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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO ANTIOXIDANTE UTILIZANDO SISTEMA SISTEMA β β -CAROTENO/ÁCIDO -CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE LINOLÉICO E MÉTODO DE SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 446-452, abr.-jun. 2006

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO SISTEMA β -CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH. Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 446-452, abr.-jun. 2006. - PowerPoint PPT Presentation

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO ANTIOXIDANTE UTILIZANDO

SISTEMA SISTEMA ββ-CAROTENO/ÁCIDO -CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE LINOLÉICO E MÉTODO DE

SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPHSEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH

Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 446-452, abr.-jun. 2006

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Introdução:Introdução:

Radicais de oxigênio e ânion superóxido → papel importante nas reações bioquímicas/fisiológicas do corpo humano;

Produção excessiva

processos patofisiológicos ou fatores ambientais adversos

falta de antioxidantes disponíveis in vivo

podem ocorrer doenças e danos profundos em tecidos

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Introdução:Introdução:

ANTIOXIDANTES → retardam a velocidade da oxidação, através de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e complexação de metais;

Compostos fenólicos

potentes antioxidantes

Acerola → ácido ascórbico

Morango, amora e açaí → determinados grupos de flavonóides como antocianinas, flavonóis e flavonas

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Introdução:Introdução:

MÉTODO DE OXIDAÇÃO DO Β-CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO

avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico

O método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação

oxidativa do ácido linoléico

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Objetivo:Objetivo:

A proposta do presente trabalho foi avaliar a atividade antioxidante de compostos puros e extratos de frutas, por

meio de dois métodos, com o objetivo de otimizar a velocidade de aquisição de dados, reduzindo também as

quantidades de reagentes e de amostras.

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos:

Frutos in natura

açaí (Euterpe oleracea Martius) acerola (Malpighia glabra L.)

amora (Rubus L.) e morango (Fragaria x ananassa Duch.)

adquiridos na Ceagesp (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo)

estágio maduro prontos para consumo

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos:

Após os frutos serem lavados em água corrente, foram cortados em pedaços, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80ºC até o momento das análises, quando foram triturados e homogeneizados em gral com pistilo, sob nitrogênio líquido;

Preparo dos extratos dos frutos:

extração realizada em duplicata; homogeneizou-se 1 g de amostra + 20 mL de metanol 70% em Ultra-Turrax por 1 min em velocidade média, em banho de gelo;filtrado em papel de filtro Whatman nº 6. refiltrado e os extratos obtidos foram reunidos, ajustando-se o volume final para 50 mL com metanol 70%.

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos:

Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:

Mistura reativa → 20 μL de ácido linoléico + 200 mg de Tween 40 + 25 μL de solução de β-caroteno a 2 mg/mL em clorofórmio + 500 μL de clorofórmio em

erlenmeyer

Completa evaporação do clorofórmio sob N2

adicionou-se 25 mL de água previamente saturada com oxigênio durante 30 min

agitou-se vigorosamente

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:

Mistura reativa límpida com absorbância entre 0,6 e 0,7 em 470 nm;

Determinação das absorbâncias → microplaca de poliestireno com 96 cavidades (λ entre 340 e 800 nm);

Cada cavidade da microplaca → 250 μL mistura reativa + 10 μL de metanol (controle) ou o mesmo volume para as soluções padrão ou extratos das amostras;

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:

Placa incubada 45ºC (acelerar as reações de oxidação e iniciar o descoramento do

β-caroteno);

Leituras realizadas imediatamente e com intervalos de 15 min, durante 120 min, em espectrofotômetro de microplaca Benchmark Plus;

As curvas foram preparadas com 100, 200, 300, 400, 500 e 600 μmoles de ácido ascórbico, 25, 50, 100, 150 e 200 μmoles de BHA e BHT e 150, 300, 450, 600 e 750 μmoles de quercetina.

