de hidrolizar enlaces β-2-1 o β-2-6 de los fructanos para liberar fructosa [55], pudiendo ser

usados para la obtención de fructooligosacáridos (FOS) o néctares de fructosa [56].

Dentro del grupo de las β-fructofuranosidasas, podemos encontrar a las que hidrolizan fructanos

desde su extremo reductor β-2-1 o β-2-6; algunos ejemplos de este tipo son, las exo-β-

fructosidasas (exoinulinasas y exolevanasas) y β-2-6-fructano-6-levanobiohidrolasas. Estas

enzimas también incluyen a las endoinulinasas, las cuales hidrolizan específicamente los enlaces

internos β-2-1 de la inulina. Finalmente las endolevansas que hidrolizan específicamente los

enlaces β-2-6 en el levano [25]. Se ha reportado de manera indistinta las β-fructofuranosidasas

y las inulinasas, siendo que las segundas son un tipo específico de las primeras.

Los fructanos son oligómeros o polímeros con residuos β-fructofuranosil, comúnmente solubles

en agua y sintetizados a partir de la acumulación de sacarosa en la vacuola [57]. Los fructanos

de origen distintos pueden diferir en el grado de polimerización (DP), la presencia de ramas, el

tipo de enlace entre unidades de fructosa adyacentes, y la posición del residuo de glucosa (figura

2.3). Los fructanos tienen varias aplicaciones potenciales en la industria de productos

alimenticios y no alimenticios, tales como prebióticos [58].

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Figura 2.3. Estructura general de los fructanos.

Las β-fructofuranosidasas pueden ser obtenidas a partir de especies vegetales y de algunos

microorganismos. Por esta razón en los últimos años se han realizado esfuerzos por encontrar u

obtener la mejor fuente microbiana. Muchas cepas de hongos, levaduras y bacterias son capaces

de producir β-fructofuranosidasas y varios de ellos han sido cultivados con éxito para la

producción de estas enzimas y su posterior extracción, concentración y purificación. Una de las

β-fructofuranosidasas más estudiadas es la inulinasa, para cuya producción los microorganismos

que comúnmente se emplean son las cepas de mohos como el Aspergillus sp. y cepas de levadura

como Kluyveromyces sp.; donde las cepas de levadura has resultado mejores productoras de

inulinasa que las cepas de hongos y bacterias [59].

2.4. Producción de β-fructofuranosidasas en Kluyveromyces marxianus

En los últimos años las cepas de Kluyveromyces marxianus han ganado un notable interés a nivel

laboratorio e industrial, por lo que están siendo más estudiadas. Un metabolito con gran

potencial son las fructanasas, que pueden ser obtenidas a partir de esta levadura.

En un estudio realizado por Arrizon y col. [60], se observó que las cepas K. marxianus aisladas

de la microbiota del mezcal en Oaxaca presentaron actividad β-fructofuranosidasa con sacarosa,

fructanos de agave e inulina como inductores. Se observó que para el caso de la inulina la

inducción fue mayor con respecto a los otros sustratos. La tabla 2.2 muestra un listado de los

principales trabajos que reportan actividad fructanasa para algunas cepas de K. marxianus, así

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como el sistema de cultivo que se empleó en cada estudio. A continuación, se describirán los

principales sistemas de cultivo que se utilizan para la producción de metabolitos.

Tabla 2.2. Lista resumen de cepas de K. marxianus productoras de fructanasa/inulinasa.

Microorganismo Tipo de

cultivo

Actividad

fructanasa, U/ml Referencia

Kluyveromyces sp. Y-85 Lote 59.5 [61]

K. marxianus Lote 43.7 [62]

K. marxianus ATCC 36907 Lote 260 [62]

K. marxianus ATCC 52466 Lote 0.418 [62]

K. marxianus CDBB-L-278 Lote 82 [63]

K. marxianus var. marxianus CBS 6556 Lote 3,000 [62]

K. marxianus UCD(FST) 55-82 Lote 212 [62]

K. marxianus var.bulgaricus Continuo 107 [64]

K. marxianus ATCC 16045 Lote 121 [65]

K. marxianus var.bulgaricus Lote 4.1 [66]

K. marxianus (A1 y A2) Lote 32 [67]

K. marxianus NRRL Y-7571 Sólido 391.9 U/g [68]

K. marxianus NRRL Y-7571 Lote 8.87 U/g-h [68]

Kluyveromyces S120 Sólido 409.8 U/g [69]

K. marxianus YS-1 Lote 24.5 [70]

K. marxianus YS-1 Lote 50.2 [71]

K. marxianus NRRL Y-7571 Sólido 463 U/g [72]

K. marxianus Lote 4.02 [73]

2.5. Sistemas de cultivo

Un biorreactor es un equipo donde se mantienen las condiciones de operación necesarias para

la reproducción, gemación o crecimiento de microorganismos; las condiciones pueden ser

agitación, suministro de oxígeno y nutrientes, control del pH y temperatura, etc. Por otra parte,

un sistema o método de cultivo hace referencia al modo de operar el biorreactor, que puede ser

de forma continua o discontinua [74].

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Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente

balance de materia en el biorreactor:

𝑑(𝑉𝐶𝑖)

𝑑𝑡= 𝐹𝑒𝐶𝑒𝑖 − 𝐹𝑠𝐶𝑠𝑖 + 𝑉𝑟𝑓𝑖 − 𝑉𝑟𝑐𝑖

Donde Ci es la concentración del componente i en el reactor y del caudal de salida, V es el

volumen del cultivo, Fe es el caudal de alimentación, Fs es el caudal de salida, Csi en la

concentración del componente i en la alimentación, rfi es la velocidad de formación del

componente i y rci es la velocidad de consumo del componente i.

Por otra parte, el volumen de cultivo variará en el tiempo de acuerdo a Fe y Fs.

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 𝐹𝑒 − 𝐹𝑠

Dependiendo de la configuración de Fe y Fs, se pueden proponer tres sistemas de cultivo: en

lote, en lote alimentado y en continuo. Se describe a continuación el primero.

2.5.1. Sistemas de cultivo en lote (batch)

En un cultivo en lote, todos los nutrientes y el inóculo se agregan en el biorreactor desde un

inicio, y no existe suministro o retirada de masa durante la cinética. En otras palabras, no se

presenta alimentación (afluente), ni corriente de cosecha (efluente).

Durante el crecimiento microbiano se pueden observar hasta siete fases: (A) latencia, donde el

crecimiento es nulo; (B) aceleración, la velocidad de crecimiento se incrementa; (C)

exponencial, la velocidad de crecimiento es constante; (D) retardación, la velocidad de

crecimiento decrece; (E) estacionaria, la velocidad de crecimiento y de muerte se igualan; y (F)

muerte, la velocidad de crecimiento es nula [75] (Figura 2.4). Es posible que exista acumulación

de inhibidores durante la fermentación.

Velocidad de acumulación

= Velocidad de entrada

Velocidad de salida

Velocidad de formación

Velocidad de consumo

― + ―

(Ec. 1)

(Ec. 2)

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27

Figura 2.4. Fases de crecimiento microbiano.

Las ecuaciones diferenciales que gobiernan los cultivos en lote son:

𝑑𝑋

𝑑𝑡= 𝜇𝑋

𝑑𝑆

𝑑𝑡=

𝜇𝑋

𝑌𝑋/𝑆

𝑑𝑃

𝑑𝑡= 𝑟𝑃

Donde X es concentración de biomasa, S es concentración de sustrato, P es concentración de

producto, t es tiempo, µ es la velocidad específica de crecimiento, Yx/s es coeficiente de

rendimiento biomasa/sustrato y rp es la velocidad de generación de producto.

Entre las desventajas que presentan los cultivos en lote para la producción de metabolitos de

interés incluida la biomasa, se encuentran: alta dependencia de las condiciones iniciales, posible

inhibición del crecimiento debido a la acumulación de toxinas, y tiempos muertos entre corridas,

entre otros.

(Ec. 3)

(Ec. 5)

(Ec. 4)

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28

2.5.2. Sistemas de cultivo en lote alimentado (fed-batch)

En este sistema, un cultivo en lote se alimenta continuamente con medio nutritivo fresco o con

alguno de sus componentes. No se presenta flujo de salida, por lo que el volumen de cultivo se

incrementa en el tiempo. Si el nutriente que se alimenta en un cultivo es el limitante del

crecimiento, entonces el lote alimentado es el sistema adecuado para controlar la velocidad de

crecimiento () del microorganismo. El cultivo en lote alimentado es particularmente útil en

procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de productos son sensibles a la

concentración del sustrato limitante; es decir, cuando el rendimiento celular o la productividad

de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se

quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración

de biomasa [76].

La ecuación diferencial que describe el cambio de biomasa con respecto al tiempo está dada por:

𝑑(𝑋𝑉)

𝑑𝑡= 𝜇𝑋𝑉

Integrando la ecuación 6, tenemos:

𝑋𝑉 = 𝑋𝑜𝑉𝑜 + 𝑌𝑋/𝑆𝑆𝑅

𝑋 =𝑋𝑜𝑉𝑜

𝐹𝑡 + 𝑉𝑜+

𝑌𝑋/𝑆𝐹𝑆𝑅

𝐹𝑡 + 𝑉𝑜

𝜇 =𝐹𝑆𝑅𝑌𝑋/𝑆

𝑋𝑜𝑉𝑜 + 𝐹𝑆𝑅𝑌𝑋/𝑆𝑡

Donde Xo y Vo es la concentración de biomasa y el volumen del cultivo al iniciar el lote

alimentado, SR es la concentración de sustrato en la alimentación, F es el flujo de alimentación.

La ecuación diferencial para el sustrato es:

𝑑(𝑆𝑉)

𝑑𝑡= 𝐹𝑆𝑅 −

𝜇𝑋𝑉

𝑌𝑋/𝑆

Resolviendo para la alimentación, queda:

𝐹𝑆𝑅 =𝜇𝑋𝑉

𝑌𝑋/𝑆

(Ec. 6)

(Ec. 7)

(Ec. 8)

(Ec. 9)

(Ec. 11)

(Ec. 10)

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De donde se deduce que la velocidad de crecimiento está limitada por la velocidad de

alimentación. En la figura 2.5 se observa que un lote alimentado inicia al finalizar un cultivo en

lote [76].

t = t0 t

X.V

µ < µmax

X.V = X0.V

0 + F.S

R.Y

X/S.t

X0.V

0

X0'.V

0'

S0'

S0 = 0

BATCH BATCH ALIMENTADO

µ = µmax

Figura 2.5. Comportamiento de la biomasa en un cultivo en lote alimentado.

Este tipo de cultivo requiere del conocimiento previo de parámetros cinéticos del

microorganismo, tal como la velocidad especifica de crecimiento máxima. Algunas de las

limitaciones del sistema en lote alimentado es que el cultivo se ve restringido al volumen total

de trabajo del biorreactor; además, requiere de mayor equipamiento que el cultivo en lote, tal

como el sistema de alimentación.

2.5.2.1. Coeficiente de mantenimiento celular

Los microorganismos requieren energía para mantener ciertas funciones específicas, tales como

recambio de material celular, trabajo osmótico, movilidad, entre otros. Es decir, que aun cuando

el crecimiento celular sea nulo (µ = 0) puede observarse cierto consumo de fuente de carbono y

energía. El coeficiente de mantenimiento celular (ms) indica la cantidad de sustrato por unidad

de biomasa por unidad de tiempo (gsustrato/gbiomasa-h) que se requiere para tales funciones. El valor

de ms puede variar en un amplio intervalo (0.01 – 0.1 g/g.h); depende de la temperatura, la

presión osmótica y la fuerza iónica [77].

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t

X.V

X0.V

0

t0

ms = 0

ms > 0

Figura 2.6. Coeficiente de mantenimiento a alta concentración de biomasa.

La figura 2.6 muestra la biomasa total dada, el coeficiente de mantenimiento celular posee un

valor diferente de cero. La ecuación para el cálculo del coeficiente de mantenimiento celular

cuando la biomasa se mantiene constante es [76]:

𝑚𝑠 =𝐹𝑆𝑅

𝑋𝑉

2.5.3. Sistemas de cultivo en estado continuo

En un cultivo en estado continuo, una o más corrientes de alimentación que contienen los

nutrientes necesarios se alimentan continuamente al biorreactor, mientras que la corriente de

efluente que contiene los productos de células y metabolitos producidos se retiran del cultivo de

manera continua. El estado estacionario se logra al mantener un caudal volumétrico igual tanto

para las corrientes de alimentación y recuperación. De este modo el volumen del cultivo, las

concentraciones de nutrientes y metabolitos permanecen en valores estables y, por lo tanto,

constantes. Con excepción de la producción de proteína unicelular, la producción de cerveza y

los procesos de tratamiento de residuos municipales, los cultivos en continuo no han sido

ampliamente adoptados por la industria biotecnológica, principalmente debido a la dificultad de

mantener la esterilidad y la protección contra los ataques de fagos o mutaciones; además, a

menudo las operaciones en estado estacionario dan resultados desfavorables comparados con

otras operaciones dinámicas como el lote y lote alimentado [76]. Sin embargo, la gran ventaja

(Ec. 12)

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31

del cultivo continuo es mantener la producción de un metabolito en un estado estacionario por

un prolongado periodo de tiempo.

Por definición, los sistemas de cultivo en estado estacionario no tienen variaciones con respecto

al tiempo, su representación matemática es:

𝜇 = 𝐷 =𝐹

𝑉

𝑆 =𝐾𝑠𝐷

𝜇𝑚𝑎𝑥 − 𝐷

𝑋 =𝐷𝑌𝑋/𝑆(𝑆𝑜 − 𝑆)

𝐷 + 𝑚𝑠𝑌𝑋/𝑆

Siendo D la tasa de dilución, S es la concentración de sustrato en el cultivo y Ks es la constante

de Monod específica para cada sustrato. El resto de los parámetros han sido definidos con

anterioridad en este documento.

Figura 2.7. Concentración de biomasa y sustrato limitante en estado estacionario a distintos valores de

D [74]. Parámetros: µmax = 1 h-1, YX/S = 0.5, Ks = 0.05 g/l, So = 5 g/l.

(Ec. 15)

(Ec. 14)

(Ec. 13)

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La Figura 2.7 muestra como varían la concentración de sustrato en estado estacionario en

función de la velocidad de dilución. Se puede observar que el efecto del mantenimiento celular

se hace notable a bajas velocidades de dilución. Además, puede apreciarse que existe un valor

de D por encima del cual la biomasa es cero; a esto se le conoce como lavado del cultivo y se

da cuando D > µmax, debido a que la velocidad de salida de las células del biorreactor será mayor

que la de crecimiento [74].

Figura 2.8. Sistemas de cultivo: a) en lote, b) en lote alimentado y c) en estado continuo.

La figura 2.8 muestra un esquema de los sistemas de cultivo en lote, lote alimentado y en estado

continuo.

2.6. Monitoreo de bioprocesos

Los procesos biotecnológicos producen una gran variedad de bioproductos. La instrumentación

convencional existente utilizada en bioprocesos está enfocada a medir parámetros

fisicoquímicos como pH, temperatura, pdO2, etc. Sin embargo, el avance de la tecnología ha

permitido el desarrollo de nuevos sensores específicos para determinar en línea variables de

mayor interés i.e. biomasa o productos de la fermentación [78].

a) b) c)

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Existen una serie de criterios que un dispositivo de medición debe satisfacer para que sean

confiables como sistemas de sensado en bioprocesos, entre los que podemos mencionar

frecuencia de medición y costo, facilidad de validación e implementación, facilidad de uso y

mantenimiento, limpieza y esterilidad, fiabilidad, precisión y reproducibilidad, linealidad,

sensibilidad y especificidad, y tiempo de respuesta [2].

El monitoreo de bioprocesos puedes ser clasificado de 3 maneras de acuerdo a la localización

del sistema analítico en relación con el biorreactor: fuera de línea (off-line), en la línea (at-line

y on-line) y en línea (in-line). En las mediciones fuera de línea, el muestreo del biorreactor y el

análisis se realiza de manera manual, efectuando la lectura en un equipo externo; por lo cual la

muestra tendrá un desfase de tiempo respecto al bioproceso. En las mediciones en la línea, el

muestreo es automático pero la muestra es analizada fuera del biorreactor (at-line) por ejemplo,

en un sistema de análisis de inyección secuencial, o cuando existe una sonda de muestreo por

donde la muestra es canalizada, analizada y regresada al biorreactor (on-line). Finalmente, en el

monitoreo en línea la medición se realiza in situ mediante un sensor inmerso en el cultivo

(invasivo) o separado del biorreactor por una barrera de vidrio (no invasivo) [78]. Entre los

parámetros comúnmente medidos en línea se encuentran: pH, temperatura, presión, viscosidad,

potencial redox, conductividad, osmolaridad, oxígeno disuelto, dióxido de carbono, peso y nivel

de líquido, flujo de fluidos y densidad óptica [79].

Durante los últimos años han surgido nuevos sistemas de monitoreo que podrían ser

considerados no convencionales, entre los que se encuentran: espectroscopia dieléctrica, sistema

de análisis y conteo de células, y el sistema de análisis por inyección secuencial, entre otros.

2.6.1. Espectroscopia dieléctrica

La biomasa es un parámetro clave en cualquier cultivo microbiano de modo que su estimación

fiable en línea es de gran interés en los procesos biotecnológicos. En la literatura se han descrito

diferentes enfoques para la medición de la biomasa. Uno de ellos se basa en la medición de la

capacitancia y que posiblemente sea la mejor técnica in situ comparada con otras opciones [80].

La capacitancia, en este caso, es la capacidad que tiene la célula para acumular carga y ser capaz

de polarizarse por efecto de un campo eléctrico [81]; propiedad que puede ser detectada y

cuantificada mediante espectroscopia dieléctrica.

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El equipo de espectroscopia dieléctrica consta de una sonda en línea que incorpora una serie de

electrodos con cuatro terminales. Dos terminales externas generan un campo eléctrico de

radiofrecuencia y otras dos terminales internas lo miden. El campo eléctrico promueve que los

iones suspendidos en el medio y el citoplasma de la levadura se muevan hacia uno de los

electrodos. Puesto que la membrana plasmática no es conductora, los iones no pueden moverse

libremente a través de ella, esto ocasiona una acumulación de carga que polariza las células [78].

Una célula no viable tiene la membrana dañada, y ya no puede considerarse un sistema cerrado;

por lo que los iones en su interior se encuentran esparcidos por el medio. Por lo tanto una célula

muerta al no poder polarizarse, no es detectada por el equipo (figura 2.9).

Figura 2.9. Esquema de la medición de la viabilidad [25] y sonda de espectroscopia dieléctrica.

