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Produção simultânea de β-galactosidase e inulinase por Kluyveromyces

marxianus CCT 7082

Elida Simone Guido

Tecnóloga em Alimentos

Profª. Drª. Susana Juliano Kalil

ORIENTADORA

Profª. Drª. Ana Paula Manera

CO-ORIENTADORA

RIO GRANDE, RS

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E

CIÊNCIA DE ALIMENTOS

Produção simultânea de β-galactosidase e inulinase por Kluyveromyces

marxianus CCT 7082

Elida Simone Guido

Tecnóloga em Alimentos

Profª. Drª. Susana Juliano Kalil

ORIENTADORA

Profª. Drª. Ana Paula Manera CO-ORIENTADORA

RIO GRANDE, RS

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E

CIÊNCIA DE ALIMENTOS

Dissertação apresentada como parte dos

requisitos necessários para obtenção do

título de Mestre em Engenharia e Ciência

de Alimentos.

i

Nunca se afaste de seus sonhos,

pois se eles se forem,

você continuará vivendo,

mas terá deixado de existir.

Charles Chaplin

http://pensador.uol.com.br/autor/charles_chaplin/

ii

Dedico àquele que esteve ao meu lado incansavelmente,

Que é meu amigo, confidente, companheiro, tudo em um só,

Que coloca um sorriso em meu rosto, que eu não sabia que tinha,

Que me faz acreditar, sem pausas, que o amor é a melhor coisa vida,

Felipe.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e as ricas bênçãos derramadas nos meus dias. Sei que as Tuas mãos me

trouxeram até aqui e me guiarão até o fim.

A professora Susana, por ter-me orientado com profissionalismo, dedicação e sabedoria, que

foram responsáveis pelo meu crescimento pessoal e profissional. Devo-te grande parte desta

conquista, e sim, eu aprendi que a vida pode ser mais bonita se a olharmos com bons olhos e

pensamentos positivos. Muito obrigada, por tudo.

A Ana Paula, pela amizade e ajuda constante no decorrer deste trabalho. A caminhada foi

longa e difícil, mas se tornou possível porque pessoas especiais andaram ao meu lado.

Aos meus pais, Lauro e Geine, pelos joelhos dobrados em oração, por suportarem comigo

cada momento de saudade, e lutarem, sem reservas, para tornar este sonho real. A Silvana e o

Léo, pela “torcida organizada” e um amor sem medidas. Com e por eles tudo faz sentido.

Ao meu namorado Felipe, por fazer de todos os meus dias, um dia especial. Te agradeço por

cada minuto de quase dois anos e quero estar contigo para sempre.

Aos meus “filhos de laboratório”, Alexandre e Marina, muito obrigada por tudo. E não se

esqueçam, sejam atenciosos e usem protetor solar (rs).

Ao Ailton e a Carol, pelo incentivo e pela acolhida desde o início. Sou grata a vocês.

A todos do Laboratório de Microbiologia e Biosseparações, especialmente Rafa e Joana, pela

ajuda e por tudo que tivemos oportunidade de conviver nesses anos.

A Ana Sanzo, pelo auxílio constante, cuidados e conselhos. Você é muito especial para mim.

A Elisane, querida “Elisete”, pela amizade e ajuda no decorrer dos dias.

Aos amigos e colegas pelas experiências e bons momentos compartilhados.

A Eliane, por ter-me feito chegar tão longe, pela amizade e parceria. Você faz parte disso tudo.

Aos amigos, que mesmo distantes se fazem presentes na minha vida, em especial Cris e

Eliane. Vocês são as minhas “irmãs” para toda e qualquer hora. Amo vocês.

A minha sogra Dionéia e meu cunhado Fábio, pelo carinho e apoio em todos os momentos.

Aos professores do PPG-ECA, pelos ensinamentos, pela ajuda e dedicação. Felizes

daqueles que têm a oportunidade de tê-los como mestres.

A Islanda, pelo auxílio sempre que foi preciso.

Aos membros da banca, pelas correções e sugestões para a melhoria deste trabalho.

À CAPES, à FAPERGS e ao CNPq, pelo indispensável apoio financeiro.

iv

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS .................................................................................................. VI

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. VII

RESUMO .................................................................................................................... IX

ABSTRACT ................................................................................................................. X

1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................2

1.1. OBJETIVOS ...........................................................................................................4

1.1.1. Objetivo geral ..................................................................................................4

1.1.2. Objetivos específicos .......................................................................................4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................6

2.1. Enzimas .................................................................................................................6

2.2. Enzima β-galactosidase .........................................................................................7

2.3. Enzima inulinase ..................................................................................................10

2.4. Micro-organismos produtores de β-galactosidase e inulinase ..............................12

2.5. Fatores que afetam a produção de enzimas .........................................................15

2.5.1. Produção de β-galactosidase ........................................................................15

2.5.2. Produção de inulinase ...................................................................................17

2.6. Produção simultânea de β-galactosidase e inulinase ...........................................18

2.7. Considerações finais ............................................................................................19

3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................21

3.1. Micro-organismo ...................................................................................................21

3.2. Preparo do inóculo ...............................................................................................21

3.3. Seleção do meio de cultivo ...................................................................................22

3.4. Cultivos com substratos individuais ......................................................................22

3.5. Cultivos com substratos mistos ............................................................................23

3.6. Otimização do meio de cultivo para produção simultânea ....................................23

3.6.1. Delineamento composto central 23 (DCC) ......................................................23

3.6.2. Delineamento composto central rotacional 22 (DCCR)...................................24

3.7. Análise estatística dos dados ...............................................................................25

3.8. Métodos analíticos ...............................................................................................25

3.8.1. Extração da enzima β-galactosidase .............................................................25

3.8.2. Determinação de biomassa ...........................................................................25

3.8.3. Determinação de massa seca .......................................................................25

3.8.4. Determinação da atividade enzimática de β-galactosidase ............................25

v

3.8.5. Determinação da atividade enzimática de inulinase.......................................26

3.8.6. Determinação de açúcares redutores ............................................................26

3.8.7. Determinação do pH ......................................................................................26

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................................28

4.1. Seleção do meio de cultivo ...................................................................................28

4.2. Cultivos com substratos individuais ......................................................................31

4.3. Cultivos com substratos mistos ............................................................................34

4.4. Otimização do meio de cultivo para produção simultânea ....................................37

4.4.1. Delineamento composto central 23 (DCC) ......................................................37

4.4.2. Delineamento composto central rotacional 22 (DCCR) ...................................42

5. CONCLUSÃO .........................................................................................................49

5.1. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ...................................................50

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................52

APÊNDICES ...............................................................................................................63

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Enzimas microbianas: origem biológica e aplicação em alimentos. ...............7

Tabela 2. Micro-organismos produtores de β-galactosidase. ......................................13

Tabela 3. Micro-organismos produtores de inulinase. .................................................14

Tabela 4. Composição dos meios de inóculo. .............................................................21

Tabela 5. Composição dos meios de cultivo. ..............................................................22

Tabela 6. Níveis codificados e valores reais das variáveis independentes. .................24

Tabela 7. Níveis codificados e valores reais das variáveis independentes. .................24

Tabela 8. Matriz do delineamento composto central 23 com valores codificados e reais

(entre parênteses) e o máximo rendimento conjunto. ..................................................37

Tabela 9. Análise de variância (ANOVA) para o rendimento conjunto do delineamento

composto central 23. ....................................................................................................40

Tabela 10. Matriz do delineamento composto central rotacional 22 com valores

codificados e reais (entre parênteses) e o máximo rendimento conjunto. ....................42

Tabela 11. Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, valor t, valor p e

limites de confiança, provenientes do delineamento composto central rotacional 22,

para o rendimento conjunto. ........................................................................................44


composto central rotacional 22 ....................................................................................45

Tabela 13. Valores observados, preditos e desvios relativos (%) para o rendimento

conjunto dos planejamentos experimentais. ................................................................47

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rotas enzimáticas de conversão da lactose por β-galactosidase. .................8

Figura 2. Fórmula estrutural da molécula de inulina ...................................................10

Figura 3. Estrutura molecular das principais formas de fruto-oligossacarídeos ...........11

Figura 4. Levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082 ..........................................13

Figura 5. Acompanhamento das atividades enzimáticas de inulinase (▼) e β-

galactosidase (▲), da produção de biomassa () e variação no pH () para a levedura

K. marxianus CCT 7082 no meio 1 com: lactose (a) ou sacarose (b). .........................28



K. marxianus CCT 7082 no meio 2 com: lactose (a) ou sacarose (b). .........................30

Figura 7. Médias ± desvio padrão para os picos de atividade de β-galactosidase (a) e

inulinase (b) nos meios 1 e 2 com: lactose (L) ou sacarose (S).. .................................31



K. marxianus CCT 7082 no meio 1 com: galactose (a), inulina (b) e glicerol (c). .........32


inulinase (b) nos substratos individuais................................ ........................................34



K. marxianus CCT 7082 no meio 1 com: lactose e sacarose (a), lactose e inulina (b) e

lactose e glicerol (c). ...................................................................................................35

Figura 11. Acompanhamento das atividades de β-galactosidase (a) e inulinase (b), da

produção de biomassa (c) e variação no pH (d) para o delineamento composto central

23.................................................................................................................................38

Figura 12. Gráfico de Pareto dos efeitos para o DCC. ................................................39

Figura 13. Superfícies de resposta e curvas de contorno para o rendimento conjunto

como uma função: (a) do pH e razão L/I; (b) do pH e tempo; (c) da razão L/I e tempo.

....................................................................................................................................41



rotacional 22 ................................................................................................................43

Figura 15. Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para o rendimento

conjunto como uma função do pH e razão L/I. ............................................................45

viii

Figura 16. Superfícies de resposta para o rendimento de inulinase (a) e de β-

galactosidase (b) como uma função do pH e razão L/I. ...............................................46

ix

RESUMO

O emprego de micro-organismos na obtenção de bioprodutos tem sido amplamente explorado nos últimos anos, com destaque para a levedura Kluyveromyces marxianus que apresenta características muito importantes do ponto de vista industrial, incluindo

a capacidade de produzir enzimas, como a -galactosidase e a inulinase, e o status GRAS (Geralmente Reconhecido como Seguro), para a produção de alimentos e

fármacos. A -galactosidase é uma enzima intracelular que converte a lactose em glicose e galactose e sintetiza galacto-oligossacarídeos (GOS) que são considerados

prebióticos. O tratamento do leite e seus derivados com -galactosidase permite o consumo desses produtos por pessoas intolerantes a lactose. A inulinase é uma enzima extracelular que produz xaropes com alto teor de frutose, até 95%, através da hidrólise da inulina em uma única etapa, além de sintetizar fruto-oligossacarídeos (FOS) que causam benefícios à saúde e podem ser utilizados como ingredientes alimentares. O aumento da demanda industrial por enzimas implica na necessidade de métodos de obtenção que assegurem a viabilidade da aplicação em larga escala.

Neste contexto, a produção simultânea de -galactosidase e inulinase em uma única etapa de cultivo é de grande interesse do ponto de vista econômico. Assim, o objetivo

principal da presente dissertação foi manter a produção de -galactosidase e obter concomitantemente a inulinase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 por cultivo

submerso. Primeiramente, selecionou-se entre dois meios de cultivo, pH 6,0 e 3,5, o mais promissor para a produção conjunta. Através do acompanhamento dos cultivos em frascos aletados agitados determinou-se que o meio com pH 6,0 foi o melhor para

ambas as enzimas, obtendo-se 19,7±0,7 U/mL de -galactosidase e 1,8±0,1 U/mL de

inulinase em lactose e 39,8±1,7 U/mL de inulinase e 3,0±0,1 U/mL de -galactosidase em sacarose. Posteriormente, as enzimas foram produzidas simultaneamente no meio selecionado com outros substratos individuais e mistos. Dos substratos individuais, a lactose foi o melhor indutor da β-galactosidase e a inulina da inulinase. Os resultados obtidos no meio com glicerol foram os mais promissores para ambas as enzimas, pois alcançou-se 8,3±0,1 e 19,3±2,9 U/mL de β-galactosidase e inulinase, respectivamente. Em relação aos substratos mistos a combinação lactose e inulina foi a melhor, obtendo-se 16,8±1,1 U/mL de β-galactosidase e 21,1±3,0 U/mL de inulinase. Na etapa seguinte, foram realizados dois planejamentos experimentais em sequência visando obter uma condição ótima para a produção simultânea das enzimas. No primeiro delineamento composto central 23 (DCC) foram avaliados os efeitos do pH inicial, da razão entre a concentração de lactose e inulina (L/I) e do tempo de adição da lactose sobre o rendimento conjunto do cultivo (%). As variáveis pH e razão L/I apresentaram efeitos significativos e foram levadas para o delineamento composto central rotacional 22 (DCCR). As condições estabelecidas para a produção conjunta de β-galactosidase e inulinase foram pH 7,0 e razão L/I de 1,5 (16,9 g de lactose/11,3 g de inulina). A quantidade dos demais componentes do meio foi fixada nos valores antes definidos. Nestas condições o rendimento conjunto do cultivo foi igual a 175,4±0,65% em 72 h. O objetivo do trabalho foi alcançado, já que na melhor condição a atividade de β-galactosidase, igual a 18,1±0,26 U/mL, foi praticamente mantida, e o rendimento de inulinase chegou a 83,5±0,76%, que corresponde a 42,9±0,38 U/mL.

