Interaction entre un peptide de B-lactoglobuline bovine (B ...between β-lg f1-8 peptide and α-la....

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Interaction entre un peptide de β-lactoglobuline bovine (β-lg f1-8) et les protéines du lactosérum

Le cas de l’α-lactalbumine

Mémoire

GABRIEL RATTÉ

Maîtrise en sciences et technologie des aliments Maître ès Sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Gabriel Ratté, 2013

iii

Résumé

Des observations préliminaires ont montré que l’auto-assemblage d’un peptide issu

de l’hydrolyse trypsique de la β-lactoglobuline (β-lg f1-8) modifiait la composition de

mélanges de protéines de lactosérum, particulièrement en α-lactalbumine (α-la) soluble. Le

but du présent travail était de démontrer l’occurrence d’interactions entre le peptide β-lg f1-

8 et l’α-la. L’étude de l’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 en présence d’α-la à 25

et 55 oC a permis d’observer que l’ajout d’α-la à un hydrolysat trypsique permettait de

retarder la floculation du peptide à 55 oC. La mise en contact d’α-la avec le peptide β-lg f1-

8 a permis de modifier le profil de solubilité de la protéine à différents pH, mais pas son

profil de dénaturation thermique obtenu par calorimétrie différentielle à balayage (DSC).

Ces observations suggèrent que le peptide β-lg f1-8 interagit avec l’α-la par le biais

d’interactions hydrophobes et qu’il pourrait être utilisé dans le développement de nouvelles

stratégies de fractionnement de mélanges protéiques.

v

Abstract

Preliminary observations showed that the self-assembly capacity of a β-

lactoglobulin peptide obtained from trypsin hydrolysis (β-lg f1-8) could modify the

composition of whey protein mixtures, mainly by reducing the amount of soluble α-

lactalbumin (α-la). The goal of this study was to demonstrate the occurrence of interactions

between β-lg f1-8 peptide and α-la. A study of the peptide self-assembly process in

presence of α-la at 25 and 55 oC showed that the addition of α-la to the original tryptic

hydrolysate delays the flocculation of peptide β-lg f1-8 at 55 oC. Adding β-lg f1-8 peptide

to α-la modified the solubility profile of the protein at various pH, but its thermal unfolding

profile obtained by differential scanning calorimetry (DSC) remained unchanged. All of

these observations suggest that the peptide β-lg f1-8 can interact with the α-la via

hydrophobic interactions and could be used for developing new strategies for the

fractionation of protein mixtures.

vii

Avant-‐propos

Ce mémoire est composé de sept chapitres. Après une introduction sur les éléments

importants du sujet (chap. 1), le mémoire présente une revue de littérature traitant du

lactosérum et de ses principaux constituants, de la structure et des principales propriétés de

l’α-lactalbumine (α-la), de la production et des caractéristiques du peptide β-lg f1-8 et pour

finir, des principaux types d’interactions protéines-peptides. Par la suite, l’hypothèse de

recherche est formulée, de même que les principaux objectifs fixés pour la vérifier (chap.

3). Viennent par la suite les deux sections où sont présentés les protocoles expérimentaux et

les résultats obtenus durant le projet de maîtrise (chap. 4 et 5). Tous les résultats de travaux

qui sont présentés dans ces sections ont été obtenus par l’auteur, parfois avec une assistance

technique par un professionnel de recherche ou un stagiaire. Pour terminer, le mémoire

présente une discussion générale permettant de résumer l’ensemble des résultats et de

valider l’hypothèse (chap. 6), suivie d’une section sur les perspectives possibles de ces

travaux (chap. 7). La dernière section du mémoire (chap. 8) est constitué d’une

bibliographie décrivant l’ensemble des références citées.

La première partie expérimentale (chap. 4) s’intitule « Effet de la température sur

l’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 en présence d’α-lactalbumine ». Ces travaux

visaient à vérifier, par une analyse turbidimétrique, si la température et la présence d’α-la

avait un impact sur le processus d’auto-assemblage menant à la floculation du peptide β-lg

f1-8 durant sa concentration par osmose inverse.

La deuxième partie expérimentale (chap. 5) s’intitule « Effet de la présence du

peptide β-lg f1-8 sur les propriétés physicochimiques de l’α-lactalbumine ». Ces travaux

ont été effectués dans le but de vérifier si la mise en contact entre l’α-la et le peptide β-lg

f1-8 pouvait provoquer un changement au niveau de certaines propriétés physicochimiques

de la protéine, soit sa solubilité à différents pH et son profil de dénaturation thermique

obtenu par calorimétrie différentielle à balayage (DSC).

ix

Remerciements

Pour commencer, je veux remercier le Dr Yves Pouliot, mon directeur de recherche,

pour m’avoir accepté au sein de son équipe et m’avoir fait confiance pour ce projet au cours

des deux dernières années. Le fait d’avoir commencé à m’accorder du temps et un projet

d’exploration lors de mon baccalauréat et de m’avoir permis de conserver et continuer ce

projet durant ma maîtrise m’a permis de m’y accrocher et d’apprécier mon expérience au

maximum. Un énorme merci pour les conseils, les réponses à mes nombreuses questions et

surtout, d’avoir continué de croire en ce que je faisais, même lorsque je semblais m’égarer

dans mes réflexions. Son approche humaine et sincère n’aura fait que rendre cette

expérience plus agréable. Également, je voudrais remercier la Dre Sylvie Gauthier, ma

codirectrice, pour ses conseils et sa rigueur qui m’ont permis de mieux comprendre les

détails et éléments clés de la recherche et ainsi rendre ma formation encore plus complète.

Une pensée également pour l’expérience en tutorat qu’elle m’a permis d’acquérir, puisque

ces deux sessions passées à superviser un cours m’auront permis de mieux cerner mes

forces et intérêts pour la suite de ma carrière.

Je souhaiterais également remercier le Dr Jean Amiot, qui a accepté de participer à

l’évaluation de mon mémoire.

J’aimerais également remercier mes collègues et amis du laboratoire 2322, passés et

présents. Fred, Valérie, Marie-Andrée, Maxime, Mélissa, Madani, Mimose, Daniel, Anne et

Maëlle, merci pour votre bonne humeur, les discussions et les rires échangés au cours des

années et pour nos sorties et moments pris ensemble pour décrocher. Un merci spécial à

Sophie et Dany, les deux stagiaires très motivés que j’ai eu la chance de superviser, qui en

plus de m’aider dans mes travaux, m’ont fait apprécier encore plus mon expérience en

recherche.

Je souhaiterais également remercier le personnel du département et tout

spécialement ceux qui m’ont aidé dans mes manipulations en laboratoire, soit Diane

x

Gagnon, Alain Gaudreault, Mélanie Martineau et Pascal Cliche. Je voudrais également

remercier la Dre Chrisina Ratti pour m’avoir permis d’utiliser son appareil DSC et pour son

aide dans mes analyses.

J’aimerais également remercier Mme Anne-François Allain et le Dr Joseph Arul,

pour m’avoir tous les deux permis d’acquérir de l’expérience lors de mes contrats

d’auxiliaire d’enseignement, contrats qui ont beaucoup aidé à alimenter ma passion pour

l’enseignement et la communication scientifique.

Un gros merci également aux autres étudiants de l’ACCESTA et tout

particulièrement à Élodie Rozoy, une amie précieuse depuis le baccalauréat et dont les

conseils m’auront été d’une grande aide au cours des deux dernières années.

J’aimerais finalement remercier mes parents et amis qui m’ont soutenu et encouragé

tout au long de ma maîtrise. Leur support moral, même s’il est souvent venu avec une part

d’incompréhension de mon sujet, a été d’une grande importance durant ces deux années.