Se han realizado estudios comparando la biomasa detectada mediante espectroscopia dieléctrica

y otros medios tradicionales, como el conteo en cámara; donde se encontró una correlación de

hasta el 95% [82]. Por lo tanto, el monitoreo de crecimiento de microorganismos en línea por

este método resulta posible. Otra técnica que provee información interesante sobre los

microrganismos es el conteo automático de células descrito a continuación.

2.6.2. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®)

El sistema de análisis y conteo de células CASY® (figura 2.10) utiliza las técnicas de exclusión

de corriente eléctrica y análisis de área de pulso, las células pueden ser analizadas y contadas de

Células viables polarizadas

Células muertas

no polarizadas

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manera eficiente y precisa. Esta tecnología puede aplicarse para el recuento de células, análisis

de cultivos celulares [83].

Cuando una célula se expone a un campo de baja tensión, la corriente eléctrica no puede

atravesar la membrana intacta, que es un aislante eléctrico, como resultado de la interrupción

eléctrica se genera un “conteo”; por lo que se puede extrapolar la concentración celular al medir

el número de conteos en un volumen determinado. Como el tamaño de la célula está relacionado

con su volumen, se puede producir un perfil del tamaño de la célula en la población en términos

de la resistencia eléctrica. Dado que las células se escanean a una alta frecuencia, se puede

producir un resultado preciso y una alta resolución. Las células vivas tienden a poseer mayor

volumen; por lo que, al pasar a través del flujo de corriente, puede generarse una caída del pulso

mayor, y luego amplificarse.

Figura 2.10. Sistema de análisis y conteo celular (CASY®)

2.6.3. Sistema de análisis por inyección secuencial (SIA)

Los analizadores bioquímicos han permitido desarrollar sistemas de muestro y análisis en línea

de metabolitos de interés en un biorreactor. Un ejemplo de esto ha sido el desarrollo (desde

principios de los años ochenta) de sistemas de análisis de inyección de flujo (FIA) y sistema de

análisis por inyección secuencial (SIA). Estas técnicas de manipulación de líquidos han

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demostrado ser flexibles para la determinación de metabolitos de interés biotecnológico en un

biorreactor [2].

Un sistema FIA se basa en el monitoreo continuo de un proceso, teniendo como desventaja el

consumo excesivo de reactivos. Un sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) permite

solventar algunas de las limitaciones de los sistemas FIA, como operar de manera discontinua

consumiendo menor cantidad de reactivos, generando menos residuos, presentando mayor

flexibilidad dado que puede ser reprogramada para determinar otros analitos, y requieren menos

instrumentación; además de proporcionar control sobre las variables viscosidad, flujo y

temperatura [84]. La figura 2.11 muestra la configuración general de un sistema de análisis de

inyección secuencial.

Figura 2.11. Esquema de un sistema de análisis por inyección secuencial [85].

Los analizadores SIA automáticos permiten ejecutar movimientos de pistón preprogramados,

sincronizados con las posiciones y movimientos de una válvula de selección multicanal. La

técnica secuencial de inyección de flujo está basada en la medida de volúmenes exactos de

solución acarreadora, de muestra y de reactivo, aspirados secuencialmente mediante una

microbureta a través de una válvula selectora y reservados en un tubo de acumulación. La

microbureta necesita controlarse de manera precisa para ejecutar movimientos de impulsión o

aspiración, paro u operación de forma reproducible [85].

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Como parte de su formación, el Dr. Pliego diseñó, construyó y validó un prototipo basado en un

sistema de inyección secuencial para la determinación de actividad lipasa/esterasa (figura 2.12)

[85], [86]. El equipo resultó ser confiable, portátil y reconfigurable para la inserción de nuevas

metodologías para determinar otras enzimas de interés. Además, diseñó un algoritmo contenido

en una interfaz gráfica, con el cual se permitió controlar de forma eficaz el sistema de inyección

secuencial.

Figura 2.12. Sistema SIA desarrollado por el Dr. Pliego y usado en el presente proyecto de tesis.

2.7. Optimización estadística de bioprocesos, MSR.

La planificación estadística experimental, el diseño factorial y la metodología por superficie de

respuesta (MSR) son herramientas utilizadas para investigar las relaciones matemáticas entre

las variables de entrada y salida de un sistema. En su esquema básico, la MSR investiga los

factores de entrada definidos para un biosistema de conversión desde el cual se generan factores

o respuestas de salida definidos, tales como el rendimiento del producto y la productividad. Sin

embargo, la fortaleza de la MSR es que también da información sobre cómo las interacciones

entre los factores de entrada influyen en las respuestas de salida [87].

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Cuando se desea realizar una optimización en un proceso biotecnológico, la MSR es una

poderosa herramienta que evita los sesgos experimentales y reduce el número de experimentos

requeridos [88]. En la optimización, la MSR es preferible a los métodos que perturban una

variable a la vez, ya que con estos pudieran desperdiciarse recursos al realizar un número

elevado de pruebas.

La MSR se define como la estrategia experimental y de análisis que permite encontrar las

condiciones de operación óptimas de un proceso, es decir, aquellas que dan como resultado

valores óptimos o cercanos al óptimo de una o varias características deseadas [89]. Esto se logra

mediante diseños de experimentos secuenciados que exploran el comportamiento de una

variable de respuesta en función de 2 o más factores (figura 2.13).

Figura 2.13. Visión gráfica de la metodología por superficie de respuesta [89].

La MSR puede ser aplicada en diferentes aspectos de los bioprocesos. Por ejemplo, en la

optimización de medio de cultivo, en las condiciones operacionales del proceso; así como de las

condiciones nutricionales del cultivo, entre otros [87].

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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Kluyveromyces marxianus es una levadura no-Saccharomyces que en los últimos años ha

demostrado un importante potencial para su uso industrial, ya que es una excelente productora

de metabolitos de gran interés como lo son las β-fructofuranosidasas.

Para producir enzimas como las fructanasas a nivel comercial, es necesario obtener una

concentración celular y una actividad enzimática máxima de modo que sea rentable. Sin

embargo, la forma de medir la actividad enzimática y el crecimiento de la levadura consiste en

utilizar técnicas convencionales que se realizan fuera de línea como el monitoreo por DNS en

microplaca, densidad óptica, conteo celular, etc.; y debido a que el intervalo entre la toma de

muestra y la medición no es en tiempo real, es posible que los resultados obtenidos de la

medición ya no sean representativos de lo que sucedía en el biorreactor al momento del

muestreo. En este sentido es deseable desarrollar estrategias de monitoreo en línea que faciliten

la obtención de información del cultivo en tiempo real, permitiendo tomar decisiones de manera

inmediata de modo que se ajusten las condiciones operacionales y nutricionales en un cultivo

que favorezcan la máxima producción de las enzimas de interés.

Las investigaciones sobre la producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura K.

marxianus en cultivos en continuo o lote alimentado a diversas condiciones son escasas. Por lo

que se desconocen los distintos estados fisiológicos de la levadura asociados a la actividad de

la enzima, limitando su implementación inmediata en la industria.

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4. JUSTIFICACIÓN

En las últimas décadas, la biotecnología se ha posicionado como una de las industrias de

avanzada y su repercusión en todos los ámbitos socio-económicos es cada vez más significativo.

Actualmente la biotecnología requiere de procesos que sean eficientes, productivos y óptimos,

para lograr esto se requieren de sistemas de control eficaces que mantenga la calidad del

producto, incrementando el margen de ganancia y disminuyendo la contaminación ambiental.

El desarrollo de estrategias a partir de sistemas que monitoreen el estado de la levadura en

tiempo real proveerá información y conocimiento sobre los estados fisiológicos de mayor

producción de β-fructofuranosidasas. Además, al evaluar la producción de fructanasas en

cultivos poco explorados, como en continuo y lote alimentado, permitirá definir las condiciones

y tipo de cultivo que maximicen la producción de la enzima. En general, se logrará un mayor

entendimiento sobre la levadura, facilitando su adopción a nivel industrial.

El proyecto SPECTRE tiene como objetivo desarrollar estrategias para monitorear el estado

fisiológico de los microorganismos durante fermentaciones o cultivos celulares, por lo que el

presente trabajo se alinea con este proyecto y proponemos desarrollar estrategias de monitoreo

a partir de un sistema de análisis de inyección secuencial y espectroscopia dieléctrica en línea

para favorecer la producción de β-fructofuranosidasas utilizando la levadura Kluyveromyces

marxianus SLP1 y contribuir de manera íntegra al alcance del objetivo principal.

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5. HIPÓTESIS

La evaluación de la actividad β-fructofuranosidasa en distintos sistemas de cultivo permitirá

determinar estrategias de monitoreo para favorecer la producción enzimática a partir de la

levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 con base en un sistema de análisis de inyección

secuencial y espectroscopia dieléctrica.

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6. OBJETIVOS

6.1. Objetivo principal

Desarrollar estrategias de monitoreo a partir de un sistema de análisis de inyección secuencial y

espectroscopia dieléctrica en línea para favorecer la producción de β-fructofuranosidasas

utilizando la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.

6.2. Objetivos específicos

- Evaluar la cinética de crecimiento a través de espectroscopia dieléctrica y la producción

de β-fructofuranosidasas con diferentes fuentes de carbono en cultivos en lote de la

levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.

- Determinar las condiciones de temperatura y velocidad específica de crecimiento que

maximicen la producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura K. marxianus

SLP1 en cultivo en continuo.

- Evaluar la producción de β-fructofuranosidasas de la levadura Kluyveromyces

marxianus SLP1 en cultivos en lote alimentado.

- Desarrollar una metodología de monitoreo en línea para determinar la actividad β-

fructofuranosidasa mediante un sistema de análisis de inyección secuencial

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7. METODOLOGÍA

A continuación, se presenta la metodología seguida durante el desarrollo del presente proyecto

de tesis.

7.1. Microorganismo

Para este trabajo se empleó la levadura nativa Kluyveromyces marxianus denominada SLP1,

perteneciente a la colección de microrganismos de la Unidad de Biotecnología Industrial del

Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ).

La cepa fue aislada de un proceso de fermentación de mezcal en el estado de San Luis Potosí,

México.

7.2. Medios de cultivos

El medio YPD se empleó para la activación y propagación de la cepa en fase líquida, y para el

almacenamiento de las células activas en fase sólida*1. La composición del medio se describe

en la tabla 7.1. El pH fue ajustado a 5.5 previo a su esterilización a 121 °C durante 15 minutos.

Tabla 7.1. Composición del medio YPD

Compuesto Concentración [g/L]

Glucosa 20

Extracto de levadura 10

Bactopectona 20

Agar*1 20

Se utilizó glucosa marca Sigma®, extracto de levadura marca Fluka® analytical, bactopectona y

agar marca BD®. Los experimentos realizados para el cumplimiento de los objetivos de este

trabajo se realizaron con un medio químicamente definido (medio mineral). La composición del

medio se detalla en la tabla 7.2. Para el estudio del impacto de la fuerte de carbono en la

producción de fructanasas, se emplearon carbohidratos de distinta complejidad molecular

(glucosa, fructosa, sacarosa, inulina de achicoria y fructanos de agave)*2 a una concentración de

20 g/L en cada caso. Para el resto de los experimentos se empleó glucosa como fuente de

carbono, donde se varió la concentración en dependencia con el ensayo*3.

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Tabla 7.2. Composición del medio químicamente definido

Fuente de carbono Concentración [g/L]

Glucosa*2 20*3

Sales principales Concentración [g/L]

KH2PO4 3.0

(NH4)2SO4 3.0

Na2HPO4 · 2H2O 1.5

Glutamato de Sodio 1.0

Oligoelementos Concentración [g/L]

MgCl2 · 6H20 0.4122

ZnCl2 0.0192

CaCl2 0.0174

FeCl2 · 4H2O 0.0117

MnCl2 · 4H2O 0.0044

CuCl2 · 2H2O 0.0006

CoCl2 · 6H2O 0.0005

(NH4)6Mo7O24 · 4H2O 0.0004

H3BO3 0.0030

Vitaminas Concentración [g/L]

Ácido 4-aminobenzoico 0.001

Mioinositol 0.125

Ácido nicotínico 0.005

Ácido pantoténico 0.005

Piridoxina 0.005

Tiamina HCl 0.005

Biotina 0.000012

Todos los compuestos son de la marca Sigma®. Las sales principales disueltas en el volumen de

trabajo de agua bidestilada fueron ajustadas a pH 4.5 y al igual que la fuente de carbono se

esterilizaron mediante calor húmedo a una temperatura de 121 °C durante 15 minutos. Los

oligoelementos y las vitaminas fueron esterilizadas en soluciones concentradas mediante

ultrafiltración a un tamaño de poro de 0.22 µm y de manera separada.

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7.3. Banco de trabajo del microorganismo

Para mantener una reserva viable de la cepa Kluyveromyces marxianus SLP1, se procedió a

realizar un banco de trabajo bajo el siguiente procedimiento:

1. Un criovial mantenido a -80 °C con la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1

perteneciente a la colección de microrganismos de la Unidad de Biotecnología Industrial

de CIATEJ fue descongelado. Primeramente, mantenido a -20 °C y posteriormente a 4

°C, durante 24 horas en cada caso.

2. El criovial descongelado fue empleado para inocular dos matraces de 500 ml con 100

ml cada uno de medio YPD, obtenido de SIGMA®, el cual contenía 20 g/L de glucosa,

10 g/L de extracto de levadura y 20 g/L de bactopectona, ajustado a pH de 5.5.

3. Los matraces se colocaron en un orbital rotatorio New Brunswick® Innova 44 por 24

horas a 30 °C y una agitación de 250 rpm.

4. Se inocularon con 1 ml del cultivo anterior dos matraces de 500 ml con 100 ml cada uno

de medio YPD, y fueron incubados a las condiciones antes descritas durante 12 horas.

5. Finalmente, se colocó 1.5 ml de una mezcla 1:1 del cultivo anterior y glicerol estéril

(SIGMA-ALDRICH®) en crioviales CORNING® de 2 mL. Cada criovial contenía un

aproximado de 3 x 108 células. Los crioviales con la cepa fueron almacenados a una

temperatura de -80 °C en un ultracongelador Thermo Scientific® 88000 para su

conservación.

7.4. Activación de cepa

Para la activación de la cepa Kluyveromyces marxianus SLP1 se realizó mediante la siguiente

metodología:

1. Un criovial del banco de trabajo fue descongelado en dos pasos; primeramente,

mantenido a -20 °C y posteriormente a 4 °C, durante 24 horas en cada temperatura.

2. El criovial descongelado fue empleado para inocular dos matraces de 500 ml con 100

ml cada uno de medio YPD, obtenido de SIGMA ALDRICH ®, ajustado a pH de 5.5.

3. Los matraces se colocaron en un orbital rotatorio New Brunswick® Innova 44 por 24

horas a 30 °C y una agitación de 250 rpm.

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4. Se realizó una dilución con agua estéril del cultivo anterior a fin de conseguir una

densidad de población de 100-300 cel/ml en el diluido.

5. Se inocularon mediante extensión en placa, dos cajas Petri con medio sólido YPD con

100 µl cada una del diluido anterior, y fueron incubadas a 30 °C durante 48 horas en una

incubadora Terlab® MA450.

Las cajas Petri se emplearon como reservorio de células activas como máximo durante dos

meses. Pasado ese tiempo se reactivaba otro criovial en caso de ser necesario.

7.5. Preparación del inóculo

Para la preparación del inóculo para los cultivos de los diferentes experimentos se realizó

mediante la siguiente metodología:

1. Se inocularon con 2 UFC dos matraces de 500 ml con 100 ml cada uno de medio YPD,

se colocaron en un orbital rotatorio New Brunswick® Innova 44 por 12 horas a 30 °C y

una agitación de 250 rpm.

2. Se inocularon con 1 ml del cultivo anterior dos matraces de 500 ml con 100 ml cada uno

de medio mineral, y fueron incubados a las condiciones antes descritas durante 10 horas.

Después de la incubación los matraces tienen una población aproximada de 4 x 108 cel/ml, con

los cuales se inocularon los biorreactores a una densidad de 2 x 107 cel/ml.

7.6. Preparación del biorreactor e instrumentación

Los experimentos se llevaron a cabo en un biorreactor marca Applikon® con una capacidad

máxima de 3 L equipado con sensores de oxígeno disuelto, pH, temperatura y permitividad

dieléctrica (FOGALE® nanotech). Antes de su uso, el biorreactor fue lavado con agua corriente,

enjuagado con agua bidestilada y después rociado con etanol al 70%, para finalmente dejarlo a

secar a temperatura ambiente. Antes de la esterilización, los sensores de pH, temperatura y 0%

de saturación de oxígeno fueron calibrados según el procedimiento para la bioconsola

Applikon® ADI 1030; la cual fue empleada para el control y/o monitoreo del pH, saturación de

oxígeno, temperatura y agitación.

Una vez seco el biorreactor, se vertió en el vaso un 90% del volumen de trabajo de una solución

de las sales principales del medio mineral ajustado a pH 4.5 (el volumen restante corresponde a

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las soluciones de fuente de carbono, oligoelementos, vitaminas e inoculo vertidas posterior a la

esterilización). La tapa adaptada con los sensores, las propelas, los deflectores (bafles), sistema

de aireación (entrada y salida), sistema de toma de muestra, solución 1M NaOH para el control

de pH (debido a la naturaleza del cultivo que solo tiende a acidificar el medio, no se requirió del

empleo de soluciones ácidas) y conexión para la alimentación de medio fresco si el experimento

lo requiere (cultivo en lote alimentado y continuo). Toda la tubería empleada fue de silicón

MasterFlex® #16 y/o #14. Se procedió al armado del biorreactor tomando las medidas de

seguridad pertinentes, tales como el sellado de las líneas en contacto con el medio mediante

pinzas y un cierre no hermético para evitar sobrepresión en el sistema. Finalmente, se esterilizó

el biorreactor a 121 °C durante 15 minutos en una autoclave Yamato® SM510.

Después del ciclo de esterilización, el biorreactor fue sellado para asegurar un cierre hermético

y llevado al área de trabajo, donde se enfrió. Se realizaron las conexiones correspondientes de

los sensores, el sistema de agitación, el sistema de control de temperatura (constituido por un

recirculador Jalubo® F25 y una manta eléctrica Applikon®), adición de solución básica para el

control de pH y el sistema de aireación (constituida por un compresor para pecera o por el

servicio de aire comprimido del laboratorio de planta piloto, según el experimento).

Una vez conectado los sensores y servicios del biorreactor, se procedió a ajustar las condiciones

del experimento tales como temperatura, pH, agitación y aireación. Pasadas entre 12 – 24 horas

del ajuste de condiciones, se procedió a calibrar el 100% de la saturación de oxígeno. Finalmente

se vertió en el biorreactor, bajo flama, las soluciones estériles de la fuente de carbono,

oligoelementos y vitaminas empleando el acceso dedicado para la inoculación. Después de este

procedimiento el biorreactor se encontró en condiciones de ser inoculado.

