Khảo sát dư lượng β-Agonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt gà và thịt heo...

7/26/2019 Khảo sát dư lượng β-Agonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt gà và thịt heo trên thị trường thành phố Cần T…

http://slidepdf.com/reader/full/khao-sat-du-luong-agonist-clenbuterol-va-salbutamol-trong-thit 1/69

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA SƯ PHẠM

BỘ MÔN HÓA HỌC ----------

Tên đề tài

“KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG -AGONIST (CLENBUTEROL

VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT GÀ VÀ THỊT HEO

TRÊN THỊ TRƯỜNG THÀNH PHỐ CẦN THƠ”

Luận văn Tốt nghiệp

Ngành: Sư phạm Hóa học

Giáo viên hướng dẫn:

TS . Nguyễn Thị Thu Thủy ThS . Lê Bảo Ngọc

Sinh viên thực hiện:

Lê Thị Hồng Búp Lớp : Sư phạm hóa học K35

MSSV: 2096714

Cần Thơ, 5/2013

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



LỜI CÁM ƠN

------- ------

Để có được kết quả như hôm nay em xin chân thành cảm ơn:

Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa học – Khoa Sư Phạm đã hướng

dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài luận văn.

Cô Lê Bảo Ngọc – Giám Đốc Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.

HCM chi nhánh Cần Thơ (Case Cần Thơ) đã giúp đỡ về trang thiết bị, dụng cụ

hóa chất để em hoàn thành đề tài.

Các anh, chị làm việc tại Case Cần Thơ, đặc biệt là các anh trong tổ Sắc K ý đã

nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm bổ ích trong suốt quá trình làm đề

tài.

Xin gởi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô trong bộ môn Sư phạm Hóa học –

Khoa Sư phạm đã dìu dắt và truyền đạt kiến thức quý báu cho em trong suốt thời

gian theo học ở trường.

Cảm ơn cha mẹ những người suốt đời tận tụy không quản khó khăn chăm lo cho

tương lai chúng con.

Các bạn sinh viên Hóa học K35, những người đã cùng tôi chia sẻ niềm vui, nỗi

buồn, động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như làm đề tài này.

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Hồng Búp





TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúcBỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy

2. Tên đề tài: “K hảo sát dư lượng -agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thịt gà

và thịt heo trên thị trường thành phố Cần Thơ” 3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Búp MSSV: 2096714

Lớp Sư phạm Hóa học K35

4. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét về hình thức LVTN:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của LVTN:

- Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

- Những vấn đề còn hạn chế:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................





c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung

chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có):

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

d. Kết luận, đề nghị và điểm:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày....tháng….năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

Ngyễn Thị Thu Thủy





TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: Ths. Lê Bảo Ngọc

2. Tên đề tài: “Khảo sát dư lượng -agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thịt gà

và thịt heo trên thị trường thành phố Cần Thơ” 3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Búp MSSV: 2096714

Lớp Sư phạm Hóa học K35

4. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét về hình thức LVTN:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................


- Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

- Những vấn đề còn hạn chế:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................





c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung

chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có):

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

d. Kết luận, đề nghị và điểm:

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày....tháng….năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

Lê Bảo Ngọc





TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúcBỘ MÔN HÓA HỌC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: Phan Thành Chung

2. Tên đề tài: “Khảo sát dư lượng -agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thịt gà

và thịt heo trên thị trường thành phố Cần Thơ” 3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hồng Búp. MSSV: 2096714. Lớp Sư phạm Hóa học K35

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức LVTN:

Đề tài gồm 36 trang không kể phần phụ lục và tài liệu tham khảo. Văn bản được in ấnđẹp, trang nhã bao gồm các hình ảnh minh họa và đúng qui cách.


Trong phần mở đầu, tác giả đã nêu rõ và cụ thể mục tiêu và giới hạn của đề tài,

phương pháp và phương tiện nghiên cứu.

Đề tài chọn phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) để xác định dư

lượng -agonist là loại hormon tăng trưởng và tạo nạc trong chăn nuôi gia súc, gia cầm

mà hiện nay không được phép sử dụng ở Việt Nam trên các mẫu thịt gà và thịt heo ở mộ t

số chợ địa phương ở thành phố Cần Thơ. Các kết quả phân tích cho thấy vẫn còn một số

mẫu thịt heo và gà vẫn còn lưu tồn một lượng -agonist (clenbuterol hoặc salbutamol)

mặc dù tỉ lệ không cao. Phương pháp định lượng dư lượng -agonist đã sử dụng là một

phương pháp phân tích với phương tiện hiện đại nên kết quả có thể tin cậy được. Đây là

một thông tin có giá trị đối với người tiêu dùng ở địa phương thành phố Cần Thơ trong

việc sử dụng thịt heo và thịt gà làm thực phẩm. Tuy nhiên, tác giả chưa nêu được các kết quả của các nghiên cứu trước đây về sử

dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) để xác định dư lượng của -

agonist để chứng minh rằng phương pháp này là lựa chọn thích hợp.

Nhìn chung, tác giả đã hoàn thành tốt mục tiêu của đề tài đề ra.

Cần Thơ, ngày....tháng….năm.. ….. Cán bộ phản biện

Phan Thành Chung





-i-

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................... iv

DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... v

DANH SÁCH BIỂU BẢNG ............................................................................................... vi

TÓM TẮT NỘI DUNG ..................................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI.............................................................................................. 1

2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................................... 1

3. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI .......................................................................................... 2

4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................. 2

5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ........................................................................... 2 NỘI DUNG .......................................................................................................................... 3

A. LÝ THUYẾT .................................................................................................................. 3

1. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ......................................................................... 3

1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................................... 3

1.2. Khái niệm .............................................................................................................. 3

1.3. Phân loại phương pháp sắc ký ............................................................................... 3

1.4. Các đại lượng cơ bản trong sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................................... 4

1.4.1. Thời gian lưu .......................................................................................................... 4

1.4.2. Hằng số phân bố ............................................................................................. 4

1.4.3. Hệ số dung lượng ............................................................................................ 5

1.4.4. Hiệu năng ........................................................................................................ 5

1.4.5. Độ chọn lọc ................................................................................................. 5

1.4.6. Độ phân giải R s ....................................................................................................... 6 1.5. Các bộ phận kỹ thuật của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................... 7

1.5.1. Bình chứa pha động ........................................................................................ 7

1.5.2. Bộ khử khí ...................................................................................................... 8

1.5.3. Bơm cao áp ..................................................................................................... 9

1.5.4. Bộ phận tiêm mẫu ........................................................................................... 9

1.5.5. Cột sắc ký ........................................................................................................ 9

1.5.6. Đầu dò ........................................................................................................... 10

1.5.7. Đầu dò khối phổ - Đầu dò khối phổ 3 tứ cực ............................................... 10





-ii-

1.5.8. Bộ phận ghi nhận tín hiệu ............................................................................. 14

1.5.9. In dữ liệu ....................................................................................................... 14

2. KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN (SOLID PHASE EXTRACTION: SPE) ............. 14

3. TỔNG QUAN VỀ CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL ................................... 16

3.1. Khái quát về họ β-agonist .................................................................................... 16

3.2. Giới thiệu về clenbuterol và salbutamol .............................................................. 16

3.3. Tác dụng của clenbuterol và salbutamol ............................................................. 16

3.3.1. Trong y học ................................................................................................... 16

3.3.2. Trong chăn nuôi ............................................................................................ 17

3.4. Tác hại của clenbuterol và salbutamol ................................................................ 17

3.5. Giới hạn cho phép của dư lượng clenbuterol và salbutamol ............................... 17

3.6. Những dấu hiệu nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa clenbuterol hoặc

salbutamol ................................................................................................................... 18

4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CLENBUTEROL VÀ

SALBUTAMOL ................................................................................................................ 18

4.1. Phương pháp Elisa ............................................................................................... 18

4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ............................................................. 19

4.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS ................................................. 22B. THỰC NGHIỆM ........................................................................................................... 23

1. THIẾT Bị, DỤNG CỤ.............................................................................................. 23

2. HÓA CHẤT ............................................................................................................. 24

3. CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ............................................................... 24

3.1. Yêu cầu chung ..................................................................................................... 24

3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc ............................................................................ 24

3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian .................................................................. 24

3.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc .................................................................... 25

4. CHUẨN BỊ MẪU BẰNG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN ...................................... 25

4.1. Chiết mẫu ............................................................................................................. 25

4.2. Làm sạch và làm giàu mẫu .................................................................................. 25

5. ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH LC-MS/MS ................................................................... 27

5.1. Điều kiện vận hành hệ thống sắc ký lỏng ............................................................ 275.2. Điều kiện vận hành hệ thống khối phổ ................................................................ 28





-iii-

6. KHẢO SÁT KHOẢNG TUYẾN TÍNH .................................................................. 28

6.1. Dựng đường chuẩn .............................................................................................. 28

6.2. Khảo sát khoảng tuyến tính ................................................................................. 30

7. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ ĐỘ LẶP LẠI ............................................ 30

8. KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG........................................................................................... 32

8.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 32

8.2. Thực hiện ............................................................................................................. 32

9. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ..................................................................... 32

9.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 32

9.2. Công thức ............................................................................................................ 32

9.3. Cách thực hiện ..................................................................................................... 32

10. KIỂM TRA DƯ LƯỢNG CỦA CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL TRONG

MẪU NGHIÊN CỨU. ....................................................................................................... 33

10.1. Nguyên tắc ......................................................................................................... 33

10.2. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................................ 33

10.3. Kết quả xác định dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo. . 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 35

1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 352. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 35

PHỤ LỤC ............................................................................................................................. a

PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ THIẾT BỊ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ............................................ a

PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ............................................................................................. b

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................r





-iv-

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

(Hiệ p hội các nhà phân tích hóa học chính thức)

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

(Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển)