PALAVRAS CHAVE: Kluyveromyces marxianus, enzimas, -galactosidase, inulinase, produção simultânea.

x

ABSTRACT

Simultaneous production of -galactosidase and inulinase from Kluyveromyces

marxianus CCT 7082

Employment of micro-organisms for obtaining bioproducts has been widely exploited in recent years, especially the yeast Kluyveromyces marxianus that has very important characteristics from the industrial point of view, including ability to produce enzymes,

like -galactosidase and inulinase, and GRAS (Generally Recognized as Safe) status

for production of foods and pharmaceuticals. -galactosidase is an intracellular enzyme used industrially for lactose hydrolysis into galactose and glucose, and synthesis of prebiotics galacto-oligosaccharides (GOS). Treatment of milk and dairy products with

-galactosidase allows his consumption by lactose intolerant people. Inulinase is an extracellular enzyme that produces high fructose syrup, until 95%, trough hydrolysis of inulin by a single step, and synthesizes fructo-oligosaccharides (FOS), that cause health benefits and can be used as an food ingredient. The industrial demand increase for enzymes requires the development of production methods to ensure viability of the

large-scale application. In this context, the simultaneous production of -galactosidase and inulinase in a single-stage cultivation is of great interest from economic point view.

Thus, the objective of present study was to maintain -galactosidase production and concomitantly yield inulinase from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 by submerged cultivation. First, we selected between two culture media, with pH 6.0 and 3.5, the best for simultaneous production. Through monitoring of the cultivation in agitated flasks, it was determined that medium with pH 6.0 was the best for both enzymes, yielding

19.7±0.7 U/mL -galactosidase and 1.8±0.1 U/mL inulinase with lactose, and 39.8±1.7

U/mL inulinase and 3.0±0.1 U/mL -galactosidase with sucrose. In the sequence, enzymes were simultaneously produced in the selected medium with other individual and mixed substrates. Of the individual substrates, lactose was the best inductor of β-galactosidase synthesis and inulin the best inductor of inulinase production. The results achieved in medium with glycerol were most promising for both enzymes, yielding 8.3±0.1 and 19.3±2.9 U/mL of β-galactosidase and inulinase, respectively. For mixed substrates, the best was lactose/inulin, reaching 16.8±1.1 U/mL β-galactosidase and 21.1±3.0 U/mL inulinase. In the next step, we performed two sequential experimental designs to obtaining optimal condition for simultaneous production. In the first central composite design 23 (CCD) were evaluated the effects of initial pH, lactose/inulin concentration ratio and lactose addition time on yield of simultaneous cultivation. Initial pH and lactose/inulin ratio showed significant effects and were led to central composite rotatable design 22 (CCRD). Conditions for simultaneous production of β-galactosidase and inulinase were pH 7.0 and L/I ratio of 1.5 (16.9 g lactose/11.3 g inulin). Amount of other medium components was fixed on previously defined values. Concomitant yield in this conditions was 175.4±0.65% at 72 h of cultivation. Objective of this study was reached since in optimized conditions was maintained the β-galactosidase activity, 18.1±0.26 U/mL, and inulinase yield was 83.5±0.76%, which corresponds to 42.9±0.38 U/mL

KEY WORDS: Kluyveromyces marxianus, enzymes, -galactosidase, inulinase, simultaneous production.

INTRODUÇÃO

2

1. INTRODUÇÃO

A modificação de alimentos e outros materiais por enzimas têm ocorrido

espontânea e deliberadamente por gerações. A aplicação biotecnológica de enzimas é

vantajosa frente aos processos físico-químicos convencionais por não necessitar de

condições drásticas de temperatura e pressão (Vandamme e Derycke, 1983).

O emprego de micro-organismos na obtenção de enzimas tem sido

amplamente explorado nos últimos anos (Hsu, Yu e Chou, 2005; Singh, Sooch e Puri,

2007; Makino et al., 2009; Braga, Gomes e Kalil, 2011). Dentre as leveduras, aquelas

pertencentes ao gênero Kluyveromyces têm despertado grande interesse industrial

devido principalmente às suas características fisiológicas e por serem reconhecidas

como seguras (Generally Recognized as Safe - GRAS) e aceitas pelo FDA (Food and

Drug Administration) para a produção de alimentos e fármacos (Hensing et al., 1994).

A espécie Kluyveromyces marxianus é de particular interesse, pois oferece

vantagens que incluem rápida taxa de crescimento, termotolerância, capacidade de

assimilar uma ampla variedade de açúcares e habilidade para produzir enzimas, tais

como β-galactosidase e inulinase (Lane e Morrissey, 2010). A linhagem CCT 7082 foi

selecionada como boa produtora da enzima β-galactosidase por Manera et al. (2008),

porém até a realização do presente estudo não se tinha conhecimento sobre a sua

capacidade de produzir inulinase e ambas as enzimas simultaneamente.

A β-galactosidase é uma enzima intracelular utilizada industrialmente na

hidrólise da lactose do leite e do soro de leite (Gekas e López-Leiva, 1985), sobretudo

na elaboração de produtos destinados a pessoas intolerantes à lactose. Embora exista

uma grande variação na população de intolerantes à lactose em diferentes países do

mundo, cerca de 70% da população mundial sofre com este problema o que torna a

importância da enzima ainda maior (Bansal et al., 2008). Além de hidrolisar a lactose,

a β-galactosidase sintetiza galacto-oligossacarídeos (GOS) que atuam como alimentos

funcionais, causando diversos efeitos benéficos à saúde (Hsu et al., 2007). Manera et

al. (2010) produziram GOS utilizando células permeabilizadas de K. marxianus CCT

7082 e obtiveram em condições otimizadas 83,0 g/L.

A inulinase é uma enzima extracelular potencialmente útil na produção de

fruto-oligossacarídeos (FOS) e de xaropes com alto teor de frutose, até 95%, em uma

única etapa (Kim et al., 1997). Os FOS são classificados como compostos prebióticos

3

e podem ser utilizados como ingredientes alimentares (Vanková et al., 2008). Santos e

Maugeri (2007) empregaram inulinase imobilizada de K. marxianus na produção de

FOS e alcançaram uma concentração máxima de 50,2 g/L.

Apesar de existir inúmeros estudos na literatura relacionados à produção

de várias enzimas, poucos deles enfocam o processo de obtenção simultânea destes

biocatalisadores amplamente empregados nos setores alimentício e farmacêutico. De

acordo com Espinoza et al. (1992), a produção concomitante de dois bioprodutos em

uma única etapa de cultivo é de grande interesse do ponto de vista econômico, com

destaque para a obtenção conjunta de β-galactosidase e inulinase por Kluyveromyces

marxianus. O estudo de Hewitt e GrootWassink (1984) assegura que os processos

utilizando leveduras para produção simultânea de enzimas podem apresentar uma boa

oportunidade de pesquisa e desenvolvimento, no entanto, é necessário encontrar um

equilíbrio entre a indução e a repressão catabólica que ocorrem neste caso.

A produção simultânea das enzimas β-galactosidase e inulinase resulta em

um melhor aproveitamento do processo. A separação da biomassa do meio de cultivo,

seguido do rompimento celular, possibilita recuperar a β-galactosidase, enquanto a

inulinase pode ser diretamente precipitada do sobrenadante do cultivo. Desde que não

ocorra a mistura das enzimas não haverá nenhum custo de extração adicional durante

o processo de separação. Porém, para tornar viável o cultivo conjunto é imprescindível

otimizar o meio e as condições operacionais. A técnica de planejamento experimental

e análise de superfície de resposta têm se mostrado muito útil na maximização de

processos biotecnológicos possibilitando a obtenção de resultados promissores.

Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal manter a

produção de β-galactosidase e obter concomitantemente a inulinase de K. marxianus

CCT 7082 por cultivo submerso, de modo a agregar valor econômico ao processo.

4

1.1. OBJETIVOS

1.1.1. Objetivo geral

- Manter a produção de β-galactosidase e obter concomitantemente a inulinase de

Kluyveromyces marxianus CCT 7082 por cultivo submerso.

1.1.2. Objetivos específicos

- Avaliar a produção simultânea de β-galactosidase e inulinase em meios de cultivo

otimizados, a base de lactose ou sacarose, com diferentes valores de pH, e selecionar

o meio que apresentar os resultados mais promissores;

- Empregar o meio selecionado na produção conjunta das enzimas β-galactosidase e

inulinase com outros substratos individuais e mistos, adicionados em concentração

pré-estabelecida;

- Otimizar o meio de cultivo para produção simultânea de β-galactosidase e inulinase

através da técnica de planejamento experimental e análise de superfície de resposta.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

6

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Enzimas

Enzimas são catalisadores biológicos que atuam em condições amenas de

reação e não poluentes, além de apresentarem alta especificidade e eficiência

catalítica. Essas características são importantes quando comparadas aos métodos

químicos de síntese orgânica e processos industriais. Levando-se em consideração

suas propriedades não é surpreendente que a quantidade de aplicações comerciais de

enzimas venha crescendo a cada ano, principalmente nas áreas de biotecnologia

industrial, ambiental e de alimentos (Koblitz, 2008).

As enzimas são catalisadores extremamente eficazes que comumente

aumentam a velocidade das reações na ordem de 105 a 1017 vezes mais do que a

reação correspondente não catalisada. As enzimas que apresentam maior aplicação

industrial são as hidrolases e as oxirredutases (Lehninger, Nelson e Cox, 2007).

Os micro-organismos pela sua ampla distribuição na natureza são as

fontes mais versáteis e fáceis de manuseio em laboratório, assim, muitas enzimas são

obtidas a partir de fermentações microbianas, suplantando a produção de origem

animal e vegetal. Isso se deve ao fato de exigirem, no geral, um tempo curto de

produção, serem obtidas em qualquer época do ano e utilizarem, normalmente,

substratos de baixo custo (Ettalibi e Baratti, 1987).

A produção de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por

fermentação submersa, onde o micro-organismo introduzido como inóculo se

desenvolve no mosto líquido. Os meios de cultivo devem conter fontes de carbono,

energia e nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento. Na produção de

enzimas indutivas a presença de um indutor é essencial. No caso da ocorrência de

repressão catabólica, deve-se evitar a presença no meio de altas concentrações de

açúcares facilmente assimiláveis, como a glicose. As operações posteriores ao

processo fermentativo dependem da localização da enzima de interesse, intracelular

ou extracelular (Lima et al., 2001).

A Tabela 1 apresenta as principais enzimas microbianas e as respectivas

aplicações em alimentos. Dentre elas, destacam-se a β-galactosidase que catalisa a

hidrólise da lactose e a síntese de galacto-oligossacarídeos (Mahoney, 1998), e a

inulinase que produz xarope com alto teor de frutose e fruto-oligossacarídeos (Pandey

et al., 1999). Ambas as enzimas podem ser obtidas a partir de leveduras do gênero

Kluyveromyces (Lane e Morrissey, 2010).

7

Tabela 1. Enzimas microbianas: origem biológica e aplicação em alimentos.

Enzima Origem biológica Aplicação

Glicose-oxidase Aspergillus niger Remoção de glicose da clara e do

ovo inteiro.

Tanase A. niger; Aspergillus

oryzae

Remoção de adstringência em

vinhos e sucos.

-amilase Bacillus licheniformis;

Bacillus subtilis; A. niger;

A. oryzae

Modificação do amido, panificação

e produção de bebidas alcoólicas.

Xilanase Streptomyces sp; A.

niger

Extração e clarificação de sucos,

óleos e gorduras vegetais.

Inulinase Kluyveromyces

marxianus

Produção de fruto-oligossacarídeos

e xarope com alto teor de frutose.

-glicosidase A. niger; A. oryzae;

Rhizopus oryzae

Síntese de açúcares não

convencionais e desglicosilação de

flavonóides.

β-galactosidase A. niger; A. oryzae;

Kluyveromyces lactis; K.

marxianus

Obtenção de produtos lácteos com

baixo teor de lactose e produção de

galacto-oligossacarídeos.

Serina-proteinase B. licheniformis Panificação, obtenção de

hidrolisado proteico; produção e

maturação de queijos, e clarificação

de cerveja.

Pectina-liase A. niger Extração e clarificação de sucos,

vinhos, óleos e gorduras vegetais.

Xilose-isomerase Actinoplanes

missouriensis

Obtenção de xarope de frutose.

Fonte: Koblitz, 2008.

2.2. Enzima β-galactosidase

A β-galactosidase (-D-galactosídeo galactohidrolase, EC 3.2.1.23), ou

lactase, é uma enzima intracelular utilizada na hidrólise da lactose do leite e soro de

leite em seus monossacarídeos glicose e galactose, principalmente no processamento

de produtos lácteos destinados a pessoas que apresentam intolerância à lactose. Esta

8

enzima também pode catalisar a reação de transgalactosilação que leva a formação

de galacto-oligossacarídeos (GOS), conforme mostra a Figura 1 (Hsu et al., 2007).

A lactose é um dissacarídeo com doçura e solubilidade relativamente

baixas e não é facilmente digerida por uma parcela significativa da população mundial.

A lactose ingerida por pessoas intolerantes não pode ser hidrolisada devido aos baixos

níveis (ou ausência) de β-galactosidase no aparelho digestivo, consequência de uma

deficiência congênita da enzima ou de uma diminuição gradativa da sua atividade com

o avanço da idade. Portanto, o excesso de lactose no intestino grosso pode levar a

desidratação dos tecidos, má absorção de cálcio e fermentação por micro-organismos,

causando flatulências, cólicas e diarréia aquosa intensa (Santiago et al., 2004;

Panesar et al., 2006).

