Mecanismos de sinalização endotelial envolvidos na atividade ...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

THAÍS PORTO RIBEIRO

Mecanismos de sinalização endotelial envolvidos na

atividade cardiovascular do α-terpineol

JOÃO PESSOA – PB

2012

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Mecanismos de sinalização endotelial envolvidos na atividade cardiovascular do α-terpineol

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos/UFPB como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos - Farmacologia.

Orientador:

Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros

Coorientador:

Prof. Dr. Valdir de Andrade Braga

JOÃO PESSOA – PB

2012

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Mecanismos de sinalização endotelial envolvidos na atividade cardiovascular do α-terpineol

Aprovado em 27 de Fevereiro de 2012.

COMISSÃO EXAMINADORA

__________________________________________________ Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros

Orientador

__________________________________________________ Prof. Dr. Demétrius Antônio Machado de Araújo

Examinador Interno

__________________________________________________ Prof. Dr. Celso José Bruno de Oliveira

Examinador Externo

__________________________________________________ Profa. Dra. Patricia Emilia Naves Givisiez

Examinador Externo

__________________________________________________ Prof. Dr. José Eduardo Krieger

Examinador Externo

JOÃO PESSOA – PB

2012

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R484m Ribeiro, Thaís Porto. Mecanismos de sinalização endotelial envolvidos na atividade

cardiovascular do -terpineol / Thaís Porto Ribeiro. - - João Pessoa:

[s.n.], 2012.

210f. : il.

Orientador: Isac Almeida de Medeiros.

Co-orientador: Valdir de Andrade Braga.

Tese (Doutorado) – UFPB/CCS.

1. Produtos naturais. 2. Óxido nítrico. 3. Artéria mesentérica

superior. 4. Canais para potássio. 5. Hipotensão.

UFPB/BC CDU: 547.9(043)

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A minha família, minha base, minha felicidade...

A todos aqueles que necessitam do contínuo estudo

de desenvolvimento de fármacos para amenizar seus sofrimentos frente às

doenças.

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Agradecimentos

Ao finalizar esta tese de doutorado gostaria de registrar meus sinceros agradecimentos

às individualidades de cada pessoa que contribuiu com este trabalho e foi capaz de amenizar o

processo solitário ao qual qualquer investigador está destinado a seguir.

Inicialmente, ao meu orientador Prof. Isac, eu agradeço por me formar uma pesquisadora e

por me ensinar nestes 10 anos como ser profissional. Ainda, por compartilhar comigo o seu

tema de pesquisa, sendo um exemplo de pesquisador e ser humano, mostrando que

devemos levar não só na pesquisa, mas para toda a vida os valores éticos de honestidade e

humildade. Obrigada pela amizade, desde a iniciação científica, pela confiança depositada na

construção desse trabalho, sou grata pelo incentivo e oportunidade de poder realizar e

conquistar esse grande sonho.

Ao meu coorientador Prof. Valdir toda minha gratidão por encarar o desafio de trabalhar

em um projeto em andamento. Por ser um pesquisador dinâmico e disposto a oferecer

estímulos e, principalmente, a percorrer novos caminhos, ouvir com atenção as questões,

dúvidas e problemas que surgiam durante o processo. Obrigada pelos ensinamentos e

contribuição durante a execução desse trabalho e acima de tudo por sua amizade.

Je remercie chaleureusement la Madame Pr. Valérie B. Schini-Kert, la diretrice du

Laboratoire de Pharmacologie et Physiopalotologie Cardiovasculares pour m’avoir accueille au

sein de sa unité, pour son acessabilité et sa disponibilité. Je la remercie de m’avoir accordé sa

confiance, ses competénces scientifique et ses précieux conseils durant mon séjour au

laboratoire.

Aos membros da banca examinadora, os professores José Eduardo Krieger, Celso de

Oliveira, Patrícia Naves, Demétrius Araujo (membro da qualificação) e aos membros da

banca de qualificação os professores Amilton Cruz e Sandra Mascarenhas, expresso meus

agradecimentos pelo interesse em compartilhar seus conhecimentos para aprimorar este

trabalho. Agradeço a ajuda e as contribuições concedidas e por me dar a honra de aceitar

julgar este trabalho.

Faço um agradecimento especial ao aluno de mestrado Leônidas, e aos alunos de doutorado

- Aurylene, Bruna, George, Maria do Socorro (Corrinha) e Melissa- eu não tenho palavras

para expressar minha gratidão, agradeço a sincera amizade e por ter depositado em mim a

confiança de aprender junto. Obrigada pelo auxílio na execução deste trabalho, tenho

orgulho de ter compartilhado todos os árduos momentos com vocês, lembrando que este

trabalho é nosso.

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Aos amigos do laboratório de Farmacologia Cardiovascular: Abraão, Ana Letícia, Angélica,

Fabíola, Islânia, Jaci, Juliane, Kivia, Lays, Maria do Carmo (Carminha), Marney, Mônica,

Natália, Priscila, Priscila, Valéria, Robson, Tays, Thaís Josy, Thyago, Walma, agradeço o

coleguismo e companheirismo em compartilhar com discussões sobre os diversos temas

relacionados e pela eficiência exercida sempre.

A TODOS os alunos do Laboratório de Neurobiologia, do Departamento de Patologia da

Universidade Federal do Paraná - Curitiba/PR. Em especial a professora Lia Nakao e as alunas

Alessandra Antunes e Karime França pelo acolhimento, interesse compartilhar seus

conhecimentos que ajudaram ao desenvolvimento deste trabalho e o compromisso com a

execução de experimentos. Agradeço toda a ajuda e as contribuições concedidas.

J’exprime toute ma reconnaissance et remercie viventent à ensemble des membres du

Laboratoire de Pharmacologie et Physiopalotologie Cardiovascular, du Laboratoire de

Biophotonique et Pharmacologie, de la Faculté de Pharmacie de l’Université de Strasbourg qui

ont tous participé à realisation de ce travail.

Mes remerciements très particuliers vont à Chuc, Evelyne, Israa, Lazare et Quentin pour son

amitié chaleureuse, son disponibilité et pour son aide à mon travail. Je remercie également

les colègues Cyril, Faraj, Grégory, Guy, Mahmoud, Mohammad, Nelly, Nourddinne,

Philipe et Thierry pour leur sympathie, leur soutien et leur bonne humeur quotidienne. Et je

remercie à le Messieur Cristhian Müller pour sa disponibilité.

Agradeço as primeiras pessoas que me ajudaram na iniciação científica; os professores

Horacinna, Katy Lísias, Márcio Roberto e Renildo que me ensinaram a dar os primeiros

passos no caminho da pesquisa e a amar tudo isso.

Aos professores Damião Piergentino e Diego Nunes, e as alunas de iniciação científica

Dayane Porto e Camilla Pinheiro eu agradeço as contribuições concedidas, principalmente

na fase inicial deste trabalho.

Impossível não ressaltar a importância que teve a convivência fraterna e a cumplicidade que

encontrei meus amigos de pós-graduação. Ter tido a oportunidade de conviver e dividir

ansiedades, alegrias e amizade sem a qual não saberia ter sido diferente, em especial a

Ionaldo, José Alves, Juan, Kiriaki, Micheline e Nilson por mostrar que os amigos são a

família que escolhemos.

Deixo também meus agradecimentos à Coordenação, em especial a professora Fátima

Agra, e a todos os professores do programa de pós-graduação, pela ajuda na construção

do conhecimento e enriquecimento durante esses anos de pós-graduação, pela dedicação e

pelo emprenho com que conduzem este programa.

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Indispensável também citar a importante função que exerceram os dirigentes e funcionários

do CBiotec na minha formação. Em especial a Mônica Rodrigues por passar a alegria todos

os dias com um sorriso e incentivo, às secretárias da pós-graduação Tânia e Carol e os

funcionários do Biotério George Thomas, os ilustres: Crispim, Sr. Luiz e Adriano.

Agradeço ao CBIOTEC, CCS e à Universidade Federal da Paraíba e à Faculté de Pharmacie

e à Université de Strasbourg por possibilitar e pelo suporte técnico a essa pesquisa. Ao

CNPq e a Capes pelo apoio financeiro de custeio de todo doutorado, além da contribuição

com a disponibilidade do portal de periódicos CAPES.

Agradeço ainda aos alunos de graduação (que me foram emprestados no estágio docência)

que me motivavam a buscar sempre mais conhecimento, depositando em mim suas

expectativas e seus questionamentos e me dando a certeza de que este é caminho certo a

seguir.

As palavras são pequenas ao expressar o tamanho da gratidão para a minha família que está

sempre presente em períodos de escolhas e decisões, pela compreensão e força em todos os

momentos da minha vida. Em especial a minha linda mãe Maria Luísa, por ser fonte de

inspiração e aos meus queridos irmãos Arthur e Rafael, os quais amo tanto! Obrigada não é

o bastante para minhas queridas avós Maria José e Severina pelo apoio concedido durante

toda minha existência, creditando toda a paciência, carinho e amor.

Aos meus eternos amigos: Andréia, Juliana, Naiana, Roxana, Suênia, Wagner. Eu não

poderia deixar de agradecer a todo o carinho e amizade dedicada durante os anos que se

fizeram antes deste momento. Desde o período de graduação e que me acompanham até

hoje. E apesar da distância e das atividades do dia-a-dia estão sempre na torcida para que

sempre dê tudo certo.

Aos amigos especiais Adriana, Benito, Fabíola, Isabella, Luciana, Renata, Vanessa e

Thiago Ianatoni que estão comigo em diversos momentos, sempre me trazendo para o

mundo real e mostrando que existem outras experiências, além da pesquisa.

A todos os meus grandes amigos que colaboraram de maneira direta ou indiretamente com

esse trabalho e que em vários momentos serviram de norte nesta caminhada. E aqueles que

de uma simples conversa, aprendemos sem mistérios, a conhecermos as pessoas com suas

limitações e vocações. A todos, minha eterna gratidão.

Thaís Porto Ribeiro Fevereiro 2012

10

Só sabemos com exatidão quando sabemos pouco;

Com o saber, cresce a dúvida.

.

Johann Wolfgang von Goethe (1749-1832)

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Os óleos essenciais são componentes voláteis orgânicos encontrados em plantas aromáticas, que apresentam vários monoterpenos, como o α-terpineol. Estudos têm demonstrado algumas atividades biológicas, tais como hipotensivas e vasorelaxantes (Guedes et al., 2004). No presente trabalho, estudaram-se os efeitos cardiovasculares do α-terpineol e caracterizou-se a farmacodinâmica destes efeitos. Para isso foram utilizados ratos normotensos Wistar (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR), empregando técnicas combinadas in vivo, in vitro, e cultivo de células endoteliais. Para determinar a medida direta da pressão arterial, foram implantados cateteres na artéria aorta e veia cava inferior para administração de drogas em ratos WKY e SHR. Adicionalmente, foram realizados estudos para avaliar a reatividade vascular, assim, animais foram sacrificados e a artéria mesentérica superior foi isolada. Os anéis foram mantidos em cubas com solução de Tyrode, e gaseificada com carbogênio. Os anéis foram fixados a um transdutor de força, o qual estava acoplado a um sistema de aquisição de dados (Miobath-4, WPI, Sarasota, EUA) a uma tensão de 0,75 g por 1h. Após este período as preparações, foram pré-contraídas com 10 µM de fenilefrina (FEN) e, em seguida, concentrações crescentes

de -terpineol (10-12-10-5 M) foram adicionadas cumulativamente. Adicionalmente, realizamos experimentos para quantificação da produção de NO e determinação da atividade da eNOS, AKT e AMPK em cultivo de células endoteliais, utilizando as

técnicas de citometria de fluxo e western blotting. Assim, observamos que -terpineol (1, 5, 10 e 20 mg/kg i.v., randomicamente) produziu uma hipotensão dose-

dependente em ratos WKY (-103, -399, -5211, -6212 mmHg, n=10) e SHR (-

375, -577, -715, -844 mmHg, n=9, respectivamente), associada a taquicardia. A resposta hipotensora foi atenuada significantemente, após o tratamento com L-NAME (20 mg/kg, i.v), sugerindo que esse efeito pode ser decorrente de uma diminuição da resistência periférica., α-terpineol demonstrou melhorar a sensibilidade do barorreflexo. A resposta vasorelaxante foi significativamente

atenuada quando comparada aos anéis na presença (WKY Emax= 60 4 e SHR Emax= 53,7 ± 3, p<0,05, n=9) e na ausência do endotélio funcional [WKY Emáx= 20,5

1 e SHR Emáx=16,1 ± 3, p<0,05, n=8]. Em anéis pré-contraídos com FEN na presença de L-NAME (100 μM), Hidroxicobalamina (30 μM) e ODQ (10 μM), a resposta relaxante foi atenuada significantemente, sugerindo uma participação da

via NO-GMPc. Adicionalmente, -terpineol aumentou os níveis de produção de NO e a atividade da eNOS por fosforilar vias como a PI3K e AMPK. No entanto, na

presença de atropina (1 M) ou indometacina (10 M), a resposta vasorelaxante de

-terpineol não foi alterada indicando que os receptores muscarínicos e metabólitos da enzima Ciclooxigenase parecem não estar envolvidos. KCl (20mM) foi capaz de

atenuar o efeito de -terpineol, e preparações com endotélio vascular incubados

com glibenclamida (10 M) e 4-aminopiridina (1 mM), tetraetilamônio (1 mM) e caribdotoxina + apamina (0,2 μM). Deste modo, concluímos que resposta

vasorelaxante promovida pelo -terpineol é dependente de endotélio e envolve a via L-Arginina-NO-GMPc por aumentar a fosforilação da eNOS por vias PI3K e AMPK, produção de NO e EDHF com participaçãode canais para potássio do tipo KCa, KV e KATP em SHR e WKY e estes efeitos são responsáveis por eventos in vivo. Palavras chaves: artéria mesentérica superior, canais para potássio, hipotensão,

óxido nítrico, -terpineol.

RIBEIRO, T. P. Mecanismos de sinalização endoteliais envolvidos na atividade cardiovascular do α-terpineol em ratos hipertensos. 2012. Tese (Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Brasil.

12

The essential oils are volatile organic constituents found in aromatic plants, which

present several monoterpenes, such -terpineol. Studies have demonstrated some biologic activities such as hypotensive and vasorelaxant (Guedes et al., 2004). In the

present work the cardiovascular effects of -terpineol was investigated and the pharmacodynamics of this effect was characterized. Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats (SHR) were anaesthetized and polyethylene catheters were inserted into the low abdominal aorta and inferior vena cava for blood pressure measurements and administration of drugs. Isolated superior mesenteric rings (1-2 mm) were suspended by cotton threads for isometric tension recordings in Tyrode’s solution (37°C, gassed with 95% O2 and 5% CO2), under 0.75g resting tension were measured by using pressure transducers, coupled to a computer set and CVMS software Miobath-4, WPI, Sarasota, EUA. In addition, the bioavailability of NO and eNOS, AKT and AMPK activity were quantified when exposing cells to α-terpineol in the cultured endothelial cells. In both SHR and normotensive rats, i.v. bolus injections of α-terpineol (1–20 mg/kg) decreased mean arterial pressure (MAP) in a dose-

related manner, WKY (-103, -399, -5211, -6212 mmHg, n=10) and SHR (-375,

-577, -715, -844 mmHg, n=9) associated with tachycardia. However, hypotensive and tachycardic responses were significantly attenuated after L-NAME (20 mg/kg,

i.v.). The -terpineol demonstrated improves the baroreflex sensitivity. In intact

isolated rat mesenteric rings -terpineol (10-12–10-5M) induced concentration-

dependent relaxation of the contractions induced by phylephrine (10M) WKY Emax=

60 4 or SHR Emax= 53.7 ± 3, p<0.05, n=9). After endothelium removal the

vasorelaxant elicited by -terpineol was significantly attenuated WKY [Emax= 20.5 1*] and SHR [Emax= 16.1 ± 3*, p<0.05, n=8]. Similar results were obtained in the

presence of L-NAME 100M, a competitive antagonist of NOS, hydroxocobalamin 30 μM, a NO scavenger or ODQ 10μM, a selective inhibitor of soluble guanylyl cyclase.

In addition, in endothelial cells, -terpineol increased eNOS activation and NO levels by phosphorylation of PI3K/ AKT and AMPK pathway. However, atropine (1ηM) or

indometacin (10 μM) had no effect on the -terpineol -induced vasorelaxation. Furthermore, vasorelaxation was significantly attenuated in the presence of 20 mM KCl a modulator K+ efflux or several blocking of potassium channels: 1mM 4-

aminopirimidine, 10 M glibenclamide, 1 mM tetraethylammonium and carybdotoxin

plus apamin (0.2M). In conclusion, the present study demonstrated that -terpineol induced hypotensive effect, probably due to a decrease of peripheral vascular resistances, which seems to be mediated by endothelium derived relaxant factors, at least NO induced. These results suggest that vasorelaxant response, almost completely mediated by the endothelium, likely via NO release and activation eNOS by PI3K and AMPK with consequently activation of NO-cGMP pathway and potassium channels activation at least, KCa, KV, and KATP are involved in the

vasorelaxant effect induced by -terpineol.

Key- Words:, hypotension, K+ channels, Nitric Oxide, superior mesenteric artery, -terpineol.

RIBEIRO, T. P. Endothelial signaling mechanisms involved in

cardiovascular effect to α-terpineol in hypertensive rats.

2012. Thesis (Graduate program in Natural Products and

Synthetic Bioactives, Pharmacology) Health Sciences Center,

Federal University of Paraíba, Joao Pessoa, Brazil.

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fatores relaxantes derivados do endotélio.............................................. 27

Figura 2: Esquema da biosíntese do óxido nítrico.................................................. 28

Figura 3: Representação do cavéolo, da caveolina-1 e interação com a eNOS...... 29

Figura 4: Representação de proteínas cinases envolvidas na fosforilação da

eNOS......................................................................................................................... 31

Figura 5: Estrutura química do α-terpineol............................................................... 35

Figura 6: Representação esquemática dos vasos onde foram implantados os

cateteres para o registro dos parâmetros cardiovasculares e administração de

drogas. .................................................................................................................... 43

Figura 7: Aparato utilizado para as medidas de pressão arterial e frequência cardíaca em ratos.....................................................................................................

43

Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental. Protocolo da

administração de doses crescentes de -terpineol em ratos WKY e SHR antes e após tratamento agudo com diferentes inibidores...................................................

44

Figura 9: Fotografia do sistema de cubas de aquisição de dados de tensão

isométrica para órgãos isolados................................................................................ 47

Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental para estudo

do efeito de concentrações crescentes -terpineol (10-12 a 10-5 M) ......................... 48

Figura 11: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg)

e (b) frequência cardíaca cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) (n=10) e hipertensos (SHR) não-anestesiados ............................................

59

Figura 12: Registro representativo dos efeitos do α-terpineol (4.8 mg/kg) sobre a

pressão arterial média (PAM, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos

(A) normotensos (WKY) (n=10) e (B) hipertensos (SHR) (n=9)............................... 60

14

Figura 13: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (% de PAM,

mmHg) e (b) frequência cardíaca (% de FC, bpm) em ratos normotensos (WKY)

(n=10) e hipertensos (SHR) não-anestesiados......................................................... 62

Figura 14: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial sistólica em ratos

normotensos (WKY) (n=10) e hipertensos (SHR) não-anestesiados..................... 63


e (b) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos

(SHR) não-anestesiados (n=6) antes e após o tratamento com

atropina...................................................................................................................... 65




hexametônio.............................................................................................................. 67




atenolol...................................................................................................................... 68




prazosin..................................................................................................................... 70

Figura 19: do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg) e (b)

frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR)

não-anestesiados (n=7). antes e após o tratamento com L-NAME.......................... 72

Figura 20: Efeitos do α-terpineol sobre a sensibilidade do barorreflexo em ratos

normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados................................... 74

Figura 21: -Terpineol induz relaxamento em anéis de artéria mesentérica de

ratos hipertensos SHR e controles WKY................................................................... 75

Figura 22: Registro original da ação do α-terpineol (10-12 - 10-5 M) em anéis de

artéria mesentérica superior isolada de rato............................................................. 76

15

Figura 23: Efeito do α-terpineol sobre o tônus basal de anéis de artéria

mesentérica superior isolada de rato........................................................................ 77

Figura 24: α-Terpineol induz relaxamento vascular dependente do endotélio

envolve a participação da enzima eNOS.................................................................. 79

Figura 25: α-Terpineol promove efeito vasorelaxante via óxido nítrico/GMPc......... 80

Figura 26: Metabólitos da ciclooxigenase ou receptores muscarínicos não estão

envolvidos na resposta vasorelaxante induzida pelo de -terpineol......................... 82

Figura 27: Caracterização da participação do EDHF no efeito vasorrelaxante

induzido pelo α-terpineol (10-12 – 10-5M)................................................................... 83

Figura 28: Efeito inibitório dos bloqueadores de canais de potássio no

relaxamento vascular induzido pelo α-terpineol em SHR e WKY............................. 85

Figura 29: Identificação dos canais de potássio que participam do relaxamento

vascular induzido pelo α-terpineol em SHR e WKY.................................................. 87

Figura 30: Acetilcolina e bradicinina induzem aumento nos níveis de NO em

cultura de células endoteliais de aorta de coelho..................................................... 89

Figura 31: α-Terpineol aumenta os níveis de NO em células endoteliais................ 91

Figura 32: α-Terpineol aumenta os níveis de NO em células endoteliais. Gráfico

dos dados que expressam a produção de NO induzida por acetilcolina ou α-

terpineol em cultura de células endoteliais de aorta de coelho................................. 92

Figura 33: A enzima eNOS está envolvida na produção de NO induzida pelo -

Terpineol.................................................................................................................... 93

Figura 34: A enzima eNOS está envolvida na produção de NO induzida pelo -

Terpineol. Gráficos da produção de NO em cultura de células endoteliais de aorta

de coelho tratados por α-terpineol ou L-NAME + α-terpineol em diferentes

concentrações............................................................................................................ 94

Figure 35: Análises representativas do efeito da insulina em cultura primária de

células endoteliais de coronária de porco................................................................. 95

Figura 36: α-terpineol induz fosforilação da eNOS................................................... 96

16

Figura 37: α-terpineol induz rápida fosforilação da Akt em Ser473 e da eNOS em

Ser1177 em cultura de células endoteliais de coronária de porco ........................... 97

Figura 38: α-terpineol induz fosforilação da Akt em Ser473 e da eNOS em

Ser1177 dependente da concentração em cultura de células endoteliais de

coronária de porco..................................................................................................... 98

Figura 39: α-terpineol induz fosforilação da AMPK em Tyr 172 em cultura de

células endoteliais de coronária de porco................................................................. 99

Figura 40: Imagens com fluorescência de DAF-2 obtidas nas imagens das

culturas de células endoteliais tratadas com α-terpineol (10-4 M ) ou L-NA (100μM)

+ α-terpineol 10-4 M).................................................................................................. 101

Figura 41: Representação da farmacodinâmica do α-terpineol................................ 116

17

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Porcentagem de inibição da resposta máxima e contração com FEN

(10 μM) para estudos da via NO/GMPc em anéis de artéria mesentérica superior

isolada de rato.......................................................................................................... 51


(10 μM) para estudos de metabolitos da ciclooxigenase e receptores

muscarínicos em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato................. 55


(10 μM) para estudos de canais de potássio em anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato............................................................................................ 60

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LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

4 – AP 4 – Aminopiridina

AA Ácido araquidônico

ACh Acetilcolina

ADP Difosfato de adenosina

AKT/ PKB Proteína cinase serina treonina tipo B

ATP Trifosfato de adenosina

AMPc Monofosfato de adenosina cíclico

AMPK Proteína cinase dependente de 5’ monofosfato de adenosina

ANOVA Análise de variância

BH4 (6R-)5,6,7,8-tetrahidro-L-biopterina

BKca Canais de potássio de grande condutância sensíveis ao Ca+2

BK Bradicinina

b.p.m. Batimentos por minuto

[Ca2+4 – CaM] Complexo Cálcio – Calmodulina

CaM Calmodulina

CaMKII Proteína cinase II dependente da calmodulina

Cav-1 Proteína caveolina -1

CECP Células endoteliais de coronária de porco

COX Ciclooxigenase

DAG Diacilglicerol

DC Débito cardíaco

DMSO Dimetilsulfóxido

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EDHF Fator hiperpolarizante derivado do endotélio

EDRF Fator relaxante derivado do endotélio

EGTA Ácido etilenoglicol-bis-(-aminoetiléter) N,N,N´,N´- tetraacético

eNOS Sintase do NO endotelial

FC Frequência cardíaca

FEN Fenilefrina

GC Ciclase de guanilil

GDP Difosfato de guanosina

Gi Proteína G inibitória

GMPc Monofosfato de guanosina cíclico

Gs Proteína G estimulatória

GTP Trifosfato de guanosina

GTPase Trifosfatase de guanosina

HDX Hidroxicobalamina

HETE Ácido hidroxiepoxieicosatrienóico

HSP90 Proteína de estresse 90 kDa

IKCa Canal de K+ de condutância intermediária ativado pelo Ca+2

INDO Indometacina

iNOS Sintase de óxido nítrico induzida

IP3 Trifosfato de inositol

KATP Canais de potássio sensíveis ao ATP

Kca Canais de potássio sensíveis ao Ca+2

KIR Canais de potássio retificadores de entrada

KV Canais de potássio sensíveis a voltagem

20

L-NAME NG-Nitro-L-arginina metil éster

L-NOHA N-hidróxi-L-arginina

MeOH Metanol

MLC Cadeia leve de miosina

MLCK Cinase da cadeia leve da miosina

NO Óxido Nítrico

NOS Sintase do NO

NPS Nitroprussiato de sódio

ODQ 1 H-[1,2,4] oxadiazólo [4,3-a] quinoxalin-1-ona

PAM Pressão arterial média

PBS Solução salina tamponada com fosfato

PGI2 Prostaciclina

PI3K fosfatidil-inositol 3-cinase

PIP2 4,5 – difosfato de inositol

PKA Proteína cinase A

PKC Proteína cinase C

PKG Proteína cinase G

PLC Fosfolipase C

RAEC Células endoteliais de aorta de coelho

RE Retículo endoplasmático

ROCC´s Canais de cálcio operados por receptores

ROS Espécies reativas de oxigênio

RS Retículo sarcoplasmático

RYR Receptor de rianodina

21

Ser Serina

SHR Rato espontaneamente hipertenso

SKCa Canal de K+ de condutância baixa ativado pelo Ca+2

Src Proteína tirosina cinase Src

TEA Tetraetilamônio

Thr Treonina

Tyr

Tirosina

TXA2 Tromboxano A2

VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular

Vm Potencial de membrana

VOCC’s Canais de cálcio operados por voltagem

WKY Rato Wistar-Kyoto normotenso

.

22

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO................................................................................................ 24

1.1 Sistema cardiovascular: O endotélio e mediadores endoteliais..................... 24

1.2 Óxido Nítrico: biosíntese e função vascular................................................... 28

1.3 Mecanismos de ativação da enzima eNOS:.................................................. 29

1.4 Disfunção endotelial associada à hipertensão: Alvos para tratamento.......... 32

1.5 Produtos Naturais: Monoterpenos e α-terpineol............................................ 34

2 – OBJETIVOS .................................................................................................. 37

2.1 Gerais............................................................................................................. 37

2.2 Específicos..................................................................................................... 37

3 – MATERIAIS................................................................................................... 39

3.1. Animais.......................................................................................................... 39

3.2 Obtenção do -terpineol................................................................................. 39

3.3 Substâncias e sais......................................................................................... 39

3.4 Soluções nutritivas......................................................................................... 40

3.5 Preparação da solução de -terpineol........................................................... 40

4 – MÉTODOS...................................................................................................... 42

4.1 Ensaios Farmacológicos in vivo. ................................................................... 42

4.2 Ensaios Farmacológicos in vitro..................................................................... 46

4.3 Ensaios bioquímicos realizados in vitro......................................................... 51

4.4 Análise Estatística........................................................................................... 56

23

5 – RESULTADOS .............................................................................................. 58

5.1 ESTUDOS in vivo............................................................................................ 58

5.2 ESTUDOS in vitro........................................................................................... 75

5.3 ENSAIOS BIOQUÍMICOS............................................................................... 88

6 – DISCUSSÃO................................................................................................... 103

7– CONCLUSÕES................................................................................................ 118

8– PERSPECTIVAS............................................................................................. 120

9– REFERÊNCIAS............................................................................................... 122

ANEXOS............................................................................................................... 149

Certificado do Comitê de ética

Vita

Publicações

24

Introdução

25

1. INTRODUÇÃO

1.1. Sistema cardiovascular: O endotélio e mediadores endoteliais

1.1.1 Homeostase cardiovascular

O controle do sistema cardiovascular envolve diferentes mecanismos e tem

por objetivo manter a homeostase do organismo promovendo um aporte de

substâncias essenciais para manutenção dos tecidos. A regulação da pressão

arterial (PA) é exercida por sistemas de retroalimentação que operam momento a

momento ou a longo prazo e dependem de uma interação do sistema nervoso

simpático e hormônios circulantes (COWLEY; ROMAN; KRIEGER, 1991; GUYTON,

1981).

