1

Metode optice de analizainstrumentala

Cursul 11

2

OBIECTIVE

� Prezentarea tipurilor de metode optice� Principiile fundamentale ale metodelor optice

� Spectroscopia moleculara UV – VIS� Principii generale� Variante de lucru� Determinari calitative� Determinari cantitative

� Spectrometrie atomica – notiuni fundamentale

3

METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC

In functie de natura interactiunii dintre radiatii si substante:

1. Metode optice de absorbţie de energie� Spectrofotometrie moleculară - UV, VIS, IR� Spectroscopie atomică

2. Metode optice de emisie de energie� Spectroscopie atomică – de emisie – domenii diverse de

lungimi de unda� Spectrofotometrie moleculară - fluorescenta,

fosforescenta, chemiluminiscenta, difuzia luminii

4

3. Metode de fluorescenta, fosforescenta, chemiluminiscenta

� Metode de difractie� Metode refractometrice� Metode polarimetrice� Metode de difuzie a luminii� Metode combinate

5

METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC

in functie de tipul de analit cercetat

Metode optice moleculare� absorbţie de energie: Spectrofotometrie (UV, VIS, IR)� emisie de energie - fluorescenta, fosforescenta,

chemiluminiscenta, difuzia sau difractie luminii, polarimetrie, refractometrie

Metode optice atomice� absorbţie de energie Spectroscopie atomică de

absorbtie AAS� emisie de energie Spectroscopie atomică de emisie OES

6

Principii fundamentale ale spectroscopieioptice

Se bazeaza pe absorbţia sau emisia radiaţiilor electromagneticede către molecule sau atomi

• radiaţia electromagnetică are:• proprietăţi de undă şi de particulă• se caracterizeaza prin :

1. lungimea de undă λ – cm (micrometri µm, nanometri nm, milimicroni mµ, angstromi Ǻ

2. frecvenţa ν (nr cicli/sec) - herzi Hz 3. amplitudine A - cm4. Energie - eV, keV , meV, calorii (cal, kcal), , ergi

.

7

Caracterizarea undelor electromagnetice

Lungimea de undă (λ) = wave lengthAmplitudine = amplitude

Unde cu frecvenţă înaltă = High frequency wavesUnde cu frecvenţă joasă = Low frequency waves

8

Rezultatul determinariispectroscopice → spectru

• spectrul prezinta grafic energia (emisă sau absorbită) in functie de lungimea de unda

• Spectrele de absorbţie→ A = f(λ).

9

Rezultatul determinarii spectroscopice → spectru

• Fiecare substanţă are un spectru de absorbţiecaracteristic:

•• ca formă generală,• ca domeniu spectral, • ca număr de maxime(picuri)

• ca raporturi întreintensităţile diverselorpicuri

10

11

Absorbţia radiaţiei electromagneticeNotiuni fundamentale

� Considerăm o radiaţie incidentă monocromatică, Io, care cade pe o celulă conţinând proba (substanta de analizat), celula are lungimea l cm iar concentraţia substanţei ce absoarbe lumina este C.

Transmitanta T Absorbanta AT = I1/I0

A = -ln(T)

12

LEGILE ABSORBTIEI - Legea Lambert-Beer

ln(I0/I) = kl

A = kl

k - coeficientul de absorbţiel – lungimea cuvei

k = const. · C

k - coeficient molar de extincţie (absorbanţă) notat ε, pentru C exprimata in [mol/l]

A = εlC

I = I0·e-kl

Forma generala a legii Lambert-Beer este:

13

SPECTROMETRIE UV – VIS (moleculara) – Caracterizare generala

� Spectrofotometrie in domeniul de lungimi de undaultraviolet (200-400 nm) si vizibil (400-750 nm)

� Aparatele utilizate se numesc spectrofotometreUV-VIS

� Se determina molecule, deci substante

14

ACTIVITATE INDEPENDENTA

� Care din urmatoarele determinari optice aplicate la controlul alimentelor se desfasoara in domeniul UV si care in domeniul VIS:

1. Determinarea polifenolilor λ = 760 nm2. Determinarea flavonoidelor λ = 510 nm3. Determinarea HMF din miere λ = 284 si 336 nm4. Determinarea proteinelor (Bradford) λ = 595 nm5. Determinarea prolinei λ = 510 nm6. Determinarea catalazei (Beers) λ = 240 nm 7. Determinarea catalazei (Guaiacol) λ = 570 nm8. Determinarea peroxidazei λ = 470 nm9. Determinarea nitritilor λ = 520 nm

15

Aparatura utilizată

Schema bloc pentru un spectrometru de absorbţie

• toate componentele optice trebuie să fie transparente pentru domeniulde lungimi de unda ales !!!!