Une pensée toute spéciale pour ma copine, Isabelle, sans qui la motivation aurait

probablement été plus ardue à trouver dans les moments plus difficiles.

xi

« Comme le corps s'accroît par les aliments, notre esprit s'accroît par les idées. »

Johann Gottfried von Herder, poète et théologien allemand

xiii

Table des matières Résumé ............................................................................................................................................... iii

Abstract ................................................................................................................................................ v

Avant-propos ...................................................................................................................................... vii

Remerciements .................................................................................................................................... ix

Table des matières ............................................................................................................................ xiii

Liste des tableaux ............................................................................................................................... xv

Liste des figures ............................................................................................................................... xvii

Liste des abréviations ........................................................................................................................ xix

1. Introduction .................................................................................................................................. 1

2. Revue de littérature ...................................................................................................................... 3

2.1 Le lactosérum ............................................................................................................................. 3 2.1.1 Production du lactosérum ................................................................................................... 3 2.1.2 Composition du lactosérum ................................................................................................ 4

2.1.2.1 Les principaux constituants ......................................................................................... 4 2.1.2.2 Les protéines du lactosérum ........................................................................................ 5

2.1.3 Séparation des constituants du lactosérum ......................................................................... 6

2.2 L’α-lactalbumine ........................................................................................................................ 9 2.2.1 Structure de la protéine ....................................................................................................... 9 2.2.2 Propriétés physicochimiques ............................................................................................ 11

2.2.2.1 Impact de la température ........................................................................................... 11 2.2.2.2 Impact du pH ............................................................................................................. 14 2.2.2.3 Potentiel d’interactions avec des ligands ................................................................... 15

2.2.3 Propriétés biologiques ...................................................................................................... 18

2.3 Le peptide β-lg f1-8 .................................................................................................................. 19 2.3.1 La β-lactoglobuline ........................................................................................................... 19 2.3.2 Description générale du peptide ....................................................................................... 21 2.3.3 Méthode de production du peptide β-lg f1-8 .................................................................... 22

2.3.3.1 Hydrolyse enzymatique ............................................................................................. 22 2.3.3.2 Concentration du mélange peptidique par membranes UF et OI .............................. 23 2.3.3.3 Purification du peptide β-lg f1-8 par lavage .............................................................. 24

2.3.4 Propriétés du peptide ........................................................................................................ 26 2.3.4.1 Impact du pH ............................................................................................................. 26 2.3.4.2 Impact de la concentration ......................................................................................... 27 2.3.4.3 Impact de la séquence d’acides aminés ..................................................................... 27

2.3.5 Interactions avec les protéines du lactosérum .................................................................. 28

2.4 Interactions protéines-peptides ................................................................................................ 29 2.4.1 Nature des interactions ..................................................................................................... 29

2.4.1.1 Interactions électrostatiques ....................................................................................... 29 2.4.1.2 Interactions hydrophobes ........................................................................................... 31

2.4.2 Méthodes de caractérisation ............................................................................................. 32

xiv

3. Hypothèse et objectifs ................................................................................................................ 35

4. Effet de la température sur l’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 en présence d’α- lactalbumine ............................................................................................................................... 37

4.1 Objectifs spécifiques et approche méthodologique ................................................................. 37

4.2 Matériel et méthodes ............................................................................................................... 38 4.2.1 Produits et matériel utilisés .............................................................................................. 38 4.2.2 Méthodes .......................................................................................................................... 38

4.2.2.1 Préparation de l’hydrolysat ....................................................................................... 38 4.2.2.2 Osmose inverse ......................................................................................................... 38 4.2.2.3 Analyses HPLC ......................................................................................................... 39 4.2.2.4 Suivi de la floculation du peptide ............................................................................. 40 4.2.2.5 Analyses statistiques ................................................................................................. 41

4.3 Résultats et discussion ............................................................................................................. 42 4.3.1 Effet de la température sur l’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 ................................ 42 4.3.2 Effet de la présence de l’α-la sur le processus d’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 à 25 et 55 oC ........................................................................................................................ 44

4.4 Conclusion ............................................................................................................................... 48

5. Effet de la présence du peptide β-lg f1-8 sur les propriétés physicochimiques de l’α- lactalbumine .............................................................................................................................. 49

5.1 Objectifs spécifiques et approche méthodologique ................................................................. 49

5.2 Matériel et méthodes ............................................................................................................... 50 5.2.1 Produits et matériel utilisés .............................................................................................. 50 5.2.2 Méthodes .......................................................................................................................... 50

5.2.2.1 Préparation du peptide β-lg f1-8 ............................................................................... 50 5.2.2.2 Analyses HPLC ......................................................................................................... 51 5.2.2.3 Détermination de la solubilité de l’α-la par turbidimétrie ......................................... 51 5.2.2.4 Analyses calorimétriques (DSC) ............................................................................... 51 5.2.2.5 Analyses statistiques ................................................................................................. 53

5.3 Résultats et discussion ............................................................................................................. 54 5.3.1 Effet de la présence du peptide β-lg f1-8 sur la solubilité de l’α-la en fonction du pH ... 54 5.3.2 Effet de la présence du peptide β-lg f1-8 sur le profil de dénaturation thermique de l’α-la ......................................................................................................................................... 59

5.4 Conclusion ............................................................................................................................... 63

6. Discussion générale ................................................................................................................... 65

7. Conclusion et perspectives ........................................................................................................ 69

8. Bibliographie ............................................................................................................................. 71

xv

Liste des tableaux

Tableau 2.1 : Teneur approximative (en %) des différents composants

contenus dans les deux principaux types de lactosérum.

p.4 Tableau 2.2 : Principales caractéristiques des protéines de lactosérum de

lait bovin.

p.5 Tableau 2.3 : Résumé des résultats et conditions expérimentales de

travaux sur le profil de dénaturation thermique de l’α-‐la par DSC. p.13

Tableau 2.4 : Principales méthodes utilisées pour la formation de

complexe cytotoxiques protéine-‐OA.

p.16 Tableau 2.5 : Peptides à activité biologique issus de l’hydrolyse

enzymatique de l’α-‐la.

p.19 Tableau 2.6 : Principales méthodes permettant de détecter la présence

d’interactions protéines-‐peptides et leurs impacts sur la protéine.

p.33 Tableau 5.1 : Préparation des échantillons pour les analyses DSC. p.52

xvii

Liste des figures

Figure 2.1 : Échelle d’application des différents traitements de filtration sur membrane.

p.7

Figure 2.2 : Représentation de la structure tridimensionnelle de l’α-‐la

bovine.

p.9 Figure 2.3 : Comparaison des structures tridimensionnelles de l’α-‐la

sous forme native (à droite) molten globule (au centre) et dénaturée (à gauche).

p.11 Figure 2.4 : Schéma du four d’un appareil DSC du type power

compensation. (S = échantillon (sample), R = référence (reference), 1 = Élément chauffant, 2 = thermomètre).

p.12 Figure 2.5 : Modèle général de la formation des molécules HAMLET. p.17 Figure 2.6 : Séquence d’acides aminés et représentation de la

structure tridimensionnelle de la β-‐lg .

p.20 Figure 2.7 : Séquence en acides aminés du peptide β-‐lg f1-‐8. p.21 Figure 2.8 : Procédé de fabrication du peptide β-‐lg f1-‐8 selon la

méthode utilisée par Pouliot et al. (2009).

p.22 Figure 2.9 : Profil peptidique (RP-‐HPLC) du mélange peptidique avant

lavage (a), du culot obtenu après 2 lavages (b) et après 5 lavages (c) à 20 oC.

p.25 Figure 2.10 : Effet du pH sur l’aspect visuel des solutions de peptide β-‐lg

f1-‐8 selon leur concentration (Adapté de Guy et al, 2011).

p.26 Figure 2.11 : Effet de la concentration sur la conformation du peptide β-‐

lg f1-‐8 observée par DC à pH 10 (Adapté de Guy et al, 2011).

p.27

xviii

Figure 2.12 : Interactions entre molécules d’eau par le biais de liens hydrogène.

p.31

Figure 4.1 : Schéma du montage expérimental utilisé pour l’osmose

inverse (OI) des mélanges peptidiques.

p.41 Figure 4.2 : Débit moyen (a) du temps moyen de floculation (b) et

du facteur de concentration critique (FCC) (c) pour les OI effectuées sur l’hydrolysat trypsique complet (HTC) (10 %, p/v) à basse température (4 ± 2 oC), température ambiante (23 ± 2 oC) et température élevée (58 ± 2 oC).