A pressão arterial é regulada a curto prazo por sistemas de barorreceptores,

quimioreceptores e receptores cardiopulmonares (neurônios especializados no arco

aórtico e seios carotídeos), cujas aferências se projetam para o sistema nervoso

central, especificamente ao núcleo do trato solitário (NTS) via nervos vagos e

glossofaríngeo. O processamento dessas informações no sistema nervoso central

produz uma regulação das vias autonômicas eferentes, havendo, assim, o controle

da distribuição do débito cardíaco em diferentes leitos vasculares. Este evento

fornece um feedback negativo em que a pressão arterial elevada reflexivamente

provoca diminuição da pressão; em contraste, a diminuição da pressão arterial

deprime o barorreflexo, fazendo com que a pressão arterial aumente. Em níveis

normais de pressão arterial, os barorreceptores inibem tonicamente os efeitos

simpáticos sobre os vasos sanguíneos e coração (TAYLOR; BISOGNANO, 2010).

O controle da PA a longo prazo é exercido pelo sistema renina-angiotensina-

aldosterona com a regulação do volume dos líquidos corporais (volemia), regulando

o equilíbrio hidroeletrolítico do corpo. A pressão arterial corresponde ao produto do

débito cardíaco (DC) pela resistência vascular periférica total (RVPT), e pode ser

influenciada pela ação de drogas sobre um ou ambos os parâmetros (MARC;

LLORENS-CORTES, 2011). A resistência vascular é influenciada, em graus

variados, dependendo da região, pela atividade de nervos simpáticos vasomotor,

pelo nível de hormônios vasoativos circulantes e por fatores locais, incluindo fatores

metabólicos produzidos pela camada endotelial (THRASHER, 2006).

26

1.1.2 O endotélio: Foco nos fatores de regulação do tônus vascular

O endotélio vascular é um importante órgão endócrino, formado por uma

monocamada de células, que exerce papel fundamental no controle de fluidez de

sangue, agregação plaquetária e regulação do tônus vascular em resposta a

hormônios vasoativos ou metabólitos, assegurando assim a provisão adequada de

nutrientes (FÉLÉTOU; KÖHLER; VANHOUTTE, 2011). As células endoteliais

vasculares são fisiologicamente expostas a forças hemodinâmicas, como a força de

cisalhamento (shear stress). Essas células sintetizam fatores que conduzem à

contração ou ao relaxamento do músculo liso vascular. Os principais fatores

contracturantes são os derivados dos metabólitos do ácido araquidônico (AA) pela

ciclooxigenase (COX) (tromboxano (TXA2) e prostaglandinas (PGH2)), as espécies

reativas de oxigênio (ROS) e endotelina-1 (ET-1). Os fatores vasodilatadores

endoteliais são o óxido nítrico (NO), metabólitos do AA produzidos pelas enzimas

COX (prostaglandinas (PGI2)), lipoxigenase (ácido 15-s-hidroxieicosatetraenóico –

15-HETE) e citocromo P450 (CYP450), como ainda o fator hiperpolarizante derivado

do endotélio (EDHF) (FÉLÉTOU; KÖHLER; VANHOUTTE, 2010; JIN, 2011).

Estes fatores são secretados pelo endotélio e se ligam principalmente a

receptores acoplados a proteína G produzindo um aumento do cálcio intracelular em

resposta a diferentes estímulos: autacóides (bradicinina BK), hormônios circulantes

(angiotensina II), neurotransmissores (acetilcolina, noradrenalina) e ainda produtos

derivados de plaquetas e coagulação (serotonina, trombina) sendo responsável pela

ativação de diferentes enzimas produzindo diferentes efeitos vasoativos (TRIGGLE;

DING, 2011).

A) Fatores Contracturantes:

As contrações dependentes do endotélio são bloqueadas por antagonistas do

receptor de tromboxano (TP), indicando que derivados do AA são gerados em

direção a células musculares lisas vasculares e ativam diretamente os receptores. O

AA é o substrato preferencial da COX-1 e COX-2, produzindo eicosanóides

biologicamente ativos os quais são fatores contracturantes. O TXA2 e a PGH2

exercem uma maior importância no controle do tônus vascular por induzir a ativação

da via proteína G-fosfolipase C (PLC) e aumento do cálcio, levando à contração da

célula muscular (WONG; VANHOUTTE, 2010).

27

Endotelina -1 (ET1) é um vasoconstrictor ativador do subtipo de receptor para

endotelina A (ETA) ou B (ETB), em células musculares vasculares, a ET1 leva à

ativação de receptores acoplados a proteína G, predominantemente, Gq/11 e G12

levando a vias de mobilização do cálcio intracelular e ativação de vias dependentes

da RhoA/ Rho-cinase. No entanto, a ativação dos receptores ETB presentes na

célula endotelial pode levar à ativação de fatores relaxantes derivados do endotélio

(RUBANYI, 2011).

As forças de cisalhamento podem induzir contração por produzir, na célula

endotelial, espécies reativas de oxigênio (ROS), como H2O2 e O2 . Estes podem ser

produzidos pelas enzimas NADPH oxidase, xantinas oxidases e ainda eNOS e COX,

principalmente na ausência de seus substratos, formando ainda peróxidos de nitrito

ao interagir com o NO (FISSLTHALER, et al. 2007).

B) Fatores Relaxantes:

Vários trabalhos descrevem a participação do endotélio vascular em

relaxamentos induzidos por uma variedade de substâncias químicas (FURCHGOTT;

ZAWADZKI, 1980; FURCHGOTT, 1983, MONCADA et al., 1988) demonstrados na

figura 1. Eicosanóides, derivados do AA, são constitutivamente produzidos pelas

células endoteliais e regulam a função vascular. Em humanos, a COX-2 parece ser o

maior contribuinte da produção de prostaciclina nas células endoteliais, embora a

COX-1 também apresente como uma importante fonte. A síntese de prostaciclina

(PGI2) é dependente da formação do AA, aciona receptores ligados à proteína Gs,

células musculares lisas, e ativam a ciclase de adenilil e resulta no aumento de

AMPc que, via PKA, induz o relaxamento. (TRIGGLE; DING, 2011).

Outro fator que desempenha um papel na vasodilatação mediada por fluxo e

contribui para o relaxamento dependente do endotélio é o fator hiperpolarizante

derivado do endotélio (EDHF). Sua formação pode ser dependente da sinalização do

cálcio intracelular, induzida pela ativação de receptores acoplados à proteína G. No

entanto, a natureza do fenômeno EDHF é questionada; Sabe-se apenas que ocorre

uma hiperpolarização dependente da ativação de canais de potássio dependentes

do cálcio com média e pequena condutância localizados nas células endoteliais. A

hiperpolarização endotelial é um pré-requisito para a hiperpolarização e relaxamento

de células musculares lisas vasculares (JIN et al. 2011). A transmissão da

hiperpolarização entre o endotélio e músculo vascular, produzida por junções tipo

28

gap mioendoteliais, implica na ativação de outros canais de potássio, como os

canais retificadores de entrada, e ativação da bomba Na+/K+ ATPase, aumentando o

estado hiperpolarizado da célula. Esta hiperpolarização é o principal efeito que

produz o fechamento dos canais de cálcio sensíveis à voltagem (CaV), ocorrendo

diminuição da concentração de cálcio intracelular e relaxamento da musculatura lisa

vascular. Atualmente, várias hipóteses são descritas para determinar a natureza

estrutural e bioquímica do EDHF, entre elas os metabólitos da enzima CYP450,

ácidos epoxieicosatrienóicos (EET), íons potássio (K+), peróxido de hidrogênio

(H2O2) e radicais nitroxil (HNO) (EDWARDS; FÉLÉTOU; WESTON, 2010).

Furchgott e Zawadzki (1980) descreveram que a ação de alguns

vasodilatadores, como a acetilcolina, era inteiramente dependente da presença do

endotélio intacto e envolvia a liberação de um fator essencial para o relaxamento

vascular, o qual foi chamado de endothelial-derivated relaxing factor (EDRF).

Posteriormente, baseados em semelhanças químicas estruturais com o EDRF,

investigadores concluíram que o endotélio era capaz de produzir óxido nítrico (NO),

tal produção é dependente da ativação da enzima sintase de óxido nítrico endotelial

(eNOS), resultado da conversão da L-arginina por estímulos externos que podem

induzir a sinalização dependente do cálcio (MONCADA et al. 1988).

Figura 1: Fatores relaxantes derivados do endotélio. Representação da produção de fatores dependentes da mobilização do cálcio na célula endotelial. PGI2: Prostaciclina, NO: Óxido Nítrico, EDHF: Fator hiperpolarizante derivado do endotélio (Adaptado de Vanhoutte, 1998)

29

1.2 Óxido Nítrico: biosíntese e função vascular

Uma das moléculas mais importantes sintetizadas pela célula endotelial é o

óxido nítrico (NO), um radical livre, gasoso, inorgânico, incolor, com uma meia vida

relativamente curta (MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991). A produção de NO,

promovida pela conversão enzimática do aminonoácido L-arginina, é constituída de

duas etapas (Figura 2) (RAFIKOV, et. al. 2011). A primeira é uma N-hidroxilação do

grupo guanidina da L-arginina, formando um intermediário N-hidróxi-L-arginina (L-

NOHA) na presença de O2 e cofatores essenciais como NAD(P)H e (6R-)5,6,7,8-

tetrahidro-L-biopterina (BH4), na segunda etapa, L-NOHA é metabolizada em L-

citrulina e NO.

Figura 2: Esquema da biosíntese do óxido nítrico. RAFIKOV, et. al. 2011

Devido à sua natureza lipofílica, o NO difunde-se através das células da

musculatura lisa adjacentes, e pode atuar estimulando a ciclase da guanilil,

metabolizando o GTP e transformando-o em GMPc, que por sua vez, ativa a

proteína cinase G (PKG) promovendo a recaptação de Ca2+ para os estoques

intracelulares, via bomba de cálcio (SERCA), abertura dos canais de K+; fechamento

dos canais de Ca2+. Todos estes eventos levam à redução da concentração de

cálcio intracelular e vasorrelaxamento (FURCHGOTT, 1983; VANHOUTTE;

BOULANGER, 1995). A característica de radical livre do NO com meia-vida biológica

curta permite que a ligação do radical do NO ao grupo de heme de ciclase de guanilil

seja um processo reversível. No entanto, autores propuseram que o NO poderiam

ativar diretamente canais para K+ do músculo liso vascular, independente da

ativação da ciclase de glanilil solúvel, levando a hiperpolarização e ao relaxamento

vascular (BOLOTINA et al. 1994; MISTRY; GARLAND, 1998) .

30

A viabilidade do NO é promovida pela ativação da enzima sintase de óxido

nítrico (NOS). Esta produção de NO pode ser dependente ou independente do

aumento de Ca2+ que ativa a NOS em três isoformas: A sintase de óxido nítrico

neuronal (nNOS), induzível (iNOS) e endotelial NOS (eNOS). Em células endoteliais

foram caracterizadas duas diferentes isoenzimas, a eNOS e a iNOS (SCHINI-

KERTH; VANHOUTTE, 1995)

1.3 Mecanismos de ativação da enzima eNOS:

A isoforma da sintase de NO endotelial (eNOS) é um determinante chave da

homeostase vascular e é regulada por diversos receptores de superfície celular. A

atividade da eNOS é caracterizada através da ligação da calmodulina ligada ao

cálcio (CAM-Ca2+) e por alterações na fosforilação pela ação de cinases específicas

(RAFIKOV, et al. 2011). Além disso, proteínas interagem com eNOS e regulam sua

atividade, como a proteína de estresse de 90kDa (hsp90) que age como um

modulador de ativação alostérica e promotor do (des)acoplamento da eNOS

(ISENOVIĆ et al. 2011). Caveolina-1 é uma proteína de ancoragem de cavéolos, de

grande interesse e tem demonstrado atenuar a atividade da eNOS, levando à

inibição da enzima em um processo reversível modulado pela interação da CAM-

Ca2+ (DRAB, et al. 2001, MICHEL; VANHOUTTE, 2010). O recrutamento de CAM-

Ca2+ e hsp90 pode deslocar a caveolina-1 levando levar a ativação da eNOS

(GRATTON, et al. 2000, RATH; DESSY; FERON, 2009) (Fig 3).

Figura 3: Representação do cavéolo, da caveolina-1 e interação com a eNOS. HSP90 (proteína de estresse de 90 kDa); CAM (Calmodulina); eNOS (sintase de NO) (Adaptado de Lucy et al. 2003).

31

Elevações da concentração de Ca2+ intracelular permitem a formação do

complexo CAM-Ca2+ levando a ativação da eNOS. Receptores metabotrópicos,

como os para bradicinina (B1), tem sido relacionados com o aumento do Ca2+ por

ativar a proteína fosfolipase Cβ, convertendo o PIP2 em inositol 1, 4, 5, trifosfato (IP3)

e diacilglicerol (DAG). A interação do IP3 com seu receptor, no retículo

sarcoplasmático, promove a liberação do Ca2+ no meio extracelular, levando à

ativação de canais iônicos (como os canais para Ca2+ operados por voltagem, (CaV))

influenciados em sua maior parte pela PKC (VENEMA, 2002, BIRD, 2011).

Entretanto, estímulos que independem das concentrações plasmáticas de Ca2+,

como a ativação de proteínas cinases, podem induzir a fosforilação da eNOS em

sítios de ativação como resíduos de serina (Ser - em 1177, 635, 617, 615, 116) e

tirosina (Tyr - 567) e resíduos inibitórios como Tyr-81 e treonina (Thr - 495)

(SCHINI-KERTH; VANHOUTTE, 1995; FULTON et. al., 1999; LIN et. al., 2003,

FLEMING, 2010, FÖRSTERMANN; SESSA, 2011). O papel das proteínas cinases

na regulação da eNOS é um tópico de interesse para investigações, assim sendo,

vários estudos tem indicado proteínas cinases que fosforilam diferentes resíduos de

serina e modular a atividade da eNOS (Figura 4).

A identificação farmacológica permitiu a descrição da fosforilação em Ser1177

como alvo de um grande número de proteínas cinases, incluindo a proteína cinase A

(PKA), dependente da concentração de AMP cíclico, (SHAH; SINGH, 2006, BIRD,

2011). Mecanismos de sinalização que culminam na fosforilação da eNOS em Ser

1177 e Ser 615 foram inicialmente demonstrados em estudos independentes que

relataram a participação da via fosfatidil-inositol 3-cinase (PI3K)/ AKT em resposta a

estímulos mecânicos, como alterações do fluxo sanguíneo (shear stress) ou

receptores com ação catalítica, por exemplo, a resposta endotelial à insulina

(FULTON et. al., 1999, CONTRERAS et. al., 2011). Eventos adicionais a estes

estímulos extracelulares, tais como alterações de ATP, hipóxia e fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF) são descritos ainda para relacionar o papel

da proteína cinase ativada por 5’-AMP (AMPK) que; após a fosforilação da porção α

em Thr 172 e consequente ativação da subunidade catalítica, produz a fosforilação

da eNOS em ser 1177 (LEVINE; LI; MICHEL, 2007, COLOMBO; MONCADA, 2009,

FISSLTHALER; FLEMING, 2010; STAHMANN et. al., 2010).

Mecanismos de transativação de proteínas cinases dependentes da

concentração de cálcio intracelular são descritas ainda para explicar os mecanismos

32

de ativação da eNOS. SCHNEIDER e colaboradores (2003) demonstraram que a

proteína cinase da cinase dependente da cálcio-calmodulina (CaMKK) ativa cinases

serina/treonina específicas que agem sobre a proteína Ca2+-CaM, como a proteína

cinase dependente de cálcio calmodulina (CAMK) I, II e IV. Estudos com inibidores

da CAMK II demonstraram a ação desta proteína em fosforilar resíduos de Ser 615 e

Ser 1177 da eNOS, levando a sua ativação e produção de NO (CAI; LIU; GARCIA,

2008). Estímulos decorrentes do estresse oxidativo levam à regulação de vias que

causam a ativação da proteína cinase C (PKC) (HEO; FUJIWARA; ABE, 2011). A

PKC interfere no processo de ativação da eNOS por fosforilar o resíduo de Thr 495,

uma vez que a desfosforilação desse resíduo está associada ao aumento da

atividade da eNOS e estímulos que elevam as concentrações de Ca2+ intracelulares

que culminam na ativação da PKC (XIE et. al., 2011).

Evidências apontam para a importância das alterações na atividade da eNOS

para a função endotelial. Modificações pós-tranducionais da atividade da enzima

estão implicadas em perturbações da sinalização dependente de endotélio que

originam a disfunção endotelial contribuindo para o desenvolvimento da doença

cardiovascular (VANHOUTTE, 2011).

Figura 4: Representação de proteínas cinases envolvidas na fosforilação da eNOS. Alterações do fluxo sanguíneo produzem estimulação de mecanoreceptores sensíveis ao estiramento que induzem a fosforilação da eNOS por proteínas cinases AKT (Ser 1177, 617), AMPK (Ser 1177), PKA (Ser 1177, 635) e CAMKII (Ser 1177) (Adaptado de ZHANG et al. 2009).

33

1.4. Disfunção endotelial associada à hipertensão: Alvos para tratamento

A disfunção endotelial é definida como um desequilíbrio de fatores vasoativos

derivados do endotélio, levando à vasoconstrição excessiva e mudanças estruturais

na parede do vaso; é um evento precoce na fisiopatologia das principais doenças

cardiovasculares (SERBAN; NILIUS; VANHOUTTE, 2010). É um distúrbio de

múltiplas facetas, que tem sido associado com hipertensão de diferentes etiologias,

que envolvem não apenas alterações da via L-arginina - NO-sintase - ciclase de

guanilil solúvel, mas também a capacidade de reduzir hiperpolarizações dependente

do endotélio e aumentar a produção de fatores contracturantes (FELÉTOU;

KÖHLER; VANHOUTTE, 2010).

A alteração da função vascular pode ser individualizada em diferentes

eventos como o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e

outros radicais livres, que são capazes de induzir o estresse oxidativo, promovendo

vasoconstrição e remodelamento vascular (HEO; FUJIWARA; ABE, 2011). Outro

aspecto importante é a produção de agentes vasoconstrictores, em particular

derivados prostanóides, e formação de peptídeos como a endotelina. Portanto,

modulações da função celular que podem levar disfunção endotelial em pacientes

hipertensos e no envelhecimento, bem como a utilização de compostos

antioxidantes para prevenção e/ou inibidores da ação de vasoconstrictores têm sido

alvos de constantes estudos (VANHOUTTE, 2011).

A literatura mostra que atividade reduzida de NO é a referência atual para o

reconhecimento de disfunção endotelial (BOURQUE; DAVIDGE; ADAMS 2011).

Situações que levam ao estresse oxidativo estão envolvidas com alterações na

expressão de eNOS com diminuição da produção de NO e reduzida capacidade de

converter a L-arginina, estes eventos estão relacionados a diminuição da expressão

ou o desacoplamento da eNOS, entretanto, a formação de peróxido de hidrogênio

pode induzir um aumento da expressão da enzima (KOLLURU; SIAMWALA;

CHATTERJEE, 2010, FELÉTOU; KÖHLER; VANHOUTTE, 2011, ISENOVIĆ, et. al.

2011).

Achados mostram que o restabelecimento e a conservação da sinalização

adequada do NO estão associados aos tratamentos efetivos de doenças

cardiovasculares, como a hipertensão. Em particular, são descritos experimentos

que modulam a eNOS: por aumentar a viabilidade do seu substrato e de cofatores,

34

induzir a transcrição ou melhorar a sua atividade, ou ainda, que possam prevenir o

seu desacoplamento (BRAAM;VERHAAR, 2007, BOURQUE; DAVIDGE; ADAMS,

2011).

Outras estratégias terapêuticas têm sido delineadas para restaurar a atividade

vascular na disfunção endotelial, entre elas, a regulação da via ciclase de guanilil

solúvel, alvo fisiológico do NO, que estimula a enzima e utiliza moduladores

alostéricos favorecendo a atividade da via NO–GMPc, bem como a utilização de

inibidores de fosfodiesterase 5 (PDE5) e assim, manter a produção de GMPc na

célula muscular lisa vascular (KASS; CHAMPION; BEAVO, 2009; PRIVIERO;

WEBB, 2010; STASCH; HOBBS, 2009).

Recentemente, a maioria dos estudos sobre os mecanismos associados com

insuficiência da vasodilatação na hipertensão tem direcionado ao papel do EDHF

(BRÄHLER, et al. 2009, GARLAND, et al. 2010). Respostas hiperpolarizantes

endotélio-dependente mediadas pelo EDHF podem fornecer uma reserva do efeito

vasodilatador na hipertensão e compensar, ao menos temporariamente, a disfunção

endotelial devido à síntese comprometida ou disponibilidade de NO (VANHOUTTE,

et al. 2009). A via de sinalização do EDHF envolve a participação dos íons K+ e as

junções gap mioendoteliais com ativação de diferentes KCa endoteliais. No entanto,

como a natureza do EDHF e sua capacidade de induzir vasodilatação estão sendo

reveladas, ações farmacológicas que possam mimetizar as ações hiperpolarizantes

têm seu interesse crescente (SCHINI-KERTH, et al. 2011, DAL-ROS, et al. 2010).

Das diversas causas de hipertensão arterial, a sua maioria permanece de

etiologia desconhecida. Caracterizada como uma doença poligênica, com influência

dos fatores ambientais (Krieger, et al.,) Na hipertensão são descritas alterações

hemodinâmicas e fisiopatológicas, incluindo anormalidades no músculo liso vascular,

hipertrofia ventricular, disfunção endotelial, síndrome metabólica, estado pró-

coagulativo, entre outras (JULIUS, 2007).

A hipertensão é frequentemente alvo nos estudos de desenvolvimento de

novas drogas, nos quais são utilizados modelos experimentais em animais que

apresentam alterações fisiológicas semelhantes àquelas encontradas em humanos.

Diferentes modelos são propostos, entre eles o rato espontaneamente hipertenso

(SHR) com a utilização do controle normotenso Wistar-Kyoto (WKY). Este modelo é

o mais usado, devido às semelhanças com as características genéticas encontradas

em seres humanos. No entanto, outros modelos são utilizados como dependentes

35

de infusão de angiotensina II, modelo de hipertensão renal com constrição de

artérias renais (2R1C), administração crônica de inibidores da enzima NOS, ou

diminuição da secreção renal de sal, os quais têm sido estudados e seus parâmetros

vasculares e cardíacos investigados (EDRIS et al., 2007).

Dessa forma, embora existam muitos medicamentos para o tratamento da

hipertensão arterial, há um grande interesse na pesquisa de novos produtos

bioativos para encontrar alternativas ao tratamento de hipertensão (PAULIS;

UNGER, 2010; TOMASONI et. al., 2010). Estudos experimentais e clínicos indicam

que produtos naturais possuem um importante papel no desenvolvimento de novas

drogas e sugerem que metabólitos secundários obtidos de plantas apresentam um

desempenho em melhorar a função dos vasos sanguíneos e, portanto, proteger o

sistema vascular (DIAS et. al. 2007, CAVALCANTE, et. al., 2010, WALLACE, 2011).

1.5 Produtos Naturais: Monoterpenos e α-terpineol.

Atualmente tem-se verificado valiosos avanços envolvendo os compostos

químicos e/ou metabólitos derivados de plantas em vários processos farmacológicos

e bioquímicos (BARBOSA-FILHO, 2008). Devido à complexidade da composição

química dos óleos essenciais, diversas ações farmacológicas são apresentadas e

demonstrando o interesse vislumbrando o desenvolvimento de novas drogas. Estes

óleos essenciais apresentam, como constituintes majoritários, os terpenos -

monoterpenos (cerca de 90% dos óleos essenciais) que são considerados, em

muitos casos, como responsáveis pelos odores de plantas aromáticas, seguido dos

sesquiterpenos, diterpenos e fenilpropenos (SANTOS et al., 2011). Os terpenóides

são hidrocarbonetos que possuem como unidade básica, o isopreno

[CH3C(CH2)CH2CH2]. A classificação básica dos vários terpenos decorre do número

de unidades isoprênicas que contêm. Os monoterpenos são constituídos de duas

unidades de isopreno e são divididos em três subgrupos: acíclicos (ex. linalol),

monocíclicos (ex. α-terpineol) e bicíclicos (ex. cânfora).

Os monoterpenos têm representado uma nova classe de agentes químicos

com elevado potencial terapêutico (TISSERAND e BALACS, 1995). São relatadas

ações diversas destes compostos na literatura, dentre elas, efeito anti-neoplásico

(JIRTLE, 1993), atividades antimicrobianas (GARCIA et al. 2008b), antioxidante

(SINGH, 2010), agonistas de canais TRP (CALIXTO et al., 2005), antinociceptiva

36

(GONÇALVES et al. 2008), antiespasmolítica (MAGALHÃES et al. 1998). Recentes

estudos com monoterpenos sobre as ações cardiovasculares têm demonstrado

atividades vasorelaxantes e hipotensoras (GUEDES et al. 2004, BASTOS et al.

2010, MENEZES et al. 2010).

Deste modo, estudos com monoterpenos vêm sendo desenvolvidos no nosso

grupo de pesquisa, os estudos realizados por GUEDES e coloboradores (2002;

2004) utilizando a rotundifolona demonstraram hipotensão associado aos efeitos

vasorelaxantes com produção de EDRF’s e inibição do influxo de cálcio em ratos.

Estes efeitos demonstram que monoterpenos são promissores em prevenir as

complicações vasculares decorrentes do processo de hipertensão. Neste contexto,

Magalhães e colaboradores (1998; 2008) avaliaram os efeitos cardiovasculares do

óleo essencial de Croton nepetaefolius e seus constituintes majoritários metileugenol

e α-terpineol. Estes monoterpenos demonstraram atividades antiespasmódicas,

capazes de diminuir a resistência vascular de leito mesentérico.

Uma triagem farmacológica preliminar realizada em nosso laboratório com o

α-terpineol e seus análogos demonstrou uma atividade vasorelaxante utilizando a

metodologia in vitro para artéria mesentérica superior. Em adição, estudos anteriores

realizados no nosso grupo demonstraram que o -terpineol, 1-metil-4-isopropil-1-

ciclohexen-8-ol (Figura 5), produziu hipotensão e vasorrelaxamento dependente da

produção dos metabólitos produzidos pelo endotélio vascular com possível

envolvimento da enzima sintase de óxido nítrico (RIBEIRO, 2008). Nesse sentido,

estudos adicionais são pertinentes para avaliar, no sistema cardiovascular, a

capacidade do -terpineol em aumentar a disponibilidade de NO, em favorecer a

ocorrência de respostas mediadas pelo EDHF, ou ainda, determinar os efeitos que

interfiram na ação de fatores contracturantes. Estas respostas são fundamentais

para restaurar a função endotelial adequada e assim retardar o aparecimento de

complicações vasculares decorrentes no processo da hipertensão.

Figura 5: Estrutura química do α-terpineol (C10 H17 O1; MM=154)

37

Objetivos

38

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Investigar os mecanismos cardiovasculares do -terpineol em ratos

espontaneamente hipertensos.

2.2 Específicos

Avaliar as ações cardiovasculares induzidas pelo -terpineol in vivo utilizando-

se animais hipertensos;

Caracterizar a influência do sistema nervoso autônomo no efeito hipotensor

induzido pelo -terpineol em ratos hipertensos.

Investigar a influência do -terpineol na sensibilidade do barorreflexo em ratos

SHR e normotensos WKY.

Determinar o relaxamento vascular induzido pelo -terpineol em artéria

mesentérica superior de animais hipertensos;

Verificar a participação das vias endoteliais NO/GMPc, da via PGI2/AMPc e

EDHF envolvidos neste efeito vasorelaxante.

Avaliar os níveis da produção de NO em células endoteliais tratadas com -

terpineol.

Investigar o sítio de fosforilação da eNOS responsável pela ativação desta

enzima em resposta ao -terpineol em cultura primária de células endoteliais.

Pesquisar a participação de proteínas cinases como AKT e AMPK envolvidas

na fosforilação da eNOS induzida pelo -terpineol em células endoteliais.

Estudar o envolvimento dos receptores endoteliais muscarínicos (M3) no

vasorrelaxamento de artéria mesentérica de ratos hipertensos

Definir a participação dos canais de K+ na vasodilatação induzida pelo -

terpineol em ratos hipertensos.

39

Materiais

40

3. MATERIAIS

3.1 Animais:

Os animais utilizados foram ratos da espécie Rattus norvegicus, variedade

Wistar Kyoto normotensos (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR),

todos machos e adultos (3 a 4 meses), pesando entre 250- 300g. Os animais foram

provenientes do biotério Prof. George Thomas do núcleo de pesquisa do Centro de

Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba. Os animais foram mantidos sob

condições de temperatura controlada (21 ±1ºC) e ciclo claro e escuro de 12 h (6-18

h), tendo livre acesso à água e a ração (Purina, Brasil).

