Introdução e objectivos.pdf

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    1. INTRODUO E OBJECTIVOS

    A enzima -galactosidase (EC.3.2.1.23), comummente conhecida como

    lactase, a enzima que catalisa a hidrlise dos resduos terminais no redutores

    dos resduos -D-galactose em -D-galactosideos. Convencionalmente, a sua

    aplicao principal a hidrlise da lactose de leite e derivados, particularmente

    soro de leite. Recentemente, tm sido extensivamente estudadas -

    galactosidases com actividade transglicoltica para a produo de alimentos

    funcionais (1,2,3).

    So muitos os organismos que sintetizam naturalmente a -

    galactosidase, includo microorganismos, plantas e clulas animais.

    Normalmente, so mais utilizadas em indstria as enzimas extradas de

    Aspergillus spp e de Kluyveromyces spp. uma vez que so obtidas a partir de

    culturas destes microrganismos com produtividade e rendimento aceitveis,

    tendo a vantagem de que os produtos so geralmente reconhecidos como

    seguros (GRAS) para consumo humano, o que crtico para aplicaes

    relacionadas com alimentao (4).

    Uma das principais razes que tem levado ao estudo intensivo desta

    enzima e das suas diversas aplicaes a possibilidade da obteno de

    alimentos sem lactose e que, por isso, possam ser consumidos por pessoas

    intolerantes a este dissacardeo, sem prejuzo do restante aporte nutricional

    benfico fornecido por tais alimentos quando inseridos numa alimentao

    equilibrada.

    1.1. Lactose

    A lactose (figura 1), juntamente com a maltose e a sacarose, um dos

    dissacardeos fisiologicamente mais importantes. Os dissacardeos so acares

    formados por dois resduos de monossacardeos unidos por uma ligao

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    glicosdica. Os seus nomes qumicos baseiam-se nos seus monossacardeos

    constituintes.

    A principal fonte de lactose o leite, numa percentagem que varia entre 4,2

    e os 4,9 deste acar (5) (tabela 1).

    Figura 1. Molcula de lactose

    Tabela 1. Percentagem de lactose em leite e derivados (5)

    Alimento Quantidade de lactose (g/100 g

    de alimento) Leite de vaca esterilizado gordo 4,5

    Leite de vaca esterilizado meio-gordo 4,7

    Leite de vaca esterilizado magro 4,7

    Leite de vaca pasteurizado gordo 4,7

    Leite de vaca UHT gordo 4,7

    Leite de vaca UHT meio-gordo 4,9

    Leite de vaca UHT magro 4,9

    Leite de cabra cru 4,6

    Leite de ovelha cru 4,2

    Leite humano 7,5

    Nata maturada pasteurizada com 30% de gordura 2,7

    Queijo flamengo com 30% ou 45% de gordura 0,2

    Requeijo com 13% de protena 5,1

    Queijo fresco 1,5

    Iogurte natural slido meio-gordo 5,0

    Iogurte aucarado batido meio-gordo 6,4

    Iogurte lquido meio-gordo 3,9

    A solubilidade e o poder edulcorante da lactose so baixos quando

    comparado com outros acares, incluindo a glucose, galactose, frutose e

    sacarose (6). Este acar higroscpico tem uma forte tendncia para absorver

    sabores e odores e tem um efeito laxativo quando consumido em grandes

    quantidades. Contudo, a hidrlise da lactose diminu os problemas de

    precipitao e aumenta o seu poder edulcorante (4).

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    A hidrlise da lactose em glucose e galactose pela -galactosidase um

    processo importante na indstria alimentar devido ao seu potencial efeito

    benfico na assimilao de produtos que contm lactose por pessoas com

    dificuldade ou intolerncia (7,8). Tem tambm aplicaes tecnolgicas e

    industriais, tais como a elaborao de leite com sabor doce, de boa

    aceitabilidade, e que pode ser consumido por indivduos intolerantes lactose,

    formao de galactooligossacridos atravs de reaces de transglicosilao

    durante a hidrlise da lactose que devido ao seu efeito pr-bitico favorecem o

    crescimento de bactrias benficas da microflora intestinal (1,9); melhoramento

    nas caractersticas tecnolgicas e sensoriais de alimentos que contm lactose

    hidrolisada proveniente de leite ou soro de leite, tais como aumento da

    solubilidade (evitando a cristalizao da lactose e o aspecto arenoso em gelados

    e produtos condensados ou em p) e aumento do poder edulcorante com

    menor valor calrico dos produtos. Muitos produtos com baixo teor em lactose

    (como por exemplo: leite sem lactose ou com percentagem reduzida de lactose,

    gelados elaborados com leite sem lactose, queijos curados) tm aplicaes na

    alimentao humana e alimentao animal (10).

