BIOCHIMIE GENERALĂ

LUCRĂRI PRACTICE

Biochimie I2012/2013

Aminoacizi si proteine/ Glucide

1

α-aminoacid

1. Carbon central (carbon α);2. Grupare amino;3. Grupare carboxil;4. Atom de hidrogen;5. Grupare R.

Aminoacizii din structuraproteinelor sunt α-aminoacizi.

Excepţie: Prolina (Pro) (iminoacid)

2

Proprietăţi

în soluţie la pH neutru – amfiioni grupareaamino = protonată / gruparea carboxil = disociată;

Majoritatea – punct de topire ~300° C;

Solubilitate crescută în solvenţi polaricomparativ cu solvenţii nepolari.

3

LP 1Reacţii de identificare a

aminoacizilor

4

Aminoacizi testaţi in cadrul L.P.

Reacţii de identificare

a aa.

5

Reacţii de identificare a aminoacizilor

Reacţia cu acid azotos;

Reacţia cu ninhidrină;

Reacţia xantoproteică;

Reacţia Millon;

Reacţia cu nitroprusiat.

Reacţii de culoare

6

Reacţia cu acidul azotos

Metoda van Slyke- aa. reacţionează cu acidul azotos latemperatura camerei cu degajare de azot.Cantitativ- un mol de aa. degajă 22,4 l azot.

Reactivi: - HCl 2M;- NaNO2 10%- aminoacizi de testat: Gly, Tyr

GlyHCl 2M

TyrHCl 2M HCl 2M

+ NaNO2 10%

degajare de N2 în primele 2 eprubete

7

Denumirea reacției Reactivul folosit Culoarea

rezultată

Tipul de aminoacid

identificat

Ninhidrinei ninhidrină albastru -

violet

caracteristică atît

pentru aminoacizi,

cît și pentru

proteine

Xantoproteică acid

azotic,hidroxid de

amoniu

galbenă/

portocalie

aminoacizii

aromatici (formează

nitroderivați)

Millon azotat de mercur

în acid azotic (acid

sulfuric)/azotit de

Na

colorație

roșie

aminoacizi ciclici cu

grupare hidroxil

(tirozina)

Nitroprusiatului

de sodiu

nitroprusiat de

sodiu în soluție

amoniacală

roșie aminoacizi cu

grupăre tiol (-SH)

liberă8

Reacţia cu ninhidrină

9

LP 2Determinarea proteinelor serice

cu reactiv Weichselbaum

10

Principiul metodei:

Compuşii cu legături peptidice reacţionează cuionii de Cu2+ în mediu alcalin, rezultând uncompus de culoare albastru-violet a căruiintensitate este direct proporţională cunumărul de legături peptidice.

Metoda poate fi folosită pentru determinareaconcentraţiei proteinelor din serul sanguin.

11

Reactivi:

• soluţie de NaOH 10%;

• reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na + Na OH +sulfat de cupru cristalizat CuSO4 x 5 H2O;

• soluţie standard proteică cu concentraţia cunoscută (10mg/ml) de albumină serică bovină (BSA);

• proba de analizat reprezentată de ser sanguin diluatcorespunzător.

12

Pt. curba etalon:

BSA (10 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD

concentratie proteica diferita

Pt. proba

Ser sanguin

+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum

Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 546nm.

13

Spectrofotometrie – generalitati

Metoda spectrofotometrică se bazează pe proprietateasubstanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagneticeşi este folosită pentru identificare, determinarea purităţii şidozare.

Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicul deradiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbio parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbitădepindede structura şi de numărul moleculelor şi al atomilorsubstanţei cu care interacţionează fascicululde radiaţii.

În funcţie de domeniile spectrale în care are loc absorbţialuminii se deosebesc: metodespectrofotometrice în ultraviolet(185-400nm), metode spectrofotometrice în vizibil (400-800nm)şi metode spectrofotometrice în infraroşu (peste800nm).

14

Spectrofotometrie - generalitati

Principiul spectrofotometriei se bazează pe determinareaconcentraţiei soluţiilor colorate latrecerea unui fascicul emisde o sursă luminoasă printr-o soluţie omogenă constituită dinsubstanţade analizat.

Astfel se determină absorbţia radiaţiei luminoase, care estedirect proporţională cuconcentraţia substanţei absorbante înconformitate cu legea Lambert-Beer: A= lg I0/I = -lg T = ε L C

A = absorbanţa;I0 = intensitatea luminii incidente;I = intensitatealuminii transmise;T = transmitanţa;L = grosimea stratului deabsorbţie (cm);C = concentraţia soluţiei absorbante (moli/l); ε =absorbtivitatea molară (constantă caracteristică fiecăreisubstanţe absorbante).

Lungimea de undă a luminii incidente este cea a culoriicomplementare a soluţiei de analizat.

15

Spectrofotometru UV-VIS

16

Curba etalon

Reprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul nostruaabsorbantei (determinata prin citire la spectrofotometru) fata deconcentratie. Sunt utilizate dilutii ale unei solutii de concentratie cunoscutapentru determinarea unei concentratii necunoscute.

17

LP 3

Metoda biuretului

18

Reacţia este utilizată pentru determinareacantitativă a proteinelor. Asemănător compusuluinumit biuret, peptidele şi proteinele conţin grupări –CO-NH- care reacţionaeză cu o soluţie alcalină desulfat Cu (II) şi determină apariţia unei coloraţiialbastru-violet.