3.2 Obtenção do -terpineol:

O monoterpeno -terpineol (Sigma/ Aldrich – EUA) e gentilmente cedido pelo

prof. Damião P. de Souza, Universidade Federal de Sergipe,

3.3 Substâncias e sais:

Cloridrato de acetilcolina (ACH); indometacina (INDO); glibenclamida (GLIB)

hidroxicobalamina (HDX); L (-) arginina; L (-) fenilefrina; nitroprussiato de sódio; N-

nitro-L(-) arginina-metil éster (L-NAME); ODQ (1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3,-

quinoxalino-1-ona), sulfato de atropina, cloridrato de tetraetilamônio (TEA), 4-

aminopiridina (4-AP) caribdotxina, apamina, cremofor, dimetilsulfóxido (DMSO),

albumina sérica bovina, HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etano-ácido

sulfônico), ortovanadato de sódio (Na3VO4), fosfato de sódio, fluoreto de sódio

(NaF), ácido ocadáico foram obtidos da empresa Sigma – Aldrich (EUA). Duodecil

sulfato de sódio (SDS) e kit de Bradford para quantificação de proteínas obtido da

Bio-Rad Laboratories (Califórnia - EUA). Cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2.2H2O),

cloreto de potássio (KCl), cloreto de sódio (NaCl), glicose (C5H12O6), cloreto de

magnésio hexahidratado (MgCl2.6H2O) foram obtidos da empresa Merck (EUA).

Fosfato monossódico 1-hidratado (NaH2PO4.H2O), bicarbonato de sódio (NaHCO3)

da empresa Vetec (Brasil). Tiopental sódico (Cristália, Brasil). Sulfato de heparina e

inibidor de protease (Roche, Alemanha).

41

A indometacina foi dissolvida juntamente com o bicarbonato de sódio

(NaHCO3) a 5% em água destilada, o ODQ foi dissolvido com o DMSO e a GLIB foi

dissolvida em etanol PA (95%). As demais soluções estoques foram dissolvidas em

água destilada. Todas as soluções foram mantidas a 18 °C e, imediatamente antes

dos experimentos, diluídas em salina ou água destilada, para ensaios in vivo e in

vitro, respectivamente. As concentrações utilizadas de NaHCO3 (5%) e DMSO

(0,1%), nas soluções não apresentaram qualquer efeito sobre as preparações

controle (dados não demonstrados).

3.4. Soluções nutritivas:

Para a preparação das soluções nutritivas foram utilizadas as seguintes

substâncias em mM: cloreto de sódio (NaCl) 158,3; cloreto de potássio (KCl) 4;

cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2); 2, sulfato de magnésio hepta-hidratado

(MgSO4.7H2O) 1,05; glicose (C6H12O6) 5,6; bicarbonato de sódio (NaHCO3) 10.

Todas estas soluções foram mantidas em carbogênio (95 % de O2 e 5 % de

CO2) a 37ºC. Nas preparações das soluções despolarizantes de Tyrode com cloreto

de potássio a 20 mM, a concentração de sódio foi isosmoticamente alterada.

3.5 Preparação da solução de -terpineol:

O -terpineol foi solubilizado em cremofor 1% e diluídos em água destilada na

concentração de 10-2 M para os experimentos in vitro e diluídos em salina na

concentração de 20 mg/mL para experimentos in vivo. As concentrações utilizadas

cremofor na cuba não excedeu 0,01%. Nesta concentração o cremofor não

demonstra qualquer efeito em anéis de artéria mesentérica superior de rato.

Todas as soluções foram estocadas a 18 °C e, imediatamente antes dos

experimentos, diluídas em salina ou água destilada, para ensaios in vivo e in vitro,

respectivamente, de acordo com a necessidade de cada protocolo experimental.

42

Métodos

43

4 MÉTODOS

Foram utilizadas diferentes abordagens: ensaios farmacológicos in vivo, com

animais íntegros, e ensaios farmacológicos in vitro, com órgãos isolados e cultivo de

células endoteliais.

4.1 Ensaios Farmacológicos in vivo.

4.1.1 Medida direta de pressão arterial e freqüência cardíaca em ratos Wistar

Kyoto normotensos (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR) não

anestesiados.

A pressão sanguínea intra-aórtica foi registrada em animais normotensos e

hipertensos, não-anestesiados, de acordo com a técnica descrita por Botelho-Ono

(2010). Brevemente, 24 horas antes da realização dos experimentos, os animais

foram anestesiados com cetamina + xilazina (80mg + 4mg/ kg), e implantou-se

catéteres de polietileno (PE), um segmento de PE-10 (diâmetro interno e externo de

0,28 - 0,61 mm, respectivamente), acoplado a um segmento de PE-50 (diâmetro

interno e externo de 0,58 - 0,96mm, respectivamente). Foram implantados na aorta

abdominal inferior e na veia cava inferior, via artéria e veia femoral esquerda,

respectivamente. A redução do diâmetro do segmento PE-10 tem como finalidade

minimizar o risco de isquemia na perna cateterizada sem, no entanto, alterar o sinal

de pressão arterial (Figura 6). Após a inserção e fixação, os catéteres foram

tunelizados subcutaneamente e exteriorizados através de uma incisão na região

cervical posterior do animal (scapulae). A PA e FC foram medidas 24 h após o ato

cirúrgico pela conexão do cateter arterial a um transdutor de pressão pré-calibrado

acoplado a um amplificador (LabTrax 2-24T, World Precision Instruments - WPI,

Sarasota, FL, USA) e este, conectado a um computador e com o programa Datatrax

2 (WPI, Sarasota, FL, USA) para aquisição e tratamentos de sinais biológicos em

animais de pequeno porte (Figura 7). O cateter venoso foi implantado para a

administração das drogas.

44

Figura 6: Representação esquemática dos vasos onde foram implantados os cateteres para o registro dos parâmetros cardiovasculares e administração de drogas.

Figura 7: Aparato utilizado para as medidas de pressão arterial e frequência cardíaca em ratos

45

4.1.2 Protocolos experimentais empregados nos estudos in vivo.

Foram utilizados 10 animais normotensos WKY e 9 hipertensos SHR. Após

um período de recuperação de 24 horas o catéter aórtico foi conectado ao transdutor

de pressão para registro da PA e FC. Um período antes do início dos experimentos

foi permitido aos animais para que assim seus valores de PA e FC estabilizassem.

Para verificar a correta implantação do catéter venoso, foi administrado o

nitroprussiato de sódio, nas doses de 10 µg/kg. Após 15 min., doses crescentes de

-terpineol foram administradas de forma randomizada com o objetivo de verificar o

efeito sobre os parâmetros analisados. As doses administradas de -terpineol

obedeceram a intervalos de aproximadamente 1h para que os parâmetros

cardiovasculares retornassem aos seus valores da linha de base (Figura 8). Os

valores de PAM e FC foram computados antes (valores da linha de base) e

imediatamente após a administração de -terpineol, e suas variações foram

expressas para cada dose, calculadas através da seguinte fórmula:

= Variação dos valores de pressão arterial

PA depois = Valores de PA depois da administração das drogas

PA antes = Valores de PA antes da administração das drogas

Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental. Protocolo da

administração de doses crescentes de -terpineol em ratos WKY e SHR antes e após tratamento agudo com diferentes inibidores.

= PA depois – PA antes

46

4.1.2.1. Avaliação do controle autonômico nas variações da PA e da FC

induzidas pela administração de α-terpineol em ratos não-anestesiados WKY e

SHR.

Depois do período de estabilização dos parâmetros cardiovasculares, a DE50

de -terpineol (4.8 mg/Kg, i.v.) foi administrado e os efeitos registrados. Em seguida

os animais foram tratados em grupos separados com atropina (2 mg/kg, ,i.v, n=6),

um antagonista muscarínico não seletivo, ou hexametônio (30 mg/kg, ,i.v, n=6), um

bloqueador ganglionar, ou atenolol (20 mg/kg,i.v, n=6), um bloqueador dos

receptores β1, ou prazosin (1 mg/kg, i.v, n=5) antagonista dos receptores α1, e 30

minutos depois, as mesmas doses do monoterpeno, obedecendo a mesma

sequência anterior, foram administradas, obtendo-se uma nova curva dose-resposta

para de -terpineol. As influências do tratamento foram obtidas por comparações

dos valores da PA e FC da condição anterior (controle) com as registradas após a

administração do antagonista.

4.1.2.2. Verificação da participação da enzima sintase de óxido nítrico (NOS) no

efeito cardiovascular induzido por -terpineol em ratos normotensos e

hipertensos não-anestesiados.

Após estabilização dos parâmetros hemodinâmicos, a DE50 de -terpineol (4.8

mg/Kg, i.v.) foi administrada e os valores de PAM e FC foram então registrados,

como descrito anteriormente. Após o retorno dos valores de PAM e FC a níveis

basais, os animais foram tratados agudamente com L-NAME 20 mg/Kg, i.v., um

inibidor da NO-sintase, (MONCADA; HIGGS, 1993) e após 30 minutos, a DE50 de -

terpineol (4.8 mg/Kg, i.v., n=7) foram administradas conforme descrito anteriormente

(Figura 7). Mudanças na PAM e na FC induzidas por -terpineol, foram comparadas

antes (valores controle) e após o tratamento com L-NAME.

47

4.1.2.3. Teste de sensibilidade do controle barorreflexo.

A estimulação do barorreflexo foi realizada pela injeção intravenosa de doses

crescentes de substâncias vasoconstritoras (fenilefrina, agonista α-adrenérgico) e

substância vasodilatadora (nitroprussiato de sódio, doador de óxido nítrico), o que

produz aumento ou diminuição da PA respectivamente, que por sua vez aumenta ou

diminui a atividade dos barorreceptores arteriais e, reflexamente, induz alterações da

FC (bradicardia barorreflexa ou taquicardia barorreflexa). Para a avaliação do efeito

do -terpineol (4.8 mg/kg, i.v.) sobre o barorreflexo, foi realizado a estimulação do

barorreflexo com a administração de fenilefrina (8 μg/kg) e nitroprussiato de sódio

(25 μg /kg) antes e após o tratamento dos animais SHR e WKY com -terpineol.

A sensibilidade do barorreflexo foi avaliada relacionando-se as alterações

reflexas de FC induzidas por alterações transitórias da PAM. As mudanças da

frequência cardíaca produzida pela administração das drogas vasoativas foram

quantificadas e analisadas à razão dos valores de mudanças de frequência cardíaca

(FC) e pressão arterial média (PAM) (ΔFC/ΔPAM), conforme previamente descrito

por Braga et al. (2008).

4.2 Ensaios Farmacológicos in vitro.

4.2.1 Preparações de anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

Os ratos normotensos e hipertensos foram eutanasiados. Em seguida, foi

retirada a artéria mesentérica superior por uma incisão no abdômen do animal, a

qual foi separada de tecidos conectivos e adiposos e então seccionada em anéis (1-

2 mm). Os anéis foram mantidos em cubas de 10 ml contendo solução de tyrode,

(pH=7,4) a 37 ºC e gaseificada com uma mistura 95% oxigênio e 5% gás carbônico.

Os anéis de artéria mesentérica superior foram suspensos por linhas de algodão, e

acopladas a um sistema de aquisição (Miobath-4, WPI, Sarasota-USA) para o

registro das contrações isométricas (Figura 9), ajustando-se uma tensão de 0,75 g, e

permanecendo por um período de 60 minutos de estabilização. Durante este período

o meio nutritivo era renovado a cada 15 minutos, para prevenir a interferência de

metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

48

Os anéis sem endotélio foram obtidos mecanicamente através do atrito entre

as paredes internas do vaso. Foram considerados anéis com endotélio, os anéis

com relaxamento superior a 80% após a aplicação de acetilcolina sobre a pré-

contração com FEN. Já os anéis com relaxamentos inferiores a 10 % foram

considerados sem endotélio. (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Anéis com

relaxamento entre 10% e 80% foram descartados.

Figura 9: Fotografia do sistema de cubas de aquisição de dados de tensão isométrica para órgãos isolados.

4.2.2 Protocolos experimentais empregados nos estudos in vitro.

4.2.2.1 Anéis de artéria mesentérica superior de rato normotenso ou

espontaneamente hipertenso pré-contraídos com fenilefrina na presença ou

ausência de endotélio.

Após o período de estabilização, de 60 min, foi induzida uma contração com

fenilefrina (10 M) e a presença de endotélio foi então verificada através do nível de

relaxamento obtido pela adição de ACh (10 M). Após a verificação da presença ou

ausência de endotélio, foi obtida uma nova contração com FEN (10 M) e após a

estabilização tônica (aproximadamente 45 minutos) da contração concentrações

crescentes (10-12 a 10-5 M) de maneira cumulativa do -terpineol foram aplicadas em

49

anéis na presença ou ausência do endotélio (Figura 10). A percentagem de inibição

da contração foi mensurada pela comparação da resposta antes e após adição de -

terpineol.

O tempo necessário para que fossem obtidas as respostas máximas para

cada concentração de -terpineol variou entre 2 e 5 minutos. No final dos

experimentos, a reversão do relaxamento produzido por -terpineol foi conseguida

após 30 minutos de sua remoção das cubas, através da troca da solução de Tyrode

e verificação da resposta do tecido à FEN (10 μM). A reversibilidade foi

rotineiramente observada para assegurar que o relaxamento do tecido não foi

ocasionado por um possível dano tecidual.

Anéis com endotélio

Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental. Protocolo do

estudo do efeito de concentrações crescentes -terpineol (10-12 a 10-5 M) em anéis

de artéria mesentérica superior isolada de rato pré-contraídos com 10 M de FEN com endotélio. Quando necessário foram administrados inibidores durante 30

minutos, seguida de uma nova contração com FEN com adição do -terpineol. Ao final foi realizada a reversibilidade com uma nova contração de FEN.

4.2.2.2 Investigação do efeito do α- terpineol sobre o tônus intrínseco vascular

de anéis mesentéricos de ratos hipertensos e normotensos.

Com finalidade de avaliar o efeito do α-terpineol sobre o tônus muscular

espontâneo, foram realizados experimentos em anéis de artéria mesentérica de

ratos hipertensos e normotensos. Uma vez verificada a presença ou ausência do

endotélio vascular como descrito anteriormente, os anéis mesentéricos tiveram suas

Fen (10M)

ACh (10M)

Inibidores (30 min)

-terpineol

EE ((++))

?

1 h

Lav.

Fen (10M)

Estab.

Fen (10M)

Estab.

50

soluções nutritivas trocadas e após o período de estabilização do tônus vascular (30

min) concentrações crescentes de α-terpineol (10-12 a 10-5 M) foram adicionadas.

Após esse tratamento, avaliou-se um possível dano tecidual, portanto, lavagens

sucessivas com solução Tyrode foram feitas seguidas por um novo período de

estabilização (30 min). Na sequência, os anéis foram tratados com fenilefrina na

concentração de 10 μM para verificar a recuperação do órgão.

4.2.2.3 Verificação da influência da inibição da enzima sintase de NO sobre a

resposta vasorelaxante induzida por -terpineol em anéis de artéria

mesentérica isolada de rato normotenso e hipertenso.

Após a verificação da presença do endotélio conforme descrito anteriormente,

as preparações de anéis de artéria mesentérica superior de ratos foram incubadas

com L-NAME (100 M), um inibidor competitivo da enzima NO-sintase (MONCADA;

HIGGS, 1993) durante 30 minutos. Após este período, uma contração tônica com

fenilefrina (10 M) foi obtida e as concentrações crescentes e cumulativas de -

terpineol (10-12 a 10-5M) foram adicionadas. As respostas de -terpineol obtidas após

a adição das substâncias foram comparadas com as obtidas na ausência. Cada

protocolo experimental supracitado foi realizado em preparação específica.

4.2.2.4 Verificação da participação da via NO/GMPc na resposta vasorelaxante

induzida por -terpineol em anéis de artéria mesentérica isolada de rato

normotenso e hipertenso.

Preparações de anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato

normotenso ou hipertenso, com endotélio, foram incubadas por 30 minutos com

ODQ (10 M), um inibidor da enzima ciclase de guanilil (GARTHWAITE et al., 1995;

KLOSS 2000) ou hidroxicobalamina (30M), um seqüestrador de óxido nítrico

(KRUSZYNA et al., 1998). Após este período, uma contração tônica com fenilefrina

(10 M) foi obtida e concentrações crescentes e cumulativas de -terpineol (10-12 a

10-5 M) foram adicionadas. A resposta de obtida após a adição deste inibidor foi

comparada com a resposta obtida na ausência desta substância.

51

4.2.2.5 Verificação da participação dos metabólitos da via da Ciclooxigenase

ou influência dos receptores muscarínicos na resposta vasorelaxante induzida

por -terpineol em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato


Conforme mencionado, após a verificação da integridade do endotélio, os

anéis de artéria mesentérica superior foram pré-incubados com indometacina 10 M,

inibidor da ciclooxigenase (CLARK; FUCHS, 1997), ou atropina (1 M) um

antagonista de receptores muscarínicos, por 30 minutos. Após este período, uma

contração tônica de fenilefrina (10 M) foi obtida e as concentrações crescentes e

cumulativas de -terpineol (10-12 a 10-5 M) foram adicionadas. A resposta de -

terpineol obtida após a adição do bloqueador foi comparada com aquela obtida na

sua ausência.

4.2.2.6 Verificação da participação de canais de K+ na resposta relaxante

induzida por -terpineol em anéis de artéria mesentérica superior isolada de

rato normotenso e hipertenso.

Após a verificação da integridade do endotélio, como descrito anteriormente,

a solução de Tyrode da cuba foi trocada pela solução despolarizante de Tyrode com

KCl a 20 mM (KCl 20 mM) e as preparações permaneceram nesta solução até o final

do experimento. Este procedimento produz alteração do efluxo de íons K+ e atenua

relaxamentos mediados por abertura de canais para K+ (CAMPBELL et al., 1996;

CLARK; FUCHS, 1997). Decorridos 30 min, foi induzida uma nova contração tônica

com FEN (10 M) e, em seguida, uma curva concentração-resposta para -terpineol

(10-12 a 10-5 M) foi obtida. A resposta obtida na presença de KCl (20 mM) foi

comparada com a resposta obtida na ausência do mesmo.

4.2.2.7 Identificação dos canais de potássio envolvidos na resposta relaxante

induzida por -terpineol em ratos normotensos e hipertensos.

Após a verificação da presença do endotélio, anteriormente as preparações

com endotélio foram incubadas separadamente com 1 mM de 4-AP, um bloqueador

52

seletivo de canais de K+ sensíveis a voltagem (KV) (LANGTON et al., 1991; LAGAUD

et al., 1999; BERG, 2002), 10 M de GLIB, um bloqueador seletivo de canais de K+

sensíveis ao ATP (KATP) (HUANG; KWOK, 1997; MOMBOULI; VANHOUTTE, 1997),

1 mM de TEA bloqueador dos canais de K+ (JACKSON, 2000), e o bloqueador

seletivo dos canais IKca e SKca (caribdotoxina associado com apamina, ambas na

concentração de 0.2μM). Após 30 min., foi induzida uma nova contração tônica com

FEN (10 M) e, em seguida, uma curva concentração-resposta para a -terpineol foi

obtida.

4.3 Ensaios bioquímicos realizados in vitro:

Estes experimentos foram realizados em colaboração com o grupo de

pesquisas da Prof. Dra. Lia Sumie Nakao do Laboratório De Neurobiologia do

Departamento de Patologia e Biologia Celular da Universidade Federal do Paraná,

em Curitiba, PR. E a colaboração da Prof. Dra. Valérie Bárbara Schini-Kert do

Laboratório de Farmacologia e Fisiopatologias Cardiovasculares, do Laboratório de

Biofotônica e Farmacologia, Faculdade de Farmácia, Universidade de Estrasburgo,

Estrasburgo, França.

4.3.1 Cultura celular

4.3.1.1 Células endoteliais imortalizadas de aorta de coelho (RAEC)

Nestes experimentos foram utilizadas células endoteliais imortalizadas de

aorta de coelho (RAEC) (BUONASSISI; VENTER, 1976), as quais foram mantidas

em incubadora com atmosfera umedecida, 5% CO2/ 90 % ar, 37 °C. O meio de

cultura foi o F12 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 20 mM de HEPES e

antibiótico gentamicina (100 μg/mL). A confluência foi atingida entre as 48h que se

seguiam. Todos os experimentos foram realizados em culturas celulares

confluentes. As células foras expostas ao meio de cultura contendo 0,1% de soro

fetal bovino durante 6 horas antes do tratamento das células.

53

4.3.1.2 Cultura primária de células endoteliais de coronária de porco

As artérias coronárias de porco foram isoladas e os segmentos longos foram

lavados internamente com PBS sem cálcio, para remover o sangue remanescente.

Em seguida, as células endoteliais foram isoladas por meio do tratamento com

colagenase (tipo I, Worthington, 1 mg/ml) durante15 min a 37 °C) e cultivadas em

placas contendo meio MCDB 131 (Invitrogen) e 15% de soro fetal bovino

suplementado com penicilina, (100 U/ ml), estreptomicina (100 U/ml), fungizona (250

μg/ml), e L-glutamina (2 mM) (todos da Cambrex). A confluência foi atingida entre as

48 a 72 horas que se seguiam. Todos os experimentos foram realizados em culturas

celulares confluentes e de primeira passagem. As células foras expostas ao meio de

cultura contendo 0,1% de soro fetal bovino (QBiogene) durante 6 horas antes do

tratamento das células.

Todos os protocolos experimentais foram executados de acordo com Guide

for the care and use of laboratory animals publicado pelo U.S. National Institutes of

Health (NHI1996).

4.3.2 Determinação da produção do NO

4.3.2.1 Quantificação dos níveis de NO em células endoteliais de aorta de

coelho induzida pelo α-terpineol.

A produção de NO em células endoteliais de aorta de coelho induzida pelo α-

terpineol foi quantificado por fluorescência. O citomêtro de fluxo (marca B&D

FACSCALIBUR) foi usado para avaliar mudanças relativas nas concentrações

intracelulares de NO por monitoramento de fluorescência de DAF-2. Para isso foi

utilizado a sonda o DAF-2DA (diacetato 4,5-diaminofluoresceína,10-5M, Calbiochem)

que apresenta uma característica permeante a célula. DAF2-DA penetra nas células

endoteliais onde é clivado através de estearases plasmáticas para DAF-2 que é

retido então na célula e reage com o NO na presença de oxigênio. Esta reação

produz combinações fluorescentes emitidas em 488 nm até 515 nm e permitem a

54

quantificação da produção do óxido nítrico. Quantificação do NO foi determinada

com software convencional de análise em níveis de intensidade fluorescente em

proporção ao DAF2-DA ao qual aumenta a quantidade de NO liberado pelas células

vasculares no basal ou condições estimuladas.

4.3.2.2 Protocolos experimentais para quantificação da produção de óxido

nítrico induzida pelo α-terpineol em células endoteliais de aorta de coelho.

As amostras foram mantidas em cultura momentos antes do experimento.

Para o tratamento com α-terpineol, as amostras foram agrupadas e o DAF-2-DA foi

adicionado.

Para os protocolos experimentais foram formados 3 grupos, o primeiro grupo

foi realizado em condições não estimuladas (NO basal) com a emissão de

fluorescência do DAF-2 formado foi utilizada como controle. Em um segundo grupo

as amostras com emissão de fluorescência pelo DAF-2 formado na presença de 10-5

M ou 10-4 M acetilcolina ou bradicinina (10-4 M) (condição de estimulação de NO)

foram utilizadas como controle positivo. Em um terceiro grupo as amostras foram

analisadas pela emissão de fluorescência pelo DAF-2 após a pré-incubação com o

monoterpeno α-terpineol (após 30 min) em diferentes concentrações (10-6 M, 10-5 M,

10-4 M).

4.3.2.3 Avaliação da influência da inibição da enzima NO sintase na produção

de óxido nítrico induzida pelo α-terpineol em células endoteliais de aorta de

coelho.

Os protocolos experimentais foram formados em 4 grupos, onde o primeiro

grupo foi realizado em condições não estimuladas (NO basal) com a emissão de

fluorescência do DAF-2 foi utilizada como controle. No segundo grupo foi utilizada

acetilcolina na concentração de 10-5 M, no terceiro grupo a concentração de 10-5 M

de α-terpineol (após 30 min) e no quarto grupo foram realizados experimentos na

presença do inibidor da enzima NO sintase, L-NAME 100 μM, adicionado às

preparações 15 minutos antes da adição do α-terpineol.

55

4.3.2.4 Confirmação do efeito α-terpineol de produzir NO em células endoteliais

de artéria coronária de porco.

A produção de NO em células endoteliais de artéria coronária de porco

induzida pelo α-terpineol foi quantificado por fluorescência. Foram realizadas

análises rápidas e de alta sensibilidade utilizando a citometria para captura amostras

em placas com o citometro Celigo Cytometer da marca Cyntellect (San Diego –

EUA). As mudanças relativas nas concentrações intracelulares de NO foi

determinado por monitoramento de fluorescência de DAF-2 (emissão 488 nm até

515 nm). A avaliação dos níveis de NO foi determinada com software convencional

Cyntellect® para análise dos níveis de intensidade fluorescente.

4.3.2.5 Protocolos experimentais para quantificação da produção de óxido

nítrico induzida pelo α-terpineol em células endoteliais de artéria coronária de

porco.

Para os protocolos experimentais foram formados 4 grupos, o primeiro grupo

foi realizado em condições não estimuladas (NO basal) e a emissão de fluorescência

do DAF-2 foi utilizada como controle. Em um segundo grupo as amostras com

emissão de fluorescência pelo DAF-2 formado na presença de bradicinina 10-4 M

(condição de estimulação de NO) foi utilizada como controle positivo. Em um terceiro

grupo, as amostras foram analisadas pela emissão de fluorescência pelo DAF-2

após a pré-incubação com o monoterpeno α-terpineol (10-4 M) (após 30 min). No

quarto grupo foram realizados experimentos na presença do inibidor da enzima NO

sintase, L-NA 100 μM, adicionado as preparações 15 minutos antes da adição do α-

terpineol (10-4M).

4.3.3 Análises por western blotting

As fosforilações da eNOS, Akt e AMPK foram determinadas em cultura de

células endoteliais de coronária de porco através da técnica de western blotting,

exatamente como descrito por Anselm e colaboradores (2007).

56

Para determinar a fosforilação das proteínas em estudo, as células foram

previamente tratadas durante 30 minutos com PBS (controle negativo), ou com o -

terpineol (10-5 a 3x10-4 M). Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes

com o PBS e então lisadas com uma mistura contendo Tris/HCl 20 mM (pH 7.5;

QBiogene), NaCl 150 mM, Na3VO4 1 mM, fosfato de sódio 10 mM, NaF 20 mM,

ácido ocadáico 0.01 mM (Sigma), inibidor de protease (Roche) e 1% Triton X-100

(QBiogen). Alguns experimentos foram realizados para investigar o efeito das

diferentes concentrações e dos tempos de incubação sobre a fosforilação das

proteínas investigadas.

A quantificação de proteínas foi descrito por Bradford (1976) e o total de

proteínas usado por amostra foi 20 μg. As proteínas foram separadas em gel de

poliacrilamida SDS 8% (Sigma) a 70 V durante 2 horas. Em seguida foram

transferidas eletroforeticamente, a 100 V durante 120 minutos, para membranas

(difluoreto de polivinilidina da Amersham), as quais foram bloqueadas com meio

contendo 3 % de albumina sérica bovina, Tris (Biorad) e 0,1% de Tween-20 (Sigma)

(TBST) durante 1 hora. Para detecção das proteínas fosforiladas, as membranas

foram incubadas com os respectivos anticorpos primários (p-AMPK Tyr-172, p-Akt

Ser473 e p-eNOS Ser1177, Cell Signaling Technology; diluição de 1:1000), a 4 °C

durante 12h. Após a lavagem em PBS, as membranas foram incubadas com o

anticorpo secundário (anticorpo anti–rabbit IgG ligado à peroxidase, diluição de

1:10000; Cell Signaling Technology), em temperatura ambiente, durante 60 minutos.

Marcadores específicos (Invitrogen) foram utilizados para a determinação do peso

molecular e identificação das proteínas na membrana. As bandas imunorreativas

foram detectadas pelo aumento da quimioluminescência (Amersham).

Frequentemente uma solução de Ponceau foi utilizada para verificar a qualidade da

transferência das proteínas.

57

4.4 Análise Estatística

Os resultados são expressos como a média ± erro padrão da média de 3

experimentos (em cultura de células) ou 4 a 9 experimentos (com animais e artérias

isoladas). Os testes t de Student (não pareado) e análise de variância ANOVA de

uma ou duas vias, seguido de teste de Bonferronni. Os valores de p < 0,05 foram

considerados significativos em avaliar as diferenças entre as médias. Para avaliar o

efeito vasorelaxante induzido por -terpineol, o parâmetro do Emáx (efeito máximo

gerado pelo agonista) foi analisado de acordo com a diminuição da resposta

máxima. Para todos estes procedimentos foi utilizado o programa estatístico

GraphPad Prism versão 5.0.

58

Resultados

59

5. RESULTADOS

5.2 ESTUDOS in vivo

5.2.1 Efeito do α-terpineol sobre a pressão arterial média (PAM, mmHg) e

frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos hipertensos (SHR) e normotensos

(WKY) não-anestesiados

Após o período de estabilização dos parâmetros cardiovasculares de ratos

normotensos não-anestesiados, os valores de pressão arterial média e frequência

cardíaca foram para PAM 105 ± 3 mmHg e FC 360 ± 3 bpm (n=10) e PAM de 185± 5

mmHg e FC de 380 ± 5 bpm para ratos SHR (n=11). α-Terpineol (1, 5, 10 and 20

mg/kg, i.v., administrado de maneira randômica) induziu hipotensão dependente de

dose em animais hipertensos SHR (-375, -577, -715, -844 mmHg, n=9) e

normotensos WKY: (-103, -399, -5211, -6212 mmHg, n=10) (Figure 11 A, B).