    Para alm do leite, a principal fonte de lactose o soro de queijo, que o

    principal subproduto da indstria queijeira. Cerca de 9 litros de soro de queijo

    so gerados durante a produo de 1 Kg de queijo (4). Estima-se que todos os

    anos 145 x 106 toneladas de soro de queijo e 6 x 106 toneladas de lactose sejam

    produzidos mundialmente. Infelizmente, nos ltimos cinquenta anos, metade

    da produo anual no foi transformada em subprodutos mas deitados

    directamente em habitats aquosos. Esta situao cria enormes problemas

    ambientais e necessita de novas estratgias para a recuperao de subprodutos

    (11). A carga orgnica do soro de queijo elevada principalmente devido ao seu

    contedo em lactose, que, juntamente com as elevadas quantidade de soro de

    queijo que so geradas, faz com que este subproduto se torne um problema

    ambiental e so requeridas solues para a sua revalorizao. Deste modo, a

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    bioconverso da lactose do soro de queijo por -galactosidase desempenha um

    papel fundamental por ampliar as aplicaes do soro de queijo reduzindo mais

    de 75% a poluio e gerando produtos de interesse para alimentao animal,

    nutrio humana e confeitaria, uso farmacutico e agrcola (4,11).

    1.2 Intolerncia lactose

    A intolerncia lactose mais comum a um hidrato de carbono e pode

    afectar pessoas de todos os grupos etrios, apesar de ocorrer com mais

    frequncia em idades avanadas. A intolerncia lactose causada pela

    deficincia em lactase (-galactosidase), a enzima que digere o acar do leite, a

    lactose (12).

    No organismo humano, a -galactosidase est localizada nas

    microvilosidades do intestino delgado (13). Devido aos baixos nveis da enzima

    no intestino, grande parte da populao demostra intolerncia lactose e, em

    consequncia, tem dificuldade em digerir leite e lacticnios (14).

    A lactose um dissacardeo formado por glucose e galactose que se

    encontra em grande abundncia no leite. Nos seres humanos, a intolerncia

    lactose ou a m-absoro de lactose um problema comum. Est estimado que

    mais de 70% da populao adulta no mundo tenha problemas a digerir a

    lactose, resultado da reduzida ou falta de actividade da -galactosidase no

    intestino delgado (13). Geralmente, a actividade da enzima lactase diminui

    exponencialmente ao longo da vida (15), atingindo cerca de 10% do valor

    nascena. Mesmo em adultos que retm nveis elevados de lactase (75% - 85%

    dos caucasianos adultos) a quantidade de lactase cerca de metade quando

    comparada com as outras sacaridases tais como a sucrase, a -dextrinase ou a

    glucoamilase (12).

    A diminuio ou falta de lactase , geralmente, denominada por

    hipolactasia. H trs tipos de hipolactsia: hipolactsia primria, hipolactsia

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    secundria e alactsia congnita. A hipolactsia primria a mais comum e

    corresponde ao decrscimo dos nveis da enzima verificado ao longo da vida em

    certas populaes e indivduos. Segue-se a hipolactsia secundria ou adquirida

    que pode ter origem numa doena gastrointestinal que danificou as

    microvilosidades ou que pode surgir como consequncia de uma infeco do

    intestino delgado, afeces inflamatrias, HIV ou malnutrio sendo que nas

    crianas geralmente secundria a infeces virais ou bacterianas. A alactsia

    congnita o tipo mais raro pois corresponde a ausncia completa da produo

    de lactose (12,13).

    Em todos os casos, a lactose no hidrolisada em galactose e glucose no

    intestino delgado, passando para o clon onde as bactrias da microflora do

    clon fermentam a lactose originando cidos gordos de cadeia curta e gases,

    dixido de carbono e hidrognio, causando sintomas como dor abdominal,

    nuseas, diarreia e flatulncia. A extenso destes sintomas varivel de

    indivduo para indivduo. O consumo de pequenas quantidades poder ser

    tolerado por alguns indivduos pois dever ter poucas consequncias uma vez

    que os cidos gordos de cadeia curta so prontamente absorvidos e os gases

    podem ser absorvidos ou expelidos. Grandes quantidades, normalmente

    superiores a 12 gramas, consumidas num nico alimento (quantidade

    tipicamente encontrada em 240 ml de leite) podero resultar numa maior

    entrada de substrato no clon do que aquela que consegue ser eliminada por

    um processo normal.