16

Spectrofotometru in UV VIS

Spectrometru FT-IR

17

Caracterizarea părţilor componente ale aparaturii in spectrometria UV VIS

1. Sursa� Emite semnalul (radiatia)� semnalul emis trebuie să fie o radiaţie continuă

în domeniul ales;� semnalul trebuie să fie constant

2. Monocromatorul� scop: separarea radiaţiei policromatice într-una

monocromatică� dispozitiv de tip optic (prisme)

18

3. Cuvele pentru probă• materiale transparente în domeniul lungimii de undă

utilizate;

� grosimea trebuie să fie reproductibilă, constantă, cunoscută, măsurabilă.� ultraviolet - cuve din cuarţ (λ 200 nm – 400 nm) � vizibil –cuve din sticlă moale sau Pyrex (λ 300 nm –

2,5µm)

19

4. Detectorii

� fotomultiplicatoare, emulsii fotografice, termocuple, celule fotoconductive, celule pneumatice şi celule fotoelectriceîn funcţie de domeniul spectrului.

� în domeniul UV – vizibil - fotocelule, celule fotomultiplicatoare, filmefotografice

20

Părţi componente ale spectrofotometruluide absorbţie UV VIS

Diferentieri functionale – UV/VIS

21

Spectrometria de absorbţieîn UV-VIS - principii

Principiu general� Unele substanţe (nemetale, metale, compuşi ai acestora, substanţe organice) au proprietatea de a forma cu reactivi specifici, în anumite condiţii, compuşi solubili coloraţi. Intensitatea de culoare a compusului format, numit compus colorimetrabil, este direct proporţională cu concentraţia sa în anumite limite ale acesteia.

� Metoda spectrofotometrică molecularǎ se bazează pe determinarea (masurarea, citirea) la un aparat numit spectrofotometru a absorbanţei unei soluţii colorate de o concentraţie anume, la o lungime de undă specifică, în domeniul ultraviolet (UV) sau vizibil (VIS).

22

� Orice determinare spectrofotometrică se caracterizează prin următoarele aspecte:

� reactivul de culoare utilizat, adică reactivul care determină formarea unui compus colorimetrabil prin reacție cu specia pe care dorim să o determinăm;

� lungimea de undă λ la care se face determinarea, specifică pentru fiecare compus şi nominalizată în metodă;

� dimensiunea cuvei aparatului care se utilizează(drumul optic; de cele mai multe ori este 1 cm).

23

Spectrometria de absorbţieîn UV-VIS

Variante de lucru:1. Colorimetria (VIS)

2. Fotometria (VIS: lumina incidentă estefiltrată prin filtre optice, cu spectru larg)

3. Spectrofotometria (UV, VIS: lumina incidentăeste filtrată prin monocromatoare, domeniulîngust)

24

Colorimetria� intensitatea culorii probei se compară vizual, în lumină albă, cu un set de soluţii etalon de concentratie cunoscuta - prelucrate în condiţiiabsolut identice cu proba.

� În această tehnică se pot realiza măsurători, prin comparaţie vizuală, în eprubetă, la lumina zilei, rezultând analize chimice cuexactităţi < decât 1%.

25

� este o metodă subiectivă şi mai puţin selectivă

� rezultatele depind mult de persoana care executăanaliza deoarece sensibilitatea maximă a ochiuluiomenesc atinge maximul pentru domeniul 550-560nm (domeniul culorii verzi), lucru important când compararea probei cu etalonul se face vizual

� Cu cât există mai multe soluţii etalon, pentrucomparaţie, cu atât metoda este mai exactă.

