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UTILISATION PRÉVUELe test Fungitell® est un test colorimétrique à base de zymogène de type sérine protéase pour une détection qualitative du (1→3)-β-D-glucane dans le sérum de patients ayant des symptômes ou des conditions médicales les prédisposant à une infection fongique invasive. La concentration du sérum en (1→3)-β-D-glucane, un composant principal de la paroi cellulaire de plusieurs champignons dont, l’importance médicale est reconnue1, pourrait aider à diagnostiquer des mycoses profondes et des fongémies2. Un test positif n’indique pas le genre de champignon en cause dans l’infection.Les dosages du (1→3)-β-D-glucane devraient être utilisées conjointement avec d’autres méthodes diagnostiques, telles que la culture microbiologique, l’examen histologique de biopsies et de radiographies.

IMPORTANT Fournir cette information au médecin traitant : Certains champignons, du genre Cryptococcus qui produisent de très faibles taux de (1→3)-β-D-glucan, pourraient ne pas avoir un sérum (1→3)-β-D-glucan assez élevé pour être détecté par le test3,4. Les infections dues à des champignons d’ordre mucorales tel que l’absidia, le mucor et le rhizopus1,4 qui ne sont pas connus pour produire du (1→3)-β-D-glucan, produisent également de faibles titres de sérum (1→3)-β-D-glucane. De plus, dans la phase levure le Blastomyces dermatitidis produit peu de (1→3)-β-D-glucan et ne pourrait être détecté par le test5.

Inclure cela dans les rapports de résultats du test Fungitell®.

RÉSUMÉ ET EXPLICATIONIl y a une croissance de l’incidence des infections fongiques due à des infections opportunistes, notamment chez les patients immunodéficients6,7,8. Les maladies fongiques invasives, tout comme les infections opportunistes, sont fréquentes parmi les malades du SIDA et ceux présentant des hémopathies malignes et compte pour une nombre croissant des infections nosocomiales, notamment chez les bénéficiaires d’une transplantation d’organe et autres patients recevant des traitements immunosuppresseurs9,10. Plusieurs maladies fongiques sont contractées par l’inhalation de spores fongiques venant du sol, de détritus végétaux, de systèmes de traitement de l’air et des surfaces exposées. Certains champignons opportunistes sont présents dans et sur la peau humaine, le tube digestif et les muqueuses11,12. Le diagnostic des mycoses invasives et des fongémies se fait en général sur un diagnostic non spécifique ou sur des techniques radiologiques. Des marqueurs biologiques d’infection fongique ont été récemment ajoutés aux méthodes diagnostiques actuellement disponibles2.Les organismes pathogènes fongiques opportunistes inclus le Candida spp., l’Aspergillus spp., le Fusarium spp., le Trichosporon spp., le Saccharomyces cerevisiae, l’Acremonium spp., le Coccidioides immitis, l’Histoplasma capsulatum, le Sporothrix schenckii, l’Exserohilum rostratum, et le Pneumocystis jirovecii. Le (1→3)-β-D-glucane produit par ces organismes, et autres, peut être détecté par le test Fungitell®1,8,13,14.

PRINCIPLE DE LA PROCÉDURELe test Fungitell® mesure la quantité de (1→3)-β-D-glucane. Le test se base sur une modification de la trajectoire du lysat d’amibocytes de limule (LAL)15,16,17,18, Figure 1. Le réactif Fungitell® modifié élimine toute réactivité endotoxine bactérienne et réagit seulement au (1→3)-β-D-glucane, a travers le facteur G-médiane du côté de la trajectoire. Le (1→3)-β-D-glucane active le facteur G, un zymogène de type sérine protéase. Le facteur G activé transforme l’enzyme pro-coagulante inactive en une enzyme coagulante active, qui à son tour coupe la para-nitroaniline (pNA) du substrat peptidique chromogène, Boc-Leu-Gly-Arg-pNA, créant un chromophore, para-nitroaniline, qui absorbe à 405 nm. L’étude cinétique du Fungitell®, décrite ci-dessous, se base sur la détermination du taux d’augmentation de la densité optique produite par un échantillon. Ce taux est interprété à la lumière d’une courbe standard produisant des estimations de concentration de (1→3)-β-D-glucane dans l’échantillon.

