L8 chapter6 1 - FORTH-IMBB1. Πολυμεράση που δεν κάνει διορθωτικό...

ΑνασυνδυασμένοDNA

James D. WatsonAmy A. Caudy

Richard M. MyersJan A. Witkowski

Γονίδια και ΓονιδιώματαΜία Συνοπτική Παρουσίαση

Ανασυνδυασμένο DNA 2Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

Κεφάλαιο 6

Τα σύγχρονα εργαλεία στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένουDNA

Ανασυνδυασμένο DNA 3

ΕΙΚΟΝΑ 6.1: Προσθήκη νέων αλληλουχιών στο 5΄ άκρο των προϊόντων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).

-Προσθήκη κατάλληλων θέσεων περιορισμού (προσοχή: δεν θα πρέπει να υπάρχει στην αλληλουχία του προϊόντος!)

-Προσθήκη αλληλουχίας επίτοπου (7-10 αμινοξέα) που θα αναγνωρίζεται από γνωστό αντίσωμα. Χρήσιμο για τον εντοπισμό ή την απομόνωση της πρωτεΐνης

Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση

4

ΕΙΚΟΝΑ 6.2: Τυχαία μεταλλαξιγένεση ενός συγκεκριμένου γονιδίου και επιλογή των μεταλλαγμένων μορφών του.

Από τη στιγμή που έχουμε έναν GFP επίτοπο

μπορούμε να δημιουργήσουμε τυχαίες μεταλλαγές με

συνθήκες που τις ευνοούν:

1. Πολυμεράση που δεν κάνει διορθωτικό έλεγχο

2. Χαμηλή συγκέντρωση μιας DNA βάσης

3. MηCl2 αντί για MgCL2

Μόνο κατά προσέγγιση των κύριων λειτουργικών περιοχών ενός γονιδίου. Δεν μπορείς να γνωρίζεις τοντρόπο λειτουργίας των μηχανισμών σε μοριακό επίπεδο.


ΕΙΚΟΝΑ 6.3: Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μέσω ολιγονουκλεοτιδίου.

ΕΙΚΟΝΑ 6.3: Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μέσω ολιγονουκλεοτιδίου.

Θέλουμε να απομακρύνουμε τα πατρικά πλασμίδια (δεν φέρουν τη μεταλλαγή) και τα

ετερόδιπλα (μόνο ένας κλώνος φέρει τη μεταλλαγή):

Μεθυλίωση Dam: η αδενοσίνη μεθυλιώνεται στην πατρική αλληλουχία GATC.

Το DNA που συντίθεται in vitro όχι. DpnI: κόβει μόνο μεθυλιωμένο DNA.

Αν κάποιος έχει ήδη καρκίνο και καταστείλουμε τη δράση του

ογκογονιδίου, τότε ο καρκίνος θεραπεύεται

ή είναι πολύ αργά;

Lac Operon

+

Διαγονιδιακή τεχνολογία ποντικών

+

Ογκογονίδια

Θα χρειαστούμε τις γνώσεις μας για το:


ΕΙΚΟΝΑ 3.1: Η ρύθμιση του οπερονίου lac.

+CAP: catabolite gene Activator Protein (όταν τα επίπεδα cAMPμειώνονται ραγδαία παρουσία γλυκόζης (καταβολική καταστολή)


ΕΙΚΟΝΑ 3.1: Η ρύθμιση του οπερονίου lac.

+CAP: catabolite gene Activator Protein (όταν τα επίπεδα cAMPμειώνονται ραγδαία παρουσία γλυκόζης (καταβολική καταστολή)

1. Αντί LacZ να βάλουμε ένα άλλο γονίδιο! 2. Να αλλάξουμε τον υποκινητή3. Να μεταφέρουμε τον “Ο” σε άλλο γονίδιο

ΕΙΚΟΝΑ 6.4: Το σύστημα Tet-off χρησιμοποιήθηκε για να διαπιστωθεί αν η συνεχής έκφραση του myc είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης ενός

όγκου.

