BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kloramfenikol

2.1.1 Sifat Fisikokimia

Rumus struktur :

O2N C C CH2OH

HOH

H NHCOCHCl2

Nama Kimia : D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-[β-hidroksi-α-(hidroksimetil)-p-

nitrofenetil]asetamida [56-75-7]

Rumus Molekul : C11H12Cl2N2O5

Berat Molekul : 323,13

Pemerian : Hablur halus berbentuk jarum atau lempeng memanjang; putih

hingga putih kelabu atau putih kekuningan; larutan praktis

netral terhadap lakmus p; stabil dalam larutan netral atau

larutan agak asam

Kelarutan : Sukar larut dalam air; mudah larut dalam etanol; dalam propilen

glikol; dalam aseton dan dalam etil asetat (Ditjen POM, 1995).

2.1.2 Farmakokinetik

Setelah pemberiaan oral, kloramfenikol diserap dengan cepat. Kadar

puncak dalam darah tercapai dalam 2 jam. Masa paruh eliminasi pada orang

dewasa kurang lebih 3 jam, pada bayi berumur kurang dari 2 minggu sekitar 24

jam. Kira-kira 50% kloramfenikol dalam darah terikat dengan albumin. Obat ini

Universitas Sumatera Utara

didistribusikan dengan baik ke berbagai jaringan tubuh, termasuk jaringan otak,

cairan serebrospinal dan mata (Kunardi dan Setiabudy, 1995)

2.1.3 Efek Samping

Efek samping yang sering terjadi ialah reaksi alergi yang ditandai dengan

merahnya kulit. Reaksi saluran cerna yang ditandai dengan mual, muntah dan

diare. Reaksi neurologik dapat terlihat dalam bentuk depresi, bingung, dan sakit

kepala (Kunardi dan Setiabudy, 1995)

2.1.4 Bentuk Sediaan

Kloramfenikol tersedia dalam bentuk salep mata tube 3,5 g, ; tetes mata 15

ml, 8 ml dan 5 ml; tetes telinga 10 ml; kapsul 500 mg/kapsul dan 250 mg/kapsul;

sirup (ISO, 2007)

Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), Kloramfenikol dapat

ditetapkan kadarnya secara KCKT dan menurut Farmakope Indonesia edisi III

(1979) Kloramfenikol ditentukan secara nitrimetri setelah direduksi terlebih

dahulu dengan Zn/HCl.

2.1.5 Kegunaan

Kloramfenikol digunakan sebagai pengobatan infeksi-infeksi yang parah

seperti tifus atau demam. Kloramfenikol kadang-kadang juga digunakan secara

topikal untuk pengobatan infeksi mata (Katzung, 2004).

2.2 Teori Kromatografi

2.2.1 Pemakaian Kromatografi

1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya

senyawa tertentu dalam cuplikan

Universitas Sumatera Utara

2. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing

komponen campuran

3. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran

dalam jumlah memadai dalam keadaan murni (Gritter, dkk., 1991).

2.2.2 Analisa Kualitatif dan Kuantitatif

a. Analisis Kualitatif

Ada 3 pendekatan untuk analisa kualitatif yakni:

1. Perbandingan antara retensi solut yang tidak diketahui dengan data retensi

baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama.

Untuk kromatografi yang menggunakan kolom (seperti KCKT dan KG),

waktu retensi (tR) atau volume retensi (VR) senyawa baku dan senyawa yang

tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara berurutan

dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu pengoperasian antar

keduanya sekecil mungkin.

2. Dengan cara spiking.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, spiking dilakukan dengan

menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki

dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan

dengan cara: pertama, dilakukan proses kromatografi sampel yang tidak di

spiking. Kedua, sampel yang telah di-spiking dengan senyawa baku dilakukan

proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung

senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah

di-spiking dibandingkan dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak

Universitas Sumatera Utara

dilakukan spiking maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung

senyawa yang kita selidiki.

3. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa.

Pada pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi, cara ini akan

memberikan informasi data spektra massa solut dengan waktu retensi tertentu.

Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan spektra yang

ada di data base komputer yang diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan

untuk solut yang belum ada baku murninya.

b. Analisis Kuantitatif

Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil

dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut

beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif:

a. Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-

komponen lain dalam kromatogram

b. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia

c. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan

dengan luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak

berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi, jika dilakukan

pada kisaran detektor yang linier (Johnson dan Stevenson, 1991).

1. Metode tinggi puncak

Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah

dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke

Universitas Sumatera Utara

puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis

dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara awal dan akhir puncak.

Gambar 1. Pengukuran tinggi puncak

Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak linier

dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan pada

puncak yang mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika kolom mengalami

kelebihan muatan.

2. Metode luas puncak

Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu

teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai

hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2). Teknik ini hanya

dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau yang mempunyai bentuk

serupa (Johnson dan Stevenson, 1991).

Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan

konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi

perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut.

Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat

untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan

dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh

Universitas Sumatera Utara

kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang

sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara

kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran

(Ditjen POM, 1995).

KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk

analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah

bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan.

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa

organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian

(impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap

(nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-

senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-

protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat

dan lain-lain.

Kelebihan KCKT antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Resolusinya baik

Mudah melaksanakannya

Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis

Dapat digunakan bermacam-macam detektor

Kolom dapat digunakan kembali

Mudah melakukan rekoveri cuplikan

Universitas Sumatera Utara

Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan

reprodusibilitasnya lebih baik

Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif

Waktu analisis umumnya singkat

Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar

Ideal untuk molekul besar dan ion (Putra, 2007)

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali

jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya

adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh

(Munson, 1991).

2.3.1 Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut

terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati

suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam

fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan

penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis

kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu

kolom, dan ukuran sampel (Rohman, 2007).

2.3.2 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

2.3.2.1 Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan

yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung wadah

harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk

kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit.

Universitas Sumatera Utara

2.3.2.2 Pompa

Untuk mengerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa

harus mampu menghasilkan tekanan 6000 psi pada kecepatan alir 0,1–10

ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan

konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang

umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa

harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor.

2.3.2.3 Injektor

Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom (kepala kolom),

diusahakan agas sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a. Hentikan aliran/stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja

atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa

digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

b. Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama

dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan

pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan

semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari

septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan

penyumbatan.

c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 2,

tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar

daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor

khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada

Universitas Sumatera Utara

posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan

atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan

bergerak ke dalam kolom.

Gambar 2. Tipe injektor katup putaran

2.3.2.4 Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis

tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom

dapat dibagi menjadi dua kelompok:

1. Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100

cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini

ada yang 5 cm.

2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjang kolom 25-100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan

pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,

terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan

kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan.

Universitas Sumatera Utara

2.3.2.5 Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan

dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki

sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang

luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan

yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi

tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern

kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam

detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer

karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam

rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama

dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor

spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor

ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.

2.3.2.6 Pengolahan Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-

puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

Area

Rt

H

W

H1/2

W1/2

Gambar 3. Kromatogram

Universitas Sumatera Utara

Guna kromatogram:

1. Kualitatif

Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama

dapat digunakan untuk identifikasi.

2. Kuantitatif

Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan

dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.

3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan

dan kinerja kolom (kapasitas ‘k’, selektifitas ‘’, jumlah pelat teoritis

‘N’, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’).

2.3.2.7 Fase Gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991).

Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu

variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase

gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat

yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.

Fase gerak harus:

- Murni; tidak ada pencemar/kontaminan

- Tidak bereaksi dengan pengemas

- Sesuai dengan detektor

- Melarutkan cuplikan

Universitas Sumatera Utara

- Mempunyai viskositas rendah

- Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan

- Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas

Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur

pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4

persyaratan pertama adalah yang paling penting.

Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut,

karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak

noise sehingga data tidak dapat digunakan (Putra, 2007).

Elusi Gradien dan Isokratik

Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:

1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam

atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap

selama elusi).

2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase

gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi

fase gerak berubah-ubah selama elusi).

Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak

selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan

resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran

polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah

memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di

dalam kolom (Putra, 2007).

Universitas Sumatera Utara

2.4 Jenis Kromatografi

1. Kromatografi Adsorbsi

Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal

dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian

sekitar 90% kromatografi ini memakai silika gel sebagai fase diamnya. Pada silika

dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus

silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat

terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor (tailling).

Fase gerak yang digunakan untuk fase diam silika atau alumina berupa pelarut

non polar yang ditambah dengan pelarut polar seperti air atau alkohol rantai

pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak timbul pengekor

puncak, misalnya n-heksan ditambah dengan metanol (Rohman, 2007).

2. Kromatografi Partisi

Tenik ini tergantung pada partisi solute diantara dua pelarut yang tidak dapat

bercampur, salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam dan yang lainnya

sebagai fase gerak (Putra, 2007).

3. Kromatografi Penukar Ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation

atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar

dipasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren

resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan

media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut

campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar

ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau

Universitas Sumatera Utara

kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak

menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion

sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin

(Rohman, 2007).

4. Kromatografi Ekslusi

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat

porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi

lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai berat molekul yang jauh lebih

besar, akan terelusi lebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran

medium dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan

solut dengan berat molekul yang besar tidak melewati poros, akan tetapi lewat

diantara partikel fase diam. Dengan demikian dalam pemisahan dengan ekslusi

ukuran ini terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti kromatografi

yang lain (Rohman, 2007)

Universitas Sumatera Utara