MATERIAUX FOURNIS AVEC LE KIT FUNGITELL®

Le kit Fungitell® est destiné à être utilisé pour un diagnostique in vitro. Les matériaux suivants fournis avec chaque kit suffisent pour tester 110 puits sur deux plaques de microtitration (55 puits chacune) :

1. Le réactif Fungitell® , un (1→3)-β-D-glucane lyophilisé spécifique LAL (deux flacons)

2. Le tampon de reconstitution Pyrosol® (deux flacons). D’autres flacons de tampon de reconstitution Pyrosol® (N° de catalogue BC051) pourraient être achetés séparément.

3. Du Glucane standard, le contenu en (1→3)-β-D-glucane est indiqué sur l’étiquette (deux flacons)4. De l’eau de qualité réactive (Reagent Grade Water, RGW) (deux bouteilles)5. Une solution alcaline de prétraitement (deux flacons)

Tous ceux-ci sauf l’étalon, ne devraient pas interférer avec les niveaux de (1→3)-β-D-glucane.

MATÉRIAUX NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNISTous les matériaux ne doivent pas interférer avec le glucane. Les verres doivent être dépyrogénés pendant au moins 7 heures à une température minimale de 235 °C (ou dans des conditions équivalentes) pour être utilisables.

1. Embouts de pipette* (250 μl - N° de catalogue PPT25, 1000 μl - N° de catalogue PPT10)

2. Des pipettes pouvant fournir des volumes de 5-25 μl et 100-1000 μl3. Une pipette automatique avec embouts pour seringue pouvant fournir 100 μl4. Des tubes à essai* (courbe de calibrage) pour la préparation des series standards et la combinaison

des réactifs de traitement du serum. (12 x 75 mm - N° de catalogue TB240 ou 13 x 100 mm - N° de catalogue TB013)

5. Lecteur de plaque d’incubation (37 °C) capable de lire à 405 nm (de préférence capable d’une surveillance à double longueur d’ondes à 405 et 490 nm) avec une plage dynamique allant jusqu’à, 2,0 unités d’absorbance au moins, couplé avec un logiciel informatique approprié de test cinétique.

6. Des tubes stériles, sans glucane, avec des bouchons à vis pour l’aliquotage des échantillons (la plupart des tubes certifiés sans RNAse, DNAse, et pyrogène n’interfèrent pas avec les niveaux de (1→3)-β-D-glucane).

7. Parafilm®

8. Microplaques* à 96 puits Remarque : les exigences du test Fungitell® ont été validées avec des plaquesprésentant les caractéristiques suivantes : en polystyrène, stériles, non revêtues, à fond plat, sans bêta-glucane interférent (selon les spécifications d’Associates of Cape Cod, Inc.) et emballées séparément.

* Ces produits, fournis par Associates of Cape Cod, Inc. (ACC), sont certifiés non interférents avec lesglucanesAttention - les pipettes en verre avec des bouchons en coton et les embouts de micro-pipette en filtres cellulosiques sont des sources potentielles de contamination de glucane.

MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONSCe produit est indiqué pour un DIAGNOSTIC IN VITRO.

Le test Fungitell® nécessite qu’une attention rigoureuse soit portée sur l’environnement et à la technique du test. Une formation complète du technicien à la méthode de dosage et à éviter la contamination est essentielle pour l’efficacité du test.

1. Certaines espèces de champignons produisent très peu de (1→3)-β-D-glucane et ne sont généralement pas détectés par le test Fungitell®. Il s’agit notamment du genre cryptococcus3,4 ainsi que les mucorales tel que l’absidia, le mucor et le rhizopus1,4. De plus, le Blastomyces dermatitidis, sous sa forme de levure, produit peu de (1→3)-β-D-glucane et n’est donc pas détecté généralement par le test Fungitell®5.

2. Ne pas pipetter à la bouche. Ne pas fumer, manger ou boire dans les zones où des prélèvements ou des réactifs du kit, sont manipulés. Respecter les consignes de sécurité locales et celles de l’entreprise.

3. Créez un environnement propre pour réaliser le test. Utilisez des matériaux et des réactifs certifiés exempts des quantités de base de (1→3)-β-D-glucane détectables. Notez que le glucane comme toute contamination fungique venant du corps humain, des vêtements, des contenants, de l’eau et des poussières pourrait interférer avec le test Fungitell®. Les matériaux cellulosiques tels que les gazes, le papier absorbant et les cartons d’emballage pourraient apporter du (1→3)-β-D-glucane dans l’environnement ou le test est réalisé.