26

Colorimetria

.tropical.com.pl/images/upload/fck/image/test.jpg

27

Culoarea unui compus nu este culoarea absorbitaci este culoarea care ramane dupa ce se scade frecventa absorbita din sursa de radiatii

28

ACTIVITATE INDEPENDENTA

� Pentru compusii care se determina la activitatea independenta anterioarascrieti culoarea compusuluicolorimetrabil care se formeaza si caruiai se determina absorbanta

29

Fotometria şi spectrofotometria

� măsoară instrumental lumina transmisă de o soluţie colorată (vizibil) sau incolora (ultraviolet) lucrând cu o sursă de lumină monocromatică. � Când lumina incidentă este filtrată, prin filtre optice, având un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie

� când domeniul filtrat este mai îngust (utilizând monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie.

� La spectrofotometrie, este posibilă fixarea mai precisă a lungimii de undă la care se lucrează.

30

� Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de absorbţie, adică o curbă, obţinută prin măsurareasemnalului în funcţie de lungimea de undă a radiaţieiincidente.

� În literatura de specialitate uneori se foloseşte pentruambele metode şi denumirea de metodă colorimetrică (sauchiar spectrocolorimetrică), ceea ce uneori poate crea confuzii.

� În domeniul UV, ochiul omenesc nepercepând lumina, se utilizează doar spectrofotometria.

31

Determinari calitative in spectroscopiaUV VIS

λ max →maxim de absorbţie

X - selectivitatea maximului de absorbţie

Se bazeaza pe compararea spectrelor de absorbţie (λ maximelor) ale substanţelor în domeniul UV-VIS, (200-750nm) cu spectre cunoscute

32

33http://siphotonics.com/Pages/UV_Vis_Spectroscopy_Software.html

34

Determinǎri cantitative ȋn spectroscopie

� Înălţimea curbei şi suprafaţa încadrată de curbă reprezintă caracteristici cantitative care servesc la determinarea concentraţiei substanţelor din probe

� Se bazeaza pe legea Lambert-Beer A = εlC

� Se realizeaza o curba de etalonare pe bazadeterminarii absorbantei etalonului la diferite concentratii cunoscute, la lungimeade unda corespunzatoare maximului de absorbtie

35

� În dreapta - curba de absorbţie la diferite concentraţii

� În stânga - curba de etalonare având un maxim de absorbţie la lungimea de undă, λmax = 610 nm

36

The molecular structure of Rose Bengal(4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-tetraiodofluorescein).

UV-vis spectra of different concentrations of Rose Bengal.

Calibration curve of Rose Bengal. Equation of line: y = 0.0977x – 0.1492 (R2 = 0.996)

http://cnx.org/content/m34525/latest/

37

Spectrul de absorbție al Rodaminei B la diferite

concentrații

38

Curba de etalonare, nitriti in ape, Griessy = 4.9051x + 0.0131

R2 = 0.9966

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

11.11.21.31.4

0 0.025 0.05 0.075 0.1 0.125 0.15 0.175 0.2 0.225 0.25

Concentratia, mg/l

Ab

sorb

anta

39

Curba etalonare nitriti ape y = 3.6836x - 0.0631

R2 = 0.9839

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

Conc

Ab

s

Curba etalonare nitriti ape y = 11.248x + 0.1883

R2 = 0.8804

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

conc

abs

40

Determinarea concentratiei pentruproba necunoscutǎ

NUMAI PENTRU DOMENIUL DE CONCENTRATIE IN CARE ESTE VALABILA LEGEA LAMBERT-BEER

1. Prin comparaţie cu un etalon de concentraţie cunoscută

2. Pe baza factorului de panta mediu, Fm

3. Pe baza ecuatiei de regresie aferenta curbei de etalonare, y=ax + b

41

1 - Prin comparaţie cu un etalon de concentraţie cunoscută (interpolare)

� εmol - coeficientul de extincţie molară pentru soluţia de concentraţie cunoscută, respectiv de concentraţie necunoscută,

� b-grosimea probei din cuvă,� c-concentraţia cunoscută a probei de referinţă,� cx- concentraţia necunoscută a probei analizată.