    A actividade da lactase pode tambm ser retardada ou diminuda aps

    nutrio parentrica prolongada. A m digesto da lactose com todos estes

    sintomas tambm pode ocorrer em adultos com o Sndrome do Clon Irritvel

    ou em crianas com dores abdominais recorrentes.

    A deficincia em lactase geralmente diagnosticada com base em:

    1. Historial dos sintomas gastrointestinais que ocorrem aps ingesto

    de leite;

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    2. Teste para nveis anormais de hidrognio no hlito;

    3. Teste de anormal tolerncia lactose o teste de tolerncia

    lactose foi originalmente baseado numa dose oral de lactose de 50g.

    Recentemente, doses menores do que 50g de lactose foram usadas de modo a

    aproximar o real consumo de lactose em lacticnios (12,16).

    Os sintomas da intolerncia lactose so aliviados pela reduo do

    consumo de alimentos que contenham lactose. Uma dieta completamente

    isenta de lactose poder no ser necessria nas pessoas com deficincia em

    lactase uma vez que o grau de intolerncia lactose muito varivel de

    individuo para individuo e a maioria dos pacientes no requer uma total evico

    da lactose da sua dieta. Assim sendo, os produtos lcteos no devero ser

    totalmente eliminados da alimentao uma vez que estes fornecem nutrientes

    importantes, tais como Clcio, Vitamina A e D, Riboflavina e Fsforo (Tabela 2).

    A maioria dos pacientes pode consumir quantidades entre 6 a 12 g de lactose

    por dia sem aparecimento de sintomas, especialmente quando consumidas sob

    a forma de queijo ou de lacticnios com culturas lcticas (5).

    Tabela 2. Valores nutricionais de lacticnios por 100 g de parte edvel (5)

    Alimento Energia (kCal)

    Valores por 100 g de parte edvel

    gua (g)

    Protena (g)

    Gordura total (g)

    Hidratos de

    Carbono (g)

    Vit. A (g)

    Vit. D (g)

    K (mg)

    Na (mg)

    Ca (mg)

    P (mg)

    Mg (mg)

    Leite de vaca UHT meio gordo

    47 89,1 3,3 1,6 4,9 22,0 0,05 163,0 40,0 112 81,0 9,0

    Queijo flamengo 30% gordura

    247 50,8 30,0 140,0 0,2 234 0,05 116 1032 850 500 55

    Nata maturada pasteurizada 30% gordura

    306 63 1,9 32 2,7 450 0,2 101 28 60 54 5,0

    Iogurte natural slido meio-gordo

    54 87,9 4,2 1,8 5,0 30 0 183 62 118 108 12

    Iogurte aucarado lquido meio-gordo

    69 83,6

    3,1 1,4 11,2 33 0 156 46 100 85 8,0

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    Os indivduos que possuem intolerncia lactose devero ser informados

    de que isto no significa que sejam alrgicos ao leite ou lacticnios, uma vez que

    este tipo de alergia est, geralmente, relacionado com a parte proteica destes

    produtos.

    Dado isto, h um mercado considervel para leite e derivados sem

    lactose, que podem ser obtidos por hidrlise enzimtica usando -galactosidase

    (4).

    1.3. -galactosidase

    A enzima -galactosidase a enzima que hidrolisa a lactose nos seus

    monmeros, glucose e galactose (Figura 2), sendo por esse motivo, tambm

    denominada por lactase.

    Figura 2. Hidrlise da lactose em glucose e galactose

    A enzima -galactosidase (Figura 3) pode ser obtida a partir de uma

    grande variedade de fontes, tais como microrganismos, plantas e animais. No

    entanto, de acordo com a sua origem, as suas propriedades diferem,

    essencialmente, no que respeitante s condies ptimas de aplicao da

    enzima, sobretudo na gama de pH (17). Enzimas de plantas e animais tm pouco

    valor comercial mas vrias fontes microbiolgicas de -galactosidase so de

    grande interesse tecnolgico. Os microrganismos oferecem vrias vantagens

    relativamente s outras fontes tais como fcil manuseamento, maior taxa de

    multiplicao e maior produo. Como resultado do interesse comercial na -

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    galactosidase, um grande nmero de microrganismos tm sido testados como

    fontes potenciais desta enzima (14,18).

    Figura 3. -galactosidase (http://www.sprintechnologies.com/sprin/index.jsp?idPagina=44)

    1.3.1. Fontes microbianas da enzima

    1.3.1.1. Enzimas bacterianas

    A enzima -galactosidase pode ser produzida por um vasto nmero de

    bactrias, mas as bactrias Streptococcus thermophilus e Bacillus

    stearothermophilus so consideradas as fontes primordiais bacterianas desta

    enzima (14).

