UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

KATYANNA SALES BEZERRA

ANÁLISE IN SILICO DA INTERAÇÃO ENTRE A INTEGRINA α2β1 E O COLÁGENO

NATAL-RN

2016

KATYANNA SALES BEZERRA

ANÁLISE IN SILICO DA INTERAÇÃO ENTRE A INTEGRINA α2β1 E O COLÁGENO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, como requisito para obtenção do

título em Mestre em Ciências Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco

NATAL-RN

2016

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Bezerra, Katyanna Sales.

Análise in silico da interação entre a integrina α2β1 e o colágeno / Katyanna Sales Bezerra. – Natal, RN, 2016. 88 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas. 1. Proteínas. – Dissertação. 2. Colágeno. – Dissertação. 3. Integrina. – Dissertação. 4. Teoria do Funcional da Densidade (DFT). - Dissertação I. Fulco, Umberto Laino. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 547.96

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida.

Agradeço à minha família pelo apoio, carinho e satisfação durante todos os momentos.

À minha mãe e meu pai por absolutamente tudo, a eles toda minha gratidão.

Ao Prof. Dr. Umberto, pela paciência, pela compreensão e confiança empregada, meu

sincero muito obrigada.

A todos os professores da Pós-Graduação em Ciências Biológicas pela transmissão

imprescindível de seus conhecimentos, especialmente aos Professores: Prof. Dr. Eudenilson

Lins de Albuquerque, Prof. Dr. Gilberto Corso, Profª. Drª. Janeusa Trindade e a Profª. Drª.

Vanessa Soares Rachetti.

Aos colegas do laboratório de Biofísica e Simulação Computacional que compartilham

comigo a jornada rumo ao universo esplêndido da pesquisa, Jéssica Vianna, Gabriela,

Aranthya, Dalila, Mylene, Jonas e José Xavier.

Ao Prof. Dr. Valder Nogueira Freire e aos componentes de seu grupo de pesquisa na

Universidade Federal do Ceará pelo compartilhamento de seus conhecimentos.

À CAPES pelo apoio financeiro.

Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram e contribuem para a minha

formação como pessoa e como futura pesquisadora.

A todos, muito obrigada!

“Aprender é a única coisa de que a mente

nunca se cansa, nunca tem medo e nunca

se arrepende”

Leonardo da Vinci

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Representação estrutural de um colágeno tripla hélice. 18

Figura 2 - Processo de formação, organização e estrutura de colágeno. 20

Figura 3- Classificação da família das integrinas e seus respectivos receptores. 24

Figura 4- Arquitetura de domínio de um heterodímero de integrina. 27

Figura 5- Modos de sinalização celular da integrina. 30

Figura 6- Sinalização mediada por integrinas. 33

Figura 7 - Representação da aplicação do método QM/MM, onde a região com o raio de 5Å

corresponde a região QM e a região de 8Å corresponde a região MM. 45

Figura 8 - Representação esquemática da aplicação do método MFCC. Os quadros apresentam

os quatro conjuntos do fracionamento. 48

Figura 9 - Representação do domínio-I α2 da integrina α2β1 complexado com uma molécula

de colágeno tripla hélice – cadeia A (roxa), cadeia B (laranja), cadeia C (verde). O metal de

coordenação é o magnésio. 51

Figura 10 - Representação do sítio de interação entre o domínio-I α2 e o colágeno tripla hélice

aplicando-se o raio de interação de 8 Å. Os aminoácidos em destaques, Thr221 e Glu33,

interagem diretamente com o íon ����. 52

Figura 11 - Principais interações que ocorrem entre os resíduos da cadeia A (Gly10, Glu11 e

Arg12) do colágeno e os resíduos do domínio-I α2 da integrina. As energias apresentam os

valores para os cálculos com o metal interagindo com o Glu33 e com o Thr221. Para cada

interação é demonstrado o número de moléculas de água envolvidas. 54

Figura 12 - Representação das interações energeticamente relevantes entre Arg12 e os

resíduos de integrina Asp219, Thr221, Glu256 e Asp292. 56

Figura 13 - Representação das interações energeticamente relevantes entre Arg12 e os

resíduos de integrina Glu299, Asp254 e Arg288. 56

Figura 14- Principais interações que ocorrem entre os resíduos da cadeia B (Glu33 e Arg34) e

os resíduos do domínio-I α2 da integrina. As energias apresentam os valores para os cálculos

com o metal interagindo com o Glu33 e com o Thr221. Para cada interação é demonstrado o

número de moléculas de água envolvidas, aqui cinco interações não apresentaram ligação a

moléculas de água. 57

Figura 15– Representação das interações mais relevantes encontradas para os aminoácidos

Glu33 da cadeia B do colágeno e a integrina. A figura destaca as interações no contexto do

metal interagindo com Thr221. 60

Figura 16– Representação das interações mais relevantes encontradas para os aminoácidos

Glu33 da cadeia B do colágeno e a integrina. A figura destaca as interações no contexto do

metal interagindo com o próprio Glu33. 61

Figura 17– Representação das interações mais relevantes encontradas para os aminoácidos

Arg34 da cadeia B do colágeno e a integrina α2β1. 61

Figura 18- Principais interações que ocorrem entre os resíduos da cadeia C (Gly54, Glu55,

Arg56 e Glu57) e os resíduos do domínio-I α2 da integrina. As energias apresentam os valores

para os cálculos com o metal interagindo com o Glu33 e com o Thr221. Para cada interação é

demonstrado o número de moléculas de água envolvidas. 62

Figura 19 – Representação das interações entre os aminoácidos Glu55 e Arg56 da cadeia C do

colágeno e Asp219 da integrina. 63

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AMBER Assisted Model Building with Energy Refinement

Cdc42 Ciclo de divisão celular 42

DNP Double Numerical plus Polarization

EGF Fator de Crescimento Epidérmico

ERK Quinase Regulada por Sinal Extracelular

FA Adesão Focal

FACIT Fibras de Colágeno Associadas a Triplas Hélices Interrompidas

FAK Quinase de Adesão Focal

FGF Fator de Crescimento de Fibroblastos

GFOGER Glicina-Fenilalanina-Hidroxiprolina-Glicina-Glutamato-Arginina

GGA Aproximação do Gradiente Generalizado

ICAM Molécula de Adesão Intercelular

ILK Quinase Ligada a Integrina

LAD I Síndrome da Deficiência de Aderência de Leucócitos

LDA Aproximações da Densidade Local

MEC Matriz Extracelular

MIDAS Sítio de Adesão Dependente de Íon Metálico

NPxY Asparagina-Prolina-x-Tirosina

ONIOM Our own N-layered Integrated molecular Orbital and Molecular Mechanics

PDGF Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas

PIP2 Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato

PIPKIγ Fosfatidilinositol-4, 5 fosfato quinase γ tipo I

PSI Plexina-Semaforina-Integrina

PTB Domínio de Ligação à Fosfotirosina

QM/MM Mecânica Quântica/Mecânica Molecular

RE Retículo Endoplasmático

RGD Arginina-Glicina-Ácido aspártico

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RCSB/PDB Research Collaboratory for Structural Bioinformatics - Protein Data Bank

VCAM-1 Molécula de Adesão Vascular-1

vWF Fator de von Willebrand

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Características dos tipos de colágenos mais conhecidos . 22

Tabela 2- Principais integrinas encontradas em vertebrados, seus ligantes e seus locais de

distribuição. 25

SUMÁRIO

1. Introdução ...................................................................................................................... 15

1.1 Colágeno .................................................................................................................... 16

1.1.1 Estrutura e Biossíntese do Colágeno ................................................................ 17

1.1.2 Tipos e Funções do Colágeno........................................................................... 20

1.2 Integrina ..................................................................................................................... 22

1.2.1 Classificação das Integrinas ................................................................................. 23

1.2.2 Estrutura das Integrinas ........................................................................................ 25

1.2.3 Funções das Integrinas ......................................................................................... 28

1.2.4 Integrinas e Sinalização ........................................................................................ 29

1.2.5 Sinalização Inside-Out ......................................................................................... 30

1.2.6 Sinalização Outside-In ......................................................................................... 32

1.2.7 Ligação entre Integrina e Colágeno ...................................................................... 35

1.2.8 Sítios no Colágeno para Ligação à Integrina ......................................................... 36

1.2.9 Sítios na Integrina para Ligação ao Colágeno ....................................................... 37

1.2.10 Patologias Associadas a Ação das Integrinas ...................................................... 37

1.3 Modelagem Molecular ................................................................................................ 39

2. Objetivos ......................................................................................................................... 41

2.1 Objetivos Gerais ......................................................................................................... 42

2.2 Objetivos Específicos ................................................................................................. 42

3. Materiais e Métodos ....................................................................................................... 43

3.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica ......................................................................... 44

3.2 Otimização da Estrutura e Simulação Computacional ................................................. 45

3.3 Determinação das Energias de Interação ..................................................................... 46

4. Resultados e Discussões.................................................................................................. 49

4.1 Interações entre a Integrina α2β1 (Domínio-I α2) e o Colágeno .................................. 51

5. Conclusões e Perspectivas .............................................................................................. 66

5.1 Conclusões ................................................................................................................. 67

5.2 Perspectivas ................................................................................................................ 68

Referências Bibliográficas ................................................................................................. 70

Apêndice A ......................................................................................................................... 83

RESUMO

A matriz extracelular (MEC) dos tecidos conjuntivos representa um complexo de numerosos

membros de várias famílias de proteínas que delineiam sua integridade estrutural e várias

funções fisiológicas. As interações que ocorrem entre a célula e a matriz desempenham um

papel preponderante na fixação celular e migração, assim como também regulam e promovem

a diferenciação celular e a expressão de genes. O controle dessas interações celulares é crucial

para grande parte dos processos biológicos. As integrinas são uma família de glicoproteínas

transmembranares, que funcionam como os principais receptores metazoários para a adesão

celular, desempenhando um papel central em funções de suporte físico para a transdução de

sinais, montagem do citoesqueleto de actina, expressão gênica e funções celulares. Estas

glicoproteínas podem se ligar a glicoproteínas da matriz extracelular, tal como o colágeno,

esta ligação permite a regulação e integridade da adesão celular, migração celular e resposta

imune. Neste sentido, este trabalho tem como objetivo realizar uma análise ab initio da

interação entre o domínio-I da integrina α2β1 e o colágeno com sequência GFOGER. A

análise foi desenvolvida utilizando-se cálculos de mecânica quântica, no âmbito da Teoria do

Funcional da Densidade (DFT), com Aproximações do Gradiente Generalizado (GGA) para

descrição dos efeitos de correlação e troca. As energias de interação entre os resíduos do

domínio-I α2 da integrina e os resíduos do colágeno foram calculadas utilizando-se o método

de fragmentação molecular com capas conjugadas (MFCC). Os resultados encontrados

comprovam a importância do íon metálico presente na região MIDAS da integrina para a

interação com a molécula do colágeno. A análise das energias de interação apresentaram os

resíduos Arg12, Glu33, Arg34, Glu55 e Arg56 da sequência GFOGER do colágeno, como

cruciais para a interação com a integrina. Já os resíduos da integrina que demonstraram ser de

grande relevância para a interação foram a Thr221, Asp219, Asp254 e Glu256. Além disso, os

resultados também destacam a importância da alteração da conformação destes resíduos

durante a interação entre as proteínas. Os resultados apresentados podem auxiliar a

compreensão de eventos que envolvem a interação entre a integrina α2β1 e o colágeno bem

como fornecer dados relevantes sobre os aspectos particulares apresentados em modelos de

mutações.

Palavras-chave: Integrina, colágeno, energia de interação, DFT.

ABSTRACT

The extracellular matrix (ECM) of connective tissues is a complex of many members of

several families of proteins that delineate its structural integrity and various physiological

functions. The interactions occurring between the matrix cell and play a key role in cell

attachment and migration, as well as regulate and promote cell differentiation and gene

expression. The control of these cellular interactions is determinative for most biological

processes. Integrins are a family of transmembrane glycoproteins that function as the main

metazoan receptors for cell adhesion plays a central role in a physical support functions for

signal transduction, cytoskeletal actin assembly, gene expression and cell functions. These

glycoproteins may bind to the extracellular matrix glycoproteins such as collagen, this

connection allows adjustment and integrity of cell adhesion, cell migration and immune

response. Thus, this study aims to perform an ab initio analysis of the interaction between the

domain-I integrin α2β1 and collagen with GFOGER sequence. The analysis was carried out

using quantum mechanical calculations within Density Functional Theory (DFT) with the

Generalized Gradient Approximation (GGA) for describing the exchange and correlation

effects. The energies of interaction between domain-I α2 integrin residues and collagen

residues were calculated using the Molecular Fragmentation with Conjugated Caps (MFCC).

The results demonstrate the importance of metal ion present in the MIDAS region of the

integrin for interaction with the collagen molecule. The analysis showed the interaction

energies residues Arg12, Glu33, Arg34, Glu55, and Arg56 GFOGER sequence of collagen, as

important to the interaction with the integrin. In the residues of integrin shown to be of great

relevance to the interaction were Thr221, Asp219, Asp254 and Glu256. Moreover, the results

also highlight the importance of changing the conformation of these residues during the

interaction between the proteins. These results can aid understanding of events involving the

interaction between integrin α2β1 and collagen as well as provide relevant data on special

aspects presented in mutations models.

Keywords: Integrin, collagen, binding energy, DFT.

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

16

1.1 COLÁGENO

A matriz extracelular (MEC) dos tecidos conjuntivos representa um complexo de

numerosos membros de várias famílias de proteínas que delineiam sua integridade estrutural

e várias funções fisiológicas. O arranjo supramolecular de elementos fibrilares, redes

microfibrilares, da mesma maneira proteínas, glicoproteínas solúveis e uma larga variável de

outras moléculas definem as características biofísicas da MEC. Sua composição e estrutura

variam significativamente entre os diferentes tipos de tecido conjuntivo. A função primária da

matriz extracelular é prover, aos tecidos, propriedades mecânicas e bioquímicas específicas

(Alberts et al., 2010; Curran; Murray, 1999; Yamaguchi et al., 1990).

As interações que ocorrem entre a célula e a matriz desempenham um papel

preponderante na fixação celular e migração, assim como também regulam e promovem a

diferenciação celular e a expressão de genes. Duas classes principais de macromoléculas

extracelulares compõem a matriz: cadeias de polissacarídeos da classe dos

glicosaminoglicanos, e as proteínas fibrosas, incluindo colágeno, elastina, fibronectina e

laminina, ambas apresentando funções estruturais e adesivas (Gelse et al., 2003; Akiyama et

al., 1990).

O termo “colágeno” descreve uma superfamília de proteínas estruturalmente

relacionadas localizadas, principalmente, na matriz extracelular dos diferentes tipos de tecidos

conjuntivos (conectivos), nos quais desempenham papel imprescindível na manutenção de sua

força e integridade estrutural. É uma proteína estrutural abundante em todos os animais, nos

seres humanos o colágeno compreende um terço das proteínas totais, representando três

quartos do peso da pele. Foram identificados, em vertebrados, vinte e oito tipos diferentes de

colágeno compostos por, pelo menos, 46 cadeias polipeptídicas distintas, além disso, muitas

outras proteínas contem domínios de ligação para colágeno (Schuppan et al., 1998;

Yamaguchi et al., 1990).

As moléculas do colágeno montam fibras característica responsáveis pela

funcionalidade e integridade dos tecidos, tais como osso, cartilagem, pele, e tendão. Elas

contribuem para a estrutura de tecidos, tais como vasos sanguíneos e também para a maioria

dos órgãos (Shoulders; Raines, 2009). Uma variedade de condições humanas, normais e

patológicas, envolve a capacidade dos tecidos de reparar e regenerar o seu quadro colagenoso.

Algumas condições patológicas, por exemplo, são caracterizadas por excessiva deposição de

17

colágeno (por exemplo, cirrose, esclerodermia, fibrose pulmonar, diabetes). Além disso,

muitas condições incapacitantes resultam em mudanças na natureza e organização do

colágeno (lesões nas válvulas cardíacas, osteoartrite, artrite, e doenças congênitas associadas a

má formação do colágeno, tais como Síndromes de Marfan e de Ehlers-Danlos)

(Ramachadran et al., 1973; Shoulders; Raines, 2009)

1.1.1 ESTRUTURA E BIOSSÍNTESE DO COLÁGENO

As moléculas de colágeno possuem três cadeias polipeptídicas helicoidais dispostas

em tripla hélice (Figura 1) (Brodsky e Persikov, 2005). Cada cadeia polipeptídica tem uma

sequência de repetição Gly-X-Y. As cadeias reúnem-se em torno de um eixo central de

maneira que todos os resíduos de glicina são posicionados no centro da tripla hélice. As

ligações de hidrogénio que ligam o NH da ligação peptídica a glicina com um grupo carbonila

(C═O), ajuda a manter as três cadeias em conjunto. O ângulo fixo do C-N peptidil-prolina ou

uma ligação peptidil-hidroxiprolina permite que cada cadeia polipeptídica dobre-se em uma

hélice com uma geometria tal que as três cadeias possam girar em conjunto para formar uma

hélice de cadeia tripla (Raman, Parthasarathi, 2006; Gurry et al, 2010).

18

Figura 1- Representação estrutural de um colágeno tripla hélice. Fonte: Bella et al., 1994.

As posições X e Y são, muitas vezes, ocupadas pelos aminoácidos prolina e

hidroxiprolina. Dependendo do tipo de colágeno, os resíduos de prolina e lisina são

modificados por hidroxilação enzimática formando, respectivamente, hidroxiprolina e

hidroxilisina. O teor de hidroxiprolina é essencial para a formação de ligações de hidrogênio

intermoleculares e contribui para a estabilidade da conformação tripla hélice (Shoulders;

Raines, 2009).

O comprimento da tripla hélice varia entre os diferentes tipos de colágeno. A

sequência de repetição (Gly-X-Y) predomina nas hélice de colágenos formadores de fibrilas

(tipos I, II e III), resultando em domínios de tripla hélice de 300 nm de comprimento

(Bateman et al., 1996; von der Mark, 1999). Em outros tipos de colágeno, estes domínios são

muito mais curtos, assim, os colágenos VI e X, por exemplo, contém triplas hélices com cerca

de 200 e 460 aminoácidos, respectivamente (von der Mark, 1999).

A biossíntese e montagem do colágeno segue o caminho normal de uma proteína

secretada (Kühn, 1986). As cadeias de colágeno são sintetizadas como precursores

denominados de procolágeno, as cadeias peptídicas são transportadas para o lúmen do retículo

endoplasmático rugoso (RE). No RE, a cadeia do procolágeno sofre uma série de reações,

primeiramente a molécula sofre uma glicosilação, assim, resíduos de galactose e glicose são

19

adicionados aos resíduos de hidroxilisina, e são adicionados oligossacarídeos longos a certos

resíduos de asparagina no propeptídeo C-terminal. Ademais, os resíduos prolina e lisina

específicos no meio das cadeias são hidroxiladas por hidroxilases ligadas à membrana (Geiger

et al, 2003; Shoulders; Raines, 2009; Bateman et al., 1996).

Após o processamento e montagem do procolágeno, o mesmo é segregado para o

espaço extracelular. Durante ou após a exocitose, enzimas extracelulares (peptidases de

procolágeno) removem as porções N e C-terminais do procolágeno, a proteína resultante deste

evento é denominada tropocolágeno e, consiste quase inteiramente, de uma cadeia tripla

hélice. A ação peptidases de procolágeno é fundamental para o início do processo de

fibrinogênese. Notadamente, é necessário que ocorra o processo de clivagem para formação

do tropocolágeno, que começa a se unir com outras moléculas de tropocolágeno, formando as

fibrilas (Shoulders; Raines, 2009).

As moléculas de tropocolágeno unem-se em uma conformação torsa por meio de

associações lado a lado, estabilizadas primeiramente pelas interações hidrofóbicas e

eletrostáticas. As ligações peptídicas estão presentes na formação das ligações cruzadas

covalentes intermoleculares entre as cadeias, resultado da interação entre os grupos aldeídos e

grupos aminos livres. Essas ligações cruzadas fornecem estabilidade e força tensora

necessária à estrutura supramolecular. (Damodaran et al., 2010; Lehninger, 2002).