� Prin împărţirea celor două ecuaţii se obţine:

� Calculul concentraţiei pentru proba necunoscută:

42

2 - Pe baza factorului de panta mediu, Fm

� factorul de transformare (de pantă) F este raportul dintre concentraţiile şi absorbanţele corespunzătoare pentru fiecare soluţie care formează scara etalon.

CiFi = -----

Ai� se calculează media aritmetică a valorilor obţinute Fi, notată cu Fm:

n∑Fii=1

Fm = ----------n

unde i are valori de la 1 la maxim n, în funcţie de numărul de soluţii etalon utilizatepentru obţinerea punctelor prin care se obţine curba de etalonare (minim 5 maxim 10, în general).

� Concentraţia probei necunoscute se determină prin calcul, înmulţind absorbanţa citită Ax cu Fm.

Cx = Ax • Fm

43

Exemplu

44

ACTIVITATE INDEPENDENTA� Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2, 3) prin metoda factorului de panta mediu Fm

45

3 - Pe baza ecuatiei de regresie

� Pe baza ecuației care descrie curba de etalonare

y = ax +b,

� Y – absorbanta� X - concentratia

� de unde x = (y- b)/a

� se determinǎ concentrația necunoscutǎ cx

cx = (absorbanţax – b)/a

46

ExempluNOTA - R2 este o masura a liniaritatii curbei, deci a respectarii legii Lambert-Beer, cu atat mai buna cu cat valoarea este mai aproape de 1

47

ACTIVITATE INDEPENDENTA

� Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2, 3) prin utilizand ecuatia de regresie a curbei de etalonare

48

Spectrometria atomica

� Spectroscopia atomică constă în urmatoarele tehnici de uz analitic: � emisia atomică;� absorbţia atomică

49

� introdusă în analiza chimică din anul 1952 de către australianul A. Walsh

� se bazează pe fenomenul descoperit de germanul G. R. Kirchhoff (1859) - şi anume inversia liniilor spectrale → legea lui Kirchhoff:

Principiul spectrometriei atomice

Fiecare element chimic absoarbe acele radiaţii pe care le poate emite în aceleaşi condiţii, bine determinate, de temperatură şi presiune.

50

� Atom → invelis electronic → stare fundamentala

� Dacă o radiaţie de o anumită lungime de undă acţionează asupra unui atom aflat în stare fundamentală, atomul poate să absoarbă radiaţia şi să treacă într-o stare excitată, un astfel de proces fiind cunoscut sub denumirea de absorbţie atomică

51

� Întrucât această stare (excitata) este instabilă, atomul va reveni imediat şi spontan către starea fundamentală.

� Electronul se va întoarce în poziţia lui iniţială, poziţia stabilă orbital şi va fi emisă o cantitate de energie radiantă echivalentă cu cea absorbită în procesul de excitare.

� Lungimea de undă a energiei radiante emise este direct legată de tranziţia electronică care a avut loc si este egalacu cea a energiei absorbite

� Deoarece fiecare element are o structură electronică unică, lungimea de undă a luminii emise este o proprietate unică a

fiecărui element în parte.

52

Ce se determina prinspectroscopie atomica?

ATOMI → ELEMENTE CHIMICE, METALE

53

Aparatura ȋn absorbția atomicǎ

54

� Sursa de radiații emite un flux luminos de intensitate constantă, prestabilita

� Soluţia conţinând proba de analizat (sau etalonul, este transformată într-un aerosol fin, în interiorul unei incinte numite sistem de pulverizare sau pulverizator (nebulizor).

� Aerosolul, amestecat intim cu amestecul de gaze(oxidant plus carburant) este condus în flacără unde atomii unui anumit element absorb doar lumina cu lungimea de undă specifică elementului respectiv.

� Monocromatorul selecteaza radiatia specificaelementului cercetat

� Detectorul (un foto-multiplicator), măsoară intensitatea luminii monocromatice

� Inregistrare date – computer -

55

Determinari in AAS

Determinare calitativă

� Atomii unui anumit element absorb doar lumina cu lungimea de undă specifică elementului respectiv(emisă de sursă şi trecută prin flacără)

� Atomii celorlalte elemente însoţitoare nu absorb lumina la aceeaşi lungime de undă ci fiecare la altevalori ale acesteia deci prin selectarea lungimiide undă se pot identifica elementele chimice

56http://wps.pearsoned.com.au/ibcol/117/30074/7699000.cw/content/index.html

57

Activitate independenta

� Care este elementul necunoscut(unknown) din exemplul de pe slide-ulanterior?