Το γονίδιο tTA συνδυάζει:

TetR: προσδένεται στο DNA

AD: προέρχεται από τον

ερπητοιό Vp16 και

ενεργοποιεί τη μεταγραφή.

Προσδένεται στο χειριστή

TetO απουσία τετρακυκλίνης

Υποκινητής της βαριάς αλυσίδας των αντισωμάτων

ΕΙΚΟΝΑ 6.4: Το σύστημα Tet-off χρησιμοποιήθηκε για να διαπιστωθεί αν η συνεχής έκφραση του myc είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης ενός όγκου.

-Απουσία τετρακυκλίνης τα ζώα πέθαιναν από όγκους του λεμφοποιητικού συστήματος.-Αν όμως –ενώ είχαν αναπτύξει όγκους- γινόταν χορήγηση τετρακυκλίνης, οι όγκοι υποχωρούσαν. Αρα η ανάπτυξη των όγκων χρειάζεται τη συνεχή ενεργοποίηση του ογκογονιδίου myc.


ΕΙΚΟΝΑ 6.5: Παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος (mAb).

Η σύντηξη των κυττάρων διευκολύνεται παρουσία πολυαιθυλενικής γλυκόλης.

Τα υβριδικά κύτταρα που εκφράζουν Hprtεπιλέγονται και αναπτύσσονται σε μέσο πουπεριέχει υποξανθίνη, αμινοπτερίνη, θυμιδίνη.

Τα κύτταρα του μυελώματος δεν συνθέτουνHprt και δεν μπορούν να επιβιώσουν.

Τα λεμφοκύτταρα της σπλήνας δεν μεγαλώνουν για πάντα.

Κάθε υβρίδιο παράγει ένα συγκεκριμένο Ab πουαναγνωρίζει ένα συγκεκριμένο αντιγόνο


ΕΙΚΟΝΑ 6.5: Παραγωγή μονοκλωνικού αντισώματος (mAb).

Όσα δείγματα είναι θετικά καλλιεργούνται περεταίρω.

Τα υβριδώματα μπορούν αν καλλιεργούνται για πάντα αφού είναι δυνητικά αθάνατα.

Σήμερα η ιδέα είναι τα Abs να χρησιμοποιηθούν για ειδική στόχευση καρκινικών κυττάρων και τηδημιουργία-παράδοση ενός “magic bullet” που θα καταστρέφει μόνο τα καρκινικά που εκφράζουνένα συγκεκριμένο αντιγόνο.


Σήμερα η ιδέα είναι τα Abs να χρησιμοποιηθούν για ειδική στόχευση καρκινικών κυττάρων και τη δημιουργία-παράδοση ενός “magic bullet” (χημειοθεραπευτικού) που θα συνδέεται με το αντίσωμα και καταστρέφει μόνο τα καρκινικά που εκφράζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο.

magic bullet

Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: ΤΑ κλωνοποίηση

Απλός φορέας

Φορέας έκφρασης

ΕΙΚΟΝΑ 6.6: Στην κλωνοποίηση TOPO TA, η λιγάση αντικαθίσταται από μια τοποϊσομεράση.

Κόβει το φωσφοδ. δεσμόστην αλληλουχία 5-CCCTT-3

-Δεν χρειάζονται περιοριστικά ένζυμα!-Οι εκκινητές δεν ενσωματώνονται γιατίδεν έχουν P

Η τοποισομεράση Ι κόβει το φωσφοδ. δεσμό του φορέα στην αλληλουχία 5-CCCTT-3 και παραμένει συνδεδεμένη στα άκρα του.

Όταν προστεθεί το προϊόν της PCR ενώνει τα άκρα του φορέα με εκείνα του PCRπροϊόντος.

-Οι τοποισομεράσες είναι μια κατηγορία ρεκομπινασών και ρυθμίζουν την υπερελίκωση του DNA.

-Καταλύουν την ανταλλαγή τμημάτων Ομόλογων DNA τμημάτων.

17Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: με ανασυνδυασμό στα βακτήρια

Δότης:

-φέρει το pir-116 πρωτεΐνη Π επιτρέπει την επιλεκτική αντιγραφήπλασμιδίων που φέρουν oriγ

-φέρει το πλασμίδιο F (fertility) που περιέχει το οπερόνιο traπρωτεΐνες που επιτρέπουν μεσωσύζευξης τη μεταφορά πλασμιδίων που διαθέτουν oriT (από το ίδιο το tra πλασμίδιο έχει αφαιρεθεί το oriTγια να μην είναι δυνατή η μεταφορά του).

-Φέρει το πλασμίδιο δότη που έχει oriT ώστε να είναι δυνατή η μεταφορά του στο στέλεχος δέκτη μέσω σύζευξης.


Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: με ανασυνδυασμό

Δέκτης:

-φέρει το ένζυμο περιορισμούI-SceIπου αναγνωρίζει μια σπάνια θέση περιορισμού 18bp και βρίσκεταιυπό τον έλεγχο του επαγώγιμου υποκινητή της αραβινόζης.

-φέρει ένα πλασμίδιο που περιέχειορισμένα γονίδια του φάγου λ που επάγουν τη διαδικασία του ανασυνδυασμού υπό τον έλεγχο του επαγώγιμου υποκινητή της λακτόζης.

-Φέρει το πλασμίδιο δέκτη που έχειένα αρνητικό δείκτη επιλογής, το pheS (είναι τοξικό για την E. Coliόταν μεγαλώνει παρουσία ενός ανάλογου φαινυλαλανίνης και του γονιδίου ανθεκτικότητας της αμπικιλίνης


Μεταφορά γονιδίου από ένα φορέα σε ένα άλλο: με ανασυνδυασμό

-Στα δύο πλασμίδια βρίσκονται2 περιοχές ομολογίας. Στο δότηέχουμε το τμήμα που πρόκειται να μεταφερθεί. Στο δέκτη το γονίδιο pheS που πρόκειται να αντικατασταθεί.

-Με σύζευξη, το πλασμίδιο δότης μεταφέρεται στο βακτήριο δέκτη.Το πλασμίδιο του δότη δεν μπορεί νααντιγραφεί γιατί το βακτήριο δέκτηςδεν έχει το pir-116.

Προστίθεται αραβινόζη και έτσι εκφράζεται το I-SceI το οποίο κόβειεκατέρωθεν των ομολογιών Α και Β και στα 2 πλασμίδια. Οι περιοχέςομολογίας παραμένουν.

-Προσθέτουμε IPTG, ενεργοποιείταιο υποκινητής lac και εκφράζονταιοι πρωτεΐνες του φάγου λ για τονανασυνδυασμό.

-Επιλέγονται τα βακτήρια που είναι ανθεκτικά στην Amp και τη Phe

Ανασυνδυασμένο DNA 20

Εικόνα 6.8. Μεταφορά γονιδίων:

-με ηλεκτροδιάτρηση.-με χλωριούχο ασβέστιο

Η έννοια της μόνιμης και παροδικής ενσωμάτωσηςτου εξωγενούς DNA στο γονιδίωμα.

Μόνιμη διαμόλυνση:Διαδοχικοί κύκλοι ανακαλλιέργειας παρουσία τουδείκτη επιλογής.


ΕΙΚΟΝΑ 6.9: Διαμόλυνση με χρήση λιποσωμάτων.

Το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο.

Τα λιπίδια φέρουν στις κεφαλές τους θετικά φορτισμένες κατιονικές ομάδες.

Τα μόρια των λιπιδίων σχηματίζουν αυθόρμητα διπλοστοιβάδες γύρω από τα μόρια DNA δημιουργώντας λιποσώματα.

Τα λιποσώματα προστίθενται στα κύτταρα.

Η επιφάνεια των περισσότερων ζωικών κυττάρων είναι αρνητικά φορτισμένη και τα θετικά φορτισμένα λιποσώματα προσκολλώνται πάνω τους.

Τα κύτταρα προσλαμβάνουν τα σύμπλοκα λιπιδίων-DNAκαι κάποια καταλήγουν στο πυρήνα.