p.43 Figure 4.3 : Débits moyens des traitements d’OI de l’hydrolysat

trypsique complet (HTC) (10 %, p/v) à 25 oC sans α-‐la (OI 25-‐SA) et avec α-‐la (OI 25-‐AA), puis à 55 oC sans α-‐la (OI 55-‐SA) et avec α-‐la (OI 55-‐AA).

p.45 Figure 4.4 : Évolution de l’A500 en fonction du temps (a) et du

facteur de concentration (b) des traitements d’OI des hydrolysats trypsiques complets (HTC) (10 %, p/v) à 25 oC sans α-‐la (OI 25-‐SA) et avec α-‐la (OI 25-‐AA), puis à 55 oC sans α-‐la (OI 55-‐SA) et avec α-‐la (OI 55-‐AA).

p.46 Figure 5.1 : Évolution de la turbidité de solutions d’α-‐la seule (1 %,

p/v), d’α-‐la avec le peptide β-‐lg f1-‐8 (1 %, p/v + 10 mg/mL) et d’α-‐la avec l’hydrolysat trypsique complet (HTC) (1 %, p/v + 5 %, p/v) (a) et de solutions d’HTC (5 %, p/v) et de peptide β-‐lg f1-‐8 (10 mg/mL) sans α-‐la (b) entre pH 2,0 et pH 9,0.

p.55 Figure 5.2 : Thermogrammes obtenus par DSC de l’α-‐la seule et en

présence du peptide β-‐lg f1-‐8. Les courbes illustrées sont la moyenne de trois analyses.

p.59 Figure 5.3 : Effet du pH sur l’α-‐la seule et en présence du peptide β-‐

lg f1-‐8 sur la température (a) et l’enthalpie (b) de dénaturation.

p.61

xix

Liste des abréviations α-‐la : alpha-‐lactalbumine

β-‐lg : bêta-‐lactoglobuline

ΔHD : enthalpie de dénaturation

A500 : absorbance à 500 nm

apo-‐α-‐la apo-‐alpha-‐lactalbumine

BAMLET : bovine alpha-‐lactalbumin made lethal for tumor cells

BSA : albumine de sérum bovin, de l’anglais bovine serum albumin

CPL : concentré de protéines de lactosérum

CD : dichroïsme circulaire, de l’anglais circular dichroism

DSC : calorimétrie différentielle à balayage, de l’anglais differential scanning

calorimetry

EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique, de l’anglais

Ethylenediaminetetraacetic acid

FTIR : spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, de l’anglais Fourier

transform infrared spectroscopy

HAMLET : human alpha-‐lactalbumin made lethal for tumor cells

holo-‐α-‐la : holo-‐alpha-‐lactalbumine

HPβCD : hydroxyl-propyl-β-cyclodextrine

HPLC : chromatographie liquide à haute performance, de l’anglais high

performance liquid chromatography

HPWP : heat-‐precipitated whey proteins

HTC : hydrolysat trypsique complet

IPL : isolat de protéines de lactosérum

MCBL : microscopie confocale à balayage laser

MG : molten globule

MF : microfiltration

NF : nanofiltration

OA : acide oléique, de l’anglais oleic acid

xx

OI : osmose inverse

pI : point isoélectrique

PM : poids moléculaire

SDS : laurysulfate de sodium, de l’anglais sodium dodecyl sulfate

UF : ultrafiltration

UV : ultra-‐violet

TD : température de dénaturation

1

1. Introduction

Le lactosérum est le liquide résiduel de la production fromagère et représente environ 80 à

90 % du volume total du lait. C’est un produit complexe avec une composition très variée

en nutriments (lactose, protéines, lipides, minéraux) selon sa provenance et ses

caractéristiques (lactosérum doux ou acide) (de Wit, 2001). Le lactosérum contient des

protéines solubles qui comptent pour environ 20 % des protéines totales du lait. La β-

lactoglobuline (β-lg) et l’α-lactalbumine (α-la), les deux protéines majeures du lactosérum,

ont fait l’objet de nombreuses études en raison de leur potentiel nutritionnel et fonctionnel.

De nombreux travaux ont montré que les protéines du lactosérum possèdent, entre autres,

des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, antimicrobiennes, etc. (Ha & Zemel,

2003; Krissansen, 2007) en plus d’agir comme agents émulsifiants, moussants et gélifiants

(de Wit, 1998; Diaz et al., 2004). D’autres travaux originaux ont mis à profit la capacité de

l’α-la à fixer des acides gras pour lui conférer des propriétés biologiques nouvelles. Ainsi,

un complexe d’α-la et d’acide oléique (OA), baptisé HAMLET (human alpha-lactalbumin

made lethal to tumor cells), a montré des propriétés anticancer (Fischer et al., 2004;

Sullivan et al., 2013; Brinkmann et al., 2013).

Les deux protéines majeures du lactosérum, particulièrement la β-lg, ont été

également utilisées pour la production de peptides à activité biologique ou fonctionnelle par

voie d’hydrolyse enzymatique. Il a été démontré que l’hydrolyse de la β-lg par des enzymes

digestives humaines (trypsine, chymotrypsine, pepsine) permet d’obtenir des peptides

antihypertensifs, hypocholestérolémiants, antithrombiques, antimicrobiens, etc.

(Szajkowska et al., 2011; Urista et al., 2011). Certains peptides de la β-lg peuvent aussi être

utilisés pour leurs propriétés fonctionnelles (émulsification, moussage, etc.), lesquelles sont

comparables à celles des protéines natives (Caessens et al., 1999; Gauthier & Pouliot,

2003). Des protéines et peptides d’origine sérique peuvent provoquer la formation de

nanoparticules sphériques, de nanofibres, de nanotubes et d’hydrogels par phénomène

d’autoassemblage (Zhang, 2003; Graveland-Bikker et al., 2006; Graveland-Bikker & de

Kruif, 2006; Arroyo-Maya et al., 2012). Des peptides produits par hydrolyse de la β-lg à

2

l’aide de différentes enzymes, comme le β-lg f1-8 par la trypsine (Pouliot et al., 2009; Guy

et al., 2011) ou le β-lg f1-45 par une protéase bactérienne (Creusot & Gruppen, 2007),

possèdent cette propriété.

Le peptide β-lg f1-8 obtenu par hydrolyse trypsique de la β-lg démontre plusieurs

caractéristiques d’intérêt. En plus de sa capacité d’auto-assemblage, celui-ci fait partie d’un

groupe de peptides (principalement β-lg f9-14, f15-40, f142-148) ayant la capacité de se

lier à la β-lg et de modifier son profil de dénaturation thermique (Barbeau et al., 1996).

L’α-la aurait également la capacité d’interagir par des interactions hydrophobes avec

certains peptides, dont le peptide β-lg f1-8 (Groleau et al., 2003). Cependant, il n’est pas

possible de tirer de conclusions définitives à partir des résultats actuellement disponibles.

Par ailleurs, d’autres travaux ont montré qu’il était possible d’utiliser un peptide immobilisé

pour la séparation de l’α-la à partir d’un isolat de protéines de lactosérum (Gurgel et al.,

2001). Les données disponibles dans la littérature suggèrent donc fortement que des

interactions entre l’α-la et le peptide β-lg f1-8 seraient possibles et pourraient être mises à

profit pour modifier certaines propriétés de l’α-la. Une méthode de fractionnement de cette

protéine à partir de mélanges plus complexes pourrait également être envisagée.

Bien que certaines utilisations potentielles mettant à profit des interactions entre le

peptide β-lg f1-8 et l’α-la semblent possibles, il existe peu d’informations à l’heure actuelle

sur la capacité d’interaction de ce peptide avec cette protéine. Le présent projet de

recherche visait donc à mettre en évidence ces interactions et à déterminer leurs impacts sur

les propriétés physicochimiques du peptide β-lg f1-8 et de l’α-la.