O tratamento do leite e seus derivados com β-galactosidase reduz o teor

de lactose, assim os produtos livres ou com baixo teor de lactose podem ser ingeridos

por pessoas intolerantes a este carboidrato (Furlan et al., 2000).

Figura 1. Rotas enzimáticas de conversão da lactose por β-galactosidase.

(Fonte: Martins e Burkert, 2009)

Os galacto-oligossacarídeos obtidos na reação catalisada pela enzima β-

galactosidase são oligossacarídeos não digeríveis compostos por 2 a 20 moléculas de

galactose e uma de glicose. Os GOS são reconhecidos como prebióticos porque

estimulam a proliferação de bactérias lácticas e bifidobactérias no intestino humano;

contribuem para a redução do nível de colesterol; atuam na prevenção do câncer de

cólon; melhoram a absorção de cálcio, entre outros (Martínez-Villaluenga et al., 2008).

9

As principais aplicações da enzima β-galactosidase incluem a melhoria das

características sensoriais e tecnológicas dos alimentos pelo aumento da solubilidade

da lactose; assimilação de produtos que contêm lactose por pessoas intolerantes a

este carboidrato; síntese de galacto-oligossacarídeos e conversão do soro de leite,

subproduto da indústria de laticínios, em diferentes produtos de valor agregado

(Cortés et al., 2005; Ustok, Tari e Harsa, 2010).

A β-galactosidase é encontrada na natureza distribuída entre vegetais

(amêndoa, pêssego, damasco) e órgãos de animais (intestino, cérebro, placenta), mas

também pode ser produzida por uma grande variedade de micro-organismos como

bactérias, fungos filamentosos e leveduras, que são a fonte mais aceitável para

produção e aplicação industrial (Richmond, Gray e Stine, 1981).

As propriedades da β-galactosidase diferem significativamente de acordo

com a origem biológica. As enzimas de origem fúngica têm pH ótimo ácido (2,5 a 5,4)

e são indicadas para a hidrólise da lactose do soro de leite. As lactases de origem

bacteriana têm pH ótimo em torno de 7,0, e as produzidas por leveduras têm atividade

ótima em pH entre 6,0 e 7,0, sendo indicadas para uso no leite. Lactases de fungos

filamentosos apresentam atividade ótima em temperatura em torno de 50ºC, enquanto

as lactases obtidas de leveduras têm temperatura ótima entre 30 e 40ºC (Panesar et

al., 2006).

Segundo Inchaurrondo, Yantorno e Voget (1994) e Ladero et al. (2006), a

síntese de β-galactosidase é induzida por lactose e galactose e reprimida por glicose.

A atividade específica da enzima é constante durante a fase exponencial de

crescimento da levedura, aumenta na fase de desaceleração breve e cessa com o

esgotamento da lactose. Na fase estacionária a atividade total mantém-se constante,

indicando que a enzima é estável e nenhuma degradação ocorre (Inchaurrondo,

Yantorno e Voget, 1994).

O método de detecção da atividade enzimática de β-galactosidase consiste

na utilização de substratos sintéticos que são prontamente hidrolisados pela enzima

liberando galactose e compostos com absorção máxima em torno de 400 nm,

quantificados por espectrofotometria (Koblitz, 2008).

Devido ao interesse industrial em β-galactosidase, um grande número de

micro-organismos tem sido avaliado como fonte potencial da enzima, principalmente

os que pertencem ao gênero Kluyveromyces sp e Aspergillus sp (Panesar et al.,

2006).

10

2.3. Enzima inulinase

A frutose é um açúcar natural amplamente utilizado na produção de

bebidas. Normalmente é obtida na forma de xarope de milho rico em frutose (High

Fructose Corn Syrup - HFCS) a partir da isomerização da glicose derivada da hidrólise

do amido. Mas ao longo das últimas décadas diversas pesquisas tem se dedicado ao

estudo de um novo processo para produção de frutose, a hidrólise da inulina

catalisada pela enzima inulinase (Ricca et al., 2009).

A inulina é um polifrutano composto por moléculas de frutose unidas por

ligações β-2,1 e uma glicose terminal, conforme mostra a Figura 2. Esse polímero tem

sido investigado como fonte para a produção de xarope de frutose através de hidrólise

enzimática, por ação exclusiva de exo-inulinases ou ação sinérgica de exo- e endo-

inulinases. A inulinase atua nas ligações β-2,1 da inulina produzindo xarope de frutose

em uma única etapa (Wei et al., 1998; Park et al., 1998).

Figura 2. Fórmula estrutural da molécula de inulina.

(Fonte: Barroso, 2009)

A produção de frutose por hidrólise da inulina é mais vantajosa que o

processo convencional com amido, que devido ao equilíbrio termodinâmico da reação

produz apenas 45% de frutose no produto final e envolve a ação das enzimas α-

amilase, amiloglicosidase e glicose isomerase. Na hidrólise da inulina por inulinases

podem ser obtidos produtos com até 95% de frutose (Mazutti et al., 2006).

As exo-inulinases (β-D frutano frutohidrolase, EC 3.2.1.80) catalisam a

remoção de frutose a partir do terminal não redutor da molécula de inulina, enquanto

as endo-inulinases (2,1-β-D frutano frutanohidrolase, EC 3.2.1.7) hidrolisam as

11

ligações internas para produzir oligossacarídeos como produtos principais (Jing et al.,

2003).

A aplicação de maior potencial da inulinase na indústria de alimentos é a

produção de fruto-oligossacarídeos (FOS), através da transfrutosilação da sacarose

(Figura 3) ou hidrólise da inulina. Os FOS estimulam o crescimento de bifidobactérias,

diminuindo o desenvolvimento de bactérias putrefativas, além de apresentarem uma

gama de características fisiológicas (Yun, 1996). Os FOS ainda proporcionam uma

série de benefícios nutricionais importantes e contribuem com propriedades funcionais

que melhoram a vida útil e o perfil de sabor de produtos alimentícios (Sangeetha,

Ramesh e Prapulla, 2005).

Figura 3. Estrutura molecular das principais formas de fruto-oligossacarídeos:

(A) 1-kestose (GF2), (B) nistose (GF3) e (C) frutofuranosil nistose (GF4).

(Fonte: Barroso, 2009)

Os fruto-oligossacarídeos representam um dos principais oligossacarídeos

da classe dos bifidogênios, em termos de produção. Esses compostos são produzidos

por dois processos que não apresentam diferenças significativas no produto final. No

primeiro, a sacarose é utilizada como substrato obtendo-se fruto-oligossacarídeos de 2

a 4 unidades fructosil ligadas em β-(2,1), com um resíduo de α-D-glicosil terminal,

conhecidos como 1-kestose, nistose e frutofuranosil nistose (Figura 3). O segundo

(C)

(A)

(B)

12

consiste na hidrólise da inulina por inulinases produzindo fruto-oligossacarídeos de

cadeia longa (Crittenden e Playne, 1996).

Algumas inulinases microbianas apresentam atividade sobre a sacarose à

semelhança da invertase. A relação S/I, que corresponde à atividade da enzima sobre

a sacarose (S) e a inulina (I), é empregada para distinguir invertase de inulinase. Uma

baixa relação S/I, ou seja, alta atividade com a inulina indica que a enzima é inulinase

(Rouwenhorst et al., 1990).

Segundo Vandamme e Derycke (1983), a temperatura ótima de atividade

da enzima inulinase é 50ºC. No entanto, a temperatura de 60ºC pode ser favorável

industrialmente porque além de combater a contaminação dos reatores, aumenta a

solubilidade da inulina. Considerando-se a estabilidade da enzima em função da

temperatura, observa-se uma rápida desnaturação acima do valor ótimo. O pH ótimo

de atividade da inulinase encontra-se na faixa de 4,5 a 5,0. No estudo de Schneider

(1996), a enzima extracelular foi estável em temperaturas inferiores a 55ºC e na faixa

de pH entre 3,0 e 7,0.

Dentre os substratos puros, a inulina e a sacarose têm sido empregadas

como fonte preferencial de carbono na produção de inulinase por diferentes micro-

organismos (Pandey et al., 1999). Recentemente, os resultados obtidos por Makino et

al. (2009) demonstraram a viabilidade da utilização de resíduos agroindustriais na

produção da enzima.

A inulinase pode ser obtida a partir de tubérculos e raízes de plantas que

contêm inulina (Vandamme e Derycke, 1983), ou através de fungos filamentosos,

bactérias e leveduras. Entre os micro-organismos, as leveduras têm sido amplamente

estudadas para a produção de inulinase, pois oferecem vantagens sobre os fungos no

processo fermentativo devido à sua natureza unicelular, sendo as do gênero

Kluyveromyces as mais utilizadas (Hensing et al., 1994).

2.4. Micro-organismos produtores de β-galactosidase e inulinase

Os micro-organismos são os principais responsáveis pelos avanços da

biotecnologia moderna produzindo diversas biomoléculas de interesse, entre estas, as

enzimas. Para ser empregado na produção de enzimas, o micro-organismo deve ser

preferencialmente seguro do ponto de vista biológico; possuir elevada capacidade de

síntese e excreção da enzima; suportar condições ambientais desfavoráveis e tolerar a

presença de substâncias tóxicas (Bom et al., 2008).

13

De acordo com os relatos da literatura, uma grande variedade de micro-

organismos é capaz de produzir β-galactosidase (Tabela 2), no entanto, as enzimas

industriais são provenientes principalmente de Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces

marxianus (leveduras), Aspergillus niger (fungo filamentoso) e Escherichia coli

(bactéria) (Zhou e Chen, 2001). A Figura 4 apresenta uma cultura de K. marxianus

CCT 7082.

Figura 4. Levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082.

(Fonte: Lemes, 2011)

Tabela 2. Micro-organismos produtores de β-galactosidase.

Micro-organismo Referência

Kluyveromyces marxianus Espinoza et al. (1992); Rech et al. (1999); Furlan et al.

(2000); Pinheiro, Belo e Mota (2003); Cortés et al.

(2005); Manera et al. (2008); Alves et al. (2010); Lemes

(2011)

Kluyveromyces lactis Zhou e Chen (2001); Becerra et al. (2004); Kim, Ji e Oh

(2004); Martínez-Villaluenga et al. (2008)

Aspergillus niger Domingues, Lima e Teixeira (2005)

Aspergillus oryzae Huerta et al. (2010)

Bacillus subtilis Konsoula e Liakopoulou - Kyriakides (2007)

Bifidobacterium longum Hsu et al. (2007)

Candida pseudotropicalis Inchaurrondo, Yantorno e Voget (1994)

Lactobacillus delbrueckii Vasiljevic e Jelen (2001)

Thermus sp Ladero et al. (2006)

14

Os micro-organismos, Aspergillus sp, Staphylococcus sp, Xanthomonas

sp, Kluyveromyces sp, Cryptococcus sp, Pichia sp, Sporotrichum sp e Candida sp, são

as melhores fontes para a produção industrial da enzima inulinase, devido à facilidade

de cultivo e o rendimento elevado da enzima. As leveduras, como Kluyveromyces

fragilis e Kluyveromyces marxianus, podem produzir mais inulinase do que linhagens

fúngicas e bacterianas, gerando grande interesse comercial (Chi et al., 2009). Na

Tabela 3, encontram-se alguns dos micro-organismos reportados na literatura com

capacidade de produzir inulinase.

Tabela 3. Micro-organismos produtores de inulinase.

Micro-organismo Referência

Kluyveromyces marxianus Rouwenhorst et al. (1990); Espinoza et al. (1992);

Hensing et al. (1994); Kalil et al. (2001); Silva-

Santisteban e Filho (2005); Singh, Sooch e Puri (2007);

Sguarezi et al. (2009)

Aspergillus ficuum Jing et al. (2003); Chen et al. (2009)

Aspergillus niger Poorna e Kulkarni (1995); Skowronek e Fiedurek

(2006); Kango (2008)

Aspergillus niveus Guimarães et al. (2009)

Pseudomonas sp Kim et al. (1997)

Rhizopus sp Ohta, Suetsugu e Nakamura (2002)

Staphylococcus sp Selvakumar e Pandey (1999)

Streptomyces sp Gill et al. (2003)

Yarrowia lipolytica Liu et al. (2010)

A levedura Kluyveromyces marxianus apresenta algumas características

muito interessantes do ponto de vista industrial como alta capacidade de conversão de

substrato em biomassa; amplo intervalo de temperatura para o crescimento; habilidade

para produzir enzimas, incluindo β-galactosidase e inulinase, e compostos aromáticos

(Tovar-Castro, Garcia-Garibay e Saucedo-Castañeda, 2008; Lane e Morrissey, 2010).

Esta levedura pode ser aplicada ainda na produção de proteínas unicelulares, etanol,

bioingredientes de soro de leite, entre outros (Fonseca et al., 2008).

Kluyveromyces marxianus se multiplica rapidamente em uma grande

variedade de fontes de carbono de baixo custo e apresenta pouca necessidade de

15

nutrientes adicionais, tornando-a economicamente atraente para os processos

industriais (Pecota, Rajgarhia e Silva, 2007).

Várias linhagens de Kluyveromyces marxianus possuem o status GRAS

(Generally Recognized As Safe) à semelhança de Saccharomyces cerevisiae e

Kluyveromyces lactis. Apesar de outras leveduras terem sido relatadas para a

produção de biocompostos, somente as que possuem o GRAS podem ser utilizadas

na indústria alimentícia e farmacêutica (Fonseca et al., 2008).

