LAURA MACHADO DE FARIA. INTRODUÇÃO Metabolismo da energia mitocondrial: - Cadeia...

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  • LAURA MACHADO DE FARIA

  • INTRODUOMetabolismo da energia mitocondrial:

    Cadeia transportadora de eltrons => bombeia prtons para o espao intermembranar => produzindo um H+ => fora dirigente para a sntese de ATP;

    H+ pode ser convertido em calor (bat) => termognese por no-tremor; H+ => mecanismo de defesa em stress oxidativo.

  • INTRODUOMecanismo de Regulao das taxas de Respirao e Sntese de ATPGrau de acoplamento entre respirao e fosforilao regulados por dois distintos processos: Oxidase Alternativa (AOx);

    Protenas Desaclopadoras (UCP).

  • INTRODUOQuais os mecanismos de regulao Termognese em Plantas?Oxidase Alternativa (AOx)Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas (PUMP)Mitocndrias de plantas possuem dois sistemas dissipadores de energia que diminuem a eficincia da fosforilao oxidativa.Regulao intrnseca sistema de dissipao-potencial redox (no forma H+) Regulao extrnseca sistema de dissipao-potencial prton eletroqumico (formao de H+)

  • so enzimas mitocondriais encontradas no eucariontes, possivelmente em animais; AOx tipo 1 monocodiledneas e dicotiledoneas expresso relacionada ao estresse; AOx tipo 2 somente em dicotiledneas expresso constitutiva; AOx tipo 3 Arabdopsis expresso diminui a baixas temperaturas (downregulated) indicando papel fisiolgico no metabolismo de energia.

    funcionam como dmero; catalizam a oxidao/reduo do oxignio/ubiquinol; a nica funo confirmada para AOx a termognese respiratria em Arum spp e outras espcies, onde a produo de calor durante a antese volatiza compostos aromticos e atrai polinizadores.

    - produz uma rota alternativa para gerao de eltrons na cadeia transportadora (transloca eltrons somente no complexo 1). a ativao da oxidase reduz a gerao de ATP.

    Oxidase Alternativa - AOx

  • torna-se ativa quando UQ pool 40-50% reduzido, aumentando sua atividade com o aumento da reduo de UQ pool; qto maior a reduo do UQ pool, menor a afinidade de AOx por O2; o estado reduzido de AOx depende da gerao de NADPH e envolve sistema de acoplamento de reduo do NADPH por glutationa e tioredoxina;

    AOx no sensitiva a inibidores da rota metablica do citocromo, mas inibida por cidos hidroxmicos, como o benzohidroxamato (BHAM) e por fatty acids (FA);- No ocorre H+ durante a respirao.

    Oxidase Alternativa - AOx

  • Mini-reviso focando nos possveis papis de Oxidase Alternativa, e a Protena Desaclopadora Mitocondrial Vegetal (PUMP) no metabolismo de energia mitocondrial em plantas. OBJETIVOS

  • METODOLOGIAEm tecidos termognicos e no termognicosEm condies normais e de estresseProtena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas (UCP)Oxidase Alternativa AOxAnlises de ExpressoEstudos Funcionais

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPEXPERIMENTOSSuperexpresso de AtPUMP1 em plantas de tabaco transgnico:

    Levando a um significativo aumento na tolerncia ao estresse oxidativo (promovido por perxido de hidrognio) qdo comparado s plantas controles no transgnicas;

    Em plantas chilling-sensitive (cana-de-aucar), o estreses oxidativo o principal componente do chilling stress);

    ROS (espcies de oxignio reativas) pode reagir com DNA, lipdeos e protenas e causar srios danos celulares;

    a mitocndria representa uma das maiores fontes de ROS durante cold stress => PUMP e AOx podem agir como reguladores da produo de ROS.

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPEXPERIMENTOSInduo de expresso de PUMP de milho por menadiona:

    gera superxido => sugere que a expresso de ZmPUMP in vivo pode ser controlado por nveis de ROS;considerar que o propsito da expresso da PUMP cold-stress-induced balancear a produo aumentada de ROS potencial.

    3. Anlises da regio upstream promotora 1.0 kb de PUMP4, 5 e AOxla (PLACE e PlantCARE) do stio de transcrio em Arabidopsis, revela uma sequncia comum alvo de um FT envolvido no processo oxidativo, ativando proteinas peroxissomal.