58

Determinare cantitativă

� Se bazeaza pe Legea Lambert-Beer

� Diminuarea intensitatii radiatiei, exprimată în unitaţi de absorbanţă, esteproporţională cu numărul de atomi aielementului de analizat, prezenţi în flacăra, deci cu concentratia acestora.

59

Aplicatiile metodelor optice la controlul alimentelor

60

CONCLUZII

� Metodele optice permit determinari de atomi si/sau molecule in functie de tehnica folosita si domeniul spectral (lungimea de unda)

� Spectrofotometria moleculara in UV si VIS estecea mai utilizata tehnica in controlul curent al alimentelor

� Determinarile optice calitative se bazeaza pe λ a maximelor si numarul acestor maxime

� Determinarile optice cantitative se bazeaza perelatia dintre absorbanta si concentratie, potrivit legii Lambert-Beer

61

� Aparatele utilizate – Spectrofotometre in care semnalul optic se converteste in semnal electricși care are componentele optice transparente la λ de lucru

� Tehnicile de lucru in spectrofotometriamoleculara sunt: colorimetria, fotometria si spectrofotometria

� Determinarile cantitative se bazeaza peoperatiunea de etalonare – curba de calibrare prin tehnici de calcul diferite

� Spectroscopia atomica – emisie si absorbtieatomica

� Aplicatiile metodelor optice in control alimentese refera la compozitie, substante adaugate si contaminanti chimici

62

Test de verificare1. Care sunt tipurile de metode optice utilizate ȋn controlul

alimentelor?2. Pe ce principiu fizic general se bazează spectroscopia optică?3. Care sunt mărimile care caracterizează o radiație

electromagnetică?4. Cum se numește rezultatul unei determinări spectroscopice?5. Care este domeniul de lungimi de undă ȋn care se execută

determinările spectroscopice ȋn UV/VIS?6. Definiți transmitanța/absorbanța la o determinare

spectrofotometrică.7. Care este legea fundamentală aplicată la determinările

spectrofotometrice?8. Definiți legea Lambert – Beer – forma generală.9. Ce se determină (dpdv analitic) atunci cănd se utilizează

metode spectrofotometrice ȋn domeniul UV și VIS?10. Care sunt părțile componente ale unui spectrofotometru?

63

11. Care diferențe sunt ȋntre spectrofotometru care face determinări ȋn domeniul UV față de cel care face determinări ȋn domeniul ȋn VIS?

12. Care este principiul general al determinărilor ȋnspectroscopia de absorbție UV-VIS?

13. Prin ce se caracterizează orice determinare spectrofotometrică?

14. Care sunt variantele de lucru ȋn spectrometria de absorbţie în UV-VIS

15. Caracterizați pe scurt colorimetria/Fotometria / spectrofotometria.

16. Pe ce se bazează o determinare calitativă in spectroscopia UV VIS ?

17. Pe ce se bazează o determinare cantitativă in spectroscopia UV VIS ?

18. Cum se realizează curba de etalonare ȋn spectroscopiaUV VIS ?

19. Care sunt metodele utilizate ȋn spectroscopia UV VIS pentru a se determina concentrația probei necunoscute?

64

20. Cum se calculează concentrația probei necunoscuteprin metoda comparaţiei cu un etalon de concentraţie cunoscută (interpolare)/ metodafactorului de panta/ utilizand ecuatia curbei de etalonare?

21. Care sunt tehnicile de lucru ale spectroscopieiatomice?

22. Pe ce fenomen fizic se bazează spectroscopiaatomică ?

23. Care este principiul de funcționare al spectroscopieiatomice ?

24. Ce se determină (dpdv analitic) prin spectroscopie atomică ?

25. Pe ce se bazează determinările calitative ȋnspectroscopia atomică?

26. Pe ce se bazează determinările cantitative ȋnspectroscopia atomică?

27. Dati cel putin trei ex de aplicatii ale metodeloroptice in domeniul alimentar