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LAURA MACHADO DE FARIA

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LAURA MACHADO DE FARIA

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INTRODUÇÃO

Metabolismo da energia mitocondrial:

- Cadeia transportadora de elétrons => bombeia prótons para o espaço intermembranar => produzindo um ΔμH+ => força dirigente para a síntese de ATP;

- ΔμH+ pode ser convertido em calor (bat) => termogênese por não-tremor;- ΔμH+ => mecanismo de defesa em stress oxidativo.

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INTRODUÇÃO

Mecanismo de Regulação das taxas de Respiração e Síntese de ATP

Grau de acoplamento entre respiração e fosforilação regulados por dois distintos processos:

- Oxidase Alternativa (AOx);

- Proteínas Desaclopadoras (UCP).

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INTRODUÇÃO

Quais os mecanismos de regulação Termogênese em Plantas?

Oxidase Alternativa (AOx) Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas

(PUMP)

Mitocôndrias de plantas possuem dois sistemas dissipadores de energia que diminuem a eficiência da fosforilação oxidativa.

Regulação intrínseca – sistema de dissipação-

potencial redox (não forma ΔμH+)

Regulação extrínseca – sistema de dissipação-

potencial próton eletroquímico

(formação de ΔμH+)

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- são enzimas mitocondriais encontradas no eucariontes, possivelmente em animais;- AOx – tipo 1 – monocodiledôneas e dicotiledoneas – expressão relacionada ao estresse;- AOx – tipo 2 – somente em dicotiledôneas – expressão constitutiva;- AOx – tipo 3 – Arabdopsis – expressão diminui a baixas temperaturas (downregulated) – indicando papel fisiológico no metabolismo de energia.

- funcionam como dímero;- catalizam a oxidação/redução do oxigênio/ubiquinol;- a única função confirmada para AOx é a termogênese respiratória em Arum spp e outras espécies, onde a produção de calor durante a antese volatiza compostos aromáticos e atrai polinizadores.

- produz uma rota alternativa para geração de elétrons na cadeia transportadora (transloca elétrons somente no complexo 1).- a ativação da oxidase reduz a geração de ATP.

Oxidase Alternativa - AOx

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- torna-se ativa quando UQ pool é 40-50% reduzido, aumentando sua atividade com o aumento da redução de UQ pool;- qto maior a redução do UQ pool, menor a afinidade de AOx por O2;- o estado reduzido de AOx depende da geração de NADPH e envolve sistema de acoplamento de redução do NADPH por glutationa e tioredoxina;

- AOx não é sensitiva a inibidores da rota metabólica do citocromo, mas é inibida por ácidos hidroxâmicos, como o benzohidroxamato (BHAM) e por fatty acids (FA);- Não ocorre ΔμH+ durante a respiração.

Oxidase Alternativa - AOx

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Mini-revisão focando nos possíveis papéis de Oxidase Alternativa, e a Proteína Desaclopadora Mitocondrial Vegetal (PUMP) no metabolismo de energia mitocondrial em plantas.

OBJETIVOS

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METODOLOGIA

Em tecidos termogênicos e não

termogênicos

Em condições normais e de

estresse

Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas (UCP)

Oxidase Alternativa AOx

Análises de Expressão

Estudos Funcionais

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

EXPERIMENTOS

1. Superexpressão de AtPUMP1 em plantas de tabaco transgênico:

- Levando a um significativo aumento na tolerância ao estresse oxidativo (promovido por peróxido de hidrogênio) qdo comparado às plantas controles não transgênicas;

- Em plantas chilling-sensitive (cana-de-açucar), o estreses oxidativo é o principal componente do chilling stress);

- ROS (espécies de oxigênio reativas) pode reagir com DNA, lipídeos e proteínas e causar sérios danos celulares;

- a mitocôndria representa uma das maiores fontes de ROS durante cold stress => PUMP e AOx podem agir como reguladores da produção de ROS.

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

EXPERIMENTOS

2. Indução de expressão de PUMP de milho por menadiona:

- gera superóxido => sugere que a expressão de ZmPUMP in vivo pode ser controlado por níveis de ROS;

- considerar que o propósito da expressão da PUMP cold-stress-induced é balancear a produção aumentada de ROS potencial.

3. Análises da região upstream promotora 1.0 kb de PUMP4, 5 e AOxla (PLACE e PlantCARE) do sítio de transcrição em Arabidopsis, revela uma sequência comum alvo de um FT envolvido no processo oxidativo, ativando proteinas peroxissomal.