O grande interesse em K. marxianus é, sem dúvida, impulsionado pelas

inúmeras aplicações industriais. O reflexo disso pode ser visto na literatura científica

onde são encontrados muitos trabalhos relacionados ao emprego biotecnológico desta

levedura. Assim, a disponibilidade de novas ferramentas e recursos moleculares; suas

características metabólicas e celulares interessantes; e o potencial para tornar-se a

levedura líder em grande parte dos processos biotecnológicos, levam a um forte

aumento das investigações sobre esta espécie (Lane e Morrissey, 2010).

2.5. Fatores que afetam a produção de enzimas

2.5.1. Produção de β-galactosidase

O aumento da demanda industrial pela enzima β-galactosidase implica no

desenvolvimento de métodos que assegurem a viabilidade econômica da hidrólise da

lactose em larga escala. O estudo dos efeitos das condições operacionais tais como

temperatura, agitação e aeração, e outros parâmetros do processo de obtenção, que

incluem crescimento do micro-organismo, oxigênio dissolvido, pH e substratos, podem

fornecer informações importantes para scale-up da produção e obtenção de melhores

resultados (Nor et al., 2001; Alves et al., 2010).

Vasiljevic e Jelen (2001) estudaram as condições ótimas para a máxima

produção de -galactosidase. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842

foi cultivado em leite desnatado e meios a base de soro de leite comum e permeado,

suplementados com proteínas do soro, extrato de levedura ou caldo MRS (Man-

Rogosa-Sharpe). O pH foi ajustado para 5,6 e a temperatura mantida em 43ºC. Os

autores concluíram que o meio com leite desnatado apresentou a maior produção de

-galactosidase, igual a 5,5 U/mL, quando comparado aos demais meios de cultivo

avaliados no trabalho.

Rajoka, Khan e Shahid (2003) utilizaram Kluyveromyces marxianus NIBGE

Y-1 para a produção de β-galactosidase na presença de diferentes substratos, como

16

lactose, galactose, celobiose, xilose, arabinose, sacarose e glicose, em temperaturas

de 22 a 45ºC. O tipo de substrato e a temperatura foram as variáveis que

apresentaram efeito direto no crescimento do micro-organismo e na produção da

enzima. Lactose mostrou ser a melhor fonte de carbono, seguido por galactose,

sacarose, celobiose, xilose, arabinose e glicose. A produção máxima da enzima

ocorreu a 35ºC e pH 5,5.

No trabalho de Manera et al. (2008) foram testadas diferentes linhagens do

gênero Kluyveromyces, capazes de produzir β-galactosidase. K. marxianus CCT 7082

foi selecionada como a melhor produtora da enzima para otimização do meio de

cultivo. No planejamento fatorial fracionário 24-1 todas as variáveis (pH, concentração

de lactose, de extrato de levedura e de (NH4)2SO4) apresentaram efeitos significativos

na produção de β-galactosidase. Portanto, a concentração de lactose, de extrato de

levedura e de (NH4)2SO4, foram avaliadas em um delineamento composto central 23.

Nas condições otimizadas (28,2 g/L de lactose; 17 g/L de extrato de levedura; 8,8 g/L

de (NH4)2SO4 e pH 6,0) a atividade enzimática foi igual a 10,6 U/mL.

Para maximização da produção de β-galactosidase por K. marxianus CCT

7082, Alves et al. (2010) investigaram através de um planejamento experimental os

efeitos simultâneos de agitação (200-500 rpm) e aeração (0,5-1,5 vvm) na atividade

enzimática e produtividade, utilizando o meio otimizado por Manera et al. (2008). Os

resultados demonstraram que a produção da enzima foi fortemente influenciada pela

velocidade de agitação, já a aeração se mostrou menos significativa. Nas condições

otimizadas (500 rpm e 1,5 vvm) obteve-se a maior atividade enzimática (17,0 U/mL) e

produtividade (1,2 U/mL.h), em 14 h de cultivo.

Braga, Gomes e Kalil (2011) verificaram em seu estudo que a linhagem

ATCC 16045 de K. marxianus se destacou como boa produtora de β-galactosidase,

dentre outras leveduras testadas, apresentando em 24 h o máximo de 9,0 U/mL. A

linhagem foi selecionada para otimizar o meio de cultivo através de um planejamento

fatorial fracionário, seguido por um fatorial completo. Foram estudadas as seguintes

variáveis: concentração de lactose, de extrato de levedura, de peptona, de (NH4)2SO4,

de água de parboilização de arroz e o pH inicial. Nas melhores condições (120 g/L de

lactose; 5 g/L de extrato de levedura; 15 g/L de peptona; 15 g/L de (NH4)2SO4; 30 g/L

de água de parboilização de arroz e pH 4,0) foi obtido 10,4 U/mL.

17

2.5.2. Produção de inulinase

Níveis elevados de enzima têm sido obtidos em meios contendo inulina,

nos cultivos em batelada com leveduras. Porém, de acordo com Parekh e Margaritis

(1986) a aplicação industrial da inulinase será viável somente quando esta enzima

estiver disponível em grande quantidade a um preço competitivo. Assim, a produção

de inulinase por vários micro-organismos tem sido amplamente reportada na literatura.

Dentre os parâmetros do processo discutidos estão a composição do meio de cultivo,

o pH, a temperatura, a aeração e a agitação.

Poorna e Kulkarni (1995) utilizaram um planejamento experimental fatorial,

no qual a inulina foi a fonte de carbono com maior efeito positivo sobre a produção de

inulinase em cultivos de Aspergillus niger, obtendo-se atividade de até 80 UI/mL. Com

sacarose como fonte de carbono a atividade foi igual a 25 UI/mL.

Wei et al. (1998) testaram diferentes fontes de carbono e nitrogênio,

temperaturas, valores de pH e volumes de meio na produção de inulinase. Para

otimizar o meio de cultivo para obtenção da enzima de Kluyveromyces sp Y-85 foi

utilizada a análise de superfície de resposta. O meio selecionado composto por extrato

de alcachofra de Jerusalém, uréia, extrato de carne e água de maceração de milho,

nas concentrações de 8, 2, 0,2 e 4%, respectivamente, foi fermentado por 24 h a 30ºC,

obtendo-se 59,5 U/mL. Foi investigada ainda a produção da enzima em fermentadores

com capacidade de 15 e 1000 L. A atividade enzimática no fermentador de 1000 L foi

de 68,9 U/mL indicando que as condições estabelecidas e a linhagem empregada no

estudo são adequadas para ampliação da escala de produção.

Kalil et al. (2001) utilizaram Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 para

obtenção de inulinase. No estudo foram determinadas as variáveis mais relevantes na

produção da enzima através de um planejamento fatorial fracionário, seguido por um

fatorial completo. Os parâmetros avaliados foram pH, concentração de sacarose, de

peptona, de extrato de levedura e de K2HPO4. As variáveis, peptona, extrato de

levedura e K2HPO4 apresentaram efeitos positivos significativos sobre a produção de

inulinase. Nas condições otimizadas (14 g/L de sacarose; 20 g/L de peptona; 10 g/L de

extrato de levedura; 1 g/L de K2HPO4 e pH igual a 3,5), a atividade enzimática foi 127

U/mL, cerca de 6 vezes mais do que antes da otimização.

Na produção de inulinase por Kluyveromyces marxianus linhagem ATCC

16045, utilizando sacarose como fonte de carbono, Silva-Santisteban e Filho (2005)

verificaram os efeitos da agitação (50-550 rpm), da aeração (0,5-2,0 vvm) e do tipo de

agitador na produção da enzima por fermentação em batelada, empregando o meio

18

otimizado por Kalil et al. (2001). Os resultados obtidos demonstraram que o cultivo da

enzima foi fortemente influenciado pelas condições de agitação enquanto a taxa de

aeração se mostrou menos significativa. Altas velocidades de agitação reduziram a

produção de inulinase devido à diminuição da viabilidade celular. Além disso, o micro-

organismo foi bastante sensível a tensão de cisalhamento em valores acima de 0,22

Pa. A maior atividade enzimática, equivalente a 176 U/mL, foi obtida com um agitador

do tipo pitched blade up nas condições otimizadas (450 rpm, 1,0 vvm, pH 3,5 e 30ºC).

Makino et al. (2009) selecionaram linhagens de Kluyveromyces sp capazes

de produzir inulinase em meio a base de resíduos agroindustriais. Entre as 10 cepas

testadas apenas duas linhagens, NCYC 587 e NRRL Y-7571, produziram a enzima

utilizando os resíduos como substrato. A otimização do cultivo foi feita com ambas as

linhagens, avaliando-se o pH e a concentração de melaço, de água de maceração de

milho e de extrato de levedura. Nas condições otimizadas, correspondente ao ponto

central, a atividade enzimática foi de 735 e 722 U/mL para as linhagens NCYC 587 e

NRRL Y-7571 respectivamente, demonstrando a viabilidade da utilização de resíduos

agroindustriais na produção de inulinase.

2.6. Produção simultânea de β-galactosidase e inulinase

Após o cultivo para obtenção de β-galactosidase somente a biomassa é

aproveitada, devido à localização intracelular desta enzima, sendo o caldo fermentado

descartado. Para um melhor aproveitamento pode-se realizar concomitantemente a

produção de uma enzima extracelular, como a inulinase, a qual estará presente no

caldo do cultivo possibilitando a separação ao final do processo.

Um dos primeiros estudos relacionados à produção simultânea de β-

galactosidase e inulinase foi realizado por Hewitt e GrootWassink (1984). Os autores

utilizaram duas linhagens de Kluyveromyces fragilis (ATCC 12424 e ATCC 52466) e

substratos individuais ou mistos. Os resultados mostraram que a síntese de ambas as

enzimas sofreu maior repressão catabólica nos cultivos em batelada com substratos

mistos. Para a produção conjunta, somente o glicerol e o D-malato não apresentaram

efeito repressivo. Os valores de atividade enzimática obtidos no cultivo contínuo foram

significativamente melhores que os da batelada, principalmente nas menores taxas de

diluição.

Espinoza et al. (1992) avaliaram 5 linhagens de Kluyveromyces marxianus

para produção simultânea das enzimas β-galactosidase e pectinase ou inulinase.

Apesar da linhagem NRRL Y-1109 ter apresentado alta atividade de lactase, eles

19

selecionaram a CDBB L-278 para a produção simultânea, por ter apresentado a maior

atividade de inulinase e pectinase entre as linhagens testadas. No cultivo simultâneo

as atividades de lactase e pectinase foram 700 e 175 U/g de biomassa, enquanto as

de lactase e inulinase foram 411 e 382 U/g de biomassa, respectivamente. Nas duas

situações citadas a atividade enzimática de ambas as enzimas foram consideráveis,

demonstrando a viabilidade do cultivo simultâneo. Os autores também observaram um

decréscimo das atividades nos cultivos mistos em relação aos sistemas enzimáticos

simples, assim como Hewitt e GrootWassink (1984).

Além dos estudos acima mencionados, na literatura há relatos sobre a

produção concomitante de outras enzimas. Konsoula e Liakopoulou-Kyriakides (2007)

analisaram os efeitos de vários nutrientes sobre a co-produção das enzimas -amilase

e β-galactosidase por Bacillus subtilis e os melhores resultados foram obtidos com

água de maceração de milho ou triptona em combinação com diferentes farinhas,

juntamente com íons de cálcio. Sangeetha, Geetha e Arulpandi (2010), estudaram a

produção simultânea de protease e lipase por Bacillus licheniformis VSG1 isolado de

efluentes de curtume, e alcançaram resultados promissores utilizando extrato de

levedura, tributirina e Tween 80®, como emulsificante, em condições otimizadas de pH,

temperatura e tempo de incubação.

2.7. Considerações finais

As enzimas β-galactosidase intracelular e inulinase extracelular produzidas

por Kluyveromyces marxianus têm merecido inúmeros estudos devido ao potencial de

aplicações na indústria alimentícia e farmacêutica. No entanto, os trabalhos abordam

em sua maioria a produção individual das enzimas. Sendo assim, se faz necessário

incrementar as pesquisas sobre o processo de obtenção conjunta de β-galactosidase

e inulinase, incluindo a otimização do meio de cultivo, de modo a obter um método

viável para ampliação da escala de produção.

MATERIAL E MÉTODOS

21

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Micro-organismo

Para a produção simultânea de -galactosidase e inulinase foi empregada

a linhagem CCT 7082 de Kluyveromyces marxianus, gentilmente cedida pelo

Laboratório de Engenharia de Bioprocessos da FEA/UNICAMP. A levedura foi mantida

a 4ºC em ágar YM (Extrato de Malte e Levedura) inclinado composto por (g/L): extrato

de malte (3,0), extrato de levedura (3,0), peptona (5,0), glicose (10,0) e ágar (20,0)

(Pinheiro, Belo e Mota, 2003).

3.2. Preparo do inóculo

A cultura de K. marxianus CCT 7082 mantida em ágar YM foi transferida

para frasco erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de caldo do mesmo meio, e

incubada a 30ºC e 180 rpm por 24 h. Este meio foi utilizado como pré-inóculo.