O trajeto helicoidal dessa superestrutura é destrógiro, oposto ao enrolamento das

hélices polipeptídicas individuais, que é levógiro. Essas duas conformações proporcionam um

enrolamento mais ajustado possível das múltiplas cadeias polipeptídicas. O enrolamento em

tripla hélice fornece uma grande resistência às forças de tensão, permitindo à molécula de

colágeno apresentar uma resistência mecânica de grande importância (Lehninger et al., 2002;

Bruckner; Prockop, 1981). A Figura 2 (abaixo) representa o processo de formação e

organização do colágeno.

20

Figura 2 - Processo de formação, organização e estrutura de colágeno. Adaptado de Damodaran et al.,

2010.

1.1.2 TIPOS E FUNÇÕES DO COLÁGENO

A diversidade de moléculas de colágeno se deve à existência de 46 cadeias α, algumas

isoformas moleculares e estruturas supramoleculares para um mesmo tipo de colágeno,

existência de promotores diversos no gene do colágeno, inclusive com a ocorrência de

splicing. Com base na sua estrutura e organização supramolecular, os colágenos podem ser

agrupados em diferentes tipos: formadores de fibrila, colágenos associados a fibrilas, fibrilas

21

de ancoragem, colágenos transmembranares, colágenos da membrana basal e outros com

funções únicas. A família mais abundante de colágenos é representada pelos formadores de

fibrilas (von der Mark, 1999; Gelse et al., 2003; Birk et al., 1998).

Os colágenos formadores de fibrilas incluem os colágenos do tipo I, II, III, V e XI, que

são caracterizados pela capacidade em montar agregados supramoleculares, altamente

orientados, com uma estrutura característica contendo fibras com diâmetros entre 25 e 400 nm

(Gelse et al., 2003; Hulmes; Miller, 1981). O colágeno tipo I é o mais abundante, sendo o tipo

mais estudado até hoje. Ele forma mais de 90% da massa orgânica dos ossos e é o principal

colágeno que compõe tendões, pele, ligamentos, córnea e vários tecidos conectivos

intersticiais. O tipo II é o componente predominante e característico da cartilagem hialina, no

entanto, também é encontrado no corpo vítreo, epitélio da córnea, notocorda e em transições

epiteliais mesenquimais embrionárias (von der Mark, 1999). Já o colágeno do tipo III é

amplamente distribuído nos tecidos contendo colágeno I, sendo um componente importante

de fibras reticulares do tecido intersticial dos pulmões, fígado, baço, derme e vasos (Rossert,

2002; von der Mark, 1999). Os tipos V e XI do colágeno formam uma subfamília, dentro da

família dos formadores de fibrilas, o tipo V pode funcionar como uma estrutura de núcleo

para as fibrilas dos tipos I e III, análogo a este modelo, o colágeno do tipo XI, provavelmente,

forma o núcleo das heterofibrilas do colágeno II (Bateman et al., 1996).

Os tipos de colágeno IX, XII, XIV, XVI, XIX, e XX são caracterizados como fibras de

colágeno associadas a triplas hélices interrompidas (FACIT). A estrutura destes tipos

caracteriza-se por apresentar domínios interrompidos não helicoidais curtos, onde as

moléculas estão associadas com a superfície de várias fibrilas. O colágeno tipo IX é

codistribuído com o colágeno tipo II na cartilagem e no corpo vítreo. Os tipos XII e XIV são

semelhantes em estrutura e sequência, ambas as moléculas associam-se com o colágeno do

tipo I na pele, pericôndrio, periósteo, tendões, pulmão, fígado, placenta, e vasos. A função

destes colágenos, bem como dos tipos XIX e XX, no interior do tecido ainda não são bem

compreendidos (Bateman et al., 1996; Gelse et al., 2003; Schuppan et al., 1998).

Outro tipo importante de colágeno é o tipo VI, ele apresenta uma tripla hélice curta e

terminais globulares ao invés de estendidos, este colágeno, após a secreção para a matriz

extracelular, agrega filamentos e forma uma rede microfibrilar independente em praticamente

todo o tecido conjuntivo. Os tipos X e VIII são colágenos de cadeias curtas, onde o colágeno

X é um componente característico da cartilagem hipertrófica no crescimento fetal e juvenil,

em costelas e vértebras, enquanto o tipo VIII encontra-se em algumas células endoteliais, mas

22

sua função ainda não é bem definida. Por fim, o tipo IV é um colágeno de membrana basal,

sendo o mais importante componente estrutural das membranas basais, tem a função de

sustentação e filtração, estando presente nos rins, na lâmina basal e na cápsula do cristalino

(Gelse et al., 2003). A Tabela 1 (abaixo) representa os principais tipos de colágeno, suas

naturezas supramoleculares, localização, patologias associadas a estes tipos e as principais

funções exercidas pelos mesmos.

Tabela 1- Características dos tipos de colágenos mais conhecidos. Adaptado de Raines; Shoulders,

2009.

1.2 INTEGRINA

O controle das interações celulares, em organismos multicelulares, é crucial para

grande parte dos processos biológicos. Estes processos vão desde a embriogênese, as vias de

manutenção das respostas imunes, a integridade dos tecidos e a homeostase. Neste sentido, a

coesão intercelular é crítica para a organização estrutural e comunicação intercelular dentro de

organismos multicelulares (Humphries, 2000; Coller, 1986).

As integrinas são uma família de glicoproteínas transmembranares do tipo I

heterodiméricas, que funcionam como os principais receptores metazoários para a adesão

celular, desempenhando um papel central em funções de suporte físico para a transdução de

sinais, montagem do citoesqueleto de actina, expressão gênica e funções celulares, incluindo a

adesão celular, migração, proliferação, diferenciação e apoptose (Hynes, 2002; Juliano,

Haskill, 1993; Schwartz et al., 1995). Estas glicoproteínas são encontradas em organismos

I Formador de fibrilas Difuso-derme, osso, tendão, ligamento Ostogênese imperfeita Resistência à traçãoII Formador de fibrilas Cartilagem hialina, humor vítreo Osteoartrose, condrodisplasia Resistência à pressãoIII Formador de fibrilas Pele, tecido conjuntivo reticular e músculo liso Síndrome de Ehlers-Danlos Manutenção da estrutura de tecidos IV Formador de uma rede tridimensional Lâminas basais Síndrome de Alport Suporte de estruturas delicadasV Formador de fibrilas Osso, córnea, placenta Síndrome de Ehlers-Danlos Resistência à traçãoVI Formador de uma rede tridimensional Cartilagem, córnea, derme Miopatia de bethlem -VII Ancora fibrilas Derme, membrana basal, bexiga urinária Epidermólise bolhosa adquirida inflamatória Une células do tecido conjuntivoVIII formador de uma rede tridimensional Cérebro, coração, rins Distrofia endotelial de Fuchs -IX Associado a fibrilas tipo III Cartilagem hialina, córnea Osteoartrose, displasia epitelial múltipla Associação lateral das fibrilasX Formador de uma rede tridimensional Cartilagem hialina Condoplasia -XI Formador de fibrilas Cartilagem hialina, disco intervertebral Condoplasia, osteoartrose Resistência à pressãoXII Associado a membranas Hemidesmossomos no epitélio Epidermólise bolhosa -XIII Múltiplos domínios tripa-hélice e interrupções Membrana basal, fígado Síndrome de Knobloch -XIV Associado a membranas Cérebro, coração, testículos Formação de placas de amilóide -XV - Membrana basal, tecido vascular Doenças neurodegenerativa -

Tipo de Colágeno Natureza Supramolecular Localização Patologia Funções

23

como esponjas, corais, nematóides, equinodermes e mamíferos (Burke, 1999). São

heterodímeros compostos por duas subunidades, α e β, não covalentemente associadas

(Campbell, Humphries, 2011). Até o momento, são conhecidas 18 subunidades α e 8

subunidades β, que se combinam para formar, pelo menos, 24 heterodímeros distintos com

diferentes propriedades de ligação e distribuição em diversos tecidos (Hynes, 2002). Cada

heterodímero é formado por um grande domínio extracelular que se liga a proteínas em

ambiente extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracelular, o qual forma

ligações com elementos do citoesqueleto através de proteínas adaptadoras citoplasmáticas

(Hynes, 2002).

As integrinas podem se ligar a glicoproteínas da matriz extracelular (MEC), tais como

colágeno, fibronectinas e lamininas, e também a receptores celulares como, por exemplo, a

molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1) e a família das moléculas de adesão intercelular

(ICAMs) (Hynes 2002; Plow et al., 2000).

A partir do reconhecimento da família de receptores de integrina há cerca de 29 anos

atrás (Hynes, 1987), houve um melhor entendimento a respeito dos receptores de adesão

celular. As integrinas e seus ligantes desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento

da resposta imunológica, no tráfego de leucócitos, na hemostasia, e no câncer, estando,

portanto, no centro de muitas doenças genéticas humanas, autoimunes, entre outras (Hynes,

2002). Eles são o alvo de fármacos terapêuticos contra trombose e inflamação, além disso, são

receptores para muitos vírus e bactérias. Devido ao fato de apresentar múltiplas funções, as

integrinas têm sido estudadas de forma intensiva. Nos últimos anos a elucidação de estruturas

3D da integrina tem permitido uma melhor compreensão da sua estrutura, funções e

interações moleculares que resultam na adesão celular, bem como, são tratadas como

potenciais alvos terapêuticos para diversas doenças (Hynes, 2002; Xiong et al., 2001).

1.2.1 CLASSIFICAÇÃO DAS INTEGRINAS

A especificidade de ligação da integrina com os componentes da matriz extracelular,

incluindo colágenos, lamininas e fibronectinas, entre outros, depende dos domínios

extracelulares das subunidades α e β da integrina. Estas proteínas são classificadas em várias

subfamílias com base nas cadeias β. As integrinas α1β1, α2β1, α10β1, e α11β1 representam

24

os principais receptores do colágeno (Camper et al, 1998; Velling et al., 1999; Hynes, 2002),

as integrinas α3β1, α6β1, α6β4 e α7β1 são conhecidas como os principais receptores de

laminina, já integrinas α5β1, α8β1, αIIbβ3 e αVβ são os principais receptores de fibronectina

que se ligam de uma forma dependente de RGD (Arginina-Glicina-Ácido aspártico) (van der

Flier, 2001; Hynes, 2002). A Tabela 2 resume a diversidade das integrinas em vertebrados.

Algumas integrinas se ligam aos mesmos ligantes extracelulares, porém, com diferentes

afinidades e, alguns ligantes são reconhecidos por diferentes integrinas, por exemplo, a

integrina α1β1 que se liga ao colágeno também se liga a laminina. Grande parte dos

heterodímeros da integrina são amplamente expressos em vários tipos de tecidos, porém,

algumas são mais restritas em sua expressão, pode-se citar como exemplo, a integrina αIIbβ3

que só é encontrada em plaquetas e a integrina α6β4 somente encontrada em células

endoteliais (Hynes, 1987; Hynes, 2002). A Figura 3 representa a classificação da família das

integrinas e seus respectivos receptores.

Figura 3- Classificação da família das integrinas e seus respectivos receptores. Adaptado de Srichai; Zent, 2010.

25

Tabela 2- Principais integrinas encontradas em vertebrados, seus ligantes e seus locais de distribuição. Adaptado

de Hynes, R.O, 1992.

1.2.2 ESTRUTURA DAS INTEGRINAS

Cada uma das subunidades α e β dos heterodímeros de integrina possuem um grande

domínio extracelular onde as subunidades dobram-se em uma porção globular N-terminal

(Figura 4), que se combinam para criar a superfície de ligação ao ligante, também possuem

um domínio transmembranar do tipo I e uma região de curta cauda citoplasmática C-terminal

(com o exceção das subunidades β4) (Shimaoka et al., 2002; Humphries, 2000). O tamanho

das subunidades varia, mas geralmente a subunidade α contem cerca de 750 aminoácidos,

enquanto a subunidade β subunidades contem 1000 aminoácidos (Xiong et al., 2001).

O domínio extracelular das integrinas são, em geral, grandes estruturas de

aproximadamente 80-150 kDa. A maior parte das informações estruturais dos domínios

extracelulares é obtida a partir de dados cristalográficos de alta resolução, como por exemplo,

a cristalografia de raio-X. A primeira estrutura cristalina completa da caracterização do

Integrina Ligante Distribuição celular e tecidual

αvβ1 Laminina, fibronectina, osteopontina Fibroblastos, osteoclastos, células tumorais

αvβ3 Fibrinogênio, vitronectina, tenascina, osteopontina, fibronectina, Vwf* Células endoteliais, plaquetas, leucócitosαvβ5 Vitronectina, osteopontina, fibronectina Células endoteliais,osteoclastos, células epiteliaisαvβ6 Fibrinogênio, vitronectina, tenascina, fibronectina Células epiteliais, células de carcinomaαvβ8 Vitronectina Melanoma, cérebro, ovário, útero, placentaα1β1 Colágeno VI, colágeno I, laminina Condrócitos, células endoteliais

α2β1 Colágeno I, colágeno IV, laminina, Queratinócitos, condrócitos, plaquetas, células endoteliais

α3β1 Laminina, trombospondina Queratinócitosα4β1 Fibronectina, VCAM-1 Leucócitos, células endoteliaisα5β1 Fibronectina, trombospondina Condrócitos, células endoteliaisα6β1 Laminina, trombospondina Condrócitos, células endoteliaisα7β1 Laminina Células musculares diferenciadasα8β1 Fibronectina Células do músculo lisoα9β1 Tenascina, VCAM-1 Queratinócitos, células endoteliaisα10β1 Colágeno Condrócitosα11β1 Colágeno Células mesenquimaisα6β4 Laminina Células endoteliaisαIIIbβ3 Fibrinogênio, fibronectina, vWF* PlaquetasαEβ7 Caderina LeucócitosαXβ2 ICAM-1, fibrinogênio LeucócitosαLβ2 ICAMs LeucócitosαMβ2 ICAM-2, fibronectina LeucócitosαDβ2 VCAM-1, vitronectina Leucócitos

* vWF Fator de von Willebrand

26

domínio extracelular de uma integrina foi publicada em 2001 e, demonstrava a integrina αvβ3

(Xiong, et al, 2001).

O domínio extracelular das subunidades α e β é composto por vários subdomínios

organizados em uma porção globular N-terminal de ligação ao ligante, que se encontra sobre

duas longas e estendidas pernas C-terminais que conectam os domínios transmembranares e

citoplasmáticos das respectivas subunidades (Figura 4), o domínio extracelular encontra-se

dobrado no estado inativo (não ligado a um ligante) e estendido quando está ligada ao algum

ligante (Xiong, et al, 2001).

A análise estrutural das subunidades α revela a existência de sete repetições

homólogas em sua porção N-terminal que se dobram em sete pás em uma β-hélice (Xiong et

al 2001;. Springer 1997). Os resíduos que participam da ligação ao ligante estão agrupados na

superfície superior da β-hélice enquanto os motivos de ligação para regulação de cátions

bivalentes estão expostos na superfície inferior. Metade das subunidades α, como por

exemplo, as de ligação ao colágeno α1, α2, α10 e α11 e as de ligação aos leucócitos αE, αD,

αL, αM e αX, contem um domínio-I que apresenta cerca de 200 resíduos e está inserido na β-

hélice (Shimaoka et al., 2002). O domínio-I é exposto na superfície superior da β-hélice e está

envolvido diretamente no reconhecimento e ligação ao ligante (Kern; Marcantonio, 1998;

Springer, 1997). Dentro do domínio-I há a presença de um sítio de adesão dependente de íon

metálico (MIDAS), que se liga a um cátion metálico bivalente desempenhando papel crucial

na ligação a uma proteína ligante. Essa ligação ao ligante altera a coordenação do íon

metálico deslocando o domínio-I e alterando sua conformação, antes fechada, para uma

conformação aberta, resultando assim em um aumento da afinidade ao ligante e, por

consequência, promovendo a ativação de integrina (Kanazashi et al., 1997; Liddington;

Ginsberg, 2002). O domínio-I é capaz de dobrar-se corretamente sem estar associado a uma

subunidade β (Lu et al., 1998).

A região C-terminal da β-hélice compreende uma região de haste, que se caracteriza

por abranger grande parte do domínio extracelular e pode ser dividido em três domínios

denominados de “coxa”, calf-1 e calf-2. O domínio “coxa” é semelhante a uma

imunoglobulina que, em conjunto com a superfície inferior da β-hélice, cria uma interface

abrangendo dois sítios de ligação ao cálcio na β-hélice. Já os domínios calf-1 e calf-2 são β-

sandwich que juntos formam contatos hidrofóbicos entre os domínios que fecham a estrutura

(Berthet et al., 2000; Lu et al., 1998).

27

A subunidade β é composta por um domínio-I-like, com um MIDAS, que é

estruturalmente semelhante ao domínio-I da subunidade α, um domínio PSI (plexina,

semaforina, integrina) de, um domínio híbrido, quatro repetições EGF (Fator de crescimento

epidérmico) e um domínio cauda- β (βTD). A subunidade β desempenha um papel importante

na ligação ao ligante em subunidades α que não possuem o domínio-I. Nos heterodímeros de

integrina, os ligantes se ligam a uma fenda na porção do domínio que está localizada entre as

interfaces das subunidades α e β. O ligante interage com um MIDAS ocupado que está

localizado dentro da subunidade β e do domínio de hélice da subunidade α (Srichai; Zent,

2010; Morgan et al., 2007).

Figura 4- Arquitetura de domínio de um heterodímero de integrina. Adaptado de Shattil et al., 2010.

O domínio PSI coopera com uma região mais C-terminal, rica em cisteína, que

imobiliza a integrina deixando-a em um estado inativo por meio de uma ligação dissulfeto

(Zang; Springer, 2001; Calvete et al., 1991; Bork et al., 1999). Já o domínio-I-like, das

subunidades β, quando associados a uma subunidade α na qual o domínio-I não esteja

28

presente, age de forma direta na ligação com o ligante. O domínio-I-like também está

envolvido na associação com a subunidade α. A porção EGF tem grande importância na

transdução de sinais e na ativação da integrina (Tsuchida, 1998). Grande parte das

subunidades β apresenta um alto grau de semelhança em suas caudas citoplasmáticas, essa

região é significativa para a adesão focal em trechos treonina/serina e para a ligação com a α-

actina (Otey et al., 1993; Tsuchida, 1998).

Os domínios transmembranares das integrinas são estruturas que possuem cerca de 25

a 29 resíduos de aminoácidos que formam α-hélices espirais enroladas. Diferentemente dos

domínios extracelulares, não há estruturas cristalográficas de alta resolução para este domínio

em qualquer heterodímero da integrina, e grande parte dos dados estruturais são com base na

análise de RMN (Ressonância magnética nuclear) (Lau et al. 2009). Já os domínios

citoplasmáticos da integrina são geralmente curtos, em grande parte não estruturados e

compostos por 10 a 70 resíduos de aminoácidos e, assim como o domínio transmembranar,

também não possuem dados de estruturas cristalográficas de alta resolução (Li et al., 2001).

Entretanto, estudos recentes demonstraram que a região da cauda do domínio citoplasmático

medeia a ligação entre a integrina e o citoesqueleto sendo, portanto, essencial para a maioria

das funções associadas a integrina.

1.2.3 FUNÇÕES DAS INTEGRINAS

No que concerne à função, as integrinas estão envolvidas em uma gama de atividades

biológicas, abrangendo patrulhamento imunológico, migração celular, forma e definição

celular, regulação do ciclo celular, crescimento, invasão, proliferação, diferenciação,

sobrevivência, apoptose e a ligação a determinados vírus (Desgrosellier; Cheresh, 2010;

Assoian; Klein, 2008).

As integrinas atuam como receptores capazes de estabelecer uma comunicação entre a

MEC e a célula. Elas também transportam informação do interior da célula para o

compartimento extracelular. Isso permite a ação de respostas rápidas e flexíveis em ambas as

direções (MEC-célula e célula-MEC). Deste modo, as funcionalidades da integrina podem ser

divididas em duas funções principais: a ligação da célula para a MEC e a transdução de sinal

da matriz para a célula. Outra função importante é a de mediação de eventos de sinalização na

29

célula (Stupack, 2007). As integrinas agem regulando processos complexos no de câncer,

como a angiogênese, crescimento do tumor e metástases (Hynes, 2002; Stupack, 2007).

A integrina α2β1, objeto de estudo neste trabalho, é altamente dependente não só do

tipo de célula, mas de sinais de outras células e do microambiente associado. Grande parte dos

estudos relacionados a esta integrina definem sua importância na adesão plaquetária

(necessárias para a homeostase e na trombose), diferenciação epitelial, morfogênese, na

biologia do tumor, cicatrização de feridas, angiogênese, inflamação e imunidade (Hemler,

1990; Kunicki et al., 1993).