API Atmospheric Pressure Ionization. (Ion hóa tại áp suất khí quyển)

CE Colision Energy (Năng lượ ng phân mảnh)

ESI Electrospray Ionization (Ion hóa tia điện)

HPLC High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)IE Ion Exchange (Trao đổi ion)

IP Ion Pairing (Cặ p ion)

LC/MS Liquid Chromatography Mass Spectroscopy

(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

LC-MS/MS Liquid Chromatography Tandem Mass Spectroscopy

(Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ)

LOD Limit of Detection (Giớ i hạn phát hiện)

LOQ Limit of Quantitation (Giớ i hạn định lượ ng)

MMI Multimode ionization (Ion hóa đa phương thức)

MRL Maximum Residue Limits (Giớ i hạn dư lượ ng tối đa)

MRM Multiple Reaction Monitoring

MS Mass spectroscopy (Khối phổ)

ppm Parts per million (Một phần triệu)

ppb Parts per billion (Một phần tỉ)

psi Pound per square inch

rpm Revolutions per minute

RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SPE Solid Phase Extraction (Chiết pha r ắn)

SCX Strong Cation Exchange (Cột trao đổi cation)

UV-VIS Ultraviolet- Visable (Quang phổ tử ngoại khả kiến)





-v-

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Thời gian lưu của cấu tử phân tích ......................................................................... 4

Hình 2: Mối quan hệ giữa hệ số phân giải R S và khả năng tách của hai peak ..................... 6

Hình 3: Sơ đồ hệ thống HPLC ............................................................................................. 7Hình 4: Bộ phận tiêm mẫu tự động trong hệ thống Agilent 7700x LC- ICP-MS ............... 9

Hình 5: Cột Eclipse plus C18 ............................................................................................ 10

Hình 6: Sơ đồ kỹ thuật phun ESI của máy Agilent Technologies Triple Quad 6410

LC/MS ................................................................................................................................ 11

Hình 7: Bộ tạo ion kiểu APCI ............................................................................................ 12

Hình 8: Sơ đồ cấu tạo đầu dò khối phổ ba tứ cực .............................................................. 13

Hình 9. Cột chiết pha rắn SPE ........................................................................................... 15

Hình 10. a) Thịt heo có chứa salbutamol b). Thịt heo không chứa clenbuterol và

salbutamol .......................................................................................................................... 18

Hình 11. Đường chuẩn clenbuterol .................................................................................... 29

Hình 12. Đường chuẩn salbutamol .................................................................................... 29





-vi-

DANH SÁCH BIỂU BẢNG

Bảng 1. Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng .................................................. 8

Bảng 2. Danh pháp, công thức cấu tạo, tính chất vật lí clenbuterol và salbutamol ........... 16

Bảng 3. Chế độ gradient của dung môi ............................................................................. 28Bảng 4. Dữ liệu dựng đường chuẩn clenbuterol ................................................................ 29

Bảng 5. Dữ liệu dựng đường chuẩn salbutamol ................................................................ 29

Bảng 6. Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của clenbuterol ...................................... 31

Bảng 7. Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của salbutamol ...................................... 31

Bảng 8. Thông tin về mẫu nghiên cứu ............................................................................... 31

Bảng 9. Kết quả phân tích dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo ở

một số chợ tại Thành phố Cần Thơ .................................................................................... 34

Bảng 10. Mẫu phát hiện clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo ở một số chợ tại

Thành phố Cần Thơ ........................................................................................................... 34





-vii-

TÓM TẮT NỘI DUNG

Trong giai đoạn hiện nay, vấn đề hóa chất trong thực phẩm là mối quan tâm của

rất nhiều người; đáng báo động là tình trạng lạm dụng chất kích thích tăng trưởng trong

chăn nuôi. Hóa chất sử dụng cho mục đích kích thích tăng trọng phổ biến hiện nay phải

kể đến là clenbuterol và salbutamol, đây là những hóa chất thuộc nhóm - agonist có tác

dụng làm giãn phế quản, là dược phẩm dùng để trị bệnh hen suyễn. Các nhà chăn nuôi đã

bổ sung clenbuterol hoặc salbutamol vào trong thức ăn gia súc, gia cầm nhằm kích thích

tăng trọng, tăng tỷ lệ nạc, giảm mỡ và thu được nhiều lợi nhuận. Theo nghiên cứu của các

nhà khoa học, tồn dư những chất này trong các sản phẩm thịt có những tác dụng phụ rất

nguy hại đến sức khỏe của người sử dụng như: rối loạn nhịp tim, liệt cơ, run cơ, phù nề…

Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn Việt Nam cũng đã ban hành lệnh cấm sử

dụng clenbuterol và salbutamol. Tuy nhiên, việc sử dụng bất hợp pháp hai loại hóa chất

này vẫn còn trên thị trường chăn nuôi. Đề tài: “KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG - AGONIST

(CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT GÀ VÀ THỊT HEO TRÊN THỊ

TRƯỜ NG THÀNH PHỐ CẦN THƠ” được thực hiện nhằm góp thông tin khoa học về

tình hình sử dụng chất kích thích tăng trọng trong chăn nuôi, sản xuất nhằm có thêm dữ

liệu cho việc ngăn chặn và phòng ngừa việc sử dụng tràn lan các loại hóa chất này ảnhhưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.

Các bước thực hiện:

Bước 1: Khảo sát một số yếu tố: khoảng tuyến tính, hiệu suất thu hồi, giới

hạn phát hiện, độ lặp lại của phương pháp kiểm tra dư lượng clenbuterol và

salbutamol mà đề tài thực hiện.

Bước 2: Thu mua 48 mẫu ở 8 chợ tr ên hai quận Cái Răng và Ninh Kiều,Thành Phố Cần Thơ .

Bước 3: Xử lý mẫu: mẫu sau khi đồng nhất được li trích bằng K 2HPO4, làm

sạch dịch chiết mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn.

Bước 3: Tiến hành phân tích trên máy LC/MS/MS Agilent 6410B, đầu dò

khố phổ ba tứ cực, xử lý số liệu.

Sau thời gian nghiên cứu và thực hiện, đề tài đạt được kết quả sau:

Chọn lọc các yếu tố để làm tăng độ tin cậy trong phân tích clenbuterol vàsalbutamol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ:





-viii-

Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp đã nghiên cứu: 62,7-84,2 đối

với clenbuterol và 61,3-67,3 đối với salbutamol.

Giới hạn phát hiện (LOD): 0,5 ppb; Giới hạn định lượng (LOQ): 1,5 ppb.

Tiến hành thu mua và phân tích 48 mẫu thịt gà và thịt lợn ở 8 chợ trên địa bàn

thành phố Cần Thơ đã thu được kết quả như sau:

Thịt gà có 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol với hàm lượng

2,59 ppb; 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện dư lượng salbutamol với hàm lượng

5,37 ppb.

Thịt heo có 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol với hàm

lượng 0,74 ppb; 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện salbutamol có hàm lượng 0,9

ppb. Không có mẫu nào vừa nhiễm cả clenbuterol và salbutamol.

Từ kết quả đạt được cho thấy phương pháp kiểm tra dư lượng clenbuterol và

salbutamol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ mà đề tài đã thực hiện là

đáng tin cậy. Số lượng mẫu nhiễm clenbuterol, salbutamol trong các mẫu thu mua ngẫu

nhiên ở các chợ trên địa bàn Thành phố Cần Thơ tương đối ít với dư lượng cũng không

cao nhưng nếu được tích trữ lâu dài trong cơ thể sẽ ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. Vì vậy,

người tiêu dùng nên cẩn trọng khi sử dụng những sản phẩm không rõ nguồn gốc, nên lựa

chọn thực phẩm đã được các cơ quan chức năng kiểm tra, đảm bảo an toàn, vệ sinh thực

phẩm.





-1-

MỞ ĐẦU

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp hiện nay, chăn nuôi là ngành giữ vị trí và vai

trò quan trọng. Để vật nuôi mau lớn, các nhà chăn nuôi đã áp dụng nhiều phương thứckhác nhau. Trong những năm gần đây, tình trạng lạm dụng chất kích thích tăng trưởng

trong chăn nuôi khá phổ biến, điển hình là clenbuterol và salbutamol. Đây là những hóa

chất thuộc nhóm -agonist. Trong y học, chúng có tác dụng làm giãn phế quản, là dược

phẩm dùng để trị bệnh hen suyễn. Trong chăn nuôi, một bộ phận người dân trộn một

trong hai chất này vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm kích thích tăng trọng, tăng tỷ lệ

nạc, giảm mỡ và thu được nhiều lợi nhuận. Tuy nhiên, việc ăn phải những thực phẩm có

tồn dư clenbuterol và salbutamol gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng như: rối

loạn nhịp tim, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng, run cơ, phù nề…

Ngày 20 tháng 06 năm 2002 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam đã ban

hành danh mục 18 kháng sinh, hóa chất cấm trong chăn nuôi (quyết định số 54/2002/QĐ-

BNN) trong đó có clenbuterol và salbutamol. Thế nhưng việc sử dụng bất hợp pháp các

loại hóa chất này vẫn còn trên thị trường chăn nuôi ở Việt Nam. Vấn đề nghiên cứu và áp

dụng các phương pháp tiên tiến để phân tích xác định, đánh giá dư lượng chất kích thíchtăng trưởng nói chung và clenbuterol, salbutamol nói riêng là rất cần thiết.

Đề tài: “KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG -AGONIST (CLENBUTEROL VÀ

SALBUTAMOL) TRONG THỊT GÀ VÀ THỊT HEO TRÊN THỊ TRƯỜNG THÀNH

PHỐ CẦN THƠ” được thực hiện nhằm góp thông tin khoa học về tình hình sử dụng chất

kích thích tăng trọng trong chăn nuôi, sản xuất.