    Apesar da enzima -galactosidase proveniente de Escherichia coli ser a

    mais extensivamente estudada, o seu uso industrial dificultado pelo facto de a

    sua aplicao no ser considerada segura em alimentos, ou seja, de este

    microrganismo no possuir estatuto GRAS. No entanto, a -galactosidase

    proveniente desta bactria est comercialmente disponvel para fins analticos

    (4).

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    As bactrias cido-lcticas (incluindo o grupo do lactococci,

    streptococci e lactobacilli) e as bifidobactrias (tabela 3), so organismos

    reconhecidos como seguros, ou seja, que possuem estatuto GRAS e que foram

    identificados como boas fontes de -galactosidase, especialmente para

    aplicao em alimentos funcionais (4,19,20).

    1.3.1.2. Enzimas de fungos

    A gama de pH ptimo das enzimas fngicas de 2,5 a 5,4, o que faz com

    que estas enzimas sejam apropriadas para o processamento de soro de leite

    cido. A temperatura ptima para estas enzimas alta e podem ser tipicamente

    usadas a temperaturas superiores a 50C.

    A principal fonte fngica desta enzima Aspergillus niger (14) (tabela 3).

    A purificao de -galactosidase de diferentes origens fngicas tem sido

    realizada atravs de variadas tcnicas de purificao, tais como peneiramento

    molecular, permuta inica e tcnicas cromatogrficas.

    1.3.1.3. Enzimas de leveduras

    As leveduras tm sido consideradas fontes importantes de -

    galactosidase do ponto de vista industrial.

    Com um pH ptimo prximo da neutralidade, as enzimas provenientes de

    leveduras so bastante apropriadas para hidrlise de lactose no leite, e so

    vastamente aceites como seguras para uso em alimentos (21). Tem sido

    realizada muita investigao relativamente produo de -galactosidase de

    diferentes estirpes de leveduras devido ao seu potencial (22).

    As principais leveduras utilizadas para a produo de -galactosidase so

    Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus e Kluyveromyces fragilis (14)

    (Tabela 3).

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    Tabela 3. Fontes microbianas de -galactosidase (14)

    Fonte Microorganismo

    Bactrias

    Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. Rittmannii

    Arthrobacter sp.

    Bacillus acidocaldarius, B. circulans, B. coagulans, B.subtilis, B. megaterum, B. stearothermophilus

    Bacteriodes polypragmatus

    Bifidobacterium bifidum, B. infantis

    Clostridium acetobutylicum, C. thermosulfurogens

    Corynebacterium murisepticum

    Escherichia coli

    Klebsiella pneumoniae

    Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L.kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L.delbrueckii

    Leuconostoc citrovorum

    Pediococcus acidilacti, P. pento

    Propioionibacterium shermanii

    Pseudomonas fluorescens

    Pseudoalteromonas haloplanktis

    Streptococcus cremoris, S. lactis, S. thermophius

    Sulfolobus solfatarius

    Thermoanaerobacter sp.

    Thermus rubus, T. aquaticus

    Trichoderma reesei

    Vibrio cholera

    Xanthomonas campestris

    Fungos

    Alternaria alternate, A. palmi

    Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A. Carbonarius, A. Oryzae

    Auerobasidium pullulans

    Curvularia inaequalis

    Fusarium monilliforme, F. oxysporum

    Mucor meihei, M. pusillus

    Neurospora crassa

    Penicillum canescens, P. chrysogenum, P. expansum

    Saccharopolyspora rectivergula

    Scopulariapsis sp

    Streptomyces violaceus

    Leveduras

    Bullera singularis

    Candida pseudotropicalis

    Saccharomyces anamensis, S. lactis, S. fragilis

    Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus

    Tradicionalmente, as -galactosidase mais utilizadas na indstria so as

    provenientes de Aspergillus spp e de Kluyveromyces spp porque podem ser

    obtidas prontamente e com elevado rendimento de culturas destes

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    microrganismos. Adicionalmente, produtos obtidos destes microrganismos so

    GRAS para consumo humano o que crtico na aplicao produo de

    alimentos.

    No Kluyveromyces spp, a -galactosidase intracelular. Devido sua

    natureza intracelular, a enzima necessita de ser extrada da clula da levedura

    pela disrupo da clula ou pela permeabilizao da clula atravs de

    substncias qumicas e/ou tratamentos mecnicos. So fontes fngicas desta

    enzima Kluveromyces lactis e Kluveromyces marximus (4). A lactose primeiro

    transportada para o interior da clula atravs de uma permease e depois

    hidrolisada intracelularmente a glucose e galactose que seguiro a via glicoltica.