Os meios para obtenção dos inóculos estão apresentados na Tabela 4. Os

meios 1A e 1B foram preparados em tampão fosfato de potássio 0,2 M pH 5,5. O pH

dos meios 2A e 2B, preparados em água destilada, foi ajustado para 6,5 com NaOH 1

M. Foram preparados frascos erlenmeyer de 500 mL contendo 150 mL de meio. A

esterilização foi feita em autoclave a 121ºC por 15 min. A lactose e a sacarose foram

esterilizadas por filtração em membrana com diâmetro de poros de 0,22 μm. O meio

foi inoculado com 10% (v/v) do pré-inóculo e incubado a 30ºC e 150 rpm por 24 h.

Tabela 4. Composição dos meios de inóculo.

Meio Composição (g/L) Referência

1A lactose (10,0), KH2PO4 (5,0), (NH4)2SO4 (1,2), extrato de

levedura (1,0) e MgSO4.7H2O (0,4) Pinheiro, Belo

e Mota.

(2003) 1B* sacarose (10,0), KH2PO4 (5,0), (NH4)2SO4 (1,2), extrato

de levedura (1,0) e MgSO4.7H2O (0,4)

2A sacarose (20,0), extrato de levedura (5,0), K2HPO4 (5,0),

NH4Cl (1,5), KCl (1,15) e MgSO4.7H2O (0,65) Kalil et al.

(2001) 2B*

lactose (20,0), extrato de levedura (5,0), K2HPO4 (5,0),

NH4Cl (1,5), KCl (1,15) e MgSO4.7H2O (0,65)

*Os meios 1A,1B e 2A, 2B se diferem somente em relação a fonte de carbono utilizada.

22

3.3. Seleção do meio de cultivo

Os meios de cultivo testados estão descritos na Tabela 5. Os meios 1A e

1B foram preparados em tampão fosfato de potássio 0,2 M pH 6,0. O pH dos meios 2A

e 2B, preparados em água destilada, foi ajustado para 3,5 com HCl 1 M. Os meios de

cultivo e os substratos foram esterilizados conforme descrito no item 3.2. O inóculo foi

padronizado utilizando câmara de Neubauer para a contagem de células, de modo a

iniciar todos os cultivos com a mesma concentração celular, igual a 1,0x107 células/mL

(Santiago et al., 2004). Utilizou-se frascos erlenmeyer aletados de 500 mL contendo

150 mL do meio em estudo, onde foi adicionado o inóculo padronizado.

Tabela 5. Composição dos meios de cultivo.

Meio Composição (g/L) Referência

1A lactose (28,2), extrato de levedura (17,0), (NH4)2SO4 (8,8),

KH2PO4 (5,0) e MgSO4.7H2O (0,4) Manera et al.

(2008) 1B*

sacarose (28,2), extrato de levedura (17,0), (NH4)2SO4

(8,8), KH2PO4 (5,0) e MgSO4.7H2O (0,4)

2A sacarose (14,0), peptona (20,0), extrato de levedura

(10,0) e K2HPO4 (1,0) Kalil et al.

(2001) 2B*

lactose (14,0), peptona (20,0), extrato de levedura (10,0)

e K2HPO4 (1,0)

*Os meios 1A, 1B e 2A, 2B se diferem somente em relação a fonte de carbono utilizada.

Os cultivos submersos foram conduzidos em agitador rotatório orbital

(Tecnal, TE-420) a 30ºC e 150 rpm por 96 h. Todos os cultivos foram realizados em

triplicata. Amostras foram devidamente coletadas no tempo inicial e a cada 24 h, para

acompanhamento da atividade enzimática de ambas as enzimas, da produção de

biomassa e variação no pH. A atividade de inulinase foi medida no sobrenadante do

caldo de cultivo (item 3.8.5.) após centrifugação a 4ºC e 5200×g por 10 min. A β-

galactosidase foi primeiramente extraída por rompimento das células (item 3.8.1.),

seguido da determinação da atividade enzimática de acordo com o item 3.8.4.

3.4. Cultivos com substratos individuais

O meio de cultivo 1 (Tabela 5) foi selecionado como o mais promissor e

utilizado na produção simultânea de β-galactosidase e inulinase com os substratos

galactose, inulina e glicerol, adicionados individualmente na concentração pré-

23

estabelecida (28,2 g/L), em substituição as fontes de carbono lactose e sacarose. O

inóculo foi preparado com o mesmo substrato individual do meio de cultivo, segundo a

composição (g/L) apresentada na Tabela 4 (Meio 1), e padronizado utilizando câmara

de Neubauer para a contagem de células (Santiago et al., 2004). Os cultivos foram

conduzidos em frascos erlenmeyer aletados com 150 mL de meio a 30ºC e 150 rpm

por 96 h, e analisados no tempo inicial e a cada 24 h conforme descrito no item 3.3.

Os ensaios foram realizados em triplicata.

3.5. Cultivos com substratos mistos

Nesta etapa, o meio de cultivo selecionado (Meio 1) foi empregado na

produção conjunta com substratos mistos, adicionados na mesma concentração que

os substratos individuais (28,2 g/L). Foram testadas três combinações de substratos

(g/L): lactose (14,1) e sacarose (14,1); lactose (14,1) e inulina (14,1); lactose (14,1) e

glicerol (14,1). O inóculo foi preparado e padronizado como descrito anteriormente. Os

cultivos com os substratos mistos foram conduzidos em frascos erlenmeyer aletados

com 150 mL de meio a 30ºC e 150 rpm por 96 h, e analisados no tempo inicial e a

cada 24 h em relação a atividade enzimática, a produção de biomassa e ao pH. Todos

os ensaios foram realizados em triplicata.

3.6. Otimização do meio de cultivo para produção simultânea

3.6.1. Delineamento composto central 23 (DCC)

Para otimizar o meio de cultivo para produção simultânea das enzimas, foi

selecionada a combinação de substratos lactose e inulina por apresentar resultados

mais promissores que os das demais combinações testadas. Os efeitos das variáveis

pH inicial, razão L/I (g de lactose/g de inulina) e tempo de adição da lactose (h) na

produção conjunta, foram avaliados utilizando um delineamento composto central 23

com 8 ensaios fatoriais e triplicata no ponto central (Rodrigues e Iemma, 2009).

As faixas de estudo foram determinadas com base em experimentos

preliminares e na literatura e os níveis das variáveis estão apresentados na Tabela 6.

A razão L/I foi calculada de modo que a soma dos dois substratos, lactose e inulina,

totalizasse 28,2 g /L. A quantidade dos demais reagentes do meio foi fixada em (g/L):

extrato de levedura (17,0), (NH4)2SO4 (8,8), KH2PO4 (5,0) e MgSO4.7H2O (0,4), de

acordo com a Tabela 5 para o Meio 1. A alimentação da lactose no decorrer do cultivo

24

teve em vista evitar ou reduzir a repressão da síntese de inulinase por glicose gerada

com a hidrólise da lactose.

Tabela 6. Níveis codificados e valores reais das variáveis independentes.

Variáveis independentes/níveis -1 0* +1

pH inicial 5,0 6,0 7,0

razão L/I (g de lactose/g de inulina) 0,5 1,0 1,5

tempo de adição da lactose (h) 0 24 48

*ponto central

O meio de cultivo foi preparado em tampão fosfato de potássio 0,2 M,

variando o pH de acordo com os ensaios do planejamento experimental. O inóculo foi

preparado com os mesmos substratos do meio de cultivo (lactose e inulina), segundo

a composição apresentada na Tabela 4 (Meio 1), e padronizado utilizando câmara de

Neubauer (Santiago et al., 2004). Os cultivos foram conduzidos em frascos erlenmeyer

aletados com 150 mL de meio a 30ºC e 150 rpm por 96 h, e analisados no tempo

inicial e a cada 24 h, conforme descrito anteriormente.

3.6.2. Delineamento composto central rotacional 22 (DCCR)

Na sequência foi realizado um delineamento composto central rotacional 22

(DCCR) com 11 ensaios (4 fatoriais, 4 axiais e 3 no ponto central), para as variáveis

que foram estatisticamente significativas no planejamento experimental anterior (pH e

razão L/I). A lactose foi adicionada no tempo inicial do cultivo, já que não apresentou

efeito significativo. Os níveis das variáveis estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Níveis codificados e valores reais das variáveis independentes.

Variáveis independentes/níveis -1,41 -1 0* 1 1,41

pH inicial 6,0 6,3 7,0 7,7 8,0

razão L/I (g de lactose/g de inulina) 0,5 0,8 1,5 2,2 2,5

*ponto central

O preparo e a padronização do inóculo, bem como do meio de cultivo,

foram realizados conforme descrito no planejamento experimental anterior (item 3.6.1).

25

3.7. Análise estatística

Os resultados foram avaliados por análise de variância (ANOVA) e teste de

Tukey a fim de verificar a existência de diferenças significativas entre os meios de

cultivo testados (p<0,05) e selecionar o mais promissor para a produção conjunta. A

análise dos resultados dos planejamentos experimentais foi realizada utilizando o

software Statistica® 6.0.

3.8. Métodos analíticos

3.8.1. Extração da enzima β-galactosidase

Para extração da β-galactosidase foram adicionados 1,1 g de pérolas de

vidro, com diâmetro entre 0,6 e 0,8 mm, para cada mililitro de suspensão celular. Um

mL de suspensão celular foi obtido por ressuspensão de 2,62 mg de células secas em

1 mL de tampão. A suspensão foi agitada por 20 min em vórtex, com intervalos de 2

min de repouso em banho de gelo a cada 2 min de agitação, obtendo-se o extrato

bruto. Para obtenção do extrato bruto clarificado a suspensão celular foi centrifugada a

4ºC e 5200×g por 10 min (Medeiros et al., 2008). A ressuspensão das células foi feita

em tampão fosfato de potássio 50 mM com MnCl2.4H2O 0,1 mM pH 6,6, de acordo

com Medeiros et al. (2012). O sobrenadante livre de células foi utilizado para estimar a

atividade enzimática.

3.8.2. Determinação de biomassa

A concentração de biomassa foi estimada por leitura da absorvância a 620

nm e convertida para massa de célula seca por mililitro (mg/mL) através de curva

padrão (Rech et al., 1999). Foram construídas curvas padrão de biomassa para todos

os meios de cultivo testados (em apêndice).

3.8.3. Determinação de massa seca

A determinação de massa seca foi feita por secagem em estufa a 105ºC

até peso constante, segundo o método adaptado de Hensing et al. (1994).

3.8.4. Determinação da atividade enzimática de β-galactosidase

A atividade enzimática de β-galactosidase foi determinada empregando-se

o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) como substrato, conforme Inchaurrondo,

Yantorno e Voget (1994). Em um tubo de ensaio contendo 2 mL de ONPG 1,25 mM,

26

preparado em tampão fosfato de potássio 50 mM com MnCl2.4H2O 0,1 mM pH 6,6,

foram adicionados 50 µL da solução enzimática. A reação ocorreu sob agitação e

controle da temperatura a 37ºC, sendo interrompida após 5 min pela adição de 0,5 mL

de carbonato de sódio 1 M. O composto o-nitrofenol (ONP) formado foi estimado por

leitura da absorvância a 420 nm. Uma unidade de atividade enzimática (U) é definida

como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 mol/mL de o-nitrofenol por

min nas condições do ensaio. O coeficiente de extinção molar do o-nitrofenol (ε)

determinado experimentalmente foi igual a 4,85 cm2/mol.

3.8.5. Determinação da atividade enzimática de inulinase

Em tubo de ensaio contendo 9,0 mL de solução de sacarose ou inulina a

2% em tampão acetato 0,1 M pH 4,5, foi adicionado 1,0 mL da solução enzimática

(Rouwenhorst et al., 1988). A reação ocorreu sob agitação e controle da temperatura a

50ºC. Em intervalos de tempo pré-determinados (1, 3, 5, 7 e 9 min) foram retirados 1,0

mL de amostra para determinação dos açúcares redutores liberados. A cada amostra

foi realizado um branco para corrigir a liberação de açúcares devido à hidrólise não

enzimática. Foi construída uma curva de absorvância em função do tempo, e com

auxílio da curva padrão de açúcar redutor (em apêndice), determinou-se a atividade

enzimática. Uma unidade de atividade enzimática (U) é definida como a capacidade da

enzima liberar 1 mol/mL de glicose por min nas condições do ensaio.

3.8.6. Determinação de açúcares redutores

Os açúcares redutores foram determinados pelo método do ácido 3-5-

dinitrossalicílico (DNS) de acordo com Miller (1959). Este método baseia-se na

redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico resultando em

um complexo de coloração alaranjada.

3.8.7. Determinação do pH

A determinação do pH da amostra foi realizada em medidor de pH

segundo a AOAC (2000).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

28

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Seleção do meio de cultivo

A levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082 foi selecionada como boa

produtora de β-galactosidase por Manera et al. (2008), que otimizaram um meio de

cultivo a base de lactose para a produção da enzima de interesse. Já Kalil et al. (2001)

maximizaram a produção de inulinase em meio de cultivo com sacarose, utilizando a

linhagem ATCC 16045 da mesma levedura. Assim, considerando o objetivo de manter

a produção de β-galactosidase e obter concomitantemente a inulinase, foi empregada

a linhagem CCT 7082 e avaliados os meios 1 e 2 (Tabela 5), otimizados por Manera et

al. (2008) e Kalil et al. (2001), respectivamente.

Convém ressaltar que até a realização do presente estudo não se tinha

conhecimento da capacidade de produção de inulinase e da viabilidade de obtenção

concomitante das enzimas β-galactosidase e inulinase por K. marxianus CCT 7082. A

Figura 5 apresenta os resultados obtidos no acompanhamento dos cultivos com o

meio 1, adicionado de lactose ou sacarose.

