La Biología Molecular en el Diagnóstico de las ... de noviembre de 2017 La Biología Molecular en...

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Vall d'Hebron Barcelona Hospital Campus 1 Sempre, el pacient primer Adoración Blanco Álvarez 16 de noviembre de 2017 La Biología Molecular en el Diagnóstico de las Hemoglobinopatías. Indicaciones y validación de resultados Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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Vall d'Hebron Barcelona Hospital Campus 1 Sempre, el pacient primer

Adoración Blanco Álvarez

16 de noviembre de 2017

La Biología Molecular en el Diagnóstico de las Hemoglobinopatías.

Indicaciones y validación de resultados

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α y β talasemia HbE HbS

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TIPO DE MUTACIÓN POSIBLE CONSECUENCIA (EJEMPLO)

Mutación puntual Variante sinónima

Variante missense (Hb S, Hb C,.)

Aparición codón stop (Hb McKess Rocks)

Desaparición codón stop (Hb Constant Spring)

Duplicación o deleción de uno

o más genes Pérdida de expresión del gen (α-talasemia)

Pérdida de la expresión de los genes β y δ pero incremento de

la función del gen Gγ (Persistencia de Hb F)

Entrecruzamiento desigual

durante la meiosis

produciendo genes de fusión

Fusión α2α1 (-α3.7 talasemia)

Fusión δβ (Hb Lepore)

Mutaciones indel (frameshift) Alteración en la pauta de lectura ( β-talasemia)

Translocaciones

cromosómicas Triplicación de un gen α

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TÉCNICAS MOLECULARES

Estudio de afinidad por el oxígeno

Estudio de estabilidad molecular

Pruebas de solubilidad

Cuantificación de las fracciones HbA2 y HbF

Electroforesis de Hemoglobinas

HEMOGRAMA

Diagnóstico en el Laboratorio Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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Discrepancia genotipo-fenotipo

Hemoglobinopatías compuestas

Diagnóstico en α-talasemia

Consejo genético

Estudio prenatal

Cuándo realizar estudio molecular en las Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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• Síndromes drepanocíticos, Hb inestables, Hb de alta afinidad, Hb M

Hemoglobinopatías estructurales

• α-talasemia, β-talasemia

Talasemias

• HB E, HB Lepore, HB Constant-Spring

Variantes de la hemoglobina talasémicas

Persistencia hereditaria de la Hb fetal

Qué estudiar en las Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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• Mutaciones conocidas y recurrentes PCR

• Grandes deleciones o adiciones conocidas o no MLPA

• Mutación desconocida Secuenciación

Cómo estudiar las

Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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Hemoglobina S: Qué, Cómo y Cuándo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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Piel F et al. 2017

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Cribado neonatal

Consejo genético

Discrepancia fenotipo-genotipo

Estudio prenatal

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CASO1

Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia.

El padre (35 a) no presenta anemia y VCM 81. Hb F y Hb A2 normal.

Ambos hermanos (6 a y 3 a) presentaban anemia (Hb 12,8 y 12,6) y microcitosis

(VCM 69 y VCM 68). El estudio del metabolismo era normal.

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Harteveld an Higgs Orphanet Journal of rare diseases 2010, 5:13

Mutaciones delecionales de α-talasemia

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TRANS

CIS

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Hidropesia fetal por Hb Bart

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SOUTHERN BLOT POLYMERASE CHAIN REACTION

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Deleción 3,7 Kb de α-tal

GAP-PCR

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PCR e hibridación inversa

• Obtención del ADN

• Amplificación PCR utilizando cebadores marcados con biotina

• Hibridación en tiras contienen sondas alelo-específicas

• Revelación utilizando estreptavidina-fosfatas-alcalina y sustrato de color

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Triplicación alfa

Deleción 3,7Kb

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CASO1

PADRE: Triplicación α

HIJOS: No presentan alteraciones

Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia.

Todos presentan microcitosis sin alteraciones en el metabolismo del hierro.

Sospecha de mutaciones puntuales

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• 69 mutaciones puntuales

• Formas no delecionales de alfa talasemia (αTα/αα)

• Afectan:

• secuencias de control de la expresión: CAJA CCAAT Y TATA

• Codón de iniciación y terminación

• Señales de splicing

• Señal de poliadenilacion

• Mutaciones sin sentido

• Modificacion del marco de lectura

• Secuencia de aminoácidos

Mutaciones no delecionales de α-talasemia

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Secuenciación Sanger Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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CASO1

PADRE: Triplicación α

HIJOS: No presentan alteraciones

Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia.

Todos presentan microcitosis sin alteraciones en el metabolismo del hierro.

HEMOGLOBINA AGRINIO EN HETEROCIGOSIS

HbVar: Hemoglobina hiperinestable

Microcitosis

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CASO 2

Niña (propositus) de 7 años con Hb 10,7, VCM 64, HbF 7,3%, HbA2 2,7%.

Hermano 9 años con Hb 11.5, VCM 63, HbF 1.8%, HbA2 3.2%.

Madre portadora de α-talasemia, 3,7Kb con leve anemia y microcitosis

Padre no estudiado

SOSPECHA: Niña δβ-talasemia heredada del padre

Hermano α-talasemia heredada de la madre

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CASO 2 Niña (propositus) de 7 años con Hb 10,7, VCM 64, HbF 7,3%, HbA2 2,7%.

Hermano 9 años con Hb 11.5, VCM 63, HbF 1.8%, HbA2 3.2%.

Madre portadora de α-talasemia, 3,7Kb con leve anemia y microcitosis

Padre no estudiado

SOSPECHA: Niña δβ-talasemia heredada del padre

Hermano α-talasemia heredada de la madre

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CASO 2

Estudio α-talasemia: Madre deleción 3,7Kb heterocigosis

Padre normal

Niña normal

Hermano deleción 3,7Kb heterocigosis

Estudio βδ-talasemia: Madre deleción Spanish heterocigosis

Padre normal

Niña deleción Spanish heterocigosis

Hermano deleción Spanish heterocigosis

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Discrepancia genotipo-fenotipo

Hemoglobinopatías compuestas

Diagnóstico en α-talasemia

Consejo genético

Estudio prenatal

Cuándo realizar estudio molecular en las Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

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