Makalah Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan Bakteri

Praktikum Mikrobiologi

XI-4/ Arrovi Septian

Kementrian Perindustrian Republik Indonesia Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor 2011

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


PEWARNAAN BAKTERIPewarnaan bakteri adalah proses mewarnai sel bakteri dengan suatu zat warna untuk memperjelas morfologi sel bakteri. Tujuan Pewarnaan Bakteri : Melihat struktur, bentuk dan ukuran sel mikroorganisme Memperjelas bentuk dan ukuran sel mikroorganisme Mempermudah melihat bentuk dan ukuran sel mikroorganisme Melihat sifat fisik dan kimia m.o berdasarkan reaksinya terhadap zat warna Teknik Pewarnaan : Pewarnaan Sederhana : Pewarnaan sel bakteri dengan menggunakan 1 zat warna saja. Contoh : 1. 2. Pewarnaan positif (badan sel yang diwarnai) Pewarnaan negatif (lapang pandang yang diwarnai)

Pewarnaan Bertingkat/Differensial : Pewarnaan sel bakteri dengan menggunakan >1 zat warna. Contoh : 1. 2. 3. Pewarnaan Gram Pewarnaan Spora Pewarnaan BTA/BTTA

Zat Pewarna Zat pewarna adalah zat yang digunakan untuk mewarnai sel bakteri agar dapat lebih mudah diamati di bawah mikroskop. Macam-macam zat warna : Kristal violet, karbol fuchsin, metilena biru, malasit hijau, safranin, nigrosin (tinta cina), metil lembayung, dll. Zat warna yang memiliki daya afinitas (daya gabung) paling kuat yaitu : Kristal violet, metilena biru, dan karbol fuchsin. Zat Warna menurut Erchlich : Zat Warna Basa : karbol fuchsin, safranin, metilena biru, metil lembayung, malasit hijau, Kristal violet. Zat Warna Asam : fuchsin asam, eosin, merah congo, nigrosin. Zat Warna Netral : campuran eosin dan metilena biru. Zat Warna Indifferent : Sudan III (merah).

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Pewarnaan Positif SederhanaDasar: Pewarnaan positif sederhana menggunakan salah satu zat warna untuk mewarnai sel,sedangkan lapang pandangnya transparan. Perlakuan ini menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1000x.

Bagan Kerja:

dibersihka n dengan kapas beralkolho l

dibagi 3 bagian dengan pencil glass

dikeringkan

LF suspensi

diamkan 1 menitbilas dengan

difiksasi

diwarnai dengan Kristal Violet 1 - 2 tetes

air suling

dikeringka n di kertas saring

ditetesi minyak imersi

pengamatan dengan mikroskop pembesaran1000x

Fungsi Tahapan:1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Kaca alas dibersihkan dengan kapas beralkohol untuk menghilankan kotoran dan lemak. Dikeringkan di atas pembakar spiritus agar kaca alas cepat kering. Dibagi 3 bagian dengan pencil glass untuk mempermudah pengamatan. Diberi suspensi bakteri 24 jam sebagai bakteri yang akan diamati. Difiksasi untuk mematikan bakteri dan melekatkan bakteri pada kaca alas. Diwarnai dengan kristal violet untuk memberikan warna pada bakteri. Dibilas dengan air suling untuk membilas kelebihan kristal violet Dikeringkan dengan kertas saring untuk mengeringkan kaca alas agar tidak menganggu pengamatan. 9. Ditetesi minyak imersi untuk mempermudah pengamatan.

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Pewarnaan Gram Metode Preston dan MorrelDasar: Pewarnaan ini dilakukan untuk menentukan sifat bakteri, apakah termasuk segolonganbakteri Gram positif atau Gram negatif. Yang termasuk golongan Gram positif adalah segolongan bakteri yang menahan persenyawaan iodine compleks yang terbentuk dari KI dan I2 dan zat Kristal violet sewaktu dicuci (zat pengawawarna). Sedangkan Gram negatif adalah segolongan bakteri yang melepaskan persenyawaan iodine compleks dan mengikat zat warna berikutnya yaitu karbol fuchsin encer.