Figura 5. Acompanhamento das atividades enzimáticas de inulinase (▼) e

β-galactosidase (▲), da produção de biomassa () e variação no pH () para a

levedura K. marxianus CCT 7082 no meio 1 com: lactose (a) ou sacarose (b).

Conforme mostra a Figura 5, no meio de cultivo 1 houve produção de

ambas as enzimas tanto em lactose (a) quanto em sacarose (b). No meio adicionado

(a) (b)

29

de lactose a atividade máxima de β-galactosidase foi de 19,7±0,7 U/mL em 72 h de

cultivo. No mesmo tempo de cultivo a atividade de inulinase foi igual a 1,8±0,1 U/mL.

Em sacarose a atividade máxima de inulinase, 39,8±1,7 U/mL, foi obtida em 96 h, e a

atividade de β-galactosidase se manteve praticamente constante em 3,0 U/mL após as

24 h de cultivo. Em lactose a produção de biomassa atingiu 18,4±0,4 mg/mL (Fig. 5

(a)), enquanto em sacarose não ultrapassou o valor de 12,8±0,1 mg/mL (Fig. 5 (b)).

No meio 1 o aumento da atividade de β-galactosidase coincidiu com o

aumento na produção de biomassa, comportamento também observado em trabalhos

reportados na literatura (Pinheiro, Belo e Mota, 2003; Hsu, Yu e Chou, 2005; Manera

et al., 2008). Em relação à inulinase, no meio com sacarose (Fig. 5 (b)), verifica-se que

não há associação com a biomassa, porque o pico de atividade foi obtido em 96 h de

cultivo onde a produção de biomassa já se encontra constante. Sguarezi et al. (2009)

descreveram situação semelhante na obtenção da enzima inulinase com K. marxianus

NRRLY-7571, onde os resultados obtidos sugeriram que a produção desta enzima foi

parcialmente associada ao crescimento celular, já que a maior taxa de produção

ocorreu quando o crescimento microbiano era negligenciável.

Na Figura 6 onde são apresentados os resultados obtidos com o meio 2,

verifica-se que em lactose (a) não houve produção de inulinase nos tempos de cultivo

avaliados. No mesmo meio a atividade de β-galactosidase alcançou 10,1±0,3 U/mL em

24 h, seguido por uma queda acentuada após as 48 h. No meio com sacarose (b)

houve produção de ambas as enzimas, porém a maior atividade de β-galactosidase,

2,7±0,3 U/mL foi obtida em 24 h de cultivo, enquanto a de inulinase, igual a 15,8±0,6

U/mL, foi em 96 h. Sendo assim, para a produção simultânea o tempo considerado foi

48 h de cultivo, onde obteve-se 2,7±0,3 U/mL de β-galactosidase e 12,4±0,1 U/mL de

inulinase.

A produção de biomassa no meio 2 alcançou 11,2±0,5 mg/mL em lactose

(Fig. 6 (a)) e 9,3±0,4 mg/mL em sacarose (Fig. 6 (b)). Em relação ao pH observou-se

um pequeno aumento no decorrer do cultivo, atingindo 3,96±0,01 no meio com lactose

e 4,22±0,05 em sacarose, diferentemente do meio de cultivo 1 onde a variação no pH

dos tempos analisados não foi maior que 0,03.

O comportamento verificado nos cultivos com o meio 2, principalmente a

ocorrência de uma queda acentuada da atividade de -galactosidase após 48 h, pode

estar relacionado com a instabilidade desta enzima em valores de pH muito ácidos, já

que o pH inicial foi igual a 3,5. Em relação à estabilidade, Medeiros (2008) já havia

verificado que a enzima -galactosidase proveniente da linhagem CCT 7082 é mais

30

estável na faixa de pH de 6,6 a 8,6. Diferentemente da -galactosidase, a inulinase

apresenta estabilidade em uma faixa mais ampla de pH, sendo que o ótimo está entre

3,5 e 5,3 (Vandamme e Derycke, 1983; Manzoni e Cavazzoni, 1988).



K. marxianus CCT 7082 no meio 2 com: lactose (a) ou sacarose (b).

Nos presentes cultivos foram utilizados frascos aletados possibilitando uma

maior aeração do meio, com consequente aumento na produção de biomassa e de

enzimas nos tempos iniciais do cultivo. Como exemplo, o meio otimizado por Manera

et al. (2008) apresentou em 24 h 5,0 U/mL de β-galactosidase e aproximadamente 3,0

mg/mL de biomassa, já neste estudo com o mesmo meio de cultivo em frasco aletados

alcançou-se 16,5 U/mL de β-galactosidase e 12,2 mg/mL de biomassa em 24 h.

A partir dos resultados obtidos nos meios 1 e 2 (Figuras 5 e 6) é possível

verificar que a lactose favoreceu a produção de β-galactosidase e a sacarose de

inulinase. Hewitt e GrootWassink (1984) observaram comportamento semelhante na

produção conjunta de β-galactosidase e inulinase de K. fragilis ATCC 12424, onde

obtiveram 9,2 U/mL de inulinase e 0,2 U/mL de β-galactosidase em sacarose, e 1,6

U/mL de inulinase e 1,3 U/mL de β-galactosidase em lactose. Portanto, os resultados

alcançados no presente estudo com K. marxianus CCT 7082 foram mais promissores

para a produção conjunta, sobretudo em relação a enzima β-galactosidase.

A Figura 7 apresenta a média e o desvio padrão das máximas atividades

enzimáticas obtidas simultaneamente nos meios 1 e 2, com lactose ou sacarose.

(a) (b)

31


inulinase (b) nos meios 1 e 2 com: lactose (L) ou sacarose (S). Letras diferentes nas

colunas da mesma cor indicam que há diferença significativa a 95% de confiança.

É possível observar que o meio 1L com lactose (a) foi o mais promissor

para a produção de β-galactosidase. Para a enzima inulinase o meio 1S com sacarose

(b) apresentou o melhor resultado. Sendo assim, o meio 1 com pH 6,0 foi selecionado

para os estudos de produção simultânea das enzimas β-galactosidase e inulinase com

substratos individuais e mistos.

4.2. Cultivos com substratos individuais

Nesta etapa foi avaliada a produção concomitante de β-galactosidase e

inulinase no meio 1 com outros substratos individuais: galactose, inulina e glicerol, na

concentração de 28,2 g/L, como feito para a lactose e a sacarose (item 4.1).

A escolha dos substratos galactose e inulina foi devido aos mesmos serem

relatados como indutores das enzimas β-galactosidase e inulinase, respectivamente,

em trabalhos reportados na literatura (Rajoka, Khan e Shahid, 2003; Gill et al., 2003;

Hsu, Yu e Chou, 2005; Singh, Sooch e Puri, 2007). Entretanto, a utilização destes

substratos só pode ser justificada se os resultados forem significativamente melhores

que os obtidos com lactose e/ou sacarose, já que apresentam um custo elevado que

pode inviabilizar os processos industriais. A inulina extraída de fontes naturais, como

raízes de chicória (Gupta et al., 1994), tubérculos de dália (Singh, Sooch e Puri, 2007)

e alcachofra de Jerusalém (Wei et al., 1998), é uma alternativa para a redução dos

custos e viabilização dos cultivos em larga escala.

O glicerol, conhecido também como 1,2,3-propanotriol, é o principal

subproduto obtido durante a transesterificação de óleos vegetais e gorduras animais.

(a) (b)

32

O emprego do glicerol em cultivos microbianos é de grande interesse do ponto de vista

econômico, por ser um subproduto disponível e de baixo custo que pode ser utilizado

como única fonte de carbono por vários micro-organismos, inclusive leveduras (Silva,

Mack e Contiero, 2009; Abad e Turon, 2012; Taccari et al.; 2012). Na Figura 8 é

apresentado o acompanhamento dos cultivos.



K. marxianus CCT 7082 no meio 1 com: galactose (a), inulina (b) e glicerol (c).

(a) (b)

(c)

33

No presente estudo, foi utilizado o glicerol puro, mas a viabilidade do uso

do glicerol bruto, proveniente da síntese de biodiesel, em cultivos microbianos já foi

avaliada (Papanikolaou e Aggelis, 2002; Santos et al., 2011; Abad e Turon, 2012).

Em galactose (Fig. 8 (a)) a máxima atividade de β-galactosidase, igual a

8,4±0,3 U/mL, foi obtida em 48 h, enquanto a de inulinase, 13,7±1,7 U/mL, foi em 96 h

de cultivo. Para a produção simultânea o tempo considerado foi 72 h onde alcançou-se

7,7±0,2 U/mL de β-galactosidase e 13,4±1,5 U/mL de inulinase. No meio a base de

inulina (Fig. 8 (b)) os picos de atividade enzimática ocorreram em 96 h de cultivo, onde

obteve-se 3,2±0,1 U/mL de β-galactosidase e 51,3±5,2 U/mL de inulinase. Quando se

utilizou o glicerol como fonte de carbono (Fig. 8 (c)) as atividades em 96 h foram

8,3±0,1 e 19,3±2,9 U/mL para a β-galactosidase e a inulinase, respectivamente.

Em relação a produção de biomassa (Fig. 8), observa-se que após as 48 h

de cultivo praticamente não ocorreu variação, atingindo valores próximos a 11 mg/mL

em galactose (a) e inulina (b), e 8 mg/mL no meio com glicerol (c). O aumento da

atividade enzimática, de ambas as enzimas, nos meios com galactose e glicerol foi

associado à produção de biomassa. Em inulina a atividade da enzima β-galactosidase

apresentou o mesmo comportamento, mas a atividade de inulinase foi maior no tempo

final do cultivo (96 h) onde a produção de biomassa já se encontra constante. Para o

pH nota-se uma pequena alteração de 6,00 para 6,15 ao longo dos cultivos com

galactose (a) e inulina (b), já no meio com glicerol (c) houve um aumento para 6,35 em

24 h seguido por uma queda até 6,22.

Hewitt e GrootWassink (1984) quando utilizaram a inulina e o glicerol na

produção concomitante obtiveram 53,0 e 10,8 U/mL de inulinase, respectivamente,

resultados semelhantes aos encontrados no presente estudo, porém a atividade de β-

galactosidase foi bem inferior, 0,42 U/mL em inulina e 0,14 U/mL em glicerol, assim

como a atividade de ambas as enzimas no meio à base de galactose, igual a 1,6 U/mL

de inulinase e 1,3 U/mL de β-galactosidase. Em comparação ao estudo de Hewitt e

GrootWassink (1984) os resultados aqui obtidos com os substratos individuais foram

mais promissores para a produção simultânea.

Algumas inulinases microbianas apresentam atividade sobre a sacarose e

a inulina. É geralmente aceito que a taxa de atividade sobre a sacarose em relação à

inulina (S/I) caracteriza a enzima: para uma inulinase a taxa S/I é menor do que 100

(Ettalibi e Baratti, 1987). Neste estudo a atividade da enzima obtida no meio a base de

inulina foi estimada em ambos os substratos e a relação S/I foi igual a 77±2,9 (<100),

confirmando que a enzima produzida por K. marxianus CCT 7082 é uma inulinase.

34

A Figura 9 apresenta a média e o desvio padrão para as máximas

atividades de β-galactosidase e inulinase obtidas simultaneamente nos substratos

individuais: lactose, sacarose, galactose, inulina e glicerol.


inulinase (b) nos substratos individuais. Letras diferentes nas colunas da mesma cor

indicam que há diferença significativa a 95% de confiança.

De acordo com os resultados mostrados, verifica-se que a produção de β-

galactosidase (Fig. 9 (a)) é induzida principalmente pela lactose, seguido do glicerol e

galactose. Os valores obtidos para a mesma enzima em inulina e sacarose são muito

inferiores aos alcançados com as outras fontes de carbono. A atividade de inulinase

(Fig. 9 (b)) em inulina foi a maior alcançada, seguido da sacarose, glicerol e galactose.

A menor atividade de inulinase foi obtida em lactose. Os resultados da produção

conjunta em glicerol foram promissores e não diferiram estatisticamente dos obtidos

no meio com galactose, que foi descartada nos ensaios posteriores com substratos

mistos devido ao custo elevado, conforme mencionado anteriormente.

4.3. Cultivos com substratos mistos

Visando manter a produção de β-galactosidase e obter concomitantemente

a inulinase no mesmo meio de cultivo, a lactose, melhor indutor da β-galactosidase, foi

combinada aos substratos indutores da inulinase, inulina e sacarose, e ao glicerol. Na

Figura 10 estão apresentados os resultados obtidos com os substratos mistos.

No meio à base de lactose e sacarose (Fig. 10 (a)), as máximas atividades

foram 18,9±0,6 U/mL de β-galactosidase e 10,0±1,1 U/mL de inulinase em 48 h de

cultivo. Em lactose e inulina (Fig. 10 (b)) o melhor resultado para a produção conjunta

(a) (b)

35

também foi em 48 h, onde obteve-se 16,8±1,1 U/mL de β-galactosidase e 21,1±3,0

U/mL de inulinase. Por fim, no meio com lactose e glicerol (Fig. 10 (c)) a atividade de

β-galactosidase em 72 h foi igual a 23,6±2,0 U/mL e a de inulinase 0,7±0,0 U/mL. É

possível observar que a combinação de substratos lactose e glicerol foi desfavorável

para a produção simultânea, porque apesar da atividade de β-galactosidase ter sido

muito promissora, a produção da enzima inulinase foi severamente afetada resultando

em atividades quase nulas.