3

2. Revue de littérature

2.1 Le lactosérum

2.1.1 Production du lactosérum

Au Canada et particulièrement au Québec, l’industrie fromagère est une industrie

importante, produisant chaque année près de 372 000 tonnes de fromages (dont 200 000

tonnes au Québec) et 2 100 000 tonnes de lactosérum (dont 1 200 000 tonnes au Québec)

(CILQ, 2010). Autrefois un déchet, la valorisation du lactosérum et de ses composantes est

devenue essentielle en raison de l’importante quantité produite et de sa forte DBO

(demande biologique en oxygène).

Selon le type de fabrication fromagère dont il est issu, le lactosérum peut être

considéré comme étant doux (lactosérum issu de la fabrication de caillés présure, fromages

à pâte pressée cuite ou non cuite, pH 5,9-6,6) ou acide (lactosérum issu des autres fromages

obtenus par coagulation mixte ou lactique, pH 4,3-4,6) (Bylund, 1995; de Wit, 2001). Dans

le cas des fromages produits par coagulation enzymatique, le lait est préalablement

standardisé et pasteurisé. Un mélange de cultures bactériennes lactiques et la présure

(mélange enzymatique de chymosine et de trypsine) sont ajoutés au lait pour le faire

coaguler. Une fois le gel formé, il est découpé en cubes à l’aide de tranchoirs rotatifs et les

cubes tombent au fond du réservoir, le lactosérum devenant le surnageant. Les étapes

suivantes dépendent beaucoup du type de fromage produit. La majorité du lactosérum est

retiré après la découpe du caillé, le reste lors de l’égouttage, puis sont effectuées les étapes

de salage et de pressage des grains de caillé. Dans la production de fromages par

coagulation acide, le lactosérum est obtenu par l’acidification du lait par des ferments

lactiques. Les caséines précipitent à pH 4,6 et le lactosérum est égoutté. Ce principe de

précipitation acide est également utilisé pour la production de caséinates, durant laquelle le

pH du lait est descendu au pI des caséines par des ferments lactiques ou des acides et le

lactosérum est récupéré par centrifugation ou décantation (de Wit, 2001). Une fois récolté,

4

le lactosérum liquide est souvent concentré et séché pour faciliter le transport et

l’entreposage. Des méthodes par traitement thermique comme l’évaporation et le séchage

(atomiseur ou séchoir à tambour) sont alors favorisées (Bylund, 1995). Le lactosérum est

rarement utilisé tel quel. Généralement, il subit différents traitements pour séparer,

concentrer ou fractionner certaines de ses composantes. Ces méthodes seront présentées à

la section 2.1.3.

2.1.2 Composition du lactosérum

2.1.2.1 Les principaux constituants

La composition du lactosérum dépend du lait utilisé au départ et du type de coagulation

dont il est issu. En général, le lactosérum est majoritairement composé d’eau, de lactose, de

protéines, de matière grasse et de minéraux. Les teneurs de ces différents éléments sont

présentées au tableau 2.1.

(Adapté de : Bylund, 1995; de Wit, 2001)

Tableau 2.1 : Teneur approximative (en %) des différents composants contenus dans les deux principaux types de lactosérum.

5

La composition de ces deux types de lactosérum est donc relativement similaire,

sauf au niveau de la teneur en minéraux. En effet, le lactosérum acide est légèrement plus

minéralisé que le lactosérum doux. Ce phénomène est principalement causé par la

décalcification des micelles de caséines lors de la baisse de pH, ce qui provoque la

libération de phosphates de calcium (Choi et al., 2008).

2.1.2.2 Les protéines du lactosérum

Les principales protéines retrouvées dans le lactosérum sont la β-lg, l’α-la, l’albumine de

sérum bovin (BSA), les immunoglobulines, la lactoferrine et les protéoses-peptones.

Certaines enzymes, comme la lactoperoxydase, le lysozyme, la phosphatase alcaline et la

catalase y sont également retrouvées. Le tableau 2.2 résume l’état des connaissances sur les

principales protéines du lactosérum et leurs caractéristiques.

(Adapté de : McIntosh et al., 1998; Gurgel et al., 2001; Baker & Baker, 2005)

Protéines

% des

protéines

totales du

lait

Masse

moléculaire

(kDa)

pI Structure

secondaire

Ponts

S-‐S

Groupements

thiol (S-‐H)

β-‐lg 12 18,4 5,3 45% feuillets β

10% hélices α 2 1

α-‐la 5,0 14,2 4,2 26% feuillets β

14% hélices α 4 0

BSA 1,2 69,0 5,1 40% feuillets β

54% hélices α 17 1

Immuno-‐

globulines 0,8 160-‐1600 6,3-‐7,0 Variable 32 -‐

Protéose-‐

peptones 1,0 4,0-‐200 Variable Variable -‐ -‐

lactoferrine <1,0 80,0 8,4-‐9,0

Deux domaines (N-‐

lobe et C-‐lobe) reliés

par une hélice α

-‐ -‐

Tableau 2.2 : Principales caractéristiques des protéines du lactosérum de lait bovin.

6

La β-lg et l’α-la représentent environ 17 % des protéines totales du lait et 85 % des

protéines du lactosérum. Ces deux protéines ont une structure assez différente, même si leur

pI et leur poids moléculaire (PM) sont relativement semblables. En effet, l’α-la ne possède

que des ponts S-S alors que la β-lg contient un groupement thiol libre, en plus d’une teneur

plus élevée en feuillets β.

2.1.3 Séparation des constituants du lactosérum

Les principaux constituants du lactosérum à être valorisés sont les protéines et le lactose.

Dans le cadre de ce mémoire, seules les méthodes concernant le fractionnement, la

purification et la concentration des protéines seront traitées.

Les protéines du lactosérum ont longtemps été isolées par différentes méthodes

nécessitant leur précipitation. La dénaturation thermique est un des procédés les plus

couramment utilisés, mais qui ne permet pas de dénaturer la totalité des protéines et qui

donne des fractions généralement insolubles appelées heat-precipitated whey protein

(HPWP) (Pearce, 1992; Bylund, 1995). Depuis, des méthodes plus efficaces d’isolation et

de séparation des protéines de lactosérum, principalement des méthodes de séparation sur

membrane et de chromatographie échangeuse d’ions, ont été développées et permettent

maintenant la fabrication à grande échelle de concentrés et d’isolats de protéines de

lactosérum.

Les systèmes de séparation membranaire permettent le fractionnement de particules

par filtration à travers des membranes de différentes porosités. La filtration peut se faire en

mode direct (flux perpendiculaire à la membrane) ou tangentielle (flux parallèle à la

membrane). Il existe également une grande variété de configurations (membranes spiralées,

à fibres creuses, tubulaires) et de matériaux (acétate de cellulose, polypropylène,

polysulfone, polyamide, etc.), selon le type de filtration à utiliser et la substance qui doit

être filtrée. Les principales méthodes de filtration utilisées en industrie alimentaire sont la

microfiltration (MF), l’ultrafiltration (UF), la nanofiltration (NF) et l’osmose inverse (OI)

7

(Allgeier et al., 2005). La figure 2.1 montre que la porosité des membranes varie selon le

type de filtration utilisé, ce qui permet de séparer les molécules selon leur taille.

La microfiltration est principalement utilisée pour le retrait de plus grosses

particules, comme les bactéries et la matière grasse. L’UF est utilisée pour produire des

concentrés de protéines de lactosérum (CPL). Ces poudres sont obtenues par séchage des

rétentats UF de lactosérum et contiennent généralement entre 25 et 80 % (p/p) de protéines

sur base sèche. Pour obtenir des poudres avec une teneur en protéines de 80 %, il faut

ajouter une étape de diafiltration après l’UF. La diafiltration est un procédé qui consiste à

ajouter de l’eau au cours de la filtration afin d’éliminer les composés de faible poids

moléculaire, comme les minéraux et le lactose. La nanofiltration est utilisée dans les

procédés de dessalement et de retrait des minéraux, tandis que l’osmose inverse sert

Figure 2.1 : Échelle d’application des différents traitements de filtration sur membrane. (Source : http://tpedessaler.e-‐monsite.com/pages/traitement/1-‐les-‐filtrations.html)

8

principalement à concentrer les particules retrouvées dans le rétentat et ce, en laissant

traverser uniquement l’eau (Pearce, 1992; Bylund, 1995; de Wit, 2001)

Les méthodes chromatographiques, comme la chromatographie échangeuse d’ions,

sont également utilisées pour purifier les composés protéiques du lactosérum. Cette

méthode permet d’obtenir des isolats de protéines de lactosérum (IPL). Les IPL peuvent

ainsi contenir plus de 90 % (p/p) de protéines. La chromatographie échangeuse d’ions

permet de séparer les molécules selon leur charge. Celles possédant une charge opposée à

la résine utilisée sont retenues, alors que les autres sont éluées plus rapidement de la

colonne. Cette méthode est également utilisée pour déminéraliser le lactosérum et pour

purifier la lactoferrine et la lactoperoxydase (Bylund, 1995; de Wit, 2001).