ΕΙΚΟΝΑ 6.10: Αναγέννηση φυτώναπό πρωτοπλάστες.

Η μεταφορά εξωγενούς DNA στα φυτά είναι δύσκολη λόγω του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρίνης.

Οι πρωτοπλάστες δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμακαι προσλαμβάνουν εύκολα DNA με διαμόλυνση ή ηλεκτροδιάτρηση.

Πιο σπουδαίο: αναγεννούν ένα πλήρες φυτό.


ΕΙΚΟΝΑ 6.10: Αναγέννησηφυτών από πρωτοπλάστες.

Όμως η αναγέννηση ολόκληρη φυτού από πρωτοπλάστες στα δημητριακά είναι εξαιρετικά δύσκολη.

Ευνοείται ο σχηματισμόςβλαστών


ΕΙΚΟΝΑ 6.11: Άμεση μεταφορά DNA σε φυτικά κύτταρα με βομβαρδισμό μικροσφαιριδίων.

Το DNA επικάθεται σε μικροσφαιρίδιαβολφραμίου ή χρυσού ~1μmκαι τοποθετούνται στην άκρη ενός πλαστικού βλήματος..

Η κάννη του πιστολιού και ο θάλαμος βρίσκονται σε κενό και τα φυτικά κύτταρα αντέχουν στο κενό για Περίπου 2 λεπτά.

Μετά το βομβαρδισμό τα κύτταρα τοποθετούνται σε καλλιέργεια και από αυτά αναγεννούνται πλήρη φυτά.


Ορισμένοι κυτταρικοί τύποι δεν επιδέχονται την εισαγωγή DNAμε τη χρήση κάποιας από τις τεχνικές που προαναφέραμε.

Έτσι πολλοί ερευνητές στράφηκαν στους ιούς.

Το γονίδιο-στόχος ενσωματώνεται στο γονιδίωμα ενός φάγου και μεταφέρεται μέσα στο κύτταρο μετά τη μόλυνση με το φάγο.

Σημειώσεις:Η χρήση ιών όπως ο SV40 είναι περιορισμένη αφού μόνο μικρά τμήματαDNA μπορούν να ενσωματωθούν (όταν το μέγεθος του DNA αυξηθείπολύ δεν είναι δυνατόν να πακεταριστεί πλέον σε ιικά σωμάτια).

Οι λυτικοί ιοί δεν είναι χρήσιμοι για μόνιμη εισαγωγή του DNA γιατίσκοτώνουν το κύτταρο.

ΕΙΚΟΝΑ 6.12: Χρήση ενός ρετροϊικού φορέα για τη σταθερή και μακροπρόθεσμη έκφραση ενός εξωγενούς γονιδίου.

Φορείς έκφρασης των gag, pol και envεισάγονται σε κυτταρικές σειρές με σταθερή διαμόλυνση.

Το γονίδιο που μας ενδιαφέρει είναι κλωνοποιημένο σε ένα ρετροιικό φορέα που τους έχουν αφαιρεθεί τα γονίδια συσκευασίας.

Τα κύτταρα τώρα εκφράζουν τις πρωτεΐνες συσκευασίας. Το RNA που παράγεται από τον ρετροιό συσκευάζεται σε ιικά σωμάτια. Οι ιοί που απελευθερώνονται περιέχουν το γονίδιο που μας ενδιαφέρει.

ΕΙΚΟΝΑ 6.12: Χρήση ενός ρετροϊικού φορέα για τη σταθερή και μακροπρόθεσμη έκφραση ενός εξωγενούς γονιδίου.

Με τους νέους ιούς μπορούμε τώρα ναμολύνουμε άλλα κύτταρα.

Το γονιδίωμα RNA των ιών συσκευάζεταιμαζί με μόρια αντίστροφης μεταγραφάσηςRNA DNA ενσωμάτωση στο χρωμόσωμα.

Οι ανασυνδυασμένοι ιοί δεν εκφράζουν gag, pol και env και τα κύτταρα που μολύνουν δεν παράγουν νέους ιούς αλλά ενσωματώνουν το γονίδιο που μας ενδιαφέρει στο γονιδίωμα του κυττάρου.