7.7. Técnicas analíticas

7.7.1. Monitoreo de biomasa

7.7.1.1. Conteo celular en cámara de Neubauer

Esta técnica se utilizó para cuantificar mediante conteo directo el crecimiento de la población

celular. Una alícuota de una muestra tomada del reactor fue depositada en una cámara de

Neubauer Marienfeld®, posteriormente se observó en un microscopio Leica® CME con un

objetivo de 40x. Se realizó el conteo sobre 15 cuadros, filas 1, 3 y 5 (figura 7.1). Cuando el

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conteo resultó alto (> 300), se realizó una dilución de la muestra. Cada conteo se realizó por

duplicado.

Para calcular la población celular en la muestra se empleó la siguiente fórmula:

𝑃𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (∗ 106 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝑙) = 𝐶

15⁄ ∗ 0.25 ∗ 𝐷

Donde:

C = conteo de células en los 15 cuadros.

D = dilución empleada en la muestra.

Figura 7.1. Rejilla de conteo de la cámara de Neubauer y recuadros contados (gris).

7.7.1.2. Densidad óptica

El perfil de crecimiento se cuantificó mediante el cambio de la absorbancia de las muestras a

través del tiempo. La lectura se realizó a una longitud de onda de 600 nm sobre una muestra de

200 µl en un pozo de una microplaca. El equipo utilizado fue un espectrómetro de microplacas

xMark® de Bio-Rad®. Cuando la absorbancia fue mayor a 1, se diluyó la muestra. Cada lectura

se realizó por duplicado.

7.7.1.3. Peso seco

El perfil de generación de biomasa durante el cultivo se realizó mediante la técnica de peso seco.

De cada muestreo del reactor, el volumen no necesitado para los análisis (entre 5 y 10 ml) fue

medido y centrifugado a 4,000 rpm en una centrífuga Applikon® 5810R con un rotor A481

durante 15 minutos. El sobrenadante fue almacenado a -20 °C y la pastilla fue resuspendida en

1

2

3

4

5

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5 ml de agua destilada. Se repitió el procedimiento de centrifugado, la pastilla fue resuspendida

en 5 ml de agua destilada y vertido dentro de un vaso de plástico desechable de 30 ml,

previamente etiquetado y puesto a peso constante. El tubo empleado para centrifugar la muestra

fue lavado con 5 ml de agua destilada y posteriormente el líquido vertido al vaso de la muestra;

esto se hizo con el objetivo de minimizar las pérdidas de biomasa.

El vaso con la muestra fue puesto en un horno Felisa® a 50 °C por 48 horas. Después el vaso se

colocó en un desecador durante 2 horas para ser enfriado sin ganar humedad. El vaso con la

muestra fue pesado en una balanza analítica AND® GR-200.

Para realizar el cálculo del peso seco en la muestra se empleó la siguiente fórmula:

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑆𝑒𝑐𝑜 (𝑔

𝐿⁄ ) = (𝑃2 − 𝑃1

𝑉𝑚) ∗ 1000

Donde:

P2 = gramos del vaso y la muestra a peso constante.

P1 = gramos del vaso a peso constante.

Vm = mililitros de muestra empleada.

7.7.1.4. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®)

El seguimiento de la cinética de crecimiento poblacional también se siguió mediante un equipo

contador de partículas de la marca Innovartis modelo CASY® TT. Después de conocer la

concentración de células en la muestra mediante el conteo en cámara de Neubauer, se realizó

una dilución de manera que hubiese un volumen de 10 ml a una concentración máxima de 106

células/ml en el buffer especial libre de partículas CASYton® y vertido en el recipiente especial

libre de partículas CASYcup®.

La muestra preparada fue colocada en el equipo para realizar las lecturas, las cuales consistieron

en tres mediciones donde se realiza el conteo de partículas en un volumen de 200 µl de manera

automática. El equipo arroja el promedio de los conteos de las tres lecturas; así como un

histograma con la distribución de tamaño de las partículas (células) contabilizadas.

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50

7.7.1.5. Espectroscopia dieléctrica.

El perfil de crecimiento en tiempo real se llevó a cabo monitoreando la permitividad mediante

la sonda de espectroscopia dieléctrica FOGALE® nanotech, la cual estaba conectada a su

terminal EVO® Box y controlado por el software EVO® 400 para registrar los datos generados

por la sonda. Esta técnica también permitió determinar la viabilidad del cultivo en el biorreactor

durante la cinética.

7.7.2. Consumo de sustrato

El perfil de consumo de sustrato se siguió mediante la determinación de la concentración de los

azúcares reductores totales en las muestras extraídas del biorreactor. El método de

determinación que se usó fue mediante el ácido 3, 5 – dinitrosalicílico (DNS) desarrollado por

Miller y col [90]. El DNS se reduce en presencia del grupo reductor de sustrato (glucosa y/o

fructosa) formando ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, el cual tiene una coloración característica y

puede determinarse por espectrofotometría a 540 nm.

La tabla 7.3 muestra los compuestos y su concentración para la preparación del reactivo DNS.

Cada compuesto fue añadido en el orden señalado y después de que el anterior fue

completamente disuelto. Se evitó la exposición a la luz en todo momento.

Tabla 7.3. Compuestos del reactivo DNS.

Compuesto Concentración [g/L]

NaOH 10

Tartrato de Na y K 200

Meta-bisulfito de Na 0.5

Fenol 2

Ácido 3,5 -

dinitrosalicílico 10

Todos los compuestos fueron marca Sigma®, excepto el Meta-bisulfito de sodio marca J.T.

Baker®. El reactivo DNS preparado se almacenó a 4 °C y protegido de la exposición de la luz.

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La metodología que se siguió para esta técnica fue la siguiente:

1. La muestra del reactor se centrifugó a 4,000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga

Applikon® 5810R con un rotor A481. El sobrenadante fue separado de la pastilla celular

por decantación. La pastilla fue procesada por la técnica de peso seco.

2. Se tomó una alícuota de 100 µl del sobrenadante y se colocó en un microtubo de 1.6 ml.

3. Se añadieron 100 µl del reactivo DNS y se homogenizó.

4. La mezcla fue colocada en un baño maría a 95 °C durante 5 minutos, para después ser

puesta en hielo durante 5 minutos para detener la reacción.

5. Se añadió 800 µl de agua destilada al microtubo y se homogenizó la mezcla.

6. En el pozo de una microplaca se colocó 200 µl de la mezcla anterior y fue leída a 540

nm en un espectrofotómetro de microplacas xMark® de Bio-Rad®.

La muestra fue analizada por triplicado y comparada contra una curva de calibración que se

construyó con concentraciones de glucosa de 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L. En cada experimento

se construyó una nueva curva de calibración con un ajuste mayor a 0.98. En los casos que la

concentración de azúcares reductores de la muestra fue mayor que el de la curva, se diluyó la

muestra y se repitió el procedimiento.

7.7.3. Actividad β-fructofuranosidasa

El seguimiento de la producción de las enzimas de interés, β-fructofuranosidasas, se realizó

mediante la detección del producto de su actividad enzimática: un azúcar reductor. La

metodología para la determinación de la actividad fructanasa se describe a continuación:

1. Del sobrenadante (extracto enzimático) que se obtuvo de la centrifugación de la muestra

del reactor, 50 µl en un microtubo y se añadió 50 µl de sustrato (100 mM acetato de

sodio + 100 mM ácido acético + 1 g/L de sacarosa, pH 5.0). Se homogenizó la muestra.

El blanco solo contuvo 50 µl de sustrato. Si el extracto enzimático estaba almacenado a

-20 °C, fue puesto a 4 °C durante 24 horas previo a su análisis.

2. La mezcla se incubó a 50 °C durante 15 minutos en un incubador Thermo-Shaker® MS-

100.

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3. Después de la incubación, se colocaron las muestras en hielo durante 2 minutos para

detener la reacción y se agregó 100 µl del reactivo DNS. Se homogenizó la mezcla.

4. Al blanco se agregó 50 µl de extracto enzimático.

5. La mezcla fue colocada en un baño maría a 95 °C durante 5 minutos, para después ser

puesta en hielo durante 5 minutos para detener la reacción.

6. Se añadió 800 µl de agua destilada al microtubo y se homogenizó.

7. En el pozo de una microplaca se colocó 200 µl de la mezcla anterior y fue leída a 540

nm en un espectrofotómetro de microplacas xMark® de Bio-Rad®.

La muestra fue analizada por triplicado y comparada contra una curva de calibración de azúcares

reductores. En cada experimento se construyó una nueva curva de calibración con un ajuste

mayor a 0.98.

Para el cálculo de las unidades de actividad enzimática en la muestra se empleó la siguiente

fórmula:

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 =𝑈

𝑚𝑙=

𝜇𝑚𝑜𝑙

𝑚𝑖𝑛 ∙ 𝑚𝑙=

𝐹 ∙ 𝑉𝑟𝑥

𝑀𝑤 ∙ 𝑡 ∙ 𝑉𝑒

Donde:

F = concentración de glucosa y/o fructosa liberada.

Vrx = volumen de reacción.

Mw = peso molecular de la glucosa.

t = tiempo de incubación.

Ve = volumen de extracto enzimático.

7.8. Cultivos en lote en biorreactor

Para evaluar el comportamiento y los parámetros cinéticos del crecimiento de la levadura

Kluyveromyces marxianus SLP1, así como estudiar la producción de las β-fructofuranosidasas

en dependencia de la fuente de carbono. Se lanzaron 5 cultivos en lote donde las fuentes de

carbono empleadas fueron: glucosa, fructosa, sacarosa, inulina y fructanos de agave (FA). En

cada caso la concentración inicial fue de 20 g/L. La selección de las fuentes se realizó con base

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en la complejidad de la molécula; desde las más sencillas y comunes como la glucosa y fructosa,

hasta la más compleja como lo son la inulina y FA. Además, se considera que FA e inulina

pueden funcionar como un inductor para la producción de fructanasas [62], [91], [92]. Como

medio de cultivo se utilizó medio mineral. Las condiciones para el crecimiento se mantuvieron

constantes en pH 4.5, temperatura 30 °C, aireación 1 vvm (el aire fue suministrado por una

bomba para pecera y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y agitación

500 rpm. Se siguió la cinética de crecimiento desde la inoculación hasta el comienzo de la fase

estacionaría, tomando una muestra de 10 ml del biorreactor cada hora. Los parámetros

monitoreados fueron pH, temperatura, oxígeno disuelto, permitividad y gases exhaustos

mediante sensores en línea; biomasa mediante conteo celular (microscopía y sistema CASY),

densidad óptica y peso seco; azúcares reductores y actividad fructanasa.

7.9. Cultivos en estado continuo en biorreactor

La determinación de los parámetros para favorecer la producción de las fructosidasas de interés,

se realizó mediante la ejecución de un diseño de experimentos tipo factorial 23 (tres factores con

2 niveles cada uno) con cuatro puntos al centro a fin de lograr los grados de libertad suficientes

para una adecuada validez estadística. Los factores que se variaron fueron: velocidad específica

de crecimiento (0.05 h-1 y 0.40 h-1, con 0.225 h-1 como punto al centro), la cual se controló

mediante la tasa de dilución del medio en el cultivo, que su vez fue controlado mediante el flujo

de alimentación (75 ml/h y 600 ml/h, con 337 ml/h como punto central; para un volumen de

trabajo de 1.5 L); la temperatura de crecimiento (26 °C y 34 °C, con 30 °C como punto al centro),

y la concentración de glucosa en el medio de alimentación (20 g/L y 60 g/L, con 40 g/L como

punto al centro). La tabla 7.4 muestra la combinación y orden de las condiciones probadas.

La cinética se inició con un cultivo en lote. Al agotarse la fuente de carbono se comenzó la

alimentación de medio de cultivo fresco. El muestreo se realizó por triplicado para cada

condición, el cual fue tomado después de haber alcanzado el estado estacionario, haberse

recambiado el volumen del reactor un mínimo de tres veces (3 tiempos de residencia) y no

haberse presentado ninguna perturbación que afectara el estado estacionario. El resto de

condiciones para el crecimiento se mantuvieron constantes en pH 4.5, aireación 1 vvm (el aire

fue suministrado por una bomba para pecera y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su

esterilización) y agitación 500 rpm. Los parámetros monitoreados fueron pH, temperatura,

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oxígeno disuelto, permitividad y gases exhaustos mediante sensores en línea; biomasa mediante

conteo celular (microscopía y sistema CASY), densidad óptica y peso seco; azúcares reductores

y actividad fructanasa.

Tabla 7.4. Combinación de factores para el diseño experimental 23.

Muestra Temperatura,

°C

Velocidad específica de

crecimiento, h-1

Concentración de

glucosa, g/L

T1 26 0.05 20

T2 34 0.05 20

T3 34 0.40 20

T4 26 0.40 20

T5 26 0.05 60

T6 26 0.40 60

T7 34 0.05 60

T8 34 0.40 60

T9 30 0.225 40

T10 30 0.225 40

T11 30 0.225 40

T12 30 0.225 40

Con el objetivo de verificar las condiciones de mayor producción de β-fructofuranosidasas de

interés arrojadas por el cultivo en estado continuo descrito anteriormente, se realizó otro cultivo

en lote alimentado donde se varió la temperatura de crecimiento (30, 34 y 38 °C) y la velocidad

específica de crecimiento (0.05 y 0.09 h-1), controlado mediante el flujo de alimentación (110

ml/h y 198 ml/h, respectivamente; para un volumen de trabajo de 2.2 L). La concentración de

glucosa en la alimentación se mantuvo constante. Cabe mencionar que se pretendía aplicar un

diseño tipo factorial 22 (dos factores con dos niveles) con puntos al centro, pero en un análisis

costo/beneficio se determinó truncar el diseño a sólo 4 condiciones La tabla 7.5 muestra la

combinación y orden las condiciones probadas.

La cinética se inició con un cultivo en lote. Al agotarse la fuente de carbono se comenzó la

alimentación de medio de cultivo fresco. El muestreo se realizó por triplicado y bajo la misma

descripción mencionada anteriormente. El resto de condiciones para el crecimiento se

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mantuvieron constantes en pH 4.5, aireación 2 vvm (el aire fue suministrado por mediante el

sistema de aire comprimido del laboratorio y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su

esterilización) y agitación 550 rpm. Los parámetros monitoreados fueron pH, temperatura,

oxígeno disuelto y permitividad; biomasa mediante conteo celular y peso seco; azúcares

reductores y actividad fructanasa en línea (ver sección 7.11) y fuera de línea.

Tabla 7.5. Condiciones de los experimentos aplicados en el segundo cultivo en continuo.

Muestra Temperatura,

°C

Velocidad específica de

crecimiento, h-1

T1 34 0.05

T2 30 0.05

T3 38 0.05

T4 34 0.09

Para mantener el volumen del cultivo constante se empleó un sistema por diferencia de peso. El

sistema consistió en una balanza Torrey®, sobre el cual se encontraba el biorreactor y que fue

tarada al comienzo del cultivo en continuo, y dos bombas peristálticas MasterFlex® (una para la

alimentación y otra para extraer el volumen de cultivo excedente). Los tres elementos estaban

conectados a una computadora y controlados mediante un programa diseñado sobre la

plataforma del software LabView® v.11.0 de National Instruments. La velocidad del flujo de

alimentación de medio fresco al biorreactor se controló mediante una de las bombas,

manteniéndose constante dependiendo de la velocidad específica de crecimiento necesaria. Al

incrementarse el peso del biorreactor por encima de un valor fijado (2 gramos en los

experimentos), la segunda bomba se activaba para extraer el volumen excedente hasta reducir

el peso del biorreactor al valor fijado. Repitiéndose el ciclo nuevamente. Cabe aclarar que para

que esta estrategia de control fuera efectiva, la velocidad de salida siempre fue mayor que la

velocidad de flujo de entrada y durante todo el tiempo de los cultivos se tuvo la precaución de

no tener perturbaciones externas sobre el peso del biorreactor.

7.10. Cultivos en lote a temperatura óptima

Para evaluar el comportamiento del crecimiento de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1

a la temperatura óptima encontrada por el diseño experimental de los cultivos en continuo, así

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como estudiar la producción de fructanasas durante la fase estacionaria, se lanzaron 2 cultivos

en lote con glucosa como fuente de carbono a 20 g/L. Como medio de cultivo se utilizó medio

mineral. Las condiciones para el crecimiento se mantuvieron constantes en pH (4.5),

temperatura (34 °C), aireación (1 vvm, el aire fue suministrado por una bomba para pecera y

filtrado por una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y agitación (500 rpm). Se siguió

la cinética de crecimiento desde la inoculación hasta el comienzo de la fase estacionaría,

tomando una muestra de 10 ml del biorreactor cada hora. Durante la fase estacionaria, el

muestreo se realizó de manera más espaciada cada 6 ó 10 horas. El primer cultivo se mantuvo

durante 65 horas, el segundo cultivo hasta la hora 100. Los parámetros monitoreados fueron pH,

temperatura, oxígeno disuelto y permitividad (en el segundo cultivo no se pudo medir la biomasa

por permitividad debido a que no se encontraba disponible el sensor de espectroscopia

dieléctrica); biomasa mediante conteo celular (microscopía y sistema CASY), densidad óptica

y peso seco; azúcares reductores y actividad β-fructofuranosidasa.

Las muestras del segundo cultivo fueron procesadas mediante la metodología de detección de

actividad proteasa (anexo A) y actividad fructanasa; después las muestras de sobrenadante

fueron dializadas durante 36 horas a 4 °C en una solución tampón de 50 mM citrato de sodio

pH 4.5, con recambios de solución cada 12 horas y reanalizadas para actividad fructanasa. Esto

con el objetivo de determinar el efecto del sobrenadante sobre la técnica de actividad.