Pour arriver à fractionner et isoler les différentes protéines du lactosérum, il existe

principalement trois méthodes. L’UF, généralement suivie d’une diafiltration, est une

technique fréquemment utilisée pour réaliser le fractionnement des protéines majeures du

lactosérum. Par contre, cette technique est limitée par le fait que l’α-la et la β-lg ont des

poids moléculaires relativement semblables, ce qui rend leur séparation par UF moins

efficace (Goodall et al., 2008; Kamau et al., 2010). Une autre manière de procéder est de

combiner la filtration membranaire avec l’hydrolyse enzymatique. En effet, il est connu que

la β-lg est facilement hydrolysable par la pepsine et la trypsine, alors que l’α-la est

hydrolysée beaucoup plus lentement par la trypsine (Kamau et al., 2010). L’hydrolyse

sélective d’une des deux protéines suivie par une étape d’UF permet donc de récolter la

protéine non digérée à un haut niveau de pureté. Une autre méthode fréquemment utilisée

est la chromatographie échangeuses d’ions. En plus de mener à la production d’IPL, cette

méthode permet de séparer l’α-la, la β-lg et la BSA selon leur charge et leur affinité pour

les résines utilisées (Kim et al., 2003; El-Sayed & Chase, 2008; Kamau et al., 2010).

9

2.2 L’α-‐lactalbumine

2.2.1 Structure de la protéine

L’α-la est la seconde protéine globulaire présente en importance dans le lactosérum bovin.

Elle est composée de 123 résidus d’acides aminés (poids moléculaire de 14,2 kDa) et sa

structure tertiaire comporte quatre ponts disulfures. L’α-la native est constituée de deux

domaines distincts, soit une large section composée d’hélices α et un petit domaine en

feuillet β. Les deux sections sont reliées par une boucle de fixation du calcium (Relkin &

Mulvihill, 1996; McGuffey, 2004). Une représentation de la structure tridimensionnelle de

la protéine est présentée à la figure 2.2. L’α-la est une métalloprotéine capable de se lier à

plusieurs ions métalliques, principalement le calcium (Ca2+), mais également aux ions Zn2+,

Mg2+, Cu2+, Co2+, Na+, K+ et Al3+ (Ren & Stuart, 1993; Velusamy & Palaniappan, 2011).

D’autres travaux ont également démontré que tous les ions ne se lieraient pas au même

endroit sur la molécule, comme le zinc, dont le site de liaison spécifique serait à environ

11,5 Å de celui du calcium (Ren & Stuart, 1993; McGuffey, 2004).

La molécule d’α-la se retrouve principalement sous sa forme native (holo-α-la),

décalcifiée (apo-α-la) ou sous une forme intermédiaire appelée molten globule state (MG).

Figure 2.2 : Représentation de la structure tridimensionnelle de l’α-‐la bovine. (Source : http://www.intechopen.com/books/milk-‐protein/).

10

L’apo-α-la est obtenue par l’utilisation d’agents chélateurs ou séquestrants du calcium

(citrate, EDTA), une augmentation de la température et une diminution du pH autour du pI

de la protéine (pH 4,2-4,5). La perte de la capacité à lier le calcium de l’α-la est

principalement due à l’ionisation de groupements carboxyles et tyrosyles dans la boucle de

fixation du calcium (McGuffey, 2004). Cette forme est plus flexible, plus hydrophobe et

moins soluble que la forme native (Bramaud et al., 1997; Brinkmann et al., 2013).

Permyakov et Berliner (2000) ont rapporté que la liaison de cations métalliques,

principalement le calcium, augmente la stabilité de la protéine. La liaison avec le calcium

peut augmenter la résistance à la dénaturation thermique de plus de 40 oC, cette variation

étant plus faible avec d’autres cations comme le Mg2+, Na+ et K+. Ces résultats démontrent

que plus les ions sont liés fortement à la protéine, plus la transition vers une température de

dénaturation élevée sera importante. La conformation apportée par la liaison avec certains

cations métalliques augmente également la stabilité de la protéine face à l’action de certains

agents dénaturants comme l’urée et le chlorhydrate de guanidine (Relkin & Mulvihill,

1996; Permyakov & Berliner, 2000).

La forme MG est une conformation intermédiaire de l’α-la, compacte et très

hétérogène. Elle possède un domaine d’hélices α toujours très structuré (native like), mais

le domaine composé de feuillets β est en majorité dénaturé (Kuwajima, 1996; Permyakov

& Berliner, 2000). Le passage à la conformation MG se produit généralement sous trois

conditions, soit 1) la présence d’agents dénaturants en concentration modérée (urée,

chlorhydrate de guanidine), 2) un faible pH menant à la dénaturation acide de la protéine ou

3) le retrait du calcium à pH neutre et à une concentration faible en sel (Kuwajima, 1996;

McGuffey, 2004). Les différences structurales entre la forme native et MG de l’α-la sont

illustrées à la figure 2.3.

11

2.2.2 Propriétés physicochimiques

2.2.2.1 Impact de la température

Le profil de dénaturation thermique de l’α-la a été étudié à plusieurs reprises,

principalement à l’aide de la méthode de calorimétrie différentielle à balayage (DSC). Un

schéma d’un appareil DSC est présenté à la figure 2.4. La méthode DSC est une méthode

calorimétrique permettant la détection rapide et en temps réel de la variation de la chaleur

libérée (processus exothermique) ou absorbée (processus endothermique) par l’échantillon

analysé, comparativement à une référence. Cette méthode permet de mesurer la température

de transition (dénaturation) et de réaction de matériaux, en plus d’autres paramètres

calorimétriques comme l’enthalpie, la chaleur massique, etc. Cette méthode permet entre

autres de caractériser des matériaux, d’évaluer leur stabilité et leur pureté, d’évaluer des

diagrammes de phase et la cinétique de dénaturation de molécules, etc. (Höhne et al.,

2003a).

Figure 2.3 : Comparaison des structures tridimensionnelles de l’α-‐la sous forme native (à droite), molten globule (au centre) et dénaturée (à gauche) (Mizuguchi et al., 2009).

12

Étant donné les nombreuses conformations possibles de la protéine selon les

conditions de température et de pH, il est normal de retrouver des valeurs différentes de

température et d’enthalpie de dénaturation dans la littérature. Les résultats d’analyses DSC

de l’α-la issus de certains travaux ainsi que les principales conditions utilisées sont

présentés au tableau 2.3. Les écarts retrouvés entre les résultats peuvent être causés par des

variations au niveau de la protéine elle-même (source, conformation), mais également par

l’utilisation de différents appareils (sensibilité), la méthode utilisée (intervalle et gradient

de température) et la préparation des échantillons (nature et concentration du tampon, pH,

concentration en α-la).

Figure 2.4 : Schéma du four d’un appareil DSC du type power compensation. (S = échantillon (sample), R = référence (reference), 1 = Élément chauffant, 2 = thermomètre) (Höhne et al., 2003a).

13

Tableau 2.3 : R

ésum

é de

s rés

ulta

ts e

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ditio

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xpér

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aux

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-‐la p

ar D

SC.