2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Khảo sát các yếu tố về hiệu suất thu hồi, giới hạn phát hiện để làm tăng độ tin cậy

của phương pháp kiểm tra dư lượng clenbuterol và salbutamol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng

ghép khối phổ mà đề tài đã thực hiện.

Kiểm tra dư lượng clenbuterol và salbutamol trong một số mẫu thịt gà, thịt heo ở

một số chợ trên thị trường Thành phố Cần Thơ. Đồng thời, giúp người tiêu dùng biết

được tác hại của các sản phẩm được chế biến từ thịt gà, thịt heo có chứa clenbuterol và

salbutamol.



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C4%90au_tim&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C4%83ng_huy%E1%BA%BFt_%C3%A1p


http://vatgia.com/hoidap/quicksearch.php?keyword=Vi%E1%BB%87t+Nam







-2-

3. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI

Xác định dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo trên thị trường

Thành Phố Cần Thơ (quận Ninh Kiều và Cái Răng) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối

phổ với các yếu tố chọn lọc từ phòng thí nghiệm.

Thời gian khảo sát: Tháng 08/2012 đến tháng 2/2013.

4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Điều tra: thu mẫu ngẫu nhiên trên thị trường Thành phố Cần Thơ .

Tổng kết kinh nghiêm: đọc tham khảo tài liệu từ các nghiên cứu trước.

Thực nghiệm trong phòng thí nghiệm: sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép

khối phổ với kỹ thuật chiết pha rắn.

5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

- Giai đoạn 1: Nhận đề tài, tìm tài liệu có liên quan đến đề tài, viết đề cương,

hoạch định cho quá trình thực hiện đề tài (5-8/2012).

- Giai đoạn 2: Thực hiện đề tài (8/2012-2/2013). Các bước tiến hành:

Bước 1: Khảo sát một số thông số khi phân tích bằng LC-MS/MS theo

phương pháp đã chọn.

Bước 2: Thu mua mẫu ở một số chợ trên địa bàn Thành Phố Cần Thơ.

Bước 3: Xử lý mẫu: mẫu sau khi đồng nhất được li trích bằng K 2HPO4, làm

sạch dịch chiết mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn.

Bước 4: Tiến hành phân tích trên máy LC-MS/MS Agilent 6410B, đầu dò

khố phổ ba tứ cực.

- Giai đoạn 3: Thu thập kết quả, xử lý số liệu, viết bài, báo cáo (3-5/2013)





-3-

NỘI DUNG

A. LÝ THUYẾT

1. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.1. Lịch sử phát hiện[4]

Để khắc phục các khó khăn khi phân tích mẫu bằng sắc ký khí, đáp ứng nhu cầu

bức thiết trong cuộc sống, kỹ thuật sắc ký lỏng được phát triển, hoàn thiện để có kỹ thuật

sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Năm

1967, Harvath C là người đầu tiên đã phát minh máy HPLC nghiên cứu về nucleotid.

Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc ký

nhanh…HPLC được áp dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu. Hợp chất có thể phân tích bằng HPLC như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc

kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ…

1.2. Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất

lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc

một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên

kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .

1.3. Phân loại phương pháp sắc ký

Trong HPLC, tùy bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách mà ng-

ườ i ta chia thành:

Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC).

Sắc ký hấp phụ: sắc ký pha thường (Normal phase: NP-HPLC) và pha ng-

ược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC).

Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC).

Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC).

Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi nhất vì có thể phân tích được

những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có

khối lượng phân tử không quá lớn (<3000 đvC).

Trong sắc ký pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung

môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử

lượng không lớn lắm.





-4-

Sắc ký pha đảo ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha

động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không

phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó nước

đóng vai trò quan trọng do đó sắc ký pha đảo được sử dụng nhiều nhất.

1.4. Các đại lượng cơ bản trong sắc k ý lỏng hiệu năng cao[1], [3], [4], [7]

1 .4.1. Thời gian lưu

- tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra khỏi cột ở điểm có

nồng độ cực đại.

- tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng

là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.

- tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.

- tR' = tR - tO

Hình 1: Thời gian lưu của cấu tử phân tích

1.4.2. H ằng số phân bố

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trìnhnhư sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân

bố và được tính như sau: M

S

C

C K

Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh, CM: nồng độ cấu tử trong pha động.

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích. K nhỏ chất

di chuyển nhanh, K lớn chất di chuyển chậm. Thông thường K ≥ 1 để chất có ái lực với

X pha tĩnh X pha động





-5-

pha tĩnh nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách. Hai chất muốn tách

ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau.

1.4.3. Hệ số dung lượng

Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột người ta sử dụng một hệ số

quan trọng gọi là hệ số dung lượng k’: M

S

M M

S S

V

V K

V C

V C k .

.

.'

VS: thể tích pha tĩnh, VM: thể tích pha động

k’ có thể tính theo công thức:O

O R

t

t t k

'

k’ phải lớn hơn 1 để peak của chất tan tách khỏi peak của dung môi nhưng không

quá lớn vì lúc đó thời gian phân tích sẽ kéo dài và mũi bị tù do chất ở trong cột quá lâu.

Khoảng k’ lý tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp chúng ta có

thể chấp nhận k’ trong khoảng từ 0,5-20.

1.4 .4. Hiệu năng

Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả năng tách mũi sắc ký của cấu tử trên

cột. Độ hiệu năng N được biểu diễn như số đĩa lí thuyết của cột. N càng lớn hiệu năng

tách của cột càng lớn.

2

2

1

2

55,5.16

W

t

W

t

H

L N R R

Vớ i W: bề r ộng mũi sắc ký

W1/2: bề r ộng của mũi ở phân nửa chiều cao.

Số đĩa lý thuyết càng lớ n, bề r ộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn.

1.4.5. Độ chọn l ọc

'

'

A

B

A

B

K

K

K

K

1

2

1

2

'

'

1

2

R

R

O R

O R

t

t

t t

t t

K

K

Độ chọn lọc là một thông số r ất quan trọng, liên quan tớ i khả năng tách của các

cấu tử cần phân tích, nó tùy thuộc bản chất của pha t ĩ nh, pha động.

Hai chất tách đượ c khi # 1 và càng lớ n, khả năng tách càng cao.





-6-

Có nhiều yếu tố ảnh hưở ng đến độ chọn lọc như thành phần dung môi pha động,

pH của môi tr ườ ng, bản chất của pha t ĩ nh, nhiệt độ. Trong đó, sự thay đổi pha động

từ dung môi này sang dung môi khác sẽ làm thay đổi đáng k ể.

1 .4.6. Độ phân gi ải Rs

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên cùng một

điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được xác định theo công

thức:

B A

RA RB AB

W W

t t R

''

.2

Trong đó: t’RA và t’RB là thời gian lưu thật của hai chất A và B; còn WA và WB là

chiều rộng đáy của peak sắc ký của hai chất A và B. Để có thể phân tích một cách định lượ ng thì 2 mũi k ề nhau phải tách hẳn nhau,

tức R S 1,3. Khi R S 1 cần phải thay các thông số thực nghiệm để làm tăng R S.

Hình 2: Mối quan hệ giữa hệ số phân giải R S và khả năng tách của hai peak





-7-

1.5. Các bộ phận kỹ thuật của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao[1], [3], [4], [12]

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:

Hình 3: Sơ đồ hệ thống HPLC

Trong đó:

1: Bình chứa pha động.

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu

5: Cột sắc ký (pha tĩnh)

6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển

hệ thống.

8: In dữ liệu.

Nguyên lý hoạt động: mẫu sau khi đượ c tiêm vào cột sẽ đượ c pha động lôi kéo

qua cột. Dựa vào khả năng tươ ng tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu vớ i pha

t ĩ nh và pha động mà chúng đượ c tách ra k hỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ đượ c ghi

nhận bở i đầu dò cụ thể. Máy tính xử lý dữ liệu và cho kết quả.

1 .5.1. Bình chứa pha động

Pha động có thể theo chương trình gradient dòng hoặc đẳng dòng, nhưng pha động

cố định thường mất thời gian lâu và khó tách các mũi. Hiện nay thường dùng nhất là dạnggradient.

Đầu dò

Cột Bơm Bộ khửkhí

Tiêm mẫu





-8-

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta

sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ

lệ của 4 đường là 100%.

Tuy nhiên, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2

hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất và đơn giản hơn, giúp ổn

định quá trình rửa giải.

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

Hòa tan mẫu phân tích.

Phù hợp với đầu dò.

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive

index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ

rửa giải (eluent strength)…Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả

năng phân tách của các mũi sắc ký.

Bảng 1. Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng

Dung môi

Độ phân

cực,

Độ r ửa giải,

Độ nhớ t,

(25oC), cP

Chỉ số khúc

xạ, (25oC)

Nhiệt độ

sôi, oC

Tetrahydrofuran 4 0,57 0,46 1,405 66

Methanol 5,1 0,95 0,54 1,326 65

Acetonitrile 5,8 0,65 0,34 1,341 82

Etylenglycol 6,9 1,11 16,5 1,431 182

Nướ c 10,2 Lớ n 0,89 1,333 100

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng

cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất

tinh khiết dùng cho phân tích.

Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,

tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích .

1 .5.2. Bộ khử khí

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:





-9-

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của

peak thay đổi.

Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì

bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và

hoạt động của cả hệ thống HPLC.

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.

1 .5.3. Bơm cao áp

Vai trò: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định ngay

cả khi thành phần pha động thay đổi.

Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 250-600 bar và tạo dòng liên tục. Áp lực

bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ nhớt pha động, kích thước pha tĩnh. Lưu

lượng bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút. Bơm được cấu tạo bằng chất liệu chịu đựng được dung

môi hữu cơ và các dung dịch đệm.

1 .5.4. Bộ phận tiêm mẫu

Vai trò: đưa mẫu vào cột phân tích với thể tích bơm có thể thay đổi. Tuy nhiên, thể

tích cho vào phải đều, độ lặp lại phải cao. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ

công (tiêm mẫu bằng tay) và tiêm mẫu tự động.