1.2.4 INTEGRINAS E SINALIZAÇÃO

As integrinas são capazes de promover a transdução de sinais intracelularmente, após

a ligação com o ligante (sinalização “outside-in”). Todavia, ao contrário da maioria dos outros

receptores celulares, as integrinas podem alternar entre conformações de alta ou baixa

afinidade para a ligação com o ligante (sinalização “inside-out”). Dependendo do tipo de

célula, as integrinas podem ser ativadas basalmente, assim como a maioria das células de

adesão que estão ligadas a uma membrana basal, ou inativadas basalmente, tal como as

plaquetas e os leucócitos, que circulam livremente até serem ativados para promover a

agregação plaquetária e mediar uma resposta inflamatória, respectivamente (Harburger;

Calderwood, 2009; Hynes, 1992). O heterodímero de integrina αIIbβ3, localizado na

superfície celular das plaquetas, denotam a melhor caracterização de integrinas basalmente

inativas. Nestas células, as integrinas apresentam um estado de baixa afinidade, no que se

refere à ligação a um ligante extracelular, dessa forma, são dependentes de uma sinalização

intracelular para que se tornem ativadas (Harburger; Calderwood, 2009; Lau et al, 2009).

As integrinas não tem atividade de quinase, porém tem a capacidade de fornecer uma

conexão entre a matriz extracelular e o citoesqueleto de actina. Esta conexão permite que as

integrinas regulem a organização do citoesqueleto celular e a motilidade, bem como, alterar

fluxos de muitas vias de sinalização intracelular, incluindo a sobrevivência celular,

proliferação celular, forma da célula e angiogênese (Calderwood, 2004). Os domínios

extracelulares podem se ligar a diversos ligantes, considerando que os domínios

citoplasmáticos intracelulares são âncoras para as proteínas do citoesqueleto. Esta ligação

30

entre o exterior e o interior da célula acarreta em uma sinalização bidirecional através da

membrana plasmática (Figura 5) (Hynes, 2002; Miranti; Brugge, 2002).

Figura 5- Modos de sinalização celular da integrina. Adaptado de Shattil et al., 2010.

1.2.5 SINALIZAÇÃO INSIDE-OUT

A sinalização inside-out, ou ativação da integrina, tem grande importância em eventos

fisiológicos, tal como nas células sanguíneas, onde as mesmas estão em estreita proximidade

com seus ligantes, porém, as interações ocorrem apenas após a ativação da integrina em

resposta específica a estímulos externos, como por exemplo, um dano à vasculatura ou um

processo de indução da inflamação (Ratnikov et al., 2005; Miranti; Brugge, 2002). As

plaquetas e os leucócitos são os sistemas mais bem caracterizados quanto ao estudo da

ativação de integrinas, todavia a ativação desta proteína é um evento primordial para muitos

tipos celulares (Calderwood, 2004).

31

No estado inativo, os domínios extracelulares da integrina estão desacoplados a

qualquer ligante e, encontram-se em uma conformação dobrada. Os sinais de ativação, a partir

de dentro da célula, induzem o endireitamento dos domínios extracelulares e proporcionam

uma mudança conformacional, de modo que estes fiquem estendidos e, portanto, ativos (Luo

et al., 2007). Esta mudança conformacional determina a exposição do local de ligação ao

ligante externo, permitindo assim, a transmissão de sinais do exterior para o interior da célula.

Os domínios transmembranares, por sua vez, desempenham papel fundamental na ativação da

integrina. Estudos tem demonstrado que a dissociação das subunidades α e β do complexo

transmembranar é crucial para as alterações conformacionais extracelulares associadas com a

sinalização da integrina (Lau et al., 2009). As informações a respeito da sinalização da

integrina, descritas até o momento, retratam uma rede de 156 componentes, ligados através de

cerca de 690 interações, que compõem o complexo de adesão da integrina (Zaidel-Bar et al.,

2007).

Uma proteína que possui papel fundamental na ativação da integrina é a talina. A

talina é uma proteína de ligação à actina, que se liga ao motivo NPxY (N é Asparagina, P

representa a Prolina, x é um aminoácido qualquer e Y é a Tirosina) em caudas citoplasmáticas

β. Esta proteína apresenta um domínio de cabeça globular com uma porção N-terminal de

50kDa e uma haste C-terminal, contendo um domínio conservado de ligação a actina, de

aproximadamente 220k. Ela contém sítios de ligação para a actina, vinculina, kinase de

adesão focal, fosfolipídeos e proteínas transmembrana, sendo responsável por mediar a

ligação da membrana celular ao citoesqueleto por meio da actina (Critchley; Gingras, 2008).

Como dito anteriormente, a talina é um mediador essencial na ativação da integrina, esse fato

tem sido demonstrado a partir do estudo da ativação das integrinas αIIbβ3 (Calderwood et al.,

2002). A ativação de integrina pela talina ocorre, provavelmente, por competição com a cauda

αIIb para a ligação com β3, na integrina αIIbβ3. Um dos subdomínios da talina se assemelha a

um domínio de ligação à fosfotirosina (PTB) que liga-se, obrigatoriamente, ao motivo

proximal de membrana NpxY das caudas β da integrina, este fato leva á desestabilização de

uma ponte salina da integrina. A consequência disto é uma mudança na posição da hélice

transmembranar, acarretando, por sua vez, a uma incompatibilidade no acondicionamento

desta hélice em αIIbβ3 e, a reorientação das caudas da integrina (Luo et al., 2004, 2007; Yin

et al., 2006; Loh et al., 1996; Partridge et al., 2005). Estes eventos resultam em uma alteração

conformacional do domínio extracelular, conduzindo a um aumento da afinidade ao ligante e,

assim, a ativação da integrina. (Wegener et al., 2007).

32

A ligação das integrinas à talina é bastante regulada, visto que, o processo de ativação

da integrina é rigorosamente controlado. Em condições fisiológicas normais, a talina

encontra-se em um estado de autoinibição, incapaz de se ligar as integrinas, já que a porção

C-terminal da talina interage com o domínio PTB da mesma, bloqueando o sítio de ligação à

integrina (Goldmann et al., 1994). Os mecanismos de ativação da talina não são bem

compreendidos, mas provavelmente envolvem a fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2), um

segundo mensageiro de lipídeos. A talina se liga e ativa PIPKIγ (fosfatidilinositol-4, 5 fosfato

quinase γ tipo I) acarretando em um aumento da produção de PIP2. PIP2, por sua vez, regula

talina, vinculina e outras proteínas de adesão focal (FA), levando a ativação da integrina,

reforço do citoesqueleto, sinalização intracelular, e a formação de FA (Sakai et al., 2001).

Ainda que esteja comprovada a necessidade da talina para a ativação da integrina,

diversos estudos indicaram que outros fatores de ativação podem cooperar com a talina. Esses

fatores englobam a observação de sensibilidade diferencial entre integrinas na ativação por

talina e o envolvimento de domínios adicionais de talina na ativação de integrina (Bouaouina

et al., 2008). Pode-se citar como exemplo a família das proteínas kindlins, que desempenham

um papel importante na sinalização inside-out, já que possuem um subdomínio PTB-like

semelhante ao da talina, ligando-se ao motivo NPxY em caudas β da integrina (Kloeker et al.,

2003; Montanez et al, 2008; Moser et al., 2008).

1.2.6 SINALIZAÇÃO OUTSIDE-IN

As integrinas por si próprias não têm atividade catalítica intrínseca. A ligação ao

ligante no domínio extracelular das mesmas promove a transdução do sinal para o citoplasma,

na direção de fora para dentro. Estes sinais intracelulares afetam o crescimento celular,

diferenciação e apoptose. A sinalização é complexa e consideravelmente influenciada pela

interferência dos receptores de fator de crescimento (Figura 6). Além disso, os sinais

intracelulares gerados levam à montagem do complexo FA, uma grande dinâmica

multiproteína que envolve mais de 150 complexos de proteínas intracelulares (Zaidel-Bar et

al., 2007). Os fatores de adesão focal (FAs) promovem um eixo para a transmissão de sinais

intracelulares. Dentro dos FAs, as proteínas estão em constante fluxo, agregando-se e

dissociando-se umas das outras incessantemente (Harburger; Calderwood, 2009).

33

Figura 6- Sinalização mediada por integrinas. Adaptado de Miranti; Brugge, 2002.

A ligação a um ligante extracelular leva a integrina a um agrupamento no plano da

membrana plasmática e, a geração de FAs, que promovem a montagem de filamentos de

actina. Os filamentos de actina são reorganizados em fibras de tensões maiores, levando a

uma maior aglomeração da integrina e aumento da ligação a matriz (Giancotti; Ruoslahti,

1999). Assim, a ligação da integrina ao citoesqueleto de actina permite a regulação do

crescimento de FA, bem como a regulação da forma da célula durante a migração celular.

Várias proteínas de adesão focal estão envolvidas no estabelecimento e manutenção da

ligação da integrina ao citoesqueleto. Dentre estas proteínas pode-se citar: as proteínas ligadas

à integrina que se ligam diretamente a actina (talina, α-actinina, filamina); as proteínas ligadas

à integrina que se ligam indiretamente o citoesqueleto (kindlins, quinase ligada a integrina -

ILK, paxilina, quinase de adesão focal - FAK); as proteínas de ligação a actina não integrinas

(vinculina); e as moléculas adaptadoras e sinalizadoras que regulam as interações entre as

proteínas dos grupos indicados anteriormente (Geiger et al. 2009; Legate et al. 2009).

A ligação inicial entre a integrina e o citoesqueleto envolve o recrutamento de talina

para β integrinas. A talina fornece uma ligação para a actina que é essencial para o

citoesqueleto (Monkley et al., 2000). Após a ligação à talina, proteínas tal como a vinculina

são recrutadas para o local de adesão focal inicial. A vinculina não se liga diretamente às

34

integrinas, ela liga-se a vários sítios na haste da talina e, provavelmente, atua como um

intermediador de reticulação que estabiliza a interação entre talina e actina (Gallant et al.,

2005; Humphries et al., 2007; Saunders et al., 2006). A α-actinina é outra proteína crítica que

liga as integrinas ao citoesqueleto de actina, ela pode ligar-se diretamente as β integrinas

agindo em associação à actina, estudos tem demonstrado que a α-actinina tem um papel

primordial no fortalecimento da adesão (Brakebusch; Fassler, 2003). Já a quinase ligada a

integrina (ILK) é outra proteína importante, que liga as integrinas ao citoesqueleto de actina.

A ILK também se liga ao seu citoesqueleto através associações com paxilina (Legate et al.,

2006). As células deficientes em ILK apresentam graves atrasos na formação de aderência

focal (Sakai et al., 2003). No mesmo sentido, as quinases de adesão focal (FAK) são proteínas

de sinalização que, provavelmente, interagem indiretamente com β integrinas através de sua

associação com paxilina (Geiger et al., 2009;. Brakebusch; Fassler, 2003). Embora não seja

necessária para a adesão focal ou para a ligação inicial das integrinas ao citoesqueleto de

actina, a FAK é responsável por estabilizar a ligação à actina por modulação da afinidade de

α-actinina com a actina (Ilic et al., 1995).

As integrinas desempenham um papel fundamental na polimerização da actina e na

dinâmica do citoesqueleto, assim, é imprescindível a ligação física entre integrinas e actina

para que estes processos ocorram (Butler et al., 2006). Os mecanismos subjacentes a estes

eventos ainda não são completamente compreendidos, no entanto, sabe-se que toda

maquinaria necessária para a polimerização de actina inclui o complexo Arp2/3, o qual

controla a montagem de uma rede de filamentos de actina através da sua função de nucleação

de actina, GTPases Rho, que desempenham papel relevante na regulação global da dinâmica

da actina. Também há a participação de proteínas como: Rac que aumenta a disponibilidade

de actina livre (Jaffe; Hall, 2005; Kiosses et al., 2001); Cdc42 (ciclo de divisão celular 42)

que é uma proteína do ciclo celular, que regulada a polaridade celular (Legate et al., 2006).

A sinalização outside-in interage com os fatores de crescimento promovendo o

controle das vias de sinalização intracelulares. Logo, as integrinas podem produzir sinais a

partir de estímulos localizados na MEC, assim como também integram sinais mecânicos e

químicos devido à sua associação direta com o citoesqueleto (Legate et al. 2009). Por

exemplo, a estimulação do fator de crescimento e a adesão mediada pela integrina, juntas,

aumentam a intensidade e a duração da ativação extracelular da quinase regulada por sinal

extracelular (ERK). Além disso, a fosforilação do receptor do fator de crescimento

epidérmico (EGF) é mais intensa quando ativada por adesão celular. Isto implica que a

35

ativação da integrina induz a agregação de receptores de fatores de crescimento incluindo o

EGF, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e o fator de crescimento de

fibroblastos (FGF). A ativação das vias de sinalização junto às integrinas é extremamente

complexa e difere dependendo do tipo de células e condições fisiológicas envolvidas

(Harburger; Calderwood, 2009).

1.2.7 LIGAÇÃO ENTRE INTEGRINA E COLÁGENO

A maioria dos pares de integrina-ligante foram identificados por cromatografia de

afinidade ou através da capacidade dos anticorpos monoclonais em bloquear a adesão de

células a ligantes específicos. Em alguns casos, os ensaios de ligação direta proteína-proteína

tem sido utilizados para suportar os dados biológicos ou bioquímicos das células. Apesar de

sua ampla variedade, é possível agrupar combinações integrina-ligante em quatro classes

principais, refletindo a base estrutural da interação molecular (Humphries et al., 2006).

Os estudos realizados até o momento comprovaram que existem quatro integrinas que

se ligam a colágenos tripla hélice intersticiais, são elas, α1β1, α2β1, α10β1 e α11β1 (Santoro

et al., 1994).

A ligação do colágeno à célula é mediada pela integrina e envolve a adesão plaquetária

na parede vascular, a manutenção da integridade do tecido e as interações entre a matriz

extracelular, o que caracteriza as interações integrina-colágeno como eventos importantes

para a manutenção fisiológica. Essas interações promovem uma ampla variedade de funções

biológicas vitais específicas tais como, desenvolvimento embrionário, cicatrização de

ferimentos, regulação celular durante a metástase em determinadas neoplasias malignas, entre

outras (Gullberg; Lundgren-Akerlund, 2002).

As integrinas α1β1 e α2β1 foram identificadas como receptores de colágeno em uma

gama de abordagens, incluindo, por exemplo, a caracterização de distúrbios hemorrágicos

genéticos, e a função de bloqueio de anticorpos monoclonais (Hynes, 2002; Shimaoka et al.,

2002). As interações entre colágenos e integrinas são dependentes de um cátion bivalente,

sendo promovidas por um magnésio ou manganês, e inibidas pelo cálcio (Hynes, 2002).

36

1.2.8 SÍTIOS NO COLÁGENO PARA LIGAÇÃO À INTEGRINA

Estudos a respeito de proteínas adesivas que se ligam a integrina demonstraram que

estas proteínas poderiam ser reduzidas, proteolicamente, a fragmentos curtos contendo

atividade adesiva, este fato demonstra que alguns peptídeos apresentam um motivo adesivo,

como por exemplo, o motivo RGD e o motivo GFOGER (Glicina-Fenilalanina-

Hidroxiprolina-Glicina-Glutamato-Arginina) (Knight et al., 2000; Lu et al., 2001). As

recentes tentativas em identificar os sítios de ligação do colágeno à integrina abordam a ação

de fragmentos que dependem de uma conformação específica.

Grande parte das interações entre células e colágeno são apoiadas no fragmento CB

desta molécula. A fixação das células ao colágeno I ocorrem nos fragmentos α1(I)CB3 e

α1(I)CB8 e a ligação a ambos os fragmentos é dependente de α1β1. Já os fragmentos

α1(I)CB3, α1(I)CB7 e α1(I)CD8, são dependentes da adesão a α1β1 (Gullberg et al., 1990).

Staatz et al (1990) analisaram uma gama de fragmentos de colágeno tipo I e descreveram que

o fragmento CB3 é o maior responsável pela ligação dependente de magnésio nas células

plaquetárias e, a ligação a este fragmento foi inibida, em experimentos, a partir da ação de um

anticorpo anti-integrina.

Já para o colágeno IV, testes identificaram um fragmento estabilizado denominado

CB(IV) cujo o qual é dependente da ligação a α1β1 e α2β1. Anticorpos para este fragmento

inibiram em até 80% a adesão do colágeno à célula (Vandenberg et al., 1991). O colágeno VI,

por sua vez, também liga-se as integrinas α1β1 e α2β1, entretanto, ainda não se sabe quais

fragmentos são relevantes para a ocorrência desta interação (Tuckwell; Humphries, 1996).

A integrina α2β1 desempenha um papel essencial na adesão das plaquetas ao colágeno

na parede do vaso sanguíneo (Knight et al., 2000). Esta adesão depende de um colágeno com

conformação de tripla hélice, sendo importante na homeostase. Estudos revelaram que a

fragmentação do colágeno tipo I indica a presença de vários de locais de ligação a integrina

α2β1, apontando a alta afinidade entre eles. Particularmente, o fragmento CB3 foi detectado

como fundamental no apoio a adesão plaquetária (Knight et al., 2000; Tuckwell; Humphries,

1996). Essa ligação entre o colágeno e a integrina α2β1 ocorre por meio do reconhecimento

da sequência GFOGER contida no colágeno. A sequência GFOGER é encontrada nos tipos I,

II e XI do colágeno e é unicamente capaz de se a ligar integrina α2β1, sem ativação prévia

37

(Knight et al., 2000), sugerindo que a sequência é capaz de induzir a conformação ativa sem

os sinais inside-out necessários para outras sequências de reconhecimento.

1.2.9 SÍTIOS NA INTEGRINA PARA LIGAÇÃO AO COLÁGENO

O domínio-I das subunidades α das integrinas tem grande importância na ligação ao

colágeno, estudos sugerem que este domínio é fundamental na ligação das integrinas α1β1 e

α2β1 ao colágeno. A porção α2 do domínio-I é especialmente importante na ligação ao

colágeno I. Estruturas cristalinas demonstram a presença de um cátion bivalente na ligação ao

domínio-I, isto levou a uma proposição na qual a ligação do ligante a este domínio, ocorre

através da coordenação pela ligação a um aspartato ou a um glutamato, por um domínio

MIDAS (Sítio de adesão dependente de íon metálico). Estudos sugerem que os cátions

bivalentes não estão fisicamente envolvidos com o complexo domínio-I-ligante, porém

regulam um equilíbrio entre os estados ativo e inativo do domínio-I (Calderwood et al., 1995;

Tuckwell; Humphries, 1996). O domínio MIDAS está presente em todas as integrinas, mas os

modos de ligação e as características do ligante, que pode ser reconhecidos na presença ou

ausência de um domínio I, em α, são diferentes. O íon metálico do MIDAS é ligado a resíduos

do domínio I. (Donoghue; Purnell, 2005).

Ainda nas subunidades α, há a presença de sete repetições homólogas, em sua porção

N-terminal, que determinam a especificidade de ligação ao colágeno, embora não se saiba a

partir de qual mecanismo isto ocorre (Tuckwell; Humphries, 1996). A subunidade β, também

tem sido analisada como um provável local de ligação com o colágeno. Estudos utilizando a

integrina αIIβ3 e a ligação RGD, identificaram uma sequência de "região conservada" como

fundamental para a ligação ao ligante (D’Souza et al., 1998).

1.2.10 PATOLOGIAS ASSOCIADAS À AÇÃO DAS INTEGRINAS

Em virtude da ação das integrinas na movimentação e adesão de leucócitos, no

controle imunológico, na mediação da renovação dos tecidos e também no processo de

migração celular (Ferraz; Fernandez, 2014; Friedl et al., 2010), muitas disfunções humanas

38

incluindo, câncer e imunodeficiências hereditárias podem ser relacionadas com a mudança

nos padrões de adesão e movimentação celular mediada pelas integrinas (Ferraz; Hernandez,

2014). Entretanto, embora as integrinas participem do processo fisiopatológico em várias

doenças, a determinação do papel das integrinas nestes processos é difícil, visto que muitas

doenças tem causas multifatoriais. Além do que, algumas células apresentam diversas

integrinas que possuem propriedades de ligação complementares (Cox et al., 2010).