14

À des valeurs de pH inférieures à 3,5, il n’est plus possible de détecter de transition

thermique, car la conformation de la protéine est modifiée par la perte de sa capacité à lier

le calcium (Bernal & Jelen, 1984; McGuffey, 2004). Cependant, plusieurs auteurs

s’entendent sur le fait que la température et l’enthalpie de dénaturation de l’α-la native dans

l’eau sont respectivement de 58 oC et 320 kJ/mol (Relkin & Mulvihill, 1996).

Contrairement à d’autres protéines, la dénaturation thermique de l’α-la est

réversible. En effet, des travaux en DSC sur la stabilité de la protéine face à la dénaturation

thermique entre 15 et 100 oC montrent des taux de réversibilité de 80-100 % pour l’holo-α-

la et de près de 50 % pour l’apo-α-la, particulièrement en présence de CaCl2 (Boye et al.,

1997). Cette stabilité provient de l’absence d’agrégation et de gélification de l’α-la lors de

la dénaturation de la protéine. Ce phénomène est possible grâce à la structure secondaire de

la protéine qui se dénature facilement lors du chauffage, mais qui retrouve sa conformation

native en présence de calcium. Des études en spectroscopie infrarouge (FTIR) semblent

montrer que la dénaturation de l’apo-α-la, qui s’accompagne quant à elle d’un certain

processus d’agrégation lors du chauffage, provoquerait la formation de feuillets β tandis

que l’holo-α-la adopterait davantage une structure en coudes, réduisant ainsi les possibilités

d’agrégation (Boye et al., 1997). Finalement, l’absence de groupements thiol libres,

reconnus pour être très actifs dans le processus d’agrégation protéique, limite également

l’agrégation de l’α-la (McGuffey, 2004).

2.2.2.2 Impact du pH

Comme il a été mentionné plus tôt, l’α-la possède une structure qui est fortement influencée

par le pH, phénomène principalement relié à sa capacité à lier le calcium (Permyakov &

Berliner, 2000). En effet, à pH acide (3,0-4,2) et en présence d’agent chélatant (EDTA), la

protéine perd la capacité à lier le calcium et passe sous la forme apo-α-la. À pH ≤ 3,0 ou

par traitement thermique léger à partir de l’apo-α-la, la protéine se retrouve alors sous

forme MG (Kuwajima, 1996; Brinkmann et al., 2013). Des analyses en fluorimétrie ont

démontré que le passage de l’α-la sous forme apo-α-la par baisse de pH provoque un

décalage de la longueur d’onde d’excitation vers le rouge (red shift), ce qui signifie que les

15

unités de tryptophane situés dans la zone hydrophobe au centre de la molécule d’α-la sont

davantage exposés au solvant (Stănciuc et al., 2012). À l’inverse, lorsque le pH est

remonté, la structure reprend son état natif en liant à nouveau le calcium et une déviation

vers le bleu (blue shift) est enregistrée. Cela signifie donc que les unités de tryptophane

sont davantage enfermées au sein de la structure et que la zone hydrophobe est moins

exposée (Permyakov & Berliner, 2000; Stănciuc et al., 2012).

À son pI, la protéine précipite et le calcium joue un rôle clé dans ce phénomène. À

ce pH, une faible concentration en calcium et une augmentation de la température

favorisent la forme décalcifiée de la protéine, laquelle a une plus faible solubilité. Plus la

température est élevée et plus la teneur en calcium est diminuée, plus la précipitation de la

protéine sera élevé (Bramaud et al., 1997).

2.2.2.3 Potentiel d’interactions avec des ligands

Selon les conditions dans lesquelles elle est placée (température, pH, force ionique, etc.),

l’α-la se montre capable d’interagir avec différents types de ligands comme des peptides et

des acides gras. Des travaux ont démontré qu’il était possible de purifier l’α-la contenue

dans un mélange protéique à l’aide de peptides fixés sur une colonne chromatographique

(Gurgel et al., 2001). Selon les conditions d’expérimentations et la composition des

peptides utilisés, l’α-la est capable de se lier à la colonne via trois mécanismes distincts,

soit par le biais d’interactions électrostatiques (basse température), par des interactions

hydrophobes (haute température) ou par un mécanisme non spécifique pouvant agir à un

grand intervalle de température (Gurgel et al., 2001).

La capacité d’interaction de l’α-la est exploitée depuis quelques années dans la mise

au point de complexes avec l’acide oléique (OA ou oleic acid), complexes qui est létal pour

certaines cellules tumorales humaines. Ces derniers, nommés Human/Bovine α-lactalbumin

made lethal to tumor cells (H/BAMLET) auraient la capacité de provoquer la mort

cellulaire (apoptosis-like mechanism) de certaines cellules cancéreuses (glioblastomes,

carcinomes, cellules tumorales lymphoïdes) (Fischer et al., 2004). Les mécanismes

16

entourant l’activité anti-cancer des molécules HAMLET ne sont pas encore tous bien

compris et font toujours l’objet de plusieurs études.

Étant donné que la formation des complexes α-la:OA se fait principalement par la

déstabilisation de l’α-la en sa forme apo-α-la, l’étude de ces complexes révèle plusieurs

caractéristiques structurales en lien avec l’α-la. Comme expliqué précédemment, cette

déstabilisation mène à la formation d’une structure plus flexible et plus hydrophobe, ce qui

permet donc à l’OA de se lier à l’α-la. Par contre, les analyses fluorimétriques montrent que

l’interaction OA:α-la est dépendante du pH, signe d’une combinaison entre des interactions

électrostatiques et hydrophobes (Stănciuc et al., 2013). Plusieurs méthodes ont été utilisées

pour effectuer cette mise en contact, principalement en utilisant différents traitements de

température et de pH. Un résumé des principales méthodes employées pour produire des

complexes d’α-la (et même d’autres protéines) et d’OA est présenté au tableau 2.4.

(Adapté de : Brinkmann et al., 2013)

Tableau 2.4 : Principales méthodes utilisées pour la formation de complexe cytotoxiques protéine-‐OA

17

Les éléments présentés au tableau 2.4 permettent donc de constater qu’il est possible

d’arriver à produire les complexes à l’aide de différentes méthodes et en utilisant différents

ratios OA:protéine. Par contre, une partie seulement des complexes formés a démontré un

effet cytotoxique, alors que d’autres sont demeurés biologiquement inactifs (Mossberg et

al., 2010). Selon Brinkmann et al. (2013), les analyses en cristallographie à rayon X

effectuées à ce jour pour déterminer la structure tridimensionnelle de ces complexes n’ont

pas fourni de résultats déterminants. En effet, l’α-la dans les complexes HAMLET

développe une structure instable et changeante avec une légère perte de sa structure

secondaire et la disparition presque complète de sa structure tertiaire. La figure 2.5 présente

néanmoins un modèle général de la formation des molécules HAMLET. Il est possible d’y

voir les trois principales étapes du processus, soit l’utilisation d’une molécule d’α-la sous sa

forme native, la décalcification de la protéine et la mise en contact avec l’OA.

Figure 2.5 : Modèle général de la formation des molécules HAMLET. (Ho et al., 2012)

18

2.2.3 Propriétés biologiques

L’α-la est une protéine reconnue pour ses qualités nutritionnelles, principalement chez les

nourrissons. L’α-la joue tout d’abord un rôle important dans la production du lait chez les

mammifères, se complexant à l’enzyme β-1,4-galactosyltransferase pour former le

complexe lactose synthase qui est essentiel à la formation de lactose (Velusamy &

Palaniappan, 2011). Elle est aussi la protéine sérique la plus abondante dans le lait humain,

contrairement au lactosérum de lait bovin qui contient principalement de la β-lg (de Wit,

2001). Elle doit donc être ajoutée dans les formulations de lait maternisé afin de mieux

reproduire la composition du lait humain. Un autre élément nutritionnel important de cette

protéine est sa teneur élevée en tryptophane puisqu’il s’agit d’un acide aminé essentiel. Cet

acide aminé a démontré des effets positifs sur le développement du cerveau et du système

nerveux des nouveaux nés, en plus de jouer un rôle important dans le fonctionnement de

ces systèmes comme précurseur direct de la sérotonine. Ainsi, des travaux ont montré

qu’un apport régulier d’α-la chez des sujets adultes permettait d’augmenter les quantités

plasmatiques de tryptophane, améliorant ainsi certaines fonctions neurologiques (attention,

performances cognitives, vigilance matinale, etc.) (Markus et al., 2002, 2005). Cette

protéine possède également une bonne digestibilité et d’un faible pouvoir allergène (Gurgel

et al., 2001; Velusamy & Palaniappan, 2011).