7.11. Cultivos en lote alimentado

Con el objetivo de estudiar la producción de β-fructofuranosidasas mediante la levadura

Kluyveromyces marxianus SLP1 en un ambiente limitado en fuente de carbono, y probar las

condiciones óptimas arrojadas por los biorreactores en estado continuo en un tipo diferente de

alimentación, se realizaron 2 cultivos en lote alimentado. El primer cultivo se hizo a una

temperatura de 34 °C, un volumen inicial de 1 litro, flujo constante de alimentación de ~70 ml/h

(fue el mínimo flujo permitido por la configuración de la bomba MasterFlex® en ese momento),

la concentración de la fuente de carbono en la alimentación fue de 100 g/L de glucosa, la

aireación fue constante durante la cinética a 1.6 L/min (el aire fue suministrado por un

compresor para pecera y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y la

agitación fue variable en dependencia con la saturación de oxígeno disuelto (inicial 500 rpm,

final 800 rpm). El segundo cultivo se realizó a una temperatura de 34 °C, un volumen inicial de

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1 litro, flujo constante de alimentación de ~17 ml/h (se modificó el cabezal de la bomba

MasterFlex® para reducir el flujo mínimo), la concentración de la fuente de carbono en la

alimentación fue de 100 g/L de glucosa, la aireación fue constante durante la cinética a 3.1 L/min

(el aire fue suministrado mediante el sistema de aire comprimido del laboratorio y filtrado por

una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y la agitación fue constante a 800 rpm. Se

siguieron las cinéticas de crecimiento hasta el límite máximo del volumen del biorreactor que

las condiciones permitieron (~2.2 L) tomando una muestra (10 ml) cada 1.5 horas en el primer

cultivo y cada 4 horas en el segundo. Las cinéticas se iniciaron con un cultivo en lote. Al agotarse

la fuente de carbono se comenzó la alimentación de medio de cultivo fresco. Los parámetros

monitoreados fueron pH, temperatura, oxígeno disuelto, permitividad y gases exhaustos

mediante sensores en línea; biomasa mediante conteo celular (microscopía), densidad óptica y

peso seco; azúcares reductores y actividad fructanasa.

7.12. Monitoreo de actividad β-fructofuranosidasa en línea

Para el monitoreo de la actividad β-fructofuranosidasa en línea se desarrolló una metodología

en un sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) cuyo diseño de software y hardware

fue desarrollado por Pliego y col dentro de su proyecto de doctorado [85]. De manera general,

el sistema SIA se conforma por una bomba peristáltica de microflujo para inyección/succión,

dos válvulas multiposición, una fuente emisora de luz de halógeno, un espectrofotómetro, una

bobina de calentamiento termostatizada, una cámara de resguardo y una cámara de mezclado.

El sistema fue controlado mediante un algoritmo diseñado en el software LabView® v.11.0 de

National Instruments. El diseño original de hardware fue adaptado para agregar una cámara de

calentamiento y una de enfriamiento. La figura 7.2 muestra la configuración y descripción de

los componentes del sistema SIA que se empleó en la implementación de la metodología para

el monitoreo de la actividad fructanasa en línea.

La metodología desarrollada para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en línea

consistió en adaptar la metodología descrita en la sección 7.7.3, por lo que para la validación de

la técnica desarrollada en el sistema SIA se comparó contra la metodología mencionada. Debido

a la naturaleza corrosiva del fenol, no se empleó en la preparación del reactivo DNS utilizado

en el sistema SIA.

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Para la determinación de la actividad fructanasa, fue necesario realizar una serie de secuencias

ordenadas que se describen a continuación de forma breve:

1. Una muestra de sobrenadante (m) libre de células proveniente del biorreactor fue

bombeada hacia la cámara de retención del sistema SIA.

2. Se realizó una dilución automática con acarreador, agua (a), en función del tiempo del

cultivo y fue homogenizada en la cámara de mezclado.

3. La muestra diluida (md) fue mezclada a partes iguales con el sustrato (s) mediante ciclos

de succión md/s/md/s.

4. La mezcla fue inyectada a la cámara de incubación, donde se mantuvo a 50 ± 2 °C

durante 15 minutos.

5. La muestra incubada (mi) fue hacia la cámara de retención y mezclada con el reactivo

DNS (r) en ciclos de succión mi/r/mi/r.

6. La mezcla fue inyectada a la cámara de calentamiento, donde se mantuvo a 93 ± 2 °C

durante 5 minutos.

7. Después la mezcla fue inyectada a la cámara de enfriamiento donde se mantuvo en hielo

durante 1 minuto.

8. La mezcla anterior fue diluida en relación 1:4 con acarreador y homogenizada en la

cámara de mezclado.

9. Finalmente, la muestra fue inyectada al detector donde fue leída a 540 nm.

De cada lectura resultó una gráfica de amplitud contra tiempo. El área bajo la curva de la gráfica

es directamente proporcional con la actividad fructanasa. Para el cálculo del área bajo la curva,

los datos fueron exportados al software MatLab® R2014b y analizados con el comando trapz,

el cual devuelve la integral aproximada de una función a través del método trapezoidal. El área

calculada fue comparada con una curva de calibración realizada en el sistema SIA. Las unidades

de actividad β-fructofuranosidasa se calcularon con la ecuación mostrada en la sección 7.7.3.

Después de cada análisis se realizó un ciclo de limpieza para eliminar cualquier traza de la

muestra anterior. La muestra se obtuvo a través de una sonda de cerámica Applikon® acoplada

al biorreactor, la cual permitió obtener un sobrenadante filtrado libre de células. En la figura 7.2

se esquematizan los puntos anteriores. En los resultados se profundizará en los detalles de la

metodología final.

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Válvula multiposición

Su

stra

to

Re

activo

Cámara de retención

Cámara de calentamiento

Cámara de enfriamiento

Bomba

Cámara de mezclado

Cámara de incubación

Válvula multiposición

Fuente de luz

Detector

1

2

4

5

6 7

8

9

Acarr

ea

dor

De

sech

os

Sonda de muestreo

Válvula multiposición

3

Figura 7.2. Descripción del sistema de análisis de inyección secuencial (SIA).

Se desarrolló la metodología para una curva de calibración generada en el sistema SIA. La curva

se construyó con 5 puntos con concentraciones de glucosa de 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L. Cada

concentración fue tratada con los puntos del 5 al 9 de la metodología antes descrita. Cada punto

se realizó por cuadriplicado y las áreas obtenidas fueron analizadas mediante el software

Statgraphics® Centurion XVI para la obtención de una línea de regresión para la concentración

de glucosa/fructosa liberada en función del área bajo la curva.

A continuación, se describen los resultados y discusión de los experimentos realizados en este

proyecto con la metodología descrita.

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8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En esta sección serán presentados los resultados de los experimentos efectuados para el

cumplimiento de los objetivos de este proyecto. Se presentan primero los resultados de la

producción de β-fructofuranosidasas en función de la fuente de carbono; así como correlaciones

de diversas técnicas de medición de la biomasa contra la permitividad. A continuación, se

describen los resultados de los reactores en continuo donde se verifican las condiciones de

máxima producción de fructanasas. Después, se detallará el perfil crecimiento y de actividad β-

fructofuranosidasa en reactores en lote alimentado. Finalmente se describirá el desarrollo de la

metodología para el monitoreo de la actividad β-fructofuranosidasa en línea durante un cultivo

en biorreactor.

8.1. Cultivos en lote en biorreactor y pruebas con diferentes fuentes de carbono

Se muestran a continuación los resultados de los 5 biorreactores con diferentes fuentes de

carbono. Para cada caso, se presentan las curvas de las distintas técnicas para el seguimiento de

la cinética de crecimiento, además de una tabla con la correlación lineal existente entre ellas a

un 95% de confianza; cuanto más próximo a 1, mayor será la correspondencia entre los métodos.

El valor en cada celda en la tabla indica la proporcionalidad entre el elemento de la columna y

el del renglón en el cual se encuentra. Las unidades en las tablas para cada parámetro son los

siguientes: permitividad, pF/cm; peso seco, g/l; DO, absorbancia; conteo en cámara (Neubauer)

y sistema CASY®, millones de células/ml; y actividad enzimática, U/ml, De manera separada,

se graficó la generación de biomasa por peso seco y permitividad contra la actividad enzimática

y el consumo de sustrato. Cabe recordar, que la permitividad es de especial importancia pues es

un método que permite el seguimiento del crecimiento del microrganismo cultivado in situ y en

tiempo real; por lo que una buena correlación con técnicas de monitoreo para diferentes

parámetros es deseable.

8.1.1. Cultivo en lote con glucosa como fuente de carbono

El primer cultivo en lote que se realizó se empleó glucosa a una concentración de 25 g/L. En la

figura 8.1 se muestran los resultados obtenidos de este experimento, se observó que, durante la

fase exponencial los métodos de conteo en cámara, densidad óptica y permitividad siguen el

mismo comportamiento; la curva de peso seco se desvío debido a variaciones metodológicas

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durante el procedimiento. Debido a problemas que se presentaron con el sistema CASY, no se

obtuvieron datos de conteo celular para este cultivo mediante ese método. No se repitieron las

condiciones para este reactor, puesto que los objetivos de estos experimentos fue tener una idea

general del comportamiento de la actividad enzimática en función de la fuente de carbono. La

máxima velocidad específica de crecimiento fue de 0.39 h-1, lo que es menor a lo que se reporta

por otros autores [26], [93]; esto se puede deber a factores que limitaron la velocidad de

crecimiento, tal como la saturación de oxígeno; en las referencias señaladas la aireación se

realizó con oxígeno puro manteniendo la saturación mínima de 40%.

Figura 8.1. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con glucosa.

En la tabla 8.1 se demuestra una correlación mayor al 97%, entre las técnicas de permitividad,

densidad óptica y conteo en cámara. La correlación con el peso seco fue menor debido a lo

expresado en el párrafo anterior. La tabla también indica que la actividad enzimática no presentó

una relación lineal con la biomasa cuando se usa glucosa como fuente de carbono, lo que indica

que la actividad enzimática se ve afectada por otros factores además de la concentración de

biomasa.

En la figura 8.2 se muestra que al agotarse la fuente de carbono se detiene el crecimiento celular,

lo que acurre aproximadamente 7 horas después de iniciado el cultivo. La curva de actividad

enzimática muestra variación en las primeras horas del cultivo, esto se debe a que la glucosa

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aún presente en el medio interfiere con la técnica y no es posible detectar variaciones de pocas

décimas de unidad de actividad en dichas condiciones. Por otro lado, se observó que al agotarse

el sustrato la actividad tiende a incrementarse, situándose en 1.5 U/ml (0.25 U/mg de biomasa

seca) al final del cultivo. La mayoría de los trabajos relacionados con la producción de β-

fructofuranosidasas empleando glucosa como fuente de carbono y en cultivos en lote han sido

realizados con cepas de Kluyveromyces mutantes, alcanzando actividades de 0.9 U/mg [94] y

0.11 U/mg [63]; mientras que con una cepa nativa se alcanzó una actividad de 0.6 U/ml [95].

Tabla 8.1. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para el

cultivo en lote utilizando glucosa como fuente de carbono

Permitividad

0.8616 Peso seco

0.9867 0.8823 DO

0.9906 0.8432 0.9734 Conteo en cámara

0.5898 0.6557 0.6213 0.6022 Actividad

Figura 8.2. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con glucosa.

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8.1.2. Cultivo en lote con fructosa como fuente de carbono

El cultivo en lote se realizó con una concentración de 25 g/L de fructosa. En la figura 8.3 se

observa que, durante toda la cinética los métodos de seguimiento del crecimiento celular fueron

similares entre sí. La curva de conteo en cámara de Neubauer se separó del resto de curvas

debido a la escala; por tanto, la curva obtenida del sistema CASY y de conteo en cámara están

asociadas al mismo eje vertical (Mcel/ml), y debido a que el sistema CASY no discrimina las

células de otras partículas genera un conteo mayor debido los fragmentos celulares acumulados

durante la cinética. La máxima velocidad específica de crecimiento fue de 0.41 h-1, que es

similar a lo reportado por la literatura para esta levadura [93].

Figura 8.3. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con fructosa.

En la tabla 8.2 se muestra las correlaciones lineales entre los sistemas de medición de biomasa,

los resultados obtenidos son próximos al 99% entre todas las técnicas de monitoreo de la cinética

de crecimiento. Así mismo, se realizó la correlación de la actividad enzimática contra el

crecimiento celular utilizando todas las técnicas de medición. Como se observa en la tabla 8.2

la actividad enzimática no está relacionada de manera proporcional con la biomasa cuando se

usa fructosa como fuente de carbono, aunque la correlación es mayor que la que se presenta con

glucosa; aunque al igual que con glucosa, la actividad enzimática debe responder también a

otros factores.

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64

Tabla 8.2. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para el

cultivo en lote utilizando fructosa como fuente de carbono

Permitividad

0.9978 Peso seco

0.9957 0.9963 DO

0.9982 0.9959 0.9950 Conteo en cámara

0.9895 0.9914 0.9937 0.9914 CASY

0.7415 0.8295 0.7483 0.7585 0.7653 Actividad

Figura 8.4. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con fructosa.

La figura 8.4 muestra que el sustrato se agota aproximadamente a las 7 horas de cultivo,

momento en el que se detuvo por completo el crecimiento de la levadura; comportamiento

similar a cuando se usó glucosa. La curva de actividad enzimática muestra variaciones en las

primeras horas del cultivo, esto se debe a que la fructosa aún presente en el medio también

interfiere con la técnica de DNS. Al agotarse la fructosa, se observó una tendencia a

incrementarse la actividad enzimática, alcanzando su valor máximo al finalizar la cinética de

5.4 U/ml (0.97 U/mg de biomasa seca). La bibliografía reporta valores desde 0.07 U/mg [63],

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65

0.7 U/ml [95] y hasta 11.87 U/mg; ésta última a las 24 horas para una cepa hiperproductora de

Kluyveromyces Sp. aislada del proceso de elaboración del pulque y aguamiel [96] lo que explica

la significativa diferencia de actividad con nuestro experimento. Tanto la cepa de la referencia

[96] como la empleada en este trabajo fueron aisladas de procesos donde la fuente principal de

carbono fueron fructanos de agave, por lo que al ser cepas adaptadas a dicha fuente de carbono

se explica la actividad fructanasa mayor con respecto a otros estudios.

8.1.3. Cultivo en lote con sacarosa como fuente de carbono

Figura 8.5. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con sacarosa.

Este cultivo se realizó con una concentración inicial de sacarosa de 20 g/L. Debido a que el

metabolismo de la sacarosa por las levaduras debe ser hidrolizada para ser asimilada, la

pendiente de la fase exponencial de crecimiento es menor que con glucosa y fructosa (figura

8.5). Además, cabría esperar que la velocidad específica de crecimiento fuera apreciablemente

menor que en los reactores anteriores, fenómeno que no se observó pues fue de 0.41 h-1. La

velocidad específica de crecimiento con sacarosa es igual que con fructosa, lo que indica que la

hidrólisis de la sacarosa no tiene un impacto sobre el crecimiento de la levadura. Tanto la figura

8.5 como la tabla 8.3 muestran que una correlación significativa entre las técnicas de biomasa

se dio entre la permitividad, peso seco y CASY en un grupo; y entre la densidad óptica y el

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66

conteo en cámara. Estas variaciones fueron principalmente a la manipulación de las muestras,

no por técnicas en sí mismas. Al igual que en los cultivos con glucosa y fructosa, la actividad

enzimática no está relacionada de manera proporcional con la biomasa cuando se usa sacarosa

como fuente de carbono.

Tabla 8.3. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para el

cultivo en lote utilizando sacarosa como fuente de carbono

Permitividad

0.9924 Peso seco

0.9490 0.9466 DO

0.9400 0.9448 0.9921 Conteo en cámara

0.9814 0.9951 0.9348 0.9308 CASY

0.7893 0.8348 0.6711 0.6991 0.8398 Actividad

Figura 8.6. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con sacarosa.

Debido al empleo del método DNS y a la naturaleza no reductora de la sacarosa, no se realizó

el seguimiento del consumo de sustrato; dado que uno de los objetivos del experimento fue

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evaluar de manera general el impacto de las hexosas en la actividad enzimática; sin embargo, se

midió la concentración de glucosa y fructosa liberadas por la hidrólisis de la sacarosa. Se observa

en la figura 8.6 un aumento sostenido de la concentración de azúcares reductores hasta la hora

6, lo que indica que la hidrólisis de la sacarosa se dio a una mayor velocidad de la que fueron

consumidos los productos; para la hora 7 hubo un descenso abrupto de los azúcares reductores

debido seguramente al consumo total del sustrato, lo que concuerda en el tiempo con los dos

cultivos anteriores. Coincide la aparición de glucosa y fructosa con la presencia de actividad

enzimática, la cual mantiene una tendencia al incremento hasta el final de la cinética, donde la

actividad máxima fue de 6.9 U/ml (1.27 U/mg de biomasa seca) lo que resulta mayor que con

fructosa, probablemente el que glucosa y fructosa no se encuentren directamente libres en el

medio promueve una actividad enzimática mayor al mismo tiempo que se evita la mencionada

represión catabólica. La bibliografía reporta que se ha conseguido desde 0.9 U/ml [95] hasta

127 U/ml, ésta última a las 38 horas de cultivo con un medio complejo resultado de un diseño

de experimentos para favorecer la actividad enzimática y empleando una cepa nativa de

Kluyveromyces marxianus [97]; se puede inferir con esta referencia que el medio de cultivo

influye de manera significativa en la actividad enzimática, así como el tiempo de cultivo, por lo

que se sugiere que estos factores que se tomen en cuenta en futuros experimentos.

8.1.4. Cultivo en lote con inulina como fuente de carbono

Este cultivo se realizó a una concentración inicial de inulina de dalia de 20 g/L. Se observa en

la figura 8.7 que después de 14 horas de cinética no se llegó a la fase estacionaria, aun así, se

decidió finalizar el cultivo debido a que los datos obtenidos hasta ese momento fueron

suficientes para una adecuada comparación con el resto de los biorreactores. Debido que la

inulina es una molécula significativamente más compleja que la sacarosa, su hidrólisis tuvo

efectos sobre la velocidad específica de crecimiento de la levadura, alcanzándose un valor

máximo de 0.25 h-1. Tanto la figura 8.7 como la tabla 8.4 muestran que la correlación entre las

técnicas de monitoreo de la biomasa no fue tan alta como en los reactores de glucosa y fructosa,

pero si lo suficiente para considerar que son estadísticamente similares (a un 95% de confianza).

Podría suponerse por las correlaciones de la actividad con las técnicas de biomasa, que existe

una proporcionalidad directa entre la expresión de fructanasas con la biomasa cuando se utilizó

inulina como fuente de carbono, sin embargo, el cultivo no llegó hasta su fase estacionaria; por

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lo que la biomasa no se estabilizó. Además, como se puede apreciar mejor en la figura 8.8, la

actividad presentó un incremento al finalizar el cultivo; mientras que la biomasa mantuvo su

pendiente de forma constante.

Figura 8.7. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con inulina.