Representações genéticas de deleção ressaltam a influência da integrina sobre o

organismo, assim como a atribuição exclusiva de cada subunidade da molécula. Neste sentido,

muitas doenças genéticas humanas podem fornecer provas explícitas da relevância clínica das

integrinas (Ferraz; Hernandez, 2014). Na Síndrome da deficiência de aderência de leucócitos

(LAD I), por exemplo, onde os pacientes manifestam infecções bacterianas persistentes e

recorrentes além de leucocitose acentuada entre episódios infecciosos, há uma disfunção

envolvendo as subunidades α1, α2 e α3, provocando, assim, um defeito na sinalização de

algumas moléculas (Alon et al., 2003). Várias outras doenças, tais como colite espontânea,

distrofia muscular congênita e algumas imunodeficiências, estão associadas a defeitos nas

integrinas.

Estudos recentes tem demonstrado que a ação das integrinas é determinante para a via

de cooperação na sobrevivência das células cancerígenas e na resistência à quimioterapia. Os

processos que envolvem a ação da integrina no câncer são a angiogênese e a metástase.

Durante a angiogênese, a síntese de proteínas é regulada negativamente pela hipóxia celular,

diminuindo a proliferação e a migração. Porém, nas células de câncer de mama, por exemplo,

há a expressão da integrina αVβ3, permitindo a reversão do efeito da hipóxia, facilitando a

invasão das células tumorais (Liotta et al., 1991).

Habart et al (2013) afirma que deleções seletivas em α2 provocam redução do volume

de plaquetas, afetando sua função. Grenache et al (2007) e Zweers et al (2007), destacaram a

importância da integrina α2β1 na neoangiogênese, onde camundongos com deleções em α2

apresentaram uma redução da neoangiogênese durante o processo de cicatrização. Já Kunicki

e Nugent (2010) observaram que mutações em uma determinada região de α2 provoca um

risco aumentado de infarto do miocárdio, provocada pela regulação anormal de plaquetas.

Estudos relacionados a metástase, em células tumorais, revelaram que a alta expressão de

α2β1 pode estar relacionada com a aceleração da metástase em modelos experimentais de

melanoma, câncer de estômago e câncer de cólon (Baronas-Lowell et al., 2004; Bartolomé et

al., 2014.; Matsuoka et al., 2000).

39

1.3 MODELAGEM MOLECULAR

Em ciência os modelos servem, antes de tudo, para simplificar a análise de fenômenos

que são de grande importância, propiciando uma ilustração didática de circunstâncias muito

complicadas, que não são facilmente acessíveis. Neste sentido, a modelagem molecular

consiste em um conjunto de ferramentas para a construção, edição e visualização, análise e

armazenamento de sistemas moleculares complexos que permitem estabelecer relações entre a

estrutura e as propriedades da matéria (Barreiro et al., 1997, Kitano, 2002; Santos, 2001).

A aplicação de modelos teóricos para representar e manipular a estrutura de moléculas,

estudar reações químicas e estabelecer relações entre a estrutura e propriedades da matéria

constituem o domínio de atuação da modelagem molecular (Freitas, 1998). A técnica também

permite a análise conformacional, cálculos de propriedades estéreo-eletrônicas e análises de

variações estruturais que auxiliam na interpretação das correlações entre as estruturas

químicas de uma série de compostos com a variação da atividade farmacológica. (Drews,

2000; Drews, 2003).

Os métodos utilizados em modelagem molecular baseiam-se nas leis físicas que

governam os átomos e moléculas, permitindo simular o seu comportamento (Drews, 2000).

Assim, se quisermos entender a nível molecular de que modo uma proteína, por exemplo,

realiza a sua tarefa no nosso organismo, a simulação pode nos fornecer pistas sobre quais

domínios de uma proteína estão diretamente envolvidas nessa tarefa, bem como as

consequências da modificação desses domínios (Campos, 2009). A partir deste fundamento,

estudos realizados por meio da modelagem em moléculas isoladas ou complexos droga-

receptor permitem prever e descrever várias características destas estruturas, expondo dados

que estejam próximos aos valores determinados experimentalmente (Santamaria et al., 1998),

tais como propriedades geométricas e energéticas, propriedades termodinâmicas e

propriedades eletrônicas (Leach, 2001).

Há muitas opções quanto aos métodos de cálculo a serem aplicados em uma

determinada estratégia de modelagem molecular. Estes métodos basicamente diferem quanto

à natureza do campo de força, ou seja, do conjunto de funções de energia e parâmetros

numéricos associados (Boyd, 1990).

40

A utilização de métodos computacionais no estudo de proteínas tem se tornado uma

prática rotineira nos dias atuais. Entretanto, é necessário enfatizar que o uso de modelagem

molecular não é uma tarefa simples. O processo de modelagem dessas moléculas, devido à

sua complexidade, emprega um grande conjunto de métodos computacionais de modo

sistemático, de forma a facilitar e otimizar o processo (Santos-Filho; Alencastro, 2003). É

nesta abordagem que a modelagem molecular se faz importante. Devido aos baixos custos

operacionais e grande versatilidade, suas metodologias são fundamentalmente aplicadas na

predição das estruturas terciárias e no processo de enovelamento de proteínas (Dill et al.,

2007).

41

CAPÍTULO 2

OBJETIVOS

42

No que concerne as informações citadas no capítulo anterior, as técnicas de análise

computacional são importantes ferramentas para o estudo de sistemas biológicos complexos.

Assim, este trabalho tem como objetivo, realizar uma análise ab initio da interação entre a

integrina α2β1 e um fragmento de colágeno com a sequência (GFOGER).

2.1 OBJETIVOS GERAIS

Este trabalho pretende, como objetivo geral, apresentar uma investigação quântica

para determinar a interação entre o domínio-I α2 da integrina α2β1 e o colágeno com uma

sequência GFOGER, pretendendo assim, identificar os resíduos de maior importância nesta

ligação, bem como avaliar as peculiaridades que envolvem o complexo integrina-colágeno.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Quantificar as energias de interação entre os resíduos do domínio-I α2 da integrina e

os resíduos do colágeno GFOGER.

• Identificar os resíduos mais importantes, tanto da integrina quanto do colágeno, para a

interação.

• Mapear a energia de interação do metal de coordenação com os resíduos das

macromoléculas envolvidas.

• Descrever com base na Teoria da Densidade Funcional (DFT) as interações mais

pertinentes entre os resíduos do colágeno e da integrina, caracterizando os tipos de

interação que acontecem e avaliá-los de acordo com a sua importância.

• Realizar uma comparação dos dados obtidos com os dados descritos na literatura.

43

CAPÍTULO 3

MATERIAIS E MÉTODOS

44

Aqui, serão abordadas as diretrizes metodológicas e os aspectos computacionais

relacionados à descrição das interações entre a integrina α2β1 e o colágeno. A estrutura

utilizada como modelo foi ajustada e as energias de interação entre os resíduos componentes

da integrina e seu ligante (colágeno) foram determinadas com base na Teoria do funcional da

Densidade (DFT) a partir da técnica de Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas

(MFCC).

3.1 OBTENÇÃO DA ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA

A estrutura cristalográfica utilizada como input para a realização dos cálculos do estudo in

silico foi obtida a partir do banco de dados Research Collaboratory for Structural

Bioinformatics - Protein Data Bank (RCSB/PDB). Este repositório contém informações sobre

estruturas 3D de moléculas biológicas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos. A estrutura

cristalográfica é identificada com o código 1DZI e caracteriza o complexo do domínio I das

integrinas do tipo α2β1 com uma cadeia tripla hélice do colágeno que possui o motivo

GFOGER (Glicina-Fenilalanina-Hidroxiprolina-Glicina-Ácido glutâmico-Arginina), além

destas proteínas, há também um íon metálico de coordenação que representa o domínio

MIDAS. Para fins da análise realizada neste trabalho fez-se necessário modificar o metal de

coordenação da estrutura cristalográfica 1DZI, onde o metal de coordenação original é o

����, foi feita a troca pelo Mg��.

A determinação da estrutura do cristal envolve a descrição da disposição no espaço de

todas as entidades químicas existentes na amostra, assim para a prescrição do cristal 1DZI foi

utilizada a técnica de difração de raio-X. Esta técnica permite a exploração do efeito da

interação radiação-matéria, em um contexto de influência elástica entre elementos com

dimensões espaciais semelhantes, com a produção de inúmeros elementos de interferência em

determinadas posições do espaço (Massa, 2004). A estrutura apresenta uma resolução de

2.1Å.

45

3.2 OTIMIZAÇÃO DA ESTRUTURA E SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL

A otimização da estrutura foi realizada utilizando-se o método híbrido QM/MM

(Mecânica Quântica/Mecânica Molecular, do inglês Quantum Mechanics/Molecular

Mechanics), em duas camadas utilizando a ferramenta ONIOM (do inglês, Our own N-

layered Integrated molecular Orbital and Molecular Mechanics) disponível no software

Gaussian09 (Frisch et al., 2009) empregado para melhor lidarmos com o tamanho da

estrutura e garantirmos a acurácia dos resultados pelo uso de métodos quânticos. Através

desse método, o sistema pode ser subdividido em um número infinito de camadas e, diferentes

níveis de teoria podem ser aplicados individualmente a cada camada. Para a camada QM

(Mecânica Quântica) empregou-se o funcional de troca-correlação híbrido M06-2X e o

conjunto de base 6-311+G (d, p) para expandir os orbitais eletrônicos. O campo de força

AMBER (do inglês, Assisted Model Building with Energy Refinement) foi utilizado para

realizar os cálculos MM (Mecânica Molecular) dentro de um esquema de incorporação

eletrônica. Assim, o delineamento definiu que o íon Mg��, e 8Å ao seu redor foram deixados

livres para se mover e, para a região QM foram selecionados os aminoácidos da integrina e do

colágeno dentro de um raio de 5Å em torno do íon. (Figura 7).

Figura 7 - Representação da aplicação do método QM/MM, onde a região com o raio de 5Å corresponde a

região QM e a região de 8Å corresponde a região MM. Elaborada pela autora.

46

Os átomos de hidrogênio apresentam densidade eletrônica mínima, sendo portanto não

identificados, ou ainda, identificados incorretamente nos arquivos de coordenadas

cristalográficas. Apenas cristais com resolução menores que 1,20Å oferecem estrutura para a

visualização dos átomos de hidrogênio. Portanto, os hidrogênios foram adicionados as suas

posições e, posteriormente otimizados utilizando-se o módulo Forcite do pacote de softwares

Acelerys Materials Studio (Delley, 1990) com o forcefield COMPASS.

Os procedimentos de cálculo foram realizados dentro do formalismo da Teoria do

Funcional da Densidade (DFT). Utilizou-se o módulo Dmol3 incluso no software Materials

Studio, fazendo uso da Aproximação do Gradiente Generalizado (GGA) como potencial de

troca e correlação, aliado ao funcional PBE (Perdew, Burke, Ernzerhof, 1996), juntamente

com uma base de precisão numérica dupla mais polarização (DNP) para expansão das funções

de onda de Kohn-Sham.

3.3 DETERMINAÇÃO DAS ENERGIAS DE INTERAÇÃO

Primeiramente fez-se necessário estabelecer limites para as interações entre a integrina

e o colágeno, assim determinou-se um raio de 8Å em torno dos resíduos das cadeias do

colágeno, partindo de cada aminoácido de interesse, a fim de englobar os resíduos da

integrina. Como há a presença de um metal de coordenação na estrutura e, levando-se em

consideração a importância deste metal para a interação entre determinados resíduos, o

cálculo foi realizado a partir do metal Mg��interagindo com dois aminoácidos que interagem

diretamente com o mesmo, que são Thr221 (resíduo da integrina) e Glu33 (resíduo do

colágeno).

Os cálculos energéticos foram realizados utilizando-se uma metodologia da Mecânica

Quântica ab initio, com base no DFT, o MFCC - método de Fragmentação Molecular com

Capas Conjugadas. Este método permite cálculos envolvendo proteínas, DNA e outras

macromoléculas biológicas, visando fornecer informações precisas a respeito das energias de

interação moleculares. A idéia central do método MFCC é a partição da energia de interação

entre moléculas de proteína em quantias individuais de interação que podem ser facilmente

calculadas. Notadamente, a proteína é decomposta em fragmentos de aminoácidos cujas

extremidades recebem porções de seções vizinhas. Assim, a energia de interação entre uma

47

proteína e uma molécula pode ser obtida por instrumento de combinações de energias de

interação entre fragmentos individuais do sistema analisado, permitindo ainda, uma

representação do ambiente local durante a fragmentação individual. O MFCC possibilita uma

maior eficiência computacional e tem importância significativa no estudo de sistemas

biológicos complexos (Zhang; Zhang, 2003; Zhang; Zhang, 2005; Gordon et al., 2011).

Baseando-se no fato de que a identificação das interações entre os resíduos foi

realizada utilizando-se um raio de 8Å a partir de cada aminoácido de interesse da molécula do

colágeno (Ri), englobando aminoácidos (Rj) da integrina, o fracionamento do sistema

cumprindo o método MFCC pôde ser iniciado. Para cada Ri foram integrados quatro

fragmentos. O primeiro, Ci-1RiCi+1 - Cj-1RjCj+1, é formado pelos resíduos Ri (colágeno) e Rj

(integrina), juntamente com seus aminoácidos vizinhos (Ci-1/Ci+1 e Cj-1/Cj+1). Em outro

momento, o resíduo da integrina foi retirado Rj, obtendo-se Ci-1RiCi+1 - Cj-1Cj+1 (segundo

fragmento). Posteriormente, o resíduo Ri também retirado apresentando o terceiro fragmento

Ci-1Ci+1 - Cj-1RjCj+1. Por fim, excluiu-se os resíduos Ri e Rj, logrando o quarto e último

fragmento que é composto apenas pelos aminoácidos vizinhos aos resíduos, Ci-1Ci+1 - Cj-

1Cj+1. Estes resíduos vizinhos são as denominadas “capas” constituintes do MFCC. Estas

“capas” são anexadas no intuito de preservar a valência das ligações, bem como, imitar o

ambiente local das moléculas.

A partir do exposto, as energias de interação entre os resíduos do colágeno e da

integrina foram calculadas utilizando-se a seguinte equação:

E (Ri-Rj) = E(Ci-1RiCi+1-Cj-1RjCj+1)- E(Ci-1RiCi+1-Cj-1Cj+1) -E(Ci-1Ci+1-Cj-1RjCj+1) +

E(Ci-1Ci+1-Cj-1Cj+1) (1)

Ou seja, E(Ci-1RiCi+1-Cj-1RjCj+1) refere-se a energia total do conjunto constituído pelos

resíduos Ri Rj, que interagem de forma recíproca e seus aminoácidos vizinhos, já o termo

E(Ci-1RiCi+1-Cj-1Cj+1) refere-se à energia do resíduo Ri com suas “capas” Ci-1Ci+1,

simultaneamente com a energia das “capas” de Rj, Cj-1Cj+1. Enquanto isso, E(Ci-1Ci+1-Cj-

1RjCj+1), é a energia do conjunto constituído por Rj e vizinhos, e finalmente, o último termo

E(Ci-1Ci+1-Cj-1Cj+1) representa a energia da porção formada pelas “capas” de Ri e Rj (Figura

8).

48

Figura 8 - Representação esquemática da aplicação do método MFCC. Os quadros apresentam os quatro

conjuntos do fracionamento. Elaborada pela autora.

Ainda sobre o cálculo das energias de interação, como o ambiente é composto por

moléculas de água fez-se necessário caracterizar o microambiente de solvatação. Assim, cada

molécula de água foi inserida, considerando-se o resíduo mais próximo com o qual realizasse

ligação de hidrogênio.

49

CAPÍTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSÕES

50

Como descrito anteriormente, a interação das células com moléculas da matriz

extracelular (MEC) influenciam muitas atividades celulares. Para muitas proteínas da MEC,

as células podem interagir com duas ou mais regiões distintas dentro da mesma

macromolécula. Para compreendermos os mecanismos moleculares responsáveis pela

modulação da MEC e pelas funções celulares, é essencial identificar e caracterizar os sítios

receptores, bem como investigar os receptores específicos que se ligam a estes locais, assim

como também, analisar as interações que ocorrem nestes sítios (Hynes, 1987; 1992).

A integrina α2β1, também conhecida como VLA-2, GPIa-IIa, CD49b, foi pela

primeira vez identificada como um receptor de matriz extracelular para colágenos e lamininas

(Kamata et al., 1999). Reconhece-se agora que a integrina α2β1 serve como um receptor para

muitas moléculas de matriz e moléculas não pertencentes a matriz. Extensas análises tem

elucidado os motivos estruturais do domínio-I em α2, necessários para a ligação ao ligante.

Os mecanismos pelos quais a integrina α2β1 desempenha um papel fundamental na fisiologia

humana, bem como no desenvolvimento de doenças vem sendo definida através de análises in

vitro e in vivo, porém há poucos estudos in silico, dentro da abordagem da modelagem

molecular, para determinação da ligação desta integrina a um ligante (Knight et al., 2000).

Tendo em vista a importância da integrina α2β1 e sua ligação ao colágeno, avaliamos

aqui, os resultados da interação entre este tipo de integrina e um colágeno tripla hélice,

tomando-se como base os dados cristalográficos do PDB 1DZI (Figura 9). Esta estrutura

cristalográfica apresenta um domínio-I da subunidade α2 da integrina. Apresenta também

fragmento de colágeno tripla hélice contendo, em suas cadeias, 21 resíduos, dentre os resíduos

identifica-se a sequência GFOGER (Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg). Há também um íon

metálico que age como metal de coordenação para o motivo MIDAS, este íon interage

diretamente com um ácido glutâmico do colágeno (Glu33) e uma treonina da integrina

(Thr221). Como relatado no capítulo anterior o metal de coordenação original do cristal, o

cobalto (����), foi substituído pelo ����, esta ação foi necessária, visto que o metal molda

interações do meio e o magnésio é descrito na literatura como o íon metálico mais efetivo,

quando presente na região MIDAS do domínio-I das integrinas (Valdramidou et al, 2008).

51

Figura 9 – Representação do domínio-I α2 da integrina α2β1 complexado com uma molécula de colágeno tripla

hélice – cadeia A (roxa), cadeia B (laranja), cadeia C (verde). O metal de coordenação é o magnésio. Elaborada

pela autora.

4.1 INTERAÇÕES ENTRE A INTEGRINA α2β1 (DOMÍNIO-I α2) E O COLÁGENO

A estrutura foi sequencialmente analisada quanto às energias de interação.

Preliminarmente, os cálculos quânticos são realizados para a quantificação das energias de

interação resíduo-resíduo dos aminoácidos que compõem o colágeno e a integrina (domínio-I

α2), na ordem: resíduos da cadeia A do colágeno em interação com resíduos da integrina,

resíduos da cadeia B interagindo com resíduos da integrina e, da mesma forma, resíduos da

cadeia C interagindo com aminoácidos da integrina. Foram identificadas, a partir da utilização

do raio de 8Å em volta dos resíduos do colágeno, 238 interações entre os resíduos de integrina

e do colágeno. Destas 238 interações, 89 foram encontradas entre a integrina e a cadeia A do

colágeno, 104 interações entre a integrina e a cadeia B e 45 entre a integrina e a cadeia C do

colágeno. Além disso, há moléculas de água interagindo com resíduos tanto da integrina

quanto do colágeno. A Figura 10 representa o sítio da integrina que interage com a molécula

52

do colágeno, segundo o limite de 8Å adotado neste trabalho, bem como os resíduos que

interagem com o íon de coordenação.

Figura 10 - Representação do sítio de interação entre o domínio-I α2 e o colágeno tripla hélice aplicando-se o

raio de interação de 8 Å. Os aminoácidos em destaques, Thr221 e Glu33, interagem diretamente com o íon

����. Elaborada pela autora.

Os aminoácidos do colágeno que representam a sequência de reconhecimento GFOGER são:

• Para a cadeia A - Gly7-Phe8-Hyp9-Gly10-Glu11-Arg12

• Para a cadeia B - Gly29-Phe30-Hyp31-Gly32-Glu33-Arg34

• Para a cadeia C - Gly51-Phe52-Hyp53-Gly54-Glu55-Arg56

O cálculo das energias de interação foi realizado em dois momentos, com o metal

���� associado ao aminoácido ácido glutâmico Glu33 do colágeno e associado à treonina

Thr221 da integrina. Lembrando que a interação entre a integrina α2β1 depende do MIDAS,

já que as interações entre a integrina e o ligante são reguladas de maneira complexa por

cátions bivalentes que se ligam em locais específicos e agem estimulando ou inibindo a

interação (Valdramidou et al, 2008). Assim, ao longo deste capítulo serão discutidos os

resultados, levando-se em consideração a interação do íon metálico com o Glu33 e a Thr221.