  • a energia para termognese fornecida pelo o aumento da respirao mitocondrial por meio de AOx;

    e controlada pelo cido Saliclico;

    - entretanto, a expresso de AOx1 induzida por cido saliclico tanto em plantas termognicas como no-termognicas.Oxidase Alternativa - AOx

  • O provvel papel de AOx em plantas no-termognicas o de minimizar a produo de ROS:

    experimentos com transgnicos de tabaco overexpressando ou faltando AOx sugerem que AOx est envolvido na resposta hipersensitiva infeco por vrus e pode prevenir a morte programada da clula induzida pela downregulaion da rota metablica do citocromo;

    Aox efetivamente induzida pela inibio qumica artificial da rota metablica do citocromo por poisons (txicos) tais como cianido e antimicina A;

    alguns autores sugerem que a induo de AOx por cianido/antimicina A, bem como por cido saliclico indireta, via aumento da produo de ROS que conhecido por upregulate a expresso de AOx1. Oxidase Alternativa - AOx

  • Fig. 1. Ratio between CO2 evolution rates of intact potato tubers stored at 51C and tubers stored at 251C. Each point represents the mean value SD of four determinations, each one using a group of four intact potato tubers. Signicant dierences (p < 0.01) between CO2 evolution rates of cold- and warm-treated potato tubers are indicated by asterisks.- conhecido que estresse ao frio ativa a AOx em plantas no-termognicas.- Taxas de CO2 em tubrculos em batata diferentes temperaturas. Oxidase Alternativa - AOx

  • Fig. 2. Determination of AOx capacity in mitochondria isolated from potato tubers stored for 4 days at 51C or 252C. Mitochondria (0.5 mg/ml) were incubated in a standard reaction medium (28C) in the presence of 2.5 g/ml oligomycin, 300 M propranolol, 2 M atractyloside, 0.1 mM ATP, 0.5% BSA, 1 mM DTT, and 0.15 mM pyruvate. Additions of 2 mM KCN and 2 mM BHAM were done where indicated. Slope 1 refers to the total respiration rate, a dierence between slope 1 and slope 2 refers to CN-sensitive respiration and between slope 2 and slope 3 to AOx capacity.AkdkdkdkdA taxa de CO2 output aumentou a 5 C;Alto consumo de O2. - Atividade AOx a 5 C foi ~ 10x maior que em 25C. Oxidase Alternativa - AOx

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPCaractersticas:

    sistemas de gradiente eletroqumico de prton por dissipao de potencial;

    principal forma de regulao extrnseca de eficincia de fosforilao oxidativa;

    mediado por H+, sem a produo de ATP;

    UCPs e PUMPs permitem o retorno dos prtons novamente matrix mitocondrial sem sntese de ATP, dissipando a energia de H+ como calor;

    o resultado um desaclopamento de respirao da sntese de ATP.

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPHistrico:

    first uncoupling protein (UCP) in 1976 (bat);

    Vercesi et al. (1995) descobriram PUMP em tubrculos de batata;

    foi detectada em vrios outros seres por produo de anticorpos contra batatas PUMP ou contra PUMP recombinante isolada de sistema de expresso em E. coli;

    outros genes codificando UCPs 1-5, AtPUMP1 e AtUCP2 foram descobertos;

    descoberta pelo grupo distintos padres de expresso entre monocot. e dicot. durante estresse ao frio sistema de dissipao de energia sujeitos a diferentes regulao transcricional em diferentes clulas e tecido;

    a existncia de UCPs em vrios seres vivos e alta homologia (em todos os eucariotos, exceto em Saccharomyces cerevisiae), sugerindo sua emergncia no incio da escala evolutiva.

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPMecanismos hipotticos de transporte de prtons:

    modelo proton-buffering o H+ transportado diretamente pela UCP;

    modelo protonophore em que o H+ transportado por um free fatty acid (FA) cycling (mecanismo flip-flop) mediado pela UCP (anions vo para o espao intermembranar e voltam para a membrana interna quando protonados e neutros).

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPRegulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos: Ativadores como ex.: - FA - free fatty acid; - UQ - ubiquinona e seu estado redox; - ROS - espcies reativas de oxignio: perxido de hidrognio, superxidos e radicais hidroxil.

    Inibidores como ex.: - nucleotdeo purina, pH-dependente;

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPRegulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:

    Ativadores: UQ - ubiquinona e seu estado redox FA - free fatty acid

    Em 2004, o grupo dos autores relataram UQ regulando a atividade UCP de uma forma diferente ao invs da ativao de UCP por UQ, encontraram que a inibio de FFA induziu a atividade de UCP por GTP, sendo este sob o controle do estado redox de UQ;- UCPs em msculos se tornou GTP-sensitiva quando o nvel de reduo de UQ foi abaixo de 64% e completamente inibida qdo abaixo de 57%.

    Inibidores como: Nucleotdeo purina, pH-dependente

    Sugerindo que o estado redox de UQ poderia ser um sensor metablico que modula a inibio do nucleotdeo purina de UCPs ativadas por FFA em mitocndria de msculo.

  • Protena Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMPRegulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:

    Ativadores: ROS - espcies reativas de oxignio: perxido de hidrognio, superxidos e radicais hidroxil:

    Evidncia de que UQ pode ativar UCP indiretamente via produo de superxido (Echtay et al., 2002). Da mesma forma para PUMP de batata (Considine et al., 2003) => sugerindo conservao dos mecanismos bsicos de ativao de UCP e PUMP.

    - aps Echtay & Brand (2001) encontrarem uma ativao de GDP-sensitive proton conductance de um mitocndria de rim por UQ. Adicionando superxido dismutase, a ativao por UQ diminui fortemente.b

  • Protena Desaclopad