4. Ne pas utiliser des réactifs après leur date d’expiration.5. Les échantillons de couleurs non attendues ou troubles, par exemple, ceux qui sont fortement

hémolysés, lipémiques, ou qui contiennent un excès de bilirubine pourraient créer une interférence optique avec le test. Si de tels échantillons sont testés, les résultats du test devraient être examinés à la recherche de preuves d’interférences optiques et de schémas cinétiques inhabituels.

6. Utilisez des vêtements de protection appropriés et des gants non poudrés lorsque vous manipulez les échantillons de patient.

7. Le serum des patients hémodialysés pourrait contenir un taux élevé de (1→3)-β-D-glucane lorsqu’on utilise certaines membranes de dialyses en cellulose19,20,38. Hémodialyse avec le triacétate de cellulose, les membranes en polysulfone ou en polyméthacrylate de méthyle ne semblent pas influer sur le test.

8. Les gazes et les éponges chirurgicaux peuvent libérer un fort taux de (1→3)-β-D-glucane qui pourrait provoquer un résultat temporairement positif, due à la contamination, au test Fungitell® comme cela à été observé chez des patients opérés21,22.

9. Les produits de fractionnement du plasma tel que l’immunoglobuline intraveineuse et l’albumine peuvent aussi être chargés de (1→3)-β-D-glucane qui, s’il est injecté ou infusé, augmentera les titres de (1→3)-β-D-glucane dans le serum pendant quelques jours23.

10. Ne pas utiliser des kits avec des contenus endommagés.11. Les matériaux exposés à des fluides éventuellement contaminés (contenant des pathogènes) doivent

être éliminés suivant la règlementation locales.

STOCKAGE DES RÉACTIFSStockez tous les réactifs, tels que fournis, entre 2 et 8 °C à l’abri de la lumière. Le réactif reconstitué Fungitell® doit être stocké entre 2 et 8 °C et être utilisé dans 2 heures qui suivent. Le réactif reconstitué Fungitell® peut également être congelé à -20 °C pendant au plus 20 jours et utilisé une fois décongelé.

MANIPULATION DES ÉCHANTILLONS1. Collecte des échantillons : Les échantillons de sang peuvent être recueilli dans des tubes stériles de

préparation de sérum ou dans des tubes séparateurs de sérum (SST) pour la préparation du sérum.

2. Conservation des échantillons : Les échantillons de serum peuvent être conservé temporairement entre 2 et 8 °C avant le test, ou congelés à -20 °C ou moins pour une conservation à plus long terme.

3. L’étiquetage des échantillons : Les échantillons doivent être clairement identifiés conformément aux bonnes pratiques de l’institution.

PROCÉDURERemarque : Les paramètres pourraient varier selon les instruments et les logiciels. En général, ce qui suit s’applique : Configurez le logiciel du lecteur de plaque pour recueillir les données sur le mode vmean. Consultez le manuel du logiciel pour les paramètres appropriés afin de vous assurer que la valeur calculée est le taux moyen de changement de la densité optique pour tous les points de données recueillis. Réglez l’intervalle de lecture du détecteur au minimum autorisé par le logiciel ou l’instrument durant les 40 minutes du test. Les règlages de la longueur d’ondes du logiciel devraient être à 405 nm moins le fond à 490 nm. Lisez le test à 405 nm si la lecture à double longueur d’ondes n’est pas disponible. La temperature d’incubation doit être à 37 °C. Configurez de sorte à commencer le mélange ou l’agitation de la plaque 5 à 10 secondes avant le début de la lecture. Sélectionnez « linéaire » ou l’équivalent pour l’ajustement du paramétrage de la courbe. La lecture devrait commencé sans décalage.