Como relatado previamente, a integrina α2β1 é um receptor de adesão expresso em

uma variedade de tipos de células, podendo complexar-se com o colágeno por meio do motivo

MIDAS dentro do domínio-I α2, ela também atua como receptor para o agente patogênico

53

humano echovirus-1 (Emsley, 1997). A ligação ao domínio-I é cátion dependente, sendo

suportada pelo magnésio ou manganês, mas não pelo cálcio (Calderwood et al, 1995). A

estrutura helicoidal tripla do colágeno é necessária para o reconhecimento por α2β1, bem

como o reconhecimento da sequência GFOGER (Emsley, 1997).

Após a realização dos cálculos os resultados foram avaliados de acordo com a

relevância dos valores energéticos apresentados, tanto as energias repulsivas (energias

positivas), quanto as energias atrativas (energias negativas).

A partir da análise dos dados obtidos avaliou-se que a energia total da interação entre a

integrina e a cadeia A do colágeno foi de -191,09 kcal/mol quando o cálculo é realizado com

o íon metálico interagindo com o resíduo Thr221 da integrina, e -266,08 kcal/mol quando o

cálculo foi realizado com o metal interagindo com o Glu33 do colágeno. Já para as interações

que ocorrem entre resíduos da cadeia B e integrina, quando o ���� foi associado ao Thr221,

o valor energético total foi -138,231 kcal/mol, entretanto, quando o mesmo íon é associado ao

Glu33 o valor foi de -454,596 kcal/mol. Enquanto isso, os valores energéticos totais para as

interações que ocorrem entre a cadeia C e a integrina, são -6,44 kcal/mol e -7,56 kcal/mol,

quando o metal está associado a Thr221 e Glu33, respectivamente (para informações mais

detalhadas ver Apêndice A).

É perceptível que os valores obtidos para as interações entre a integrina e a cadeia B

são bastante diferentes, quando comparadas com a associação realizada a partir do metal,

denotando a importância dos resíduos desta cadeia no contexto da interação entre o domínio-I

analisado. Serão discutidos adiante os fatores que colaboram para esta diferença energética.

Entre a cadeia A do colágeno e o domínio-I α2 da integrina foram analisadas 89

interações, levando-se em consideração o metal de coordenação em dois momentos, ligado a

Thr211 (treonina) e ao Glu33 (ácido glutâmico). As interações mais relevantes estão

representadas na Figura 11.

54

Figura 11 - Principais interações que ocorrem entre os resíduos da cadeia A (Gly10, Glu11 e Arg12) do

colágeno e os resíduos do domínio-I α2 da integrina. As energias apresentam os valores para os cálculos com o

metal interagindo com o Glu33 e com o Thr221. Para cada interação é demonstrado o número de moléculas de

água envolvidas. Elaborado pela autora.

A representação acima expõe os valores energéticos encontrados para as interações

colocadas, é possível verificar que para a maioria das interações os valores são iguais,

independente do aminoácido (Thr221 ou Glu33) ao qual o metal de coordenação esteja ligado.

Entretanto, é de fácil percepção a diferença energética entre a interação com o resíduo Arg12

(resíduo do colágeno) e a Thr221 (resíduo da integrina), apresentando os valores 74,34

kcal/mol e -1,80 kcal/mol, quando o metal interage com a Thr221 e Glu33, respectivamente.

A partir destes dados pode-se verificar que a sequência GFOGER da cadeia A do

colágeno, representada por Gly7-Phe8-Hyp9-Gly10-Glu11-Arg12, tem grande relevância para

a ligação com o domínio- α2 da integrina, visto que os dois aminoácidos do colágeno que

apresentam valores energéticos importantes quando interagem com resíduos da integrina,

pertencem a esta sequência, Glu11 e Arg12. A interação Glu11-Glu256, com energia

repulsiva de 41,69 kcal/mol, provavelmente apresenta este valor porque o ácido glutâmico (ou

glutamato) possui uma cadeia lateral polar carregada negativamente, denotando uma grande

55

repulsão entre estes resíduos. O valor energético desta interação foi igual, independente do

resíduo que interagia com o íon, isso significa que esta ligação não sofre influência direta ou

indireta da região MIDAS. Assim, independente da interação realizada pelo íon, os

aminoácidos Glu11 e Glu256 não devem sofrer alterações conformacionais.

O resíduo Arg12 do colágeno denotou sete interações significativas com resíduos do

domínio-I α2, sendo cinco atrativas e duas repulsivas. As interações atrativas ocorrem entre

Arg12-Asp219 (-40,16 kcal/mol), Arg12-Asp254 (-38,27 kcal/mol), Arg12-Glu256 (-68,37

kcal/mol), Arg12-Asp292 (-35,48 kcal/mol) e Arg12-Glu299 (-34,71 kcal/mol). Três

interações entre arginina e ácido aspártico destacam-se pela atratividade apresentada, esta

atração deve-se porque a arginina possui cadeia lateral carregada positivamente e o ácido

aspártico exibe uma cadeia lateral carregada negativamente, o grupo amino (NH3+) da cadeia

lateral da arginina e o grupamento carboxílico do ácido aspártico (COO-) interagem formando

uma ponte salina (Donald et al., 2011), permitindo a ocorrência desta alta atratividade

eletrostática entre os resíduos envolvidos, além disso há a presença de moléculas de água na

interação, permitindo a ocorrência de ligações de hidrogênio, aumentado, desta forma, a

afinidade da interação. Da mesma maneira, os valores energéticos atrativos que ocorrem entre

as interações da arginina com o glutamato, também podem ser explicados pelo fato de

permitirem a ocorrência de pontes salinas. No que concerne as interações repulsivas estão

Arg12-Arg288 (34,40 kcal/mol) e Arg12-Thr221 (74,34 kcal/mol). A repulsividade entre as

argininas é explicada pelo fato da interação apresentar forte interação carga-carga entre os

grupos funcionais guanidinas de mesma carga (Neves; Yeager; Abagyan, 2012). Já a alta

repulsão demonstrada na interação Arg12-Thr221, quando o metal interage com esta treonina,

está relacionada ao fato de que ao interagir diretamente com o metal de coordenação ����

através do oxigênio da hidroxila, a treonina, tem seu estado conformacional alterado. Percebe-

se que quando esta mesma interação é calculada com o ���� interagindo com o Glu33, a

energia encontrada é atrativa (1,81 kcal/mol), porém de baixa intensidade. As Figuras 12 e 13

representam as principais interações realizadas pelo aminoácido Arg12 e resíduos da

integrina.

56

Figura 12 - Representação das interações energeticamente relevantes entre Arg12 e os resíduos de

integrina Asp219, Thr221, Glu256 e Asp292. Elaborado pela autora.

Figura 13 - Representação das interações energeticamente relevantes entre Arg12 e os resíduos de

integrina Glu299, Asp254 e Arg288. Elaborado pela autora.

Foram observadas 104 interações entre a cadeia B do colágeno e o domínio-I α2 da

integrina, do mesmo modo da análise demonstrada anteriormente com a cadeia A, leva-se em

57

consideração o metal de coordenação ligado a Thr211 e a Glu33. As interações mais

relevantes são apresentadas na Figura 14.

Figura 14- Principais interações que ocorrem entre os resíduos da cadeia B (Glu33 e Arg34) e os

resíduos do domínio-I α2 da integrina. As energias apresentam os valores para os cálculos com o metal

interagindo com o Glu33 e com o Thr221. Para cada interação é demonstrado o número de moléculas de

água envolvidas, aqui cinco interações não apresentaram ligação a moléculas de água. Elaborado pela

autora.

É possível verificar que as interações obtidas entre os aminoácidos da cadeia B do

colágeno e os resíduos da integrina, apresentam variações energéticas consideráveis

dependendo da interação com o íon metálico. Assim, nota-se que quando consideramos o

���� interagindo diretamente com o Thr221 obtemos sete interações repulsivas e seis

interações atrativas, levando-se em consideração as interações energeticamente mais

importantes. Os valores energéticos positivos (repulsão) são apresentados pelas seguintes

interações: Glu33-Asp151 (46,05 kcal/mol), Glu33-Glu152 (33,44 kcal/mol), Glu33-Ser153

58

(4,65 kcal/mol), Glu33-Asp219 (40,24 kcal/mol), Glu33-Asp254 (44,16 kcal/mol), Glu33-

Glu256 (57,17 kcal/mol) e Arg34-Thr221 (63,29 kcal/mol). Enquanto isso, as interações que

denotaram valores energéticos negativos (atração) foram: Glu33-Asn154 (-15,41 kcal/mol),

Glu33-Ser155 (-9,74 kcal/mol), Glu33-Thr221 (-181,277 kcal/mol), Glu33-Arg288 (-30,62

kcal/mol), Arg34-Asp219 (-102,36 kcal/mol) e Arg34-Glu256 (-35,20 kcal/mol).

Porém, quando é observado o metal de coordenação interagindo diretamente com o

Glu33, todos os valores demonstrados denotam alterações. Para este cálculo (����- Glu33)

obtemos duas interações repulsivas e onze interações atrativas. Os valores energéticos

repulsivos são apresentados pelas interações: Glu33-Glu152 (57,24 kcal/mol) e Glu33-

Arg288 (34,22 kcal/mol). As interações com valores energéticos atrativos são: Glu33-Asp151

(-77,75 kcal/mol), Glu33-Ser153 (-13,76 kcal/mol), Glu33-Asn154 (-8,56 kcal/mol), Glu33-

Ser154 (-22,55 kcal/mol), Glu33-Asp219 (-60,38 kcal/mol), Glu33-Thr221 (-17,64 kcal/mol),

Glu33-Asp254 (-74,49 kcal/mol), Glu33-Glu256 (-94,64 kcal/mol), Arg34-Asp219 (-80,63

kcal/mol), Arg34-Thr211 (-1,46 kcal/mol), Arg34-Glu256 (-25,68 kcal/mol).

O aminoácido Glu33 apresentou 10 interações, com valores energéticos

consideravelmente importantes, entre os resíduos da integrina. Três interações ocorreram

entre o Glu33 e ácido aspártico (Asp151, Asp219 e Asp254). Quando o ���� está

coordenando diretamente o Thr221, todas as interações Glu33 com o ácido aspártico são

repulsivas, visto que ambos os aminoácidos são carregados negativamente o que promove

uma força eletrostática de repulsão entre eles. No entanto, quando o metal de coordenação é

associado ao Glu33, as mesmas interações tornam-se atrativas. Bella e Berman (2000)

constataram que apenas um resíduo carregado negativamente faz contato direto com o metal,

embora possa haver algum outro sendo coordenado através de moléculas de água, assim,

quando um grupo carboxílico do ligante aproxima-se, haverá uma indução a um rearranjo em

volta do local onde está o metal, este rearranjo só pode ser alcançado através de alterações

conformacionais adicionais que se estendem ao longo do domínio-I. Os mesmos autores

afirmam, ainda, que os resíduos do domínio-I da integrina que definem a sequência DXSXS

(Asp151-Glu152-Ser153-Asn154-Ser155) mantem a mesma coordenação ao íon metálico

esteja a integrina ligada ou não a um ligante.

Já as interações importantes que ocorrem entre o Glu33 e o ácido glutâmico realizam-

se duas vezes, sendo elas: Glu33-Glu152 e Glu33-Glu256. Nas interações onde o metal não

interage com o Glu33 os valores para ambas as interações são repulsivos, como exposto

59

anteriormente, isto ocorre devido as forças repulsivas eletrostáticas que ocorrem entre as

cadeias laterais carregadas do ácido glutâmico. Quando comparado aos valores energéticos

considerando o íon divalente interagindo com o Glu33, há um fortalecimento da repulsividade

entre Glu33-Glu152 e o surgimento de uma alta atratividade entre os resíduos Glu33-Glu256,

esta atratividade deve-se ao fato das alterações conformacionais que ocorrem em Glu33

quando coordena-se com o íon metálico, além disso o aminoácido Glu256 apresenta ligações

mediadas por moléculas de água com o metal (Emsley et al., 2000).

Outra interação relevante ocorre entre Glu33 e as serinas Ser153 e Ser155, onde

também há diferença significativa quando levamos em consideração o íon interagindo com o

ácido glutâmico, Emsley et al (2000), descreve que, após a ligação do colágeno à integrina, o

íon promove um rearranjo a fim de manter sua interação direta com o resíduo da integrina,

para isso, o mesmo interage indiretamente, através de ligações de hidrogênio com as serinas.

Este fato deve explicar o aumento na atração para a interação do Glu33 com as serinas,

quando este ácido glutâmico interage com o íon de coordenação. O Glu33 apresenta, ainda,

interações importantes com Asn154, Arg288 e Thr221, a interação com o Asn154 é atrativa e

apresenta ligações de hidrogênio, independente da interação do metal, entretanto a atração é

menor quando o metal interage com o Glu33. Já com relação a Arg288, a energia de interação

é alterada dependendo da interação do metal, a energia é atrativa quando o metal interage com

o resíduo da integrina e repulsiva quando o metal interage com o Glu33, a atração se dá pela

polaridade das cadeias laterais destes aminoácidos, por outro lado, a repulsão se dá pelo fato

do ácido glutâmico ter seu estado conformacional alterado pela ligação direta ao metal de

coordenação (Emsley et al., 2000).

O valor energético mais alto encontrado entre todas as interações realizadas ocorreu

entre o Glu33 e a Thr221, os dois resíduos que interagem diretamente com o metal de

coordenação ����, apresentando o valor -181,27 kcal/mol (para o cálculo realizado com o

metal interagindo com o Thr221). O resíduo Thr221 pertence a região MIDAS da integrina,

sendo o aminoácido que interage diretamente com o ����. Os íons divalentes são essenciais

para o funcionamento normal das integrinas, o sítio de ligação MIDAS é essencial para a

ligação entre a molécula de colágeno e a integrina α2β1 (Vorup-Jensen et al, 2007). Assim, o

metal precisa estar associado a Thr221 para que a integrina torne-se ativa e possa conectar-se

ao colágeno. A treonina não têm uma carga formal negativa, o que deve deixar o íon metálico

fortemente eletrofílico e capaz de formar um vínculo forte com o glutamato do colágeno.

60

Após a ligação ao ligante o íon irá coordenar o ácido glutâmico e realizará uma interação com

a treonina por meio de ligações de hidrogênio (Emsley et al, 2000).

Outro resíduo do colágeno que se destaca pela sua importância é a Arg34 que interage

com os resíduos Asp219, Thr221 e Glu256. O vínculo altamente atrativo que se dá entre

Arg34 e Asp219 deve-se ao fato de suas cadeias laterais serem, respectivamente, positiva e

negativa, logo, formam uma ponte salina de grande importância para o complexo analisado, o

mesmo ocorre para a interação com Glu256 aliado as ligações de hidrogênio mediadas pela

presença de água. A interação da Arg34 com Thr211 é fortemente repulsiva. Knight et al

(2000) afirma, em sua pesquisa, que as argininas são cruciais para que o colágeno possa ligar-

se com alta afinidade às integrinas. As Figuras 15, 16, 17 representam as principais interações

realizadas entre os aminoácidos da cadeia B do colágeno e aminoácidos da integrina.

Figura 15– Representação das interações mais relevantes encontradas para os aminoácidos Glu33 da cadeia B

do colágeno e a integrina. A figura destaca as interações no contexto do metal interagindo com Thr221.

Elaborado pela autora.

61

Figura 16– Representação das interações mais relevantes encontradas para os aminoácidos Glu33 da cadeia B

do colágeno e a integrina. A figura destaca as interações no contexto do metal interagindo com o próprio Glu33.

Elaborado pela autora.

Figura 17– Representação das interações mais relevantes encontradas para os aminoácidos Arg34 da cadeia B

do colágeno e a integrina α2β1. Elaborado pela autora.

A partir do exposto é evidente a influência da sequência GFOGER da cadeia B do

colágeno para a ligação da proteína à integrina. O fato do Glu33 ser o aminoácido que é

coordenado diretamente pelo íon metálico faz dessa cadeia a mais importante para a correta

interação entre as macromoléculas do complexo.

Enquanto isso, a cadeia C do colágeno apresentou 45 interações com resíduos do

domínio-I α2 da integrina. As interações entre Glu54-Asp219 (36,98 kcal/mol) e Arg56-

Asp219 (-33,88 kcal/mol) foram as únicas que denotaram importância considerável para a

cadeia C (Figura 18), ambas não apresentaram diferença quanto aos valores de energia

levando-se em consideração a coordenação do íon metálico.

62

Figura 18- Principais interações que ocorrem entre os resíduos da cadeia C (Gly54, Glu55, Arg56 e Glu57) e os

resíduos do domínio-I α2 da integrina. As energias apresentam os valores para os cálculos com o metal

interagindo com o Glu33 e com o Thr221. Para cada interação é demonstrado o número de moléculas de água

envolvidas. Elaborado pela autora.

As polaridades negativas das cadeias laterais do ácido glutâmico e do ácido aspártico

explicam a repulsividade encontrada. Já a interação entre a arginina e o ácido aspártico se dá

pela formação de ponte salina entre as cadeias polares dos resíduos. Além disso, a presença de

moléculas de água nas interações permite o surgimento de ligações de hidrogênio que

perfazem um ambiente de microsolvatação. Abaixo estão representadas as interações mais

importantes encontradas entre resíduos da cadeia C do colágeno e a integrina no domínio-I

(Figura 19).

63

Figura 19 – Representação das interações entre os aminoácidos Glu55 e Arg56 da cadeia C do

colágeno e Asp219 da integrina. Elaborado pela autora.

Como demonstrado, vários aminoácidos são de fundamental importância para a

formação do complexo integrina-colágeno. Mutações que por ventura, possam ocorrer

substituindo qualquer um destes aminoácidos podem acarretar em graves doenças para o ser

humano.

A sequência GFOGER do colágeno aqui analisado confirma a relevância da presença

destes aminoácidos que representam um local de ligação de elevada afinidade para a integrina

α2β1. Os resultados apresentados demonstram conclusivamente que o íon metálico e o Glu33

do colágeno desempenham papel central na ligação com a integrina. A afinidade da interação

provavelmente reflete os laços excepcionalmente fortes formados pela ponte metálica (Jung;

Moroi,1998). Knight et al (2000), demonstrou que a substituição do glutamato do GFOGER

por um ácido aspártico elimina a potencialidade da sequência, reduzindo a afinidade da

interação colágeno-integrina. No mesmo estudo, os autores também afirmam que a arginina

da sequência do colágeno é um resíduo de importância significativa para o aumento da

afinidade da interação.

Kamata et al., 1999 e Smith et al., 2000, descrevem a importância da ponte salina,

realizada entre a arginina e o ácido aspártico, em um modelo de mutagênese do ácido

aspártico, onde há perturbação da regulação da ligação a α2β1 quando ocorre a mutação. Da

mesma maneira, os resíduos do domínio-I α2 da integrina que participam direta ou

indiretamente da ligação ao íon metálico possuem elevada relevância para a ligação ao

ligante, Kamata et al., 1999, também descreveu que em um modelo onde há mutação em

64

Thr221, houve um bloqueio da adesão celular ao colágeno, sugerindo, assim, que o resíduo é

essencialmente crítico para a adesão da integrina α2β1 ao colágeno.

Comprovamos neste trabalho que a cadeia central do colágeno (cadeia B) é a mais

importante para a correta interação entre o colágeno tripla hélice e o domínio-I da integrina,

salientando que o aminoácido que interage diretamente com o metal encontra-se nesta cadeia,

as alterações conformacionais para os resíduos desta cadeia são mais intensas. Segundo

Emsley et al. (2000) dois aminoácidos de arginina presentes nesta cadeia tem importância

significativa pelo fato de realizarem pontes salina, o mesmo autor afirma que mutações nestas

argininas podem influenciar de modo negativo a interação entre as macromoléculas. Ademais,

devemos considerar também o fato de que a região central da cadeia B, onde localiza-se a

sequência GFOGER, está mais próxima do sítio da integrina analisado neste trabalho.

Já a cadeia C do colágeno demonstra sofrer menos intervenção do íon metálico,

quando ocorre a ligação do colágeno com a integrina, logo possíveis mutações na sequência

GFOGER desta cadeia, provavelmente não acarretarão em problemas quanto a ligação das

proteínas. A cadeia A, por sua vez, demostra, pela análise dos valores aferidos, sofrer

influência do íon de coordenação, com destaque para os aminoácidos Glu11 e Arg12.