Tabla 8.4. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para el

cultivo en lote utilizando inulina como fuente de carbono

Permitividad

0.9855 Peso seco

0.9875 0.9977 DO

0.9877 0.9834 0.9842 Conteo en cámara

0.9815 0.9725 0.9750 0.9906 CASY

0.8826 0.9434 0.9330 0.8786 0.8532 Actividad

De la misma manera que con el cultivo con sacarosa, para el consumo de sustrato se midió la

liberación de azúcares reductores debido a la hidrólisis de la inulina. Se observa en la figura 8.8,

que la concentración de azúcares reductores se mantuvo siempre en valores mínimos; por lo que

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la glucosa y fructosa fueron asimilados tan rápido como fueron liberados. Este resultado sugiere

que las β-fructofuranosidasas expresadas por Kluyveromyces marxianus SLP1 en este

experimento mostraron mayor velocidad de hidrólisis sobre sacarosa que sobre inulina. La

máxima actividad enzimática alcanzada en este cultivo fue de 38.33 U/ml (5.5 U/mg de biomasa

seca) lo que resulta significativamente mayor que con las anteriores fuentes de carbono. Cabe

señalar que se dejó de tomar muestras a las 14 horas de cultivo, pero una muestra tomada en el

momento de cosechar el biorreactor (a las 17 horas) arrojó una actividad de 90 U/ml, lo que

indica que la actividad enzimática continuaba en aumento debido probablemente a la presencia

de sustrato aún en el medio. Hay reportes a condiciones similares con valores de actividad

enzimática desde 25 U/ml [98], 43.8 U/ml [95] y 50.0 U/ml [99] con un medio complejo

producto de un diseño de experimentos para favorecer la producción de inulinasa, y hasta 27.74

U/mg a las 24 horas con una cepa hiperproductora de Kluyveromyces sp. aislada del proceso de

elaboración del pulque y aguamiel [96]. Debido que este experimento se detuvo antes de

agotarse la fuente de carbono, la actividad fructanasa alcanzada resultó menor a las referencias

señaladas por lo que los datos no son del todo comparables; pero si ofrecen una idea general del

impacto de la inulina sobre la actividad enzimática con respecto a las fuentes de carbono de los

experimentos anteriores.

Figura 8.8. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con inulina.

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8.1.5. Cultivo en lote con fructanos de agave como fuente de carbono

Este cultivo se realizó con una concentración inicial de fructanos de agave (FA) de 20 g/L. Se

observa en la figura 8.9 que el crecimiento fue similar al que se presentó con inulina. Al igual

que con el cultivo con inulina, después de 14 horas de cinética no se llegó a la fase estacionaria,

aun así, se decidió finalizar el cultivo debido que los datos obtenidos hasta ese momento fueron

suficientes para una adecuada comparación con el resto de los biorreactores. Debido a la

naturaleza ramificada de los FA, la liberación de unidades de glucosa y fructosa es más lenta

que con inulina debido principalmente a impedimentos estéricos con la enzima; por lo que la

velocidad específica de crecimiento fue la menor con respecto a los 5 experimentos anteriores,

alcanzándose un valor máximo de 0.21 h-1. Tanto la figura 8.9 como la tabla 8.5 muestran que

la correlación entre las técnicas de monitoreo de la biomasa son suficientemente altas para

considerar que son estadísticamente similares (a un 95% de confianza). Al igual que con inulina,

la alta correlación entre actividad y biomasa no indica que haya necesariamente una

proporcionalidad directa entre la actividad β-fructofuranosidasa con la biomasa, pues no se

estudió la actividad durante la fase estacionaria. Al comparar las pendientes de biomasa total y

actividad enzimática, se puede determinar que conforme avanza el cultivo hay mayor actividad

por gramo de biomasa; por lo que se puede formular la hipótesis de que esto se debe a que las

células hijas están “condicionadas” para producir β-fructofuranosidasas desde un inicio.

Figura 8.9. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con FA.

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Tabla 8.5. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para el

cultivo en lote utilizando FA como fuente de carbono

Permitividad

0.9943 Peso seco

0.9925 0.9948 DO

0.9619 0.9631 0.9708 Conteo en cámara

0.9761 0.9820 0.9888 0.9819 CASY

0.9252 0.9513 0.9315 0.8833 0.9035 Actividad

Figura 8.10. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con FA.

Al igual que con la inulina, no se pudo realizar el seguimiento del consumo de FA; midiéndose

entonces la concentración de glucosa y fructosa liberados por la hidrólisis del mismo. Se observa

en la figura 8.10 la presencia de azúcares reductores al inicio del cultivo, esto se debe a la

hidrólisis parcial que sufren los FA en el momento de la esterilización por calor [25], además

de la que ya contiene de manera libre la fuente empleada. La concentración de dichos azúcares

disminuye hasta dejar de detectarse, lo que indica que desde el inicio del cultivo la velocidad de

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asimilación de las moléculas de glucosa y fructosa fue mayor que la velocidad de hidrólisis de

los FA. Este resultado indica que las β-fructofuranosidasas expresadas por Kluyveromyces

marxianus SLP1 presentan la menor velocidad de hidrólisis sobre FA que sobre glucosa y

fructosa. La máxima actividad enzimática alcanzada en este cultivo fue de 40 U/ml (5.8 U/mg

de biomasa seca), similar a lo obtenido con inulina. Hay solo 2 estudios que evalúan la actividad

enzimática en un cultivo con FA como fuente de carbono, donde obtiene valores de 12 U/ml

[91] y 4.02 U/mg [73]; cabe señalar que los cultivos de ambos reportes fueron realizados a nivel

matraz, por lo que las condiciones aireación y pH no fueron controladas, lo que pudo afectar la

actividad enzimática.

8.1.6. Comparativa entre actividad enzimática y fuente de carbono

En la figura 8.11 se aprecia claramente la magnitud de la diferencia en la actividad enzimática

según la fuente de carbono que se empleó. Siendo la actividad más baja para la glucosa, seguida

de la fructosa y ligeramente mayor con sacarosa; con inulina y FA la diferencia es significativa,

siendo hasta 26 veces mayor que lo producido con glucosa durante el mismo tiempo de cultivo.

Figura 8.11. Comparativa de actividad enzimática según la fuente de carbono.

Diversas fuentes bibliográficas reportan una represión catabólica de la actividad de

inulinasas/fructanasas en la levadura Kluyveromyces marxianus por parte de la glucosa [63],

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[92], [94], lo que coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. Por lo que formulamos

la hipótesis de que al hidrolizarse la inulina o FA la liberación de las unidades de glucosa y

fructosa es lo suficientemente lenta para que los azúcares sean asimilados, manteniendo la

concentración de glucosa/fructosa en niveles mínimos; evitándose la represión catabólica y

manteniendo estresada la célula por limitación de sustrato. Los experimentos que a continuación

se detallan servirán de apoyo para la verificación de tal hipótesis.

La evaluación de los cultivos en lote con las diferentes fuentes de carbono permitió proponer

cultivos en continuo con glucosa como fuente de carbono, pues este tipo de cultivo permite

mantener la concentración de sustrato en el medio a niveles mínimos y favoreciendo la

producción de fructanasas.

8.2. Cultivos en estado continuo en biorreactor

A continuación, se presentan los resultados de dos cultivos en estado continuo que se realizaron

con el objetivo de determinar las condiciones de temperatura (Temp), velocidad específica de

crecimiento (µ) y concentración de glucosa en la alimentación (C_S0) que maximicen la

producción de la enzima de interés. Como se mencionó en párrafos anteriores, los niveles

residuales de glucosa/fructosa inducen la actividad β-fructofuranosidasa y al mismo tiempo

impiden la represión catabólica, razones por las cuales se empleó glucosa en los siguientes

experimentos. Asimismo, es deseable diseñar un proceso en el que se consiga una alta actividad

enzimática con una fuente de carbono económica y abundante. Lo que no ocurre con fuentes de

carbono como la inulina y los FA, que pueden ser productos caros y cuyas cantidades

disponibles en el mercado son menores que la glucosa; además se requeriría la caracterización

previa de los fructanos como control de calidad, incrementando los costos de proceso.

8.2.1. Primer cultivo en continuo

El diseño de experimentos que se corrió para el primer sistema en continuo generó una gran

cantidad de datos provenientes tanto de los sensores de monitoreo en línea, como los fuera de

línea. La tabla 8.11 muestra los parámetros asociados a cada condición, así como los resultados

obtenidos de biomasa y actividad para cada caso (en el anexo B se encuentra el resto de la

información generada en este experimento). Las condiciones se propusieron con base en

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experimentos anteriores realizados por el Dr. Alejandro Arana y el equipo francés del proyecto

SPECTRE (el Dr. Charles Ghommidh y la Dra. Laurence Preziosi-Belloy) que no han sido

publicados.

Tabla 8.11. Resultados de biomasa y actividad enzimática del primer cultivo en estado continuo.

Muestra Temp

(°C)

µ

(h-1)

C_S0

(g/L)

Biomasa

(g/L)

Actividad

(U/ml)

Actividad

(U/g)

T1R1 26 0.05 20 8.64 177.87 20,589

T2R1 34 0.05 20 7.11 812.22 114,303

T3R1 34 0.4 20 3.31 15.34 4,631

T4R1 26 0.4 20 2.92 2.92 1,113

T5R1 26 0.05 60 9.35 128.92 13,785

T7R1 34 0.05 60 6.14 74.86 12,185

T6R1 26 0.4 60 2.35 13.21 5,621

T8R1 34 0.4 60 5.73 0.55 95

T9R1 30 0.225 40 5.13 23.24 4,532

T10R1 30 0.225 40 6.55 16.54 1,814

T11R1 30 0.225 40 6.79 27.04 3,997

T12R1 30 0.225 40 5.42 23.31 4,735

T1R2 26 0.05 20 8.83 182.53 20,676

T2R2 34 0.05 20 6.94 892.24 128,628

T3R2 34 0.4 20 3.25 37.00 11,374

T4R2 26 0.4 20 3.12 3.25 936

T5R2 26 0.05 60 9.44 129.09 13,672

T7R2 34 0.05 60 5.93 71.95 12,135

T6R2 26 0.4 60 2.16 4.42 2,044

T8R2 34 0.4 60 5.87 0.47 80

T9R2 30 0.225 40 5.21 27.12 5,121

T10R2 30 0.225 40 6.78 17.52 1,943

T11R2 30 0.225 40 6.66 32.12 4,823

T12R2 30 0.225 40 5.25 23.29 4,605

T1R3 26 0.05 20 8.94 129.60 14,500

T2R3 34 0.05 20 7.05 562.07 79,748

T3R3 34 0.4 20 3.36 35.75 10,653

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T4R3 26 0.4 20 3.05 1.87 614

T5R3 26 0.05 60 9.17 108.44 11,823

T7R3 34 0.05 60 6.37 100.91 15,837

T6R3 26 0.4 60 2.61 6.41 2,455

T8R3 34 0.4 60 6.40 1.66 259

T9R3 30 0.225 40 5.43 30.93 5,697

T10R3 30 0.225 40 6.87 19.93 2,149

T11R3 30 0.225 40 6.87 34.53 5,025

T12R3 30 0.225 40 5.36 25.96 4,842

Como se puede apreciar en las columnas de actividad de la tabla 8.11, que en la gran mayoría

de las condiciones se logra una actividad enzimática más elevada que la conseguida con la

misma fuente de carbono en cultivo en lote (en negritas las actividades más altas); incluso, en

varias de las condiciones se detectó una mayor actividad β-fructofuranosidasa que la conseguida

en los cultivos en lote con inulina y FA; probando que los cultivos en estado continuo son una

mejor opción que los cultivos en lote para una alta producción de β-fructofuranosidasas a partir

de Kluyveromyces marxianus SLP1.

Se han publicado diversos reportes en la literatura científica que exploran el impacto de la tasa

de crecimiento de K. marxianus sobre la actividad fructanasa en quimiostato, encontrando que

a velocidades específicas de crecimiento menores mejora la actividad, lo que se encuentra en

concordancia con lo expuesto anteriormente. Uno de estos trabajos alcanza actividades de hasta

52 U/mg de biomasa seca a µ = 0.1 h-1 empleando inulina como fuente de carbono, mientras

que con glucosa alcanzan 3.9 U/ml [92]; por lo que la tasa de dilución tiene un efecto

significativo en la actividad enzimática. En otro reporte encontraron que a µ = 0.05 h-1

alcanzaban la máxima actividad, sin embargo, disminuía al incrementarse µ; los autores no

probaron una tasa de crecimiento menor. La fuente de carbono utilizada fue sacarosa [64]. En

el presente trabajo se detectaron actividades enzimáticas mayores a cualquier reporte y

empleando glucosa como fuente de carbono; por otra parte, la cepa de K. marxianus SLP1

mostró ser una muy buena productora de la enzima de interés.

A continuación, se detalla cómo se relacionan los factores probados con la actividad de β-

fructofuranosidasas.

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8.2.1.1. Análisis por superficie de respuesta

Con los datos generados se realizó un análisis por superficie de respuesta, o para ser precisos

volumen de respuesta, que muestra el impacto de cada uno de los factores probados sobre la

variable de respuesta, que fue la actividad enzimática en U/ml. Para el análisis estadístico se

recurrió al programa Statgraphics Centurion versión 16.2.04. La tabla 8.12 muestra el análisis

de varianza para la actividad enzimática donde se verifica que tanto los factores como sus

interacciones tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la variable de respuesta, con

un nivel de confianza del 95% (P < 0.05).

Tabla 8.12. Análisis de varianza para la actividad enzimática

Factor Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón F Valor P

A: Temp 122764. 1 122764. 19.99 0.0001

B: µ 439522. 1 439522. 71.56 0.0000

C: C_So 203830. 1 203830. 33.19 0.0000

AB 106548. 1 106548. 17.35 0.0003

AC 166112. 1 166112. 27.05 0.0000

BC 179047. 1 179047. 29.15 0.0000

BC 179047. 1 179047. 16.18 0.0004

Total error 153549. 25 6141.97

Total (corr.) 1.50545E6 32

Según la figura 8.12, la actividad enzimática es más alta cuando la temperatura se sitúa en 34

°C en lugar que a 26; así como una velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1 y una

concentración de 20 g/l de glucosa en la alimentación, en lugar de valores mayores. Así mismo,

la longitud de las barras en cada factor es un indicativo de la magnitud en que éste afecta la

variable de respuesta. De esta manera, el factor que más impacta sobre la actividad enzimática

es la velocidad específica de crecimiento.

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Figura 8.12. Gráfico de efectos principales.

Figura 8.13. Gráfica de interacciones entre factores.

Tal como lo demuestra el análisis de varianza, la interacción entre los factores tiene un efecto

significativo sobre la variable de respuesta. En la figura 8.13 se puede apreciar que la actividad

enzimática es favorecida cuando los factores se encuentran en la siguiente combinación: Temp

(+) – µ (-), Temp (+) – C_So (-) y µ (-) – C_So (-); es decir, mantener una temperatura que

tienda hacia los 34 °C al mismo tiempo que se mantiene una velocidad de crecimiento y una

concentración de sustrato bajas en ambos casos, concordando con la figura 8.12. Además, las

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78

longitudes de las barras indican que la interacción µ – C_So es la que afecta en mayor magnitud

la variable de respuesta.

La superficie de respuesta generada (figura 8.14) con los datos de este experimento indica el

comportamiento que presenta la actividad de fructanasas en función de los factores propuestos.

Como ya se ha indicado, los valores de la actividad β-fructofuranosidasa tendieron a

incrementarse conforme se elevaba la temperatura, se reducía la velocidad específica de

crecimiento, así como la concentración de sustrato en la alimentación; concretamente, la

máxima actividad enzimática alcanzada (755 ± 170 U/ml) se dio a una temperatura de 34 °C,

velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1 y 20 g/l de glucosa en la alimentación. Lo que

representa una frontera de las condiciones analizadas, por lo que el punto óptimo podría

encontrarse fuera de la zona del análisis.

Figura 8.14. Superficie de respuesta para la actividad enzimática en función de los factores probados.

La reducción de la velocidad específica de crecimiento se consiguió disminuyendo la velocidad

de alimentación, que combinado con una menor concentración de glucosa en el alimento da

como resultado un descenso significativo en la disponibilidad de fuente de carbono durante el

cultivo. De esta manera, se consigue recrear las condiciones de disponibilidad de glucosa que

se presentan durante los cultivos con inulina y FA, con el consiguiente importante incremento

de la actividad fructanasa.

µ, 1/h

Temp, °C

C_

So

, g

/l

Act. Enz., U/ml0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.0

Contours of Estimated Response SurfaceC_So=60.0

26 28 30 32 34 00.1

0.20.3

0.420

30

40

50

60

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79

Los resultados de este experimento apoyan la hipótesis que se presentó en la sección 8.1, que la

actividad de β-fructofuranosidasas está directamente relacionada con la limitación continua de

glucosa durante el cultivo de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.

No se encontró ningún tipo de correlación entre el resto de parámetros monitoreados, mostrados

en el anexo A, con la actividad enzimática.

Finalmente, se realizó una regresión lineal multivariada para generar un modelo que relaciona

los factores probados y sus interacciones con la variable de respuesta:

𝐴𝑐𝑡. 𝐸𝑛𝑧 (𝑈𝑚𝑙⁄ ) = −3175 + 129 𝑇𝑒𝑚𝑝 (°𝐶) + 7502 𝜇 (ℎ−1) + 57 𝐶𝑆0

(𝑔

𝑙⁄ ) − 309 𝑇𝑒𝑚𝑝 ∗ 𝜇 − 2 𝑇𝑒𝑚𝑝

∗ 𝐶𝑆0− 135 𝜇 ∗ 𝐶𝑆0

+ 5 𝑇𝑒𝑚𝑝 ∗ 𝜇 ∗ 𝐶𝑆0

El valor R2ajustado del modelo es de 87, por lo que es capaz de explicar el 87% de la variabilidad

de los datos, a un nivel de significancia del 5%.

8.2.2 Segundo cultivo en estado continuo

Con el objetivo de verificar y ampliar la zona de exploración en torno a las condiciones de mayor

producción enzimática del cultivo en continuo anterior, se propuso inicialmente un diseño de

experimentos 22 con puntos al centro, con temperatura de cultivo y velocidad especifica de

crecimiento como factores. Los niveles propuestos fueron 30 y 38 °C para la temperatura, y 0.01

y 0.09 h-1 para la velocidad específica de crecimiento, con 34 °C y 0.05 h-1 como punto central.

El experimento se concentró en la verificación de las condiciones de mayor producción de β-

fructofuranosidasas arrojadas por el primer cultivo en continuo, y el impacto de la temperatura

sobre la variable de respuesta a µ = 0.05 h-1. Las condiciones que si fueron probadas son las que

se muestran en la tabla 8.13, junto con los resultados de biomasa y actividad para cada caso.

Debido al bajo número de condiciones, no fue posible realizar un análisis estadístico similar al

primer cultivo en continuo.