Hình 4: Bộ phận tiêm mẫu tự động trong hệ thống Agilent 7700x LC- ICP-MS

1.5.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Cột chứa pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ

5-25 cm đường kính trong 1-10 mm, hạt nhồi cỡ 0,3-5µm… Các loại cột thường dùng

trong HPLC: cột pha thường, cột pha tạo nối, cột pha đảo, cột trao đổi ion, cột sắc ký

gel…

Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký. Thông thường chất nhồi cột làsilicagel (pha thuận) hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu





-10-

cơ (pha đảo). Ngoài ra, người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxit, polyme xốp,

chất trao đổi ion.

Hình 5: Cột Eclipse plus C18

1.5.6. Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trênsắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo, tính chất của các chất phân tích mà

người ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng

độ nhất định của chất phân tích.

Một số loại đầu dò:

- Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360 nm để phát hiện UV.

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các

chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dò thông dụng nhất.

- Đầu dò huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và

các dẫn xuất có huỳnh quang.

- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các

chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.

- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng trong đo các loại đường.

- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.

- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…

- Đầu dò ampe kế (Amperometric detector).

- Đầu dò khối phổ. Hiện nay, có bốn kiểu đầu dò chính đang được sử dụng: Đầu

dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT), đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép

biến đổi Fourier, đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of -Flight, TOF), đầu dò khối phổ

tứ cực (Quadrupole).

1 .5.7. Đầu dò khối phổ - Đầu dò khối phổ 3 tứ cực[1], [3], [13]

Hiện nay, đầu dò k hối phổ đượ c ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợ p





-11-

chất nhận danh chính xác.

Các bộ phận chính của đầu dò khối phổ: bộ tạo ion (ionizer), bộ tách khối (mas

analyser), bộ dò ion(detector).

1.5.7.1. Bộ tạo ion

Với hệ thống sắc ký lỏng MS - ba tứ cực của Agilent có 4 nguồn tạo ion đó là:

ESI, APCI, APPI, MMI. Trong nội dung của bài này, chúng tôi chỉ đề cập đến hai kỹ

thuật APCI và ESI. Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng

nhiều hơn cả.

Kỹ thuật phun ESI

ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt,

phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích

(dương hoặc âm tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn

APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide…

hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol.

Trong ESI, các ion được hình thành như sau: các phân tử hóa chất và dung môi khi

ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế (3-5kV) sau đó

được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra chung quanh ống mao quản . Dưới tác dụng của

điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống maoquản. Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và

do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, sẽ bể dần ra thành các hạt nhỏ mang điện

tích. Sau đó, các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận phân tích ion qua

một cửa rất nhỏ. Dung môi và khí nitơ bị bơm chân không hút ra ngoài.

Hình 6: Sơ đồ kỹ thuật phun ESI của máy Agilent Technologies 6410 Triple QuadLC/MS

Dòng khí nitơ

IonỐng phun sương

Hạtsươngmangđiệntích

Bộ gạn lọc





-12-

Kỹ thuật APCI

APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ

phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.

Trong APCI, ion được hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan

trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt

nóng. Khi ra khỏi ống nhờ khí nitơ , dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của

nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một

vùng có áp suất khí quyển. Nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ điện cực phóng

điện, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (M + H) + và trao đổi electron

hoặc proton để biến thành ion âm (M – H)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ tách khối.

Hình 7: Bộ tạo ion kiểu APCI

1.5.7.2. Bộ tách khối

Hiện nay có 3 kỹ thuật tách có thể thực hiện MS/MS: kỹ thuật bẫy ion, kỹ thuật ba

tứ cực, kỹ thuật khối phổ thời gian bay (TOF). Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng thiết

bị có kỹ thuật ba tứ cực.

Sau khi diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu APCI (ion hóa hóa học

tại áp suất khí quyển) hoặc ESI (ion hóa tia điện)... Ion sinh ra được tập trung và gia tốc

bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ tách khối. Tại đây các ion được tách ra cô lập thành

một loại ion nhất định. Phân mảnh ion cô lập, MS thứ hai sẽ phân tách những ion này.

Những ion mong muốn sẽ chuyển đến đầu dò và chuyển thành tín hiệu.

Trong đó, hệ quang học ion (ion optics) là một bát cực (octopole) gồm tám thanh

hình trục xếp song song có tác dụng như bộ lọc khối để đưa ion vào tứ cực thứ nhất (Q1).

Ngoài ra còn có 2 thấu kính nằm trước và sau buồng va đập để hỗ trợ đưa ion vào buồngva đập và tứ cực thứ 3 (Q3). Bộ tách khối (mass analyzer) gồm một buồng va chạm





-13-

(collision cell, được xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3). Đầu dò

phát hiện ion (Dual Dynode Detector) gồm có 2 dynode đặt vuông góc với dòng các ion

và phân tử trung tính đi ra khỏi bộ tách khối.

Hình 8: Sơ đồ cấu tạo đầu dò khối phổ ba tứ cực

Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ ba tứ cực

+ Full Scan

Khi thao tác với chế độ full scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho

khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để

nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ

ba tứ cực, chế độ full scan thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.

+ Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng

cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước

đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với đầu

dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân

mảnh khi đã biết ion mẹ.

+ Product ion: với kỹ thuật này các ion sẽ qua tứ cực thứ nhất để chọn ion của chất

cần phân tích (thường là ion mẹ) rồi đi qua tứ cực thứ hai. Tại tứ cực thứ hai, ion mẹ sẽ

đập thành nhiều ion con. Các ion này sẽ tiến thẳng đến đầu dò. Đầu dò sẽ cung cấp toàn

bộ mảnh phổ của ion ban đầu.

+ SRM (Selected Reaction Monitoring): cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ

nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được cácion con. Tại tứ cực thứ 3, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát





-14-

hiện.

+ MRM (Multiple Reaction Monitoring): trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật

đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ

thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Kỹ thuật này tương tự SRM nhưng ở tứ cực

thứ 3, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.

1.5.8. Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi

nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ

số phân giải… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích.

1.5.9. I n d ữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có

cài phần mềm điều khiển.

2. KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN (SOLID PHASE EXTRACTION: SPE)

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch

mẫu phân tích từ dung dịch, bằng cách cho chất cần phân tích hấp phụ lên một cột pha

rắn sau đó chất phân tích sẽ được rửa giải bằng dung môi thích hợp. Cơ chế của quá trình

lưu giữ bao gồm phân bố pha đảo, pha thường và trao đổi ion.

Ưu điểm của phương pháp SPE là khả năng làm giàu mẫu cao, giúp loại bỏ ảnh

hưởng của các chất gây nhiễu, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian và giảm lượng dung môi

sử dụng so với phương pháp chiết lỏng- lỏng.

Cột SPE có nhiều dạng nhưng loại thường sử dụng là những cột nhỏ có dạng thân

ống tiêm, bên trong nhồi các pha tĩnh. Pha tĩnh nhồi vào cột chiếm bề dày cột khoảng

0,5- 2 cm, lượng sử dụng từ 100 mg đến 1 g, trong một số trường hợp có thể lên đến vàigram. Trong cột có 2 đĩa thuỷ tinh xốp giúp giữ chất tách không cho rơi theo dung môi để

giữ cho cột ổn định. Cột SPE có 3 loại:

Loại chứa các pha tĩnh như C18, C8, C4, C2, cyclophenyl...là silic ghép các

nhánh không phân cực dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.

Loại chứa các chất tách như silica, florisil, amino alumina,. .. có ghép các

nhóm như – OH, -NH2, -CN dùng chủ yếu để tách các chất tương đối phân cực.

Phần lớn được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột ghép – CN

có thể sử dụng trong pha đảo).





-15-

Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột

SCX tách cation).

Hình 9. Cột chiết pha rắn

Các bước tiến hành trong kỹ thuật chiết pha rắn.

Bước 1: Hoạt hóa cột

Mục đích: chuẩn bị cột đạt điều kiện tương hợp với dung dịch sắp đưa vào cột.

Nếu không hoạt hóa cột chất cần phân tích khó tương tác với cột. Hoạt hóa cột còn loại

trừ các chất bẩn có thể có trong cột trước khi sử dụng. Dung môi sử dụng tùy thuộc bề

mặt của cột.

Bước 2: Nạp dung dịch mẫu vào cột Cho mẫu từ từ qua cột. Vận tốc rút tùy thuộc qui trình phân tích khoảng vài

ml/phút.

Bước 3: Rửa cột

Dùng một lượng dung môi thích hợp để rửa những chất gây ảnh hưởng đến quá

trình phân tích ra khỏi cột.

Bước 4: Rửa giải chất cần phân tích

Dùng dung môi rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột. Dung môi không tương tác

quá mạnh với chất cần phân tích vì những chất có bản chất tương tự sẽ được rửa giải

cùng thời gian. Ngược lại, dung môi tương tác quá yếu thì dẫn đến hao phí dung môi,

thời gian thực hiện lâu và nồng độ dung dịch bị pha loãng.

Bước 5: Làm giàu chất phân tích

Dung dịch mẫu sau khi làm sạch bằng cột SPE thường được thổi khô bằng khí nitơ

hoặc dùng máy cô quay chân không để đuổi sạch dung môi. Cặn còn lại được hòa tan

chính xác bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp trước khi đưa vào máy phân tích.





-16-

3. TỔNG QUAN VỀ CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL

3.1. Khái quát về họ β-agonist

Họ β-agonist hay còn được gọi là chất tăng trọng, chất tạo nạc là một loại hooc

môn kích thích tăng trưởng.