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- a energia para termogênese é fornecida pelo o aumento da respiração mitocondrial por meio de AOx;

- e é controlada pelo Ácido Salicílico;

- entretanto, a expressão de AOx1 é induzida por ácido salicílico tanto em plantas termogênicas como não-termogênicas.

Oxidase Alternativa - AOx

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• O provável papel de AOx em plantas não-termogênicas é o de minimizar a produção de ROS:

- experimentos com transgênicos de tabaco overexpressando ou faltando AOx sugerem que AOx está envolvido na resposta hipersensitiva à infecção por vírus e pode prevenir a morte programada da célula induzida pela downregulaion da rota metabólica do citocromo;

- Aox é efetivamente induzida pela inibição química artificial da rota metabólica do citocromo por poisons (tóxicos) tais como cianido e antimicina A;

- alguns autores sugerem que a indução de AOx por cianido/antimicina A, bem como por ácido salicílico é indireta, via aumento da produção de ROS que é conhecido por upregulate a expressão de AOx1.

Oxidase Alternativa - AOx

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Fig. 1. Ratio between CO2 evolution rates of intact potato tubers stored at 5±1°C and tubers stored at 25±1°C. Each point represents the mean value ±SD of four determinations, each one using a group of four intact potato tubers. Significant di erences (p < 0.01) between CO2 evolution rates of cold- and ffwarm-treated potato tubers are indicated by asterisks.

- É conhecido que estresse ao frio ativa a AOx em plantas não-termogênicas.

- Taxas de CO2 em tubérculos em batata diferentes temperaturas.

Oxidase Alternativa - AOx

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Fig. 2. Determination of AOx capacity in mitochondria isolated from potato tubers stored for 4 days at 5±1°C or 25±2°C. Mitochondria (0.5 mg/ml) were incubated in a standard reaction medium (28°C) in the presence of 2.5 μg/ml oligomycin, 300 μM propranolol, 2 μM atractyloside, 0.1 mM ATP, 0.5% BSA, 1 mM DTT, and 0.15 mM pyruvate. Additions of 2 mM KCN and 2 mM BHAM were done where indicated. Slope 1 refers to the total respiration rate, a di erence between slope 1 and slope 2 refers ffto CN-sensitive respiration and between slope 2 and slope 3 to AOx capacity.

Akdkdkdkd

-A taxa de CO2 output aumentou a 5 °C;-Alto consumo de O2.

- Atividade AOx a 5 °C foi ~ 10x maior que em 25°C.

Oxidase Alternativa - AOx

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

Características:

• sistemas de gradiente eletroquímico de próton por dissipação de potencial;

• principal forma de regulação extrínseca de eficiência de fosforilação oxidativa;

• mediado por ΔμH+, sem a produção de ATP;

• UCPs e PUMPs permitem o retorno dos prótons novamente à matrix mitocondrial sem síntese de ATP, dissipando a energia de ΔμH+ como calor;

• o resultado é um desaclopamento de respiração da síntese de ATP.

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

Histórico:

• first uncoupling protein (UCP) in 1976 (bat);

• Vercesi et al. (1995) descobriram PUMP em tubérculos de batata;

•foi detectada em vários outros seres por produção de anticorpos contra batatas PUMP ou contra PUMP recombinante isolada de sistema de expressão em E. coli;

• outros genes codificando UCPs 1-5, AtPUMP1 e AtUCP2 foram descobertos;

•descoberta pelo grupo distintos padrões de expressão entre monocot. e dicot. durante estresse ao frio – sistema de dissipação de energia sujeitos a diferentes regulação transcricional em diferentes células e tecido;

•a existência de UCPs em vários seres vivos e alta homologia (em todos os eucariotos, exceto em Saccharomyces cerevisiae), sugerindo sua emergência no início da escala evolutiva.

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

Mecanismos hipotéticos de transporte de prótons:

• modelo proton-buffering – o H+ é transportado diretamente pela UCP;

• modelo protonophore – em que o H+ é transportado por um free fatty acid (FA) cycling (mecanismo flip-flop) mediado pela UCP (anions vão para o espaço intermembranar e voltam para a membrana interna quando protonados e neutros).

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Regulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:

• Ativadores como ex.: - FA - free fatty acid; - UQ - ubiquinona e seu estado redox; - ROS - espécies reativas de oxigênio: peróxido de hidrogênio, superóxidos e radicais hidroxil.

• Inibidores como ex.: - nucleotídeo purina, pH-dependente;

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

Regulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:

• Ativadores: UQ - ubiquinona e seu estado redox FA - free fatty acid

- Em 2004, o grupo dos autores relataram UQ regulando a atividade UCP de uma forma diferente – ao invés da ativação de UCP por UQ, encontraram que a inibição de FFA induziu a atividade de UCP por GTP, sendo este sob o controle do estado redox de UQ;- UCPs em músculos se tornou GTP-sensitiva quando o nível de redução de UQ foi abaixo de 64% e completamente inibida qdo abaixo de 57%.