Alat dan Bahan: 1. Mikroskop 2. Kapas steril 3. Pipet 4. Kaca alas datar 5. Pembakar spirtus 6. Tabung reaksi 7. Ose 8. Kertas Saring 9. Pensil gelas 10. Piala gelas 1. Alkohol 70% 2. Larutan fisiologis (LF) 3. Suspensi bakteri 24 jam 4. Minyak imersi 5. Zat warna kristal violet 6. Zat warna karbol fuchsin 7. Air suling 8. Decolorizer (aseton : alkohol = 1:3) 9. Larutan lugol

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Bagan Kerja:



dikeringkan

LF suspensi

diamkan 1 menit 2

kelebihan Kristal Violet dibuang + lugol 1 - 2 tetes diamkan 1 menit 2

difiksasi

diwarnai dengan Kristal Violet 1 - 2 tetes

bilas dengan air suling celupkan 3x pada decolorizer (aseton alkolhol 1 : 3)

bilas dengan air suling

diwarnai dengan karbol fuksin 1 - 2 tetes diamkan 1 menit 2





Fungsi Tahapan:1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Kaca alas dibersihkan dengan kapas beralkohol untuk menghilankan kotoran dan lemak. Dikeringkan di atas pembakar spiritus agar kaca alas cepat kering. Dibagi 3 bagian dengan pencil glass untuk mempermudah pengamatan. Diberi suspensi bakteri 24 jam sebagai bakteri yang akan diamati. Difiksasi untuk mematikan bakteri dan melekatkan bakteri pada kaca alas. Diwarnai dengan kristal violet untuk memberikan warna pada bakteri terutam Gram + Ditetesi lugol untuk menghasilkan KI dan I2 yang mengintensifkan zat warna. Dicelupkan pada decolorizer sebagai pemucat dan pembilas pada bakteri Gram Ditetesi karbol fuchsin untuk mewarnai Gram Dibilas dengan air suling untuk membilas kelebihan karbol fuksin Dikeringkan dengan kertas saring untuk mengeringkan kaca alas agar tidak menganggu pengamatan. 12. Ditetesi minyak imersi untuk mempermudah pengamatan.

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Perbedaan bakteri Gram positif dengan Gram negative : Peptidoglikan (lapisan pada dinding sel bakteri yang menahan zat warna) Lapisan peptidoglikan bakteri (+) >tebal bakteri (-) Lapisan lemak bakteri (-) >tebal bakteri (+), sedangkan decolorizer mengandung alcohol sehingga lapisan lemak larut dalam alcohol dan zat warna pada bakteri Gram negative mudah dilepas. Perbedaan kecepatan lepasnya zat warna Gram positif menunjukkan sifat seperti gram negative apabila : o Faktor umur biakan yang terlalu tua, sehingga kemampuan mengikat zat warna pada dinding sel (permeabilitas) menjadi lemah. o Decolorizing yang terlalu lama o Ulasan suspense bakteri yang terlalu tebal

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Pewarnaan Kapsul Metode AnthonyDasar: Pada umumnya sel bakteri mengandung air 80-85%, protein, karbohidrat, lemak, dan enzim.Sel bakteri terdiri dari sel endoplasma/cytoplasma/protoplasma. Cytoplasma ini dikelilingi membrane cytoplasma dimana didalamnya terdapat granule-granule inti sel. Granul-granul ini merupakan persediaan makanan. Kapsul seluruh sel dibungkus oleh suatu substansi semacam slym/gelatin. Kapsul ini befungsi untuk melindungi bakteri terhadap serangan luar.

