BIOCHIMIE GENERAL

LUCRRI PRACTICE

Biochimie I2012/2013

Aminoacizi si proteine/ Glucide

1

-aminoacid

1. Carbon central (carbon );2. Grupare amino;3. Grupare carboxil;4. Atom de hidrogen;5. Grupare R.

Aminoacizii din structuraproteinelor sunt -aminoacizi.

Excepie: Prolina (Pro) (iminoacid)

2

Proprieti

n soluie la pH neutru amfiioni grupareaamino = protonat / gruparea carboxil = disociat;

Majoritatea punct de topire ~300 C;

Solubilitate crescut n solveni polaricomparativ cu solvenii nepolari.

3

LP 1Reacii de identificare a

aminoacizilor

4

Aminoacizi testai in cadrul L.P.

Reacii de identificare

a aa.

5

Reacii de identificare a aminoacizilor

Reacia cu acid azotos;

Reacia cu ninhidrin;

Reacia xantoproteic;

Reacia Millon;

Reacia cu nitroprusiat.

Reacii de culoare

6

Reacia cu acidul azotos

Metoda van Slyke- aa. reacioneaz cu acidul azotos latemperatura camerei cu degajare de azot.Cantitativ- un mol de aa. degaj 22,4 l azot.

Reactivi: - HCl 2M;- NaNO2 10%- aminoacizi de testat: Gly, Tyr

GlyHCl 2M

TyrHCl 2M HCl 2M

+ NaNO2 10%

degajare de N2 n primele 2 eprubete

7

Denumirea reaciei Reactivul folosit Culoarea

rezultat

Tipul de aminoacid

identificat

Ninhidrinei ninhidrin albastru -violet

caracteristic att

pentru aminoacizi,

ct i pentru

proteine

Xantoproteic acid azotic,hidroxid de

amoniu

galben/

portocalie

aminoacizii

aromatici (formeaz

nitroderivai)

Millon azotat de mercurn acid azotic (acid

sulfuric)/azotit de

Na

coloraie

roie

aminoacizi ciclici cu

grupare hidroxil

(tirozina)

Nitroprusiatului

de sodiu

nitroprusiat de

sodiu n soluie

amoniacal

roie aminoacizi cu

grupre tiol (-SH)

liber8

Reacia cu ninhidrin

9

LP 2Determinarea proteinelor serice

cu reactiv Weichselbaum

10

Principiul metodei:

Compuii cu legturi peptidice reacioneaz cuionii de Cu2+ n mediu alcalin, rezultnd uncompus de culoare albastru-violet a cruiintensitate este direct proporional cunumrul de legturi peptidice.

Metoda poate fi folosit pentru determinareaconcentraiei proteinelor din serul sanguin.

11

Reactivi:

soluie de NaOH 10%;

reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na + Na OH +sulfat de cupru cristalizat CuSO4 x 5 H2O;

soluie standard proteic cu concentraia cunoscut (10mg/ml) de albumin seric bovin (BSA);

proba de analizat reprezentat de ser sanguin diluatcorespunztor.

12

Pt. curba etalon:

BSA (10 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si ADconcentratie proteica diferita

Pt. proba

Ser sanguin

+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum

Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 546nm.

13

Spectrofotometrie generalitati

Metoda spectrofotometric se bazeaz pe proprietateasubstanelor de a absorbi selectiv radiaiile electromagneticei este folosit pentru identificare, determinarea puritii idozare.

Spectrele de absorbie se obin la trecerea unui fascicul deradiaii continue prin substana de analizat care poate absorbio parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbitdepindede structura i de numrul moleculelor i al atomilorsubstanei cu care interacioneaz fascicululde radiaii.

n funcie de domeniile spectrale n care are loc absorbialuminii se deosebesc: metodespectrofotometrice n ultraviolet(185-400nm), metode spectrofotometrice n vizibil (400-800nm)i metode spectrofotometrice n infrarou (peste800nm).

14

Spectrofotometrie - generalitati

Principiul spectrofotometriei se bazeaz pe determinareaconcentraiei soluiilor colorate latrecerea unui fascicul emisde o surs luminoas printr-o soluie omogen constituit dinsubstanade analizat.

Astfel se determin absorbia radiaiei luminoase, care estedirect proporional cuconcentraia substanei absorbante nconformitate cu legea Lambert-Beer: A= lg I0/I = -lg T = L C

A = absorbana;I0 = intensitatea luminii incidente;I = intensitatealuminii transmise;T = transmitana;L = grosimea stratului deabsorbie (cm);C = concentraia soluiei absorbante (moli/l); =absorbtivitatea molar (constant caracteristic fiecreisubstane absorbante).

Lungimea de und a luminii incidente este cea a culoriicomplementare a soluiei de analizat.

15

Spectrofotometru UV-VIS

16

Curba etalon

Reprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul nostruaabsorbantei (determinata prin citire la spectrofotometru) fata deconcentratie. Sunt utilizate dilutii ale unei solutii de concentratie cunoscutapentru determinarea unei concentratii necunoscute.

17

LP 3

Metoda biuretului

18

Reacia este utilizat pentru determinareacantitativ a proteinelor. Asemntor compusuluinumit biuret, peptidele i proteinele conin grupri CO-NH- care reacionaez cu o soluie alcalin desulfat Cu (II) i determin apariia unei coloraiialbastru-violet.