1. Préparation du glucane standard fournit dans le kit.a. Dissolvez un flacon de glucane étalon avec le volume de RGW indiqué sur le flacon, pour obtenir

une solution de 100 pg/ml. Faites tourbillonner pendant au moins 30 secondes d’une vitesse moyenne à une vitesse moyenne élevée pour reconstituer l’étalon (solution 1). La solution de glucane doit être conservée entre 2 et 8 °C et utilisée dans les trois jours. Les étapes b à e ci-dessous donnent un exemple de préparation de schéma d’une courbe standard.

b. Préparez 50 pg/ml de solution étalon (solution 2) en mélangeant 500 μl de RGW et 500 μl de solution 1 dans un tube sans glucane (solution 2). Faire tourbillonner pendant au moins 10 secondes.

c. Préparez 25 pg/ml de solution étalon (solution 3) en mélangeant 500 μl de RGW et 500 μl de solution 2 dans un tube sans glucane (solution 3). Faites tourbillonner pendant au moins 10 secondes.

d. Préparez 12,5 pg/ml de solution étalon (solution 4) en mélangeant 500 μl de RGW et 500 μl de solution 3 dans un tube sans glucane (solution 4). Faire tourbilloner pendant au moins 10 secondes.

e. Préparez 6,25 pg/ml de solution étalon (solution 5) en mélangeant 500 μl de RGW et 500 μl de solution 4 dans un tube sans glucane (solution 5). Faire tourbillonner pendant au moins 10 secondes.

2. Ouvrir la solution alcaline de prétraitement. La solution de prétraitement au sérum alcalin convertie les glucanes à triple-hélices en glucanes monocaténaires17,18 qui sont plus sensible au test. De plus le pH alcalin rend inactif les protéases sanguines et les inhibateurs qui pourraient interférer avec le test24.Jeter le tube (en respectant les procédures du laboratoire) sauf s’il doit être utilisé dans un test subséquent; dans ce cas, le recouvrir avec du Parafilm, en utilisant le côté qui est face au support papier.

3. Entrez les concentrations standards dans les paramètres du logiciel respectivement, 500, 250, 125, 62,5 et 31 pg/ml. Notez que les concentrations standards entrées sont cinq fois plus élevées que celles préparées au point 1. ci-dessus. Cela due au fait que le volume d’étalon utilisé dans le test est de 25 μl par puits, soit cinq fois le volume de l’échantillon de sérum utilisé (voir le point 4.b ci-dessous). Placez la plaque de microtitration dans le logiciel avec les normes (St), les contrôles négatifs (Neg) et 21 inconnues (Uk) chacune dosée en double de la manière suivante :Remarque 1 : Les puits extérieurs peuvent être utilisés, s’il a été prouvé que leur efficacité équivaut à celle des puits internes.Remarque 2 : Pour éviter une contamination accidentelle, remettez le couvercle sur la microplaque après avoir ajouté les échantillons et les réactifs dans les puits. Ôter le couvercle avant de placer la plaque dans le lecteur afin d’éviter une interférence optique due à la condensation.Remarque 3 : Les contrôles négatifs ne sont pas utilisés dans la courbe standard.

4. Ajout de sérum et de réactif de prétraitement.a. Décongelez les échantillons de sérum congelés à température ambiante. Bien mélangez tous les

échantillons en tourbillonnant pendant au moins 30 secondes à vitesse moyenne et moyenne haute.

b. Transférez 5 μl de l’échantillon de sérum dans chacun des puits indiqués (Uk) au moins en double. Répétez l’opération pour chaque échantillon de sérum.

c. Ajoutez 20 µl de la solution de prétraitement alcaline dans chaque puits contenant du sérum. Assurez-vous que le sérum et les gouttelettes de prétraitement soient en contact les uns avec les autres. Remarque : Les étapes b et c peuvent être réalisées dans l’ordre inverse selon la préférence du technicien.

d. Agitez la plaque pendant 5 à 10 secondes afin de mélanger le contenu des puits (vous pouvez utiliser la fonction agitation du lecteur de plaque) puis incuber pendant 10 minutes à 37 °C dans le lecteur de la plaque d’incubation.

5. Reconstitution du réactif Fungitell®. Remarque : Cela pourrait être réalisé pendant que l’incubation de prétraitement est en cours. La cohérence du temps de reconstitution améliorera la reproductibilité puisque la réaction du Fungitell® bien qu’à un faible niveau, commence après la reconstitution.a. Reconstituez un flacon de réactif Fungitell® en ajoutant 2,8 ml de RGW et 2,8 ml de tampon de

reconstitution Pyrosol en utilisant la pipette de 1000 μl. Couvrez le tube avec du Parafilm en utilisant le côté qui est face au support papier. Tournoyez doucement le tube pour faire dissoudre complétement. Ne pas faire tourbillonner.