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:

Resultados foram expressos como porcentagem de inibição da oxidação, que foi calculada em relação ao decaimento da absorbância do controle (Ac);

A queda da absorbância das amostras (Aam) foi correlacionada com a queda do controle, obtendo-se a porcentagem da inibição da oxidação (% I) através da equação:

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:

Eficiência do antioxidante → valores de F1 e F2 (YANISHILIEVA & MARINOVA) calculados a partir da curva de oxidação (abs470 nm x tmin)

Eficiência em bloquear a reação em cadeia (interação com os radicais

peróxidos) → mensurada na primeira parte da curva (15 e 45 min)

A relação entre as tangentes das curvas da solução padrão e do controle expressa a eficiência do antioxidante (F1) (Equação 2):

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:

Possibilidade de o antioxidante participar de outras reações durante o processo oxidativo → medida durante a segunda parte da curva (75 e 90

min) (F2):

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Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante através do método de seqüestro de radicais livres (DPPH):

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE → capacidade dos antioxidantes em seqüestrar o radical DPPH

Foi utilizado metanol como CONTROLE e BHA, BHT, ácido ascórbico, ácido clorogênico e quercetina como PADRÕES;

Decaimento da absorbância das amostras (Aam) correlacionado ao decaimento da absorbância do controle (Ac) → porcentagem de seqüestro de radicais livres (% SRL), que pode ser expressa através da equação:

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico com microplaca de poliestireno e DPPH→ expressiva redução do uso de reagentes e de amostras (95%);

Sistema β-caroteno/ácido linoléico → leituras no leitor de microplaca são automáticas e seqüenciais → maior precisão e não requer a presença do analista durante o ensaio;

Determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico:

BHA e BHT → ampla utilização na indústria alimentícia;

QUERCETINA e ÁCIDO ASCÓRBICO → normalmente presentes em frutas e vegetais;

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

ÁCIDO ASCÓRBICO → conhecido por sua atividade antioxidante e por isso é utilizado em cosméticos ou em tratamentos de doenças degenerativas;

Após o Ác. Ascórbico doar

os 2 H redutores, ficou passível de receber elétrons, devido ao radical

ascorbila formado, que é

um agente oxidante

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável;

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Maior percentagem de

inibição em menor concentração

Estrutura semelhante a

quercetina, mas com glicosídeo na OH →

Menor atividade

↓ atividade antioxidante →

poucas OH redutoras

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável;

Valores de F1 e F2 próximos de 1 → menor atividade antioxidante;

F1 → ação sobre o BLOQUEIO DE PERÓXIDOS;

F2 → ação antioxidante em outras reações durante a oxidação;

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Atividade antioxidante através do método de seqüestro de radicais livres (DPPH)

Transferência de elétrons de um composto antioxidante para o DPPH, que ao se reduzir perde sua coloração púrpura;

Avalia apenas o poder redutor do antioxidante → não detecta substâncias pró-oxidantes;

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Radical ascorbila não interfere na reação nesse

sistema → Ação antioxidante

Maior porcentagem de seqüestro de

radicais livres em comparação ao BHA e o BHT.

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Resultados e discussão:Resultados e discussão:

Menor atividade que acerola e amora nesse

sistema

Maior porcentagem de seqüestro de radicais livres →

ácido ascórbico → ação antioxidante

Menor atividade em ambos os

sistemas

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Conclusões:Conclusões:

Atividade antioxidante dos extratos das frutas mostrou-se de acordo com a dos padrões analisados;

Sistema β-caroteno/ácido linoléico → extrato de ACEROLA comportou-se como PRÓ-OXIDANTE e o AÇAÍ, a AMORA e o MORANGO comportaram-se como ANTIOXIDANTES;

Seqüestro de radicais livres (DPPH) → extrato de ACEROLA apresentou a maior atividade antioxidante, seguido pelos extratos de AMORA, AÇAÍ e MORANGO;

ÁCIDO ASCÓRBICO → comportamento relacionado nos dois sistemas;

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Conclusões:Conclusões:

Adaptações dos métodos utilizando microplacas permitiram a realização de múltiplas análises, minimizaram o uso de reagentes e reduziram significativamente a quantidade de amostra necessária;

A automatização das leituras de absorbância simplificou e reduziu o tempo e o trabalho despendido pelo analista, proporcionando também grande precisão nos resultados.