Comme il a été mentionné précédemment, les protéines du lactosérum sont de plus

en plus utilisées pour la production de peptides possédant des activités biologiques

intéressantes au niveau santé. L’α-la a également été étudiée pour cet aspect et même s’il

n’y a pas encore de produits issus de son hydrolyse sur le marché, plusieurs peptides

couvrant une large gamme d’activités ont été découverts. Une liste de certains de ces

peptides est présentée au tableau 2.5. Comme il est possible de constater, l’α-la est capable

de fournir des séquences peptidiques couvrant un large spectre de fonctions et qui peuvent

être obtenues à partir de plusieurs enzymes, dont les principales enzymes digestives

humaines (trypsine, chymotrypsine, pepsine).

19

(Adapté de : Kamau et al., 2010)

2.3 Le peptide β-‐lg f1-‐8

2.3.1 La β-‐lactoglobuline

La β-lg est la plus abondante des protéines du lactosérum bovin, représentant près de 40 %

de son contenu total. C’est une protéine globulaire contenant 162 acides aminés; elle est

reconnue pour sa richesse en lysine, leucine, acide glutamique et acide aspartique. Son

poids moléculaire est de 18 400 Da et son pI de 5,1. Sa structure secondaire est composée

en majorité de feuillets β (≈50 %), mais on retrouve également des hélices α (10 %), des

coudes β (8 %) et une assez forte proportion de structure désordonnée (35 %) (Allain, 1998;

Kontopidis et al., 2004). Sa structure est également renforcée par deux ponts disulfures et

par une structure tertiaire composée majoritairement de feuillets β antiparallèles. La

séquence primaire en acides aminés ainsi qu’une représentation de sa structure

tridimensionnelle sont présentées à la figure 2.6.

Tableau 2.5 : Peptides à activité biologique issus de l’hydrolyse enzymatique de l’α-‐la.

20

La β-lg est reconnue pour posséder plusieurs fonctions, tant nutritionnelles que

fonctionnelles. Une des fonctions les plus étudiées présentement est la capacité de la

protéine à lier certaines molécules d’intérêt nutritionnel et à servir de matrice protectrice

lors de la digestion. Il a été démontré que la β-lg est capable de lier certaines vitamines (D2

et D3), le cholestérol, certaines catéchines et même le mercure (Kontopidis et al., 2004;

Zorilla et al., 2011; Diarrassouba, 2013). Ces interactions se produisent principalement

dans une zone centrale de la protéine, nommée calyx ou β-barrel, qui est formée de feuillets

β. Cette cavité hydrophobe, qui permet de fixer une grande variété de ligands, est régulée

par une boucle (EF loop) qui agit comme une porte au site de liaison. À bas pH, cette

boucle est en position « fermée » et les interactions sont impossibles. Lorsque le pH

augmente, la boucle s’ouvre ce qui permet aux ligands de s’insérer dans la cavité

hydrophobe (Kontopidis et al., 2004). Ce changement de structure, nommé transition de

Tanford, se produit généralement entre pH 6,5 et 7,5 (Taulier & Chalikian, 2001).

Un autre aspect important de la β-lg est la production de peptides par hydrolyse

enzymatique. L’hydrolyse de cette protéine par une grande variété d’enzymes (pepsine,

trypsine, chymotrypsine, plasmine, protéases bactériennes, etc.) permet de générer plusieurs

peptides bioactifs, qui ont démontré des propriétés antioxydantes, hypocholestérolémiantes,

antimicrobiennes, opioïdes, anti-cancer, antihypertensives, etc. (Caessens et al., 1999;

Madureira et al., 2010; Urista et al., 2011). En plus de leur potentiel d’activités biologiques,

Figure 2.6 : Séquence d’acides aminés et représentation de la structure tridimensionnelle de la β-‐lg (Filion, 2006).

21

les hydrolysats de β-lg contiennent certains courts peptides (5-15 acides aminés) qui

possèdent une capacité d’autoassemblage, pour ainsi former des structures complexes de

nanofibres et même d’hydrogels. Le peptide β-lg f1-8 produit par hydrolyse trypsique de la

β-lg (Pouliot et al., 2009), de même que le fragment β-lg f1-45 obtenu à l’aide d’une

protéase bactérienne (Creusot et al., 2007 et 2008), démontrent cette propriété.

2.3.2 Description générale du peptide

Comme le démontre la figure 2.7, le peptide β-lg f1-8 est constitué des huit premiers acides

aminés de la β-lg localisés à l’extrémité N-terminale (Leu-Ile-Val-Thr-Gln-Thr-Met-Lys)

de la protéine. Son point isoélectrique est de 8,75 et sa masse moléculaire est de 933,5

g/mol (Pouliot et al., 2009). En raison de sa composition en acides aminés (7 résidus

hydrophobes et 1 résidu basique), le peptide β-lg f1-8 est généralement très peu soluble

dans l’eau. De plus, les conditions de concentration, de pH et de température sous

lesquelles sa réhydratation est effectuée peuvent donner lieu à la formation de nanofibres et

d’hydrogels.

Sa capacité d’auto-assemblage a été observée au départ durant la concentration par

osmose inverse (OI) d’un hydrolysat de protéines de lactosérum obtenu à l’aide de la

trypsine. Lors de ce procédé, un précipité s’est formé spontanément et s’est montré

insoluble dans les différents solvants testés (urée, mercaptoéthanol et SDS). Par contre, le

précipité s’est avéré soluble en conditions très acides (pH < 2). L’analyse de la fraction

insoluble a permis de confirmer que le peptide β-lg f1-8 était majoritairement responsable

de la formation d’agrégats. Ce peptide représentait plus de 94 % du contenu peptidique de

Figure 2.7 : Séquence en acides aminés du peptide β-‐lg f1-‐8 (Adapté de Pouliot et al., 2009).

22

la fraction insoluble, ce qui a pu être démontré à l’aide d’une analyse en chromatographie

liquide en phase inversée (RP-HPLC) et par spectrométrie de masse (MS) (Pouliot et al.,

2009).

2.3.3 Méthode de production du peptide β-‐lg f1-‐8

La méthode suggérée par les travaux de Pouliot et al. (2009) est illustrée à la figure 2.8. La

production du peptide β-lg f1-8 comprend quatre principales étapes, soit l’hydrolyse

trypsique d’un IPL (1), la séparation du mélange peptidique par UF (2) et sa concentration

par OI jusqu’à l’apparition d’un précipité (3). Pour terminer la purification du peptide, le

précipité doit subir un lavage (3-5 stages) à l’eau déionisée suivi d’une centrifugation (4).

2.3.3.1 Hydrolyse enzymatique

Le peptide β-lg f1-8 est issu d’une hydrolyse enzymatique d’un IPL par la trypsine, une

endopeptidase qui coupe préférentiellement du côté carboxyl des acides aminés basiques

(Lys et Arg). Cette enzyme produit donc le peptide β-lg f1-8 en coupant le lien entre la

lysine en position 8 et la glycine en position 9 de la protéine, à partir de son extrémité N-

terminale. D’autres peptides comme le β-lg f15-20, f76-82 et f142-148 se retrouvent

également dans l’hydrolysat (Pouliot et al., 2009). L’utilisation de la trypsine nécessite

l’ajout de calcium dans la solution d’IPL puisque les ions Ca2+ stabilisent la structure de

l’enzyme, ce qui permet d’augmenter son activité (Cliffe & Grant, 1981). Durant

Figure 2.8 : Procédé de fabrication du peptide β-‐lg f1-‐8 selon la méthode utilisée par Pouliot et al. (2009).