6. Ajout de contrôles négatifs et des étalons de glucane. À la fin du prétraitement de l’incubation du serum (étape 3. d), retirer la plaque du lecteur de plaque d’incubation et ajouter les étalons et les contrôles négatifs à la plaque. Modèle de concentration standard recommandée :a. Ajoutez 25 μl de RGW aux puits G2 et G3.

b. Ajoutez 25 μl des 6,25 pg/ml de la solution étalon 5 aux puits F2 et F3.c. Ajoutez 25 μl des 12,5 pg/ml de la solution étalon 4 aux puits E2 et E3.d. Ajoutez 25 μl des 25 pg/ml de la solution étalon 3 aux puits D2 et D3.e. Ajoutez 25 μl des 50 pg/ml de la solution étalon 2 aux puits C2 et C3.f. Ajoutez 25 μl des 100 pg/ml de la solution étalon 1 aux puits B2 et B3.

7. Ajout du réactif Fungitell® et procédure d’incubation de la plaque.a. Ajoutez 100 μl de réactif Fungitell® à chaque puits (contenant des contrôles négatifs, des étalons

et des échantillons) en utilisant la pipette à répétition.b. Insérez la plaque dans le lecteur de microplaque (équilibré à 37 °C) en présence du couvercle et

agitez pendant 5 – 10 secondes. Lisez la plaque sans le couvercle à 405 nm moins 490 nm, pendant 40 minutes à 37 °C. Remarque : Si l'instrument ne laisse pas le temps d'enlever le couvercle entre l'agitation et la lecture, agitez sans le couvercle pour garantir une lecture sans couvercle. Si la soustraction du bruit de fond (à 490 nm) n'est pas disponible, il est acceptable de lire à 405 nm. Si la fonction d’agitation de la plaque n’est pas disponible avec le lecteur de microplaque, vous pouvez utiliser un agitateur de microplaque externe.

c. Recueillez et analysez les données de la manière suivante : Examinez la densité optique des tracés d’échantillons test et cherchez des schémas cinétiques autres qu’une légère augmentation comparable à celle des étalons. Des tracés invalides indiquant une interférence optique (ex : leurs schémas cinétiques ne correspondent pas à ceux des étalons). Calculez le taux moyen de changement de la densité optique (unités de milli-absorbance par minute) pour tous les points entre 0 et 40 minutes (réalisé par le logiciel). Interpolez les concentrations de l’échantillon (1→3)-β-D-glucan à partir de la courbe standard (réalisée par le logiciel).

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSLes résultats du test Fungitell® doivent être utilisés comme aide au diagnostic d’une infection fongique invasive. Les résultats sont exprimés en pg/ml de sérum et varient de non-détectable (<31 pg/ml) à >500 pg/ml. Ils sont imprimés ou lu par le logiciel à partir de la courbe standard. Des valeurs au delà de500 pg/ml nécessitent que l’échantillon soit dilué avec du RGW et testé de nouveau. Le laboratoire qui effectue le test doit informer le médecin traitant que toutes les infections fongiques n’entraînent pas des taux élevés de sérum (1→3)-β-D-glucane. Certains champignons, du genre cryptococcus3,4, produisent un taux très faible de (1→3)-β-D-glucane. Les mucorales, tel que l’absidia, le mucor et le rhizopus1,4 ne sont pas connus pour produire du (1→3)-β-D-glucane. De même, le blastomyces dermatitidis, dans sa phase de levure, produit très peu de (1→3)-β-D-glucan, et les malades souffrant de blastomycose ont un taux de (1→3)-β-D-glucane indétectable au test Fungitell®5.

RÉSULTAT NÉGATIFLes valeurs de (1→3)-β-D-glucane <60 pg/ml sont interprétées comme des résultats négatifs.

RÉSULTAT INDÉTERMINÉLes valeurs de 60 à 79 pg/ml indiquent la possibilité d’une infection fongique. Des prélèvements et des analyses supplémentaires de sérum sont recommandés. Des prélèvements et des analyses fréquents sont une meilleure aide au diagnostic.

RÉSULTAT POSITIVEDes valeurs de (1→3)-β-D-glucane ≥ 80 pg/ml sont interprétées comme un résultat positif. Un résultat positif signifie que du (1→3)-β-D-glucane a été détecté. Un résultat positif n’indique pas la présence d’une maladie et doit être utilisé en conjonction avec d’autres bilans cliniques pour établir un diagnostic.