• Inibidores como: Nucleotídeo purina, pH-dependente

Sugerindo que o estado redox de UQ poderia ser um sensor metabólico que modula a inibição do nucleotídeo purina de UCPs ativadas por FFA em mitocôndria de músculo.

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

Regulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:

• Ativadores: ROS - espécies reativas de oxigênio: peróxido de hidrogênio, superóxidos e radicais hidroxil:

Evidência de que UQ pode ativar UCP indiretamente via produção de superóxido (Echtay et al., 2002). Da mesma forma para PUMP de batata (Considine et al., 2003) => sugerindo conservação dos mecanismos básicos de ativação de UCP e PUMP.

- após Echtay & Brand (2001) encontrarem uma ativação de GDP-sensitive proton conductance de um mitocôndria de rim por UQ. Adicionando superóxido dismutase, a ativação por UQ diminui fortemente.b

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

UCPs – Função Termogênica x Não-Termogênica

- originalmente consideradas apenas produtoras de calor em termogênese por não-tremor em mamíferos que hibernam – rewarming period (BAT de UCP1 e muscle-type UCP);Obs.: Ca2+ -ATPase (SERCA) hidrolisa ATP (dissipação da energia conservada em ATP) sem o transporte de Ca2+ (uncoupled Ca2+ ATPase), resultando em produção de calor.

- a participação de outras isoformas de UCP na termogênese é incerta:- UCP2 e UCP3 – regulação do peso do corpo ou produção de ROS;

- PUMP1, 4 e 5 são induzidas pelo frio (expressão de genes PUMP em Arabidopsis codificando PUMP1, 4 e 5.- PUMP2 e 3 – expressão lenta e insensível ao frio.

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP

UCPs – Função Termogênica x Não-Termogênica

UCPs em plantas não-termogênicas:

- Hipótese a favor de um papel mais geral: a regulação do metabolismo energético em mitocôndria => para evitar um extremo aumento do ΔμH+, o qual pode levar a uma excessiva produção de espécies de oxigênio reativas.

=> Levantando questões sobre o real papel fisiológico das UCPs.

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Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas

Fig. 3. Electrical transmembrane potential (ΔΨ) of mitochondria isolated from potato tubers stored for 4 days at 25±2 or 5±1C. Potato mitochondria (‘‘PM’’; 0.5 mg/ml) were incubated in a standard medium (28C) containing 2 μg/ml oligomycin, 7 μM atractyloside, 300 μM propranolol, 0.1 mM ATP, and 10 μM linoleic acid (LA). Additions of 5 mM ATP, 0.1% BSA, and 1 mM KCN were done where indicated. ΔΨ was estimated as a function of changes in safranin O fluorescence (arbitrary units, here referred to as a.u.).

Expressão de StPUMP aumenta na exposição ao frio => Entretanto, a alta capacidade funcional de StPUMP não dispara a termogênese.

- Armazenamento no frio por 4 dias seguidos produz uma resposta da mitocôndria ao re-acoplamento (taxa de respiração diminui ao mesmo nível do controle) quando adicionado ATP e BSA.

- Ao contrário, ATP não produz efeito no controle mitocondrial ao re-acoplamento para tubérculos warm-stored.

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CONCLUSÕES

• As Regulações intrínseca e extrínseca da fosforilação oxidativa em plantas são realizadas por meio da dissipação de energia que leva ao aumento da produção de calor;

• Contudo, sistemas de dissipação de energia manifestam termogênese somente diante de uma capacidade funcional muito alta;

• Níveis de expressão suficientemente altos para promover a termogênese: UCP1 em tecido adiposo marrom de mamíferos e AOx1 em algumas espécies de espádices;

• A possível função termogênica de PUMP veio de observações de estresse ao frio, que estimulou a transcrição de genes PUMP em raízes e flores de batata a Arabidopsis thaliana;

• Contudo, o estresse ao frio elevou a produção de ROS que também induziu a transcrição de genes PUMP;

• A maioria das plantas, com exceção das termogênicas, não produzem suficiente aquecimento metabólico para aumentar a temperatura de todo o tecido;

• Isto sugere que o papel biológico de ambos os sistemas pode ser mais no sentido de, por haver nestes casos relevantes funções da PUMP e AOx concomitantes, melhorar a regulação do metabolismo de energia mitocondrial e a prevenção da formação excessiva de ROS.