Intensitatea culorii este o măsură a numărului delegături peptidice prezente într-o proteină.

19

Reacţia nu este specifică pentru legaturile peptidice compusii cu doua grupari carbonil legate printr-un atom de C sau N dau reactie pozitiva.

Metoda este utilizata pt. determinarea unor cantitati mari de proteine (1-20 mg).

20

Reactivi:

•Reactiv biuret;

•soluţie standard proteică cu concentraţiacunoscută (5 mg/ml) de albumină sericăbovină (BSA);

•proba de analizat reprezentată extractproteic total.

21

Pt. curba etalon:

BSA (5 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD

concentratie proteica diferita

Pt. proba

EPT diluat corespunzator

+ reactiv biuret

Incubare 10’/ 37°C. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 540nm. Citirea se face fata de A.D.

22

23

LP 4Reacţii de identificare a

glucidelor

24

Glucide testate in cadrul L.P.

Reacţii de identificare a glucidelor

Glucoza

Fructoza

25

Glucide testate in cadrul L.P.

Reacţii de identificare a glucidelor

Zaharoza

26

Reacţii de identificare a glucidelor

Reacţia Molisch;

Reacţia cu iodul;

Reacţia Benedict;

Reacţia Seliwanoff;

Reacţia Fehling.

Reacţii de culoare

27

Denumirea reacției Reactivul folosit Culoarea

rezultată

Specificitate

Molisch Alfa-naftol 5%

Acid sulfuric conc.

Rosu-

purpuriu.

Monozaharide,

oligozaharide,

polizaharide.

R. cu iodul Sol de iod 0,005 M

HCl 1M

Albastru pt.

amidon, rosu

brun pt.

glicogen si

amidon partial

hidrolizat

Amidon

glicogen

Benedict r. Benedict (citrat

de Na+ carbonat

de Na + sulfat de

Cu)

colorație

roșie

Glucide cu caracter

reducator

28

Denumirea reacției Reactivul folosit Culoarea

rezultată

Specificitate

Seliwanoff r. Seliwanoff

(rezorcina in HCl

3M).

rosu Cetoze

Fehling Reactiv F I

Reactiv FII

rosu Glucide cu caracter

reducator

29

Glucide cu caracter reducator - glucoza

Echilibrul intre forma piranozica si cea cu lant deschis este directionat catre aceasta din urma pentru a se produce reactia de oxidare.

30

LP 5Dozarea zaharurilor

reducatoare din extractul de portocala cu o-toludina

31

Principiul metodei:

In prezenta acidului acetic, la cald,zaharurile reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex colorat careprezinta un maxim de absorbtie la 630nm.

Metoda poate fi folosită pentrudeterminarea concentraţiei glucozei dinserul sanguin.

32

Reactivi:

•Reactiv o-toluidina;

•Solutie standrad de glucoza 100 mg%;

•proba de analizat reprezentată de extractde portocala diluat corespunzător.

33

Pt. curba etalon:

Sol. Standard de glucoza (100 mg%) + A.D.

Diferite volume sol. st. glucoza si AD

concentratie diferita

Pt. proba

Extract de portocala

+ r. o-toluidina

Incubare 10’/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 630 nm fata de blanc.

34

Reactia glucozei cu o-toluidina

35

LP 5Dozarea lactozei din lapte

36

Lactoza – dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de vacă şi 2-3% din laptele uman.

37

Principiul metodei:

Concentraţia lactozei poate fi determinată prinorice metodă caracteristică pentru zaharurireducătoare, după deproteinizarea laptelui.

În cazul acestui experiment, se realizeazădeproteinizarea laptelui cu o soluţie dewolframat de sodiu, dozarea efectivărealizându-se prin metoda Nelson. În cazulacestei metode, ionii de Cu (II) sunt reduşi laioni de Cu (I), care la rândul lor reduc acidulfosfomolibdenic la un produs de reacţiealbastru.

38

Reactivi:

• reactiv alcalin de cupru;

• reactiv fosfomolibdenic;

• soluţie 10% de wolframat de sodiu;

• soluţie M/3 de H2SO4;

• soluţie stoc de lactoză 1%;

39

La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaugă 2 ml desoluţie de wolframat de sodiu 10% şi, încet, sub agitareconstantă, 2 ml M/3 soluţie de acid sulfuric. Amestecul este adusla un volum final de 100 ml, iar după 5 minute de staţionare estefiltrat printr-o hârtie de filtru.

E1 E2 E3

Filtrat 1 ml -

Apa distilata 1 ml - 2 ml

Soluţie standard de lactoză* - 2ml -

Reactiv alcalin de cupru 2 ml 2 ml 2 ml

Se incubează timp de 8 minute pe baie

de apă la fierbere; ulterior eprubetele se

răcesc şi se adugă în fiecare eprubetă

reactiv fosfomolibdenic.

Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 ml

Dupa 1 min. de staţionare, amestecurile de reacţie se diluează la un volum final de 25 ml

cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4.

Se citeşte densitatea optică a probelor E1 şi E2 faţă de blanc E3, la 630 nm.40

Calculul rezultatelor

Densităţile optice fiind proporţionale cu concentraţiile este valabilă relaţia:

D.O.proba 1/ D.O.proba 2 = C1/C2, unde C1 este concentraţia lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraţia lactozei dinm standard (0,6 mg).

Concentraţia lactozei din lapte, exprimă în g/100 ml este dată de relaţia:

(D.O.proba 1/ D.O.proba 2) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)

41