Ressaltamos também a influência da região MIDAS para a interação integrina-

colágeno, Emsley et al.(2000), descreve que a ponte metálica entre a integrina e um resíduo

ácido, denota uma característica crítica para a interação no domínio-I de α2. Os resíduos que

interagem com MIDAS, a partir da coordenação do metal são invariantes entre os domínios -I,

e a mutagênese de qualquer destes resíduos anula a ligação ao ligante. Já os resíduos expostos

à superfície em torno do motivo MIDAS são mais variáveis, eles fornecem pontos de contato

adicionais ao ligante (Kamata et al., 1999).

Muitas doenças, associadas a ligação integrina-colágeno, vem sendo discutidas.

Estudos in vitro verificaram que deleções na estrutura de α2 provocam redução da resposta

plaquetária e o bloqueio a ligação com o colágeno do tipo I, bem como desestabilização na

formação de trombos (He et al., 2003). Kunicki et al (1993), relata a significância funcional

de α2β1 descrevendo os níveis de expressão desta integrina em plaquetas, correlacionando os

altos níveis de expressão a um aumento na capacidade das plaquetas em aderirem ao colágeno

tipo I, o que provoca um risco aumentado para a ocorrência de trombose. Nieuwenhuis (1985)

descreveu que pacientes com níveis reduzidos na expressão de integrinas α2β1 em plaquetas

65

ou com presença de auto-anticorpos contra essa integrina apresentavam a uma ativação de

plaquetas prejudicada por colágeno, mas não por outras moléculas.

Por outro lado, estudos a respeito de defeitos no envelhecimento ósseo e da cartilagem

revelam que a deficiência de α2 retarda a osteoporose induzida por idade (Peters et al., 2012;

Stange et al., 2013). Três décadas após a identificação da proteína de superfície celular VLA-

2 em células T (Hemler et al., 1985), um estudo recente demonstrou que α2β1 coopera com o

receptor da interleucina 7 (IL-7) em linfócitos Th17 para mediar a perda óssea (Azraq et al.,

2015), assim, pode-se inferir que a integrina α2β1 tem potencial para ser alvo farmacológico

contra a osteoporose. Znoyko et al (2005) demonstrou, em um estudo in vitro com células

provenientes de lesão hepática, que a estimulação da integrina α2β1 resultou na formação de

redes multicelulares, aumentado o processo de fibrogênese em células do fígado.

A partir do exposto coloca-se aqui a importância do estudo e investigação dos

mecanismos que envolvem a interação entre a integrina α2β1 com o colágeno. Este trabalho

permitiu a análise das interações que ocorrem entre o complexo integrina-colágeno com o

intuito de verificar a importância do íon metálico para a rede de interações que ocorrem entre

os resíduos das moléculas envolvidas, inferir as principais interações quanto ao seus valores

energéticos e compará-los com os dados que se tem até os dias de hoje na literatura.

66

CAPÍTULO 5

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

67

5.1 CONCLUSÕES

Com a intenção de elucidar as peculiaridades que envolvem a interação entre a

integrina α2β1 e o colágeno, este trabalho quantificou as energias de interação entre os

resíduos do domínio-I α2 desta integrina e os resíduos de colágeno, utilizando métodos de

simulação computacional empregando o nível quântico no entendimento das interações entre

as proteínas com base no DFT (Teoria do Funcional da Densidade). Além disso, realizou-se o

método de Fragmentação Molecular com Capas Conjugadas (MFCC) para determinar quais

aminoácidos seriam de maior importância na interação entre o domínio-I α2 e o colágeno.

Os resultados obtidos demonstraram a importância do motivo MIDAS, localizado no

domínio-I α2, para o delineamento das interações. O cálculo das energias de interação para

Thr221 e Glu33 revela que a interação destes resíduos com o metal de coordenação tem papel

fundamental para a ocorrência da ligação entre a integrina α2β1, visto que interagem

diretamente com o íon de coordenação.

Destacamos, para as interações entre a cadeia A e a integrina, o resíduo de arginina

Arg12 e os resíduos de ácido aspártico (Asp219, Asp254 e Asp292) pela alta afinidade

atrativa apresentada entre eles devido a presença de pontes salinas. Para as interações entre a

cadeia B e o domínio-I α2 da integrina, evidenciam-se as interações atrativas que ocorrem

entre Glu33-Thr221, Arg34-Asp219, Arg34-Glu256 quando o metal está ligado ao Thr221 e

as interações entre Glu33-Asp219, Glu33-Asp254, Glu33-Glu256, Arg34-Asp219, quando o

cálculo foi realizado com o metal ligado a Glu33. Já em relação a cadeia C as interações

atrativas expressivas foram Arg56-Asp219.

Já as interações repulsivas pertinentes encontradas para as interações entre o domínio-I

α2 e a cadeia A do colágeno ocorreram entre Arg12 e Thr221 (com o metal ligado a Glu33).

Para a cadeia B destacam-se as interações Glu33-Asp151, Glu33-Glu152, Glu33-Asp219,

Glu33-Glu256 e Arg34-Thr221 (para os cálculos com o metal ligado a Thr221) e, também

Glu33-Arg288 (para o metal ligado ao Glu33). Na cadeia C, encontramos a interação

repulsiva Glu55-Asp219.

Percebemos ainda, que todos os resíduos do colágeno que apresentaram valores

energéticos de interação significativos estão inseridos na sequência GFOGER das cadeias

correspondentes. Este fato corrobora com os dados apresentados na literatura, bem como

68

ressalta a influência desta sequência para a ligação integrina-colágeno. A sequência DXSXS

da integrina, também mostrou-se relevante, no entanto, somente para as interações ocorridas

entre a cadeia B e os resíduos da integrina analisada.

Também ressaltamos aqui a influência dos resíduos da cadeia B para as alterações

conformacionais que ocorrem a partir das ligações com o metal de coordenação. A alteração

do resíduo de interação com o íon modifica as energias de interação entre aminoácidos

próximos ao sítio MIDAS, possibilitando um remodelamento do sistema. Esse

remodelamento modifica a afinidade da interação das proteínas envolvidas no complexo.

Com base nas informações expostas, inferimos a importância dos resultados para a

análise proposta, visto que o conhecimento dos aspectos singulares que envolvem a interação

entre a integrina α2β1 e o colágeno podem vir a auxiliar a determinação de diversos eventos

que ocorrem denotando muitas patologias.

5.2 PERSPECTIVAS

Este trabalho trouxe como resultado principal o mapeamento das interações que acontecem

entre os resíduos do colágeno e o domínio-I da integrina α2β1, moldadas pela influência do

metal de coordenação. O conhecimento das interações mais importantes, bem como os

resíduos mais significativos, pode nos promover pistas de como ocorrem os eventos

complexos que envolvem a interação entre integrina e colágeno, assim como também,

identificar regiões as quais possa haver a ação de fármacos agonistas ou antagonistas para a

ligação integrina α2β1-colágeno, visto que algumas doenças são originadas da exacerbação

desta ligação e outras pela diminuição da expressão destas ligações.

Apesar do seu significativo potencial terapêutico, apenas alguns agentes com base em

peptídeos tem sido utilizados para regular as funções da integrina α2β1 alvejando o domínio-I

α2. A maior dificuldade para o desenvolvimento desses fármacos é a complexidade das

integrinas, visto que as mesmas atuam em variados tipos celulares. Logo, o desafio encontra-

se em desenvolver drogas com alta especificidade que driblem a redundância destas

moléculas.

Neste contexto, a análise de regiões com sequências específicas para ligantes são

fundamentalmente importantes para o desenvolvimento de novas drogas. Assim este trabalho

69

é extremamente relevante na tentativa de esclarecer as especificidades que envolvem a

interação entre o domínio-I de α2β1 e o colágeno com sequência GFOGER. Destaca-se

também a utilização bem sucedida de métodos computacionais nessa análise, comprovando a

eficácia destes métodos nas análises de sistemas biológicos complexos.

70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. 2010. Biologia

Molecular da Célula. 5ª Edição. Editora Artmed, 2010.

Albuquerque, E. L. et al. DNA-based nanobiostructured devices: The role of

quasiperiodicity and correlation effects. Physics Reports, v. 535, p. 139-209, 2014.

Allinger, N.L; Lii, J.H. Molecular mechanics. The MM3 force field for hydrocarbons. 3.

The van der Waals' potentials and crystal data for aliphatic and aromatic

hydrocarbons. J. Am. Chem. Soc.111 (23), pp 8576–8582, 1989.

Alon, R.; Etzioni, A. LAD-III, a novel group of leukocyte integrin activation deficiencies.

Trends Immunol; 24:561-6, 2003.

Azreq, M-A. E.; et al. Cooperation between IL-7 Receptor and Integrin α2β1 (CD49b)

Drives Th17-Mediated Bone Loss. J Immunol 2015 195:4198-4209, 2015.

Akiyama, S.K.; Nagata, K.; Yamada, K.M. Cell surface receptors for extracellular matrix

components. Biochim Biophys Acta. 1031(1):91–110, 1990.

Assoian, R.K.; Klein, E.A. Growth control by intracellular tension and extracellular

stiffness. Trends Cell Biol., Vol. 7. pp. 347-52, 2008.

Baronas-Lowell, D.; Lauer-Fields, J. L.; Borgia, J. A.; Sferrazza, G. F.; Al-Ghoul, M.;

Minond, D.; Fields, G. B. Differential modulation of human melanoma cell

metalloproteinase expression by alpha2beta1 integrin and CD44 triple-helical ligands

derived from type IV collagen. J. Biol. Chem. 279,43503-43513, 2004.

Bartolome, R. A.; Barderas, R.; Torres, S.; Fernandez-Acenero, M. J.; Mendes, M.; Garcıa-

Foncillas, J.; Lopez-Lucendo, M.; Casal, J. I. Cadherin-17 interacts with alpha2beta1

integrin to regulate cell proliferation and adhesion in colorectal cancer cells causing

liver metastasis. Oncogene 33, 1658-1669, 2014.

Barczyk, M.; Carracedo, S.; Gullberg, D. Integrins. Cell Tissue Res, 339: 269–280, 2010.

Barreiro, E.J.; Rodrigues, C.R.; Albuquerque, M.G.; Sant’anna, C.M.R; Alencastro, R.B.

Modelagem molecular: Uma ferramenta para o planejamento racional de fármacos em

química medicinal. Química Nova, v. 20 n. 3, p. 300-310, 1997.

71

Bateman, J.F.; Lamande, S.R.; Ramshaw, J.A.M. Collagen superfamily, in: W.D. Comper

(Ed.), Extracellular Matrix, Harwood Academic Press, Melbourne, pp. 22–67, 1996.

Bella, J.; Eaton, M.; Brodsky, B.; Berman, H.M. Crystal and molecular structure of a

collagen-like peptide at 1.9 A resolution. Science, 266 5182, 75-81, 1994.

Bella, J.; Berman, H.M. Integrin–collagen complex: a metal–glutamate handshake.

Structure, Vol 8 No 6, 2000.

Berthet, V.; et al. Role of endoproteolytic processing in the adhesive and signaling

functions of alphavbeta5 integrin. J Biol Chem, 275(43): p. 33308-13, 2000.

Birk, D.E; Fitch, J.M; Babiarz, J.P.; Linsenmayer, T.F. Collagen type I and type V are

present in the same fibril in the avian corneal stroma. J. Cell Biol. 106 999–1008, 1988.

Bork, P.; et al. Domains in plexins: links to integrins and transcription factors. Trends

Biochem Sci, 24(7): p. 261-3, 1999.

Bouaouina, M.; Lad, Y.; Calderwood, D. A. The N-terminal domains of talin cooperate

with the phosphotyrosine binding-like domain to activate β1 and 3 integrins. J. Biol.

Chem., 6118-6125, 2008.

Boyd, D. B. Compendium of software for molecular modeling. In: Lipkowitz, K. B. &

Boyd, D. B. Reviews in computational chemistry. VCH Pub, New York, 1990.

Brakebusch, C.; Fassler, R. The integrin-actin connection, an eternal love affair. EMBO J,

22:2324–2333, 2003.

Brooijmans, N.; Kuntz, I. D. Molecular recognition and docking algorithms. Annu. Rev.

Biophys. Biomol. Struct. 32, 335-373, 2003.

Bruckner, P. Prockop, D.J. Proteolytic enzymes as probes for the triple – delical

conformation of procollagen. Anal. Biochem. 110 360 – 368, 1981.

Burke, R.D. Invertebrate integrins: structure, function, and evolution. Int Rev Cytol,

191:257–284, 1999.

Burke, K. Perspective on density functional theory. The Journal of Chemical Physics,

v.136, n. 15, p. 150901, 2012.

Calderwood, D. A. Integrin activation. J. Cell Sci, 117, 657-666, 2004.

72

Calderwood, D.A.; Tuckwell, D.S.; Humphries, M.J. Specificity of integrin I-domain-ligand

binding. Biochem Soc Trans, 23:504S, 1995.

Calvete, J.J.; Henschen, A.; Gonzalez-Rodriguez, J. Assignment of disulphide bonds in

human platelet GPIIIa. A disulphide pattern for the beta-subunits of the integrin family.

Biochem J, 274 (Pt 1): p. 63-71, 1991.

Campbell, I.D.; Humphries, M.J. Integrin structure, activation and interactions. Cold

Spring Harb Perspect Biol, 3:a004994, 2011.

Camper, L.; Hellman, U.; Lundgren-Akerlund, E. Isolation, cloning, and sequence analysis

of the integrin subunit alpha10, a beta1-associated collagen binding integrin expressed

on chondrocytes. J Biol Chem, 273:20383–20389, 1998.

Carvalho, I. et al. Introdução a modelagem molecular de fármacos no curso experimental

de química farmacêutica. Quim. Nova, Vol. 26, No. 3, 428-438, 2003.

Cho, A. E.; Chung, J. Y.; Kim, M.; Park, K. Quantum mechanical scoring for protein

docking. J. Chem. Phys. 131, 134108, 2009.

Chung, L. W.; Hirao, H.; Li, X.; Morokuma, K. The ONIOM method: its foundation and

applications to metalloenzymes and photobiology. Wiley Interdisciplinary Reviews:

Computational Molecular Science, v. 2, n. 2, p. 327-350, 2012.

Coelho, L.W. et al. Aplicação de mecânica molecular em química inorgânica. Quim. Nov

22(3), 1999.

Coller, B.S. Activation affects access to the platelet receptor for adhesive glycoproteins. J

Cell Biol, 103(2): p. 451-6, 1986.

Cox, D.; Brennan, M.; Moran, N. Integrins as therapeutic targets: lessons and

opportunities. Nat Rev; 9:804-20, 2010.

Curran, S.; Murray, G.I. Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis. J

Pathol. 189: 300-308, 1999.

Critchley, D. R.; Gingras, A. R. Talin at a glance. J. Cell Sci., 121, 1345-1347, 2008.

Da Costa, R.F.; Freire, V.N.; Bezerra, E.M.; Cavada, B.S.; Caetano, E.W.S.; De Lima Filho,

J.L.; Albuquerque, E.L. Explaining statin inhibition effectiveness of HMG-CoA reductase

73

by quantum biochemistry computations. Physical Chemistry Chemical Physics, v. 14, p.

1389-1398, 2012.

Damodaran, S.; Parkin, K. L.; Fennema O. R. Química de alimentos de Fennema. 4. ed.

Porto Alegre (RS): Artmed; 2010.

Delley, B. An All-Electron Numerical Method for Solving the Local Density Functional

for Polyatomic Molecules. Journal of Chemical Physics, v. 92, n. 1, p. 508-517, 1990.

Desgrosellier, J. S.; Cheresh, D. A. Integrins in cancer: biological implications and

therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer, Vol 1; pp 9-22, 2010.

Dewar, M.J.S.; Zoebisch, E.G.; Healy, E.F.; Stewart, J.J.P. AM1: A new general purpose

quantum mechanical molecular model. J. Am. Chem. Soc., v. 107, p. 3902- 3909, 1985.

Dill, K.A.; et al. The protein folding problem: when will it be solved? Current Opinion in

Structural Biology, v.17(3), p. 342-346, 2007.

D’Souza, S.E.; Ginsberg, M.H.; Burke, T.A.; Lam, S.C.T.; Plow, E.F. Localization of an

Arg-Gly-Asp recognition site within an integrin adhesion receptor. Science, 242:91-93,

1998.

Drews, J. Drug Discovery: A Historical Perspective. Science. 287, 1960-1964. 2000.

Drews, J. Strategic trends in the drug industry. Drug Discovery Today. 8 (9), 411-420.

2003.

Donald, J.E.; et al. Salt Bridges: Geometrically Specific, Designable Interactions. Proteins;

79(3): 898–915, 2011.

Donoghue, P.C.J.; Purnell, M.A. Genome duplication, extinction and vertebrate evolution.

Trends Ecology Evol. 20:312–319, 2005.

Ferraz, F.B; Hernandez, J.H. Integrinas na adesão, migração e sinalização celular:

associação com patologias e estudos clínicos. Rev Cient da FMC ,Vol. 9, nº 2, 2014.

Freitas, L.C.G. Prêmio Nobel de química 1999. Química Nova na Escola, n. 8, p.3-6, 1998.

Friedl, P.; Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. J Cell Biol;

188:11–9, 2010.

74

Gallant, N.D.; Michael, K.E.; Garcia, A.J. Cell adhesion strengthening: contributions of

adhesive area, integrin binding, and focal adhesion assembly. Mol Biol Cell, 16:4329–

4340, 2005.

Geiger, B.; Spatz, J.P.; Bershadsky, A.D. Environmental sensing through focal adhesions.

Nat Rev, 10:21–33, 2009.

Gelse, K.; Pöschlb, E.; Aigner, T. Collagens-structure, function, and biosynthesis.

Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1531 – 1546, 2003.

Giancotti, F.G.; Ruoslahti, E. Integrin signaling. Science, 285:1028–1032, 1999.

Goldmann, W.H.; Bremer, A.; Haner, M.; Aebi, U.; Isenberg, G. Native talin is a dumbbell-

shaped homodimer when it interacts with actin. J Struct Biol, 112:3–10, 1994.

Grenache, D. G.; Zhang, Z.; Wells, L. E.; Santoro, S. A.; Davidson, J. M.; Zutter, M. M.

Wound healing in the α2β1 integrin-deficient mouse: altered keratinocyte biology and

dysregulated matrix metalloproteinase expression. J. Invest. Dermatol. 127, 455-466,

2007.

Gullberg, D.E.; Lundgren-Akerlund, E. Collagen-binding I domain integrins-what do they

do?. Prog Histochem Cytochem, 37(1): p. 3-54, 2002.

Gullberg, D.; Turner, D.C.; Borg, T.K.; Terracio, L.; Rubin, K. Different α1-integrin

collagen receptors on rat hepatocytes and cardiac fibroblasts. Exp Cell Res, 190:254-264,

1990.

Gurry, T.; Nerenberg, P.S.; Stulz, C.M., The contribution of interchain salt bridges to

triple-helical stability in collagen. J.Biophys., 98, 2634, 2010.

Gordon, M.S.; Fedorov, D.G.; Pruitt, S.R.; Slipchenko, L.V. Fragmentation methods: a

route to accurate calculations on large systems. Chem. Rev., v. 112, n. 1, p. 632-672, 2011.

Habart, D.; Cheli, Y.; Nugent, D. J;, Ruggeri, Z. M.; Kunicki, T. J. Conditional knockout of

integrin alpha2beta1 in murine megakaryocytes leads to reduced mean platelet volume.

PLoS ONE 8, e55094, 2013.

Harburger, D.S.; Calderwood, D.A. Integrin signalling at a glance. Journal of Cell Science,

122, 159-163, 2009.

75

Hemler, M.E. VLA proteins in the integrin family: structures, functions, and their role

on leukocytes. Annu Rev Immunol 8:365–400, 1990.

Hohenberg, P.; Kohn, W. Inhomogeneous electron gas. Physical Review, v. 136, p.B864-

B871, 1964.

Hulmes, D.J; Miller, A. Molecular packing in collagen. Nature 293 234– 239, 1981.

Humphries, M.J. Integrin structure. Biochem Soc Trans, 28(4): p. 311-39, 2000.

Humphries, J.D.; Wang, P.; Streuli, C.; Geiger, B.; Humphries, M.J.; Ballestrem, C.; Vinculin

controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. J Cell Biol,

179:1043–1057, 2007.

Hynes, R.O. Integrins: A Family of Cell Surface Receptors. Cell, Vol. 48, 549-554, 1987.

