Mοριακή διαγνωστική στα Νευρολογικά Νοσήματα

Ιωαννίδης Αναστάσιος BSc, MD, PhDΕπίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας

Πανεπιστήμιο ΠελοποννήσουΕπιστημονικός Υπεύθυνος Εργαστηρίου Medisyn

ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

Νευρολογική διαταραχή ή νευρολογικό νόσημα θεωρείται κάθε

Δομική

Βιοχημική

Ηλεκτρική

διαταραχή στο νευρικό σύστημα (εγκέφαλος, νωτιαίος μυελός, περιφερικοί νευρώνες)

ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

ΚΑΤΑ ICD-10G00-G09 Φλεγμονώδεις παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος

G10-G13 Συστηματικές ατροφίες που προσβάλλουν πρωτοπαθώς το ΚΝΣ

G20-G26 Εξωπυραμιδικές και κινητικές διαταραχές

G30-G32 Άλλα εκφυλιστικα νοσήματα του νευρικού συστήματος

G35-G37 Απομυελινωτικά νοσήματα του ΚΝΣ

G40-G47 Επεισοδιακές και παροξυσμικές διαταραχές

G50-G59 Διαταραχές των νεύρων, των νευρικών ριζών και πλεγμάτων

G60-G64 Πολυνευροπάθειες και άλλες διαταραχές του περιφερικού νευρικού συστήματος

G70-G73 Παθήσεις της νευρομυϊκής σύναψης και των μυών

G80-G83 Εγκεφαλική παράλυση και άλλα παραλυτικά σύνδρομα

G90-G99 Άλλες διαταραχές του νευρικού συστήματος

ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ

Μοριακή Διαγνωστική: είναι μια συλλογή από τεχνικές που

χρησιμοποιούνται στη διερεύνηση της δομής και της

λειτουργίας του γενετικού υλικού, τόσο του ίδιου του ατόμου

όσο και των μικροοργανισμών που τον προσβάλλουν

Είναι ένα εργαλείο που συμβάλλει στην πρόγνωση, διάγνωση

και θεραπευτική αντιμετώπιση του ατόμου

Λοιμώξεις Κεντρικού Νευρικού

Συστήματος

Μηνιγγίτιδα

Εγκεφαλίτιδα

Μηνιγγοεγκεφαλιτιδα

Εγκεφαλικό απόστημα

Λοιμώξεις που δρουν στο ΚΝΣ μέσω τοξινών:

τέτανος, αλλαντίαση, διφθερίτιδα

Λοιμώξεις ΚΝΣ που οφείλονται σε:

Νευροχειρουργικές επεμβάσεις

Τραύμα του ΚΝΣ

Νευροτρόπους ιούς (πολιομυελίτιδας, έρπητα

ζωστήρα, HTLV-1)

Η εισαγωγή των μοριακών μεθόδων έγινε με κύριο σκοπό να επιλυθούν οι

αδυναμίες των κλασικών μεθόδων, έτσι ώστε ο αιτιολογικός παράγοντας της

λοίμωξης να ταυτοποιείται αξιόπιστα και γρήγορα με στόχο την εφαρμογή

αιτιολογικής θεραπείας

Μοριακή διαγνωστική και λοιμώξεις

❖ Μη καλλιεργήσιμα παθογόνα

❖ Δύσχρηστα ή αργά αναπτυσσόμενα

παθογόνα

❖ Mycobacterium tuberculosis

❖ Legionella pneumophila

❖ Πολύ μολυσματικοί παράγοντες που είναι

επικίνδυνοι

❖ Francisella tularensis

❖ Brucella species

❖ Ebola virus

❖ Παθογόνα σε χαμηλή συγκέντρωση

❖ Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση σε δείγματα

μικρού/πολύ μικρού όγκου

❖ Αντιική ευαισθησία φαρμάκων

❖ HIV μόλυνση

❖ Μη βιώσιμοι παθογόνοι μικροοργανισμοί

Πλεονεκτήματα

❖ Μεγαλή ευαισθησία (High sensitivity)

❖ Θεωρητικά μπορεί να ανιχνευθεί η

παρουσία ενός και μόνο παθογόνου

μικροοργανισμού (single

cell/molecule)

❖ Υψηλή ειδικότητα (High specificity)

❖ ανίχνευση συγκεκριμένων γονότυπων

❖ ανίχνευση φαρμακευτικής αντοχής

❖ πρόβλεψη μολυσματικότητας

❖ Ταχύτητα (Speed)

❖ Πιο γρήγορα από τις συμβατικές

μεθόδους καλλιέργειας για

συγκεκριμένα παθογόνα

❖ Ευκολία (Simplicity)