Alat dan Bahan: 1. Mikroskop 2. Kapas steril 3. Pipet 4. Kaca alas datar 5. Pembakar spirtus 6. Tabung reaksi 7. Ose 8. Kertas Saring 9. Pensil gelas 10. Piala gelas 1. Alkohol 70% 2. Larutan fisiologis (LF) 3. Suspensi bakteri 48 jam 4. Minyak imersi 5. Zat warna kristal violet 6. Air suling 7. Larutan terusi 20%

Bagan Kerja:

XI-4/

Pewarnaan Bakteri




dikeringkan

LF suspensi

diamkan 1 menit 2diwarnai dengan Kristal Violet 1 - 2 tetesbilas dengan larutan terusi 20%




Fungsi Tahapan:1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Kaca alas dibersihkan dengan kapas beralkohol untuk menghilankan kotoran dan lemak. Dikeringkan di atas pembakar spiritus agar kaca alas cepat kering. Dibagi 3 bagian dengan pencil glass untuk mempermudah pengamatan. Diberi suspensi bakteri sebagai bakteri yang akan diamati. Tidak difiksasi agar kapsul bakteri tidak rusak. Diberi kristal violet untuk mewarnai sel bakteri. Dibilas larutan terusi 20% untuk peluntur warna + mencuci kelebihannya. Dikeringkan dengan kertas saring untuk mengeringkan kaca alas agar tidak menganggu pengamatan. 9. Ditetesi minyak imersi untuk mempermudah pengamatan.

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Pewarnaan Spora Metode Schaeffer-FultonDasar: Spora adalah mekanisme pertahanan dari bakteri dimana keadaan lingkungannya ekstrim.Spora dilapisi oleh lilin sehingga ketika dipanaskan lilin akan meleleh dan zat warna akan masuk, ketika didinginkan lilin kembali mengeras dan membeku. Zat warna akan terperangkap dalam lapisan tersebut sedangkan bentuk sel vegetatifnya diwarnai oleh zat warna kedua.

Alat dan Bahan: 1. Mikroskop 2. Kapas steril 3. Pipet 4. Kaca alas datar 5. Pembakar spirtus 6. Tabung reaksi 7. Ose 8. Kertas Saring 9. Pensil gelas 1. Alkohol 70% 2. Larutan fisiologis (LF) 3. Suspensi bakteri 48 jam 4. Minyak imersi 5. Zat warna malasit hijau 6. Zat warna safranin 7. Air suling

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Bagan Kerja:



dikeringkan

LF suspensi

dipanaskan 2 menit


difiksasi

diwarnai dengan Malasit hijau berlebih

dari timbulnya uap di permukaan

diwarnai dengan safranin 1 - 2 tetes diamkan 2 menit





Fungsi Tahapan:1. 2. 3. 4. 5. 6. Kaca alas dibersihkan dengan kapas beralkohol untuk menghilankan kotoran dan lemak. Dikeringkan di atas pembakar spiritus agar kaca alas cepat kering. Dibagi 3 bagian dengan pencil glass untuk mempermudah pengamatan. Diberi suspensi bakteri 48 jam sebagai bakteri yang akan diamati. Difiksasi untuk mematikan bakteri dan melekatkan bakteri pada kaca alas. Ditetesi zat warna malasit hijau dan dipanaskan untuk membuk dinding spora agar zat warna dapat masuk ke dalam bakteri dan mewarnai spora. 7. 8. Dibilas dengan air suling untuk menghilangkan atau membilas kelebihan zat warna. Ditetesi safranin untuk mewarnai sel vegetatif yang belum terwarnai.

9. Dikeringkan dengan kertas saring untuk mengeringkan kaca alas agar tidak menganggu pengamatan. 10. Ditetesi minyak imersi untuk mempermudah pengamatan.

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) dan Bakteri Tidak Tahan Asam (BTTA) Metode Ziehl NeelsenDasar: Beberapa bakteri seperti Mycrobacterium tuberculosis, M. paratuberculose, tidak dapatdiwarnai dengan cara sederhana. Ini disebabkan lapisan paling luar (dinding sel) dari bakteri terdiri dari lapisan lilin yang tebal dan sulit ditembus zat warna. Tetapi, dengan larutan fuchsin pekat yang mengandung phenol, disertai dengan pemanasan, lapisan akan terbentuk kembali dan tidak akan terpengaruh bahan pencuci warna sekalipun itu adalah asam encer. Bakteri tersebut adalah bakteri tahan asam sedangkan bakteri yang apabila terkena asam encer saja akan melepaskan kembali zat warna sebelumnya disebut bakteri tidak tahan asam.