Este efeito hipotensor foi associado a uma taquicardia inicial, seguida de uma

bradicardia em ambos os grupos de animais.

Como observado nos valores de batimentos por minuto (bpm) de animais

normotensos, foi notado que o α-terpineol produziu uma taquicardia seguida de uma

bradicardia persistente evidente nas maiores doses de 10 e 20 mg/kg (WKY: tempo

inicial 0: 45±5, 64±11, 110±7, 113±22 bpm; tempo de 3 min: -3±5, -10±4, -73±4,

-125±2 bpm, n=10). Em animais hipertensos este efeito foi reproduzido, no entanto,

a dose de 5 mg/kg foi capaz de produzir a hipotensão e taquicardia com a

bradicardia secundária superior a 60 bpm (SHR: Tempo 0: 61±5, 75±9, 85±3, 72±8

bpm; Tempo 3 min: -33±12, -71±5, -126±16, -144±32 bpm, n=9; Figura 11 C, D).

O valor da DE50 α-terpineol foi de 4.8 mg/kg, este valor foi calculado de acordo

com a relação dose-efeito. Na figura 12 estão apresentados os registros

representativos do efeito do α-terpineol na dose de 4.8 mg/kg.

60

Figura 11: Efeitos do α-terpineol sobre (A e B) a pressão arterial média (PAM,

mmHg) e (C e D) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) (n=10) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=9). Os valores foram expressos

como média e.p.m.

SHR WKY

A B

C D

61

Figura 12: Registro representativo dos efeitos do α-terpineol (4.8 mg/kg) sobre a

pressão arterial média (PAM, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos (A)

normotensos (WKY) (n=10) e (B) hipertensos (SHR) (n=9).

A

B

62

5.2.2 Efeito do α-terpineol sobre a pressão arterial média (PAM, mmHg) e

frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos hipertensos (SHR) e normotensos

(WKY) não-anestesiados

Nas figuras 13 A e B estão representados os valores em porcentagem de

delta (Δ) da PAM (mmHg) e FC (bpm) de ratos SHR e WKY tratados com α-

terpineol. Foi demonstrado que o efeito hipotensor induzido pelo monoterpeno foi

superior em animais hipertensos SHR em comparação com os animais normotensos

WKY, no entanto as respostas taquicárdicas e bradicárdicas não foram alteradas.

Observou-se, ainda, que o α-terpineol produziu respostas hipotensoras

superior sobre o efeito da PA sistólica em comparaç ão ao efeito observado com a

diastólica em animais hipertensos SHR. No entanto, os efeitos não foram diferentes

em animais normotensos WKY (Figura 14).

63

Figura 13: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (% de PAM,

mmHg) e (b) frequência cardíaca (% de FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) (n=10) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=9). Os valores foram expressos

como média e.p.m.

A

B C

64

Figura 14: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial sistólica em ratos

normotensos (WKY) (n=10) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=9). Os valores

foram expressos como média e.p.m.

A

B

65

5.2.3 Efeito do α-terpineol sobre o controle autonômico de ratos não-

anestesiados normotensos e hipertensos.

5.1.3.1 Avaliação do bloqueio com atropina na resposta do α-terpineol.

Observou-se que α-terpineol exibe ações sobre o controle autonômico,

passamos a investigar inicialmente sobre o bloqueio parassimpático com atropina (2

mg ⁄ kg; i.v.) e foi notado que a resposta hipotensiva induzida por α-terpineol ED50:

4.8 mg ⁄ kg; i.v. em ambos os animais hipertensos SHR (valor de ΔPAM antes da

atropina -627 mmHg, n=6 e depois ΔPAM= -619 mmHg e normotensos WKY

(valor de ΔPAM antes da atropina -515 mmHg e depois ΔPAM= -546 mmHg, n=6)

não foi alterada (Figure 15 A e B).

Em contraste as respostas induzidas pelo α-terpineol foram significantemente

reduzidas após o pré-tratamento com atropina. Verificou-se que a taquicardia foi

diminuída de maneira significativa nos animais SHR [ΔFC antes da atropina (Tempo

0)= 89±5 bpm versus ΔFC depois (Tempo 0)= 60±4 bpm] e normotensos WKY [ΔFC

antes da atropina (Tempo 0)= 65±11 bpm; ΔFC depois (Tempo 0)= 59±3 bpm]

(figura 15 C e D).

Associado a este efeito exercido pela atropina, foi observado que o efeito

bradicárdico secundário decorrente do tratamento com α-terpineol foi fortemente

reduzido, especialmente em animais hipertensos [SHR: ΔFC antes da atropina

(Tempo 3 min.) = -125±6 bpm, n=5; ΔFC depois (Tempo 3 min.)= -10±4 bpm, n=6;

em comparação com os animais WKY [ ΔFC antes da atropina (Tempo 3) min. -11±4

bpm, n=5; ΔFC depois (Tempo 3 min.) -2±2 bpm, n=6] (figura 15 C e D)

66

Figura 15: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg) e (b) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=6) antes e após o tratamento com atropina. Os valores

foram expressos como média e.p.m. * p < 0,05 em relação a ausência de tratamento (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

WKY SHR A B

C D

67

5.1.3.2 Avaliação da resposta ao tratamento intravenoso com α-terpineol após

o bloqueio simpático com atenolol ou hexametônio em ratos SHR ou WKY.

Nas figuras 16 e 17 estão representados os valores de delta (Δ) da PAM

(mmHg) e FC (bpm) de ratos SHR e WKY tratados com hexametônio ou atenolol. Foi

demonstrado que o bloqueio com hexametônio (30 mg ⁄ kg; i.v.) (Figura 16) ou

atenolol (20 mg ⁄ kg; i.v.) (Figura 17) não alterou a resposta hipotensiva induzida por

α-terpineol ED50: 4.8 mg ⁄ kg; i.v. em animais SHR ou WKY.

Isto foi observado nos valores de ΔPAM para SHR (valor de ΔPAM antes de

hexametônio= -656 mmHg e ΔPAM depois = -615 mmHg, n=6 ou para atenolol

ΔPAM antes = -643 mmHg e ΔPAM depois = -622 mmHg, n=6), bem como para

os animais WKY (valor de ΔPAM antes de hexametônio= -543 mmHg e ΔPAM

depois = -5110 mmHg, n=6 ou para atenolol ΔPAM antes= -535 mmHg, n=5 e

ΔPAM depois = -678 mmHg) (Figure 16 e 17 A e B).

Constatou-se que as respostas taquicádica e bradicárdica induzidas pelo α-

terpineol foram significantemente reduzidas quando os animais hipertensos ou WKY

foram tratados com hexametônio ou atenolol. Verificou-se que a taquicardia foi

diminuída de maneira significativa nos animais SHR tratados com hexametônio [ΔFC

antes de hexametônio (Tempo 0)= 88±4 bpm; ΔFC depois (Tempo 0) =5±1 bpm] ou

atenolol [ΔFC antes de atenolol (Tempo 0)= 77±6 bpm; ΔFC depois (Tempo 0)=

45±7 bpm], bem como a redução foi observada em animais WKY tratados com

hexametônio [ΔFC antes de hexametônio (Tempo 0)= 74±6 bpm; ΔFC depois

(Tempo 0) =0±0 bpm] ou atenolol [ΔFC antes de atenolol (Tempo 0)= 73±6 bpm;

ΔFC depois (Tempo 0)= 42±6 bpm].

De maneira semelhante, a resposta bradicárdica foi reduzida em animais SHR

[ΔFC antes de hexametônio (Tempo 3)= -120±34 bpm; ΔFC depois (Tempo 3)= -22±

10 bpm] ou atenolol [ΔFC antes de atenolol (Tempo 3)= -145±10 bpm; ΔFC depois

(Tempo 3)= -73 ± 22 bpm], bem como a redução foi observada em animais WKY

tratados com hexametônio [ΔFC antes de hexametônio (Tempo 3)= -10±3 bpm; ΔFC

depois (Tempo 3) =0±0 bpm] ou atenolol [ΔFC antes de atenolol (Tempo 3)= -26±7

bpm; ΔFC depois (Tempo 3)= -16±8 bpm].

68

Figura 16: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg) e (b) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=6) antes e após o tratamento com hexametônio. Os

valores foram expressos como média e.p.m. * p < 0,05 em relação a ausência de tratamento (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

WKY SHR A B

C D

69

Figura 17: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg) e (b) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=6). antes e após o tratamento com atenolol. Os valores


WKY SHR A B

C D

70

5.1.3.3 Efeito do α-terpineol após o bloqueio simpático periférico com prazosin em ratos SHR ou WKY.

A administração de prazosin (1 mg/kg, i.v), antagonista dos receptores α1,

não induziu alterações nas respostas hipotensoras induzidas pelo α-terpineol (ED50:

4.8 mg ⁄ kg; i.v.) em animais SHR ou WKY. Estes dados são apresentados nos

gráficos presentes na figura 15: Confirmados pelos valores em animais SHR [ΔPAM

antes= -677 e ΔPAM depois= -656 mmHg, n=6] e normotensos WKY [ΔPAM

antes= -594 mmHg, n=5 e ΔPAM depois = 569 mmHg] (Figura 18 A e B)

Associado a este efeito, prazosin não exerceu mudanças sobre os efeitos

taquicárdicos em animais hipertensos [SHR: ΔFC antes de prazosin (Tempo 0 min) =

77±6 bpm, n=5; ΔFC depois (Tempo 0 min.)= 85±7 bpm, n=5; em comparação com

os animais WKY [ ΔFC antes de prazosin (Tempo 0 min.)=73±3 bpm, n=5; ΔFC

depois (Tempo 0 min.)= 78±8 bpm, n=5]. De maneira semelhante, não alterou efeitos

os bradicárdicos tardios em SHR (Tempo 3 min.) = -143±10 bpm, n=5; ΔFC depois

(Tempo 3 min.)= -173±12 bpm, n=5; em comparação com os animais WKY [ ΔFC

antes da atropina (Tempo 3) min. -11±4 bpm, n=5; ΔFC depois (Tempo 3 min.) -36±3

-2±2 bpm, n=5] (Figura 18 C e D).

71

Figura 18: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg) e (b) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=5). antes e após o tratamento com prazosin. Os valores


SHR WKY A B

C D

72

5.1.4 Investigação da enzima sintase de óxido nítrico (NOS) no efeito

cardiovascular induzido por -terpineol em ratos hipertensos não-

anestesiados.

Realizaram-se os experimentos in vivo que procuravam verificar a

participação da enzima NOS. Constatou-se que a resposta hipotensiva induzida pelo

α-terpineol (4.8 mg ⁄ kg; i.v.) foi atenuada após o bloqueio agudo da NOS com L-

NAME (20 mg/Kg) em animais hipertensos SHR [ΔPAM antes de L-NAME= -675

mmHg, n=8 e ΔPAM depois SHR: -351 mmHg, n=7] e seus controles normotensos

[ΔPAM antes=-499 mmHg, n=5 e ΔPAM depois= -292 mmHg, n=7] (Figura 19 A e

B).

A frequência cardíaca também foi atenuada de maneira significativa após o

tratamento com α-terpineol na dose de 4.8 mg ⁄ kg; i.v. demonstrando a importância

da ativação da NOS para α-terpineol exercer seus efeitos sistêmicos (figura 16 C e

D) tanto em animais hipertensos [SHR: ΔFC antes de L-NAME (Tempo 0 min.) =

78±8 bpm, n=5; ΔFC depois (Tempo 0 min.)= 45±8 bpm, n=7]. O mesmo foi

observado para os animais WKY [ ΔFC antes de L-NAME (Tempo 0 min.)= 64±11

bpm, n=5; ΔFC depois (Tempo 0 min.)= 45±7 bpm, n=7].

A resposta bradicárdica após 3 minutos de administração deste monoterpeno

foi reduzida apenas em animais hipertensos [SHR: ΔFC antes de L-NAME (Tempo

3) = -163±21 bpm, n=7 ΔFC depois (Tempo 3) = -87±22 bpm, n=7]. O tratamento

com L-NAME não alterou os efeitos bradicárdicos induzidos por α-terpineol em WKY

[ ΔFC antes de L-NAME (Tempo 3) min. -33±4 bpm, n=7; ΔFC depois (Tempo 3

min.) -37±22 bpm, n=5] (figura 19 C e D).

73

Figura 19: Efeitos do α-terpineol sobre (a) a pressão arterial média (PAM, mmHg) e (b) frequência cardíaca (FC, bpm) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=7). antes e após o tratamento com L-NAME. Os valores


SHR WKY A B

C D

74

5.1.5 Avaliação do efeito da infusão intravenosa de α-terpineol sobre as

respostas cardiovasculares à estimulação do barorreflexo

Neste protocolo experimental, avaliamos a influência do α-terpineol (4.8

mg/kg, i.v.) sobre as respostas cardiovasculares desencadeadas pela estimulação

do barorreflexo, como mostrado na figura 20.

Os ratos SHR tratados apenas com veículo apresentaram uma redução do

ganho do barorreflexo quando comparados ao grupo WKY controle tratados com

veículo (−0.86±0.07 vs. −2.51±0.2 bpm mm Hg−1, p<0.05). Entretanto, a

administração aguda de α-terpineol (4.8 mg/Kg, i.v.) foi capaz de restaurar a

sensibilidade do barorreflexo em ratos hipertensos SHR (SHR (veículo) −0.86±0.07

vs. SHR (α-terpineol) −1.5±0.08 bpm mm Hg−1, p<0.05, n=4). Estes dados

demonstram ainda que o α-terpineol melhora o ganho do barorreflexo, no entanto,

sem alterar a sensibilidade do barorreflexo dos animais WKY quando tratado com α-

terpineol (−2.23±0.2 mm Hg−1, P >0.05, n=4) (Figura 20)

75

Figura 20: Efeitos do α-terpineol sobre a sensibilidade do barorreflexo (bpmmmHg-1) em ratos normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) não-anestesiados (n=4). Os

valores foram expressos como média e.p.m. *p< 0,05 em relação ao controle WKY, p< 0,05 entre os grupos SHR (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

76

5.2 ESTUDOS in vitro

5.2.1 Efeito do α-terpineol sobre as contrações induzidas por FEN em anéis de

artéria mesentérica superior isolada de ratos

A administração cumulativa de -terpineol (10-12 a 10-5M) induziu um

vasorrelaxamento dependente de concentração em anéis, pré-contraídos com FEN

(10 μM), com endotélio de artéria mesentérica superior de ratos hipertensos SHR

[Emáx = 53,7 ± 3, n=9] e seus controles normotensos WKY [Emáx = 60 4, n=9]. A

remoção do endotélio vascular inibiu a resposta vasorelaxante induzida pelo -

terpineol, com uma diminuição da porcentagem de relaxamento máximo (Emáx) em

ratos hipertensos [Emáx = 16,1 ± 3, p<0,05, n=8] e controles WKY [Emáx = 20,5 ± 1,

p<0,05, n=8] (figura 21; tabela 1).

Figura 21: -Terpineol induz relaxamento em anéis de artéria mesentérica de ratos

hipertensos SHR e controles WKY. Atividade vasorelaxante do -terpineol (10-12 a 10-5M) em anéis isolados de arteria mesentérica de rato SHR e WKY pré-contraídos

com fenilefrina. () Rato normotenso WKY com endotélio; () Rato normotenso WKY sem endotélio; () Rato hipertenso SHR com endotélio; () Rato hipertenso

SHR sem endotélio. Os resultados correspondem à média ± e.p.m. * p < 0,05; em

comparação aos respectivos controles (ANOVA de uma via e pós teste de Bonferroni).

77

5.2.2 Efeito do α-terpineol sobre o tônus intrínseco vascular de anéis

mesentéricos de ratos espontaneamente hipertensos e seus controles

normotensos.

A administração cumulativa de α-terpineol (10-12 - 10-5 M) não promoveu

efeito sobre o tônus muscular espontâneo em preparações de anéis com endotélio

funcional intacto ou sem endotélio em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e

seus controles normotensos (WKY).

A reversibilidade foi observada para assegurar que o α-terpineol não

ocasionou dano tecidual, demonstrado no registro original da ação do α-terpineol

sobre a artéria mesentérica (figura 22 A, B; figura 23).

Figura 22: Registro original da ação do α-terpineol (10-12 - 10-5 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato (A) SHR ou (B) WKY, com o endotélio intacto, no tônus basal. As setas indicam o momento da adição do α-terpineol.

A

B

78

Figura 23: Efeito do α-terpineol sobre o tônus basal de anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato. () Rato normotenso WKY com endotélio; () Rato normotenso WKY sem endotélio; () Rato hipertenso SHR com endotélio; () Rato hipertenso SHR sem endotélio. Os resultados correspondem à média ± e.p.m. (n=4).

79

5.2.3. Participação da via L-arginina/NO/ GMPc na resposta vasorelaxante

induzida pelo -terpineol em anéis de artéria mesentérica isolada de rato


As respostas vasorelaxantes induzidas por concentrações crescentes de α-

terpineol (10-12 – 10-5M) foram significativamente atenuadas com diminuição de suas

respostas máximas na presença de fenilefrina 10 μM após o pré-tratamento L-

NAME (100 μM), um antagonista competitivo da NOS, em animais WKY [Emáx = 18,1

± 3,8] ou SHR [Emáx = 20,1± 3, *p < 0,05, n=8] (figura 24, tabela 1)

Em sequência, as respostas induzidas pelo α-terpineol (10-12 – 10-5M) foram

abolidas anéis de artéria mesentérica com endotélio de animais hipertensos pré-

incubados com hidroxicobalamina 30 μM, seqüestrador de NO ou de ODQ (10 μM),

um inibidor seletivo da ciclase de guanilil solúvel, SHR [Emáx = 17,3 ± 3; 18,1 ± 3, *p

< 0,05, n=8, respectivamente]. Esta resposta vasorelaxante reduzida foi semelhante

ao observado em animais WKY [Emáx = 23,5 ± 7; 20,8 ± 1 *p < 0,05, n=8,

respectivamente] (figura 25, tabela 1).

Tabela 1 Porcentagem de inibição da resposta máxima e contração com FEN (10

μM) para estudos com anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

Condição experimental

% de Resposta máxima n

WKY SHR

Endotélio presente 60 4 53,7 ± 3 9

Sem endotélio 20,5 1* 16,1 ± 3* 8

L- NAME 100 M 18,1 ±3.8* 20,1± 3 * 8

Hidroxicobalamina 30 M 23,5 ± 7* 17,3 ± 3* 8

ODQ 10 M 20,8 ± 1* 18,1 ± 3* 8

Dados apresentados como médian ± e.p.m. *p < 0.05 quando comparados com preparações com endotélio presente.

80

Figura 24: α-Terpineol induz relaxamento vascular dependente do endotélio envolve a participação da enzima eNOS. Atividade vasorelaxante em anéis de artéria

mesentérica com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 M), na presença e na ausência de ()LNAME (100 μM) tratadas com α-terpineol (10-12 – 10-5M)

(n=8); (A) WKY e (B) SHR. * p <0,05

81

Figura 25: α-Terpineol promove efeito vasorelaxante via óxido nítrico/GMPc. Atividade vasorelaxante em anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional,

pré-contraídos com FEN (10 M), na presença e na ausência de ()HDX 30 μM (n = 8) ou ()ODQ 10 μM (n = 8) tratadas com α-terpineol (10-12 – 10-5M). (A) WKY e (B)

SHR. * p <0,05

82

5.2.4 Verificação da participação dos metabólitos da via da Ciclooxigenase ou

influência dos receptores muscarínicos (M3) sobre a resposta vasorelaxante


rato hipertenso SHR e normotenso WKY

O pré-tratamento com indomenetacina 10 μM, inibidor não seletivo da enzima

ciclooxigenase, em anéis de artéria mesentérica superior com endotélio intacto e

pré-contraídos com FEN (10 M) isolados de animais hipertensos [Emáx = 53,1 ± 4]

ou normotensos [Emáx =61,1 ± 5] não foi alterou o vasorrelaxamento induzido por

concentrações crescentes de -terpineol (10-12 – 10-5M).

Nos experimentos que investigaram a participação do endotélio e o

envolvimento dos receptores muscarínicos M3, na presença de atropina 1M,

antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos, os efeitos vasorelaxantes

produzidos pelo tratamento com -terpineol (10-12 – 10-5M) não foram alteradas

significativamente em anéis de artéria mesentérica superior de rato SHR [Emáx =41,5

± 2] ou WKY [Emáx =53,3 ± 8, *p < 0,05, n=8], respectivamente (Figura 26, Tabela 2).


(10μM) para estudos com anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

Condição experimental

% de Resposta máxima n

WKY SHR


Sem endotélio 20,5 1* 16,1 ± 3* 8

Indometacina 10 M 61,1 ± 5 53,1 ± 4 8

Atropina 1 M 53,3 ± 8 41,5 ± 2 8

Dados apresentados como médian ± e.p.m. *p < 0.05 quando comparados com preparações com endotélio presente.

83

Figura 26: Metabólitos da ciclooxigenase ou receptores muscarínicos não estão

envolvidos na resposta vasorelaxante induzida pelo de -terpineol. Concentrações

crescentes de -terpineol (10-12 – 10-5M) em anéis com endotélio funcional de artéria

mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10 M), na ausência

(n = 9) e na presença de indometacina 10 μM (n = 8) () ou atropina1 ηM (n = 8)

(),(A) WKY e (B) SHR; * p <0,05.

84

5.2.5 Participação dos canais de potássio responsáveis pelo fator

hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) no efeito vasorelaxante

induzido pelo α-terpineol em ratos SHR e WKY

Para a investigação sobre a participação do EDHF os anéis de artéria

mesentérica. Foram incubados em preparações de caribdotoxina mais apamina (0,2

μM). Observou-se que o relaxamento vascular induzido pelo -terpineol (10-12 – 10-5

M) foi alterado após incubação destes inibidores em animais SHR [Emáx = 29,5 ± 2]

ou WKY e [Emáx= 39,5 ± 3, *p < 0,05, n=8] respectivamente (figura 27, Tabela 3).

Figura 27: Caracterização da participação do EDHF no efeito vasorrelaxante induzido pelo α-terpineol (10-12 – 10-5M) em anéis com endotélio funcional de artéria

mesentérica superior isolada de rato SHR () e WKY, () pré-contraídos com FEN

(10 M), na ausência (n = 8) e na presença de caribdotoxina + apamina 0.2 μM (n = 6) [SHR () ou WKY ()]; * p <0,05.

85

5.2.6 Identificação dos canais de potássios envolvidos na resposta relaxante


rato hipertenso e normotenso

5.2.6.1 Participação dos canais de potássio na resposta vasorelaxante induzida

por -terpineol

Na investigação para identificar qual canal de K+ estaria envolvido nos efeitos

vasculares induzidos pelo -terpineol (10-12 – 10-5 M) foi observado que em

preparações na contendo alta concentração de potássio (KCl 20mM) ou na

presença de tetraetilamônio (TEA; bloqueador não seletivo de canais de potássio (1

mM) reduziu o efeito vasorelaxante induzido pelo monoterpeno tanto em animais

hipertensos [Emáx = 36,4± 6; 38,5± 4, *p < 0,05, n=6] quanto normotensos [Emáx= 23±

4; 37,5± 4, *p < 0,05, n=6], respectivamente (figura 28, tabela 3).

É importante salientar que não foram observadas alterações significantes na

contração dos anéis de artéria mesentérica em resposta à fenilefrina após a

incubação dos bloqueadores de canais de K+ utilizados.

86

Figura 28: Efeito inibitório dos bloqueadores de canais de potássio no relaxamento

vascular induzido pelo α-terpineol em SHR e WKY. O relaxamento produzido pelo α-

terpineol (10-12 – 10-5M) foi testado na ausência e presença de KCl 20mM (modulador do efluxo de potássio) () ou tetraetilamônio (TEA, bloqueador não seletivo de canais de potássio) ()em anéis com endotélio funcional de artéria mesentérica superior isolada de rato SHR (B) ou WKY (A), pré-contraídos com FEN

(10 M), * p < 0,05;.

87

5.2.6.2 Avaliação dos canais de potássio sensíveis a ATP (KATP) e dependentes

de voltagem (KV) em anéis de artéria mesentérica isolada de rato hipertenso e

normotenso tratados com -terpineol.

Em anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional na presença de 10

M de GLIB (um bloqueador dos canais KATP) ou na presença de 1 mM de 4-AP

(bloqueador dos canais Kv) foi observado que as curvas concentração-resposta para

-terpineol (10-12 – 10-5M) foram significantemente atenuadas Estes dados

apresentaram um deslocamento das curvas para a direita e diminuição de seus

efeitos máximos em animais SHR [Emáx = 24,2± 3; 42,5 ± 2, *p < 0,05, n=6] ou em

ratos normotensos WKY [Emáx= 33± 3; 38,7± 1, *p < 0,05, n=6] (figura 29, tabela 3).

Tabela 3 Porcentagem de inibição da resposta máxima e contração com FEN (10

μM) para estudos com anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

Condição experimental % de Resposta máxima N

WKY SHR


KCl 20mM 23± 4* 36,4± 6* 8

TEA 1mM 37,5± 4* 38,5± 4* 6

Caribdotoxina + apamina 0.2M 39,5 ± 3* 29,5 ± 2* 6

Glibenclamida 30 M 33± 3* 24,2± 3* 6

4 AP 1mM 38,7± 1* 42,5 ± 2* 6

Dados apresentados como médian ± e.p.m. *p < 0.05 quando comparados com preparações com endotélio presente TEA, Tetraetilamônio; 4-AP, 4-Aminopiridina.

88

Figura 29: Identificação dos canais de potássio que participam do relaxamento

vascular induzido pelo α-terpineol em SHR e WKY. O relaxamento produzido pelo α-

terpineol (10-12 – 10-5M) foi testado na ausência e presença de glibenclamida (10μM)

(bloqueador do KATP) () ou 4-aminopiridina (4-AP, bloqueador de KV) ()em anéis com endotélio funcional de artéria mesentérica superior isolada de rato SHR (B) ou

WKY (A), pré-contraídos com FEN (10 M), * p < 0,05;

89

5.4 ENSAIOS BIOQUÍMICOS

5.3.1 Determinação da produção do NO

5.3.1.1 Produção de óxido nítrico induzida por bradicinina e acetilcolina.

Neste experimento, uma cultura de linhagem imortalizada de células

endoteliais de aorta de coelho foi utilizada para investigar a produção de óxido

nítrico induzida por bradicinina 10-4M, acetilcolina 10-4M e 10-5M. Estes experimentos

foram utilizados como controle positivo das análises subsequentes.

Os valores de indução da produção de NO estão expressos em % de

fluorescência produzida pela reação para detecção de NO por DAF em células

endoteliais de aorta de coelho. Neste experimento foi observado que a acetilcolina e

bradicinina foram capazes de aumentar os níveis de NO (Figura 30).

90

A

B

Figura 30: Acetilcolina e bradicinina induzem aumento nos níveis de NO em cultura de células endoteliais de aorta de coelho. (A) Registro representativo da produção de NO induzida por bradicinina, acetilcolina (10-4 e 10-5 M) em cultura de células endoteliais de aorta de coelho (B) Gráfico representativo da produção de NO induzida por bradicinina, acetilcolina (10-4 and 10-5 M) em cultura de células endoteliais de aorta de coelho (n=3).

91

5.3.1.2 Quantificação dos níveis de NO em células endoteliais de aorta de

coelho induzida pelo α-terpineol

Nos experimentos que buscaram investigar os aumentos dos níveis de NO

utilizamos, inicialmente, células endoteliais de aorta de coelho e avaliamos em

condições controle de produção de NO em células endoteliais de aorta de coelho.

Realizamos experimentos na presença de acetilcolina 10-5M e diferentes

concentrações de -terpineol (10-6 M, 10-5 M, 10-4 M) foram quantificados por

fluorescência. A figura 31 A e B mostra o deslocamento da fluorescência após o

tratamento com acetilcolina e -terpineol em relação à população de células em

relação a unidades relativas de DAF-2 (Figura 31).

O gráfico apresentado na figura 32 representa os dados da produção de NO

determinado pela % em Δ da fluorescência de DAF detectada em células endoteliais

de aorta de coelho.

92

A

B

Figura 31: -Terpineol aumenta os níveis de NO em células endoteliais. (A) Registros representativos do aumento da intensidade de fluorescência de DAF-2 decorrente da produção de NO induzida por α-terpineol (10-6 ) ou ACh (10-5M e (B) por α-terpineol (10-6 e 10-4 M) em cultura de células endoteliais de aorta de coelho. (C) Gráfico representativo da produção de NO induzida por acetilcolina (10-5 M) ou α-terpineol (10-6 e10-4 M) em cultura de células endoteliais de aorta de coelho.

93

Figura 32: -Terpineol aumenta os níveis de NO em células endoteliais. Gráfico dos dados que expressam a produção de NO induzida por acetilcolina (10-5 M) ou α-terpineol (10-6 - 10-4 M) em cultura de células endoteliais de aorta de coelho (n=3).

94

5.3.1.3 Avaliação da influência da inibição da enzima NO sintase na produção

de óxido nítrico induzida pelo α-terpineol em células endoteliais de aorta de

coelho.