Họ β-agonist gồm 2 nhóm. Nhóm β1-agonist, gồm các chất có tác dụng kích thích

tim được dùng để điều trị sốc tim, suy tim cấp tính như: dobutamine, isoproterenol,

xamoterol, epinephrine. Nhóm β2-agonist, gồm các chất làm giãn cơ, được dùng để điều

trị hen suyễn, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính như: salbutanol (albuterol), clenbuterol,

isoproterenol, terbutaline, fenoterol, cinaterol, ractopamine…Trong những chất kể trên

thì salbutamol, clenbuterol và ractopamine là ba chất đứng đầu trong danh mục 18 chất

kháng sinh, hóa chất bị cấm sử dụng trong chăn nuôi. [16]

3.2. Giới thiệu về clenbuterol và salbutamol

Bảng 2. Danh pháp, công thức cấu tạo, tính chất vật lí của clenbuterol và

salbutamol

Clenbuterol Salbutamol

Tên gọi 1-(4-amino-3,5-dichlorophenyl)

-2-(tert-butylamino)ethanol

4-[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]

-2-(hydroxymethyl)phenol

CTPT C12H18Cl2ON2 (276,0796 đvC) C13H21O3 N (239,15 đvC)

CTCT

Tính chất vật lí

Điểm nóng chảy: 174-175,5oC

Chất bột màu trắng, tan trong

H2O, C2H5OH, CH3OH, CHCl3,

không tan trong benzen.

Điểm nóng chảy: 157-158oC

Chất bột màu trắng, tan trong H2O,

C2H5OH, CH3OH, tan ít trong CHCl3,

không tan trong benzen.

3.3. Tác dụng của clenbuterol và salbutamol[17]

3 .3.1. Trong y học

Salbutamol được hấp thụ dễ dàng qua đường tiêu hóa, là loại thuốc được sử dụngnhiều tr ong k hoa hô hấp như: cắt cơn hen, giãn phế quản, giãn cơ trơn, viêm phế quản



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ho%C3%B3c_m%C3%B4n&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Dobutamine&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Isoproterenol&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Xamoterol&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/Epinephrine

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=File:Salbutamol.svg&page=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=File:Clenbuterol_skeletal.svg&page=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/Epinephrine

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Xamoterol&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Isoproterenol&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Dobutamine&action=edit&redlink=1





-17-

mãn tính. Trong sản khoa, thuốc sử dụng với chỉ định trong chuyển dạ sớm khi không có

biến chứng và xảy ra ở tuần thứ 24-33 của thai kỳ, làm chậm thời gian sinh, có tác dụng

đối với sự phát triển của phôi thai nhi. Trên thị trường, các thuốc có hoạt chất sabultamol

có rất nhiều dạng bào chế như viên nén, thuốc tiêm, thuốc đặt trực tràng, hậu môn, thuốc

hít…

Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, điều trị hen và sử dụng ở bệnh nhân

có bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, khi dùng cho người chúng có tên biệt dược broncodil,

clenbutol, ventolax, protovent... Tuy nhiên, clenbuterol có thể gây tổn hại đến hệ thần

kinh và tuần hoàn của con người.

3 .3.2. Trong chăn nuôi

Clenbuterol và salbutamol điều tiết sinh trưởng động vật, thúc đẩy quá trình phát

triển cơ bắp, nở mông, nở vai làm tăng lượng thịt nạc và đẩy nhanh việc phân giải mỡ,

giảm tối đa lượng mỡ hình thành nhằm tạo ra vật nuôi siêu nạc, mau lớn nhưng dùng quá

liều sẽ khiến cơ thể vật nuôi mang bệnh và có thể dẫn đến tử vong.

3.4. Tác hại của clenbuterol và salbutamol[15],[17]

Clenbuterol và salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức

khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng như rối

loạn nhịp tim, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng, run cơ , phù nề, có thể gây nhược cơ, làm giảm vận động của cơ, khớ p, khiến cơ thể phát triển không bình

thườ ng…

3.5. Giới hạn cho phép của dư lượng clenbuterol và salbutamol

Châu Âu: MRL clenbuterol 0,1 ppb (thịt) và 0,5 ppb (gan).

Codex Alimentarius: MRL clenbuterol 0,2 ppb (thịt) và 0,6 ppb (gan).

Việt nam, -agonist tuyệt đối bị cấm sử dụng trong thức ăn chăn nuôi và do đókhông đượ c có trong thịt gia súc, gia cầm.



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=C%C6%A1_b%E1%BA%AFp&action=edit&redlink=1



http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%8Bt













-18-

3.6. Nhữ ng dấu hiệu nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứ a clenbuterol hoặc

salbutamol

a) b)

Hình 10. a) Thịt heo có chứa salbutamol

b). Thịt heo không chứa clenbuterol và sal butamol

Thịt có màu đỏ au giống thịt bò, phần nạc chiếm tỷ lệ lớn, lớp mỡ mỏng, đôi khi

dính sát vào da, thịt không đàn hồi, mặt cắt trên thớ thịt không được mịn. Theo các

chuyên gia, thịt có chứa clenbuterol hoặc salbutamol có lượng nước nhiều hơn nên khi

đun chính sẽ teo và tách ra nhiều nước, có độ săn chắc kém, thịt không đậm đà và ít có

hương vị thơm tự nhiên như vật nuôi theo phương pháp truyền thống. Vì vậy, để đảm bảo

sức khỏe người tiêu dùng nên mua thịt gia súc, gia cầm có dấu kiểm dịch thú y vì thực

phẩm này đã được cơ quan chức năng kiểm tra, đảm bảo an toàn thực phẩm.

4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CLENBUTEROL

VÀ SALBUTAMOL

4.1. Phương pháp Elisa[2], [14]

Phương pháp ELISA (ENZYM–LINK IMUNOSORRBENT ASSAY) đã được sử

dụng rộng rãi để xác định các chất dư lượng thuốc trừ sâu, độc tố nấm mốc(Skeritt,1998). Nguyên lý của phương pháp ELISA xác định clenbuterol và salbutamol là

dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng thể - kháng nguyên.

Kháng nguyên được cố định trên bề mặt của giếng phân tích. Kháng nguyên tự do

(chất cần phân tích) và kháng nguyên cố định sẽ cạnh tranh để bám vào kháng thể. Lượng

kháng nguyên tự do càng nhiều thì lượng kháng thể bị kháng nguyên cố định giữ lại càng

ít. Sau khi rửa trôi các chất còn dư, dùng một lượng kháng thể thứ 2 có đánh dấu enzyme

để phát hiện lượng kháng thể ban đầu bị giữ lại. Bằng phản ứng tạo màu và phép đo

cường độ màu tại bước sóng 450 nm và cường độ màu này tỷ lệ nghịch với nồng độ chất





-19-

cần phân tích. Từ đó suy ra, lượng kháng nguyên tự do (chất cần phân tích) là bao nhiêu.

4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ[6], [8], [9], [10].

Xác định β2-agonist trong thịt heo, sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với sắc ký lỏng

ghép khối phổ.

Phương pháp này xác định đồng thời dư lượng của bốn β2-agonist: terbutaline,

salbutamol, clenbuterol và formoterol trong thịt heo. Các chất phân tích được tinh chế

bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) và định lượng bằng sắc ký

lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-ESI-MS/MS). Phương pháp này cung cấp giới hạn phát

hiện (LOD) nhỏ hơn ng/g. Các phạm vi hiệu chuẩn cho các hợp chất này thu được từ 0,25

đến 5 ng/g. Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 78 đến 101% với giá trị RSD giữa 1,8 và

7,2%.Thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 1200.

Hệ thống sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ đầu dò 3 tứ cực (Agilent 6460

Triple quad LC-MS/MS).

Cột Agilent SamliQ SCX Polymer, 50 x 3 mL, 60 mg (p/n: 5982-3236).

Cột C18 Agilent ZORBAX Eclipse, 50 x 2,1 mm, 1,8 mm (p/n: 959,741-906).

Hệ thống hút chân không Manifold (p/n: 5982-9120)





-20-

Chuẩn bị mẫu bằng kỹ thuật chiết lỏng lỏng

Kỹ thuật chiết pha rắn Hoạt hóa cột SPE với 3 ml methanol và sau đó cân bằng với 3 ml nước. Cho qua

Ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút

Lấy lớp trên cho vào ống ly tâm khác

Cân 2 g thịt heo (± 0,01 g) cho vào ống mũ 15 ml

Thêm vào 8 ml sodium acetate 0,2 M (pH = 5,2) vortex, thêm tiếp

100 μl β-glucuronidase, vortex trong 2 phút

Thêm 5 ml axit percloric 0,1 M pH = 1 (± 0,3)

Thủy phân ở 37°C trong 16 giờ Lắc trong 15 phút


Lấy 4 ml ở lớp trên cho vào ống ly tâm

Điều chỉnh pH đến 11 bằng sodium hydroxide 10 M.

Thêm vào 10 ml dung dịch natri clorua bão hòa isopropanol-ethyl

acetate (60:40)

Thổi khô bằng khí nitơ ở 40oC, hòa tan lại mẫu trong 5 ml sodium

acetate 0,2M (pH = 5,2)

Lắc trong 5 phút

Ly tâm ở 4000 rpm trong 5 phút,lấy lớp trên cho vào ống ly tâm khác,

lặp lại bước trên.

Xay mẫu bằng máy xay sinh tố





-21-

cột 5 ml dung dịch mẫu. Sau đó rửa cột bằng 2 ml nước và 2 ml acid formic trong nướ c

2%. Toàn bộ nước thải được loại bỏ. Hút chân không trong 3 phút cho đến khô cột. Cuối

cùng rửa giải với 5 ml dung dịch amoniac 5% trong methanol.

Sau đó thổi khô bằng khí nitơ ở 40°C. Mẫu được hòa tan lại bằng 1 ml acid formic

0,1% trong H2O/Acetonitrile (90:10), sau đó vortex và đánh siêu âm, cho vào ống 1,5 ml

và ly tâm ở 3000 rpm trong 5 phút. Cuối cùng cho vào vial 2 ml để phân tích.