Alat dan Bahan: 1. Mikroskop 2. Kapas steril 3. Pipet 4. Kaca alas datar 5. Pembakar spirtus 6. Tabung reaksi 7. Ose 8. Kertas Saring 9. Pensil gelas 10. Piala gelas 1. Alkohol 70% 2. Larutan fisiologis (LF) 3. Suspensi bakteri 24 jam 4. Minyak imersi 5. Zat warna metylene blue 6. Zat warna karbol fuchsin 7. Air suling 8. Asam alkohol (3 ml HCl 36% dan 97 ml alkohol 96%)

XI-4/

Pewarnaan Bakteri


Bagan Kerja:



dikeringkan

LF suspensi

diwarnai dengan Karbol Fuchsin

dipanaskan 5 - 7 menit


difiksasi

diwarnai dengan metilena blue diamkan 2 menit




Fungsi Tahapan:1. 2. 3. 4. 5. Kaca alas dibersihkan dengan kapas beralkohol untuk menghilankan kotoran dan lemak. Dikeringkan di atas pembakar spiritus agar kaca alas cepat kering. Dibagi 3 bagian dengan pencil glass untuk mempermudah pengamatan. Diberi suspensi bakteri 24 jam sebagai bakteri yang akan diamati. Diberi karbol fuksin sambil dipanaskan untuk melelehkan lapisan lilin yang tebal dan sulit ditembus zat warna. 6. Dicuci dengan asam alcohol agar bakteri yang tidak tahan asam dapat melepaskan zat warna karbol fuksin. 7. 8. 9. Ditetesi metilena blue untuk mewarnai bakteri tidak tahan asam. Dibilas air suling untuk membilas kelebihan zat warna metilena blue. Dikeringkan dengan kertas saring untuk mengeringkan kaca alas agar tidak menganggu pengamatan. 10. Ditetesi minyak imersi untuk mempermudah pengamatan.

XI-4/

Pewarnaan BakteriGram Preston dan Morrel Suspensi bakteri 24 jam 24 jam Kristal Violet Karbol Fuchsin 1. Mengetahui bentuk sel bakteri Gram positif dan Gram negatif 2. Menentukan sifat bakteri Gram positif atau Gram negatif Kapsul Anthony Suspensi bakteri 48 jam 48 (hasil inokulasi 24 jam + litmus milk 24 jam) Kristal Violet 1. Mengetahui kapsul yang mengelilingi sel bakteri. 2. Melakukan teknik pewarnaan kapsul dengan benar. Spora Schaeffer-Fulton Suspensi bakteri 48 jam 48 jam Malasit Hijau Safranin 1. Mengetahui macammacam bentuk spora 2. Membedakan spora dengan sel vegetatifnya

Praktikum MikrobiologiBTA/BTTA Ziehl Neelsen Suspensi bakteri 24 jam 24 jam Karbol Fuchsin Metilena Blue 1. Menentukan bateri termasuk ke golongan BTA/BTTA 2. Mampu membedakan antara BTA dengan BTTA

Metode Sumber Bahan Umur Bakteri Zat Warna Tujuan

Hasil Pengamatan

Identifikasi Warna

Ungu: Gram Positif Merah: Gram Negatif + : Bacillus subtilis,

Ungu: Sel Bakteri Tidak berwarna di sekeliling ungu: Kapsul Bakteri

Hijau: Spora Merah: Sel Vegetatif

Merah: BTA Biru: BTTA BTA: Mycobacterium

Contoh Bakteri

Propionibacterium sp. - : E. coli, Enterobacter aerogenes

Staphylococcus pyogenik

Bacillus antrachis Bacillus cereus

tuberculosis, M. Paratuberculose BTTA: Bacillus okhensis

XI-4/

Makalah Pewarnaan Bakteri

Documents

Transcript of Makalah Pewarnaan Bakteri