O -terpineol (10-6 M, 10-5 M, 10-4 M), incubado durante 30 minutos, foi capaz

de aumentar significativamente os níveis da produção de NO. Associado a este

efeito observamos que a presença do L-NAME (100 μM; inibidor da enzima eNOS)

foi capaz de reverter esta indução da produção de NO pelo -terpineol em cultura de

células endoteliais de aorta de coelho (Figura 34 A e B).

Na Figura 33 apresenta os dados representativos da intensidade de

fluorescência induzida pelo -terpineol (10-5 M) e o pré-tratamento com L-NAME.

Figura 33: A enzima eNOS está envolvida na produção de NO induzida pelo -Terpineol. Registros representativos do aumento da intensidade de fluorescência de DAF-2 decorrente da produção de NO induzida por α-terpineol (10-5 M) na presença

ou ausência de L-NAME (100 μM) em cultura de células endoteliais de aorta de

coelho.

95

A

B

Figura 34: A enzima eNOS está envolvida na produção de NO induzida pelo -Terpineol. (A e B) Gráficos da produção de NO em cultura de células endoteliais de aorta de coelho tratados por α-terpineol (10-5 M) ou L-NAME + α-terpineol em diferentes concentrações (n=3).

96

5.3.2 Análise por western blot

5.3.2.1 Efeito da insulina na fosforilação da eNOS (Ser 1177) e AKT (Ser 473)

Em nossos experimentos, com células endoteliais de artéria coronária de

porco, utilizou-se a insulina como controle positivo das fosforilação para eNOS e

AKT. Inicialmente, foi observado que a insulina induziu um forte aumento nos

primeiros 5 minutos da fosforilação da eNOS em Ser1177 quando comparado com o

controle. Adicional a estes dados foi observado o aumento da intensidade de

fosforilação em 30 minutos que se manteve durante o tempo avaliado de 180 min

(Figura 35)

Na sequência de experimentos, a exposição das células endoteliais a insulina

produziu fosforilação da eNOS e da AKT (ser 473) de maneira concentração

dependente (10-8 M, 3x10-8, 10-7, 3x10-7, 10-6), onde foram observadas maiores

níveis de fosforilações para as células que foram tratadas com as concentrações de

insulina de 10-6 M e 3x 10-7 M durante 30 minutos (Figura 35)

Figure 35. Análises representativas do efeito da insulina em cultura primária de células endoteliais de coronária de porco. Insulina causou fosforilação da eNOS em Ser 1177 dependente do tempo (A) e fosforilação da eNOS em Ser 1177 e AKT Ser 473 dependente da dose.

97

5.3.2.2 Efeito do tratamento com α-terpineol sobre a fosforilação da eNOS em

Ser 1177 de células endoteliais de artéria coronária de porco

A exposição das células endoteliais ao α-terpineol nas concentrações iniciais

de 10-4 M e 3x10-4 M causou a fosforilação intensa da eNOS desde os primeiros

minutos de exposição ao monoterpeno (Figura 36) Estes níveis de fosforilação

aumentaram de acordo com o tempo e se mantiveram estáveis durante os 60

minutos subseqüentes. Avaliamos como controle a expressão da eNOS total.

Figura 36: α-terpineol induz fosforilação da eNOS. (A) Análises representativas do

efeito de α-terpineol (10-4M e 3x10-4M) em cultura primária de células endoteliais de

coronária de porco. α-terpineol induz fosforilação da eNOS em Ser1177 e não altera

a eNOS total. Os resultados são mostrados como a média ± e.p.m. de 3 experimentos. * p < 0,05 em relação ao controle representado pelo tempo ―0‖ (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni).

A

B C

98

5.3.2.3 Efeito sobre a fosforilação da AKT em Ser 473 de células endoteliais de

artéria coronária de porco induzida pelo α-terpineol.

Para melhor compreender a via de sinalização endotelial envolvida na

produção do NO e ativação da enzima eNOS em resposta ao α-terpineol, os níveis

de fosforilação das proteínas AKT (Ser 473) e eNOS (Ser 1177) foram investigados

em cultura de células endoteliais de artéria coronária de porco após tratamentos

com α-terpineol (10-4 M) em diferentes períodos de tempo (Figura 37). Constatou-se

que α-terpineol induz fosforilação da enzima eNOS e AKT e estes níveis de

fosforilação aumentaram de acordo com o tempo e se mantiveram estáveis durante

os 30 min. de tratamento.

Figura 37: α-terpineol induz rápida fosforilação da Akt em Ser473 e da eNOS a

Ser1177 em cultura de células endoteliais de coronária de porco. (A) imunoblots representativos; (B) e (C) mostram a análise densitométrica das bandas para p-Akt e

p-eNOS nos diferentes tempos de exposição para a concentração de 10-4 M do α-

terpineol. Os resultados são mostrados como a média ± e.p.m. de 3 a 4 experimentos. * p < 0,05 em relação ao controle representado pelo tempo ―0‖ (ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni).

B

A

C

99

5.3.2.4 Efeito dependente da concentração do α-terpineol na fosforilação da

AKT e da eNOS em células endoteliais de artéria coronária de porco

α-Terpineol (10-6M, 10-5M, 3x10-5M 10-4M) induziu o aumento da fosforilação

das proteínas AKT em Ser473 e da eNOS em Ser1177 em cultura de células

endoteliais da artéria coronária de porco dependente da concentração em relação ao

controle não tratado (Figura 38). Para estes experimentos utilizamos a insulina (10-6

M) como controle positivo.

Os níveis de fosforilação da AKT foram maiores nas células tratadas com as

concentrações de 3x10-5 M, 10-4 M (Figura 38 B). Esta tendência também foi

observada quanto aos níveis de fosforilação da eNOS, nos quais observou-se um

aumento na fosforilação nas concentrações de 3x10-5 M, 10-4 M (Figura 38)

A

Figura 38: α-terpineol induz fosforilação da Akt em Ser473 e da eNOS em Ser1177

dependente da concentração em cultura de células endoteliais de coronária de porco. (A) imunoblots representativos; (B) e (C) mostram a análise densitométrica das bandas para p-Akt e p-eNOS nos diferentes tratamentos com insulina (10-6 M) e

α-terpineol (10-6 M - 10-4 M). Os resultados são mostrados como a média ± e.p.m. de

3 experimentos. * ou # p < 0,05 em relação ao controle representado pelo tempo ―0‖ (ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni).

B C

100

5.3.2.5 Efeito do α-terpineol em células endoteliais de artéria coronária de

porco em induzir a fosforilação da AMPK (Tyr 172)

Os níveis de fosforilação da AMPK (Tyr 172) foram fortemente aumentados

pelo tratamento das células endoteliais com o α-terpineol (10-4 M e 3x10-4 M),

durante os primeiros 15 minutos (Figura 39). No entanto os níveis de fosforilação

retornaram os níveis basais nos próximos 30 minutos e demais períodos de tempo

observados.

Figura 39: α-terpineol induz fosforilação da AMPK em Tyr 172 em cultura de células

endoteliais de coronária de porco. (A) imunoblots representativos; (B) e (C) mostram

a análise densitométrica das bandas para p-AMPKα nas concentrações de 10-4 M e

3x 10-4 M de α-terpineol. (Os resultados são mostrados como a média ± e.p.m. * p <

0,05 em relação ao controle representado pelo tempo ―0‖ (ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni).

A

B C

101

5.3.3 Quantificação dos níveis de NO em células endoteliais de artéria

coronária de porco.

Nossos dados anteriores determinaram que a exposição do α-terpineol a uma

linhagem de células endoteliais de aorta de coelho produziu um aumento da

produção de NO. Para melhor caracterizar a via de sinalização endotelial envolvida

na produção do NO e fosforilação da eNOS, AKT e AMPK em resposta ao α-

terpineol, foram investigados os níveis de produção de NO induzidos pelo α-terpineol

em cultura primária de células endoteliais de artéria coronária de porco. E

observamos que a exposição ao α-terpineol induz aumento da formação de NO, por

aumento da intensidade de fluorescência do DAF-2, analisados por citometria. Este

efeito estimulatório foi reduzido quando as células endoteliais foram pré-tratadas

com o L-NA, um inibidor da eNOS. A produção induzida pela bradicinina foi usada

como controle positivo da produção de NO (Figura 40).

102

Figura 40: Imagens com fluorescência de DAF-2 obtidas nas imagens das culturas

de células endoteliais tratadas com α-terpineol (10-4 M ) ou L-NA (100 μM) + α-

terpineol 10-4 M). As barras correspondem à média ± e.p.m das porcentagens determinadas pela análise de pixels nas imagens escaneadas pelo citomêtro das células endoteliais (n = 3). A bradicinina (10-4 M) foi usada como controle positivo. * p< 0,05 (ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni).

A

B

103

Discussão

104

6. DISCUSSÃO

A presente tese permite observar em destaque as ações cardiovasculares do

-terpineol em animais hipertensos, caracterizando a farmacodinâmica destes

efeitos. Tendo em conta os resultados parcelares incluídos na tese, estas

considerações deter-se-ão sobre os aspectos referentes ao conjunto de dados no

que diz respeito à: (a) Utilização de modelos experimentais de hipertensão e

controles normotensos in vivo e in vitro e (b) Abordagens bioquímicas para clarificar

os mecanismos moleculares envolvidos.

Em estudos iniciais desenvolvidos pelo nosso grupo (RIBEIRO, 2008)

evidenciamos que o -terpineol produziu efeito hipotensor, associado à diminuição

da resistência vascular dependente do endotélio, caracterizados pelo envolvimento

da via de sinalização L-arginina/ eNOS/ ciclase de guanilil solúvel em animais

normotensos experimentais in vivo. Nesta ordem de investigação, para melhor

compreender as ações cardiovasculares, os efeitos deste monoterpeno foram

avaliados em um modelo experimental de hipertensão espontânea (SHR). Desta

forma, foi observado que α-terpineol induziu uma hipotensão em animais hipertensos

dependente da participação da enzima NOS e produziu melhora na sensibilidade do

barorreflexo, provavelmente decorrente da melhora da função endotelial.

Diante da evidência do -terpineol exercer um efeito protetor sobre o sistema

cardiovascular foram avaliados os efeitos vasculares em modelos de animais

hipertensos e em cultivo de células endoteliais. Notou-se que o -terpineol produziu

um efeito vasorelaxante em animais hipertensos de maneira semelhante aos seus

controles normotensos, envolvendo mecanismos endoteliais de sinalização, como a

participação da via L-arginina/ NO/ GMPc. Em continuidade, foi demonstrado que -

terpineol induziu aumento dos níveis celulares de NO em células endoteliais. Ao

desvendar o mecanismo de sinalização deste monoterpeno em ativar células

endoteliais e estimular a formação de NO, um maior fator vasoprotetor, estes dados

indicaram que o -terpineol induziu a ativação das vias upstreams como a PI3K/AKT

e AMPK que exerceram um papel chave na ativação induzida por fosforilação da

enzima eNOS. Adicionalmente, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram

outros mecanismos endoteliais envolvidos no relaxamento produzido pelo -

105

terpineol, associada à participação da via do NO, entre eles, a ativação do EDHF e

canais de potássio do músculo liso vascular.

Inicialmente, neste trabalho, foi evidenciado que a administração aguda de -

terpineol produziu uma hipotensão em animais WKY com livre movimentação (figura

11 A). Estes dados corroboram os resultados anteriormente obtidos no nosso grupo,

onde foi demonstrado que o -terpineol produziu hipotensão associada à taquicardia

e este evento foi sugerido envolver a via NO/ GMPc (RIBEIRO 2008). É importante

salientar que o α-terpineol apresenta baixa toxicidade, com uma DL50 de 4.300

mg/kg do peso corporal, quando administrado em ratos por via oral (JENNER et al.,

1964).

Estudos descreveram que a produção insuficiente de NO contribui para a

disfunção endotelial e alterações vasculares envolvidas na hipertensão(FÉLÉTOU;

KÖHLER; VANHOUTTE, 2011). Desta forma, investigou-se a capacidade do -

terpineol em contribuir com efeitos benéficos para melhora da hipertensão. Não é do

nosso conhecimento estudos com o -terpineol em modelos de hipertensão, além

dos descritos nesse trabalho de tese.

Animais SHR compreendem em um modelo experimental de hipertensão

arterial que se assemelha à hipertensão essencial humana, portanto, é amplamente

utilizado em estudos experimentais. Utilizamos animais não-anestesiados nos

experimentos para medida direta da pressão arterial (PA), uma vez que a anestesia

modifica o funcionamento dos principais sistemas de regulação da pressão arterial,

tais como o sistema renina-angiotensina, o sistema nervoso simpático e o

barorreflexo, produz depressão de algumas sinapses do sistema nervoso central,

alterando as respostas autonômicas, além de outros efeitos sobre os sistemas

básicos de controle fisiológico da pressão arterial (DORWARD et al., 1985;

FLUCKIGER et al., 1985).

Os dados demonstraram que de forma peculiar, -terpineol produziu a

diminuição da pressão arterial média dependente da dose, em animais hipertensos,

associado à taquicardia e bradicardia (Figura 11 B, D; Figura 12). Observou-se,

ainda, que -terpineol produziu efeito hipotensor superior em animais SHR em

comparação aos animais normotensos WKY, sem alterar as respostas taquicárdicas

e bradicárdicas (Figura 13 e Figura 14).

106

Para examinar a origem da hipotensão inicial, ocasionada pelo -terpineol, que

ocorre concomitantemente com uma taquicardia inicial e seguida de uma bradicardia

em animais hipertensos. Os experimentos foram focados, inicialmente, na

diminuição na pressão arterial (PA) resultante da inibição tônica vagal da freqüência

cardíaca, do débito cardíaco e do sistema nervoso simpático (SNS) do coração e da

vasculatura. Assim, o tratamento com inibidores poderia impedir as mudanças na

transição do sistema nervoso autônomo e das atividades que ocorrem durante o

curso da hipertensão. Em um grupo separado dos animais SHR e WKY, os animais

foram tratados com atropina e foi observado que as respostas hipotensora -

terpineol ED50 4,8 mg / kg, (i.v.) permaneceram inalteradas, no entanto, a resposta

bradicárdica secundária foi abolida, sugerindo a participação da ativação secundária

do barorreflexo no efeito hipotensor induzido pelo -terpineol (Figura 15). Estes

dados apresentam semelhança a outros estudos com respostas bifásicas exercidas

por compostos com ações cardiovasculares (INTERAMINENSE et al., 2011).

Em continuidade, avaliou-se o papel do sistema nervoso autônomo no efeito

cardiovascular do α-terpineol em animais hipertensos. Foi observado que os

inibidores como atenolol e hexametônio foram capazes de alterar a resposta do

monoterpeno sobre a bradicardia mediada pelo barorreflexo em SHR e WKY. No

entanto, a hipotensão não foi alterada (Figura 16 e 17). Este resultado foi esperado,

uma vez que, o bloqueio autonômico cardíaco não altera o efeito que diminui a PA.

Portanto, sugere que a bradicardia secundária é reflexa a ação da ativação dos

barorreceptores durante o rápido aumento da PA, observado na taquicardia inicial

decorrente do -terpineol. Esta atividade bradicárdica é normalmente mediada pelo

sistema nervoso parassimpático em ratos conscientes. A segunda constatação

importante do estudo é que as respostas hipotensoras ao -terpineol também

permaneceram inalterados após o tratamento com prazosin, um -1-adrenoceptor

seletivo antagonista, em ratos SHR e WKY (Figura 18).

A homeostase cardiovascular é controlada e coordenada por uma interação

contínua de mecanismos neurais e humorais. Os fatores vasculares são capazes de

diminuir a pressão arterial por promover a formação de fatores relaxantes derivados

do endotélio, como o NO com participação da via L-arginina- NO- GMPc. Diante

destas projeções, demonstramos através do bloqueio farmacológico da enzima NOS

(L-NAME), que os efeitos hipotensores em SHR e WKY induzidos pelo -terpineol

107

envolvem a ativação da enzima eNOS e conversão da L-arginina em NO (Figura 19).

No entanto, a utilização do L-NAME não produziu alterações sobre a bradicardia

secundária exercida 3 minutos após o tratamento com o monoterpeno, indicando

que o efeito é, em parte, devido a uma vasodilatação periférica e envolve a NOS no

vaso.

Portanto, neste estudo, demonstramos pela primeira vez as ações

cardiovasculares do tratamento intravenoso do -terpineol em animais hipertensos,

o qual produziu hipotensão envolvendo a participação da enzima NOS em animais

hipertensos. De maneira semelhante, as nossas evidências anteriores relacionadas

com os efeitos cardiovasculares do α-terpineol, em animais normotensos, nos

direcionam ao mecanismo relacionado à participação de óxido nítrico vascular

(RIBEIRO, 2008).

Os dados obtidos com o -terpineol disponíveis até o momento sugerem que

este monoterpeno exerce uma influência sobre mecanismos neuro-humorais de

controle da PA. Considerando que mudanças subsequentes na pressão arterial são

mediadas pelo sistema nervoso autônomo e a desregulação autonômica tem sido

reconhecida como um importante fator de alteração cardiovascular, com diminuição

na sensibilidade do barorreflexo cardíaco e alteração do balanço simpático-

parassimpático. Em sequência, a hipótese do α-terpineol em exercer influências

sobre a melhora do ganho no sistema barorreflexo foi avaliada.

Estudos anteriores evidenciaram que SHR com 13 semanas de idade já

apresentam reflexo barorreceptor prejudicado, no que diz respeito ao componente

parassimpático quando comparados com ratos controle normotensos (WKY)

(CORDELLINI et. al., 2006). Deste modo, para conhecer os efeitos antes ou depois

do pré-tratamento com -terpineol sobre a função barorreflexa, foi avaliado a

sensibilidade do barorreflexo em animais SHR e WKY acima de 13 semanas. E os

dados obtidos nos permitem afirmar que o -terpineol foi capaz de aumentar a

sensibilidade do barorreflexo (Figura 20) e este efeito pode ser atribuído,

possivelmente, por melhora da função endotelial.

A hipótese da interação entre NO e sistema nervoso simpático em regular

pressão sanguínea normal não pode ser descartada. Além disso, recentemente foi

relatado que a interação entre NO e o reflexo de baroreceptores exerce papel no

108

controle à longo prazo da pressão sanguínea (RAJAPAKSE; MATTSON, 2009).

Várias questões têm relacionado os mecanismos que envolvem a modulação da

frequência cardíaca com o NO, em particular interações existentes entre a via do NO

e do sistema nervoso autônomo (CHOWDHARY; TOWNEND, 1999,

CHARKOUDIAN; RABBITTS 2009).

Para melhor compreender a natureza do efeito hipotensor observado nos

experimentos in vivo com animais hipertensos, foram investigadas as atividades do

·α-terpineol utilizando o modelo experimental in vitro de artéria mesentérica superior

isolada rato, baseadondo-se em relatos de influências do componente vascular e o

papel importante na manutenção da PA. Os vasos de artéria mesentérica foram

utilizados uma vez que apresentam maior resistência à passagem do fluxo e são

amplamente implicadas na regulação do débito sanguíneo e da pressão capilar,

refletindo, desta forma, as variações da resistência periférica global (FOLKOW,

1982; AALKJAER, et. al., 1987). Inicialmente observou-se que o -terpineol não

exerce qualquer alteração sobre o tônus basal (Figura 22 e 23).

O endotélio vascular apresenta papel importante no controle do tônus vascular

e da pressão arterial através da liberação de substâncias vasoativas que agem

diretamente em células do músculo liso vascular, causando contração ou

relaxamento (SERBAN et. al. 2010). Várias substâncias derivadas do endotélio

podem causar relaxamento do músculo liso isolado: óxido nítrico (NO), prostaciclinas

(PGI2), e ácidos epoxieicosatrienóicos (FLEMING, 2010; FÉLÉTOU; VANHOUTTE,

2010). Assim, estudos que introduzem novas substâncias capazes de relaxar

artérias através do estímulo da liberação do NO endotelial têm sido relatados.

(LUCIANO et. al. 2011, SCHINI-KERT et. al., 2010).

Magalhães (2008) explanou que constituintes de óleos essenciais foram

capazes de diminuir a resistência vascular, em leito mesentérico, demonstrando a

característica de efeitos promissores desses constituintes no sistema cardiovascular.

Em nossos estudos anteriores, constatou-se que o -terpineol induziu um

relaxamento em animais normotensos, dependente do endotélio vascular e este

efeito foi mediado pela via NO/GMPc (RIBEIRO, 2008).

Na hipertensão vários modelos experimentais apresentam diminuições do

relaxamento em resposta a acetilcolina. (VANHOUTTE, 2011, FÉLÉTOU;

109

VANHOUTTE, 2010). Os mecanismos implicados nestes efeitos envolvem, em maior

parte, a inativação e desacoplamento da enzima eNOS, diminuição da

disponibilidade de NO e de outros fatores relaxantes derivados do endotélio e ainda,

o aumento da produção de ROS (FÖRSTERMANN; SESSA, 2011; FLEMING, 2010).

Dessa forma, estudos demonstram que diferentes compostos podem exercer

proteção vascular na hipertensão através de duas formas: (a) por meio da ação

direta nas células endoteliais, resultando no aumento da atividade da eNOS e/ou da

síntese e liberação do NO e EDHF (SCHINI-KERTH 2010; RAMLI, et. al. 2011), ou

(b) devido à habilidade desses compostos de prevenir a oxidação do NO,

aumentando a sua biodisponibilidade e diminuindo a produção de ROS

(TOMASONI, et. al. 2010; WALLACE, 2011)

Desta forma, foram avaliados os mecanismos de sinalização celular em que o

-terpineol poderia produzir um efeito vasoprotetor em um modelo experimental para

hipertensão. Nesta perspectiva, foi desenvolvido um estudo para avaliar o efeito

vasorelaxante do -terpineol em artéria mesentérica superior de rato SHR. Neste

vaso, o -terpineol causou o relaxamento dos anéis com endotélio vascular, de

forma dependente da concentração em animais hipertensos e seus controles

normotensos (Figura 21) e este efeito foi inibido na presença do L-NAME (inibidor

das NOS) (Figura 24 A e B). Estes resultados demonstram a participação NO no

mecanismo vasorelaxante do monoterpeno em vasos de resistência e corroboram

com os efeitos observados em ratos Wistar albinos normotensos (RIBEIRO, 2008).

A contínua produção de NO pelo endotélio vascular é crucial para regulação da

pressão arterial e regulação do fluxo sanguíneo foi utilizada a hidroxocobalamina (30

μM) para confirmarmos que NO, induzido pelo α-terpineol, seria o mediador

responsável pela resposta vasorelaxante em SHR, dependente de endotélio (Figura

25 A e B). A hidroxicobalamina, um seqüestrador do NO, apresenta a cobalamina

oxidada (Cb (III)) em sua estrutura, que captura o NO assim que ele sai da célula

endotelial formando um complexo Cb(III)–NO (KRUSZYNA et al., 1998). Desse

modo a resposta em anéis de artéria mesentérica de rato hipertenso e normotenso

com endotélio foi atenuada, sugerindo que o NO uma vez produzido poderá interagir

com sítios de ação na célula muscular lisa vascular.

Diferentes trabalhos têm demonstrado que o NO produz seus efeitos por via

dependente de GMPc, através da um mecanismo mediado por proteínas cinases

110

dependentes de GMPc (PKG) (STASCH; HOBBS, 2009). A PKG promove

fosforilações que levam a ativação da bomba de Ca2+ no retículo sarcoplasmático

(SERCA); aceleração da recaptação de Ca2+ para os estoques intracelulares;

abertura dos canais para K+ na membrana plasmática hiperpolarizando as células

musculares lisa; fechamento dos canais para Ca2+; ativação do trocador Na+/Ca2+.

Todos estes eventos levam a uma redução concentração de cálcio intracelular. Além

disso, a PKG promove fosforilação da cinase da cadeia leve da miosina (MLCK),

inativando-a, e estes eventos em conjunto promovem o vasorrelaxamento,

diminuindo assim a resistência vascular periférica (VANHOUTTE; BOULANGER,

1995; IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER, 2003; HILGERS; WEBB, 2005, TODA,

2011). Assim, o pré-tratamento com ODQ, inibidor da ciclase de guanilil solúvel,

reduziu a resposta relaxante induzida por concentrações crescentes de -terpineol

em anéis de artéria mesentérica de rato SHR e WKY (Figura 25 A e B), indicando a

participação da via NO-GMPc.

Para confirmar se o NO seria o mediador responsável pela resposta relaxante

do -terpineol, dependente de endotélio vascular, realizamos experimentos em

linhagem de células endoteliais de aorta de coelho. Estes dados demonstraram a

capacidade da célula endotelial de aumentar os níveis de produção de NO em

condições tratadas com acetilcolina e bradicinina (Figura 30). Foi observado que, na

presença da bradicinina a produção de NO é superior a indução de NO promovida

pelas diferentes concentrações de acetilcolina. Estes dados corroboram dados na

literatura que demonstram maior expressão de receptores para bradicinina em

relação à de acetilcolina, demonstrado no efeito de indução da produção de óxido

nítrico (WOODLEY,et al. 1994; WANG et al.,1995). De maneira semelhante, o

tratamento com o -terpineol induziu aumento dos níveis de NO e esta indução foi

prevenida pelo tratamento com L-NAME, confirmando a participação da eNOS

(Figura 31 A e B; Figura 32; 33; 34 A e B).

Como já referido, a ativação da NOS ocorre com a ligação da calmodulina

ligada ao Ca2+ ou dependente da adição de um fosfato no resíduo de Ser 1177 em

seu sítio de ligação (FLEMING; 2010). Estudos demonstram existir diferenças

temporais na relação entre a indução do aumento da concentração de Ca2+

intracelular em células endoteliais e ativação de NOS, além das mudanças nos

níveis intracelulares de Ca2+ (PRESTA et al., 1997), vários mecanismos para regular

111

atividade de NOS foram propostos, incluindo a interação da NOS com proteínas

(entre elas a Hsp90 e caveolina-1), fosfolipídios de membrana, fosforilação com

participação de proteínas cinases, como também alterações no pH fisiológico

(PRITCHARD 2001; KIM, 2005; RATH 2009; FLEMING et al., 2010).

Nesse sentido, foram realizados estudos adicionais, em cultura primária de

células endoteliais de artérias coronárias de porco, para confirmar se o -terpineol

estaria relacionado com a ativação direta da NOS. Para isso, foi utilizada uma

metodologia que identifica a atividade da eNOS, de acordo com o nível de

fosforilação presente. A fosforilação da eNOS no resíduo de Ser1177 é

característica de ativações dependentes de proteínas cinases.

Em células endoteliais a insulina produz ativação da eNOS devido a

fosforilação do resíduo de Ser 1177 e este evento é dependente da ativação da AKT

(FULTON et al. 1999). Verificou-se que após o tratamento com a insulina a eNOS

apresentou um aumento da fosforilação dependente de tempo e concentração em

Ser1177 em cultura primária de células endoteliais de coronária de porco (Figura

35). Este mecanismo foi descrito para ativações decorrentes também de outros

receptores tirosina cinase (GONZÁLEZ-SÁNCHEZ; SERRANO-RÍOS 2007).

O tratamento das células endoteliais de artéria coronária de porco com -

terpineol produziram fosforilação da eNOS no resíduo de Ser 1177. Este efeito foi

observado pela fosforilação aumentada nas diferentes condições experimentais,

dependente do tempo de tratamento e concentração, resultado semelhante ao

encontrado na indução pela insulina (Figura 36 e 38). O -terpineol induziu uma

ativação persistente da via da eNOS mesmo após um curto período de tratamento (5

minutos) em células endoteliais de artéria coronária. Este dado foi semelhante aos

observados com o relaxamento de anéis de artéria mesentérica, em que o período

de tratamento foi de 2-5 min.

Dado a redundância que é inerente em sistemas fisiológicos, e a importância

crítica da fosforilação da eNOS em Ser1177 para produção de NO, não é

surpreendente que diferentes proteínas cinases estejam envolvidas nesta ativação

em resposta a estímulos, como a força de cisalhamento e fator de crescimento

endotelial vascular (NAKAGAWA; JOHNSON, 2011). A participação da proteína

cinase B (AKT) dependente da ativação da PI3-cinase foi investigada após o

112

tratamento com o -terpineol em conduzir à fosforilação em Ser1177 da eNOS. De

tal modo, foi mostrado que o -terpineol induziu a ativação da via PI3-cinase/AKT

em células endoteliais e este efeito foi dependente de concentração e apresentou

intensidade de fosforilação máxima em 30 minutos (Figuras 37 e 38). Este evento

sugere que a fosforilação da eNOS em Ser1177 (um sítio ativador) é secundária a

ativação da AKT. Estes dados são semelhantes ao encontrados na literatura ao que

concerne a ativação da eNOS decorrente do tratamento com diferentes produtos

naturais (LORENZ et. al. 2004; EDIRISINGHE et. al. 2008; ANSELM et. al, 2009).

Dentre as proteínas cinases envolvidas na ativação da eNOS, foi relatado que

a via de sinalização dependente da proteína cinase AMPK foi descrita fosforilar

resíduos de Ser1177 em diferentes modelos animais (LEVINE; LI; MICHEL, 2007;

FISSLTHALER 2007; 2009). O aumento da fosforilação da porção AMPKα (Thr 172)

foi observado em células endoteliais, após o tratamento com o -terpineol,

principalmente no tempo inicial de 15 minutos (Figura 39). Semelhante a esta

ativação, a AMPK é dependente de alterações do metabolismo celular e estímulos

como a força de cisalhamento e uma relação de elevada de AMP para ATP (SESSA

et al., 1992; ZHANG et. al., 2009). Esta fosforilação induzida pelo monoterpeno

indica que esta sinalização dependente de proteínas cinases é um importante

regulador upstream da p-eNOS Ser1177.