CONTRÔLE QUALITÉ• Le coefficient de correlation (r) de la courbe standard (linéaire vs. linéaire) devrait être ≥ 0,980.• Les puits avec 25 μl de RGW sont les contrôles négatifs. Les contrôles négatifs doivent avoir des

valeurs de densité optique réelle (unités de milli-absorbance par minute) inférieures à 50 % de la norme la plus basse. Si ce n’est pas le cas, le test devrait être répété avec de nouveaux réactifs.

• Gestion des échantillons à problème. Si l’analyste observe des cinétiques de densité optique inhabituelle dans le test d’un échantillon incolore ou trouble (comme ceux fortement hémolysés, lipémiques ou contenant un excès de bilirubine), l’échantillon doit être dilué avec du RGW et testé de nouveau. La dilution doit être comptabilisée dans le rapport des résultats en multipliant le résultat par le facteur de dilution. Le facteur de dilution est généralement entré dans la configuration du logiciel pour l’échantillon et la correction est appliquée de manière automatique.

• Des échantillons témoins peuvent être effectués à des seuils de coupure et à des seuils fortement positifspour vérifier que les réactifs et le test fonctionnent correctement. Tout utilisateur du test doit établir un programme de contrôle qualité pour s’assurer que le test soit effectué de manière compétente, dans le respect de la règlementation applicable dans sa localité.

LES LIMITES DU TEST 1. L’emplacement des tissus dans une infection fongique(10), l’encapsulation, et le taux de (1→3)-β-D-

glucane produit par certains champignons pourraient affecter la concentration en sérum de cet analyte. La capacité réduite de la (1→3)-β-D-glucane à contribuer à la circulation sanguine peut réduire la capacité à détecter certaines infections fongiques. Le cryptococcus spp. produit une faible quantité de (1→3)-β-D-glucane3,4. Les mucorales, y compris l’absidia spp., le mucor spp. et le rhizopus spp. ne produisent pas de (1→3)-β-D-glucan1,4. Le blastomyces dermatitidis, dans sa phase de levure, produit peu de (1→3)-β-D-glucane, et les résultats du test sont généralement négatifs5.

2. Certaines personnes ont un taux élevé de (1→3)-β-D-glucane qui tombe dans la zone indéterminée. Dans ces cas, des tests de surveillance supplémentaires sont recommandés.

3. La fréquence des tests dépendra du risque relatif d’infection fongique qu’encourt le patient. Des taux d’échantillonnage d’au moins deux à trois fois par semaine sont recommandés pour les patients à risque.

4. Des résultats positifs ont été observés chez les patients hémodialysés19,20, chez les sujets traités avec certains produits sanguins fractionnés tels que l’albumine de sérum et les immunoglobulines25 et dans les spécimens ou chez les sujets exposés aux gazes et aux éponges chirurgicales contenant du glucane. Il faut 3 à 4 jours aux patients pour retrouver le niveau de base du sérum en (1→3)-β-D-glucane, après une exposition chirurgicale à des éponges et à des gazes contenant du (1→3)-β-D-glucane21,22. Il faudrait prendre en compte cela dans le choix du moment pour l’échantillonnage des patients opérés.

5. Les échantillons prélevés au talon ou au doigt sont inacceptables, car il a été prouvé que le gaze imbibé d’alcool et utilisé pour préparer le site (et, potentiellement, le pool sanguin de la surface de la

TEST

2020-02-11PN001268-fr Rev10

Mode d’emploi

Test pour le (13)-β-D-glucane sérique

Téléphone : +1 (508) 540-3444Numéro vert : +1 (888) 395-2221Fax : +1 (508) 540-8680Assistance technique : +1 (800) 848-3248Service à la clientèle : +1 (800) 525-8378

FIGURE 1Trajectoire du Lysat d’amébocyte de limule

Endotoxine de lipopolysaccharides (LPS)

Enzyme de coagulation

(1→3)-β-D-glucaneFacteur C activé

Facteur B

Facteur C

Facteur B activé

Enzyme de pro-coagulation

Facteur G activé Facteur G

Boc-Leu-Gly-Arg-pNA(Substrat artificiel)

Boc-Leu-Gly-Arg + pNATrajectoire inactivée

42

peau) contamine les spécimens. À ce jour les études n’ont observés aucune différence entre les échantillons obtenus par tirage aux traits ou par ponction veineuse26,27.