Como se puede observar en la tabla, la condición que favoreció la mayor producción de β-

fructofuranosidasas fue 34 °C y µ = 0.05 h-1; justamente la misma condición que en el primer

diseño experimental. Resulta llamativo que la máxima actividad alcanzada en el segundo

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experimento es la mitad de la que se obtuvo en el primero. La única deferencia observada

durante los 2 cultivos fue el porcentaje de saturación de oxígeno en el medio durante la

condición de máxima actividad: en el primer cultivo se mantuvo entre 2.5 y 3.5%, mientras que

en el segundo cultivo se mantuvo por debajo del 1%; es importante señalar que debido al margen

de error del propio sensor de oxígeno, la saturación durante el segundo cultivo pudo haber caído

a 0%. Aunque en el segundo experimento la aireación fue del doble que en el primero, los

volúmenes de trabajo fueron diferentes (1.5 L para el primero y 2.2 L para el segundo); lo que

resulta en una diferencia en el flujo neto de aire aún mayor (1.5 L/min para el primer caso y 4.4

L/min para el segundo). La velocidad de aireación puede incrementar el tamaño de burbuja, que

a su vez impacta de manera negativa el coeficiente de transferencia de oxígeno al medio de

cultivo [100]–[102]; para contrarrestar esa consecuencia, se incrementó la agitación de 500 a

550 rpm en el segundo diseño. La estrategia empleada no fue suficiente para mejorar el

porcentaje de saturación de oxígeno disuelto. Por otro lado, no era recomendable incrementar la

agitación por encima de los 550 rpm; pues como lo reporta Silva-Santisteban y Maugeri [65], la

producción de inulinasa comienza a decrecer a partir de una agitación superior a 500 rpm. Estos

resultados sugieren que la producción de β-fructofuranosidasas se encuentra afectada de manera

importante por la disponibilidad de oxígeno disuelto en el medio.

Tabla 8.13. Condiciones y resultados para el segundo cultivo en continuo.

Muestra Temperatura,

°C

Velocidad específica

de crecimiento, h-1

Biomasa

g/l

Actividad

U/ml

Actividad

kU/g *

T1 34 0.05 6.4 398 ± 30 63 ± 5

T2 30 0.05 7.5 126 ± 9 16.9 ± 1.3

T3 38 0.05 7.7 295 ± 30 38.1 ± 4

T4 34 0.09 6.4 65 ± 6 10.2 ± 1.1

* kU/g = 1000 U/g o U/mg

La figura 8.15 muestra cómo se afectó la actividad enzimática por la temperatura a una velocidad

específica de crecimiento de 0.05 h-1. Se aprecia una caída de la actividad más pronunciada a

temperaturas menores de 34 °C que a temperaturas mayores; produciendo hasta 69% menos a

30 °C y 26% menos a 38 °C que a 34 °C. Dentro del equipo de trabajo de biotecnología industrial

de CIATEJ, Núñez-López reportó que la mejor temperatura para la producción de fructanasas

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fue de 20 °C en cultivo realizados a nivel matraz, con actividades de hasta 7.93 ± 0.6 U/ml [25];

lo que es evidencia del impacto que puede tener el sistema de cultivo en la producción de

metabolitos de interés.

Figura 8.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática a µ = 0.05 h-1.

Finalmente, la actividad enzimática medida sobre la muestra 4 obtenida bajo las condiciones de

34 °C y µ = 0.09 h-1 prueba el fuerte efecto que tiene la disponibilidad de glucosa sobre la

actividad de la enzima de interés. Con solo subir la tasa de dilución de 0.05 a 0.09 h-1 a 34 °C,

la actividad enzimática cayó un 84%.

El segundo cultivo en continuo se realizó también con el objetivo de validar la metodología para

el monitoreo en línea de la actividad enzimática mediante un sistema de análisis de inyección

secuencial, cuyos resultados se presentan y discuten en la sección 8.5.3.

Una vez que se verificó que a 34 °C se favorecía la producción de β-fructofuranosidasas en

cultivos en continuo, se decidió evaluar el comportamiento de la levadura y la producción de la

enzima a dicha temperatura en un cultivo en lote. Además, se mantuvieron los cultivos durante

un tiempo prolongado aun cuando se había agotado la fuente de carbono.

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8.3. Cultivos en lote a 34 °C en biorreactor

A una temperatura de 34 °C, la velocidad específica de crecimiento de la levadura

Kluyveromyces marxianus SLP1 fue de 0.53 h-1; consumiéndose el sustrato en apenas 5 horas.

Debido a la naturaleza de cada técnica de monitoreo de biomasa, estas difieren unas de otras en

la fase estacionaria (figura 8.16); ya que en esta fase se produce mayormente degradación y

muerte celular.

Figura 8.16. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 1 a 34 °C.

Resulta de especial interés el comportamiento de la actividad enzimática conforme avanza la

edad del cultivo (figura 8.17). Justo al agotarse la glucosa se presentó un incremento de la

actividad enzimática (característica que se ha observado en los cultivos anteriores) de la hora 5

a la hora 8 para caer de manera apreciable en la hora 13. No hubo ninguna perturbación en las

condiciones del cultivo que justifique dicho comportamiento, por lo que se hipotetizó sobre la

producción de proteasas dado que coincide relativamente con el agotamiento de la fuente de

carbono. La mayor concentración de proteasas presentes en el medio degradaría las fructanasas

producidas, lo que explicaría el repentino descenso de la actividad de la enzima de interés. Pero

a partir de la hora 18 se midió un incremento sostenido de la actividad fructanasa; por lo que la

producción de β-fructofuranosidasas se vería favorecida sobre la posible producción de

proteasas. Nótese que aún sin haber glucosa disponible en el medio, la actividad enzimática

continúa; por lo que las células que se encuentran activas deben obtener energía de otras fuentes.

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Figura 8.17. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 1 a 34 °C.

Con el objetivo de explorar la generación de proteasas durante la cinética y verificar el

incremento continuo de la producción de β-fructofuranosidasas aún en condiciones de pleno

agotamiento de la fuente de carbono inicial, realizó a cabo un segundo cultivo en lote a 34 °C.

Gracias al uso del sistema de aire comprimido este cultivo se llevó a cabo con una aireación

mayor, concretamente a 2 vvm. En las figuras 8.18 y 8.19 se puede apreciar que las curvas de

biomasa tienen un comportamiento similar entre sí. Además, se obtuvo mayor cantidad de

biomasa en este cultivo con respecto al cultivo anterior; presumiblemente por la mayor

disponibilidad de oxígeno.

De nuevo resulta de especial interés la curva de actividad enzimática. En este reactor no se

presentó el súbito descenso de la actividad en ningún momento del cultivo; de hecho, a partir de

la hora 10 la actividad fructanasa comenzó a incrementarse de manera sostenida hasta

aproximadamente la hora 83, para después descender ligeramente. Exceptuando la variación de

la actividad en el anterior cultivo, ambos experimentos tuvieron un comportamiento similar en

cuanto a la actividad de la enzima. Estos resultados también apoyan la hipótesis de que la

restricción completa de glucosa en el medio favorece la actividad de β-fructofuranosidasas. La

figura 8.18 muestra mayor actividad en U/ml para el cultivo 2 (6.1 U/ml) que para el cultivo 1

(2.8 U/ml), pero esto fue debido al mayor rendimiento biomasa/sustrato consecuencia de la

mejor aireación; pero en términos de U/g de biomasa seca, ambos cultivos tuvieron una

actividad similar en torno a la hora 65 (~ 800 U/g).

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Figura 8.18. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 2 a 34 °C.

No se detectó actividad proteasa en las muestras del cultivo en lote 2; es necesario aclarar, que

las muestras fueron analizadas varios días después de terminada la cinética. Aunque las muestras

se mantuvieron a -20 °C, la proteasa pudo haberse degradado haciendo imposible su detección

mediante la metodología implementada. También existe la posibilidad que no se haya producido

la proteasa debido a que la mejor aireación redujo los niveles de estrés en la levadura.

Figura 8.19. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 2 a 34 °C.

Muestras representativas de la cinética fueron dializadas y analizadas para actividad fructanasa

con el objetivo de determinar el impacto del sobrenadante sobre la técnica para la determinación

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de azúcares reductores. Como se observa en la figura 8.20, las muestras dializadas mostraron

una mayor actividad que la no dializada; aproximadamente un 10% mayor, lo que concuerda

con lo reportado por Miller y col [90]. Donde los autores mostraron que las sales tienen un

impacto en la coloración de la prueba lo que afectaría la absorción a 540 nm.

Cada vez que se realizó la prueba de actividad con sobrenadante sin diluir, se observó que la

disolución final tendía a quedarse impregnada a las paredes del microtubo, afectando

directamente a la respuesta final de actividad. Estos resultados indican algún tipo de interacción

entre el sobrenadante y los reactivos de la metodología de determinación de actividad

enzimática; el efecto no se observó en muestras diluidas. Todos los valores de actividad

reportados en el presente trabajo se realizaron con muestras diluidas al menos 10 veces.

Cabe señalar que se tomó en cuenta la pérdida de volumen de cultivo por evaporación. A las

condiciones a las que se realizaron los cultivos, se puede perder entre 4 y 5 ml de agua por hora

debido a la aireación. En un cultivo en lote de pocas horas, el volumen perdido no es

significativo; pero después de 100 horas, como fue el caso, la pérdida por evaporación puede

representar hasta el 30% del volumen inicial. Por tanto, es importante tomar en cuenta la

evaporación en cultivos en biorreactores; principalmente en cultivos en lote.

Figura 8.20. Actividad enzimática de muestras dializadas vs no dializadas.

8.4. Cultivos en lote alimentado en biorreactor

A continuación, se muestran los resultados de los 2 cultivos en lote alimentado que se realizaron

con el objetivo de evaluar la producción de β-fructofuranosidasas en condiciones controladas de

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restricción de sustrato. El tiempo de cultivo cero y los datos reportados corresponden a partir

del inicio de la alimentación.

8.4.1. Primer cultivo en lote alimentado

Debido que los experimentos anteriores han indicado que al limitar la disponibilidad de glucosa

en el medio promueve la producción de β-fructofuranosidasas, se corrió un primer cultivo en

lote alimentado con velocidad de alimentación constante. Al mantener fija la cantidad de glucosa

suministrado al cultivo por unidad de tiempo, conforme se incrementó la biomasa menor

disposición de sustrato hubo por unidad de biomasa, disminuyendo en consecuencia la velocidad

de crecimiento de la levadura de manera progresiva. Por tanto, se pudo estudiar el impacto de

la velocidad específica de crecimiento sobre la producción de la enzima de interés manteniendo

en todo momento la restricción de glucosa. El flujo de alimentación se mantuvo alrededor de 70

ml/h, mientras que la concentración de glucosa en el medio de alimentación fue de 100 g/L.

La figura 8.21 muestra la evolución de la concentración de biomasa durante la fase de

alimentación. Como ya se ha presentado en los cultivos anteriores, la correlación entre las

diferentes técnicas es relativamente buena, mayor al 97%; exceptuando en esta ocasión el conteo

en cámara, que presentó una variabilidad elevada.

Figura 8.21. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 1.

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Una de las cualidades de un cultivo en lote alimentado es que se puede calcular de manera

sencilla el rendimiento biomasa/sustrato, 𝑌𝑥/𝑠 (ver sección 2.5.2). Al graficar la biomasa total

(peso seco * volumen de cultivo) contra el tiempo (figura 8.22), la biomasa total tiende a

incrementarse de manera lineal con el tiempo. El rendimiento 𝑌𝑥/𝑠 se obtiene de dividir la

pendiente de la línea contra la cantidad de sustrato total suministrado (flujo de alimentación *

concentración de sustrato en la alimentación). De esta manera, el valor calculado para el

rendimiento biomasa/sustrato a las condiciones del cultivo en el lote alimentado 1 fue de 0.15 g

de biomasa/g de glucosa, que es un valor bajo comparado con lo reportado en otras fuentes [26],

[32]. Esta diferencia puede deberse a la baja disponibilidad de oxígeno disuelto en el medio,

pues el sistema de aireación empleado no logra elevar el porcentaje de saturación de oxígeno

por encima del 3%.

Figura 8.22. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 1.

Durante toda la etapa de alimentación el suministro de glucosa total fue mantenido en niveles

bajos, de modo que la levadura se encontró en todo momento limitada en fuente de carbono,

presentándose un incremento sostenido de la actividad fructanasa durante todo el cultivo (figuras

8.23 y 8.24). Este comportamiento refuerza la hipótesis antes mencionada que propone que la

limitación de glucosa es el impulsor para la producción de β-fructofuranosidasas.

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Figura 8.23. Biomasa vs actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 1.

Se presentó un fenómeno interesante durante este cultivo, como se puede ver en la curva de

sustrato de la figura 8.23 la concentración de glucosa tuvo una tendencia a incrementarse.

Aunque es cierto que la pendiente de acumulación es pequeña. El que haya una concentración

de glucosa presente durante el cultivo más allá de la que puede considerarse residual, indica que

por alguna razón la levadura no pudo consumir toda la glucosa disponible. La única razón que

se encontró para justificar este suceso fue que debía existir otro elemento limitante del

crecimiento. Este limitante fue probablemente la disponibilidad de oxígeno. En la figura 8.24,

la curva de saturación de oxígeno muestra el porcentaje de oxígeno de los gases exhaustos, que

se mantiene en descenso desde el inicio de la alimentación. Es natural que la demanda de

oxígeno se aumente al incrementarse la biomasa total, y por tanto descienda el porcentaje en los

gases de salida; pero ya se ha visto en los cultivos anteriores que 1 vvm de aireación no resulta

suficiente para la cantidad de biomasa alcanzada en el experimento (para este cultivo aún no se

contaba con aire comprimido en el laboratorio). Así que la limitante de oxígeno es un candidato

plausible que explique la acumulación de sustrato.

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Figura 8.24. Actividad enzimática y velocidad específica de crecimiento para el cultivo en lote

alimentado 1.

La máxima actividad enzimática en U/ml se presentó a las 18 horas de cultivo, justo antes de

detener el cultivo por haber alcanzado el máximo volumen del biorreactor; donde se obtuvo 150

U/ml. Mientras que en kU/g, la máxima actividad se alcanzó a las 13 horas; donde fue de 15.5

kU/g, sin descender de manera significativa durante el resto del cultivo. Esta discrepancia se

debe a que la medición de la actividad enzimática en U/ml, tiende a depender de la concentración

de biomasa; mientras que, la medición de la actividad enzimática en U/g responde a la biomasa

total en el sistema.

Nótese que el incremento de la actividad enzimática es poco o nulo después de la hora 13, lo

que coincide con una caída en la saturación de oxígeno. Este comportamiento refuerza la idea

que limitación de oxígeno en el medio afecta directamente a la producción de β-

fructofuranosidasas. Quizá sea la razón por la que la actividad estuvo por debajo de la detectada

en los reactores en continuo. Hensing y col reportan que en cultivo en lote alimentado de la

levadura K. marxianus CBS 6556 en un rango de temperatura entre 30 – 40 °C y una saturación

de oxígeno en medio por encima del 50% obtuvieron una concentración de biomasa seca de 100

g/l, y hasta 3000 U/ml (30,000 U/g) [32]. El valor reportado resulta hasta 20 veces lo medido en

el primer cultivo en lote alimentado, lo que demuestra que es posible obtener altos valores de

actividad fructanasa al no limitar la oxigenación en el cultivo y consiguiendo una elevada

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saturación de biomasa. En la misma referencia se reportó que la mayor actividad se incrementó

al disminuir la velocidad específica de crecimiento, siendo la de máxima producción a 0.05 h-1;

no exploraron velocidades de crecimiento menores. Este resultado concuerda con lo que se ha

reportado en este trabajo de tesis; y como lo muestra la curva de velocidad específica de

crecimiento de la figura 8.24, la mayor producción de fructanasas se dio a µ ~ 0.05 h-1.

8.4.2. Segundo cultivo en lote alimentado

Con el objetivo de explorar la producción de la enzima de interés a velocidades específicas de

crecimiento menores a 0.05 h-1, se realizó un segundo cultivo en lote alimentado donde el flujo

de alimentación fue el mínimo posible dado por el sistema de bombeo. El flujo de alimentación

se redujo a 17 ml/h, empleando un cabezal de la bomba peristáltica que admitiera un diámetro

de tubería menor. La concentración de glucosa en la alimentación se mantuvo en 100 g/L. Para

mejorar la oxigenación se empleó el sistema de aire comprimido del laboratorio para mantener

en 2 vvm la aireación, manteniendo la saturación de oxígeno disuelto en el cultivo entre 40 –

50%.

Figura 8.25. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 2.

La figura 8.25 muestra la evolución de la concentración de biomasa durante la fase de

alimentación. Como ya se ha presentado en los cultivos anteriores, la correlación entre las

diferentes técnicas es relativamente buena, mayor al 96%; exceptuando de nuevo el conteo en

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cámara, que presentó un comportamiento fuera de lo esperado y que se aleja de la tendencia

presentada por el resto de las técnicas de monitoreo de biomasa. Aparentemente el grado de

error en el conteo en cámara de Neubauer se incrementa de manera importante a altas

poblaciones.

Se observó que a partir de la hora 30 la concentración de biomasa se mantuvo prácticamente

constante, lo que indica que la biomasa total no creció de manera lineal con el tiempo. En la

figura 8.26 se demuestra que en efecto no es lineal la acumulación de biomasa, sino que presenta

una curvatura donde la generación de biomasa tiende a detenerse. Este comportamiento se debe

a que la velocidad de alimentación resultó ser demasiado baja para mantener una tasa de

generación de biomasa constante, como ocurrió en el primer cultivo en lote alimentado. Si el

volumen del biorreactor hubiera sido lo suficientemente grande, eventualmente la biomasa

acumulada hubiera sido tal que la cantidad de sustrato alimentado sería insuficiente para generar

biomasa y hubiese sido usado únicamente para mantener vivas las células en el biorreactor, que

es lo que se conoce como coeficiente de mantenimiento celular. De la ecuación 12 (Sección

2.5.2), tenemos que:

𝑚𝑠 =𝐹𝑆𝑅

𝑋𝑉

Figura 8.26. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 2.