Điều kiện HPLC

Cột: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2,1 mm x 50 mm; 1,8 mm (p/n:

959.741-906).

Tốc độ dòng: 0,4 ml/min, cột nhiệt độ: 40°C.

Pha động: nước (0,1% acid formic 2 mM CH3COONH4, A), acetonitrile (0,1%

acid formic, B).

Nồng độ:

Điều kiện vận hành hệ thống khối phổ

- Nguồn tạo ion: ESI+ 4000V

- Áp suất dòng khí nitơ cho hệ phun sương (Nebulizer): 45psi

- Thế áp vào ống mao quản (Capillary): 4000V

- Nhiệt độ dòng khí (Gas temp): 325oC- Tốc độ dòng khí (Gas flow): 5 l/min

- Chọn chế độ quét phổ MRM

Ion định lượ ng Ion định tính

Terbutaline 226,1→152,1 226,1→125

Salbutamol 240,1→148,1 240,1→222,1

Clenbuterol 277→203 277 →259,1

Formoterol 345,1→149,1 345,1→327,1

Thời gian (phút) A (%) B (%)

0 90 10

0,5 90 10

1,8 20 80

2 90 10

3,5 90 10





-22-

Sắc ký đồ terbutaline, salbutamol, clenbuterol, formoterol xem phụ lục 2.1

4.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS[11]

Xác định hàm lượng salbutamol và clenbuterol trong nước tiểu động vật bằng kỹ

thuật sắc ký khí ghép khối phổ. Phương pháp này đã được xác nhận theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và

2002/657/EC. Hiệu suất thu hồi 68,8 % đối với clenbuterol và 69,6 % đối với salbutamol.

Qui trình xử lý mẫu: Mẫu được pha loãng với 10 ml dung dịch đệm phosphate (pH

= 7) và ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút tại nhiệt độ phòng. Toàn bộ dung dịch mẫu được

làm sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE).

Hoạt hóa cột SPE NARC-2 bằng 2 ml methanol, 2 ml nước và cuối cùng với 2 ml

đệm phosphate. Cho dung dịch mẫu qua cột, rửa cột với 1 ml dung dịch acid axetic, 6 ml

methanol và hút chân không trong 5 phút, sau đó rửa giải bằng 5 ml acetate acetyl với

amoniac (4%). Dung dịch mẫu được thổi khô bằng khí nitơ ở 45°C. Mẫu được hòa tan lại

trong 300 μl methanol và lắc mạnh. Sau đó, dung dịch được cho vào vial tạo dẫn xuất và

thổi khô bằng khí nitơ. Thêm vào vial 20 μl BSTFA (N,O-bis (trimetylsilyl

trifluoroacetamide)), chứa 1% TMCS (trimethylchlorosilane) và đun nóng ở 65°C trong

1,5 giờ . Cuối cùng, cho vào vial 2 ml để phân tích bằng GC-MS.

Điều kiện sắc ký

Hệ thống Trace GC 2000 (Thermo Quest). Khí mang: heli. Quá trình tách sắc ký

được thực hiện trong cột mao quản DB-1MS, 30 m x 0,25mm; 0,25 μm (J & W

Scientific). Sự trích và chuyển mẫu được lưu giữ tại nhiệt độ 250°C và 280°C. Lò sắc ký

khí đã được lập trình ở nhiệt độ từ 70 đến 200°C ở tỷ lệ 18°C/ phút và sau đó đến 250°C ở

5°C/phút và cuối cùng đến 300°C ở 20°C/phút và giữ trong 8 phút.

Các thiết bị sắc ký khí với đầu dò Finnigan Polaris MS (Thermo Quest), hoạt độngtrong chế độ MS/MS tại m/z: 262 và ion tại m/z: 188, 225, 227 cho clenbuterol, và hoạt

động trong chế độ ion đơn (SIM) với các ion lựa chọn tại m/z: 369, 350, 294, 207, 86 cho

salbutamol. Sắc ký đồ xem phụ lục 2.2.





-23-

B. THỰC NGHIỆM

1. THIẾT Bị, DỤNG CỤ

Hệ thống máy LC-MS/MS:

Đầu dò Triple Quad LC-MS/MS 6410B. Cột XDB - C18; 4,6 x 50 mm, kích thước hạt 2,1 m và cột bảo vệ (Mer ck)

Bơm gradient Binary pump SL

Bộ tiêm mẫu tự động Hip – ALS.

Hệ điều nhiệt TCC-SL

Cột chiết pha rắn Strata SCX (200 mg, dung tích 6 ml)

Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc.

Máy lắc ngang stuart.

Máy ly tâm GmpH Z36 HK.

Máy vortex Velp scientifica.

Máy xay mẫu Philips 600W.

Tủ sấy Memmert

Bể đánh siêu âm có gia nhiệt Elma S100H.

Máy đo pH HANMA HI 250. Hệ thống hút chân không

Cân phân tích gram, chính xác tới 0,0001 g.

Màng lọc PTFE (polytetrafluoroethylene), 13 mm, 045 µm.

Micropipet loại 20-200 µl và 100-1000 µl.

Ống nhựa 50 ml chịu được dung môi.

Bình định mức dung tích 10 ml

Pipet, dung tích 2 ml, 5 ml,10 ml, chia vạch đến 0,1 ml.

Micropipet, dung tích từ 50 l đến 200 l và từ 200 l đến 1000 l.

Hệ thống thổi khô bằng khí nitơ

Giấy lọc Ø = 10 cm.

Các dụng cụ thủy tinh khác: ống đong, cốc có mỏ, ống ly tâm...





-24-

2. HÓA CHẤT

K 2HPO4, NH4OH đậm đặc.

Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck – Đức.

Nước cất 2 lần không ion.

Chuẩn salbutamol, clenbuterol hydrochloride của hãng Fluka.

Khí nitơ.

3. CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN

3.1. Yêu cầu chung

Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực hiện trong ngày. Nếu không phân tích

được trong ngày thì phải bảo quản dịch mẫu ở -200C.

3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc

Chuẩn Co salbuatamol (100 ppm): cân chính xác 1,01 mg salbutamol cho vào bình

định mức dung tích 10ml, thêm metanol đến vạch, lắc đều. (Hàm lượng tinh khiết của

chuẩn gốc là 99%). Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -20oC, bền trong một năm.

Chuẩn Co clenbuterol (100 ppm): cân chính xác 1,143 mg clenbuterol

hydrochloride cho vào bình định mức dung tích 10ml, thêm metanol đến vạch, lắc đều.

(Hàm lượng tinh khiết của chuẩn gốc là 99%). Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -20oC, bền

trong một năm.

3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian

Chuẩn trung gian 1 (10 ppm): lấy 1 ml chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức

dung tích 10 ml, thêm metanol đến vạch, lắc đều. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -20oC,

bền trong một năm.

Chuẩn trung gian 2 (1 ppm): lấy 1 ml chuẩn 10 ppm cho vào bình định mức dungtích 10ml, thêm metanol đến vạch, lắc đều. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -20oC, bền trong

một năm.

Chuẩn trung gian 3 (100 ppb): lấy 1 ml chuẩn 1 ppm cho vào bình định mức dung

tích 10ml, thêm metanol đến vạch, lắc đều. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -20oC, bền trong

một năm.

Chuẩn trung gian 4 (50 ppb): lấy 5ml chuẩn 100 ppb cho vào bình định mức dung

tích 10ml, thêm metanol đến vạch, lắc đều. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -20oC, bền trong

một năm.





-25-

3.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc

Chuẩn C1: Lấy 1,6 ml chuẩn 50 ppb cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm

metanol đến vạch, lắc đều được chuẩn 8 ppb.

Chuẩn C2: Lấy 800 μl chuẩn 50 ppb cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm


Chuẩn C3 Lấy 400 μl chuẩn 50 ppb cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm


Chuẩn C4: Lấy 200 μl chuẩn 50 ppb cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm

metanol đến vạch, lắc đều, được chuẩn 1 ppb.

Chuẩn C5: Lấy 100 μl chuẩn 50 ppb cho vào bình định mức dung tích 10 ml, t hêm

metanol đến vạch, lắc đều, được chuẩn 0,5 ppb.

Các chuẩn làm việc từ C1 đến C5 được pha hằng ngày.

4. CHUẨN BỊ MẪU BẰNG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN

Quá trình chuẩn bị mẫu chia làm hai giai đoạn:

+ Giai đoạn chiết mẫu

+ Giai đoạn làm sạch và làm giàu mẫu: sử dụng cột SPE- Cationit acid mạnh

(SCX).

4.1. Chiết mẫu

Mẫu được xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố để đồng nhất mẫu.

Dùng cân kỹ thuật cân 1 gam mẫu thử đã được đồng nhất, chính xác đến 0,01 gam

cho vào ống nhựa dung tích 50 ml. Thêm vào 10 ml K 2HPO4 (pH = 5), vortex trong 2

phút, đánh siêu âm trong 30 phút, ly tâm ở 4000 rpm trong 4 phút. Chiết lấy dung dịch

lớp trên.

4.2. Làm sạch và làm giàu mẫu Làm sạch mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (Solid Phase Extraction: SPE)

Clenbuterol và salbutamol là những hợp chất mang điện tích dương ở pH acid nên

các hợp chất này có thể được giữ tốt bởi cột trao đổi cation. Trong bài viết này, chúng tôi

lựa chọn cột trao đổi cation SCX. Các bước tiến hành trong quá trình làm sạch mẫu bằng

kỹ thuật chiết pha rắn:

- Hoạt hóa cột

Cách thực hiện: Cột SCX được gắn với hệ thống hút chân không, cho qua cột lần

lượt 6 ml CH3OH, 6 ml H2O, 6 ml K 2HPO4.





-26-

- Cho toàn bộ dịch chiết qua cột đã được hoạt hóa.