A sinalização induzida pelo -terpineol, via ativação das redes de interações

celular da AKT e AMPK (como mostrado no estudo presente), poderia evitar falhas

específicas na sinalização de fosforilação da eNOS em Ser1177 e aumentar a

biodisponibilidade de NO. Dessa forma, nós avaliamos as ações do -terpineol

sobre a indução da produção de NO, durante o sinal de transdução que induz a

fosforilação e consequente ativação da eNOS, em células endoteliais de artéria

coronária de porco. A meia vida do NO é muito curta, portanto, foi utilizado uma

metodologia associada à citometria com sensível detecção para o NO, a sonda

fluorescente DAF-2DA. Nós observamos que o -terpineol induz o aumento da

intensidade de fluorescência, caracterizando o aumento dos níveis de NO nesse tipo

celular e prevenida após o pré-tratamento com L-NAME (Figura 40), o que corrobora

os dados anteriores obtidos em linhagem de célula endoteliais de aorta de coelho.

Além do NO, o endotélio vascular produz um fator relaxante que produz

hiperpolarização no músculo liso vascular, que age independentemente da via do

113

NO e das prostaciclinas. Dentre os bloqueadores, o uso de apamina concomitante

com caribdotoxina demonstrou bloquear respostas produzidas por fatores

hiperpolarizantes derivados do endotélio (EDHF) (BUSSE et al., 2003, FELETOU;

VANHOUTTE 2010). Neste trabalho o relaxamento induzido pelo -terpineol foi

afetado pela associação de caribdotoxina + apamina, ambos bloqueadores de

canais KCa, envolvidos no mecanismo de ação vasorrelaxante do EDHF em vasos de

resistência de animais hipertensos (Figura 27).

Estudos foram propostos onde o NO, via GMPc, pode ativar vários tipos de

canais de potássio presentes na membrana plasmática do músculo liso vascular

(COLEMAN et al., 2004). Essa ativação poderia ser realizada também por uma via

independente da ativação de ciclase de guanilil solúvel, levando à hiperpolarização e

relaxamento das células musculares lisas (BOLOTINA et al., 1994). Para

evidenciarmos a participação de canais de potássio no vasorrelaxamento induzido

pelo α-terpineol, realizamos experimentos na presença de diferentes inibidores

destes canais.

Quatro classes diferentes de canais para K+ são expressas células de músculo

liso vascular. Estes incluem canais para K+ retificadores internos (KIR), canais para

K+ sensíveis a ATP (KATP), canais para K+ ativados pelo Ca2+ (KCa), e canais para K+

ativados por voltagem (KV) (IUPHAR 2002; HADDY et al., 2006).

Segundo a literatura, os abridores de canal de K+ são eficazes em inibir a

contração da musculatura lisa vascular em condições de aumento moderado da

concentração externa de potássio (< 40 mM) enquanto que, em níveis maiores de K+

externo são desprovidos deste efeito (NELSON, 1995). Uma vez que em altas

concentrações de K+, o potencial de membrana da célula muscular lisa está muito

próximo do potencial de equilíbrio do K+, onde o fluxo resultante de K+ e

hiperpolarização são evitados (NELSON, 1995). Em condições experimentais, em

anéis de artéria mesentérica de ratos hipertensos, foi observado que a presença 20

mM de KCl atenuou significantemente a resposta vasorelaxante induzida pelo -

terpineol em relação ao controle, de maneira similar este efeito foi reduzido na

presença de tetraetilamônio um inibidor de canais de potássio quando usado a altas

concentrações (> 1mM) em menores concentrações estas drogas são seletivas para

canais BKCa (BRAYDEN; NELSON, 1992). Sugerindo a participação dos canais para

K+ na indução neste vasorrelaxamento (figura 28).

114

Farouque (2003) demonstrou a interação entre canais para KATP e os fatores

vasoativos derivados do endotélio no controle do fluxo sanguíneo sobre o músculo

esquelético. Conforme descrito na literatura hiperpolarizações causadas por NO

normalmente são prevenidas por bloqueadores de canais KATP. Portanto, verificou-se

que a glibenclamida, um inibidor destes canais, em anéis com endotélio de artéria

mesentérica superior isolada de rato hipertenso foi capaz de atenuar

significativamente a resposta vasorelaxante induzida por -terpineol (Figura 29).

A ativação de canais KV aumenta efluxo de K+, resultando em hiperpolarização

de membrana. Estes canais são ativados por despolarização da membrana e têm

participação na regulação de retroalimentação negativa ao longo do potencial de

membrana associado a outros canais para K+ (JACKSON, 2000; 2005). Estes canais

em células musculares lisas constituem um mecanismo essencial na regulação da

despolarização e conseqüente vasoconstrição como também parecem estar

envolvidos na repolarização, além disso, o NO é capaz de ativar canais KV em

algumas artérias e ativá-los por mecanismos dependentes e independentes de

GMPc (COSTA et al., 2001; IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER, 2003; YUAN et

al., 1996; JACKSON 2005). Costa e colaboradores (2001) propuseram ainda que

formas reduzidas de NO também sejam capazes de ativar canais KV em músculo liso

por um mecanismo dependente de GMPc. A diminuição da disponibilidade do NO

derivado do endotélio como presente em animais hipertensos SHR, pode levar à

despolarização das células musculares vasculares e conseqüente contração devido

à inibição ou fechamento dos canais KV (IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER;

2003, JACKSON, 2005, FELETOU; VANHOUTTE, 2000). A 4-aminopiridina (4-AP)

(1 mM), um bloqueador seletivo de canais para K+ dependente de voltagem (KV)

(SOBEY, 2001; FOZARD; MANLEY, 2001) teve proeminente efeito inibitório,

sugerindo que a abertura destes canais (e conseqüente hiperpolarização da

membrana de células musculares lisas) é requerida para o vasorrelaxamento

induzido pelo -terpineol em anéis de artéria mesentérica de rato SHR na presença

do endotélio (Figura 29).

Nos vasos, as prostaciclinas são formadas em células endoteliais a partir de

uma sequência de reações enzimáticas iniciada pela ciclooxigenase (COX) e se

difundem até as células musculares (VANHOUTTE, 2009). O mecanismo de ação da

PGI2 envolve a ativação da proteína Gs, ativação da ciclase de adenilil e aumento

dos níveis intracelular de AMPc, promovendo a ativação da PKA e conseqüente

115

vasodilatação (VANHOUTTE, 2011). Para verificar a influência das prostaciclinas no

relaxamento induzido pelo -terpineol, foi utilizado a indometacina (10 μM) e

constatamos que o relaxamento induzido por este monoterpeno não foi atenuado

sugerindo que produtos formados a partir da via da COX não participam deste efeito

(Figura 26).

A liberação do NO e outros fatores relaxantes é conseqüente da ação de

mediadores endoteliais estimulados por diversas substâncias, endógenas ou não,

que agem em receptores localizados na membrana das células endoteliais, como a

acetilcolina (FURCHGOTT, 1983). Adicional a este conceito, nossos resultados

demonstraram que a atropina (um antagonista seletivo dos receptores muscarínicos)

não foi capaz de inibir a vasodilatação induzida pelo -terpineol em ratos

normotensos (Figura 26).

Dessa forma, é de grande interesse evidenciar a participação de receptores de

membrana da célula endotelial em resposta ao -terpineol, bem como a

possibilidade de mecanismos de ativação dependentes de proteínas cinases (AMPK

ou a via PI3-cinase/Akt) modular junções gap mioendoteliais e/ou atividade de

canais de potássio ainda precisa ser investigada. Recentes estudos apontam para o

envolvimento da AMPK ou da via PI3-cinase/ AKT na regulação KATP, KIR ou BKCa

(HABA et. al., 2010, CHANG et. al., 2009; DAL-CIM 2011), entretanto, o papel na

regulação da função vascular não está bem elucidada e carece de mais estudos.

Outro tópico de interesse está em conhecer as ações do monoterpeno em prevenir o

estresse oxidativo e assim contribuir com os demais mecanismos que previnem a

disfunção endotelial, uma vez que existem relatos na literatura que demonstram o

potencial antioxidante de vários monoterpenos (SINGH, 2010).

A formação de fatores endoteliais vasoprotetores induzido pelo -terpineol,

demonstrados neste trabalho, podem ajudar a esclarecer os efeitos benéficos

exercidos no sistema cardiovascular. O efeito benéfico está associado à restauração

dos efeitos vasoprotetores por induzir a formação de NO, aumento da atividade da

eNOS, via ativação de proteínas envolvidas com a prevenção de alterações do

metabolismo celular, como apoptose (PI3K/AKT) e diminuição do ATP disponível

(AMPK), fatores que contribuem para diminuir a disfunção endotelial. Por

conseguinte, o -terpineol demonstrou ser capaz de diminuir o estado excitável da

116

célula muscular lisa vascular, e originando a hiperpolarização, o que produz a

redução do potencial de membrana reduzindo o estado contrátil da célula muscular,

fator primordial para estados de prevenção e/ou tratamento para hipertensão.

Por fim, coletivamente neste trabalho, demonstrou-se a capacidade do -terpineol

em induzir a hipotensão e diminuir a resistência vascular periférica mediado por fatores

relaxantes derivados do endotélio em animais hipertensos. Este evento está implicado

acontecer no endotélio vascular, onde o -terpineol induz a ativação da via PI3-cinase/

AKT e AMPK e consequente ativação da enzima eNOS com aumento da produção de

NO e como conseqüência deste evento, ocorre a ativação da enzima ciclase de guanilil

solúvel. Um fato interessante foi que o -terpineol demonstrou-se capaz de induzir a

formação de outros fatores relaxantes derivados do endotélio, como o EDHF,

associado à ativação de canais KCa, KATP e KV (Figura 41).

Estes efeitos produzidos pelo -terpineol desempenham um papel crucial no

controle da homeostase vascular, incluindo em modelos experimentais de

hipertensão in vivo e in vitro. Portanto, estes efeitos obtidos com -terpineol revelam

a importância dos estudos que podem contribuir com substâncias que contenham a

propriedade de modular a produção endógena do NO, tendo os produtos naturais

como uma importante fonte.

117

Figura 41: Representação da farmacodinâmica do α-terpineol. Ativação de proteínas cinases AKT e AMPK envolvidas na fosforilação da eNOS (Ser 1177) e consequente produção de NO, associado a produção do EDHF, em células endoteliais, os quais favorecem o relaxamento na célula muscular lisa.

118

Conclusões

119

CONCLUSÕES

Conforme demonstrado, os resultados do presente estudo nos permitem concluir:

O -terpineol promove um vasorrelaxamento em anéis de artéria

mesentérica superior isolada de rato ocorre de maneira dependente de

endotélio vascular, com aumento dos níveis de NO em cultura celular.

A infusão intravenosa de -terpineol promove hipotensão e alterações nas

respostas cardiovasculares e reflexas, com aumento do ganho do

barorreflexo, em animais hipertensos e normotensos.

Verificamos que o -terpineol induz hipotensão e taquicardia em ratos

hipertensos e normotensos não-anestesiados. E esta hipotensão parece

estar envolvida, em parte a via L-arginina-NO-GMPc.

Identificamos a sinalização em que o -terpineol induz relaxamento, que

envolve mecanismos endoteliais NO/GMPc, e EDHF em artéria

mesentérica de animais hipertensos e normotensos.

O -terpineol leva a ativação de vias que acionam proteínas cinases como

AKT e AMPK para induzir a fosforilação da eNOS e consequente

produção de NO em células endoteliais.

A participação dos canais de K+ na vasodilatação induzida pelo -terpineol

em artéria mesentérica de rato hipertenso SHR e WKY foi confirmada, o

que leva à ativação de canais de K+ KCa, KATP, KV e hiperpolarização da

membrana da célula muscular, com conseqüente vasorrelaxamento.

120

Perspectivas

121

PERSPECTIVAS

Atualmente, o -terpineol oferece uma alternativa para os estudos que

avaliam os efeitos benéficos para o sistema cardiovascular. Novos estudos são

propostos para avaliar a farmacodinâmica do -terpineol sobre os fatores

predisponentes que desencadeiam o estresse oxidativo. Assim, poderemos

identificar alternativas para prevenção e/ou tratamento de condições relacionadas à

disfunção endotelial e levam a doenças cardiovasculares, como a hipertensão,

aterosclerose, e demais fatores de risco, como diabetes, resistência a insulina e

obesidade. Em adição, demais propostas de grande interesse podem ser

desenvolvidas para estudos de farmacocinética e desenvolvimento farmacotécnico,

em uma visão para o desenvolvimento de novas moléculas que visem à terapêutica.

.

122

Referências

123

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150

Anexos

151

Certificado do Comitê de ética

152

VITA

Lista de Publicações

Artigos integrantes da tese

Artigos Completos publicados.

1. Ribeiro TP, Porto, DL, Menezes, CP Antunes, AA, Silva, DF, De Sousa, DP, Nakao, LS, Braga, VA, Medeiros, I A. Unraveling the cardiovascular effects induced by alpha-terpineol: a role for the NO-cGMP pathway. 2010. Clin Exp Pharmacol Physiol; 37 (8) 811-6. doi: 10.1111/j.1440-1681.2010.05383.x.

Artigos propostos para submissão.

1. Ribeiro, Thaís P., Oliveira, A.C., França-Silva, Maria S., Mendes-Junior L G, Braga, Valdir A, Medeiros, Isac A., α-Terpineol induces endothelial function and baroreflex sensitivity improvement in spontaneously hypertensive rat. J Cardiov. Pharmacol, 2012.

2. Ribeiro, Thaís P.; Bruna P. V. Dantas; José G. F. Albuquerque; Lazare Belamelaba; Valdir A. Braga; Valérie B. Schini-Kerth, Isac A. Medeiros. Endothelial signaling mechanisms involved in vasodilation to α-terpineol in spontaneously hypertensive rats. Pharmacological Research, 2012.

Artigos publicados durante o período doutoral (2008-2012) Artigos Completos publicados.

1. Bastos, JF., Moreira, IJ., Ribeiro, TP., Medeiros, IA., Antoniolli, AR., De Sousa, DP., Santos, MR. 2010. Hypotensive and Vasorelaxant Effects of Citronellol, a Monoterpene Alcohol, in Rats. 2010. Basic Clin Pharmacol Toxicol 106 (4) 331 - 337. doi.10.1111/j.1742-7843.2009.00492.x

2. Nunes, FC.; Ribeiro, TP. ; França-Silva, MS. ; Medeiros, IA. ; Braga, VA. Superoxide scavenging in the rostral ventrolateral medulla blunts the pressor response to peripheral chemoreflex activation. 2010. Brain Research 10;1351:141-9.

3. Cavalcante, H.M., Ribeiro, T.P., Silva, D.F., Nunes, X.P., Barbosa-Filho, J.M., Diniz, M.F. Correia, NA, Braga, VA, Medeiros, IA. Cardiovascular Effects Elicited by Milonine, a New 8,14-Dihydromorphinandienone Alkaloid. 2011. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol 108(2):122-30. doi: 10.1111/j.1742-7843.2010.00631.x..

153

4. Luciano MN, Ribeiro TP, de França-Silva MD, do Nascimento RJ, de Jesus Oliveira E, França KC, Antunes AA, Nakao LS, Aita CA, Braga VA, de Medeiros IA. Uncovering the vasorelaxant effect induced by Vale do São Francisco red wine: A role for nitric oxide. J Cardiov. Pharmacol. 2011. doi: 10.1097/FJC.0b013e318217db1f.]

5. Braga VA, Medeiros IA, Ribeiro TP, et al. Angiotensin-II-induced reactive oxygen species along the SFO-PVN-RVLM pathway: implications in neurogenic hypertension. Review. Brazilian Journal of Medical and Biological Research (BJMBR)-on line., 2011.

6. Oliveira, A.C., Sena-Filho JG., Mendes-Junior L G., Anjos R M., Ribeiro, TP., Barbosa-filho, J. M., Braga, V. A., Medeiros, I. A. Erythroxylum pungens O.E.Schulz elicits vasorelaxation by reducing intracellular calcium concentration in vascular smooth muscle cells of rats. Revista Brasileira de Farmacognosia (Impresso). , v.01, 2011.

Artigos submetidos para publicação.

1. França-Silva, Maria S., Ribeiro, Thaís P., Luciano, Melissa N, Silva, Juliane

S., Santos, A. F., França, K C, Nakao, Lia S, Athayde-Filho, P. F., Braga, Valdir A, Medeiros, Isac A., Introducing a new nitric oxide donor: the 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan (NDBP) and its vasorelaxant effect. Nitric Oxide (Print). , 2012. 3

2. DANTAS, B. P. V., Magalhães, N, Ribeiro, Thaís P, Oliveira, A. C., Assis, K. P, Câmara, C., Braga, Valdir A, Medeiros, Isac A., Alencar, J.L. Naphthoquinone, a new oxime, induces vasorelaxation via nitric oxide signaling mechanisms. Fundamental & Clinical Pharmacology. , 2012.

154

Publicações

155

Este trabalho tem por objetivo investigar e caracterizar a farmacodinâmica do

α-terpineol, um monoterpeno constituinte de diferentes óleos essenciais, sobre o

sistema cardiovascular de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e seus

controles normotensos (WKY), utilizando metodologias in vivo e in vitro. Este estudo

compreende ainda em avaliar os efeitos do α-terpineol sobre a variação da produção

de óxido nítrico e os mecanismos de ativação da enzima eNOS em células

endoteliais cultivadas.

Esta seção abrange 3 artigos formados a partir dos resultados da tese:

O primeiro artigo (estudo A) consiste na caracterização dos efeitos

cardiovasculares do α-terpineol com foco sobre o óxido nítrico.

No segundo artigo (estudo B) foram evidenciados os mecanismos

adicionais envolvidos na resposta cardiovascular do α-terpineol com

experimentos in vivo. Os efeitos do α-terpineol foram investigados sobre o

controle autonômico de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e seus

controles normotensos (WKY), bem como a participação da via dependente

de óxido nítrico em animais conscientes e livre movimentação.

E por fim, no último artigo (estudo C), foi investigada a rede de sinalização

celular envolvida no relaxamento vascular de animais hipertensos, com

ênfase sobre o papel do endotélio vascular. Foi caracterizado a via de

ativação da enzima eNOS e consequente produção de NO e participação

da enzima guanili ciclase solúvel e a participação do EDHF e dos canais de

potássio.

156

Estudo A: Caracterização dos efeitos cardiovasculares induzidos por -terpineol:

um papel para via NO-GMPc

Artigo 1: Unraveling the cardiovascular effects induced by -terpineol: a role for the

NO-cGMP pathway

Revista: Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 37(8),811-6, 2010

RESUMO

Introdução: -Terpineol é um monoterpeno presente em óleos essenciais de

diversas espécies de plantas aromáticas. Objetivos: No presente estudo,

investigamos o mecanismo de ações cardiovasculares induzidas pelo -terpineol.

Resultados: O monoterpeno -terpineol (1, 5, 10, 20 e 30 mg ⁄ kg, i.v.) produziu

hipotensão dependente da dose (-10 ± 3, -20 ± 8, -39 ± 16, -52 ± 21 e -57 ± 23

mmHg, respectivamente; n = 5) seguida da taquicardia. A resposta hipotensora foi

atenuada após a administração do N-nitro-Larginina metil-éster (L-NAME; 20 mg⁄

kg, i.v.; -2 ± 1, -5 ±2, -7 ± 3, -22 ± 9 and -22 ± 10 mmHg, respectivamente; P < 0,05;

n = 5). Em anéis de artéria mesentérica pré-contraídas com 10 μM de fenilefrina

(PE), -terpineol (10-12 a 10-5 μM) causou relaxamento dependente de concentração

(relaxamento máximo em resposta a fenilefrina 10μM (Emax)= 61 ± 6%; n = 7). Após

a remoção do endotélio vascular o vasorrelaxamento foi atenuado (Emáx= 20 ± 1%;

p<0,05; n= 7). Em adição o vasorrelaxamento induzido pelo -terpineol em anéis de

artéria mesentérica pré-tratados com 100 ou 300 μM L-NAME, 30 μM

hidroxicobalamina ou 10 μM 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalina-1-ona foi

atenuado (Emax=18 ± 3, 23 ± 3, 24 ± 7 and 21 ± 1%, respectivamente; n = 6; P <

0,05). Em seguida, o -terpineol (10-6, 10-5 e 10-4 μM) induziu aumento dos níveis de

óxido nítrico (NO) (12 ± 6, 18 ± 9 e 34 ± 12% fluorescência, respectivamente; n= 3)

em linhagem de células endoteliais de aorta de coelho. Em conclusão, o uso

combinado de metodologias que envolvem experimentos funcionais e bioquímicos,

no presente estudo, foi capaz de demonstrar que a hipotensão e vasorrelaxamento

induzido pelo -terpineol são mediados em parte pelo endotélio e envolve a indução

do NO e a via NO-GMPc.

163

Estudo B: Avaliação das ações cardiovasculares do -terpineol em animais

hipertensos – Experimentos in vivo.

Artigo 2: α-Terpineol induces hypotension and improves baroreflex sensitivity in

spontaneously hypertensive rat

Revista: Journal Cardiovascular Pharmacology, to be submitted, 2012

RESUMO

Introdução: Os monoterpenos apresentam propriedades benéficas no sistema

cardiovascular, como efeitos protetores sobre a camada endotelial, vasorelaxante e

hipotensores (Bastos, 2009; Ribeiro, 2010). Objetivos: O presente estudo investigou

a resposta hipotensora ao tratamento intravenoso (i.v) com monoterpeno, α-

terpineol, em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e controles normotensos

(WKY). Resultados: Em ambos SHR e WKY, injeções de α-terpineol (1–20 mg/kg,

i.v) diminuiu a pressão arterial média (MAP) dependente da dose em WKY e SHR

(-103, -399, -5211, -6212mmHg, n=10 e -37 5, -577, -715, -844 mmHg,

n=9, respectivamente) associado a taquicardia. O tratamento com hexametônio (30

mg/kg), ou atropina (2 mg/kg), ou atenolol (20 mg/kg), ou prazosim (1 mg/kg), não

afetou a hipotensão induzida por α-terpineol. Em seguida, a injeção do L-NAME

(20mg/kg), um bloqueador da NOS, foi capaz de reduzir a hipotensão produzida pelo

α-terpineol em ratos SHR e WKY, tanto em porcentagem quanto em valores

absolutos. A sensibilidade do barorreflexo de animais hipertensos e normotensos foi

avaliada antes e após o tratamento intravenoso com o α-terpineol e observamos que

o -terpineol foi capaz de aumentar a sensibilidade do barorreflexo de animais SHR.

Este conjunto de dados demonstra que o tratamento intravenoso com α-terpineol

diminui a pressão arterial em ratos hipertensos e sugere que pode ser parcialmente

atribuído a ação vascular, associado ao aumento da sensibilidade do barorreflexo.

164

α-Terpineol induces hypotension and improves baroreflex sensitivity in

spontaneously hypertensive rat

Thaís P. Ribeiro (1); Aurylene C. Oliveira (1); Maria S. França-Silva (1); Leônidas G.

Mendes-Junior (1); Valdir A. Braga(1); Isac A. Medeiros(1).

(1) Centro de Biotecnologia, Universidade Federal da Paraíba, Cidade

Universitária, Campus I, João Pessoa, PB, Brazil;

Running title: α-terpineol induces hypotension in hypertensive rats.

Corresponding author and reprint requests to:

Isac Almeida de Medeiros, PhD

Biotechnology Center, Federal University of Paraiba

B.O. Box 5009, 58.051-970

João Pessoa, PB, Brazil.

Phone: (55) 83 3216 7366 or 3216 7177

FAX : (55) 83 3216 75 11 or 83 3216 73 65

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

165

SUMMARY

Studies in animals have documented beneficial properties of monoterpenes in the

cardiovascular system such as endothelial protective, vasorelaxant and hypotensive

activities (Bastos, 2009; Ribeiro, 2010). The present study investigated the

hypotensive responses to intravenous (i.v.) treatment with α-terpineol in the

spontaneous hypertensive rats (SHR) and Wistar normotensive controls (WKY). In

both SHR and WKY (i.v.) bolus injections of α-terpineol (1–20 mg/kg) decreased

mean arterial pressure (MAP) in a dose-related manner [WKY -103, -399, -5211,

-6212 mmHg, n=10) and SHR -375, -577, -715, -844 mmHg, n=9] associated

with tachycardia following bradycardia [WKY: Time 0: 45±5, 64±11, 110±7, 113±22

bpm; Time 3 min: -3±5, -10±4, -73±4, -125±2 bpm, n=10; SHR: Time 0: 61±5, 75±9,

85±3, 72±8 bpm; Time 3 min: -33±12, -71±5, -126±16, -144±32 bpm, n=9]. In SHR

unaffected the enhancement of α-terpineol-induced hypotension likes

hexamethonium (30 mg/kg) or atropine (2 mg/kg) or atenolol (20 mg/kg), prazosin (1

mg/kg). Likewise, both maximal percentage and absolute decreases in MAP elicited

by i.v. injection of the L-NAME (20mg/kg), NOS blocker, were significantly greater in

SHR than in control. We observe the α-terpineol increased the baroreflex gain,

improving the sensitivity of this cardiovascular reflex. These results show that α-

terpineol (i.v.) decreases blood pressure in conscious SHR, and this action is greater

when compared with normotensive rats. The data further support our previous

hypothesis that hypotensive effects of α-terpineol are partially attributed to the

actions of NO formation, and associate to increases in baroreflex sensitivity.

Keywords: monoterpene, hypotension, nitric oxide

166

INTRODUCTION

The arterial pressure is regulated by feedback control systems, operating in

both short and long term, which rely on autonomic nerves and circulating hormones

as their effector mechanisms. The vascular resistance in any particular region is

influenced, to varying degrees depending on the region, by the activity of sympathetic

vasomotor nerves, the level of circulating vasoactive hormones and also by local

factors, including metabolites and endothelial factors (Thrasher et al. 2006). The

principal mechanism for regulating arterial pressure in the short term is the

baroreceptor reflex with the sympathetic nervous system that controls the distribution

of cardiac output to different vascular beds (Kirchheim 1976). That involves the

compensatory reflex mechanism that responds to changes in arterial pressure

(Taylor et al. 2010). Cardiovascular homeostasis in the longer term depends on an

interaction between hormones and the sympathetic nervous system and this involved

in the onset of hypertension and different animal models have been used to study

this pathology, such as the spontaneously hypertensive rats (SHR). In SHR is

characterized by increased peripheral vascular resistance, sympathetic overactivity

and increased heart rate (Valenti et al. 2011; Kawada et al. 2011; Krum et al. 2011).

A precise knowledge of early development of the cardiovascular diseases is

often target for the studies with these new drugs where the vascular and cardiac

parameters are investigated (Edris et al., 2007). Although many effective drugs for

the treatment of hypertension exist, there is great interest in the research of new

bioactive products to treat hypertension (Kwan et al. 1995), including from plants

such as monoterpenes essential oils derivative (Luo et al. 2010).

Studies in animals have demonstrated beneficial properties of monoterpenes

in the cardiovascular system such as endothelial protective, vasorelaxant and

hypotensive activities (Guedes et al. 2004, Bastos et al. 2009, Magalhães et al,

2008). In this context, -terpineol, a monoterpene, is able to induce a reversible and

concentration-dependent vasorelaxation that was reduced or abolished under

blockade of NOS by L-NAME isolated rat superior mesenteric artery rings and

consequent release of endothelium-derived relaxing factors (EDRFs), mainly NO

(Ribeiro et al., 2010).

167

Although some studies have been conducted, the cardiovascular effects of α-

terpineol needs further investigation. Of note, its effects on hypertension had not yet

been investigated. Since hypertension is often associated with an imbalance

between sympathetic and parasympathetic activity, and the dysfunction in

baroreceptor reflex, we aimed to evaluate the action of α-terpineol on the

cardiovascular parameter and baroreflex sensitivity in spontaneously hypertensive

rats (SHR) and its normotensive control (WKY).

METHODS

Animals

Male 14 to 16-week-old Wistar Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive

(SHR) rats, were used for all experiments. Animals were housed under controlled

conditions of temperature (21 1ºC), lighting cycle (lights on: 06:00-18:00 h), and

food (Labina®, PURINA, Brazil) and water ad libitum. Experimental protocols and

procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of

the Biotechnology Center – Federal University of Paraiba (CEPA # 020207).

Drugs

The drugs used were: cremophor EL, dimethyl sulphoxide (DMSO), L-

phenylephrine chloride, sodium nitroprussiate, hexamethonium, atropine, prazosim,

atenolol, Nw-nitro-L-arginine methyl esther (L-NAME), all from Sigma Chemical Co.,

Saint Louis, MO, USA. Heparin sodium salt (Roche), sodium thiopental (Cristália)

and α-Terpineol 95.0% (GC) of purity (Sigma).

The α-terpineol stock solution was prepared in saline solution and kept at -4o

C. α-Terpineol was dissolved in a mixture of saline and chremophor and diluted to

the desired concentrations just before use. The other compounds were freely

dissolved in saline solution.