❖ Αυτοματοποιημένες μέθοδοι/δοκιμασίες

❖ Δεν επηρεάζονται από τα αντιμικροβιακά

Μειονεκτήματα

❖ Κόστος

❖ Η μεγάλη ειδικότητα απαιτεί την ύπαρξη

κλινικών δεδομένων πριν τη μοριακή

διερεύνηση

❖ Υψηλή εξειδίκευση άρα και

ανάγκη εξειδικευμένου

προσωπικού

❖ Νέοι λοιμογόνοι/παθογόνοι παράγοντες

❖ Υψηλή ειδικότητα? Συχνά προκαλεί

ερωτήματα για την κλινική σημασία

του αποτελέσματος

Διαχείριση κλινικών δειγμάτων & μοριακή ανάλυση

Κλινικό Δείγμα

Λύση-Καθαρισμός

Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος

mRNA

Ιϊκό RNA

rRNA

ΗλεκτροφόρησηΠροϊόντα

Κλωνοποίηση

RT-PCR

Αλληλούχηση

DNA

cDNA

PCR

Υβριδισμός

Μικροσυστοιχίες

Αλληλούχιση επόμενης γενιάς

ΑΛΛΗΛΟΥΧΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ 16s ή 23s ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΟΥ RNA

Muzzi A, Mora M, Pizza M, Rappuoli R, Donati C. Conservation of meningococcal antigens in the genus Neisseria. MBio. 2013 Jun 11;4(3)

ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ (Microarray Comparative Genomic

Hybridization –MCGH)

ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΙΑΣ(Next Generation Sequencing - NGS)

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΤΥΠΟΥ MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry - MALDI-TOF MS)

hybriSpot 24TM

hybriSpot 24TM

ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

ΚΑΤΑ ICD-10G00-G09 Φλεγμονώδεις παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος

G10-G13 Συστηματικές ατροφίες που προσβάλλουν πρωτοπαθώς το ΚΝΣ

G20-G26 Εξωπυραμιδικές και κινητικές διαταραχές

G30-G32 Άλλα εκφυλιστικά νοσήματα του νευρικού συστήματος

G35-G37 Απομυελινωτικά νοσήματα του ΚΝΣ

G40-G47 Επεισοδιακές και παροξυσμικές διαταραχές

G50-G59 Διαταραχές των νεύρων, των νευρικών ριζών και πλεγμάτων

G60-G64 Πολυνευροπάθειες και άλλες διαταραχές του περιφερικού νευρικού συστήματος

G70-G73 Παθήσεις της νευρομυϊκής σύναψης και των μυών

G80-G83 Εγκεφαλική παράλυση και άλλα παραλυτικά σύνδρομα

G90-G99 Άλλες διαταραχές του νευρικού συστήματος

G00-G09 Φλεγμονώδεις παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος

G10-G13 Συστηματικές ατροφίες που προσβάλλουν πρωτοπαθώς το ΚΝΣ

G20-G26 Εξωπυραμιδικές και κινητικές διαταραχές

G30-G32 Άλλα εκφυλιστικα νοσήματα του νευρικού συστήματος

G35-G37 Απομυελινωτικά νοσήματα του ΚΝΣ

G40-G47 Επεισοδιακές και παροξυσμικές διαταραχές

G50-G59 Διαταραχές των νεύρων, των νευρικών ριζών και πλεγμάτων

G60-G64 Πολυνευροπάθειες και άλλες διαταραχές του περιφερικού νευρικού συστήματος

G70-G73 Παθήσεις της νευρομυϊκής σύναψης και των μυών

G80-G83 Εγκεφαλική παράλυση και άλλα παραλυτικά σύνδρομα

G90-G99 Άλλες διαταραχές του νευρικού συστήματος

Από τα, περίπου 6000 γενετικά νοσήματα που αναφέρονται στον κατάλογο των κληρονομικών νοσημάτων McKusick, το 1/3 προσβάλλει, με κάποιον τρόπο, το νευρικό σύστημα. Ο κύριος λόγος για τον οποίο το νευρικό σύστημα εμφανίζει τον μεγαλύτερο αριθμό γενετικών νοσημάτων από κάθε άλλο σύστημα του ανθρώπινου οργανισμού, φαίνεται να σχετίζεται

με το γεγονός ότι, το 1/3, περίπου, των γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος εμπλέκεται στη διαδικασία ανάπτυξης του νευρικού συστήματος.

Τα γενετικά νοσήματα νευρικού συστήματος δεν είναι

ίσως πολύ συχνά, αλλά το βάρος που επιφέρουν για το

άτομο και την κοινωνία είναι δυσβάσταχτο αφού συχνά

οδηγούν σε σημαντική αναπηρία ήδη από τα πρώτα

χρόνια της ζωής και έχουν μία αναπόφευκτη προοδευτική

επιδείνωση.

