Ligação de O2 a Mioglobina e a Hemoglobina

A Mioglobina possui 1 sítio de ligação para o O2

** 8 α-Helical segments

** contains one heme

** MW 16,700

** Single O2 binding site

** reversible protein-ligand

interaction

** Oxygen storage

A Hemoglobina possui 4 sítios de ligação ao O2

- Estrutura Quaternária

2 unidades α e 2 unidades β

-Interação forte entre as subunidades α e β.

A Comparison of The Structure of Myoglobin and The β-Subunit of Hemoglobin

1.   Reversible Binding of Proteins to a Ligand:

Oxygen Binding Proteins

“ Protophorphyrin IX” Porfirina

“ Heme” : contain iron.

Anéis pirrólicos

A Histidina 93 coordena com o Ferro e auxilia a sua ligação ao O2

Distal histidine

Proximal histidine (His93)

Fe2+

O grupo heme visto de lado

Globin molecule

Coordination bond

Molecular oxygen

Fig. 1. Physiological and pathophysiological oxygen partial pressures (pO2). The pO2 of inspired air drops progressively as oxygen passes from the lungs into the circulation, which irrigates the tissues of major organs, and then in the venous system before re-oxygenation in the lungs. The pO2 of solid tumours (insert) is generally low compared to that of non-malignant tissues.

Brahimi-Horn, M. C. & Pouysségur, J. (2007) Oxygen, a source of life and stress. FEBS Letters 581, 3582.

Ligação de O2 à Mioglobina

Tecidos Pulmão

A ligação de O2 altera a conformação das subunidades da hemoglobina

TENSO

DEOXI-Hb RELAXADO

OXI-Hb

Ligação de O2 a Hemoglobina

T

R

O grupo Heme em seu ambiente na cadeia da Hb humana sem Ligante

A ligação de O2 altera a conformação local da cadeia peptídica...

Azul – forma T

Rosa – forma R

….resultando na alteração da conformação total do tetrâmero…

Fig. 5-10

Cooperatividade entre as subunidades resulta numa curva de ligação de O2 sigmoidal

T-state

R-state DesoxiHb (T) capta O2 no pulmão, convertendo-se para o estado R, o qual por sua vez, capta mais O2

OxiHb (R) volta aos tecidos onde a pressão de O2 é baixa e inicia a liberação de O2, promovendo a conversão da Hb em desoxiHb (T)

2,3-BisFosfoGlicerato (BFG) liga-se a Hb reduzindo a sua afinidade por O2

Hb pura libera apenas 8 % do O2

Hb + 2,3-BFG libera 66 % do O2

2,3-BFG é um efetor alostérico (allos=outro; stereo=estrutura)

2,3-BFG estabiliza a estrutura T (desoxi) da Hb

Efeito do pH na ligação da Hb ao O2

(Efeito Bohr, Christian Bohr 1904)

A diminuição do pH aumenta a liberação de O2 nos tecidos

A diminuição do pH afeta a ionização de Histidinas... No pH menor a His 146 está protonada, estabilizando a estrutura T da Hb

Exergônico Endergônico

Vias Metabólicas Séries de reações consecutivas catalisadas enzimaticamente, que produzem produtos específicos (metabólitos). Note que: as vias são interconectadas (pontos de cruzamento). Pontos importantes: - conhecer as principais avenidas (vias), - os cruzamentos mais importantes (intermediários comuns) e - como o fluxo nessas vias são controladas (regulação)...

Visão Geral do Catabolismo

1.  Duas condições fundamentais para a vida :

(1) capacidade de se autoreplicar

(2) capacidade de catalisar reações químicas eficiente e seletivamente

Ex. : Açúcar pode ser estocado por anos, mas no organismo ele libera energia química em segundos …… “ catálise”

2.  Catalisadores em sistema biológico:

“ AS ENZIMAS” …..Proteínas altamente especializadas que possuem

eficiência catalítica extraordinária

alto grau de especificidade

aceleram as reações químicas

1. Introdução: Enzimas

Energia

Enzimas são catalisadores extraordinários e altamente específicos!