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El modelo calculado por regresión exponencial para la biomasa total en función del tiempo fue:

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑔) = 5.22 + 48.9 (1 − 𝑒−0.02𝑡)

El modelo presentó un nivel de ajuste del 98.4%. Al evaluar el modelo en un tiempo infinito, la

máxima biomasa total teórica sería de 54.1 g. Por lo que mediante la ecuación 12, el coeficiente

de mantenimiento para la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 a 34 °C fue de 0.031 gramos

de glucosa por gramo de biomasa. Hensing y col. calcularon un valor de 0.024 gramos de

glucosa por gramo de biomasa para un cultivo en lote alimentado; no precisan a qué temperatura

corresponde dicho valor, lo manejan como constante en un rango de 30 a 40 °C [32], lo que

concuerda con el valor obtenido en este experimento. Otros trabajos reportan valores de 0.25

g/g-h a 30 °C con lactosa [103] o hasta 0.46 g/g-h a 35 °C con jugo de achicoria [104]; los

valores difieren de manera significativa con nuestro estudio probablemente al medio de cultivo

complejo empleado en las referencias. Todas con cepas de la levadura K. marxianus.

Figura 8.27. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 2.

La condición de restricción de biomasa de este cultivo también tuvo efectos sobre la producción

de fructanasas. Se esperaba que la actividad enzimática se mantuviera en ascenso durante el

cultivo, pero como lo demuestra la figura 8.27, el máximo de actividad se alcanzó a las 16 horas

de iniciada la alimentación para después descender y mantenerse constante durante las últimas

30 horas. Justamente en torno a esa hora la tasa de producción de biomasa parece haberse

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reducido a juzgar por el cambio de pendiente en la curva de peso seco en la hora 25. Los

resultados indican que hay un límite en el grado de limitación de la fuente de sustrato; por debajo

de dicho límite, la levadura aparentemente cambia su estado fisiológico provocando que haya

menor actividad enzimática. Lo cual puede deberse a la menor actividad de fructanasas y/o el

incremento de la producción de proteasas.

Por otro lado, la máxima actividad enzimática en este cultivo, 45.9 U/ml, coincide con el

momento en que la velocidad específica de crecimiento es de 0.05 h-1 (figura 8.28), lo que

concuerda con los experimentos anteriores y la literatura revisada. Estos resultados indican que

al manejar una µ < 0.05 h-1, la producción de la enzima de interés también disminuye; por lo

que restringir la glucosa a valores próximos al coeficiente de mantenimiento durante el cultivo

puede resultar contraproducente para la actividad de la enzima de interés. No se presentó

restricción por oxígeno, manteniéndose entre 40 y 50% de saturación durante todo cultivo; por

lo que la disminución de la actividad enzimática solo se debió la limitación de la fuente de

carbono.

Finalmente, una prueba preliminar de actividad fructanasa empleando inulina y FA como

sustrato, indicó que la enzima monitoreada en este proyecto de tesis si tiene actividad β-

fructofuranosidasa. Teniendo un ratio de actividad (sacarosa/inulina) de 40 y un ratio de

(sacarosa/FA) de 16. Esto significa que la enzima tiene más afinidad por los FA que por la

inulina, por lo que se trataría efectivamente de una β-fructofuranosidasa más que de una

inulinasa. Arrizon y col [73] realizó pruebas de actividad con esta cepa en cultivos en lote y

sobre inulina obteniendo un ratio (S/I) de 125, lo que da a entender que el cultivo en continuo

podría favorecer la actividad β-fructofuranosidasa. Otros reportes con cultivos en continuo,

obtienen un ratio (S/I) de 15 [92]; lo que concuerda con lo obtenido en este estudio.

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Figura 8.28. Actividad enzimática y velocidad específica de crecimiento para el cultivo en lote

alimentado 2.

8.5. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa

Con el objetivo de conocer la evolución de la producción de β-fructofuranosidasas en un cultivo

en tiempo real, se desarrolló primeramente una metodología para la determinación de la

actividad β-fructofuranosidasa en un sistema de análisis por inyección secuencial (SIA)

diseñado en el laboratorio de Biotecnología industrial; el cual permitió la automatización del

procedimiento. Posteriormente, el SIA fue acoplado a un cultivo en biorreactor para la medición

en línea de la actividad enzimática. A continuación se exponen los resultados.

8.5.1. Metodología para la curva de calibración en el sistema SIA

El primer objetivo fue desarrollar una metodología para generar una curva de calibración, en la

cual se relacionará la respuesta del equipo con la concentración de azúcares reductores en una

muestra. Para la generación de la curva se emplearon 5 concentraciones conocidas de glucosa:

0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L. La tabla 8.14 detalla los parámetros programados en el sistema SIA

para la determinación de la concentración de glucosa en una muestra. La metodología se

describe a continuación de manera general:

1. La muestra (m) fue mezclada a volúmenes iguales con reactivo DNS (r) mediante el

ciclo de succión r/m/r/m/r/m.

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2. La mezcla se envió a la cámara de calentamiento a 95 °C durante 5 minutos (Al mismo

tiempo se realizó el lavado del sistema de agitación).

3. Después la mezcla fue enviada a la cámara de enfriamiento a 0 °C durante 1 minuto.

4. La mezcla anterior fue diluida en relación 1:4 con acarreador agua y homogenizada en

la cámara de mezclado.

5. La muestra fue inyectada al detector donde fue leída a 540 nm.

6. Se repitió el procedimiento anterior para cada punto de la curva.

Debido a que el sistema SIA posee partes metálicas que están en contacto con la muestra durante

los análisis y debido a que el fenol es corrosivo, se decidió no emplearlo en la preparación del

reactivo DNS. Pruebas preliminares indicaron que la coloración final del ensayo, aunque menos

intensa, continúa siendo proporcional a la concentración de azúcares reductores.

El tiempo de succión/inyección se expresan en segundos. La velocidad de flujo del sistema fue

de 20 µl/s. Cada metodología con el sistema SIA se inició con la inyección de una burbuja de

aire, lo que permitió que la muestra no se diluyera con el acarreador, lo que no es deseable. La

implementación de burbujas de aire presentó un inconveniente. Debido a la configuración y

construcción del sistema SIA, fue común que quedaran atrapadas microburbujas de aire en los

resquicios del sistema, que al acumularse se liberaban en el transcurso de la metodología

evitando una adecuada homogenización de la mezcla, dando una lectura final errónea. Por el

contrario, no usar tapones de aire provoca diluciones indeseadas en la muestra, incrementando

el volumen de trabajo fuera de las capacidades del equipo, haciendo inviable la metodología.

Algunos sistemas SIA hacen uso de dispositivos que eliminan las burbujas presentes en el

sistema [105], pero el sistema empleado en este trabajo no contó con dicho tipo de dispositivos.

Tabla 8.14. Protocolo para un punto de la curva de calibración en el SIA

Descripción Secuencia Posición

válvula Succión Inyección

Tiempo,

s

Aire 0 8 1 0 2

Reactivo DNS 1 9 1 0 1

Muestra 2 2 1 0 1

Reactivo DNS 3 9 1 0 2

Muestra 4 2 1 0 2

Reactivo DNS 5 9 1 0 1

Muestra 6 2 1 0 1

A cámara de calentamiento 7 8 0 1 60

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Lavado mezclador* 8 7 0 1 125

Agitación* 9 22 0 0 15

A cámara de retención* 10 7 1 0 65

A desecho* 11 5 0 1 75

A cámara de enfriamiento 12 8 1 0 30

Enfriamiento 13 8 0 0 60

A cámara de retención 14 8 1 0 30

A cámara de mezclado 15 7 0 1 40

Agitación 16 22 0 0 30

A cámara de retención 17 7 1 0 28

A espectrofotómetro 18 10 0 1 35

Lectura a 540 nm 19 21 0 1 70

Desecho 20 10 0 1 35

Lavado de cámaras** 21 8 0 1 120

A cámara de retención** 22 8 1 0 65

Desecho** 23 5 0 1 70

* Lavado del sistema de mezclado.

** Lavado completo del sistema SIA

El sistema SIA arrojó como respuesta de la lectura una curva de absorbancia contra tiempo. Por

lo tanto, el área bajo la curva es proporcional a la concentración de azúcares reductores en la

muestra. Los datos de cada curva fueron procesados para ser leídos por un programa diseñado

en el software MatLab® R2014b, con el cual se calculó el área bajo la curva para cada condición

(el código del programa se encuentra en el anexo C). Las áreas finalmente fueron analizadas en

el software Statgraphics® Centurion XVI para la obtención de una línea de regresión para la

concentración de glucosa/fructosa liberada en función del área bajo la curva.

La figura 8.29 muestra las curvas generadas por el sistema SIA para cada una de las 5

concentraciones de la curva de calibración. Se realizaron 3 repeticiones de la misma y se puede

apreciar cómo cada grupo de curvas de una concentración dada quedaron próximas entre sí. La

figura 8.30 muestra el ajuste de los datos con una línea de regresión. El coeficiente de regresión

ajustado, R2, fue de 0.997; lo que demuestra que existe un alto grado de correlación entre la

concentración de glucosa en la muestra y la respuesta que arroja el sistema SIA al implementar

la metodología desarrollada para la curva de calibración. Estos resultados demuestran que se

puede desarrollar e implementar una metodología para el monitoreo de la actividad enzimática

basada en la liberación de azúcares reductores, tal como lo es el ensayo que se empleó para la

actividad en este trabajo de tesis.

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Figura 8.29. Respuestas generadas por el SIA para la curva de calibración.

Figura 8.30. Curva de calibración SIA.

Debido a los límites impuestos por la curva de calibración, la metodología desarrollada para la

determinación de la actividad fructanasa teóricamente tiene la capacidad de medir la actividad

enzimática en un rango lineal de 0.01-1.4 U/ml. Para actividades fuera de ese rango debe diluirse

o concentrarse la muestra según se requiera.

2.0 g/L

1.5 g/L

1.0 g/L

0.5 g/L

0.0 g/L

R2 = 0.997

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8.5.2. Metodología para la determinación de actividad β-fructofuranosidasa en el

sistema SIA

Para el desarrollo de la metodología para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa

en el sistema SIA se emplearon muestras del primer reactor en lote alimentado. Principalmente,

se utilizaron 2 muestras de 1 hora (A1) y 2 horas (A2) de haber empezado la alimentación y que

poseían una actividad baja; y 2 muestras de 7 horas (B1) y 8 horas (B2) con mayor actividad.

Se procuró diseñar la metodología con las mismas muestras para evitar un factor de variación

adicional. Se realizaron numerosas pruebas en el sistema SIA buscando la secuencia más

apropiada para lograr una metodología automática para la detección de la actividad enzimática

y que fuera lo más repetible posible.

Tabla 8.15. Protocolo para el blanco de la muestra en el SIA

Descripción Secuencia Posición

válvula Succión Inyección

Tiempo,

s

Muestra 0 2 1 0 4

Dilución 1:10 1 7 0 1 40

Aire 2 8 1 0 2

A cámara de mezclado 3 7 0 1 4

Agitación 4 22 0 0 30

Módulo de dilución 1:10 (si es requerido)

A cámara de retención 5 7 1 0 5

Reactivo DNS 6 9 1 0 2

A cámara de retención 7 7 1 0 1

Reactivo DNS 8 9 1 0 2

Aire 9 8 1 0 2

Resguardo 10 10 0 1 10

Lavado de cámaras 11 8 0 1 120

A cámara de retención 12 8 1 0 65

Desecho 13 5 0 1 70

A cámara de retención 14 8 1 0 20

Desecho 15 5 0 1 30

A cámara de retención 16 10 1 0 4

Sobrenadante 17 1 1 0 1

A cámara de retención 18 10 1 0 2

Sobrenadante 19 1 1 0 1

A cámara de retención 20 10 1 0 4

A partir de esta línea se ejecutan las secuencias 7 a 23 de la tabla 8.14

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99

En la sección 7.12 se describe de manera general la metodología finalmente implementada. La

tabla 8.15 detalla los parámetros programados en el sistema SIA para el blanco de la muestra a

la que se determina la actividad fructanasa. La tabla 8.16 detalla los parámetros programados en

el sistema SIA para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en una muestra.

Tabla 8.16. Protocolo para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en el SIA

Descripción Secuencia Posición

válvula Succión Inyección

Tiempo,

s

Muestra 0 2 1 0 4

Dilución 1:10 1 7 0 1 40

Aire 2 8 1 0 2

A cámara de mezclado 3 7 0 1 4

Agitación 4 22 0 0 30

Módulo de dilución 1:10 (si es requerido)

A cámara de retención 5 7 1 0 5

Sobrenadante 6 1 1 0 1

A cámara de retención 7 7 1 0 1

Sobrenadante 8 1 1 0 1

Aire 9 8 1 0 2

A cámara de incubación 10 10 0 1 35

A cámara de retención 11 7 1 0 40

Desecho 12 5 0 1 55

Lavado sist de mezclado* 13-16 Varios -- -- 280

Lavado cámaras** 17 8 0 1 120

A cámara de retención** 18 8 1 0 65

Desecho** 19 5 0 1 70

A cámara de retención** 20 8 1 0 20

Desecho** 21 5 0 1 30

Incubación a 50 °C 22 10 0 0 200

A cámara de retención 23 10 1 0 30

Reactivo DNS 24 9 1 0 1

A cámara de retención 25 10 1 0 1

Reactivo DNS 26 9 1 0 1

A cámara de retención 27 10 1 0 1

Reactivo DNS 28 9 1 0 2

A cámara de retención 29 10 1 0 3

A partir de esta línea se ejecutan las secuencias 7 a 23 de la tabla 8.14

* Ver lavado del sistema de mezclado tabla 8.14.

** Lavado de cámaras de calentamiento y enfriamiento

Para realizar diluciones mayores a 10, se agregó un módulo con instrucciones que incluyen el

resguardo de la muestra a diluir, la dilución en sí misma y el lavado del sistema para evitar la

contaminación con muestra no diluida. La tabla 8.17 muestra las instrucciones para incrementar

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100

la dilución de la muestra 10 veces; es decir, 1:100. Para diluciones mayores se repitió el módulo,

incrementando la dilución hasta 1:1000.

Tabla 8.17. Protocolo para el módulo de dilución 1:10.

Descripción Secuencia Posición

válvula Succión Inyección

Tiempo,

s

A cámara de retención 5 7 1 0 8

Aire 6 8 1 0 2

A resguardo 7 10 0 1 8

A cámara de retención 8 7 1 0 40

Desecho 9 5 0 1 55

Lavado sistema de mezclado 10 7 0 1 180

A cámara de retención 11 7 1 0 65

Desecho 12 5 0 1 75

A cámara de retención 13 10 1 0 8

Dilución 1:10 14 7 0 1 44

Aire 15 8 1 0 2

A cámara de mezclado 16 7 0 1 4

Agitación 17 22 0 0 30

Desecho 18 10 0 1 60

En la figura 8.31 se aprecian las curvas de respuesta que se generaron al aplicar la metodología

para la determinación de la actividad fructanasa desarrollada en el sistema SIA. El programa

aplicado en el ejemplo de la figura fue para una dilución 1:100, con lo que se demuestra que es

posible alcanzar la repetibilidad aún en diluciones sucesivas realizadas de manera automática

por el mismo SIA.

Es necesario puntualizar que la repetibilidad observada solo se pudo conseguir cuando no hay

presencia de burbujas de aire no deseadas en el sistema. Como ya se comentó en el apartado de

la metodología de la curva de calibración, las burbujas de aire se emplean para mantener una

muestra aislada del acarreador y evitar diluciones cuando no se desean. Contrariamente a lo

deseado, la aparición espontánea de burbujas evita que haya una adecuada homogenización

donde si la debe de haber; provocando que la respuesta de actividad sea significativamente

menor a la real. Las burbujas se generaron debido a la acumulación en resquicios del sistema y

que el flujo del acarreador no logra desplazar; así como en la cámara de calentamiento, donde

la temperatura provoca evaporación del acarreador y la liberación de gases disueltos.

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Figura 8.31. Respuesta SIA para la actividad β-fructofuranosidasa de una muestra.

En la figura 8.32 se observa el impacto que puede tener la presencia de burbujas de aire en etapas

no deseadas durante la metodología para actividad. La muestra del ejemplo es la misma, con la

misma dilución y bajo los mismos parámetros. La presencia espontánea de burbujas puede

afectar en varias etapas del proceso, tales como: la homogenización del sustrato con el

sobrenadante, una inadecuada hidrólisis del sustrato durante la incubación, problemas de

mezclado con el reactivo DNS, reacción de coloración incompleta durante el calentamiento e

interferencias con el espectrómetro durante la lectura; provocando una reducción de la señal de

actividad y afectando la repetibilidad de la técnica.

Muestra

Blanco

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Figura 8.32. Respuesta SIA con y sin generación de burbujas espontaneas para la misma muestra.

Un buen ejemplo de lo expresado anteriormente se da en la figura 8.33, donde se ve la

variabilidad que puede presentarse con la misma muestra; en este caso la muestra B2, que

corresponde a la hora 7 del segundo cultivo en lote alimentado. Obsérvese que las burbujas

pueden afectar incluso a la señal del blanco, que en principio no debe tener coloración por la

ausencia de azúcares reductores en el sobrenadante.

Figura 8.33. Repetibilidad en actividad enzimática para la muestra B2.

Blanco

Sin generación de burbujas

Con generación de burbujas

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Se realizó una comparación entre los resultados de actividad enzimática arrojados por la

metodología en microplaca y los resultados que se obtuvieron con el procedimiento diseñado en

el sistema SIA. En la tabla 8.18 se muestra el condensado de los resultados.

Tabla 8.18. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA

MICROPLACA SIA

MUESTRA Actividad

U/ml

Desv

std

Actividad

U/ml

Desv

std

% Error

SIA vs Mp

A1 8.45 1.20 7.20 3.56 14.79

A2 10.47 0.80 8.34 2.18 20.39

B1 74.45 1.21 74.50 5.33 0.07

B2 83.70 1.95 83.70 6.50 0.00

La desviación que hay entre las repeticiones de una muestra en el SIA pueden llegar a ser hasta

4 veces mayor a las desviaciones que presenta la técnica en microplaca. Como ya se ha

comentado, esto se debe a la variabilidad a la que se ve sometida la respuesta generada en el

SIA debido a la aparición de burbujas en etapas clave de la técnica. Comparando la actividad

promedio entre las dos técnicas, se aprecia que cuanto menor es la actividad mayor es el grado

de separación, pudiendo ser de hasta el 20% de diferencia como en la muestra A2. Resulta que,

al incrementarse la actividad en la muestra, la diferencia entre los promedios de las 2 técnicas

desaparece; con lo que se demuestra que tanto el sistema SIA, como la metodología

implementada en él, tienen el potencial de ser empleados como un método para la determinación

de la actividad fructanasa en una muestra. Claro está que se requiere mayor desarrollo a nivel

del software y hardware para reducir el nivel de variabilidad, ya que por con el diseño probado

la confiabilidad de los resultados solo se puede conseguir con un número elevado de

repeticiones.

Finalmente, las figuras 8.34 y 8.35 muestran que los resultados de las 2 técnicas no son

estadísticamente diferentes a un nivel de confianza del 95%; es decir, estadísticamente las 2

técnicas ofrecen resultados similares. Aunque es necesario señalar, que esta similitud se debe

principalmente a la alta variabilidad presente en la técnica del sistema SIA.