6. Les niveaux de test ont été établis chez des sujets adultes. Les niveaux normaux et de seuil pour les enfants en bas âge et les enfants plus âgés sont à l'étude28,29.

7. La plage de reportage du test est de 31 pg/ml à 500 pg/ml. Les valeurs en dessous de 31 pg/ml doivent être reportées comme étant <31 pg/ml. Les valeurs au dessus de 500 pg/ml doivent être reportées comme étant >500 pg/ml, sauf si l’échantillon a été dilué.

SUBSTANCES INTERFÉRENTESLes conditions d’échantillonnage ci-dessous peuvent influer sur un résultat de test Fungitell® précis:

• Hémolyse• Turbidité de l’échantillon causé par la lipémie• La présence de bilirubine visible à l’oeil nu• Sérum trouble• Un taux élevé d’immunoglobuline G, tel qu’il pourrait exister dans le sérum à cause de myélome

multiple, pourrait entraîner une précipitation dans le mélange réactionnel après l’ajout du Fungitell® au sérum prétraité30.

VALEURS ATTENDUESLes valeurs du béta glucane sont élevées dans plusieurs infections fongiques. Lorsque les signes et les symptômes sont présents à un taux de 80 pg/ml ou plus, la valeur prédictive selon laquelle le sujet est positif pour une infection fongique varie entre 74,4 et 91,7 %. En l’absence de signes et de symptômes à moins de 60 pg/ml, la valeur prédictive négative varie entre 65,1 % et 85,1 %.

CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCETest de comparaisonDes études prospectives multicentriques pour valider les caractéristiques de performance du test Fungitell® ont été réalisées31. Le test a été comparé à d’autres méthodes de détection standards, (ex: hémoculture, examen histopathologique de biopsie et de radiographie) de mycoses et de fongémies.Le test a été utilisé sur trois cent cinquante-neuf (359) sujets. Un échantillon unique à été obtenu pour chaque sujet. Les sujets à faible risque comprenaient des personnes apparemment en bonne santé et celles sur les sites cliniques étaient hospitalisées pour des raisons autres que des infections fongiques. Une accumulation de sujets a été faite sur six sites cliniques aux États-Unis. Quatre sites cliniques ont effectué le test sur un total de 285 échantillons. ACC a testé deux fois tous les 359 échantillons mais n’a utilisé que la deuxième série de résultats pour déterminer les performances du test. Les résultats de la seconde série d’analyses n’étaient pas statistiquement différents de la première série.La sensibilité de toute la population sujet (359) y compris les malades de la cryptococcosis était de 65,0 % ([d’une intervalle de confiance (IC) de 0,1 - 70,0 % 95 %]). La spécificité était de 81,1 % (77,1 - 85,2 % IC) (Tableau 1).

Tableau 1 Résultats du test ACC à un seuil de 60-80 pg/ml par site

Site

Avéré/probableSensibilité >=80 pg/ml

Spécificité<60 pg/ml

Équi

voqu

e60

<=X

<80 Total

Pos/

Clin

. Pos

Sens

ibili

té

Vale

ur

préd

ictiv

e po

sitiv

e

Nég

/ C

lin. N

ég

Spécificité

Vale

ur

préd

ictiv

e né

gativ

e

1 32/50 64,0 97,0 39/40 97,5 69,6 1 902 14/24 58,3 93,3 17/20 85,0 70,8 5 443 14/19 73,7 46,7 36/54 66,7 90,0 3 734 25/33 75,8 92,6 37/43 86,0 86,0 6 765 21/36 58,3 80,8 30/39 76,9 69,8 6 75

6 0/1 0.0Ne

s’applique pas

0/0Ne

s’applique pas

0.0 0 1

Total 106/163 65,0 80,9 159/196 81,1 76,8 21 359

Lorsque l’on compare les résultats obtenus par ACC (359 échantillons) et par les sites cliniques (285 échantillons) au diagnostique clinique, la sensibilité est de 64,3 % (58,8 % - 69,9 % IC) pour ACC et de 61,5 % (55,9 % - 67,2 % IC) pour les sites. La spécificité est de 86,6 % (82,7 % - 90,6 % IC) pour ACC contre 79,6 % (74,9 % - 84,3 % IC) pour les sites.