168

Arterial pressure (AP) and heart rate (HR) recordings in unanesthetized rats

For AP and HR recordings, procedures were similar to those previously

described (Oliveira et al. 1996). Briefly, under ketamin plus xilazin anesthesia (45

mg.Kg-1, i.p.), rats were fitted with polyethylene catheters inserted into the lower

abdominal aorta and inferior vena cava through left femoral artery and vein,

respectively. Both catheters were filled with heparinized saline, tunneled

subcutaneously, exteriorized and sutured at the dorsal surface of the neck. Twenty-

four hours after surgical procedures, experiments were performed in unanesthetized

rats. Blood pressure and heart rate were recorded in conscious rats using a pressure

transducer coupled to an acquisition system (LabTrax 2-24T, World Precision

Instruments, Sarasota, FL, USA) connected to a computer running the software

DataTrax 2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)..

Experimental design and protocols

1. Effect of α-terpineol on blood pressure and heart rate in unanesthetized rats

Normotensive (WKY) and hypertensive (SHR) animals received a series of

increasing bolus doses (1, 5, 10 and 20 mg/kg) of α-terpineol via the i.v. catheter,

and time course of the changes in blood pressure and heart rate was recorded. The

injections were separated by a time sufficient to allow full recovery of arterial

pressure, usually 15 min. This series of experiments was carried out to establish a

dose–effect relationship and the ED50 of α-terpineol.

2. Effects of α-terpineol on the autonomic control in unanesthetized rats

After hemodynamic parameters had stabilized, ED50 doses of α-terpineol

(4.8 mg/kg, i.v.) were administered. Thirty minutes after administration of α-terpineol,

atropine (2 mg ⁄ kg; i.v.; 30 min.), a non-selective muscarinic receptor antagonist,

prazosin (1 mg/kg, i.v) alpha-adrenergic receptor antagonist, atenolol (20 mg ⁄ kg;

i.v.; 30 min), beta-adrenergic receptor antagonist, or hexamethonium (30 mg/kg, i.v.),

a nicotinic receptor antagonist and ganglionic blocker, were administered separately,

169

and 30 min later α-terpineol was repeated. Changes in MAP and HR induced by α-

terpineol were compared before and after blockers.

3. Systemic hemodynamic effects of α-terpineol before and after nitric oxide synthase

blockade in vivo

Different doses of α-terpineol (4.8 mg/Kg i.v.) were administered. Successive

injections were separated by a time sufficient to allow full recovery of arterial

pressure (usually 15 min). After a 30 min of baseline recording, L-NAME (20 mg.Kg-

1, i.v.) was administered and 30 min later α-terpineol was repeated. Changes in MAP

and HR induced by α-terpineol were compared before and after L-NAME treatment.

4. Effects of α-terpineol in the baroreflex sensitivity

For baroreflex sensitivity studies, animals were divided in six different groups:

WKY + vehicle; WKY + α-terpineol; SHR + vehicle; SHR + α-terpineol. Following

baseline blood pressure and heart rate recordings, baroreflex was activated using

classical vasoactive drugs (modified Oxford Method, Botelho-Ono, 2010) before and

after acute administration of drugs. Phenylephrine (8 μg/Kg) and sodium

nitroprusside (25 μg/Kg) were given as intravenous bolus injection before and after α-

terpineol (4.8 mg/Kg, i.v.) or vehicle depending on the group. A 15-minute interval

was allowed between phenylephrine and sodium nitroprusside injections. Reflex

changes in heart rate produced by vasoactive drugs administration were quantified

and plotted as changes in heart rate over changes in mean arterial pressure

(ΔHR/ΔMAP) as described by Braga et al. (2008).

Data analysis

Values were expressed as mean ± S.E.M. When appropriate, statistical

significance was determined by two-way ANOVA following Bonferroni’s post-test,

using GraphPad Prism© software, version 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla,

CA, USA). Values of P<0.05 were considered statistically significant.

170

RESULTS

Effect of α-terpineol on blood pressure and heart rate in unanesthetized rats

Baseline values of mean arterial pressure WKY and heart rate were 105 ± 3

mmHg and 360 ± 3 bpm, respectively and 185 ± 5 mmHg and 380 ± 5 bpm for SHR.

α-Terpineol (1, 5, 10 and 20 mg/kg, i.v., randomly) induced hypotension in a dose-

dependent manner WKY: (-103, -399, -5211, -6212 mmHg, n=10) and SHR:

(-375, -577, -715, -844 mmHg, n=9) (Figure 1A, B), associated to an initial

tachycardia followed by a severe bradycardia in both animal groups (WKY: Time 0:

45±5, 64±11, 110±7, 113±22 bpm; Time 3 min: -3±5, -10±4, -73±4, -125±2 bpm,

n=10; SHR: Time 0: 61±5, 75±9, 85±3, 72±8 bpm; Time 3 min: -33±12, -71±5, -

126±16, -144±32 bpm, n=9; figure 1 C, D).

171

Figure 1. Changes in mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) induced by the acute administration of different doses of α-terpineol (1- 20 mg/kg, i.v.) in conscious rats. (A and C) normotensive Wistar Kyoto rats; (B and D) spontaneously

hypertensive rats. Values are expressed as mean s.e.m. (n=6), *P0.05 vs. control (Two-way ANOVA followed by Bonferroni’s post-test).

172

Effects of α-terpineol on the autonomic control in unanesthetized rats

After evaluating the action of α-terpineol on the autonomic control we

observed that parasympathetic blockade with atropine (2 mg ⁄ kg; i.v.) did not cause

changes in the hypotensive response elicited by α-terpineol ED50: 4.8 mg ⁄ kg; i.v. in

both hypertensive and normotensive animals (Figure 4A). WKY: -515 mmHg, n=6

and after Atropine WKY: -546 mmHg, n=6 and SHR: -627 mmHg, n=6 and after

atropine SHR: -619 mmHg, n=5. In contrast, the tachycardia and bradycardia

response was significantly reduced after α-terpineol treatment [WKY: Time 0: 65±11

bpm; Time 3 min: -11±4 bpm, n=5; After atropine WKY: Time 0: 59±3 bpm; Time 3

min: -2±2 bpm, n=5; and SHR: Time 0: 89±5 bpm; Time 3 min: -125±6 bpm, n=5;

After atropine SHR: Time 0: 60±4 bpm; Time 3 min: -10±4 bpm, n=5; figure 2 C, D].

Figure 2. Changes in mean arterial pressure (MAP), and heart rate (HR) induced by the acute administration of different doses of α-terpineol (4.8 mg/kg, i.v.) in normotensive and hypertensive rats before and after administrations of atropine (2

mg ⁄ kg; i.v.). Values are expressed as mean s.e.m. (n=6), *P0.05.

173

Likewise, α-terpineol ED50: 4.8 mg ⁄ kg; i.v. in both hypertensive and

normotensive animals (Figure 4A) the blockade with atenolol (20 mg ⁄ kg; i.v.) or

hexametonium (30 mg ⁄ kg; i.v.) (Figure 5A,B) WKY: -535 mmHg, n=5 and after

atenolol WKY: -678 mmHg, n=6 and SHR: -643 mmHg, n=6 and after atenolol

SHR: -622 mmHg, n=4 or hexametonium WKY: -543 mmHg, n=5 and after

hexametonium WKY: -5110 mmHg, n=5 and SHR: -656 mmHg, n=6 and after

hexametonium SHR: -615 mmHg, n=5 (Figure 6A,B) significantly reduced the

tachycardic and bradycardic responses but not cause changes in the hypotensive

response to α-terpineol, in hypertensive and normotensive rats. WKY: Time 0: 73±6

bpm; Time 3 min: -26±7 bpm, n=5; After Atenolol WKY: Time 0: 42±6 bpm; Time 3

min: -16±8 bpm, n=5; and SHR: Time 0: 77±6 bpm; Time 3 min: -145±10 bpm, n=5;

After Atenolol SHR: Time 0: 45±7 bpm; Time 3 min: -73±22 bpm, n=5; figure 5 C, D)

and WKY: Time 0: 74±6 bpm; Time 3 min: -10±3 bpm, n=5; After hexametonium

WKY: Time 0: 0±0 bpm; Time 3 min: -16±2 bpm, n=5; and SHR: Time 0: 88±4 bpm;

Time 3 min: -120±34 bpm, n=5; After hexametonium SHR: Time 0: 5±1 bpm; Time 3

min: -22±10 bpm, n=5; figure 6 C, D).

Figure 3. Changes in mean arterial pressure (MAP), and heart rate (HR) induced by the acute administration of different doses of α-terpineol (4.8 mg/kg, i.v.) in

174

normotensive and hypertensive rats before and after administrations of atenolol (20

mg ⁄ kg; i.v.). Values are expressed as mean s.e.m. (n=6), *P0.05.

Figure 4. Changes in mean arterial pressure (MAP), and heart rate (HR) induced by the acute administration of different doses of α-terpineol (mg/kg, i.v.) in normotensive and hypertensive rats before and after administrations of hexamethonium (30 mg ⁄

kg; i.v.). Values are expressed as mean s.e.m. (n=6), *P0.05.

175

Prazosin (1 mg ⁄ kg; i.v.), in turn, showed no changes in blood pressure and

heart rate (Figure 7A,B). MAP (WKY): -594 mmHg, n=5 and after Prazosin WKY: -

569 mmHg, n=5 (SHR): -677 mmHg, n=5 and after Prazosin SHR: -656 mmHg,

n=5 (Figure 6A,B) HR(WKY): Time 0: 73±3 bpm; Time 3 min: -26±7 bpm, n=5; After

Prazosin WKY: Time 0: 78±8 bpm; Time 3 min: -36±3 bpm, n=5; (SHR): Time 0:

77±6 bpm; Time 3 min: -143±10 bpm, n=5; After Prazosin SHR: Time 0: 85±7 bpm;

Time 3 min: -173±12 bpm, n=5; figure 7 C, D).

Figure 5. Changes in mean arterial pressure (MAP), and heart rate (HR) induced by the acute administration of different doses of α-terpineol (4.8 mg/kg, i.v.) in normotensive and hypertensive rats before and after administrations of prazosin (1

mg⁄kg; i.v.). Values are expressed as mean s.e.m. (n=6), *P0.05.

176

Systemic hemodynamic effects of α-terpineol before and after nitric oxide synthase

blockade in vivo

The hypotensive response was attenuated after acute blockade of the NO-

synthase with L-NAME (20 mg/Kg) MAP (WKY): -499 mmHg, n=5 and after L-

NAME WKY: -292 mmHg, n=7 (SHR): -675 mmHg, n=8 and after L-NAME SHR: -

351 mmHg, n=7 (Figure 8 A, B). The heart rate was also significantly attenuated at

4.8 mg/kg, demonstrating the importance of the NOS-activation in the systemic

effects induced by α-terpineol (figure 8). Bradycardic response three minutes after

administration this monoterpene was reduced only in hypertensive rats. HR (WKY):

Time 0: 64±11 bpm; Time 3 min: -33±4 bpm, n=7; After L-NAME WKY: Time 0: 45±7

bpm; Time 3 min: -37±22 bpm, n=5; (SHR): Time 0: 78±8 bpm; Time 3 min: -163±21

bpm, n=7; After L-NAME SHR: Time 0: 45±8 bpm; Time 3 min: -87±22 bpm, n=7;

figure 8 C, D).

Figure 6. Changes in mean arterial pressure (MAP), and heart rate (HR) induced by the acute administration of different doses of α-terpineol (4.8 mg/kg, i.v.) in normotensive and hypertensive rats before and after administrations of L-NAME (20

mg ⁄ kg; i.v.). Values are expressed as mean s.e.m. (n=6), *P0.05

177

Effects of α-terpineol in the baroreflex sensitivity

Representative tracings showing the changes in heart rate in response to

baroreflex activation are illustrated in Fig. 8. Rats from the SHR group presented a

reduction in baroreflex gain when compared to the WKY group (−0.86±0.07 vs.

−2.51±0.2 bpm mm Hg−1, P>0.05) as shown in Fig. 9. In SHR rats, acute

administration of α-terpineol (4.8 mg/Kg, i.v.), a monoterpene, restored the

depressed baroreflex sensitivity to values that resembles to those presented by WKY

+ α-terpineol and SHR + α-terpineol group (−2.23±0.2 vs. −1.5±0.08 bpm mm Hg−1, P

>0.05, n=4). Of note, administration of vehicle (i.v.) before and after baroreflex

activation produced no changes in baroreflex gain in either SHR or vehicle groups

(Fig. 8).

Figure 7. Effects of α-terpineol (4.8 mg/kg,i.v.) on the baroreflex sensivity of

normotensive (WKY) and hypertensive (SHR) rats. Values are expressed as mean

s.e.m. (n=5), (*) SHR control versus SHR after α-terpineol, (#) WKY and SHR P0.05

DISCUSSION

178

In this report, we sought to clarify the underlying mechanisms by which α-

terpineol elicits its cardiovascular effects in rats. The major findings of this work were

that the monoterpene α-terpineol induces marked hypotension and improvement of

baroreflex sensitivity in spontaneously hypertensive unanesthetized rats, which could

be attributed, at least in part, to a decrease of peripheral vascular resistance

mediated by increases in NO release and consequently activation of the NO-GMPc

pathway.

Many kinds of animal models are being employed to understand potential

mechanisms of cardiovascular control in health and disease. Examples of some of

these animal models include spontaneously hypertensive rat (SHR), which is a

suitable model to study hypertension development as it mimics humans essential

hypertension. These similarities include a genetic predisposition to high blood

pressure with no specific etiology, increased total peripheral resistance without

volume expansion and its endothelial function is decreased in its early stage

(Grunfeld et al., 1995).

Baseline MAP and HR values of conscious normotensive rats (WKY) and

spontaneously hypertensive rat (SHR) were of the same order of magnitude as those

reported previously in the same preparation (Guimarães et al. 2012). In both groups,

i.v. administration with α-terpineol induced immediate and dose-dependent decrease

in MAP and tachycardic response. Recent studies from our laboratory have shown

that i.v. administration of α-terpineol decreased MAP in conscious normotensive rats

(Ribeiro et al. 2010). However, in the present study, this is the first time that such

cardiovascular effects of α-terpineol have been reported in SHR. We focused on the

initial hypotension that occurred concomitantly with initial reflex tachycardia followed

by bradycardia.

To examine the origin of the α-terpineol-induced initial hypotension and

tachycardia followed by bradycardia, we compared the cardiovascular responses to

pretreatment with i.v. atropine partially significantly decreased the bradycardic effects

of α-terpineol without affecting the hypotension in SHR and WKY rats.

To determine the role of the autonomic nervous system in α-terpineol -induced

cardiovascular effects in rats. The administration of α-terpineol was able to decrease

MAP in SHR and WKY rats, even when the central sympathetic nerve drive was

eliminated by ganglionic blockade with hexamethonium. The hypotensive effects of

179

α-terpineol are associated with a significant and dose-dependent bradycardia after 3

min its administration, which appears to be partly dependent upon the presence of an

operational autonomic drive to the heart, as demonstrated by its attenuation in

hexamethonium in SHR and WKY rats. This indicates that α-terpineol-induced

maximal hypotensive and tachycardic response was unaffected in SHR and WKY

rats and bradycardic responses to α-terpineol are mediated by a vagal reflex and an

efferent cholinergic mechanism.

In a separate group of animals SHR and WKY rats (n = 5), hypotensive

responses to α-terpineol ED50 4.8 mg/kg, i.v. also remained unaffected by i.v. The

lack of effect of atenolol on baroreflex-mediated bradycardia in SHR and WKY was

expected. We have demonstrated that attenuation of the HR response to

baroreceptor stimulation by cardiac autonomic blockade does not affect the reflex

decreases in BP. The baroreceptor reflex bradycardia during rapid increases in BP is

normally mediated by the parasympathetic nervous system in conscious rats. The

second important finding from the present study is that hypotensive responses to α-

terpineol also remained unaffected after treatment with prazosin, a selective α-1-

adrenoceptor antagonist, in SHR and WKY rats.

Impaired endothelial function and reduced baroreflex sensitivity (BRS) are

important predictors of cardiovascular morbidity, especially in SHR rats. Considering

that endothelium-derived NO plays a major role in the regulation of blood pressure

and vascular tone (Chowdhary; Townend, 1999) we hypothesized that the decrease

in blood pressure elicited by α-terpineol could be due to NO release from intact

vascular endothelium. Indeed, in the presence of NO synthase inhibition,

hypotension and tachycardia induced by α-terpineol were significantly attenuated

when compared to that induced by the α-terpineol given alone indicating that, the

hypotensive effect of the compound in conscious normotensive rats may be

dependent on NO release from vascular endothelium. It is most likely that the

vasorelaxation produced by α-terpineol evoked baroreflex-mediated tachycardia,

mainly in the lower doses. However, we cannot rule out a direct action of α-terpineol-

derived NO on the autonomic control of the heart as described earlier (Charkoudian

et al. 2009 and Kishi et al. 2003).

It is well documented in the literature that nitric oxide can act on brain areas

involved in the cardiovascular control (Kishi et al. 2003). In this way, Kishi et al.

(2003) demonstrated that overexpression of eNOS in the RVLM favors GABA

180

release and sympathoinhibition, reducing the sympathetic tone to the vessels and to

the heart causing hypotension and bradicardia (Garcıa et al. 2008).

Evidence from animal studies suggests that diminished baroreflex sensitivity is

caused by endothelial dysfunction (Fahim 2003; Chapleau 1989). In particular, in

experimentally induced endothelial dysfunction, the decreased prostacyclin and

increased thromboxane concentrations are associated with reduced baroreflex

impulses from the carotid artery (Chapleau et al. 1995). Evaluating alterations in the

balance of cardiovascular sympathetic/parasympathetic motor activity is important for

gaining insights into neural mechanisms of cardiovascular disease. In addition, many

diseases are associated with a change in baroreceptor reflex gain. For example,

essential hypertension is related to an increase in sympathetic tone (Grassi et al.

1998) and an attenuated cardiac baroreceptor reflex (Korner et al. 1995), which is an

important prognostic indicator of autonomic dysfunction (LaRovere et al. 2001).

Baroreceptor afferent sensitivity and baroreflex-mediated changes in heart rate (HR)

(Ohta et al. 1995) are consistently impaired in spontaneously hypertensive rats

(SHR) (Kawada et al. 2011). The new findings in the present study were that the

baroreflex sensitivity by α-terpineol was enhanced in SHR and WKY rats.

The reasons for the enhancement of the baroreflex sensitivity in SHR and

WKY rats α-terpineol-induced are complex. One possibility is that the cardiac

sympathetic afferent inputs increase in hypertension, which may be caused by α-

terpineol release in the myocardium stimulating the cardiac sympathetic afferents

and by the increased sensitivity of cardiac sympathetic afferents to the chemical

stimulus. Another possibility is that the central gain of the baroreflex sensitivity α-

terpineol-induced is increased in hypertension, which is supported by the present

findings that the baroreflex sensitivity responses induced by overexpression of eNOS

in the brain were greater in SHR and WKY rats (Guo et al. 2009).

The autonomic nervous system influences cardiovascular physiology, at least

partly, by the arterial baroreflex. Thus the impairment of endothelial function and

decrease of nitric oxide (NO) is seen very early in the development of hypertension.

Interestingly, the enhanced α-terpineol in SHR and WKY rats may possibly be

associated with preferential vasodilation in the mesenteric vascular bed (Magalhães

et al. 2008, Ribeiro et al. 2010).

181

Regardless of how it acts, by improving endothelial cell function, α-terpineol

could improve autonomic nervous system control through 2 mechanisms: indirectly,

by improving hemodynamics, or directly, by acting on subendothelial nerve endings

at the baroreceptor level (carotid, aortic, or cardiopulmonary). Possible support for a

direct action comes from the recent observation that endothelium-derived nitric oxide

increases vagal activity in SHR rats. However further chronic studies are needed to

explore the interactions between α-terpineol-induced NO release and their

consequent actions of sympathetic activity and baroreflex sensitivity.

In conclusion, we have demonstrated that α-terpineol produces hypotension in

vivo normotensive Wistar Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR)

and increases in baroreflex sensitivity.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors wish to express their sincere thanks to José Crispim Duarte and

collaborators for technical assistance. This work was funded by CAPES and CNPq-

Brazil.

182

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Medeiros+IA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Alves+PB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Marchioro+M%22%5BAuthor%5D




185

Toda N, Okamura T. The pharmacology of nitric oxide in the peripheral nervous

system of bood vessels. Pharmacol. Rev. 2003; 55: 271–324.

Valenti VE, De Abreu LC, Colombari E, Sato MA, Ferreira C. The variability of

baroreflex sensitivity in juvenile, spontaneously hypertensive rats. Cardiovasc J

Afr. 2011 Jan-Feb;22(1):14-7.

Vogt-Eisele AK, Weber K, Sherkheli MA. et al., Monoterpenoid agonists of TRPV3.

Br. J. Pharmacol. 2007; 151: 530–540.

186

Estudo C: Mecanismos de sinalização celular envolvidos nos efeitos

vasculares induzidos pelo α-terpineol em animais hipertensos.

Artigo 3: Endothelial signaling mechanisms involved in vasodilation to α-terpineol in spontaneously

hypertensive rats.

Revista: Pharmacological Research, to be submitted, 2012

RESUMO

Introdução: O α-terpineol apresenta propriedades benéficas no sistema

cardiovascular, como efeitos vasorelaxante e hipotensores (Ribeiro et al. 2010) e

demonstrou em animais hipertensos produzir hipotensão e melhora da

sensibilidade do barorreflexo (Ribeiro et al. 2012). Objetivos: Este estudo teve o

objetivo de investigar os mecanismos de sinalização celular envolvidos no

vasorrelaxamento induzido pelo α-terpineol em ratos hipertensos. Resultados: Em

anéis de artéria mesentérica pré-contraídos com fenilefrina (10 µM), α-terpineol (10-

12 a 10-5 M) causa relaxamento dependente da concentração em ratos hipertensos

e controles normotensos (WKY resposta máxima a fenilefrina (10 µM) (Emax) = 60

4 ou SHR [Emax = 53.7 ± 3, n=9]. Após a remoção do endotélio vascular o

relaxamento induzido pelo -terpineol foi atenuado em WKY e SHR. Este efeito do

-terpineol foi atenuado também na presença de 100μM L-NAME, 30 μM

hidroxicobalamina ou ODQ 10 μM em ratos SHR e WKY. Em experimentos com

células endoteliais de coronária de porco observamos que -terpineol induz

ativação das vias PI3K/ATK e AMPK com aumento da fosforilação em Ser 1177 e

consequente ativação da eNOS e produção de NO. Em seguida, o efeito

vasorelaxante induzido pelo -terpineol foi atenuado na presença de 20 mM KCl,

modulador do efluxo de K+ ou diferentes bloqueadores de canais de potássio, como

TEA (1 mM); caribdotoxina (0.2 μM) + apamina (0.2 μM); glibenclamida (10µM) e 4-

AP. Em conclusão nos demonstramos que o vasorrelaxamento induzido pelo -

terpineol, em ambos, ratos SHR e WKY é mediado pela via de ativação da

PI3K/ATK e AMPK com aumento da fosforilação da eNOS e indução de NO, com

consequente ativação da via NO-cGMP, associado a produção do EDHF e

participação dos canais para potássio.

187

Endothelial signaling mechanisms involved in vasodilation to -terpineol in

spontaneously hypertensive rats

Thaís P. Ribeiro(1); Bruna P. V. Dantas (1); José George F. de Albuquerque (1) Lazare

Belamelaba (2); Valdir A. Braga(1); Valérie B. Schini-Kerth(2), Isac A. Medeiros(1).

(1) Centro de Biotecnologia, Universidade Federal da Paraíba, Cidade

Universitária, Campus I, João Pessoa, PB, Brazil;

(2) Laboratoire de Biophotonique e pharmacologie de la Faculté de Pharmacie,

l’Université de Strasbourg, UMR 7213, Illkirch, France.

Running title: -terpineol induces NO and EDHF in hypertensive rats

Corresponding author and requests for reprints:

Isac Almeida de Medeiros, PhD

Centro de Biotecnologia, Universidade Federal da Paraíba

Caixa Postal 5009, 58.051-970

João Pessoa, PB, Brazil.

E-mail: [email protected] Phone: (55) 83 3216 7366 or 3216 7177 FAX : (55) 83

3216 75 11 or 83 3216 73 65

SUMMARY

mailto:[email protected]

188

1. α-Terpineol is a monoterpene found in essential oils of several aromatic plant

species. Here we investigate the mechanisms underlying the cardiovascular

changes induced by -terpineol in SHR and WKY rats.

2. In phenylephrine (10 µM) pre-contracted mesenteric artery rings, α-terpineol

(10-12 to 10-5 M) caused a concentration-dependent relaxation [WKY maximum

response to PE (10 µM) = 60 4 or SHR maximum response to PE (10 µM) = 53.7

± 3, p<0.05, n=9]. After endothelium removal, the vasorelaxation elicited by -

terpineol was attenuated in WKY [maximum response to PE (10 µM) = 20.5 1*]

and in SHR [maximum response to PE (10 µM) 16.1 ± 3, p<0.05, n=8]. In addition,

vasorelaxation induced by -terpineol in rings pre-treated with L-NAME 100 µM or

hydroxocobalamin 30 µM or ODQ 10 M was attenuated in SHR and WKY [WKY

maximum response to PE (10 µM) = 18.1 ±3.8; 23.5 ± 7; 20.8 ± 1 and SHR

maximum response to PE (10 µM) = 20.1± 3 ; 17.3 ± 3; 18.1 ± 3 p<0.05, n=8]. In

experiments with endothelial cells we observed that -terpineol activates PI3K/ATK

and AMPK pathways with increase of Ser 1177 phosphorylation and consequently

eNOS activation and NO production.

3. Furthermore, the relaxant effect induced by -terpineol was attenuated in the

presence of KCl (20 mM), a modulator efflux K+ or different potassium channel

blockers such as TEA (1 mM); Charybdotoxin (0.2 μM) plus apamin (0.2 μM);

Glibenclamide (10µM) or 4-AP [WKY maximum response to PE (10 µM) = 23± 4;

37.5± 4; 28.6 ± 7; 33± 3; 38.7± 1 and SHR maximum response to PE (10 µM) =

36.4± 6; 38.5± 4; 35.1 ± 2; 24.2± 3; 42.5 ± 2, p<0.05, n=6].

4. In conclusion, we demonstrated that the -terpineol-induced vasorelaxation in

both SHR and WKY rats is, at least in part, mediated by the endothelium, most

likely via activation of PI3K/ATK and AMPK pathway with increase of eNOS

phosphorylation and NO release and consequently, activation of the NO-cGMP

pathway. Moreover, it seems to involve the EDHF production and potassium

channel activation.

Keywords: monoterpene, vasodilatation, nitric oxide, EDHF

189

INTRODUCTION

Vascular endothelial cells are exposed to numerous endogenous vasoactive

agents, these compounds bind to their respective membrane receptors and elicit a

rise in endothelial [Ca2+]i, which in turn enhances the production and release of a

number of vasodilators, including NO, prostacyclin, and endothelium-dependent

hyperpolarizing factors (EDHF) 1. New findings in the last decade have demonstrated

that the vascular endothelium is an important regulatory organ in maintaining

cardiovascular homeostasis and that endothelial dysfunction, involving alterations of

the L-arginine NO-synthase–soluble guanylyl cyclase pathway, eNOS uncoupling,

EDHF and enhanced production of contracting factors (prostanoids) which has been

associated with hypertension 2-3.

The endothelial nitric oxide synthase (eNOS) has been regarded as the

source of endothelial NO, Ca2+-activated calmodulin is important for the regulation of

eNOS activity. However, other proteins interact with eNOS and regulate its activity

(HSP90, Cav-1, AKT) 4. Proteins kinases, such AKT, AMPK, PKA, CAMKII, have

been proposed phosphorylate sites on eNOS that controlled activity were Ser 1177

as an activator. Further elucidation of therapeutic agents can promote eNOS

coupling and other potential avenues leading to the beneficial actions of NO in the

cardiovascular system 5.

Studies have demonstrated beneficial properties of essential oils in the

cardiovascular system such as antithrombotic, antiplatelet, endothelial protective,

vasorelaxant and hypotensive activities 6-7. Previous studies from Magalhães et.al

(2008) demonstrated that -terpineol induces relaxation in whole mesenteric vascular

bed preparation. Altogether, our preliminary studies indicate that -terpineol induces

endothelium-dependent relaxations in rat mesenteric artery rings by stimulating the

endothelial formation of NO, and is a potent hypotensive agent in vivo in the rat 9.

The major aim of this work is to elucidate the signal transduction pathway

endothelium-dependent relaxations in spontaneously hypertensive rats (SHR) in

response to this monoterpene, using approaches in vitro. We hypothesized the

vasodilator responses to α-terpineol, in SHR, may be involved mediators than NO as

well as K+ channels in small vessels.

190

Fig. 1 Structural formula of a-terpineol

METHODS

Animals

Male SHR and Wistar Kyoto rats (250-300 g) were used for all experiments.

Animals were housed under controlled conditions of temperature (21 1ºC) and

lighting cycle (lights on: 06:00-18:00 h). In addition, they had free access to food

(Labina®, PURINA, Brazil) and tap water. Experimental protocols and procedures

were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the

Biotechnology Center – Federal University of Paraiba (CEPA # 010210).