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104

Figura 8.34. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras A.

Pliego y col reportaron una metodología para el monitoreo de la actividad lipasa/esterasa

desarrollado en el mismo sistema SIA empleado en este trabajo de tesis. Reportan una

desviación estándar relativa (RSD) de hasta 8.75% entre los resultados de actividad con la

técnica, y valores de RSD entre 4.29 – 27.79% con la técnica en microplaca [86]. Los valores

son similares para la metodología de actividad fructanasa reportados en este trabajo. Cañizares-

Macías y col reportaron el uso de un sistema FIA (flow injection analysis) genérico con un

termostato acoplado para la determinación azúcares reductores mediante DNS [106]. El sistema

demuestra una alta linealidad entre las curvas de calibración presentadas, pero no validan su

metodología contra otras técnicas de fiabilidad probada; además, el sistema FIA es un equipo

que por diseño es más sencillo que un sistema SIA. Siendo el SIA un equipo más robusto y

versátil.

Figura 8.35. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras B.

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105

8.5.3. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa de un cultivo en

continuo

Durante la realización del segundo cultivo en estado continuo, el biorreactor fue acoplado al

sistema SIA mediante una tubería conectada a una sonda de cerámica en contacto con el cultivo

(figura 8.36 y 8.37), la cual permitió la extracción de sobrenadante libre de células y su inyección

al SIA para la determinación in situ de la actividad fructanasa.

Figura 8.36. 1. Sistema de cultivo en continuo: bioconsola, biorreactor, balanza, bombas de entrada y

salida, tanque de alimentación y recipiente para desecho. 2. Sistema SIA. 3. Línea de acoplamiento.

1

2

3

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106

Figura 8.37. 1. Biorreactor. 2. Sistema SIA. 3. Línea de acoplamiento.

Para la toma de muestra directamente del biorreactor para la determinación de la actividad

enzimática fue necesario añadir algunas líneas (tabla 8.19) al inicio del protocolo descrito en la

tabla 8.15 para contemplar el volumen de la línea de acoplamiento y lavados necesarios del

misma. El protocolo para la actividad enzimática (tabla 8.16) no sufrió modificaciones.

Tabla 8.19. Protocolo para succión de sobrenadante desde biorreactor

Descripción Secuencia Válvula Succión Inyección Tiempo

Aire 0 3 1 0 1

Del biorreactor 1 2 1 0 60

Desecho 2 5 0 1 80

Aire 3 3 1 0 1

Del biorreactor 4 2 1 0 60

Desecho 5 5 0 1 80

Aire 6 3 1 0 1

Del biorreactor 7 2 1 0 60

Desecho 8 5 0 1 90

3

1

2

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La lectura se realizó en concordancia con el muestreo de cada una de las condiciones discutidas

en la sección 8.2.2. Uno de los grandes inconvenientes de los métodos diseñados en el sistema

SIA es que, debido a los ciclos de dilución y limpieza, añadidos al tiempo propio de la

metodología, el análisis de una sola muestra podía llevar más de una hora; sumado a que no

todas las repeticiones fueron útiles debido a la interferencia importante de burbujas, no se

pudieron realizar el número de corridas necesarias por punto para lograr absorber la variabilidad

del método. La tabla 8.20 muestra los resultados generados por el sistema SIA comparados con

los que se obtuvieron en microplaca.

Tabla 8.20. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA en línea.

MICROPLACA SIA

MUESTRA Actividad

U/ml

Desv

std

Actividad

U/ml

Desv

std

% Error

SIA vs Mp

T1 398 30 313 190 -27

T2 126 9 154 39 18

T3 295 30 286 120 -3

T4 65 6 152 23 57

El haber contado con pocas mediciones por punto (entre 2 y 3) imposibilitó el descarte de curvas

pues no había manera de identificar valores atípicos. Por tal motivo, la desviación estándar que

se observa para las mediciones con el SIA son considerablemente altas. Además, el grado de

diferencia con la técnica en microplaca es fluctuante.

Estos experimentos demostraron que es posible desarrollar una metodología que permita el

monitoreo de la actividad β-fructofuranosidasa tanto en línea como fuera de línea. Sin embargo,

aún hay trabajo por realizar tanto en software, hardware y método para lograr la repetibilidad y

precisión que demanda cualquier técnica de medición y monitoreo de actividad enzimática.

Hay reportes donde se logra satisfactoriamente la medición en línea de metabolitos mediante

sistemas SIA, tales como actividad β-galactosidasa [107], azúcares, ácido láctico, proteína y

hasta biomasa [108].

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9. CONCLUSIONES

Las técnicas de monitoreo de la cinética de crecimiento tienen un alto grado de

correlación entre sí (> 95%); siendo la correlación entre peso seco y permitividad la de

mayor importancia, pues se puede conocer la cantidad de biomasa de manera confiable

y en tiempo real durante el cultivo.

La producción de β-fructofuranosidasas es inducida por inulina y fructanos de agave en

cultivos por lote de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.

La producción de β-fructofuranosidasas en cultivos de la levadura Kluyveromyces

marxianus SLP1 se incrementó al mantener la concentración de glucosa en valores

residuales.

Una temperatura de 34 °C y µ = 0.05 h-1 fueron las condiciones de máxima producción

de β-fructofuranosidasas en el rango estudiado. Alcanzando una actividad de hasta 110

U/mg (750 U/ml), que es mayor a lo reportado en la literatura.

Las β-fructofuranosidasas producidas bajo las condiciones probadas demostró un ratio

de actividad de 40 sobre inulina y de 15 sobre fructanos de agave, lo que demuestra una

mayor afinidad de la enzima por fructanos de agave que por inulina; por lo que si se

trataría de una fructanasa.

El sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) puede ser usado para el monitoreo

de la actividad β-fructofuranosidasa fuera de línea con un alto número de corridas por

muestra, y tiene el potencial de ser usado en línea durante un cultivo con realizando

modificaciones de software y hardware.

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10. PERSPECTIVAS

Evaluar la producción de β-fructofuranosidasas en función de la saturación de oxígeno

e inductores (inulina y fructanos de agave) en diferentes sistemas de cultivo.

Escalar el cultivo en continuo para la producción de β-fructofuranosidasas a partir de la

levadura K. marxianus SLP1 para su implementación a nivel industrial.

Modelar la producción de β-fructofuranosidasas en función de distintos estados

fisiológicos de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.

Diseñar e implementar una estrategia de control con base en las técnicas de monitoreo

en línea: espectroscopia dieléctrica y actividad β-fructofuranosidasa (SIA).

Modificar el software y hardware del sistema SIA para hacerlo más robusto, preciso y

confiable para la implementación de metodologías analíticas en y fuera de línea.

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110

11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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market. [Accessed: 01-Jun-2017].

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[10] J. F. T. Spencer and D. M. Spencer, Yeasts in natural and artificial habitats. Springer

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[103] G. Buitrago, L. Soto, G. Páez, K. Araujo, Z. Mármol, and M. Rincón, “Continue

production of single cell protein of Kluyveromyces marxianus var. marxianus from

diluited cheese whey” Rev. Tec. Ing. Univ. Zulia, vol. 31, no. D, pp. 107–113, 2008.

[104] A. Margaritis and P. Bajpai, “Continuous ethanol production from Jerusalem artichoke

tubers. I. Use of free cells of Kluyveromyces marxianus” Biotechnol. Bioeng., vol. 24, no.

7, pp. 1473–1482, Jul. 1982.

[105] M. Trojanowicz, Advances in flow analysis. John Wiley & Sons, 2008.

[106] P. Cañizares-Macías, L. Hernández-Garciadiego, and H. Gómez-Ruíz, “An Automated

Flow Injection Analysis Procedure for the Determination of Reducing Sugars by DNSA

Method” vol. 66, no. 3, 2001.

[107] H.-A. Kracke-Helm, L. Brandes, B. Hitzmann, U. Rinas, and K. Schügerl, “On-line

determination of intracellular β-galactosidase activity in recombinant Escherichia coli

using flow injection analysis (FIA)” J. Biotechnol., vol. 20, no. 1, pp. 95–104, 1991.

[108] J. Nielsen, K. Nikolajsen, S. Benthin, and J. Villadsen, “Application of flow-injection

analysis in the on-line monitoring of sugars, lactic acid, protein and biomass during lactic

acid fermentations” Anal. Chim. Acta, vol. 237, pp. 165–175, 1990.

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119

12. ANEXOS

A. Metodología para la prueba de actividad proteasa

Soluciones:

- Buffer A: 50 mM citrato de sodio pH 4.5

- Sustrato: 0.5% azocaseína + 50 mM citrato de sodio pH 4.5

- Extracto: muestra a analizar

- Stop: 20% TCA en agua destilada.

Metodología

Blanco Muestra

Mezclar 225 µl de buffer A con 25 µl de

extracto

Mezclar 225 µl de buffer A con 25 µl de

extracto

Agregar 250 µl de solución stop y agitar Agregar 250 µl de sustrato y agitar

Incubar a 34 °C durante 60 min a 900 rpm. Incubar a 34 °C durante 60 min a 900 rpm.

Agregar 250 µl de sustrato. Agregar 250 µl de solución stop.

Incubar a -20 °C durante 5 minutos. Incubar a -20 °C durante 5 minutos.

Centrifugación a 10,000 g durante 5 minutos

a 4 °C

Centrifugación a 10,000 g durante 5 minutos

a 4 °C

Recuperar sobrenadante y leer a 366 nm. Recuperar sobrenadante y leer a 366 nm.

Las unidades de actividad proteasa se calculan con la siguiente fórmula:

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎 (𝑈𝑚𝑙⁄ ) =

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎366𝑛𝑚− 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜366𝑛𝑚

𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠𝑖𝑛𝑐𝑢𝑏𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 𝑚𝑙𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

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B. Datos del primer cultivo en estado continuo

MU

ES

TR

A

Tem

per

atu

ra,

°C

µ,

h-1

Glu

cosa

ali

men

taci

ón

, g

/l

Co

nte

o c

ám

ara

,

Mce

l/m

l

CA

SY

,

Mco

nte

os/

ml

DO

, a

bso

rba

nci

a

Bio

ma

sa,

g/l

Per

mit

ivid

ad

,

pF

/cm

O2,

%

CO

2,

%

dO

2,

%

Eta

no

l, %

Act

ivid

ad

fru

cta

na

sa,

U/g

Act

ivid

ad

fru

cta

na

sa,

U/m

l

T1R1 26 0.05 20 1270 2078 17.7 8.64 3.1 25.727 0.727 11.7 -- 20589 177.87

T1R2 26 0.05 20 1280 2655 19 8.83 2.97 25.391 0.728 16.3 -- 20676 182.53

T1R3 26 0.05 20 1285 2060 20.9 8.94 3.1 25.74 0.878 11.9 -- 14500 129.60

T2R1 34 0.05 20 1050 2297 13 7.11 3.48 21.49 0.149 2.7 -- 114303 812.22

T2R2 34 0.05 20 1015 2081 14.2 6.94 3.53 22.112 0.16 2.6 -- 128628 892.24

T4R2 26 0.4 20 227 231 7.5 3.12 1.78 20.26 1.456 2.6 -- 936 3.25

T2R3 34 0.05 20 1100 2139 14.8 7.05 3.62 22.199 0.149 2.6 -- 79748 562.07

T4R1 26 0.4 20 240 239 6.9 2.92 1.81 20.279 1.448 2.6 -- 1113 2.92

T3R1 34 0.4 20 358 552 8.4 3.31 1.67 20.85 1.857 2.6 -- 4631 15.34

T3R2 34 0.4 20 333 540 8.6 3.25 1.7 20.805 1.801 2.6 -- 11374 37.00

T4R3 26 0.4 20 255 243 7.8 3.05 1.81 20.139 1.496 2.6 -- 614 1.87

T3R3 34 0.4 20 460 502 8.8 3.36 1.69 20.628 1.855 2.6 -- 10653 35.75

T5R1 26 0.05 60 1483 2372 17.5 9.35 3.16 20.082 1.685 100 0.667 13785 128.92

T5R2 26 0.05 60 1465 2350 17.3 9.44 3.19 20.087 1.713 100 0.651 13672 129.09

T5R3 26 0.05 60 1090 2612 15.8 9.17 3.04 19.945 1.782 100 0.717 11823 108.44

T7R1 34 0.05 60 503 302 11.1 6.14 2.45 21.553 1.456 2.7 1.445 12185 74.86

T7R2 34 0.05 60 490 277 11.7 5.93 2.46 21.491 1.45 2.7 1.454 12135 71.95

T7R3 34 0.05 60 518 273 11.6 6.37 -- -- -- -- -- 15837 100.91

T6R1 26 0.4 60 204 227 6.9 2.35 1.11 20.051 2.434 2.6 0.205 5621 13.21

T6R2 26 0.4 60 233 245 6.6 2.16 1.08 20.005 2.339 2.6 0.234 2044 4.42

T6R3 26 0.4 60 255 252 7.3 2.61 1.07 19.884 2.29 2.6 0.127 2455 6.41

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T8R1 34 0.4 60 458 354 10.1 5.73 2.62 17.92 7.936 2.7 3.222 95 0.55

T8R2 34 0.4 60 435 395 10.8 5.87 2.66 17.849 7.883 2.7 3.103 80 0.47

T8R3 34 0.4 60 470 467 11.4 6.40 2.69 17.639 8.443 2.7 3.289 259 1.66

T9R1 30 0.225 40 620 794 11.2 5.13 2.16 19.48 4.13 2.7 1.837 4532 23.24

T9R2 30 0.225 40 714 917 11 5.21 2.38 19.431 4.194 2.7 1.871 5121 27.12

T9R3 30 0.225 40 738 986 11.9 5.43 2.42 20.186 0.24 2.7 1.832 5697 30.93

T10R1 30 0.225 40 622 1056 11.1 6.55 2.31 18.793 4.296 2.7 1.784 1814 16.54

T10R2 30 0.225 40 673 1142 12.9 6.68 2.73 18.764 4.244 2.7 1.784 1943 17.52

T10R3 30 0.225 40 650 1250 12.7 6.87 -- -- -- -- -- 2149 19.93

T11R1 30 0.225 40 887 1323 13.1 6.79 2.68 17.873 4.209 2.6 1.732 3997 27.04

T11R2 30 0.225 40 768 1243 12.7 6.66 2.85 17.803 4.244 2.7 1.69 4823 32.12

T11R3 30 0.225 40 668 1422 12.9 6.87 2.85 17.761 4.038 2.7 1.76 5025 34.53

T12R1 30 0.225 40 590 965 11.9 5.42 2.33 17.612 4.347 2.7 1.949 4735 23.31

T12R2 30 0.225 40 680 910 10.8 5.25 2.33 17.509 4.246 2.7 1.931 4605 23.29

T12R3 30 0.225 40 575 685 10.4 5.36 2.31 17.573 4.325 2.7 1.941 4842 25.96

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C. Código del programa para calcular el área bajo la curva de la curva de

calibración SIA

[FileName,PathName]=uigetfile('*.xlsx','Selecciona el archivo de Excel'); addpath(PathName) dat1=uiimport(FileName); datos=dat1.data; a=input('Cuántas corridas se realizaron? '); %Número de puntos de la

curva(suele ser 5) y=input('Cuántas repeticiones por corrida? '); %Número de veces que se

ejecutó el programa para repetibilidad z=input('Cuántos conteos tiene cada curva? '); %Número de datos generados

en las curvas ct=1; cI=2; for c=1:y for f=1:a for b=1:z t(f,c,b)=datos(b,ct); I(f,c,b)=datos(b,cI); i(b)=t(f,c,b); j(b)=I(f,c,b); end ct=ct+2; cI=cI+2; A(f,c)=trapz(i,j); m(f)=mean(A(f,:)); s(f)=std(A(f,:)); hold on plot(i,j) end end hold off A m s legend('0.0 g/l','0.5 g/l','1.0 g/l','1.5 g/l','2.0 g/l')

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D. Código del programa para calcular el área bajo la curva de muestras para

determinación de actividad β-fructofuranosidasa

[FileName,PathName]=uigetfile('*.xlsx','Selecciona el archivo de Excel'); addpath(PathName) dat1=uiimport(FileName); datos=dat1.data; % Este programa presupone que son repeticiones de un mismo punto a=input('Cuántas corridas se realizaron? '); z=input('Cuántos conteos tiene cada curva? '); ct=1; cI=2; for c=1:a for f=1:2 for b=1:z t(f,c,b)=datos(b,ct); I(f,c,b)=datos(b,cI); i(b)=t(f,c,b); j(b)=I(f,c,b); end ct=ct+2; cI=cI+2; A(f,c)=trapz(i,j); m(f)=mean(A(f,:)); s(f)=std(A(f,:)); hold on plot(i,j) end end hold off A m s Ar=m(2)-m(1) legend('Blanco','Muestra')

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E. Código del programa para calcular la actividad β-fructofuranosidasa de muestras

provenientes de un biorreactor acoplado al sistema SIA

[FileName,PathName]=uigetfile('*.xlsx','Selecciona el archivo de Excel'); addpath(PathName) dat1=uiimport(FileName); datos=dat1.data; a=input('Cuántas muestras se tomaron? '); %Número de muestras tomadas del

reactor z=input('Cuántos conteos tiene cada curva? '); %Cantidad de renglones

generados por lectura d=input('Qué dilución se empleó?'); %Depende del programa del SIA empleado:

10, 100, 1000 ó más cTb=1; cAb=2; cTm=3; cAm=4; for c=1:a for b=1:z Tb(c,b)=datos(b,cTb); Ab(c,b)=datos(b,cAb); Tm(c,b)=datos(b,cTm); Am(c,b)=datos(b,cAm); xb(b)=Tb(c,b); yb(b)=Ab(c,b); xm(b)=Tm(c,b); ym(b)=Am(c,b); end cTb=cTb+4; cAb=cAb+4; cTm=cTm+4; cAm=cAm+4; Ab(c)=trapz(xb,yb); Am(c)=trapz(xm,ym); if Am(c)>Ab(c) Aaj(c)=Am(c)-Ab(c); else Aaj(c)=0; end ActEnz(c)=Aaj(c)*0.06546*d*0.7401; m=c-1; figure (c); hold on plot(xb,yb) plot(xm,ym) title(['Muestra T',num2str(m)]) legend('Blanco','Muestra') hold off end Aaj mAaj=mean(Aaj) ActEnz mActEnz=mean(ActEnz)

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F. Memorias: “Sustainable and Integrated use of Agave”. III International

Symposium on Agave. Guadalajara, Jalisco, Mexico. November 3-5, 2016

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