CANDIDOSEDans l’étude prospective 107 sujets ont été diagnostiqués positifs à la candidose. 83 sur les 107 étaient positifs au test Fungitell®.

Cent soixante-quinze échantillons de la bibliothèque de candidose ont été fournis à Associates of Cape Cod, Inc. 145 des 175 se sont avérés positifs lors du test.

ASPERGILLOSEUn total de 10 sujets étaient positifs de l’aspergillose. 8 des 10 étaient positifs au test.

FUSARIOSETrois sujets étaient positifs de la fusariose. 2 sur les 3 étaient positifs au test.

TRAITEMENT MÉDICAMENTEUX ANTI-FONGIQUELa présence ou l’absence d’un traitement médicamenteux antifongique n’a statistiquement aucun effet significatif sur la sensibilité du test. 118 sujets sous traitement antifongique ont été testés positifs pour une infection fongique invasive. 82 étaient positifs au test (sensibilité, 69,5 %; 61,2 % - 77,8 % IC). De plus, vingt-quatre (24) sujets, sans traitement anti-fongique, se sont révélés positifs. 18 étaient positifs au test (sensibilité, 75 %; 57,7 % - 92,3 % IC).

SPÉCIFICITÉUn total de 170 sujets ont été testés négatifs pour une infection fongique et semblaient être en bonne santé physique. La spécificité était de 86,5 % avec le test (82,8 % - 90,1 % IC). Une spécificité de 81,1 % (77,1 - 85,2 % IC) à été observée lorsque les 26 sujets testés négatifs à une infection fongique, mais ayant d’autres troubles, ont été rajoutés.

TEST DE CORRELATIONSQuatre sites cliniques ont testé un total de 285 échantillons. Les résultats du test sur le site ont quantitativement corrélés à 96,4 % avec les résultats chez Associates of Cape Cod, Inc. Les correlations d’Associates of Cape Cod, Inc. avec les différents sites de test varient entre 90,6 et 99,2 %.

PRÉCISIONDans les études de précision, dix (10) échantillons différents ont été testés chacun par trois sites de test, sur trois jours différents. La variation intra test allait de 0,9 à 28,9 %. Les valeurs Inter test variaient de 3,9 à 23,8 %. Les quatre (4) échantillons négatifs ont été exclus des deux analyses.

MÉTA-ANALYSESEn outre, de nombreuses études évaluées par des pairs ont été publiées au sujet de l’apport du (1→3)-β-D-glucane sérique au diagnostic des infections fongiques invasives, y compris les méta-analyses de la performance diagnostique32,33,34,35,36,37.

LÉGENDE DES SYMBOLES

« Utilisé le » « Limitation de température »

« Contenu suffisant pour ‘N’ tests » « Fabricant »

« Code de lot » « Consulter le mode d’emploi »

« Dispositif médical pour diagnostic in vitro » « Représentant autorisé »

« N° de catalogue » « Marque CE »

« Exclusivement sur ordonnance »

Associates of Cape Cod Europe GmbH, Opelstrasse 14, D-64546 Mörfelden-Walldorf, Allemagne

Sponsor australien : Emergo Australia, Level 20, Tower II, Darling Park, 201 Sussex Street Sydney, NSW 2000, Australie

RÉFÉRENCES

Vous pouvez obtenir d’autres références sur notre site internet Fungitell.com.

INSTALLATION

ÉCHANTILLONS

4Ajoutez 20 µl de solution alcaline de prétraitement dans les échantillons des puits de pyroplate.

3 Incubez à 37 °C pendant 10 minutes.

PROCÉDURE DU TEST FUNGITELL ®

GUIDE RAPIDE

5 µl

20 µl

Incubez et collectez les données cinétiques à 37 °C pendant 40 minutes.

8

Reconstituez le stock de glucane et faire des étalons.

1 Pipetez 5 µl d’échantillon dans les puits de pyroplate.

2

Fungitell® Assay Report Date: Patient Beta-Glucan Interpretation

I.D.

pg/mL

~ ~ ~ ~ ~ 35

- ~ ~ ~ ~ ~

70 n/a

~ ~ ~ ~ ~ 290

+

9 Lire les données.

Reconstituez le réactif Fungitell®.

5Ajoutez 25 µl d’étalons au pyroplate.

625 µl

7 100 µl

Ajoutez 100 µl de réactif de lysate Fungitell® dans les puits pyroplate.