ΕΙΚΟΝΑ 17.17Tο πλασμίδιο Ti και η παρεμβολή RNA

Οι όγκοι επάγονται από το πλασμίδιο Ti του βακτηρίου. Μέρος του DNA του Ti (το Τ-DNA ή μετασχηματιστικό DNA) ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του

φυτικού κυττάρου.

T-DNA: -περιβάλλεται από 2 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 25bp που εμπλέκονται στην εκτομή του T DNA-ακολουθεί η μεταφορά του T-DNA από το βακτήριο στο πυρήνα και η ένθεση του στο πυρηνικό DNA-τα γονίδια της εκτομής, μεταφοράς και ένθεσης βρίσκονται σε άλλη περιοχή του πλασμιδίου (virulence)

ΕΙΚΟΝΑ 6.13: Μεταφορά γονιδίων σε φυτικά κύτταρα με τη χρήση ενός δυαδικού συστήματος.

Χρησιμοποιούμε 2 πλασμίδια:

Δυαδικός φορέας: -Διατηρεί τις 2 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες25bp που εμπλέκονται στην εκτομή του T DNA.-φέρει θετικό δείκτη επιλογής NPTII ώστε τα κύτταρα να είναι ανθεκτικά στη καναμυκίνη-δε φέρει το γονίδιο που εκφράζει την αυξητική ορμόνη και επάγει τους όγκους στο φυτό.

Βοηθητικός φορέας:-έχει αφαιρεθεί το Τ DNA-έχει όμως τα γονίδια vir που είναι υπεύθυνα για την εκτομή, μεταφορά και ένθεση του T DNA.

ΕΙΚΟΝΑ 6.13: Μεταφορά γονιδίων σε φυτικά κύτταρα με τη χρήση ενός δυαδικού συστήματος.

Κλωνοποιούμε το 5’ cDNA του γονιδίου τηςΠολυγαλακτουρονάσης που προάγει την ωρίμανση της ντομάτας με τέτοια φορά ώστε να συντίθεται το αντισημαίνον RNA.

…και επάγουμε τη σίγαση του γονιδίου.


ΕΙΚΟΝΑ 6.14: Κατασκευήδιαγονιδιακών ποντικών μεμικροένεση.

Παραγωγή εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (κυττάρων ES) από βλαστοκύστες ποντικού.

Knockinζώα

In vivo σήμανση πρωτεϊνών με στόχο το φθορισμό:

In vivo βιοτινυλίωση πρωτεϊνών:In vivo biotinylation tagging of transcription factors

Biotin-TF

MSChIP-on-chip

Σε κυτταρικές σειρές:

BirA Tg

Χ

Biotin-tagged TF1

Biotin-tagged TF2


Το σύστημα CRISPR-CAS9



Όταν τα βακτήρια μολύνονται από κάποιο ιό, κάποια πρωτεϊνικά σύμπλοκα «μνήμης» του CRISPR–Casανοσοποιητικού συστήματος επιλέγουν αλληλουχίες του ιού (protospacers) και τις ενσωματώνουν σαν αλληλουχίεςστο δικό τους χρωμόσωμα. Αυτές οι αλληλουχίες ενσωματώνονται σε μια σειρά επαναλαμβανόμενων αλληλουχιώνπου λέγονται «clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)».



Την επόμενη φορά που τα βακτήρια θα μολυνθούν με το ίδιο ιικό DNA, τα μετάγραφα των spacers καθοδηγούν μια ενδονουκλεάση στο ιικό DNA που το κόβει.


PAM: protospacer adjacent motifs


Το σύστημα CRISPR-CAS9 στη γονιδιακή θεραπεία


Knockout Knockin

CRISPR-CAS9 και επιδιόρθωση γενετικών βλαβών

L8 chapter6 1 - FORTH-IMBB1. Πολυμεράση που δεν κάνει διορθωτικό...

Documents

Transcript of L8 chapter6 1 - FORTH-IMBB1. Πολυμεράση που δεν κάνει διορθωτικό...