Hynes, R.O. Integrins: Versatility, Modulation, and Signaling in Cell Adhesion. Cell,

Vol. 69, 1 l-25, 1992.

Hynes, R.O.; Zhao, Q. The evolution of cell adhesion. J Cell Biol, 150:F89–F96, 2000.

Hynes, R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell, 110(6): p. 673-87,

2002.

Ilic, D.; Furuta, Y.; Kanazawa, S.; Takeda, N.; Sobue, K.; Nakatsuji, N.; Nomura, S.;

Fujimoto, J.; Okada, M.; Yamamoto, T. Reduced cell motility and enhanced focal adhesion

contact formation in cells from FAK-deficient mice. Nature, 377:539–544, 1995.

Frisch, M. J.; AL., E. Gaussian 09, Revision A.01. 2009.

Juliano, R.L.; Haskill, S. Signal transduction from the extracellular matrix. J Cell Biol,

120(3): p. 577-85, 1993.

Kamata, T.; Liddington, R. C.; Takada, Y. Interaction between collagen and the alpha(2) I-

domain of integrin alpha(2)beta(1). Critical role of conserved residues in the metal ion-

dependent adhesion site (MIDAS) region. J Biol Chem.; 274(45):32108-11, 1999.

Kanazashi, S.I.; Sharma, C.P.; Arnaout, M.A. Integrin-ligand interactions: scratching the

surface. Curr Opin Hematol, 4(1): p. 67-74, 1997.

76

Kern, A.; Marcantonio, E.E. Role of the I-domain in collagen binding specificity and

activation of the integrins alpha1beta1 and alpha2beta1. J Cell Physiol, 176(3): p. 634-41,

1998.

Kitano, H. Standards for modeling. Nature Biotechnol. 20, 337, 2002.

Kloeker, S.; Major, M.B.; Calderwood, D.A.; Ginsberg, M.H.; Jones, D.A.; Beckerle, M.C.

The Kindler syndrome protein is regulated by TGFβ and involved in integrin-mediated

adhesion. J. Biol. Chem., 279, 6824-6833, 2003.

Kohn, W; Sham, L.J. Self-Consistent Equations Including Exchange and Correlation

Effects. Physical Review, v. 140, n. 4A, p. A1133-A1138, 1965.

Kühn, K. The collagen family-variations in the molecular and supermolecular structure.

Rheumatology 10, 29 – 69, 1986.

Knight, C.G.; Morton, L.F.; Peachey, A.R.; Tuckwell, D.S.; Farndale, R.W.; Barnes, M.J.

The collagen-binding A-domains of integrins a1b1 and a2b1 recognize the same specific

amino acid sequence, GFOGER, in native (triple-helical) collagens. J. Biol. Chem. 275,

35–40, 2000.

Kunicki, T.J.; Orchekowski, R.; Annis, D.; Honda, Y. Variability of integrin alpha 2 beta 1

activity on human platelets. Blood 82:2693–2703, 1993.

Kunicki, T. J.; Nugent, D. J. The genetics of normal platelet reactivity. Blood 116, 2627-

2634, 2010.

Lau, T.L.; Kim, C.; Ginsberg, M.H.; Ulmer, T.S. The structure of the integrin aIIbb3

transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. EMBO J, 28:

1351–1361, 2009.

Leach, A. R. Molecular Modeling: Principles and Applications. 2. ed., Pretince Hall, 2001.

Legate, K.R.; Wickstrom, S.A.; Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin

outside-in signaling. Genes Dev, 23:397–418, 2009.

Lehninger, A. L.; Nelson, L. D.; Cox, M. M. Princípios de Bioquímica. 3 ed., São Paulo:

SARVIER, 1009p, 2002.

77

Li, R.; Babu, C.R.; Lear, J.D.; Wand, A.J.; Bennett, J.S.; DeGrado, W.F. Oligomerization of

the integrin alphaIIbbeta3: roles of the transmembrane and cytoplasmic domains. Proc

Natl Acad Sci USA, 98:12462–12467, 2001.

Liddington, R.C.; Ginsberg, M.H. Integrin activation takes shape. J Cell Biol, 158:833–839,

2002.

Liotta, L.A.; Steeg, P.S.; Steller-Stevenson, W.G. Cancer metastasis and angiogenesis: an

imbalance of positive and negative regulation. Cell; 64: 327-36, 1991.

Loh, E.; Qi, W.; Vilaire, G.; Bennett, J.S. Effect of cytoplasmic domain mutations on the

agonist-stimulated ligand binding activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3. J Biol

Chem, 271:30233–30241, 1996.

Lu, C.; Oxvig, C.; Springer, T.A. The structure of the beta-propeller domain and C-

terminal region of the integrin alphaM subunit. Dependence on beta subunit association

and prediction of domains. J Biol Chem, 273(24): p. 15138-47, 1998.

Lu, C., et al. An isolated, surface-expressed I domain of the integrin alphaLbeta2 is

sufficient for strong adhesive function when locked in the open conformation with a

disulfide bond. Proc Natl Acad Sci U S A, 98(5): p. 2387-92, 2001.

Luo, B.H.; Carman, C.V.; Springer, T.A. Structural basis of integrin regulation and

signaling. Annu Rev Immunol, 25:619–647, 2007.

Luo, B.H.; Carman, C.V.; Takagi, J.; Springer, T.A. Disrupting integrin transmembrane

domain heterodimerization increases ligand binding affinity, not valency or clustering.

Proc Natl Acad Sci USA, 102:3679–3684, 2005.

Luo, B.H.; Springer, T.A.; Takagi, J. A specific interface between integrin transmembrane

helices and affinity for ligand. PLoS Biol, 2:e153, 2004.

March, N. H.; Matthai, C. C. The application of quantum chemistry and condensed

matter theory in studying amino-acids, protein folding and anticancer drug technology.

Theoretical Chemistry Accounts, v. 125, n. 3-6, p. 193–201, 2009.

Massa, W. Crystal Structure Determination. Berlin, Germany. Springer. 4° ed. 226 pp.,

2004.

78

Miranti, C. K.; Brugge, J. S. Sensing the environment: a historical perspective on integrin

signal transduction. Nat. Cell Biol. 4, E83-E90, 2002.

Monkley, S.J.; Zhou, X.H.; Kinston, S.J.; Giblett, S.M.; Hemmings, L.; Priddle, H.; Brown,

J.E.; Pritchard, C.A.; Critchley, D.R.; Fassler, R. Disruption of the talin gene arrests mouse

development at the gastrulation stage. Dev Dyn, 219:560–574, 2000.

Montanez, E.; Ussar, S.; Schifferer, M.; Bosl, M.; Zent, R.; Moser, M.; Fassler, R. Kindlin-2

controls bidirectional signaling of integrins. Genes Dev, 22:1325–1330, 2008.

Morgan, M. R.; Humphries, M. J.; Bass, M. D. Synergistic control of cell adhesion by

integrins and syndecans. Nat Rev Mol Cell Biol., 12:957-969, 2007.

Moser, M.; Nieswandt, B.; Ussar, S.; Pozgajova, M.; Fassler, R. Kindlin-3 is essential for

integrin activation and platelet aggregation. Nat Med, 14:325–330, 2008.

Neves, M. A. C.; Yeger, M.; Abagyan, R. Unusual Arginine Formations in Protein

Function and Assembly: Rings, Strings, and Stacks. J. Phys. Chem B; 116 (23), pp 7006–

7013, 2012.

Nimmi, N.E. Collagen: structure, function, and metabolism in normal and fibrotic

tissues. Seminars in Arthritis and Rheumatism. Vol. 13, 1 (August), 1983.

Nieuwenhuis, H. K; et al. Human blood platelets showing no response to collagen fail to

express surface glycoprotein Ia. Nature 318:470–472, 1985.

Nieuwenhuis, H.K.; et al. Deficiency of platelet membrane glycoprotein Ia associated with

a decreased platelet adhesion to subendothelium: a defect in platelet spreading. Blood

68:692–695, 1986.

Otey, C.A.; et al. Mapping of the alpha-actinin binding site within the beta 1 integrin

cytoplasmic domain. J Biol Chem, 268(28): p. 21193-7, 1993.

Partridge, A.W.; Liu, S.; Kim, S.; Bowie, J.U.; Ginsberg, M.H. Transmembrane domain

helix packing stabilizes integrin alphaIIbbeta3 in the low affinity state. J Biol Chem, 280:

7294-7300, 2005.

Perdew, J. P.; Burke, K.; Ernzerhof, M. Generalized gradient approximation made simple.

Physical review letters, v. 77, n. 18, p. 3865-3868, 1996.

79

Plow E.F.; Haas, T.A.; Zhang, L.; Loftus, J.; Smith, J.W. Ligand binding to integrins. J Biol

Chem, 275:21785–21788, 2000.

Raman, S.S; Parthasarathi, R. Role of aspartic acid in collagen structure and stability: A

molecular dynamics investigation J. Phys Chem B, 20678-85, 2006.

Ramachadran, G. N.; Sasiskhran, V. Conformation of polypeptides and proteins. Advan.

Prot. Chem. 23:283-437, 1968

Ramachadran, G.N; Bansal, M.; Bhatnagar, R.S. A hypothesis on the role of

hydroxyproline in stabilizing the collagen structure. Biochim. Biophys. Acta, 322, 166-

171, 1973.

Ratnikov, B.I.; Partridge, A.W.; Ginsberg, M.H. Integrin activation by talin. J Thromb

Haemost, 3:1783–1790, 2005.

Rodrigues, C.R. Modelagem molecular. Quim. Nov. 3, 2001.

Rodrigues, C. R. F.; et al. Quantum biochemistry study of the T3-785 tropocollagen

triple-helical structure. Chemical Physics Letters, v. 559, p. 88-93, 2013.

Rossert, J.; Crombrugghe, de B. Type I collagen: structure, synthesis and regulation, in:

Bilezkian, J.P.; Raisz, L.G.; Rodan, G.A. (Eds.), Principles in Bone Biology, Academic Press,

Orlando, pp. 189–210, 2002.

Sakai, T.; Jove, R.; Fassler, R.; Mosher, D.F. Role of the cytoplasmic tyrosines of beta 1A

integrins in transformation by v-src. Proc Natl Acad Sci USA, 98:3808-3813, 2001.

Sakai, T.; Li, S.; Docheva, D.; Grashoff, C.; Sakai, K.; Kostka, G.; Braun, A.; Pfeifer, A.;

Yurchenco, P.D.; Fassler, R. Integrin-linked kinase (ILK) is required for polarizing the

epiblast, cell adhesion, and controlling actin accumulation. Genes Dev, 17:926–940, 2003.

Sant’Anna, C.M.R. Métodos de modelagem molecular para estudo e planejamento de

compostos bioativos: uma introdução. Rev. Virtual Quim., 1 (1), 49‐57, 2009.

Santoro, S.A.; et al. Analysis of collagen receptors. Methods Enzymol, 245: p.147-83, 1994.

Santos, H. F. O Conceito da Modelagem Molecular. Cadernos Temáticos de Química Nova

na Escola, n. 4, 2001.

Santos-Filho, O. A.; Alencastro, R. B. Modelagem de proteínas por homologia. Química

Nova. v26, n2, p253-259, 2003.

80

Santamaria, R.; et al. Molecular electrostatic potentials and Mulliken charge populations

of DNA mini-sequences. Chemical Physics, v. 227, n. 3, p. 317-329, 1998.

Saunders, R.M.; Holt, M.R.; Jennings, L.; Sutton, D.H.; Barsukov, I.L.; Bobkov, A.;

Liddington, R.C.; Adamson, E.A.; Dunn, G.A.; Critchley, D.R. Role of vinculin in

regulating focal adhesion turnover. Eur J Cell Biol, 85:487–500, 2006.

Silva, T.F.; Penna, A. L.B. Colágeno: Características químicas e propriedades funcionais. Rev Inst Adolfo Lutz.; 71(3):530-9, 2012

Schwartz, M.A.; Schaller, M.D.; Ginsberg, M.H. Integrins: emerging paradigms of signal

transduction. Annu Rev Cell Dev Biol, 11:549–599, 1995.

Schuppan, D.; Schmid, M.; Somasundaram, R.; Ackermann, R.; Ruehl, M.; Nakamura, T.;

Riecken, E.O. Collagens in the liver extracellular matrix bind hepatocyte growth factor.

Gastroenterology, 114 139 – 152, 1998.

Shattil, S. J.; Kim, C.; Ginsberg, M. H. The final steps of integrin activation: the end game.

Nat Rev Mol Cell Biol. Vol 4 ; pp. 288-300, 2010.

Sherrill, C. D. Frontiers in electronic structure theory. The Journal of chemical physics, v.

132, n. 11, p. 110902, doi:10.1063/1.3369628, 2010.

Shimaoka, M.; Takagi, J.; Springer, T.A. Conformational regulation of integrin structure

and function. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 31: p. 485-516, 2002.

Shoulders, M.D.; Raines, R.T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78:

929–958, 2009.

Sousa, S. F., Fernandes, P. A., and Ramos, M. J. Protein–ligand docking: Current status and

future challenges, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 65, 15-26, 2006.

Springer, T.A. Folding of the N-terminal, ligand-binding region of integrin alpha-

subunits into a beta-propeller domain. Proc Natl Acad Sci USA, 94:65–72, 1997.

Srichai, M.B.; Zent, R. Integrin Structure and Function. Cell-Extracellular Matrix

Interactions in Cancer, Springer Science Business Media, LLC 2010.

Staatz, W.D.; Walsh, J.J.; Pexton, T.; Santoro, S.A. The α2β1 integrin cell surface collagen

receptor binds to the α1(I)CB3 peptide of collagen. J Biol Chem, 265:4778-4781, 1990.

Stupack, D.G. The biology of integrins. Oncology (Williston Park), Vol. 9. pp. 6-12, 2007.

81

Svensson, M.; et al. ONIOM:  A Multilayered Integrated MO + MM Method for

Geometry Optimizations and Single Point Energy Predictions. A Test for Diels−Alder

Reactions and Pt(P(t-Bu)3)2 + H2 Oxidative Addition. The Journal of Physical Chemistry,

v. 100, n. 50, p. 19357-19363, 1996/01/01 1996.

Tsuchida, J.; et al. The ‘ligand-induced conformational change' of alpha 5 beta 1 integrin.

Relocation of alpha 5 subunit to uncover the beta 1 stalk region. J Cell Sci, 111 ( Pt 12):

p. 1759-66, 1998.

Tuckwell, D.; Humphries, M. Integrin–collagen binding. Seminars in Cell & Developmental

Biology, Vol 7: pp 649–657, 1996.

Valdramidou, D; Humpphries, M.J.; Mould, P. Distinct Roles of β1 Metal Ion-dependent Adhesion Site (MIDAS), Adjacent to MIDAS (ADMIDAS), and Ligand-associated Metal-binding Site (LIMBS) Cation-binding Sites in Ligand Recognition by Integrin α2β1. The Journal of Biological Chemistry, 283, 32704-32714, 2008.

van der Flier, A.; Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res,

305:285–298, 2001.

von der Mark, K. Structure, biosynthesis and gene regulation of collagens in cartilage and

bone, Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism. Academic Press, Orlando, pp. 3– 29,

1999.

Vandenberg, P.; Kern, A.; Ries, A.; Luckenbill-Edds, L.; Mann, K.; Kühn, K.

Characterization of a type IV collagen major cell binding site with affinity to the α1β1

and the α2β1 α3β1 integrins. J Cell Biol, 113:1475-1483, 1991.

Velling T.; Kusche-Gullberg, M.; Sejersen, T.; Gullberg, D. cDNA cloning and

chromosomal localization of human alpha(11) integrin. A collagen-binding, I domain-

containing, beta(1) associated integrin alpha-chain present in muscle tissues. J Biol

Chem, 274:25735–25742, 1999.

Vreven, T.; Morokuma, K.; Farkas, Ö.; Schlegel, H. B.; Frisch, M. J. Geometry optimization

with QM/MM, ONIOM, and other combined methods. I. Microiterations and

constraints. Journal of Computational Chemistry 24, 760-769, 2003.

Vorup-Jensen, T.; et al. The connection between metal ion affinity and ligand affinity in

integrin I domains. Biochim Biophys Acta.; 1774(9): 1148–1155, 2007.

82

Xiong, J.P.; Stehle, T.; Diefenbach, B.; Zhang, R.; Dunker, R.; Scott, D.L.; Joachimiak, A.;

Goodman, S.L.; Arnaout, M.A. Crystal structure of the extracellular segment of integrin

alpha Vbeta3. Science, 294, 339–345, 2001.

Yamaguchi, Y.; Mann, D.M.; Ruoslathi, E. Negative regulation of transforming growth

factor-h by the proteoglycan decorin, Nature 346, 281 – 284, 1990.

Yin, H.; Litvinov, R.I.; Vilaire, G.; Zhu, H.; Li, W.; Caputo, G.A.; Moore, D.T.; Lear, J.D.;

Weisel, J.W.; Degrado, W.F.; Bennett, J.S. Activation of platelet alphaIIbbeta3 by an

exogenous peptide corresponding to the transmembrane domain of alphaIIb. J Biol

Chem, 281:36732–3674, 2006.

Weiner, S.J.; et al. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids

and proteins. J. Am. Chem. Soc.,106 (3), pp 765–784, 1984.

Wegener, K.L.; Campbell, I.D. Transmembrane and cytoplasmic domains in integrin

activation and protein-protein interactions (review). Mol Membr Biol, 25:376–387, 2008.

Wegener, K.L.; Partridge, A.W.; Han, J.; Pickford, A.R.; Liddington, R.C.; Ginsberg, M.H.;

Campbell, I.D. Structural basis of integrin activation by talin. Cell. 128:171–182, 2007.

Zang, Q.; Springer, T.A. Amino acid residues in the PSI domain and cysteine-rich repeats

of the integrin beta2 subunit that restrain activation of the integrin alpha(X)beta(2). J

Biol Chem, 276(10): p. 6922-9, 2001.

Zaidel-Bar, R.; Itzkovitz, S.; Ma’ayan, A.; Iyengar, R.; Geiger, B. Functional atlas of the

integrin adhesome. Nat. Cell Biol., 9, 858-867, 2007.

Zhang, D. W.; Zhang, J, Z. H. Molecular fractionation with conjugate caps for full quantum mechanical calculation of protein-molecule interaction energy. Journal of Chemical Physics, v. 119, p. 3599-605, 2003.

Zhang, D. W.; Zhang, J. Z. H. Full quantum mechanical study of binding of HIV-1 protease drugs. International Journal of Quantum Chemistry, v. 103, p. 246-257, 2005.

Zhou, T.; Huang, D.; Caflisch, A. Quantum Mechanical Methods for Drug Design. Curr Top Med Chem 10: 33-45, 2010.

Zweers,M. C.; Davidson, J.M.; Pozzi, A.; Hallinger, R.; Janz, K.; Quondamatteo, F.; Leutgeb, B.; Krieg, T.; Eckes, B. Integrin alpha2beta1 is required for regulation of murine wound angiogenesis but is dispensable for reepithelialization. J. Invest. Dermatol. 127, 467-478, 2007.

83

APÊNDICE A

84

Tabela A.1 – Interações realizadas entre os resíduos da cadeia A do colágeno e os resíduos do domínio-I

α2 da integrina α2β1.