A maior parte da História da Bioquímica coincide com a História das Enzimas 1850 Louis Pasteur …………..Fermentação em células vivas (“força vital”, vitalismo) 1878 Fredrich Wilhelm Kuhne…Enzima (en=no e zyme=levedura) 1897 Eduard Buchner …… Extrato de levedura livre de células capaz de realizar a fermentação 1894 Emil Fischer ………………Hipótese chave-fechadura 1926 James Sumner ……. Cristalização da Urease do Feijão Preto → Demonstrou que enzimas

são proteinas J.B.S. Haldane …… Interações Enzima-Substrato (Escreveu um tratado sobre Enzimas)

Atividade catalítica depende da conformação proteica

Glucose

Se a Enzima é desnaturada ou dissociada em subunidades ela perde a atividade catalítica!!

Isomerização: aldose cetose

Enzima alostérica

Clivagem da frutose 1,6-bifosfato

Cofatores : compostos inorgânicos

Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+

Coenzimas : compostos orgânicos.

Normalmente derivado de vitaminas

Grupo Prostético - Componente químico adicional requerido por certas enzimas

-  Estão firmemente ligados às enzimas

Holoenzima = Apoenzima (porção proteica) + coenzima ou cofator

Cofatores : compostos inorgânicos (Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+)

Coenzimas : compostos orgânicos. (Normalmente derivado de vitaminas)

Código para Enzimas : EC 2.7.1.1.

Classificação São classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam

Classe Subclasse Transferase

Fosfotransferase

ATP glicose fosfotransferase

A função termodinâmica denominada de energia livre (G) é importante para compreender como as enzimas trabalham.

2. Como as enzimas trabalham?

Parâmetros termodinâmicos que deve-se considerar:

1) A variação de energia livre (∆G) entre produtos e reagentes

2) A energia necessária (energia de ativação) para iniciar a conversão dos reagentes em produtos

∆G: indica a espontaneidade da reação

Energia de ativação: determina a velocidade da reação

As enzimas afeta apenas a energia de ativação!

ΔG = ΔH -TΔS

ΔH - que reflete os tipos e o número de ligações químicas e interações não-covalentes quebrados e formados ΔS – que reflete a variação da desordem do sistema

Sob condições de temperatura e pressão constantes...

ΔG<0 (negativo) : Reações espontâneas > produtos têm menos energia livre que os reagentes, a qual pode ser utilizada para realizar trabalho –são reações exergônicas. ΔG >0 (positivo): Pecisam que seja fornecida energia – são reações endergônicas.

ΔG = ΔH -TΔS

ΔG’o negativo → G reagentes > G produtos

ΔG’o positivo → G reagentes < G produtos

Lembrem-se todas as reações químicas tendem a ocorrer no sentido que resulta na diminuição de energia livre do sistema.

Reação ocorre espontaneamente sob condições padrão.

Reação ocorre no sentido reverso, caso seja iniciada com a concentração 1 M (condições padrão)

Energia Livre de Ativação

No interior das células as reações químicas ocorrem devido à presença de enzimas

Enzimas: catalisadores capazes de aumentar

enormemente a velocidade de reações químicas específicas sem serem consumidos no processo. Elas dimimuem a energia de ativação.

Energia de ativação (ΔG*): energia extra necessária

para que a reação ocorra.

Enzimas afetam a velocidade mas não o equilíbrio químico

Reação Química : S P

1. Catalisador não afeta a posição e nem a direção do equilíbrio

2. Um equilíbrio favorável não significa que a conversão de S→P ocorra em uma velocidade mensurável

3. A velocidade depende da Energia de Ativação: “energia necessária para o alinhamento dos grupos químicos reagentes, formação de cargas transientes, rearranjos de ligações e outras transformações necessária para que a reação ocorra em uma das direções”

O equilíbrio da reação está relacionado à variação de energia livre padrão

Um grande valor negativo de ΔGo’ indica um equilíbrio de reação favorável á formação dos produtos, mas não significa que ela ocorra a uma velocidade considerável.