Reagents

The drugs used were: cremophor EL, dimethyl sulphoxide (DMSO) L-

phenylephrine chloride, acetylcholine chloride, N-nitro-L-arginine methyl esther (L-

NAME), indomethacin, 1H-[1,2,4] oxadiazolo – [4,3-a] quinoxalin – 1 – one (ODQ),

tetraethylanmonium, glibenclaminde, 4-aminopyridin, carybdotoxin, apamin,

bradykinin all from Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO, USA. Hydroxocobalamin

(Bristol-Myers Squibb),

-Terpineol stock solution was prepared in distilled water and kept at -4o C. -

Terpineol was dissolved in a mixture of distilled water and chremophor and diluted to

the desired concentrations with distilled water just before use. The final concentration

of cremophor in the bath never exceeded 0.01% and had no effect when tested in

control preparations (data not shown). Indomethacin was dissolved in 0.5% w/v

sodium bicarbonate and ODQ was dissolved in DMSO. The other compounds were

freely dissolved in distilled water. The composition of the Tyrode’s solution used was

(mM): NaCl, 158.3; KCl, 4.0; CaCl2, 2.0; MgCl2, 1.05; NaH2PO4, 0.42; NaHCO3, 10.0

and glucose, 5.6.

191

Cell culture

Porcine coronary artery segments were flushed with PBS without calcium to

remove remaining blood. Thereafter, endothelial cells were isolated by collagenase

treatment (type I, Worthington, 1 mg/ml for 12 min at 37 °C), and cultured in culture

dishes containing medium MCDB 131 (Invitrogen) and 15% fetal calf serum

supplemented with penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 U/ml), fungizone (250

μg/ml), and L-glutamine (2mM) (all from Cambrex), and grown for 48–72 h, in 24-well

plates. All experiments were performed with confluent cultures of cells used at first

passage. Cells were exposed to serum-free culture medium in the presence of 0.1%

bovine serum albumin (QBiogene) for 6 h prior to treatment.

Western blot analysis

After treatment, cells were washed twice with PBS and then lysed in extraction

buffer (composition inmM: Tris/HCl 20 (pH 7.5; QBiogene), NaCl 150, Na3VO4 1,

sodium pyrophosphate 10, NaF 20, okadaic acid 0.01 (Sigma), a tablet of protease

inhibitor (Roche) and 1% Triton X-100 (QBiogen). Total proteins (20 μg) were

separated on 8% SDS-polyacrylamide (Sigma) gels at 70 V for 2.5 h. Separated

proteins were transferred electrophoretically onto polyvinylidine difluoride

membranes (Amersham) at 100 V for 120 min. Membranes were blocked with

blocking buffer containing 3% bovine serum albumin for p-AMPK, p-Akt and p-eNOS,

Tris buffered saline solution (Biorad) and 0.1% Tween 20 (Sigma) (TBS-T) for 1 h.

For detection of phosphorylated proteins, membranes were incubated with the

respective primary antibody (p-AMPKα Tyr172, p-Akt Ser473 and p-eNOS Ser1177,

Cell Signaling Technology; dilution of 1:1000) overnight at 4 °C. After washing,

membranes were incubated with the secondary antibody (peroxidase-labeled anti–

rabbit IgG, dilution of 1:5000; Cell Signaling Technology) at room temperature for 60

min. Prestained markers (Invitrogen) were used for molecular mass determinations.

Immunoreactive bands were detected by enhanced chemiluminescence

(Amersham). Ponceau staining was performed to verify the quality of the transfer and

equal amounts of proteins in each lane.

192

Determination of NO formation

Bioavailability of NO in the cultured endothelial cells was quantified exposing

cells to -terpineol (10-4 M) for 15 min after pre-incubation with 10 μM DAF-2DA for

30 min at 37 °C. The endothelial cells were also stimulated with bradikinin (BK) (10-5

μM for 15 min before DAF administration. Treatments were performed in triplicate.

The DAF-2DA used in the present study is a fluorescent indicator that enables direct

detection of NO under physiological conditions using flow cytometry 10.

In the present study, the low concentrations of NO released from endothelial

cells under basal conditions could be detected by DAF-2DA, evidenced as a small

increase of fluorescence intensity. To verify whether the fluorescent signal obtained

after the addition of DAF-2DA was dependent on the presence of NO, endothelial

cells were pre-incubated with L-NA (100 mol ⁄ L) for 30 min before the addition of

DAF-2DA and α-terpineol. Samples were analysed by cytometry using CeligoTM

adherent cell cytometer equipment (Cyntellect, San Diego, CA, USA). Data were

analysed by Celigo software. Thus, changes in [NO]i were expressed as F ⁄ F0,

where F is the fluorescence of the sample and F0 is the minimum (basal)

fluorescence. Results are expressed as the mean ± SEM of three independent

experiments performed in triplicate.

Vascular reactivity studies in isolated rat superior mesenteric rings

SHR and Wistar Kyoto rats were euthanized by stunning and bleeding. The

superior mesenteric artery was removed and cleaned from connective tissue and fat.

Whenever appropriated, the endothelium was removed by gently rubbing the intimal

surface of the vessels. Rings (1-2 mm) were obtained and placed in physiological

Tyrode’s solution, maintained to 37oC and gassed with carbogenic mixture (95 % O2

and 5 % CO2) and maintained at pH 7.4. All preparations were stabilized under a

resting tension of 0.75 g for 1 h. The solution was replaced every 15 min to prevent

the accumulation of metabolites11. The force of contraction was isometrically

recorded by a force transducer (Miobath-4, WPI, Sarasota, FL, USA) coupled to an

amplifier-recorder (Miobath-4, WPI, Sarasota, FL, USA) and to a computer equipped

with an analog–to–digital converter board.

193

The presence of functional endothelium was assessed by the ability of

acetylcholine (10 µM) to induce more than 85 % relaxation of vessels pre-contracted

with phenylephrine (10 µM) and the absence, less than 10% of relaxation to

acetylcholine was taken as an evidence that the vessel segments were functionally

denuded of endothelium12. The inhibitors were added 30 minutes before the

application of phenylephrine. In the tonic phase of the second contraction, α-terpineol

(10-12 to 10-5 M) was cumulatively added to preparations until a maximum response

for the addition was observed as indicated by a plateau response (approximately 2-3

minutes). Inhibition was calculated by comparing the response elicited by α-terpineol

before and after the inhibitors or antagonists were added to the preparation.

Experimental protocols

# Effect of α-terpineol on sustained contractions induced by phenylephrine (10 µM) in

isolated preparations of SHR rat mesenteric rings and control normotensive (WKY).

After a stabilization period, rings from SHR and WKY rats with or without

functional endothelium were used in these experiments. Two successive contractions

of similar magnitude were induced by phenylephrine 10 µM, separately. During the

tonic phase of the second contraction, α-terpineol (10-12 – 10-5 M) was cumulatively

added to preparations until a maximum response for the drug was observed as

indicated by a plateau response (approximately 2-3 minutes). The relaxation was

measured by comparing the developed tension before and after addition of α-

terpineol and Emax values were calculated as previously described.

# Influences of NO/cGMP signaling on the vasorelaxant effects of α-terpineol in SHR

and control normotensive (WKY).

The vasorelaxant responses to the test drugs are expressed as a percentage

of the tonic contraction induced by phenylephrine 10 µM. Preparations were exposed

to: a) L-NAME (100 M), a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor [13] ; b)

hydroxocobalamin (30 M) a nitric oxide (NO) scavenger [14]; c) ODQ (10M), a

194

soluble guanylate cyclase (sCG) inhibitor [15]; and α-terpineol (10-12 to 10-5 M) was

cumulatively added to preparations until a maximum response.

# Investigation of the putative role of muscarinic receptors, cyclooxygenase, in

endothelial-dependent vasorelaxant effect induced by α-terpineol in SHR rats and

control normotensive.

PHE-induced sustained contractions were obtained in intact rings in both SHR

and WKY rats, previously incubated with atropine (1M) muscarinic receptors [16]

blocker or indomethacin (10 μM) a cyclooxygenase (COX) inhibitor [17], separately.

Then, concentration–response curves to α-terpineol (10-12 – 10-5 M) were obtained.

# K+ channels-Mediated Endothelium-Dependent Vasodilation α-terpineol-induced

PHE-induced sustained contractions were obtained in intact rings previously

incubated with KCl 20mM or TEA, a calcium-activated K+ channels (KCa) blocker [18]

Charybdotoxin (0.2 M) plus apamin (0.2 M) a calcium-activated K+ channels (IKCa

or SKca) blocker [19] Glibenclamide (10 M) KATP blocker, 4-Aminopyridine (1mM), a

voltage activated K+ channels (KV) blocker [20].

Data analysis

Values were expressed as mean ± S.E.M. When appropriate, statistical

significance was determined by one-way ANOVA following Bonferroni’s post-test,

using GraphPad Prism© software, version 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla,

CA, USA). The maximal relaxation corresponds to the maximum response to PE (10

µM) of the highest concentration used. Values of P<0.05 were considered statistically

significant.

195

RESULTS

# Effect of α-terpineol on sustained contractions induced by phenylephrine (10 µM) in

isolated preparations of SHR rat mesenteric rings.

The chemical structure of α-terpineol is represented in Fig. 1. The effects of α-

terpineol on the cumulative concentration–response curves for phenylephrine on

isolated SHR and WKY rat mesenteric arteries are shown in Fig. 2 and Table 1 for

Emax values. The Emax values for phenylephrine in endothelium-intact or -denuded

rings were depressed in the presence of increasing concentrations α-terpineol (10-12

to 10-5 M) in isolated preparations of SHR rat mesenteric rings and WKY. α-Terpineol

induced vasorelaxation, in a concentration-dependent manner with endothelium-

intact (WKY maximum response to PE (10 µM) = 60 4 or SHR maximum response

to PE (10 µM) = 53.7 ± 3, p<0.05, n=9). After removal of vascular endothelium, the

relaxant response induced by α-terpineol was significantly attenuated for WKY

[maximum response to PE (10 µM) = 20.5 1*] and SHR [maximum response to PE

(10 µM) 16.1 ± 3*, p<0.05, n=8]

Figure 2. Concentration-response curves showing the relaxant effect of α-terpineol (10-12 to 10-5). The response is expressed as a percentage of relaxation in phenyephrine-induced contraction. Each data point represents the mean±s.e.m from

9 experiments. * P 0.05 indicates significant differences between maximum response to PE (10 µM) (one-way ANOVA following Bonferroni’s post-test). Values of

the (▲) WKY: Intact endothelium or ( ) Denuded endothelium; ( ), SHR: Intact

endothelium or ( ) Denuded endothelium. # Influences of NO/cGMP signaling on the vasorelaxant effects of α-terpineol in SHR.

196

Since α-terpineol induced endothelium-dependent relaxation in spontaneously

hypertensive rats or control normotensive isolated mesenteric arteries, an attempt

was made to investigate the endothelium-derived vasoactive factors implicated in this

relaxation. The vasorelaxant responses induced by increasing concentrations of α-

terpineol (10-12 to 10-5 M) were significantly rightward shifted in the presence of NO-

synthase inhibitor (L-NAME 100 M) in SHR and WKY rats. [WKY maximum

response to PE (10 µM) = 18.1 ±3.8 and SHR maximum response to PE (10 µM) =

20.1± 3, p>0.05] (Figure 2 and Table 1).

Figure 3. Concentration-response curves showing the relaxant effect of α-terpineol (10-12 to 10-5). The response is expressed as a percentage of relaxation in phenyephrine-induced contraction. Each data point represents the mean±S.E.M from

8 experiments. p 0.05 indicates significant differences between maximum response to PE (10 µM) (one-way ANOVA following Bonferroni’s post-test). Values of the Intact

endothelium ( ) or ( ) Denuded endothelium, L-NAME (), or Hydroxocobalamin () or ODQ ().

In the presence of hydroxocobalamin (30 μM) for WKY [maximum response to

PE (10 µM) = 23.5 ± 7 and SHR maximum response to PE (10 µM) = 17.3 ± 3 or

197

ODQ (10 μM) for WKY [maximum response to PE (10 µM)= 20.8 ± 1 and SHR

maximum response to PE (10 µM) = 18.1 ± 3*, the relaxation induced by increasing

concentrations of α-terpineol was significantly shifted to the right in a similar

proportion to that obtained in endothelium denuded or L-NAME pre-incubated rings

(Figure 2 and Table 1).

# Investigation of the putative role of muscarinic receptors, cyclooxygenase, in

endothelial-dependent vasorelaxant effect induced by α-terpineol in SHR.

Treatment with cyclooxygenase inhibitor indomethacin (10 μM) for WKY

[maximum response to PE (10 µM) = 61.1 ± 5] and SHR [maximum response to PE

(10 µM) = 53.1 ± 4, p<0.05] in isolated rat superior mesenteric rings with intact

endothelium pre-contracted with phenylephrine (10 μM), had no significant effect on

α-terpineol-induced relaxations. Furthermore, relaxing effect induced by the α-

terpineol was not altered (Figure 4 and Table 2) after pre-incubation of endothelium-

intact rings with atropine (1ηM) for WKY [maximum response to PE (10 µM) = 53.3 ±

8 and SHR maximum response to PE (10 µM) = 41.5 ± 2, a competitive antagonist

for the muscarinic acetylcholine receptor, suggesting muscarinic acetylcholine

http://en.wikipedia.org/wiki/Competitive_antagonist

http://en.wikipedia.org/wiki/Muscarinic_acetylcholine_receptor



198

receptor or that COX-derived products are not involved in the relaxation induced by

α-terpineol

Figure 4. Concentration-response curves showing the relaxant effect of α-terpineol (10-12 to 10-5). The response is expressed as a percentage of relaxation in phenyephrine-induced contraction. Each data point represents the mean±S.E.M from 6 experiments. * P<0.05 indicates significant differences between maximum response to PE (10 µM) (one-way ANOVA following Bonferroni’s post-test). Values of the Intact endothelium after pre-incubation of intact endothelium rings with atropine (1ηM) (), or indomethacin (10 μM) ().

# K+ channels-mediated endothelium-dependent vasodilation α-terpineol-induced

199

PHE-induced sustained contractions were obtained and observed that

vasorelaxant response induced by α-terpineol was reduced in preparations with

endothelium pre-treated with KCl 20mM (efflux modulate) [WKY MR to PE (10 µM) =

23± 4* and SHR MR to PE (10 µM) = 36.4± 6, p<0,05, n=6] or TEA, 1mM, at this

concentration TEA is a non-selective BKCa blocker [WKY [MR to PE (10 µM) = 37.5±

4 and SHR MR to PE (10 µM) = 38.5± 4].

In experiments with charybdotoxin (200M) plus apamin, a blocker of SKCa,

IKCa [WKY MR to PE (10 µM) = 28.6 ± 7 and SHR MR to PE (10 µM) = 35.1 ± 2,

p<0.05, n=6] or Glibenclamide (10 M) KATP blocker [WKY MR to PE (10 µM) = 33± 3

and SHR MR to PE (10 µM) = 24.2± 3*]; or 4-Aminopyridine (1mM), a voltage

activated K+ channels (KV) blocker [WKY MR to PE (10 µM) = 38.7± 1* and SHR MR

to PE (10 µM) = 42.5 ± 2*] the relaxant response induced by α-terpineol was

significantly attenuated (Figure 5 and table 3).

200

Figure 5 Concentration-response curves showing the relaxant effect of α-terpineol (10-12 to 10-5). Values of the Intact endothelium after pre-incubation of intact

endothelium rings with (), A. In the presence of KCl 20mM () or TEA (1mM) () WKY and SHR; or 4-AP (1mM) () or Glibenclamide (10 μM) () and SHR; or Charybdotoxin plus apamin () and SHR.

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

-Terpineol (Log M)

Intact endothelium KCl 20mM

Emax= 23 4

Intact endothelium - Phe 10 M

Emax= 60 4

WKY

TEA (1mM)

Emax=37.5 4

** *

**

%

of

maxim

al re

sp

on

se

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

-Terpineol (Log M)

Intact endothelium KCl 20mM

Emax= 36.4 6 *


Emax= 53.7 3

SHR

TEA (1mM)

Emax= 38.5 4*

**

*

*

%

of

maxim

al re

sp

on

se

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

0

20

40

60

-Terpineol (Log M)

4-AP 1mM

Emax= 38.7 1*

Intact endothelium - Phe 10M

Emax= 60 4

WKY

Glibenclamide 10 M

Emax = 33 3*

**

**

*

*

%

of

maxim

al re

sp

on

se

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

-Terpineol (Log M)

4-AP 1mM

Emax= 42.5 2*


Emax= 53.7 3

SHR

Glibenclamide 10 M

Emax= 24.2 3*

**

**

*

**

**

*

%

of

maxim

al re

sp

on

se

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

-Terpineol (Log M)

Charybdotoxin (0.2M) + Apamin (0.2M)

Emax= 28.6 7

Intact endothelium - Phe 10M

Emax= 60 4

WKY

* * * * **

*

%

of

maxim

al re

sp

on

se

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

-Terpineol (Log M)

Charybdotoxin (0.2M) + Apamin (0.2M)

Emax= 35.1 2 *


Emax= 53.7 3

SHR

**

**

*

*

%

of

maxim

al re

sp

on

se

201

# α-Terpineol and insulin causes the activation of eNOS

Experiments were performed to determine whether this signaling pathway is

also involved in α-terpineol-induced NO-mediated relaxations in mesenteric arteries

are critically dependent eNOS activation. Unstimulated endothelial cells had no

expression of p-eNOS, α-terpineol increased within 5 min signal of p-eNOS and,

thereafter, this signal evolved differentially, returned to baseline at 180 min. For

positive control we observed that insulin-stimulated conditions by p-eNOS Ser 1177

(Fig 6 Fig 7).

A

B

Figure 6. Insulin caused a time-dependent phosphorylation of eNOS at Ser1177 (A) and (B) dose-dependent phosphorylation of eNOS and pAKT.

Figure 7 α-Terpineol caused a time-dependent phosphorylation of eNOS at Ser1177 and total eNOS

202

# Role of protein kinase AKT in α-terpineol-induced eNOS activation

To better characterize the signaling pathway involved in eNOS activation in

response to α-terpineol, levels of p-Akt and p-eNOS were assessed in endothelial

cells by immunoblotting. α-Terpineol increased within 5 min signals of p-Akt and p-

eNOS and, thereafter, these signals evolved differentially. Compared to vehicle

stimulation, insulin-evoked robust increases in p-Akt S473 and p-eNOS S1177 5, 30,

60 and 180 min, associated the α-terpineol-induced effect.

Figure 8: α-Terpineol caused a time-dependent phosphorylation of eNOS and pAKT. Representative traces of 4 separate experiments performed in triplicate. Bar graphs showing the effects of α-terpineol (10-4 M) in time-course (5 min- 180 min).

203

In addition, was assessed dose-response to α-terpineol to eNOS activation in

response in endothelial cells by immunoblotting. Compared to vehicle stimulation,

insulin-evoked robust increases in levels of p-eNOS S1177 and p-AKT S473. α-

Terpineol increased within 30 min signals in concentration-dependents of p-Akt and

p-eNOS and, thereafter, these signals evolved differentially.

Figure 9: α-Terpineol caused a time-dependent phosphorylation of eNOS and pAKT. Representative traces of three separate experiments performed in triplicate. Bar graphs showing the effects of α-terpineol (10-4 M) in time-course (5 min- 180 min).

204

# Role of protein kinase AMPK in α-terpineol-induced eNOS activation

Indeed, phosphorylation of pAMPKα was an early and transient event, which

reached a peak value within 15 min and then returned to baseline at 30 min. In

contrast, the level of p-Akt and p-eNOS was detected after 5 min and then increased

steadily until 60 min. These data indicate that α-terpineol, act on upstream mediators

of the activation of the PI3-kinase/Akt pathway and AMPK leading to eNOS

phosphorylation.

Figure 9 α-Terpineol caused a time-dependent phosphorylation of eNOS and pAKT. Representative traces of three separate experiments performed in triplicate. Bar graphs showing the effects of α-terpineol (10-4 M) in time-course (5 min- 180 min).

205

# α-Terpineol stimulates the formation of NO in endothelial cells

Next, experiments were performed to provide direct evidence that α-terpineol

induces NO formation in porcine coronary artery endothelial cells using flow

cytometry. Exposure of cells to α-terpineol induced about a 1.5-fold increase in the

formation of NO (Fig. 10). The stimulatory effect was abolished by L-NA.

Figure 10: Nitric oxide (NO) generation by a rabbit aorta endothelial cell line (10-6 cells⁄mL) was estimated using diaminofluoresceindiacetate (DAF-2DA). Representative traces of three separate experiments performed in triplicate. Bar graphs showing the effects of BK (positive control), α-terpineol (10-4 M) alone, and in

the presence of 100μM L-NAME, p 0.05.

M-4

Bra

dikin

in 1

0M-4

-terp

ineo

l 10

M-4

-terp

ineo

l 10

L-NA +

0

20

40

60

NO

Rele

ase (

Flu

ore

sce

nce,

%)

206

DISCUSSION

In this report, we sought to clarify the underlying mechanisms by which α-

terpineol elicits its vasodilation in spontaneously hypertensive rats (SHR) and

normotensive control (WKY). The major findings of this work were that the

monoterpene α-terpineol induces decrease of peripheral vascular resistance

mediated by increases in NO release and consequently activation of the NO-GMPc

pathway, EDHF and K+ channels participation activation in spontaneously

hypertensive rats and their normotensive controls.

The vascular endothelium, releasing nitric oxide and endothelium- derived

hyperpolarizing factors (EDHFs), is known to play an important role in regulating the

tone of arterial resistance vessel. Essential hypertension is characterized by impaired

endothelium-dependent vasodilation as the result of a reduction in NO oxide

availability. Through the activation of NO synthase, α-terpineol enhances the release

of NO from the endothelium and induces a relaxation of the vascular smooth muscle

cell in normotensive rats [9].

Thus, we performed experiments in isolated superior mesenteric arteries of

the spontaneously hypertensive rats (SHR) and normotensive control (WKY). We

found that under this controlled conditions, α-terpineol induced vasorelaxation that

was significantly attenuated after removal of the functional endothelium.

In order to investigate whether the vasodilator effect of α-terpineol is

dependent on NO-cGMP and/or endothelium derived hyperpolarizing factor (EDHF)

pathways, in this way contribute to the relaxing effect verified in our experiment. The

present study suggests that the vasodilator effect of the α-terpineol partially depends

on the release of NO from the endothelial cells, in presence of a NOS inhibitor and a

NO scavenger the concentration-response curves to α-terpineol were shifted to the

right, suggesting that EDRFs (at least NO) play an important role in the α-terpineol-

induced vasorelaxant response. In contrast, infusion of the NOS inhibitor (L-NAME)

plus L-arginine decreased the vasorelaxation produced by α-terpineol, suggesting

that L-arginine, in the presence of a NOS inhibitor, improves NO-dependent

vasorelaxation in isolated superior mesenteric arteries of the spontaneously

hypertensive rats (SHR) and Wistar Kyoto normotensive control (WKY). Moreover,

the present findings provide also direct evidence that α-terpineol activates eNOS as

indicated by the L-NAME sensitive formation of NO and the enhanced

207

phosphorylation of eNOS at Ser1177 in endothelial cells. These data corroborate

with Ribeiro et al. (2010) with mesenteric arteries of Wistar rats and Magalhães et al.

(2008) where α-terpineol-evoked vasorelaxation were also significantly reduced by L-

NAME in rat mesenteric vascular bed preparations. The latter effect is a novel finding

that may be important to the understanding of monoterpenes biological activity.

Interestingly, α-terpineol induced p-eNOS S1177 to total eNOS increased

phosphorylation maximal between 30 and 60 min in cultured endothelial cells.

Additional eNOS phosphorylation sites that are specifically activated by AMPK and

AKT were also evaluated. These data suggest that in our experimental setting, eNOS

might be preferentially phosphorylated by AKT but not by AMPK mediated signalling.

These data demonstrated that signalling kinases are important upstream activators of

phosphorylation of eNOS S1177 α-terpineol-induced in endothelial cells.

Vascular NO dilates all types of blood vessels by stimulating soluble guanylyl

cyclase and increasing cGMP in smooth muscle cells22 and subsequent cGMP-

dependent protein kinase (PKG) activation23. However, NO has been proposed to

mediate a variety of effects via cGMP-independent mechanisms24. Therefore, in

order to verify the participation of NO/GMPc pathway, we incubated the preparations

with ODQ. Under this condition, the concentration-response curve to α-terpineol was

shifted to the right, suggesting that the relaxant response elicited by the α-terpineol

involves the NO/sGC/GMPc pathway (Figure 3 and Table 1).

Furthermore, after its synthesis and release, NO diffuses to adjacent smooth

muscle cells and causes them to relax22. Therefore, many studies have been

performed to directly measure vascular relaxation elicited by natural products and

found that the vasorelaxant effect is related to stimulation of NO release from

vascular tissues9,25-26.

Our results suggest that the cardiovascular effects induced by α-terpineol

could be partially mediated by activation of eNOS and consequently NO production.

To assess whether enhanced NO release by α-terpineol was associated to the

activation of muscarinic receptors, the effects of atropine on the endothelium-

dependent relaxation response to α-terpineol were investigated. Thus, pre-incubation

of the mesenteric rings with atropine did not affect the vasorelaxation induced by α-

terpineol. These findings indicated that the α-terpineol-induced vascular relaxation

does not involve the activation of muscarinic receptors in the vasculature. (Figure 4

and Table 2).

208

It is reported in the literature that the endothelium-dependent vasorelaxant

response may also involve the release of COX-derived products, such as PGI2, via

the COX pathway. To determine if the vasorelaxant effect induced by α-terpineol

involves COX metabolites, we incubated the preparations with 10 µM indomethacin.

In this condition the relaxation induced by increasing concentrations of α-terpineol

was not affected, suggesting that COX-products are not involved in the vasorelaxant

response induced by α-terpineol. (Figure 4 and Table 2).

The role of K+ channels in the nitric oxide-induced vasorelaxation has been

largely investigated in resistance vessels [27,28]. Moreover, K+ channels play an

important role in the regulation of contractility and vascular tone [18]. In most cases,

the vasorelaxation mediated by membrane hyperpolarization is attributed to the rise

in K+ permeability. Therefore, hyperpolarization of the endothelium membrane

elevates [Ca2+]i by an increase in Ca2+ influx that induces relaxation of the underlying

smooth muscle [29] through endothelium-derived hyperpolarizing factors (EDHFs) and

the generation of nitric oxide and prostacyclin. Several types of potassium channels

have been proposed to regulate endothelial membrane potential, including large

conductance, BKCa, Kir, SKCa and IKCa channels[18]. KATP, KV which can be blocked by

glibenclamide and 4-AP, respectively.

In this context, α-terpineol -induced vasorelaxation curve was right shifted in the

presence of KCl (20 mM), suggesting a role for K+ channels activation in

spontaneously hypertensive rats and normotensive control. Therefore, we further

investigated the effect of α-terpineol in spontaneously hypertensive rats and

normotensive control mesenteric rings with intact endothelium in the presence of

glibenclamide (10 µM), a potassium channel ATP-sensitive (KATP) blocker. Under this

experimental condition, glibenclamide attenuated the vasorelaxation induced by α-

terpineol. It has been reported in the literature that the subtype of K+ channels that

plays a role in NO-GMPc relaxation pathway is the KATP in most arteries [18].

In addition, the nitric oxide pathway has been shown to activate calcium-

activated K+ channels (KCa) in mesenteric arteries. The KCa channels are classified by

their conductances as follows: BKCa, IKCa and SKCa channel [32-33]. In the present

experiments, were used TEA, sensitive to all BKCa channels, apamin to SKCa

channels and charybdotoxin to IKCa channels. SKCa and IKCa channels in vascular

endothelium appear to have particularly prominent roles, since inhibition of these

channels prevents EDHF mediated vasodilation [1, 18, and 28]. In our experiments,

209

treatment with TEA (1 mM) and charybdotoxin plus apamin (0.2μM) produced a shift

to the right of the concentration–response curves for α-terpineol, suggesting a role for

BKCa, IKCa, SKCa channels endothelium-dependent in spontaneously hypertensive

rats and normotensive control (Figure 5; Table 3).

In conclusion, using combined functional and pharmacological approaches, we

have demonstrated that, α-terpineol produces vasorelaxation in both SHR and WKY

rats, mediated by the endothelium via activation of AKT and AMPK upstreams

pathway to eNOS phosphorylation and increase of NO levels and consequential NO-

GMPc pathway. In addition, we indicate that effect endothelium-dependent induced

by α-terpineol evokes, at least, EDHF production and potassium channel activation.

Altogether, these findings should provide convincing evidence that α-terpineol uses

several signal transduction pathways to enhance the endothelial formation of NO,

and hence to increase the protection of the vascular system. This vascular activation

has potential benefits including (1) improved endothelial function via greater

vasodilatation of resistance arteries and (2) analyses performed in cultured cell

systems must be validated in vivo models in order to more fully delineate the

endothelial dysfunction in normal physiology and in disease states, such

hypertension.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors wish to express their sincere thanks to José Crispim Duarte, Evelyne

Lacoffrette, Dr. Christian Müller and collaborators for technical assistance. This work

was funded by CAPES and CNPq-Brazil.

210

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