Mg_THR221 Mg_GLU33

GLY4 TYR157 6.84 8.0 -0,008 -0,008

PRO5 TYR157 3.17 8.0 0.85 0.85

PRO5 PRO158 6.11 8.0 0.24 0.24

PRO5 ASP160 HOH9;HOH10;HOH11;HOH49;HOH51 6.88 8.0 -3.84 -3.84

PRO5 TYR285 7.85 8.0 0.13 0.13

HYP6 ILE156 7.96 8.0 -0.41 -0.41

HYP6 TYR157 2.04 8.0 -4.73 -4.73

HYP6 PRO158 5.37 8.0 0.02 0.02

HYP6 TRP159 HOH8 5.73 8.0 -0.87 -0.87

HYP6 ASP160 HOH9;HOH10;HOH11;HOH49HOH51 5.56 8.0 -5.57 -5.57

HYP6 GLN215 HOH93;HOH94;HOH95 7.36 8.0 0.20 0.20

HYP6 LEU286 HOH253 7.31 8.0 0.05 0.05

GLY7 ASN154 HOH307;HOH3;HOH4 7.48 8.0 1.74 1.74

GLY7 ILE156 HOH307 7.36 8.0 0.79 0.79

GLY7 TYR157 HOH307 2.98 8.0 -3.70 -3.70

GLY7 PRO158 HOH307 6.78 8.0 -0.17 -0.17

GLY7 TRP159 HOH8 7.81 8.0 -0.64 -0.64

GLY7 GLN215 HOH307;HOH93;HOH94;HOH95 7.82 8.0 -0.28 -0.28

GLY7 LEU286 HOH307;HOH253 6.20 8.0 0.31 0.31

PHE8 ASN154 HOH382;HOH3;HOH4 6.50 8.0 -0.47 -0.47

PHE8 SER155 HOH382 6.59 8.0 -0.96 -0.96

PHE8 ILE156 HOH382 6.72 8.0 -0.84 -0.84

PHE8 TYR157 HOH382 3.35 8.0 -3.50 -3.50

PHE8 PRO158 HOH382 6.25 8.0 -0.49 -0.49

PHE8 TRP159 HOH382;HOH8 7.92 8.0 -0.32 -0.32

PHE8 GLY284 HOH382;HOH250 6.54 8.0 0.19 0.19

PHE8 TYR285 HOH382 2.40 8.0 -1.42 -1.42

PHE8 LEU286 HOH382;HOH382;HOH253 1.92 8.0 0.41 0.41

PHE8 ASN287 HOH382;HOH254;HOH256 3.63 8.0 -0.59 -0,59

PHE8 ARG288 HOH382;HOH5;HOH257;HOH258 7.13 8.0 2.88 2.88

HYP9 GLU152 HOH308;HOH254;HOH256 7.55 8.0 -0.78 -0.78

HYP9 SER153 HOH308;HOH2 4.98 8.0 -0.11 -0.11

HYP9 ASN154 HOH308;HOH3;HOH4 2.21 8.0 -2.63 -2.63

HYP9 SER155 HOH308 2.48 8.0 -3.80 -3.80

HYP9 ILE156 HOH308 2.58 8.0 -5.02 -5.02

HYP9 TYR157 HOH308 2.46 8.0 -5.11 -5.11

HYP9 PRO158 HOH308 5.62 8.0 -0.34 -0.34

HYP9 TRP159 HOH8 6.69 8.0 -0.29 -0.29

HYP9 GLN215 HOH308;HOH93;HOH94;HOH95 4.63 8.0 -0.50 -0.50

HYP9 GLY217 HOH308 7.22 8.0 0.46 0.46

HYP9 GLY218 HOH308 4.21 8.0 -0.82 -0.82

HYP9 ASP219 HOH308;HOH112 7.99 8.0 -2.70 -2.70

HYP9 ASP254 HOH308 6.26 8.0 -2.89 -2.89

HYP9 GLU256 HOH308;HOH218;HOH219;HOH414 6.89 8.0 -3.20 -3.20

HYP9 VAL282 HOH308 7.51 8.0 -0.06 -0.06

HYP9 TYR285 HOH308 6.68 8.0 0.57 0.57

HYP9 LEU286 HOH308;HOH253 2.44 8.0 -2.74 -2.74

HYP9 ASN287 HOH308;HOH254;HOH256 6.77 8.0 -0.24 -0.24

HYP9 ARG288 HOH308;HOH5;HOH257;HOH258 5.40 8.0 0.87 0.87

GLY10 ASN154 HOH309;HOH3;HOH4 4.63 8.0 -1.68 -1.68

GLY10 SER155 HOH309 5.33 8.0 -1.86 -1.86

GLY10 ILE156 HOH309 7.81 8.0 -0.24 -0.24

GLY10 TYR157 HOH309 7.38 8.0 0.01 0.01

GLY10 GLU256 HOH309;HOH218;HOH219;HOH414 7.32 8.0 3.08 3.08

GLY10 LEU286 HOH309;HOH253 6.74 8.0 -0.47 -0.47

GLY10 ARG288 HOH309;HOH5;HOH257;HOH258 7.83 8.0 -1.78 -1.78

Energia (kcal/mol)Resíduo - Colágeno

(Cadeia A)Resíduo - Integrina H2O (Envolvidas na Interação) Distância (Å) Raio (Å)

85

Tabela A.1 - (Continuação) Interações realizadas entre os resíduos da cadeia A do colágeno e os

resíduos do domínio-I α2 da integrina α2β1.

GLU11 ASN154 HOH387;HOH3;HOH4 7.65 8.0 -3.05 -3.05

GLU11 SER155 HOH387 7.79 8.0 0.20 0.20

GLU11 GLU256 HOH387;HOH218;HOH219;HOH414 7.83 8.0 41.69 41.69

GLU11 LEU286 HOH387;HOH253 7.98 8.0 -3.18 -3.18

GLU11 ASN287 HOH387;HOH254;HOH256 7.06 8.0 3.17 3.17

GLU11 ARG288 HOH387;HOH5;HOH257;HOH258 7.44 8.0 -35.19 -35.19

ARG12 ASN154 HOH310;HOH3;HOH4 6.43 8.0 2.15 2.15

ARG12 SER155 HOH310 5.22 8.0 -0.54 -0.54

ARG12 ASP219 HOH310;HOH112 3.07 8.0 -40.17 -40.17

ARG12 LEU220 HOH310 4.89 8.0 0.64 1.09

ARG12 THR221 HOH310 5.22 8.0 74.35 -1.80

ARG12 ASN222 HOH310;HOH120;HOH121;HOH122 6.52 8.0 1.00 1.62

ARG12 ASP254 HOH310 7.71 8.0 -38.27 -38.27

ARG12 GLY255 HOH310;HOH215 6.71 8.0 0.87 0.87

ARG12 GLU256 HOH310;HOH218;HOH219;HOH414 2.97 8.0 -68.38 -68.38

ARG12 SER257 HOH310 2.91 8.0 -7.48 -7.48

ARG12 HIS258 HOH310;HOH222 2.21 8.0 0.26 0.26

ARG12 ASP259 HOH310;HOH225 5.93 8.0 -32.63 -32.63

ARG12 GLY260 HOH310;HOH227 6.31 8.0 0.75 0.75

ARG12 LEU286 HOH310;HOH253 7.78 8.0 0.13 0.13

ARG12 ARG288 HOH310;HOH5;HOH257;HOH258 6.74 8.0 34.40 34.40

ARG12 ASP292 HOH310;HOH261;HOH262 7.89 8.0 -35.48 -35.48

ARG12 ASN295 HOH310;HOH263;HOH264;HOH265 7.83 8.0 2.02 2.02

ARG12 LEU296 HOH310 5.66 8.0 -0.92 -0.92

ARG12 GLU299 HOH310 7.69 8.0 -34.71 -34.71

GLY13 ASN154 HOH311;HOH3;HOH4 6.38 8.0 0.25 0.25

GLY13 SER155 HOH311 7.98 8.0 -0.01 -0.01

GLY13 ASP219 HOH311;HOH112 6.57 8.0 0.86 0.86

GLY13 LEU220 HOH311 7.71 8.0 -0.26 -0.16

GLY13 HIS258 HOH311;HOH222 5.78 8.0 0.20 0.20

PRO14 HIS258 HOH311;HOH222 7.43 8.0 -0.69 -0.69

HYP15 HIS258 HOH311;HOH222 6.96 8.0 0.04 0.04

GLY16 HIS258 HOH311;HOH222 6.65 8.0 0.14 0.14

-191.10 -266.08ENERGIA TOTAL

86

Tabela A.2 - Interações realizadas entre os resíduos da cadeia B do colágeno e os resíduos do domínio-I

α2 da integrina α2β1.

Mg_THR221 Mg_GLU33

GLY26 TYR157 7.04 8.0 0.20 0.20

PRO27 TYR157 6.12 8.0 0.23 0.23

HYP28 TYR157 HOH350 6.72 8.0 -0.54 -0.54

GLY29 ASN154 HOH3;HOH4 6.45 8.0 -0.82 -0.82

GLY29 ILE156 7.86 8.0 -0.37 -0.37

GLY29 TYR157 4.76 8.0 -0.12 -0.12

GLY29 GLN215 HOH93;HOH94;HOH95 7.40 8.0 -0.12 -0.12

GLY29 LEU286 HOH253 7.74 8.0 0.15 0.15

PHE30 GLU152 HOH2 5.65 8.0 0.03 0.03

PHE30 SER153 5.71 8.0 0.40 0.40

PHE30 ASN154 HOH3;HOH4 2.24 8.0 -2.58 -2.58

PHE30 SER155 4.78 8.0 -0.36 -0.36

PHE30 ILE156 4.58 8.0 -0.28 -0.28

PHE30 TYR157 4.17 8.0 -0.18 -0.18

PHE30 PRO158 6.55 8.0 -0.03 -0.03

PHE30 TRP159 HOH8 4.55 8.0 -0.25 -0.25

PHE30 ASP160 HOH9;HOH10;HOH11;HOH49;HOH51 7.71 8.0 -0.13 -0.13

PHE30 ALA188 7.98 8.0 0.15 0.15

PHE30 SER214 HOH91 6.30 8.0 0.07 0.07

PHE30 GLN215 HOH93;HOH94;HOH95 2.56 8.0 -5.00 -5.00

PHE30 TYR216 3.89 8.0 -0.59 -0.59

PHE30 GLY217 2.65 8.0 -0.66 -0.66

PHE30 GLY218 4.14 8.0 -0.13 -0.13

PHE30 ASP219 HOH112 6.50 8.0 -1.33 -1.33

PHE30 LEU286 HOH253 7.66 8.0 -0.18 -0.18

HYP31 SER153 HOH351 7.07 8.0 -0.90 -0.90

HYP31 ASN154 HOH351;HOH3;HOH4 2.53 8.0 -4.65 -4.65

HYP31 SER155 HOH351 5.41 8.0 0.29 0.29

HYP31 ILE156 HOH351 7.24 8.0 0.66 0.66

HYP31 TYR216 HOH351 7.76 8.0 0.15 0.15

HYP31 GLY217 HOH351 5.93 8.0 -0.54 -0.54

HYP31 GLY218 HOH351 5.53 8.0 0.48 0.48

HYP31 ASP219 HOH351;HOH112 5.04 8.0 1.59 1.59

GLY32 SER153 7.78 8.0 -0.09 -0.19

GLY32 ASN154 HOH3;HOH4 3.55 8.0 -2.82 -3.35

GLY32 SER155 5.04 8.0 -0.11 0.43

GLY32 ILE156 7.66 8.0 0.01 -0.06

GLY32 GLY218 5.54 8.0 -0.01 0.07

GLY32 ASP219 HOH112 4.07 8.0 0.97 -0.06

GLY32 LEU220 7.00 8.0 -0.02 -0.02

GLY32 GLU256 HOH218;HOH219;HOH414 7.51 8.0 -1.45 -0.90

GLY32 HIS258 HOH222 6.89 8.0 0.14 0.33

GLU33 ASP151 HOH413 5.50 8.0 4.05 -77.76

GLU33 GLU152 HOH2 6.34 8.0 33.45 57.24

GLU33 SER153 2.33 8.0 4.65 -13.76

GLU33 ASN154 HOH3;HOH4 2.31 8.0 -15.41 -8.56

GLU33 SER155 1.95 8.0 -9.75 -22.55

Raio (Å)Energia (kcal/mol)Resíduo - Colágeno

(Cadeia B)Resíduo - Integrina H2O (Envolvidas na Interação) Distância (Å)

87

Tabela A.2 – (Continuação) Interações realizadas entre os resíduos da cadeia B do colágeno e os resíduos

do domínio-I α2 da integrina α2β1.

GLU33 ILE156 4.29 8.0 1.17 -2.51

GLU33 TYR187 7.35 8.0 -1.56 -2.72

GLU33 ALA188 5.93 8.0 -0.52 -2.45

GLU33 ASN189 HOH30 5.96 8.0 0.86 1.54

GLU33 GLN215 HOH93;HOH94;HOH95 7.28 8.0 1.25 -2.98

GLU33 GLY217 6.38 8.0 -1.82 -0.34

GLU33 GLY218 2.61 8.0 6.43 2.93

GLU33 ASP219 HOH112 2.15 8.0 40.24 -60.38

GLU33 LEU220 3.26 8.0 -2.36 -4.18

GLU33 THR221 2.51 8.0 -181.28 -17.64

GLU33 ASN222 HOH120;HOH121;HOH122 6.48 8.0 -1.51 1.51

GLU33 THR223 HOH266 7.74 8.0 1.50 -1.03

GLU33 ASP254 5.63 8.0 44.17 -74.50

GLU33 GLU256 HOH218;HOH219;HOH414 4.75 8.0 57.17 -94.64

GLU33 SER257 5.65 8.0 -1.26 -1.89

GLU33 HIS258 2.08 8.0 -6.89 0.90

GLU33 ARG288 HOH5;HOH257;HOH258 7.76 8.0 -30.62 34.22

ARG34 SER153 HOH354 6.94 8.0 0.26 0.78

ARG34 ASN154 HOH354;HOH3;HOH4 5.72 8.0 -0.38 -3.40

ARG34 SER155 HOH354 6.98 8.0 2.85 -0.34

ARG34 ASN189 HOH354;HOH30 3.53 8.0 -9.92 -12.25

ARG34 ASN190 HOH354;HOH31;HOH32;HOH33;HOH34 7.45 8.0 -1.76 -0.37

ARG34 GLY218 HOH354 5.56 8.0 7.03 1.04

ARG34 ASP219 HOH354;HOH112 1.89 8.0 -102.36 -80.63

ARG34 LEU220 HOH354 2.00 8.0 -5.20 -5.20

ARG34 THR221 HOH354 5.57 8.0 63.29 -1.47

ARG34 ASN222 HOH354;HOH120;HOH121;HOH122 7.13 8.0 -0.90 -0.90

ARG34 GLU256 HOH354;HOH218;HOH219;HOH414 6.36 8.0 -35.20 -25.68

ARG34 SER257 HOH354 7.43 8.0 0.26 0.54

ARG34 HIS258 HOH354 1.88 8.0 -3.40 -5.90

GLY35 ASP219 HOH112 5.93 8.0 5.59 5.59

GLY35 LEU220 4.83 8.0 -0.41 -0.10

GLY35 THR221 7.14 8.0 1.36 0.03

GLY35 GLU256 HOH218;HOH219;HOH414 6.97 8.0 1.95 1.95

GLY35 SER257 7.05 8.0 -0,.92 -0.92

GLY35 HIS258 2.71 8.0 -4.12 -4.12

PRO36 ASP219 HOH112 5,33 8.0 1.82 1.82

PRO36 LEU220 6,12 8.0 -0.18 -0.06

PRO36 THR221 7,11 8.0 -0.27 -0.22

PRO36 GLU256 HOH218;HOH219;HOH414 5,65 8.0 -0.87 -0.87

PRO36 SER257 4,96 8.0 -1.07 -1.07

PRO36 HIS258 2,79 8.0 -3.28 -3.28

PRO36 ASP259 HOH225 6,85 8.0 0.08 0.08

PRO36 GLY260 HOH227 7,28 8.0 -0.08 -0.08

HYP37 LEU220 HOH355;HOH356 4,66 8.0 -0.46 -0.97

HYP37 THR221 HOH355;HOH356 6,59 8.0 -7.51 -0.11

HYP37 ASN222 HOH355;HOH356 2,12 8.0 0.31 0.15

HYP37 GLU256 HOH355;HOH356;HOH218;HOH219;HOH414 7,03 8.0 1.03 1.03

HYP37 SER257 HOH355;HOH356 4,39 8.0 0.48 0.48

HYP37 HIS258 HOH355;HOH356 2,2 8.0 -5.08 -5.08

HYP37 ASP259 HOH355;HOH356 4,11 8.0 -1.75 -1.75

HYP37 GLY260 HOH355;HOH356 4,96 8.0 -0.22 -0.22

HYP37 SER261 HOH228;HOH229 4,99 8.0 -0.13 -0.13

HYP37 MET262 HOH355;HOH356 7,45 8.0 -2.59 -2.59

GLY38 HIS258 7,22 8.0 0.56 0.56

GLY38 SER261 HOH228;HOH229 7,79 8.0 -0.25 -0.25

HYP40 SER261 HOH357;HOH358;HOH228;HOH229 6,21 8.0 -1.58 -1.58

-138.23 -454.60ENERGIA TOTAL

88

Tabela A.3 –Interações realizadas entre os resíduos da cadeia C do colágeno e os resíduos do domínio-I

α2 da integrina α2β1.

Mg_THR221 Mg_GLU33

HYP47 PRO158 HOH379 7.87 8.0 0.07 0.07

HYP47 TYR285 HOH379 7.02 8.0 0.70 0.70

HYP47 LEU286 HOH379;HOH253 7.56 8.0 0.14 0.14

GLY48 TYR157 5.55 8.0 0.34 0.34

PRO49 TYR157 7.39 8.0 -0.34 -0.34

HYP50 TYR157 HOH381;HOH383;HOH384 7.22 8.0 -0.30 -0.30

HYP50 LEU286 HOH381;HOH383;HOH384;HOH253 6.75 8.0 0.96 0.96

HYP50 ASN287 HOH381;HOH383;HOH384 7.57 8.0 -0.29 -0.29

GLY51 ASN154 HOH3;HOH4 6.54 8.0 0.50 0.50

GLY51 SER155 8.00 8.0 0.01 0.01

GLY51 TYR157 7.91 8.0 0.03 0.03

GLY51 LEU286 HOH253 7.96 8.0 -0.25 -0..25

PHE52 ASN154 HOH3;HOH4 6.76 8.0 -0.45 -0.45

HYP53 ASN154 HOH385;HOH386;HOH3;HOH4 7.92 8.0 -1.00 -1.00

GLY54 ASN154 HOH389;HOH3;HOH4 6.14 8.0 0.99 0.99

GLY54 ASP219 HOH389;HOH112 5.55 8.0 -3.52 -3.52

GLY54 HIS258 HOH389;HOH222 7.02 8.0 0.54 0.54

GLU55 ASN154 HOH390;HOH391;HOH3;HOH4 7.04 8.0 -3.24 -3.24

GLU55 ASP219 HOH390;HOH391;HOH112 4.77 8.0 36.98 36.98

GLU55 LEU220 HOH390;HOH391 7.03 8.0 1.56 -0.25

GLU55 HIS258 HOH390;HOH391;HOH222 6.43 8.0 -3.03 -3.03

ARG56 ASP219 HOH392;HOH393;HOH394;HOH112 7.11 8.0 -33.89 -3.,89

ARG56 LEU220 HOH392;HOH393;HOH394 5.94 8.0 -0.26 1.00

ARG56 HIS258 HOH392;HOH393;HOH394;HOH222 6.78 8.0 1.24 1.24

GLY57 ASP219 HOH112 6.57 8.0 4.25 4.25

GLY57 LEU220 4.81 8.0 -0.07 -0.02

GLY57 HIS258 HOH222 4.48 8.0 -0.20 -0.20

PRO58 ASN189 HOH30 7.77 8.0 -0.36 -0.36

PRO58 ASP219 HOH112 6.00 8.0 -1.00 -1.00

PRO58 LEU220 2.68 8.0 -0.69 -1.43

PRO58 THR221 7.05 8.0 -0.30 0.04

PRO58 ASN222 HOH120;HOH121;HOH122 5.25 8.0 -0.80 -1.02

PRO58 SER257 7.77 8.0 0.30 0.30

PRO58 HIS258 HOH222 3.13 8.0 -88 -0.88

PRO58 ASP259 HOH225 7.04 8.0 -0.63 -0.63

HYP59 LEU220 6.81 8.0 -0.08 -0.08

HYP59 HIS258 HOH222 7.56 8.0 0,03 0.03

GLY60 HIS258 HOH395;HOH222 7.64 8.0 -0,54 -0.54

GLY60 SER261 HOH395;HOH228;HOH229 7.41 8.0 -0.33 -0.33

PRO61 HIS258 HOH222 6.99 8.0 -0.59 -0.59

PRO61 ASP259 HOH225 7.27 8.0 0.14 0.14

PRO61 SER261 HOH228;HOH229 4.56 8.0 -0.59 -0.59

PRO61 MET262 7.53 8.0 -1.79 -1.79

HYP62 SER261 HOH396;HOH397;HOH228;HOH229 7.83 8.0 0.18 0.18

-6.44 -7.57

Energia (kcal/mol)

ENERGIA TOTAL

Resíduo - Colágeno

(Cadeia C)Resíduo - Integrina H2O (Envolvidas na Interação) Distância (Å) Raio (Å)