As enzimas fornecem um ambiente específico (SÍTIO ATIVO) onde uma dada reação é energeticamente mais fovorável.

Quimotripsina

SÍTIO ATIVO

Tamanho:

Enzima >>> Substrato

SUBSTRATO (ligante)

2. Como as enzimas trabalham?

Reação Química : S P

“Estado Fundamental” Ponto de Partida para a reação de ida ou de volta.

“Energia de Ativação”

Variação de Energia Livre Padrão Bioquímico

“Estado de transição”

Enzimas afetam a velocidade mas não o equilíbrio químico

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

Enzimas aceleram a velocidade da reação diminuindo a energia de ativação

ENERGIA DE ATIVAÇÃO

(A enzima não é gasta no processo e não afeta o ponto de equilíbrio)

Formas complementares de um Substrato e seu Sítio Ativo (Chave-Fechadura, Emil Fischer)

“Complexo Enzima Substrato”

Diidrofolato Redutase

NADP+

Tetraidrofolato

Conceito chave-fechadura sugere um encaixe perfeito entre E e S.

O que resultaria numa enzima pouco eficiente!!

NADP+ liga-se a uma cavidade complementar à sua forma e propriedades iônicas.

Enzima imaginária (“bastonase”) projetada para catalisar a quebra de um bastão de metal

Modelo Chave-Fechadura A cavidade complementar ao substrato estabiliza-o mas não o quebra.

O substrato estabiliza o estado de transição do complexo ES, diminuindo a energia de ativação.

Algumas interações fracas são formadas no complexo ES, mas a totalidade das interações fracas é estabelecida apenas no estado de transição.

O papel da energia de ligação para a catálise

1.  A energia de ligação confere especificidade e catálise.

2.  E + S → ES: A interações fracas formadas entre E e S fornecem a maior parte da energia necessária para a catálise.

Energia de ligação

“Estuda o mecanismo de reações catalisadas enzimaticamente através do estudo da velocidade

da reação enzimática e como ela se altera em função de mudanças nos parâmetros

experimentais”

3. Cinética Enzimática

1913: Teoria geral da ação das enzimas

E + S ↔ ES ↔ E + P

1.  Inicialmente a enzima se combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo ES, um passo relativamente rápido;

2.  A seguir, o complexo ES se rompe liberando a enzima (E) e o produto (P) - uma etapa lenta. ETAPA LIMITANTE DA REAÇÃO!

1 2

A concentração do substrato afeta a velocidade das reações catalisadas enzimaticamente

E + S ↔ ES ↔ E + P Enzima está saturada com S (todas as enzimas econtram-se complexadas com o substrato)

[S] << [E]: Grande quantidade de enzimas livres.

1.   Velocidade Inicial ( V0 ) : velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E]

2. Velocidade máxima ( V max) : ponto em que não ocorre variações em V0 com o aumento da [S].

Equação que relaciona [S] e a Vmax de forma quantitativa.

Michaelis-Mentem derivaram a reação partindo da hipótese de que o passo limitante da reação é a quebra do complexo ES.

Equação de Michaelis-Menten

1. E + S ⇌ ES reversível e relativamente rápida

2. ES ⇌ E + P , Quebra do complexo ES é LENTA!

3.   Velocidade total é dependente da [ES]

4.   Quando [S] ↓ a maioria de E está na forma livre

mas quando [S] ↑↑, a maoria de E está complexada ….. “Enzima está saturada”

E + S ⇌ ES ⇌ E + P

Onde: Vo: velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] Vmax: V máximo [S]: concentração do substrato Km: constante de Michaelis

Significado do Km

•  KM = [S] quando vo = 1/2 Vmax .