    A enzima desta levedura tem um pH ptimo perto da neutralidade (6.0

    7.0) e, como tal, tem uma ampla gama de aplicaes, particularmente na

    hidrlise de soro de queijo, que como j foi referido anteriormente, o principal

    subproduto da indstria queijeira.

    A Lactozym 2600L, -galactosidase utilizada neste estudo, uma enzima

    livre obtida a partir de Kluyveromyces lactis, disponibilizada comercialmente

    pela Sigma-Aldrich. Esta preparao enzimtica encontra-se no estado liquido.

    Ser tambm utilizada a imibond galactosidase SPRIN, uma preparao

    de -galactosidase proveniente de Kluyveromyces lactis, disponibilizada

    comercialmente pela SPRIN technologies, j imobilizada covalentemente numa

    resina Amino Acrlica e que possu um tamanho de partcula entre os 200-

    500m.

    Kluyveromyces Lactis um ascomiceto que pertence aos

    endoascomycetales tendo sido anteriormente mal classificado como

    Saccharomyces lactis e Kluyveromyces fragilis var. lactis. Tem sido objecto de

    intensivo estudo taxonmico sendo que, hoje em dia, Kluyveromyces lactis

    considerado uma espcie nica (23).

    A sua propriedade de crescer na lactose como nica fonte de carbono

    distingue o K. lactis da maioria das outras leveduras e pode ser usada para

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    seleccionar isolados a partir de produtos da indstria de lacticnios. Por isso o

    seu nome de levedura do leite ou lctea. No entanto, este microorganismo

    pode usar uma variada gama de substratos para a respirao.

    Possui um metabolismo respiratrio fermentativo e a maioria das

    estirpes pode crescer em fontes de carbono fermentveis quando a via

    respiratria no est acessvel. No entanto, K. lactis , aparentemente, um

    aerbio estrito, que no capaz de crescer sob condies estritamente

    anaerbias.

    A utilizao de lactose uma das principais caractersticas do K. lactis e

    tem sido, por isso, bastante estudada. O metabolismo da lactose induzido e

    co-regulado com o metabolismo da galactose por um activador transcripcional,

    Lac9p ou KlGal4p. Dois genes LAC4 e LAC12, que codificam a -galactosidase e a

    lactose premiase, respectivamente, so especficos para o metabolismo da

    lactose (23).

    A -galactosidase de K. lactis (codificada pelo gene LAC4) tem um grande

    interesse em biotecnologia na indstria alimentar e na reciclagem de soro de

    queijo. A vantagem de K. lactis relativamente a A. Niger (microrganismo

    tambm bastante utilizado como fonte desta enzima) que a levedura K. lactis

    produz maiores quantidades de unidades enzimticas. Contudo, devido sua

    natureza intracelular, a produo industrial e a aplicao da -galactosidase de

    K.lactis so limitadas pelos custos associados ao processo extraco. Para

    contornar este facto, duas estratgias tm sido adoptadas para a secreo de -

    galactosidase de K. lactis: usando leveduras de estirpes com capacidade de lise

    espontnea ou atravs da utilizao de sequncias sinal de secreo heterloga

    para a produo extracelular. Nos dois casos, plasmdeos episomais so usados

    para a clonagem e expresso de -galactosidase de K. lactis recombinante (4).

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    1.3.2. Aplicao Industrial

    Apesar da enzima -galactosidase ter inmeras aplicaes na indstria

    alimentar e dos lacticnios, a moderada estabilidade da enzima livre uma das

    limitaes que impede a implementao geral de biocatalisadores escala

    industrial. Para a produo de leite sem lactose, por exemplo, a enzima -

    galactosidase pode ser adicionada directamente ao leite inteiro, mas aps o

    processo estar finalizado, a enzima pode ser desactivada pelo tratamento por

    calor. Uma vez que a enzima livre no pode ser reutilizada, este procedimento

    no economicamente vivel (14).

    Apesar de ainda haver quem utilize a enzima livre para hidrolisar a

    lactose, o alto custo da enzima e a sua moderada estabilidade fazem com a

    imobilizao da -galactosidase seja uma rea de grande interesse devido aos

    seus potenciais benefcios. A utilizao de tcnicas de imobilizao de

    importncia significativa do ponto de vista econmico porque permite a

    reutilizao da enzima, o seu uso em operaes contnuas, aumenta a

    estabilidade enzimtica e facilita a separao da enzima do substrato no final do

    processo (4, 24). No entanto, a utilizao de enzimas imobilizadas apresenta

    ainda algumas limitaes, incluindo a baixa taxa de recuperao da actividade

    enzimtica, a perda gradual da enzima durante o processo reaccional e uma

    elevada resistncia na transferncia de massa entre algumas enzimas

    imobilizadas e os substratos (4).