- Rửa cột lần lượt bằng 3 ml H2O, 3 ml CH3OH: H2O (10: 90).

Lưu ý: Từ giai đoạn này trở về trước không được làm khô hay nứt cột.

- Rửa giải: chuyển chất phân tích về dạng anion với dung dịch rửa giải bằng cách

thêm 5 ml CH3OH : NH4OHđđ (95:5 v/v).

- Thổi khô bằng khí nitơ, định mức bằng 1ml CH3OH : H2O (1:1), sau đó lọc qua

màng lọc 0,45 µm và cho vào vial để tiêm vào thiết bị LC-MS/MS.





-27-

Qui trình xử lý mẫu được tóm tắt như sau:

5. ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH LC-MS/MS

5.1. Điều kiện vận hành hệ thống sắc ký lỏng

Sử dụng cột pha đảo XDB - C18: 4,6 x50 mm, đường kính hạt 2,1 µm.

Pha động A: H2O

Cân 1 g mẫu (± 0,01 g) cho vào ống nhựa 50ml

Cho dịch lọc qua cột SCX (6ml) đã được hoạt hóa.

(Hoạt hóa cột SCX lần lượt bằng 6 ml CH3OH, 6 ml H2O

6 ml K 2HPO4)

Rửa cột: 3ml H2O, 3ml CH3OH:H2O (10:90)

Thêm vào 10 ml K 2HPO4 (pH = 5 )

Rửa giải bằng 5ml CH3OH: NH4OHđđ (95:5)

Thổi khô bằng khí nitơ ở 40oC, định mức bằng 1ml

CH3OH: H2O (1:1), lọc qua màng lọc 0,45 µm

Xay mẫu bằng máy xay sinh tố

LC-MS/MS

Vortex trong 2 phút

Đánh siêu âm trong 30 phút






-28-

Pha động B: Acetonitrile

Bảng 3. Chế độ gradient của dung môi

Thờ i gian (phút) % B Tốc độ dòng (ml/ phút)

0 15 0,4

4,0 100 0,4

10,0 100 0,4

Thể tích tiêm: 10µl

Thời gian ổn định (Post time): 5 phút

Thời gian dừng (Time stop): 10 phút

5.2. Điều kiện vận hành hệ thống khối phổ

Nguồn tạo ion: ESI+ 4000 VÁp suất dòng khí nitơ cho hệ phun sương (Nebulizer): 45 psi

Thế áp vào ống mao quản (Capillary): 4000V

Nhiệt độ dòng khí (Gas temp): 325oC

Tốc độ dòng khí (Gas flow): 9 l/min

MRM và năng lượng phân mảnh CE:

- Đối với clenbuterol

m/z: 277,0 → 203,0 (định lượng) CE: 10 V

m/z: 277,0 → 259,0 (định tính) CE: 5 V

- Đối với salbutamol

m/z: 240,2 → 148,0 (định lượng) CE: 10 V

m/z: 240,2 → 222,2 (định tính) CE: 5 V

6. KHẢO SÁT KHOẢNG TUYẾN TÍNH[8]

6.1. Dựng đường chuẩn Dựng đường chuẩn của các chất cần phân tích tại sáu điểm có nồng độ tương ứng

trong các dung dịch chuẩn làm việc (cách pha dung dịch chuẩn đã trình bày ở mục 3).

Đối với clenbuterol dữ liệu bảng 4, salbutamol dữ liệu bảng 5.





-29-

Bảng 4. Dữ liệu đường chuẩn của clenbuterol

Nồng độ (ppb) 0 0,5 1 2 4 8

Diện tích peak 2 196 495 919 1811 3731

y = 463.61x

R2 = 0.9995

0500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 2 4 6 8 10

Nồng độ (ppb)

D i ệ n

t í c h

Hình 11. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của clenbuterol

Bảng 5. Dữ liệu đường chuẩn của salbutamol

Nồng độ (ppb) 0 0,5 1 2 4 8

Diện tích peak 1 304 780 1529 3076 5971

y = 751.46xR

2 = 0.9995

0

1000

20003000

4000

5000

6000

7000

0 2 4 6 8 10

Nồng độ (ppb)

D i ệ n

t í c h

Hình 12. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của salbutamol

Lưu ý: Khi xây dựng đường chuẩn cần bảo đảm nồng độ chuẩn chính xác. Đường

chuẩn là yếu tố sống còn quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích . Do đó nếu trong

quá trình xây dựng đường chuẩn mắc những sai số lớn sẽ dẫn đến kết quả phân tích





-30-

không chính xác.

6.2. Khảo sát khoảng tuyến tính

Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện chạy dãy chuẩn với 6

nồng độ pha từ 0 đến 8 ppb. Nếu đồ thị tuyến tính trong khoảng nồng độ này (R 2 ≥ 0,99)

thì chấp nhận dãy nồng độ này, nếu không phải tiếp tục thu hẹp dải nồng độ cho đến khi

nào R 2 ≥ 0,99.

Từ kết quả trên cho thấy các đường biểu diễn trên là tuyến tính trong khoảng nồng

độ khảo sát (R 2 tính được đều lớn hơn 0,99). Như vậy, quy trình định lượng có tính tuyến

tính trong khoảng nồng độ khảo sát.

7. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ ĐỘ LẶP LẠI[5]

Chuẩn bị mẫu trắng: là mẫu thịt heo, thịt gà đã được phân tích nhiều lần (n=6) với

kết quả không phát hiện clenbuterol và salbutamol. Mẫu được đồng nhất và bảo quản ở

nhiệt độ -20oC, dùng làm mẫu thêm chuẩn.

Mẫu thêm chuẩn: cân 1 g mẫu trắng, thêm một lượng chất chuẩn (clenbuterol

hydrochloride, salbutamol) xác định vào mẫu trắng, vortex, để yên 30 phút, xử lí mẫu

theo qui trình 4.

Hiệu suất thu hồi, độ lặp lại được xác định bằng cách: Thêm một lượng chất chuẩn

xác định vào mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó (M+C) với điều kiện phân tích

LC-MS/MS (mục 5), làm lặp lại 6 lần.

cov(%) 100

re ery

spiked

C R x

C

Trong đó: R (%): hiệu suất thu hồi

Crecovery: nồng độ thu hồi

eryreC cov : nồng độ thu hồi trung bình

Cspiked: nồng độ chuẩn thêm vào mẫu (lí thuyết)

Độ lệch chuẩn: SD =1

)( 2

1

n

x xn

i

r

Độ lệch chuẩn tương đối: 100100(%) x x

x x

SD RSD r





-31-

Nồng độ chất phân tích có trong mẫu được tính theo công thức sau:

f xm

V xC C o

C: nồng độ chất phân tích có trong mẫu (ppb)

Co: nồng độ chất phân tích tính từ đường chuẩn (ppb) m: khối lượng mẫu phân tích (g)

V: thể tích định mức của dung dịch chiết (ml)

f: hệ số pha loãng.

Độ lặp lại thể hiện thông qua độ lệch chuẩn hay độ lệch chuẩn tương đối. Độ lặp

lại càng thấp thì độ lệch chuẩn (độ lệch chuẩn tương đối) càng lớn.

Bảng 6. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của clenbuterol

Nền mẫuMẫu thêm

chuẩn

Cspiked

(ppb)

eryreC cov

(ppb)R(%) SD (n=6) RSD (%)

Thịt gà

M + C1 1,5 1,037 63,3 - 78,7 0,089 8,60

M + C2 3 2,253 69,7 - 80,3 0,120 5,33

M + C3 4,5 3,562 76,7 - 84,2 0,122 3,422

Thịt heo

M + C1 1,5 1,005 62,7 - 72 0,053 5,293

M + C2 3 2,278 71 - 80,7 0,124 5,45

M + C3 4,5 3,537 77,6 - 81,6 0,078 2,202

Bảng 7. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của salbutamol

Nền mẫuMẫu thêm

chuẩn

Cspiked

(ppb)

eryreC cov

(ppb)R (%) r (n=6) RSD (%)

Thịt gàM + C1 1,5 0,950 61,3 - 66 0,024 2,506M + C2 3 1,938 62,7 - 67,3 0,051 2,654

M + C3 4,5 2,872 62 - 65,6 0,061 2,122

Thịt heo

M + C1 1,5 0,947 61,3 - 65,3 0,028 2,967

M + C2 3 1,935 61,7 - 67 0,054 2,811

M + C3 4,5 2,878 62,2 - 65,8 0,059 2,040





-32-

Kết quả RSD thu được đều nhỏ hơn 21%, đáp ứng tiêu chuẩn phân tích theo qui

định AOAC (với nồng độ <10 ppb, RSD < 21%). Như vậy, độ lặp lại của kết quả phân

tích là chấp nhận được.

8. KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG[5]

8.1. Định nghĩa

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung

bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

8.2. Thực hiện

Độ đúng được tính toán trên tỷ lệ phần trăm thu hồi trong định lượng khi thêm vào

một lượng chất tan đã cho biết vào mẫu đo. Xem kết quả bảng 8 và 9.

Kết quả hiệu suất thu hồi khi phân tích các mẫu trên từ 61,3-84,2%, đáp ứng tiêu

chuẩn phân tích theo qui định AOAC (với nồng độ 1 và < 10 ppb hiệu suất thu hồi: 60-

120%). Như vậy độ đúng có thể chấp nhận được.

9. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN

9.1. Định nghĩa

Giới hạn phát hiện (LOD): là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể

phát hiện bởi phương pháp này.

Giới hạn định lượng (LOQ): là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể

định lượng bởi phương pháp này với độ tin cậy cao.

9.2. Công thức

LOD, LOQ được xác định theo công thức sau:

T

C x LOD Min3 LOQ = 3 x LOD

Trong đó: T = N

S

S: Cường độ tín hiệu

N: Nhiễu nền

CMin: Nồng độ nhỏ nhất chất chuẩn khi tiêm vào mẫu

LOD: giới hạn phát hiện.