•  Em geral, quanto menor o KM, mais forte é ligação do substrato pela enzima.

• KM é usado como uma medida da afinidade da enzima pelo substrato

Transformação da equação de Michaelis e Mentem Gráfico do Duplo-Recíproco (Equação de Lineweaver- Burk)

Enzimas estão sujeitas à inibição

1.  Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática

Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou acelerando a velocidade da reação… esse é o mecanismo de ação da grande maioria de agentes farmacêuticos.

Ex. : Aspirina→ Inibidor da síntese de Prostaglandinas → Antiinflamatório

2. Classificação:

1) Inibição Reversível: Inibição Competitiva

Inibição Não-Competitiva

Inibição Inconpetitiva

Inibição Mista

2) Inibição Irreversível

As especificidades das fosfolipases

Arachidonic acid an some eicosanoid derivatives

(response to hormonal signals)

Aspirin, acetaminophen, .... Inhibiting the enzyme cyclooxygenase

Inibição competitiva

(I liga-se somente a E)

Inibição competitiva

Ki: constante de dissociação do inibidor Ki=[E][I]/[EI] Qto < Ki, mais potente é a inibição.

Cinética na presença de [I] crescentes

1. Vmax → não se altera 2. Km → aumenta

1 KM (1 + I/Ki) 1 1 --- = ---------------- x --- + --- v VM S VM

KM aumenta; Vmax igual

Exemplo: Intoxicação por Metanol

Desidrogenase alcoolica converte metanol em formaldeído (tóxico!) que pode resultar em cegueira.

Tratamento: ETANOL

O etanol compete com o metanol pelo sítio ativo da enzima

Inibição competitiva

Inibição Não-Competitiva

Inibidor liga-se a enzima em um sítio diferente a do sítio ativo do substrato.

Inibição Não-Competitiva

(I liga-se a E ou ES)

1. Vmax → diminui 2. Km → não se altera

1 KM 1 1 --- = ---------------- x --- + ----------------- v VM / (1 + I/Ki) S VM / (1 + I/Ki)

KM igual; Vmax diminui

Inibição Irreversível Inibidores irreversíveis combinam-se com um grupo funcional na molécula da enzima ou o destroem ou ainda formam uma associação covalente bastante estável. São úteis como ferramentas no estudo de mecanismo de reação, principalmente para a identificação de aminoácidos importantes para a catálise no sítio ativo.

Quimotripsina

Diisopropylfluorophosphate Forma permanentemente inativa

5. Enzimas Alostéricas

Enzimas reguladas pela ligação não-covalente de compostos reguladores chamados, moduladores

alostéricos.

A regulação enzimática envolve alterações conformacionais similares a da Hemoglobina

Enzimas Regulatórias

5. Enzimas Alostéricas

São proteínas compostas de subunidades (Estrutura Quaternária) e exibe cooperatividade

Possuem sítios distintos de ligação:

Sítio regulatório e sítio catalítico (ativo). Sítio regulatório localiza-se em um sítio distinto do sítio ativo. Esses sítios podem estar localizados em uma mesma subunidade ou em subunidades distintas.

5. Enzimas Alostéricas

•  Em muitas enzimas alostéricas o sítio de ligação do substrato e o(s) sítio(s) de ligação do substrato estão em subunidades diferentes.

•  O modulador pode ser Estimulatório ou Inibitório

•  Ligação do modulador causa MUDANÇAS na CONFORMAÇÃO.