    1.4. Mtodos de Imobilizao Enzimtica

    Vrios tipos de suportes e tcnicas tm sido utilizados e investigados para

    a imobilizao desta enzima mas apenas alguns foram ampliados e menos ainda

    foram aplicados a nvel industrial ou semi-industrial (14). Aparentemente a

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    adequao do suporte varia de enzima para enzima e consoante o objectivo do

    seu uso sendo necessrio optimizar para cada sistema (25).

    A imobilizao de clulas ou enzimas definida como a confinao fsica

    de enzimas ou clulas ou a sua localizao numa regio ou espao definido com

    a reteno da sua actividade cataltica, que podem ser utilizadas repetida e

    continuamente (26).

    O processo de imobilizao dever ser suave o suficiente de modo a que

    a enzima no se desnature durante o processo de imobilizao (27). A enzima

    imobilizada mais facilmente manipulada e facilita a separao do produto,

    minimizando ou eliminando a contaminao de protena no produto (28).

    A tecnologia de imobilizao de -galactosidase um processo efectivo

    para a hidrlise bem-sucedida da lactose e ultrapassa os problemas associados

    aos custos da enzima solvel (21,25). Todavia, existem problemas associados

    enzima imobilizada tais como a contaminao microbiolgica e a aderncia de

    protenas. Contudo, para processos a longo termo usando enzimas imobilizadas,

    indispensvel proceder a lavagens e pasteurizaes peridicas (4).

    Em estudos anteriores (29, 30, 31) a enzima foi imobilizada de diversos

    modos, tais como:

    1. Adsoro fsica;

    2. Encapsulao;

    3. Ligao covalente.

    1.4.1. Adsoro fsica

    A adsoro fsica (Figura 4) considerada o mtodo mais simples de

    imobilizao no qual uma enzima imobilizada num transportador insolvel em

    gua e o biocatalisador mantido na superfcie do transportador por foras

    fsicas (fora de Van der Waals). Frequentemente, esto presentes foras

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    adicionais na interaco entre o transportador e o biocatalizador principalmente

    interaces hidrofbicas, pontes de hidrognio e ligaes heteropolares

    (inicas). Este mtodo tem a vantagem de ser de simples realizao e de ter

    pouca influncia na conformao do biocatalizador. No entanto, as

    desvantagens desta tcnica so a relativa fragilidade nas foras de ligao

    adsortivas. Diferentes materiais de suporte inorgnicos (alumnio, slica, vidro

    poroso, terra diatomcea, argila, bentonite) e orgnicos (celulose, amido,

    carvo activado e resinas inicas como a amberlite, Sephadex, Dowex) podem

    ser usados para adsoro enzimtica. A adsoro da enzima tambm pode ser

    estabilizada por tratamento com gluteraldedo (14,26).

    1.4.2. A Encapsulao

    A encapsulao o mtodo que visa colocar a enzima num invlucro de

    pequenas dimenses (Figura 4). A encapsulao em membrana e em matriz

    (incluindo microencapsulao) so os principais mtodos de encapsulao. A

    principal vantagem da tcnica de encapsulao a simplicidade pela qual as

    partculas esfricas so obtidas pela extruso de uma suspenso de polmero-

    clula num meio contendo ies de carga positiva ou atravs de polimerizao

    trmica. Para alm disso, as esferas formadas, particularmente as esferas de

    alginato, so transparente e, normalmente, mecanicamente estveis. A principal

    limitao desta tcnica para a imobilizao de enzimas a possvel lenta perda

    de enzima durante o uso continuado. Contudo, melhoramentos podero ser

    realizados atravs da utilizao de procedimentos de ligao apropriados. As

    matrizes usadas so normalmente feitas de polmeros tais como o alginato de

    clcio, agar, k-carregenina, poliacrilamida, quitosano e colagnio. No entanto,

    algumas matrizes slidas como o carvo activado e a terra de diatomcea,

    tambm podem ser usadas para imobilizao. As membranas normalmente

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    utilizadas para encapsulao de enzimas so nylon, celulose, polisulfone e

    poliacrilamida. (14,26)

    Este mtodo o utilizado neste estudo.

    1.4.3. Ligao Covalente

    No mtodo de ligao covalente h uma reteno da enzima numa

    superfcie de suporte atravs da formao de uma ligao covalente. As enzimas

    ligam-se a um suporte atravs de certos grupos funcionais tais como o grupo

    amina, carboxilo, hidroxilo e sulfidrilo. Estes grupos funcionais no devero

    estar no centro activo da enzima. frequente que se recomende que a

    imobilizao seja realizada na presena de substrato ou de um inibidor

    competitivo para que se proteja o stio activo num suporte. Os grupos

    funcionais no material de suporte so normalmente activados atravs de um

    reagente qumico tal como brometo cianogenico, carbodimida e gluteraldedo.