Intensitatea culorii este o msur a numrului delegturi peptidice prezente ntr-o protein.

19

Reacia nu este specific pentru legaturile peptidice compusii cu doua grupari carbonil legate printr-un atom de C sau N dau reactie pozitiva.

Metoda este utilizata pt. determinarea unor cantitati mari de proteine (1-20 mg).

20

Reactivi:

Reactiv biuret;

soluie standard proteic cu concentraiacunoscut (5 mg/ml) de albumin sericbovin (BSA);

proba de analizat reprezentat extractproteic total.

21

Pt. curba etalon:

BSA (5 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si ADconcentratie proteica diferita

Pt. proba

EPT diluat corespunzator

+ reactiv biuret

Incubare 10/ 37C. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 540nm. Citirea se face fata de A.D.

22

23

LP 4Reacii de identificare a

glucidelor

24

Glucide testate in cadrul L.P.

Reacii de identificare a glucidelor

Glucoza

Fructoza

25

Glucide testate in cadrul L.P.

Reacii de identificare a glucidelor

Zaharoza

26

Reacii de identificare a glucidelor

Reacia Molisch;

Reacia cu iodul;

Reacia Benedict;

Reacia Seliwanoff;

Reacia Fehling.

Reacii de culoare

27

Denumirea reaciei Reactivul folosit Culoarea

rezultat

Specificitate

Molisch Alfa-naftol 5%Acid sulfuric conc.

Rosu-

purpuriu.

Monozaharide,

oligozaharide,

polizaharide.

R. cu iodul Sol de iod 0,005 MHCl 1M

Albastru pt.

amidon, rosu

brun pt.

glicogen si

amidon partial

hidrolizat

Amidon

glicogen

Benedict r. Benedict (citratde Na+ carbonat

de Na + sulfat de

Cu)

coloraie

roie

Glucide cu caracter

reducator

28

Denumirea reaciei Reactivul folosit Culoarea

rezultat

Specificitate

Seliwanoff r. Seliwanoff(rezorcina in HCl

3M).

rosu Cetoze

Fehling Reactiv F IReactiv FII

rosu Glucide cu caracter

reducator

29

Glucide cu caracter reducator - glucoza

Echilibrul intre forma piranozica si cea cu lant deschis este directionat catre aceasta din urma pentru a se produce reactia de oxidare.

30

LP 5Dozarea zaharurilor

reducatoare din extractul de portocala cu o-toludina

31

Principiul metodei:

In prezenta acidului acetic, la cald,zaharurile reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex colorat careprezinta un maxim de absorbtie la 630nm.

Metoda poate fi folosit pentrudeterminarea concentraiei glucozei dinserul sanguin.

32

Reactivi:

Reactiv o-toluidina;

Solutie standrad de glucoza 100 mg%;

proba de analizat reprezentat de extractde portocala diluat corespunztor.

33

Pt. curba etalon:

Sol. Standard de glucoza (100 mg%) + A.D.

Diferite volume sol. st. glucoza si ADconcentratie diferita

Pt. proba

Extract de portocala

+ r. o-toluidina

Incubare 10/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 630 nm fata de blanc.

34

Reactia glucozei cu o-toluidina

35

LP 5Dozarea lactozei din lapte

36

Lactoza dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de vac i 2-3% din laptele uman.

37

Principiul metodei:

Concentraia lactozei poate fi determinat prinorice metod caracteristic pentru zaharurireductoare, dup deproteinizarea laptelui.

n cazul acestui experiment, se realizeazdeproteinizarea laptelui cu o soluie dewolframat de sodiu, dozarea efectivrealizndu-se prin metoda Nelson. n cazulacestei metode, ionii de Cu (II) sunt redui laioni de Cu (I), care la rndul lor reduc acidulfosfomolibdenic la un produs de reaciealbastru.

38

Reactivi:

reactiv alcalin de cupru;

reactiv fosfomolibdenic;

soluie 10% de wolframat de sodiu;

soluie M/3 de H2SO4;

soluie stoc de lactoz 1%;

39

La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaug 2 ml desoluie de wolframat de sodiu 10% i, ncet, sub agitareconstant, 2 ml M/3 soluie de acid sulfuric. Amestecul este adusla un volum final de 100 ml, iar dup 5 minute de staionare estefiltrat printr-o hrtie de filtru.

E1 E2 E3

Filtrat 1 ml -

Apa distilata 1 ml - 2 ml

Soluie standard de lactoz* - 2ml -

Reactiv alcalin de cupru 2 ml 2 ml 2 ml

Se incubeaz timp de 8 minute pe baie

de ap la fierbere; ulterior eprubetele se

rcesc i se adug n fiecare eprubet

reactiv fosfomolibdenic.

Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 ml

Dupa 1 min. de staionare, amestecurile de reacie se dilueaz la un volum final de 25 ml

cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4.

Se citete densitatea optic a probelor E1 i E2 fa de blanc E3, la 630 nm.40

Calculul rezultatelor

Densitile optice fiind proporionale cu concentraiile este valabil relaia:

D.O.proba 1/ D.O.proba 2 = C1/C2, unde C1 este concentraia lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraia lactozei dinm standard (0,6 mg).

Concentraia lactozei din lapte, exprim n g/100 ml este dat de relaia:

(D.O.proba 1/ D.O.proba 2) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)

41