Figura 10. Acompanhamento das atividades enzimáticas de inulinase (▼) e

β-galactosidase (▲), da produção de biomassa () e variação no pH () para a

levedura K. marxianus CCT 7082 no meio 1 com: lactose e sacarose (a), lactose e

inulina (b) e lactose e glicerol (c).

(a) (b)

(c)

36

Na literatura há relatos de que o glicerol favoreceu a produção da enzima

β-galactosidase quando utilizado na forma individual ou em combinação com outros

substratos (Fowler, 1972; Chen, Lee e Houng, 1992). Provavelmente isso acontece

porque o glicerol não causa repressão catabólica na síntese da enzima.

Através da Figura 10, verifica-se que nos substratos mistos as atividades

enzimáticas foram melhores em termos de produção conjunta, exceto para o meio com

lactose e glicerol. No entanto, quando são comparados os resultados obtidos com os

substratos mistos em relação aos substratos individuais observa-se que a produção de

inulinase foi bem inferior, enquanto a de β-galactosidase foi menos afetada. Espinoza

et al. (1992) também constataram que a produção simultânea de enzimas resultou na

redução dos níveis observados nos sistemas enzimáticos simples, especificadamente

26% de β-galactosidase e 47% de inulinase foram alcançados.

De acordo com Hewitt e GrootWassink (1984), o decréscimo observado

nos níveis enzimáticos em cultivos com substratos mistos está relacionado a utilização

sequencial dos substratos atendendo a um crescimento diáuxico, onde podem ser

observadas múltiplas fases-lag devido à existência de diferentes fontes de carbono. O

fenômeno de diauxia é causado pela mudança nas vias metabólicas para se adaptar

ao novo substrato, após o primeiro e preferencial ter sido consumido (Maugeri, 2011).

Hewitt e GrootWassink (1984) ainda relataram que o cultivo para obtenção

concomitante de β-galactosidase e inulinase de Kluyveromyces fragilis ATCC 12424

em um meio contendo substratos mistos, lactose e inulina, levou a uma produção de

71 e 40% das atividades máximas obtidas com os substratos individuais. Conforme os

autores, a produção conjunta de β-galactosidase e inulinase foi sensível à repressão

catabólica, portanto o uso de um meio com mistura de substratos resultou em uma

taxa de produção menor. Isso também foi relatado para a inulinase em outros estudos

(GrootWassink e Hewitt, 1983; Rouwenhorst et al., 1988).

Segundo Flores et al. (2000) a repressão catabólica é definida como o

processo no qual açúcares facilmente assimiláveis no metabolismo provocam a

repressão da transcrição de genes que codificam as enzimas necessárias para o uso

de fontes alternativas de carbono. A repressão catabólica é comumente referida ao

efeito da glicose, já que para leveduras a glicose é o principal substrato regulador em

condições aeróbicas, mas aparentemente não é um fenômeno restrito à mesma

(Fiechter, Fuhrmann e Kappeli, 1981). Pelo visto a repressão catabólica pela fonte de

carbono pode ser o principal mecanismo de regulação da produção de enzimas.

37

No presente estudo a redução das atividades enzimáticas nos cultivos

com os substratos mistos lactose e inulina, em relação aos substratos individuais, foi

de 15 e 59% para a β-galactosidase e a inulinase, respectivamente. Para a inulinase o

resultado obtido foi semelhante aos encontrados por Hewitt e GrootWassink (1984) e

Espinoza et al. (1992). Em relação a β-galactosidase convém salientar que a atividade

foi ligeiramente afetada tornando a produção conjunta ainda mais promissora. Assim,

como alternativa para obter um aumento da produção de ambas as enzimas no cultivo

simultâneo com substratos mistos utilizou-se a técnica de planejamento experimental.

4.4. Otimização do meio de cultivo para produção simultânea

4.4.1. Delineamento composto central 23 (DCC)

Nesta etapa avaliou-se os efeitos do pH, da razão L/I e do tempo de adição

da lactose sobre a produção simultânea de β-galactosidase e inulinase, através de um

delineamento composto central 23. A Tabela 8 apresenta a matriz com os valores

codificados e reais das variáveis, e a resposta para o rendimento conjunto do cultivo,

considerando-se a maior atividade de β-galactosidase e a correspondente de inulinase

obtidas simultaneamente em cada ensaio do planejamento experimental.

Tabela 8. Matriz do delineamento composto central 23 com valores codificados e reais

(entre parênteses) e o máximo rendimento conjunto.

Ensaio pH Razão

L/I

Tempo*

(h)

Rendimento de

β-galactosidase

(%)**

Rendimento

de inulinase

(%)**

Rendimento

conjunto

(%)***

1 -1 (5,0) -1 (0,5) -1 (0) 64,5 32,7 97,2

2 +1 (7,0) -1 (0,5) -1 (0) 58,4 82,7 141,0

3 -1 (5,0) +1 (1,5) -1 (0) 99,5 34,5 134,0

4 +1 (7,0) +1 (1,5) -1 (0) 98,0 83,8 181,8

5 -1 (5,0) -1 (0,5) +1 (48) 93,9 33,9 127,8

6 +1 (7,0) -1 (0,5) +1 (48) 67,5 100,8 168,3

7 -1 (5,0) +1 (1,5) +1 (48) 88,3 32,7 121,1

8 +1 (7,0) +1 (1,5) +1 (48) 103,0 77,6 180,6

9 0 (6,0) 0 (1,0) 0 (24) 90,9 40,9 131,8

10 0 (6,0) 0 (1,0) 0 (24) 92,9 42,5 135,4

11 0 (6,0) 0 (1,0) 0 (24) 89,3 40,9 130,3

* Tempo de adição da lactose

** Rendimento individual (%)= atividade máxima do ensaio

atividade máxima nos substratos individuais×100

*** Soma dos rendimentos individuais

38

Como visto no item 4.2, nos substratos lactose e inulina foram obtidas as

máximas atividades enzimáticas, igual a 19,7±0,7 U/mL de β-galactosidase e 51,3±5,2

U/mL de inulinase, respectivamente. Devido à redução da atividade de ambas as

enzimas nos cultivos com substratos mistos em relação aos substratos individuais, os

valores máximos mencionados foram utilizados no cálculo do rendimento individual de

cada enzima nos ensaios do planejamento experimental, onde foram adicionados os

mesmos substratos, lactose e inulina, mas na forma mista. A soma dos rendimentos

individuais resultou no rendimento conjunto. Os rendimentos de β-galactosidase acima

de 100%, como nos ensaios 6 (Tabela 8), 4 e 6 (Tabela 10), foram obtidos devido as

atividades alcançadas nos planejamentos terem sido maiores que 19,7 U/mL.

A Figura 11, apresenta o acompanhamento das atividades enzimáticas de

β-galactosidase e inulinase, da produção de biomassa e a variação no pH ao longo do

cultivo, para os ensaios do delineamento composto central 23.



23.

(a) (b)

(c) (d)

39

Conforme mostra a Figura 11 (a), os ensaios 1 e 3 apresentaram picos de

atividade de β-galactosidase em 48 h de cultivo. Para os ensaios 2, 4 e 6 e os pontos

centrais os picos ocorreram em 72 h, e nos ensaios 5, 7 e 8 as máximas atividades

foram obtidas em 96 h. Em relação à inulinase (Fig. 11 (b)), os picos de atividade dos

ensaios 1, 2, 3, 6, 8 e 9 ocorreram no mesmo tempo que os da β-galactosidase, já no

ensaio 4 a máxima atividade foi obtida em 96 h e nos demais (5, 7, 10 e 11) em 48 h.

Nos ensaios 5, 6, 7 e 8 onde a lactose foi adicionada em 48 h o acompanhamento dos

cultivos foi estendido até 120 h, porém, observou-se que após 96 h a atividade de β-

galactosidase sofreu uma queda acentuada (dados não mostrados), inviabilizando a

produção conjunta. É possível observar ainda que todos os valores de pH (Fig. 11 (d))

apresentaram pequenas variações no decorrer do cultivo, principalmente o pH 6,0 no

ponto central do planejamento experimental.

O máximo rendimento conjunto para cada ensaio variou de 97 a 182%. Os

melhores resultados foram alcançados nos ensaios 4 e 8 (Tabela 8), com rendimentos

de 181,8 (72 h) e 180,6% (96 h), respectivamente. As condições do ensaio 4 foram pH

no nível +1 (7,0), razão L/I no nível +1 (1,5=16,9 g de lactose/11,3 g de inulina) e o

tempo de adição da lactose no nível -1 (0=tempo inicial). No ensaio 8 os valores de pH

e razão L/I foram os mesmos do ensaio 4, mas a lactose foi adicionada no tempo de

48 h (nível +1). A Figura 12 apresenta a análise dos efeitos principais e de interação

sobre o rendimento conjunto do cultivo utilizando K. marxianus CCT 7082.

Figura 12. Gráfico de Pareto dos efeitos para o DCC. Barras que cruzam a linha

pontilhada representam efeitos estatisticamente significativos com 95% de confiança.

p=.05

Estimativa dos efeitos (valores absolutos)

1L x 3L

1L x 2L

(3) tempo (L)

2L x 3L

(2) razão L/I (L)

(1) pH (L) 7.45316

3.23311

-2.79884

1.70330

0.89741

0.32728

40

Os resultados mostram (Fig. 12), que o rendimento do cultivo simultâneo

foi mais significativamente afetado, ao nível de significância de 5% (p<0,05), pelo pH e

a razão L/I. A interação entre a razão L/I e o tempo de adição da lactose apresentou

efeito significativo, mas negativo. Portanto, um incremento no pH e na razão L/I (nível -

1 para +1) resultou em maiores rendimentos conjunto. Os efeitos do tempo de adição

da lactose e das demais interações não foram estatisticamente significativos para a

resposta avaliada. Para verificar a validade do modelo do rendimento conjunto (%) em

função das variáveis significativas codificadas foi realizada uma análise de variância

(ANOVA), apresentada na Tabela 9. Os parâmetros não significativos (p>0,05) foram

eliminados do modelo e adicionados aos resíduos. O coeficiente de correlação (0,951)

e o F calculado (5,06 vezes maior que o F tabelado) a 95% de confiança foram muito

bons, assim, o modelo linear obtido (Eq. 1) é adequado para descrever a resposta em

função das variáveis analisadas.


composto central 23.

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática F calculado

Regressão 6101,1 3 2033,7 22,0

Resíduos 645,7 7 92,2

Total 6746,8 10

Coeficiente de correlação: R= 0,951

F0,95;3;7= 4,35

Rendimento conjunto (%) = 140,8 + 24,0 (pH) + 10,4 (razão L/I) – 9,0 (razão L/I x

tempo) (Eq. 1)

A partir do modelo empírico validado foram geradas as superfícies de

resposta e as curvas de contorno, apresentadas na Figura 13, a fim de determinar as

melhores condições para obtenção de rendimentos mais promissores. De acordo com

a Figura 13 (a) os maiores rendimentos conjunto, cerca de 180%, foram obtidos em

valores mais elevados de pH (7,0) e razão L/I (1,5). Na Figura 13 (b) observa-se que

os melhores resultados foram alcançados em pH 7,0, independente do tempo em que

a lactose foi adicionada. Para a Figura 13 (c) verifica-se que em razão L/I de 1,5 e no

menor tempo de adição da lactose, correspondente ao início do cultivo, são obtidos os

resultados mais promissores do rendimento conjunto.

41

(a)

(b)

(c)

Figura 13. Superfícies de resposta e curvas de contorno para o rendimento conjunto

como uma função: (a) do pH e razão L/I; (b) do pH e tempo; (c) da razão L/I e tempo.

42

Sendo assim, a análise das superfícies de resposta e curvas de contorno

sugere que o aumento das faixas de estudo das variáveis pH e razão L/I poderiam

levar a condição ótima para a produção simultânea das enzimas.

4.4.2. Delineamento composto central rotacional 22 (DCCR)

Com base nos resultados obtidos anteriormente (item 4.4.1.), um segundo

planejamento experimental foi realizado com as variáveis significativas, pH e razão L/I,

tendo como resposta o rendimento conjunto do cultivo. O ensaio 4 (pH 7,0 e razão L/I

1,5) que apresentou os melhores resultados no planejamento anterior foi definido

como ponto central no novo planejamento. A Tabela 10 apresenta a matriz com os

valores codificados e reais das variáveis, e a resposta para o rendimento conjunto,

considerando-se a máxima atividade da enzima β-galactosidase e a correspondente

de inulinase obtidas simultaneamente em cada um dos ensaios.

Tabela 10. Matriz do delineamento composto central rotacional 22 com valores

codificados e reais (entre parênteses) e o máximo rendimento conjunto.