As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas divergem do comportamento de Michaelis-Mentem

1.  As enzimas alostéricas apresentam relações entre Vo e S que diferem da cinética de Michaelis-Menten.

2.  Curva sigmoidal em vez de hiperbólica.

3.  Ao invés de Km tem-se um K0,5

5. Enzimas Alostéricas

Efeitos de um modulador positivo e negativo sobre a enzima alostérica

Positive modulator

Negative modulator

5. Enzimas Alostéricas

Glicólise

Fosfofrutoquinase

•  Tetrâmero •  Substratos

–  F6P –  ATP

•  Efetores Alostéricos –  PEP, ATP (negativo) –  ADP (positivo)

Monômero ADP

Sítio Ativo

Exemplo de enzima alostérica

Fosfofrutoquinase é regulada alostericamente por ATP

Modulador negativo

5. Enzimas Alostéricas

Regulação Alostérica

•  Lembrar dos estados T e R da Hemoglobina

•  Inibidores alostéricos favorecem o estado T (menor afinidade)

•  Ativadores alostéricos favorecem o estado R (maior afinidade)

2 modelos de Cooperatividade •  Concerted

–  Symmetry driven- all R or All T. Substrate stabilizes R.

•  Sequential –  Ligand induced –

neighboring unoccupied subunits are variably affected

Modificação Covalente

Glicogênio fosforilase

Habilidade catalítica em converter S em P.

Medida: Unidades de Atividade. 1U=1µmole produto/min. (em condições ótimas)

Atividade específica: atividade enzimática quantidade de enzimas Expresso em: unidades/mg proteína

Atividade de uma enzima

Catálise Enzimática

A catálise é um processo que aumenta a velocidade com o qual a reação chega ao equilíbrio.

Duas propriedades importantes para a catálise: 1. Especificidade pela ligação ao substrato

2. Organização otimizada dos grupos catalíticos

Mecanismos de catálise

1) Catálise ácido-base

2) Catálise Covalente

3) Catálise por Íons Metálicos

A reação não-catalisada ocorre lentamente devido à alta energia do estado de transição. Na catálise ácida-geral, a transferência de um próton, diminui a energia do estado de transição. Na catálise básica-geral, a abstração de um próton por uma base, ajuda a estabilizar o estado de transição.

Catálise ácido-base

NNH

+H

-H NNH

HNão-ionizado"Catalisador Básico"(proton 'sink')"

Ionizado"Catalisador ácido"(proton source)"

Reação não-catalisada

Formação de um carbânion no estado de transição

Reação não-catalisada

Catálise ácida (transferência de prótons para o estado de transição)

A doação de um próton ao átomo de oxigênio, reduz o caráter de carbânion do estado de transição, diminuindo a energia de ativação e acelerando a reação.

Reação não-catalisada

Catálise básica (remoção de prótons por uma Base)

A remoção parcial de um próton por uma base diminui a energia do estado de transição.

Algumas reações são simultaneamente sujeitas a catálise ácida e básica

Catálise Ácida Geral

Catálise Básica Geral

Exemplo: Reação da RNAse A - Catálise ácido-básica geral

Catálise Ácida Geral

Catálise Básica Geral

Exemplo: Reação da RNAse A - Catálise ácido-básica geral

Catálise Covalente

Formação transitória de uma ligação covalente entre o catalisador e o substrato.

A-B + :X A-X + B

A-B A + B H2O

A + B + :X H2O

Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

Catálise por Íons Metálicos

Cerca de 1/3 de todas as enzimas conhecidas necessita de íons metálicos para que tenha atividade catalítica

Metais ligam-se a substratos de modo a orientá-los de

forma apropriada para a reação

Metais promovem reações de oxi-redução

Metais conferem estabilização de cargas

Enolase

Enolase

2 íon de Mg2+ coordenam com a carboxila

Extração de um próton (catálise básica geral)

Estabilização da forma enólica pelos Mg2+

Enolase

Eliminação de hidróxido por catálise ácida geral

Enolase

Catálise Eletrostática

A ligação de um substrato normalmente exclui água do sítio ativo

Grupos carregados no sítio ativo da enzima que tem constante dielétrica baixa organizam-se de maneira a

estabilizarem o complexo de transição.