Κληρονομικά

Νόσος των Charcot-Marie-

Tooth

Νόσος του Huntington

Κληρονομικές Αταξίες

Μυοτονική Δυστροφία

Μυϊκές Δυστροφίες

Μιτοχονδριακά Νοσήματα

Σποραδικά

Νόσος του Alzheimer

Σκλήρυνση κατά πλάκας

Πλάγια Μυατροφική

Σκλήρυνση

Νόσος του Parkinson

Μέχρι και τη δεκαετία του 80 τα

γενετικά νοσήματα του

νευρικού συστήματος ήταν

συνδεδεμένα με αισθήματα

«θεραπευτικής απαισιοδοξίας»

Η επανάσταση στη Μοριακή Βιολογία

στη δεκαετία του 90 (ανάλυση

σύνδεσης, ανάλυση μεταλλάξεων)

οδήγησε στη μοριακή προσπέλαση

της αιτιοπαθογένειας των

Νευρογενετικών Νοσημάτων

Η Νόσος του Huntington είναι το

πρώτο νόσημα που χαρτογραφήθηκε

στις αρχές της δεκαετίας του 90 με

τη χρήση γενετικών δεικτών (RFLPS

markers)

Σήμερα ένας αξιόλογος αριθμός

νευρολογικών νοσημάτων ταυτοποιείται

μέσω γενετικού test και παρέχεται η

δυνατότητα στον ασθενή για :

•Προσυμτωματικό έλεγχο

•Γενετική συμβουλή

•Προγεννητικό έλεγχο

ΝΟΣΗΜΑ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΤΕΣΤ

Νόσος του Huntington (HD) repeat test

Αταξία του Friedreich (FRDA) repeat test

Πολυνευροπάθειες (CMT1A,CMT1B, CMT1X,

CMT2, CMT1F, CMT1E. CMT2D)

sequencing test, MLPA evaluation, Long PCR

Μυοτονική Δυστροφία (DM1, DM2) southern blot test

TP-PCR

Νωτιαιοπαρεγκεφαλιδικές αταξίες

(SCA1, SCA2, SCA3. SCA6, SCA7, SCA8,

SCA10, SCA12, SCA17)

repeat test

Οδοντοτοερυθροωχρολουιζιανή ατροφία

(DRPLA)

repeat test

Πλάγια Μυατροφική σκλήρυνση ( ALS) sequencing test

RP-PCR

Νόσος του Parkinson (PARK) sequencing test, MLPA evaluation

Οικογενής σπαστική παραπληγία (HSP) sequencing test, MLPA evaluation

Μιτοχονδριακά Νοσήματα sequencing test

southern blot

RFLPS

Μυϊκή Δυστροφία (DMD) southern blot

Η μοριακή

μελέτη των

νευρολογικών

νοσημάτων

αποκάλυψε :

Την κλινική και

γενετική

ετερογένεια των

νευρολογικών

νοσημάτων

Την ύπαρξη των

δυναμικών

μεταλλαγών

Πως η βλάβη

ενός γονιδίου έχει

πολυγονιδιακές

επιπτώσεις

Κλινικός τύπος CMT Γενετική ταξινόμηση CMT Συνήθης φαινότυπος Γονίδια

CMT1 (MCV <38m/s) Γενετική ταξινόμηση CMT Κλασσική CMT με ετερογένεια ως

προς τη βαρύτηταΔιπλασιασμός PMP22

CMT1A Κλασική CMT, βαριά CMT MPZ

CMT1B Κλασική CMT LITAF

CMT1C Κλασική CMT, βαριά CMT EGR2

CMT1D Κλασική CMT, βαριά CMT Σημειακές μεταλλαγές PMP22

CMT1E Κλασική CMT NEFL

CMT1F Κλασική CMT, βαρύτερη στους

άνδρεςGJB1

CMTX Συνήθως βαριά CMT GDAP1, MTMR2/MTMR13, SH3TC2, NDRG1,

EGR2, PRX, HK1, FGD4, FIG4

CMT4A, CMT4B, CMT4C, CMT4D,

CMT4E, CMT4F, CMT4G, CMT4H, CMT4J

Κλασική CMT MFN2

CMT2 (MCV >38m/s) CMT2A Κλασική CMT NEFL, MPZ, GDAP1

CMT2E,CMT2I, CMT2K Κυρίως αισθητική συμμετοχή

(παρόμοια εικόνα με HSN1)RAB7

CMT2B Κυρίως κινητική συμμετοχή

(παρόμοια εικόνα με dHMN)TRPV4, GARS, HSPB1, HSPB8

CMT2C, CMT2D, CMT2F, CMT2L Κλασική CMT, ήπια στις γυναίκες με

μορφή CMT2GJB1

CMTX Συνήθως κλασική ή βαριά CMT LMNA, MED25, GDAP1

CMT2B1, CMT2B2, CMT2H Κλασική HNPP Έλλειψη PMP22

HNPP HNPP Κλασική HNPP ενίοτε και με στοιχεία

κλασικής CMTΣημειακές μεταλλαγές PMP22

Πολυνευροπάθειες

Νευρολογικά νοσήματα

που προκαλούνται από

επανάληψη

τρινουκλεοτιδίων

20ς αιώνας, νέες μοριακές

τεχνικές καινούργιες

δυνατότητες

microarrays

Next generation sequencing -

Exome sequencing

ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ(MICROARRAYS)

Η βασική αρχή των

DNA τσιπς είναι ότι

ένα μόριο mRNA θα

προσκολληθεί ειδικά,

μέσω δημιουργίας

ζευγών βάσεων, με

ένα μόριο DNA που

έχει

συμπληρωματική

αλληλουχία

ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ

ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΙΑΣ(NEXT GENERATION SEQUENCING)

ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ

ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΕΞΟΝΙΩΝ(EXOME SEQUENCING)