LOQ: giới hạn định lượng

9.3. Cách thực hiện

- Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu trắng với nồng độ khá nhỏ (ppb).





-33-

- Xử lí mẫu thêm chuẩn như qui trình 4 và thực hiện phân tích bằng kỹ thuật LC -

MS/MS theo điều kiện 5.

- Tìm ra dung dịch mẫu có nồng độ chuẩn tối thiểu đã biết trước (Cmin) với tín hiệu

sao cho 3 < N

S < 10

Kết quả thu được: LOD = 0,5 ppb; LOQ = 1,5 ppb

10. KIỂM TRA DƯ LƯỢNG CỦA CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL

TRONG MẪU NGHIÊN CỨ U.

10.1. Nguyên tắc

Mẫu sau khi đồng nhất, được li trích bằng K 2HPO4, làm sạch dịch chiết mẫu bằng kỹ

thuật chiết pha rắn và đem phân tích trên máy LC-MS/MS Agilent 6410B.

10.2. Mẫu nghiên cứu

Tổng số 48 mẫu gồm 24 mẫu thịt gà và 24 mẫu thịt heo được thu mua tại 8 chợ

trên địa bàn thành phố Cần Thơ.

Chợ Tân An, Hưng Lợi, Xuân Khánh, An Nghiệp, An Bình thuộc quận Ninh Kiều

và chợ Phú Thứ, Cái Răng, Hưng Phú thuộc quận Cái Răng.

Bảng 8. Thông tin về mẫu nghiên cứu.

STT Chợ Số mẫu thịt gà Số mẫu thịt heo Thờ i gian lấy mẫu

1 Tân An 3 3 15/01/2013

2 Hưng Lợ i 3 3 15/01/2013

3 Xuân Khánh 3 3 15/01/2013

4 An Bình 3 3 15/01/2013

5 An Nghiệ p 3 3 15/01/2013

6 Phú Thú 3 3 15/01/2013

7 Hưng Phú 3 3 15/01/2013

8 Cái Răng 3 3 15/01/2013

Tất cả các mẫu được bảo quản đông lạnh ít nhất -20oC cho đến khi xử lý.

10.3. Kết quả xác định dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo.

Sau khi thu mua mẫu, tiến hành kí hiệu đánh dấu các mẫu, thực hiện phân tích

mẫu theo các các bước như quy trình 4 với các điều kiện phân tích 5, thu được kết quả

sau:





-34-

Bảng 9. Kết quả phân tích dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt gà

thịt heo ở một số chợ tại Thành phố Cần Thơ .

STT Tên mẫu Số mẫu phát hiện Số mẫu không phát hiện Tổng số mẫu

1 Thịt gà 02 22 242 Thịt heo 02 22 24

Tổng 04 44 48

Tỷ lệ (%) 8,33 91,67 100

Thảo luận

Có 4 mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol, salbutamol chiếm 8,33 % trong đó có 2mẫu thịt gà và 2 mẫu thịt heo.

Có 44 mẫu không phát hiện dư lượng clenbuterol, salbutamol chiếm 91,67 %

trong số 48 mẫu phân tích được.

Bảng 10. Mẫu phát hiện clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo ở

một số chợ tại Thành phố Cần Thơ.

STT Kí hiệu mẫu Loại mẫu Địa điểm lấy mẫu Dư lượ ng Hoá chất

1 THITGA2-TA Thịt gà 2 Chợ Tân An 5,37 ppb Salbutamol

2 THITGA3-HP Thịt gà 3 Chợ Hưng Phú 2,59 ppb Clenbuterol

3 THITHEO1-HL Thịt heo 1 Chợ Hưng Lợ i 0,74 ppb Clenbuterol

4 THITHEO3-AB Thịt heo 3 Chợ An Bình 0,9 ppb Salbutamol

Thảo luận

Bảng 10 cho thấy có 4 mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol, salbutamol. Trong đó

có 2 mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol (1 mẫu trên thịt gà, 1 mẫu trên thịt heo), 2 mẫu

phát hiện dư lượng salbutamol (1 mẫu trên thịt gà, 1 mẫu trên thịt heo), không có mẫu

nào vừa bị nhiễm cả clenbuterol và salbutamol. Qua điều tra 48 mẫu gồm thịt heo và thịt

gà ở 8 chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ ta thấy số lượng mẫu nhiễm tương đối ít, dư

lượng nhiễm thấp ở mức độ < 6 ppb nhưng nếu được tích trữ lâu dài trong cơ thể sẽ ảnh

hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.





-35-

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

Sau thời gian nghiên cứu với nhiều khó khăn và thuận lợi trong quá trình thực

hiện, đề tài đã hoàn thành mục tiêu đề ra và bước đầu đạt kết quả như sau:

- Chọn lọc các yếu tố để làm tăng độ tin cậy trong phân tích clenbuterol và

salbutamol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ:

Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp đã nghiên cứu: 62,7-84,2 đối

với clenbuterol và 61,3-67,3 đối với salbutamol.

Giới hạn phát hiện (LOD): 0,5 ppb; Giới hạn định lượng (LOQ): 1,5 ppb.

Các kết quả này đáp ứng tiêu chuẩn phân tích theo qui định AOAC.

- Điều tra và phân tích 48 mẫu thịt gà và thịt heo ở 8 chợ trên địa bàn thành phốCần Thơ với kết quả như sau:

Thịt gà có 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol với hàm lượng

2,59 ppb; 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện dư lượng salbutamol với hàm lượng

5,37 ppb.

Thịt heo có 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện dư lượng clenbuterol với hàm

lượng 0,74 ppb; 1/24 (4,17%) mẫu phát hiện salbutamol có hàm lượng 0,9

ppb.

Từ kết quả đạt được cho thấy hiện nay phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là

phương pháp được lựa chọn ở nhiều phòng thí nghiệm với độ chính xác cao. Đối với

clenbuterol và salbutamol, hai hợp chất thuộc nhóm kích thích tăng trưởng vẫn còn đang

sử dụng trong chăn nuôi. Dư lượng của chúng trong các sản phẩm chế biến ảnh hưởng

xấu đến sức khỏe con người. Vì vậy, người tiêu dùng nên cẩn trọng khi sử dụng những

sản phẩm không rõ nguồn gốc, nên lựa chọn thực phẩm đã được các cơ quan chức năngkiểm tra, đảm bảo an toàn, vệ sinh thực phẩm.

2. KIẾN NGHỊ

Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam đã có quyết định số 54 vào

ngày 20/06/2002 nghiêm cấm sử dụng một số loại kháng sinh, hóa chất trong đó có

clenbuterol và salbutamol nhưng đến nay vẫn chưa được kiểm soát chặt chẽ. Người dân

vẫn tiếp tục sử dụng hai loại hóa chất này vì lợi nhuận kinh tế. Vì vậy, cần có sự phối hợpchặt chẽ giữa phòng thí nghiệm, trung tâm phân tích với các cơ quan nhà nước để việc





-36-

kiểm tra được tiến hành thường xuyên, nghiêm khắc và hiệu quả hơn. Đồng thời, có

những khuyến cáo, chế tài cụ thể cho những hình thức vi pham.

Do thời gian và điều kiện hạn chế nên đề tài chỉ mới khảo sát với số lượng mẫu

nhỏ để kiểm tra clenbuterol và salbutamol, 2 chất trong nhóm β2-agonist. Nếu có thể

chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu, tiến hành khảo sát đồng thời nhiều chất trong họ β-

agonist.





Luận văn tốt nghiệ p

-a-

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ THIẾT BỊ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Máy LC-MS/MS Agilent 6410B

Máy đo pH Máy ly tâm

Máy vortex






-b-

PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ

Phụ lục 2.1: Sắc ký đồ terbutaline, salbutamol, clenbuterol, formoterol

Phụ lục 2.2. Sắc ký đồ của salbutamol: A. Mẫu blank, B. Mẫu thêm chuẩn 0,25ng/ml.






-c-

Phụ lục 2.3: Sắc ký đồ mẫu blank






-d-

Phụ lục 2.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 0,5 ppb






-e-

Phụ lục 2.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 1 ppb






-f-







-g-







-h-







-i-

Phụ lục 2.9: Sắc ký đồ mẫu thịt gà 3 chợ Phú Thứ không phát hiện

Data File THITGA3-PT.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Sample






-j-

Phụ lục 2.10: Sắc ký đồ mẫu thịt gà 1 chợ Xuân Khánh không phát hiện

Data File THITGA1-XK.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample






-k-

Phụ lục 2.11: Sắc ký đồ mẫu thịt heo 3 chợ An Nghiệp không phát hiện

Data File THITHEO3-AN.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample






-l-

Phụ lục 2.12: Sắc ký đồ mẫu thịt gà 1 chợ Cái Răng không phát hiện

Data File THITGA1-CR.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample






-m-

Phụ lục 2.13: Sắc ký đồ mẫu thịt gà 2 chợ Tân An phát hiện salbutamol

Data File THITGA2-TA.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample






-n-

Phụ lục 2.14: Sắc ký đồ mẫu thịt gà 3 chợ Hưng Phú phát hiện clenbuterol

Data File THITGA3-HP.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample






-o-

Phụ lục 2.15: Sắc ký đồ mẫu thịt heo 3 chợ An Bình phát hiện salbutamol

Data File THITHEO3-AB.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample






-p-

Phụ lục 2.16: Sắc ký đồ mẫu thịt heo 1 chợ Hưng Lợi phát hiện clenbuterol

Data File THITHEO1-HL.dAcq Method File MRMCOTMOI.mSample Type Sample



Khảo sát dư lượng β-Agonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt gà và thịt heo...

Documents

Transcript of Khảo sát dư lượng β-Agonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt gà và thịt heo...