Ensaio pH Razão

L/I

Rendimento de

β-galactosidase

(%)*

Rendimento

de inulinase

(%)*

Rendimento

conjunto

(%)**

1 -1 (6,3) -1 (0,8) 71,6 63,0 134,5

2 +1 (7,7) -1 (0,8) 84,3 51,5 135,7

3 -1 (6,3) +1 (2,2) 90,4 61,8 152,1

4 +1 (7,7) +1 (2,2) 125,9 55,9 181,8

5 -1,41 (6,0) 0 (1,5) 88,3 43,3 131,6

6 +1,41 (8,0) 0 (1,5) 113,7 52,8 166,5

7 0 (7,0) -1,41 (0,5) 59,9 79,5 139,4

8 0 (7,0) +1,41 (2,5) 95,9 72,9 168,8

9 0 (7,0) 0 (1,5) 90,4 84,4 174,8

10 0 (7,0) 0 (1,5) 92,4 83,0 175,4

11 0 (7,0) 0 (1,5) 92,9 83,2 176,1

* Rendimento individual (%)= atividade máxima do ensaio

atividade máxima nos substratos individuais ×100

** Soma dos rendimentos individuais

A Figura 14 apresenta o acompanhamento das atividades enzimáticas de

β-galactosidase e inulinase, da produção de biomassa e a variação no pH ao longo do

cultivo para os ensaios do delineamento composto central rotacional 22.

43



rotacional 22.

Conforme mostra a Figura 14 (a), os ensaios 3, 4, 6, 7 e 8 apresentaram

picos de atividade de β-galactosidase em 48 h de cultivo. Para os demais ensaios, as

máximas atividades foram obtidas em 72 h. Em relação a inulinase (Fig. 14 (b)), os

picos de atividade dos ensaios 5 e 6 ocorreram em 48 h, já nos ensaios 1, 3, 4, 8, 9,

10 e 11 as máximas atividades foram obtidas em 72 h, e nos demais (2, 7) em 96 h. A

produção de biomassa, estimada em massa seca (mg/mL), nos dois planejamentos

(Figs. 11 e 14 (c)) atingiu valores entre 11,0 e 13,6 mg/mL. Os valores de pH 6,0, 6,3 e

7,0 (Fig. 14 (d)) apresentaram pequenas variações no decorrer do tempo, já para os

valores de pH 7,7 e 8,0 ao final do cultivo as diferenças foram de até 0,5 e 0,6,

respectivamente.

O máximo rendimento conjunto para cada ensaio variou de 132 a 182%.

Os melhores resultados foram alcançados no ensaio 4 e nos pontos centrais, em 72 h

de cultivo (Tabela 10). As condições do ensaio 4 foram pH no nível +1 (7,7) e razão L/I

(c) (d)

(b) (a)

44

no nível +1 (2,2=19,4 g de lactose/8,8 g de inulina), obtendo-se um rendimento de

181,8%. Nos pontos centrais, ensaios 9, 10 e 11, as condições empregadas foram pH

7,0 e razão L/I de 1,5 (16,9 g de lactose/11,3 g de inulina), com rendimentos de 174,8,

175,4 e 176,1%, respectivamente.

O ensaio 8 também foi promissor para ambas as enzimas, principalmente

em relação a β-galactosidase. A razão L/I empregada, igual a 2,5, corresponde a 20,1

g de lactose/8,1 g de inulina. Considerando-se que o preço da lactose é muito inferior

ao da inulina, este ensaio se torna interessante do ponto de vista econômico.

A Tabela 11 apresenta o coeficiente de regressão, o desvio padrão, o valor

t, o valor p e os limites de confiança para o rendimento conjunto (%). Como pode-se

observar os termos quadráticos e lineares foram significativos a 95% de confiança. A

interação entre pH e razão L/I também foi estatisticamente significativa (p<0,05).

Tabela 11. Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, valor t, valor p e

limites de confiança, provenientes do delineamento composto central rotacional 22,

para o rendimento conjunto.

Coef. de

regressão

Desvio

padrão t (5) p

Lim. de

conf.

-95%

Lim. de

conf.

+95%

Média 175,5 2,7 66,3 0,000 168,7 182,3

(1) pH (L)* 10,1 1,6 6,2 0,002 5,9 14,2

pH (Q)* -13,4 1,9 -6,9 0,001 -18,4 -8,4

(2) razão L/I (L)* 13,2 1,6 8,1 0,000 9,0 17,4

razão (Q)* -10,8 1,9 -5,6 0,003 -15,8 -5,9

1L x 2L* 7,1 2,3 3,1 0,027 1,2 13,0

*fatores estatisticamente significativos a 95% de confiança (p<0,05).

Para validação do modelo quadrático do rendimento conjunto em função

das variáveis significativas codificadas foi realizada a análise de variância (ANOVA),

conforme apresentado na Tabela 12.

O coeficiente de correlação obtido foi de 0,986 e o F calculado 6,97 vezes

maior que o valor tabelado a 95% de confiança (p<0,05).

45


composto central rotacional 22.

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática F calculado

Regressão 3690,7 5 738,1 35,2

Resíduos 105,0 5 21,0

Total 3795,6 10

Coeficiente de correlação: R= 0,986

F0,95;5;5= 5,05

Em vista dos ótimos resultados da análise de variância pôde-se obter o

modelo codificado que descreve o comportamento da produção conjunta, expresso na

Eq. 2, e construir a superfície de resposta e a curva de contorno da Figura 15.

Rendimento conjunto (%) = 175,5 + 10,0 (pH) – 13,4 (pH)2 + 13,2 (razão L/I) – 10,8

(razão L/I)2 + 7,1 (pH x razão L/I) (Eq. 2)

Através da análise da Figura 15, observa-se que os maiores rendimentos

conjunto podem ser obtidos em pH entre 7,0 e 7,7 e razão L/I entre 1,5 (16,9 g de

lactose/ 11,3 g de inulina) e 2,2 (19,4 g de lactose/ 8,8 g de inulina).

Figura 15. Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para o rendimento

conjunto como uma função do pH e razão L/I.

(a) (b)

46

Como é possível observar na Tabela 10, o rendimento conjunto do ensaio

4 foi 6,4% maior que a média do ponto central, igual a 175,4±0,65%, porém, se

considerarmos a produção de cada enzima os melhores resultados foram obtidos na

condição central, onde a atividade de β-galactosidase foi praticamente mantida e o

rendimento da enzima inulinase chegou a 83,5±0,76%. No ensaio 4 o rendimento de

β-galactosidase (125,9%) foi bem superior aos demais mas o de inulinase (55,9%) não

ultrapassou 60%, possivelmente devido a alta concentração de lactose e o pH do meio

de cultivo que favoreceram a produção da primeira enzima.

Quando os rendimentos são analisados para cada enzima individualmente,

as superfícies de resposta geradas (Fig. 16), a partir dos modelos validados pela

ANOVA (Eq. 3 e 4), mostram que os melhores resultados para a inulinase (Fig. 16 (a))

são alcançados na região central e para a enzima β-galactosidase (Fig. 16 (b)) em

valores mais elevados de pH e razão L/I. No entanto, há de se considerar que era

esperado observar este tipo de comportamento, já que são duas enzimas microbianas

com características distintas sendo obtidas simultaneamente no mesmo meio.

Rendimento de inulinase (%) = 83,6 – 18,9 (pH)2 – 4,7 (razão L/I)2 (Eq. 3)

Rendimento de β-galactosidase (%) = 91,9 + 10,5 (pH) + 5,5 (pH)2 + 13,9 (razão L/I)

– 6,1 (razão L/I)2 + 5,7 (pH + razão L/I) (Eq. 4)

Figura 16. Superfícies de resposta para o rendimento de inulinase (a) e de β-

galactosidase (b) como uma função do pH e razão L/I.

(a) (b)

47

A Tabela 13 apresenta os desvios relativos (%) entre as respostas

experimentais e preditas pelos modelos, mostrando que as Eq. (1) e (2) são realmente

válidas para descrever a resposta em função das variáveis codificadas, já que os

desvios foram inferiores a 10% o que é aceitável para cultivos microbianos, devido às

dificuldades enfrentadas na reprodução dos resultados.

Tabela 13. Valores observados, preditos e desvios relativos (%) para o rendimento

conjunto dos planejamentos experimentais.

Ensaios

DCC

Ensaios

DCCR

Observados Preditos Desvio Observados Preditos Desvio

1 97,2 97,5 -0,30 1 134,5 135,1 -0,45

2 141,1 145,4 -3,11 2 135,7 141,0 -3,88

3 134,0 136,3 -1,70 3 152,1 147,3 3,20

4 181,8 184,2 -1,32 4 181,8 181,6 0,12

5 127,8 115,5 9,65 5 131,6 134,7 -2,36

6 168,3 163,4 2,90 6 166,5 163,0 2,10

7 121,1 118,3 2,30 7 139,4 135,3 2,93

8 180,6 166,2 7,99 8 168,8 172,5 -2,19

9 131,8 140,8 -6,86 9 174,8 175,5 -0,37

10 135,4 140,8 -4,03 10 175,4 175,5 -0,02

11 130,3 140,8 -8,11 11 176,1 175,5 0,38

Na literatura não são encontrados relatos de estudos para a otimização da

produção concomitante de β-galactosidase e inulinase por leveduras. Além disso, os

resultados alcançados com os substratos mistos de carbono, lactose e inulina, nas

condições otimizadas foram promissores, obtendo-se valores de atividade enzimática

próximos aos dos substratos individuais, mais especificadamente 18,1±0,26 U/mL de

β-galactosidase e 42,9±0,38 U/mL de inulinase.

Em relação a outras pesquisas com a linhagem CCT 7082 (Manera et al.

2008; Alves et al. 2010), a produção da enzima β-galactosidase foi melhorada neste

trabalho, além de obter inulinase simultaneamente. Acredita-se que o uso de frascos

aletados e valores mais elevados de pH nos cultivos conduziram a estes resultados.

No entanto, para a obtenção de resultados ainda mais promissores pode-

se buscar abordagens como a seleção de micro-organismos com alta capacidade de

produção conjunta e o emprego do cultivo contínuo. Por outro lado, a produção mais

eficiente de ambas as enzimas no mesmo meio exige uma maior compreensão dos

mecanismos reguladores que atuam durante o crescimento na presença de substratos

mistos, como lactose e inulina.

48

CONCLUSÃO

49

5. CONCLUSÃO

Dentre os dois meios testados, pH 6,0 e 3,5, na produção concomitante de

β-galactosidase e inulinase, o meio de cultivo com pH 6,0 foi o mais promissor quando

adicionado de diferentes substratos de carbono, apresentando 19,7±0,7 U/mL de β-

galactosidase e 1,8±0,1 U/mL de inulinase em lactose, e 39,8±1,7 U/mL de inulinase e

3,1±0,23 U/mL de β-galactosidase em sacarose.

Para os substratos individuais no meio selecionado, a lactose foi o melhor

indutor da enzima β-galactosidase, seguido do glicerol e da galactose. Em relação a

inulinase, a fonte de carbono que possibilitou maior produção da enzima foi a inulina,

seguido da sacarose. Nos meios com os substratos indutores de β-galactosidase a

produção de inulinase foi significativamente inferior, e o mesmo aconteceu com a β-

galactosidase em inulina e sacarose. Os resultados da produção conjunta em glicerol

foram promissores e não diferiram estatisticamente dos obtidos em galactose.

Dos substratos mistos a combinação que apresentou os maiores valores

para atividade enzimática de ambas as enzimas foi lactose e inulina. Em todos os

ensaios com substratos mistos a produção de inulinase foi bem inferior em relação aos

substratos individuais, enquanto a de β-galactosidase foi menos afetada.

A técnica de planejamento experimental permitiu a obtenção de melhores

níveis de enzimas simultaneamente. As condições estabelecidas para a produção

conjunta de β-galactosidase e inulinase foram pH 7,0 e razão entre a concentração de

lactose e inulina igual a 1,5, que corresponde a 16,9 g de lactose/11,3 g de inulina. A

quantidade dos demais reagentes do meio de cultivo foi fixada em (g/L): extrato de

levedura (17,0), (NH4)2SO4 (8,8), KH2PO4 (5,0) e MgSO4.7H2O (0,4). Os máximos

rendimentos conjunto, 174,8, 175,4 e 176,1%, foram obtidos nos pontos centrais do

planejamento, onde a atividade da enzima β-galactosidase, igual a 18,1±0,26 U/mL, foi

praticamente mantida, e a de inulinase alcançou 42,9±0,38 U/mL.

A produção simultânea de β-galactosidase e inulinase e a separação para

determinação das atividades enzimáticas foram possíveis, já que uma enzima é

intracelular e a outra extracelular. O processo estabelecido é de grande interesse do

ponto de vista industrial, considerando que podem ser obtidas duas enzimas em uma

única etapa de cultivo.

50

5.1. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Isolar e selecionar micro-organismos com capacidade para produção simultânea de

β-galactosidase e inulinase;

Otimizar o meio de cultivo para a produção simultânea das enzimas utilizando

lactose comercial e substratos que contenham inulina;

Purificar as enzimas obtidas utilizando métodos como precipitação e ultrafiltração;

Caracterizar as enzimas purificadas;

Quantificar e caracterizar a biomassa do cultivo;

Validar experimentalmente o modelo.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

52

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABAD, S.; TURON, X. Valorization of biodiesel derived glycerol as a carbon source to

obtain added-value metabolites: Focus on polyunsaturated fatty acids. Biotechnology

Advances, v. 30, p. 733-741, 2012.

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galactosidase production: a simultaneous investigation of agitation and aeration

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APÊNDICES

64

Figura 1. Curvas padrão de biomassa para a levedura Kluyveromyces marxianus CCT

7082 em diferentes fontes de carbono, individuais e mistas.

65

Figura 2. Curva padrão de ONP (o-nitrofenol) para determinação do coeficiente de

extinção (ε).

Figura 3. Curva padrão de açúcar redutor (glicose), determinado pelo método do ácido

3,5-dinitrossalícilo (DNS).

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