    Cascas de ovo partidas em pequenos pedaos podem ser bons transportadores

    para imobilizao de -galactosidase devido ao seu baixo custo, boa resistncia

    mecnica e resistncia a ataques microbianos (14,26) (Figura 4).

    Figura 4. Esquema dos vrios mtodos de imobilizao. (26)

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    1.5.Cintica Enzimtica

    A cintica enzimtica o estudo da velocidade de uma reaco qumica

    que ocorre na presena de uma enzima. Permite compreender melhor os

    pormenores do mecanismo cataltico das enzimas, o papel das enzimas no

    metabolismo, o controlo da actividade e os mecanismos de inibio.

    O estudo cintico de uma enzima visa primariamente caracterizar, ou

    seja descrever, a actividade dessa enzima. In vitro estuda-se a actividade da

    enzima procurando saber que tipo de reaces pode catalisar, com que

    substratos pode interagir e como se modifica essa actividade (qualitativa e/ou

    quantitativamente) quando se fazem variar as condies experimentais. O valor

    de pH, a temperatura, o tempo de incubao, as concentraes dos substratos,

    de cofactores ou de outras substncias (inibidores ou activadores) so exemplos

    de condies experimentais que podem ser modificadas com o objectivo de

    observar a variao da actividade da enzima (32).

    Para que uma reaco enzimtica se d, a enzima (E) e o substrato (S)

    tm de se encontrar e formar o complexo enzima-substrato (ES). Este equilbrio

    expresso sob a forma:

    E+S ES

    A enzima pode ento transformar o substrato num produto (P). Existe de

    forma transitria um complexo EP, havendo ento dissociao deste complexo

    em enzima livre (E) e produto (P). Este mecanismo pode escrever-se na forma

    simplificada:

    E+S [ES] E+P

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    A reaco de formao de ES normalmente mais rpida que a reaco

    de dissociao de EP, ou seja, a libertao do produto da reaco

    normalmente um passo limitante da reaco.

    O estudo de uma reaco enzimtica in vitro no reflecte a verdadeira

    situao das enzimas em clulas, mas possibilita a simplificao da

    determinao de parmetros cinticos. Dentro de uma clula, o substrato pode

    estar confinado a um dado compartimento e no sofrer facilmente difuso: por

    exemplo, pode ser o produto de uma reaco anterior numa via metablica,

    pelo que passa directamente de uma enzima para a outra.

    Nos ensaios in vitro utilizada uma concentrao de substrato maior que

    a concentrao de enzima de modo a possibilitar a monitorizao da variao da

    velocidade de reaco. Como S est a ser convertido em P, S decresce com o

    tempo, medida que o produto se acumula em soluo. Como a concentrao

    de substrato influencia a formao do complexo ES (e portanto da formao de

    produto), vai influenciar tambm a velocidade da reaco (32,33).

    Nestas condies, a velocidade inicial medida (V0) depende apenas da

    concentrao de enzima. Um grfico representativo de V0 em funo da

    concentrao de substrato apresenta uma forma caracterstica de semi-

    hiprbole: a baixas concentraes de substrato, a variao de V0 com a

    concentrao de substrato linear; medida que se usam contraces de

    substrato mais elevadas, V0 sofre uma variao cada vez menor, tendendo para

    um valor limite. Este valor denominado velocidade mxima (Vmx).

    Os primeiros estudos da cintica enzimtica com base cientfica foram

    feitos por Leonor Michaelis e Maud Menten, em 1913, que propuseram pela

    primeira vez um mecanismo para as reaces catalisadas enzimaticamente. As

    suas concepes foram baseadas nos factos observveis quando um substrato

    sofre uma transformao sob a aco cataltica de uma enzima:

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    a velocidade aumenta hiperbolicamente com a concentrao do

    substrato, sendo a reaco de ordem zero quando a concentrao do substrato

    elevada e de 1 ordem quando a concentrao baixa.

    a velocidade aumenta linearmente com a concentrao de enzima,

    para qualquer valor constante da concentrao de substrato.

    A semi-hiprbole correspondente ao comportamento da velocidade de

    uma enzima em funo da concentrao do substrato pode ser descrita

    matematicamente pela equao de Michaelis-Menten:

    V0=Vmax [S]/(KM+[S])

    em que [S], V0 e Vmax so as grandezas anteriormente definidas e KM a

    constante de Michaelis. Esta equao pode ser deduzida de forma intuitiva

    considerando a forma como se desenrola a catlise enzimtica (33)

    assumida, nesta deduo, a existncia de um estado estacionrio, em

    que a concentrao do complexo enzima-substrato permanece constante ao

    longo do tempo.

    A constante Km expressa em unidades de concentrao e tem um

    significado tal que quando a concentrao do substrato iguala o seu valor a

    velocidade da reaco igual a metade de Vmax (i.e., [S] = KM => V = Vmax).

    A teoria do estado estacionrio, introduzida por G. E. Briggs e J. B. S.

    Haldane em 1925, considera que a velocidade a que o complexo ES se forma

    aproximadamente igual velocidade da sua dissociao. Existe um curto

    perodo de tempo, normalmente na ordem dos microssegundos, em que h

    uma acumulao de ES estado pr-estacionrio. O estudo da cintica

    enzimtica envolvendo a teoria do estado estacionrio referida como cintica

    do estado estacionrio (33).

    Tambm assumido que a concentrao de produto insignificante no

    incio da reaco, logo, no dada importncia extenso da reaco inversa

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    no equilbrio entre substrato e produto, S P, considerando-se apenas a reaco

    directa na deduo da equao. Assim, a reaco descrita por:

    E+S [ES] E+P

    Como j referido, a formao do complexo limita a velocidade da

    reaco, medida como V0:

    V0 = k2[ES]

    Se a concentrao do complexo enzima-substrato fosse facilmente

    mensurvel, o valor de k2 seria simples de determinar directamente. No

    entanto, esse no o caso, e o valor de concentrao do complexo enzima-

    substrato tem de ser deduzido. Para tal, considere-se que a concentrao do

    total de enzima (Et) presente na reaco o somatrio da concentrao de

    enzima em complexo com o substrato e da concentrao de enzima "livre" (E)

    (no ligada a substrato):

    [E]t = [E]l + [ES]

    Embora o grfico obtido directamente da equao de Michaelis-Menten

    seja de interpretao relativamente simples, existem tratamentos matemticos

    que simplificam a representao grfica da equao e permitem a obteno

    rpida de parmetros cinticos.

    O tratamento mais conhecido o de Lineweaver-Burk. A equao de

    Michaelis-Menten pode ser transformada numa equao da recta, do tipo

    y=ax+b:

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    Este tipo de tratamento matemtico permite uma determinao mais

    precisa de Vmax, um parmetro que s se obtm por aproximao num grfico

    de Michaelis-Menten.

    1.5.1. Inibio Enzimtica

    Quando a presena de uma substncia na soluo provoca a diminuio

    da velocidade da reaco essa substncia designa-se por Inibidor e a sua aco

    pode ser reversvel ou irreversvel. A inibio reversvel caracterizada por um

    equilbrio estabelecido muito rapidamente entre enzima e inibidor. Os principais

    tipos de inibio reversvel so:

    a inibio competitiva, ocorre quando o inibidor compete com o

    normal substrato para se ligar ao stio activo cataltico.

    a inibio no-competitiva, ocorre quando o inibidor se liga

    enzima ou ao complexo enzima-substrato, no no stio activo do enzima mas

    num outro stio no cataliticamente activo. Ao ligar-se forma complexos

    inactivos, alterando o valor da constante cataltica.

    a inibio incompetitiva (caso muito particular de inibio mista),

    ocorre quando, ), o inibidor no se combina com o enzima livre nem interfere

    com a ligao entre enzima e substrato mas combina-se com o complexo

    enzima-substrato para formar um complexo enzima-substrato-inibidor inactivo.

    Estes tipos distintos de inibio reversvel podem distinguir-se

    experimentalmente pelos efeitos do inibidor na cintica da reaco e que se

    podem analisar recorrendo equao de Michaelis (32).

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    1.6. Objectivos

    O objectivo principal deste trabalho estudar a enzima -galactosidase,

    proveniente de Kluyveromices lactis, na sua forma livre e imobilizada, com a

    finalidade de produo de derivados de lactose de modo a melhorar as

    caractersticas e as qualidades de leites, com aplicao na indstria.

    Os objectivos especficos incluem:

    1. Imobilizao da -galactosidase em alginato de clcio.

    2. Avaliao da actividade e estabilidade operacional da enzima em

    diferentes condies operacionais, com avaliao dos parmetros

    cinticos (e.g. temperatura, pH, concentrao da enzima e do

    substrato).

    3. Comparao do desempenho enzimtico nas diferentes formas (livre e

    imobilizada) atravs da utilizao de um substrato padro.

    4. Optimizao dos parmetros operacionais para aplicao em leite.