(1) (2) (3) (4)

23

l’hydrolyse, la méthode pH-stat est utilisée pour mesurer l’avancement de la réaction

jusqu’au degré d’hydrolyse recherché (5,6 %). Cette méthode permet de mesurer en temps

réel l’hydrolyse des liens peptidiques par une ou plusieurs enzymes. La progression de la

réaction est évaluée par titration des groupes d’acides aminés libérés par l’enzyme à l’aide

d’une solution alcaline (NaOH 2 N). Le degré d’hydrolyse (DH) est calculé à partir de la

formule suivante :

Il est possible de déterminer le volume de base à ajouter durant la réaction pour

atteindre le degré d’hydrolyse requis (del Toro & García-Carreño, 2002). Les avantages de

cette méthode sont qu’elle permet de suivre en temps réel la réaction d’hydrolyse et qu’elle

ne nécessite pas l’utilisation de tampons puisque le pH est maintenu à 8,0 durant tout le

processus.

2.3.3.2 Concentration du mélange peptidique par membranes UF et OI

Suite à l’hydrolyse trypsique, la réaction est arrêtée par une étape d’UF avec une membrane

de seuil de coupure de 10 kDa. L’UF permet de conserver la trypsine encore active et les

protéines non-hydrolysées dans le rétentat. Cette méthode permet d’arrêter l’hydrolyse sans

avoir à chauffer l’hydrolysat pour dénaturer l’enzyme. Le perméat, riche en peptides, est

récupéré et concentré par OI, ce qui permet d’éliminer un grand volume d’eau et d’amener

le peptide β-lg f1-8 à sa concentration de floculation critique de 2,0-2,5 mg/mL (Pouliot et

al., 2009; Guy et al., 2011). L’effet de la concentration sur le peptide sera traité plus loin.

DH = B × NB × 1α × 1

MP × 1

htot × 100

où :B = Volume de base (mL)NB = Normalité de la base1/α = Degré de dissociation approximatif des groupements - NH3

+

Mp = Teneur en protéines dans la solutionhtot = Nombre de liaisons peptidiques dans la protéine (meq/g)

24

2.3.3.3 Purification du peptide β-‐lg f1-‐8 par lavage

La purification du peptide β-lg f1-8 peut se faire par une simple séquence de lavages à

l’aide d’eau déionisée et de centrifugations. La centrifugation s’effectue à 5000 × g pendant

12 min. Le peptide étant insoluble, il forme un culot qui est ensuite lavé afin d’augmenter

le degré de purification du fragment. Après élimination du surnageant, le même volume

d’eau HPLC est ajouté dans les tubes qui sont ensuite agités au vortex, puis centrifugés à

nouveau. Cette opération de lavage/centrifugation est répétée de 3 à 5 fois. La figure 2.9

montre l’évolution de la composition peptidique entre l’hydrolysat trypsique complet

(HTC) (a) le précipité obtenu après deux lavages (b), puis après une séquence de cinq

lavages (c). Dans ce dernier cas, la pureté du peptide est supérieure à 94 %.

25

Figure 2.9: Profil peptidique (RP-‐HPLC) du mélange peptidique avant lavage (a), du culot obtenu après 2 lavages (b) et après 5 lavages (c) à 20 oC (Résultats non-‐publiés).

a

b

c

26

2.3.4 Propriétés du peptide

2.3.4.1 Impact du pH

L’impact de la variation du pH sur le processus d’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 a

été vérifié par dichroïsme circulaire (CD) à différentes concentrations. Ces analyses ont

démontrées qu’à toutes les concentrations étudiées, les solutions peptidiques restaient

claires à pH inférieur à 2,0. À des valeurs supérieures de pH, une concentration critique

d’environ 2,5 mg/mL a été observée, donnant une suspension trouble entre pH 3,0 et 8,0. À

pH 9,0-11,0, les solutions commencent à former des hydrogels, passant de gels tendres à

des concentrations entre 3 et 30 mg/mL, à des gels fermes et opaques pour des

concentrations supérieures à 50 mg/mL (figure 2.10).

Les analyses en CD ont démontré un passage de la forme complètement aléatoire à

des pH acides, puis à l’apparition de plus en plus d’unités peptidiques sous la forme de

feuillets β lorsque le pH augmente. Cette transition est causée par le changement de la

charge globale du peptide qui est de +2 à pH 1,0-2,0, +1 entre pH 3,0 et 8,0, nulle aux

alentours de son pI (8,75) et -1 à des pH supérieurs à 9,0. Le changement de configuration

du peptide et l’auto-assemblage menant à sa floculation sont davantage favorisés lorsque la

charge du peptide s’approche de la neutralité ou est négative (Guy et al., 2011).

Figure 2.10 : Effet du pH sur l’aspect visuel des solutions de peptide β-‐lg f1-‐8 selon leur concentration (Adapté de Guy et al., 2011).

27

2.3.4.2 Impact de la concentration

Le passage du peptide de sa conformation aléatoire à une structure en feuillets β, qui mène

au processus d’auto-assemblage, est dépendant de la concentration. Des analyses de CD ont

démontré qu’à pH 10 et à une concentration entre 0,4 et 1,0 mg/mL, le peptide β-lg f1-8

adopte principalement une conformation aléatoire. Lorsque la concentration est augmentée

entre 1,0 et 1,5 mg/mL, la solution contient un mélange de peptide sous la forme aléatoire

et en feuillets β. Les résultats obtenus par Guy et al. (2011) sont synthétisés à la figure 2.11.

Les résultats présentés aux figures 2.10 et 2.11 démontrent donc qu’à un pH

supérieur à 2,0 et à une concentration supérieure à 1,5-2,0 mg/mL, le peptides adopte une

conformation en feuillet β et les unités peptidiques interagissent alors entre-elles, ce qui

peut mener à la formation de structures insolubles plus complexes (nanofibres, hydrogels).

2.3.4.3 Impact de la séquence d’acides aminés

Pour vérifier l’impact de la séquence d’acides aminés du peptide sur le processus d’auto-

assemblage, celle-ci a été modifiée par le biais de soustractions, d’ajouts et de substitutions

d’acides aminés (Guy, 2011). Le raccourcissement de la section hydrophobe en début de

chaîne, en substituant la leucine par une glycine, a provoqué une très forte diminution de la

transition du peptide en feuillet β. Cet effet s’est montré minime suite à la réduction du

caractère hydrophile du peptide, par substitution de la lysine par une alanine, signe que le

Figure 2.11 : Effet de la concentration sur la conformation du peptide β-‐lg f1-‐8 observée par DC à pH 10 (Adapté de Guy et al., 2011).

28

caractère hydrophobe du peptide est un élément dominant du processus d’auto-assemblage.

Par contre, une balance entre les interactions hydrophobes et électrostatiques est également

essentielle au processus. Une substitution de la lysine par l’acide glutamique n’a provoqué

aucun changement dans les spectres CD du peptide aux différents pH étudiés. La lysine

n’est donc pas nécessaire à l’auto-assemblage du peptide f1-8 et pourrait donc être

remplacée par un autre acide aminé (Guy, 2011).

2.3.5 Interactions avec les protéines du lactosérum

Des signes d’interactions entre le peptide β-lg f1-8 et les protéines du lactosérum ont déjà

été observés lors d’études précédentes. L’analyse par calorimétrie différentielle à balayage

(DSC) des interactions entre la β-lg et des peptides issus de protéines de lactosérum a

permis de constater une stabilisation de la protéine face à sa dénaturation thermique

(Barbeau et al., 1996). L’introduction d’une molécule hydrophobe dans la zone hydrophobe

de la protéine induit une modification de sa conformation vers une forme plus compacte et

la formation de nouveaux liens hydrogène internes. Ces interactions augmentent donc la

stabilité thermique de la protéine et cette stabilité varie selon la proportion de résidus non-

polaires des ligands. Plus la proportion de résidus non-polaires est élevée, plus la stabilité

de la protéine à la dénaturation thermique augmente. Selon les résultats obtenus par

Barbeau et al. (1996), la fraction protéique qui provoque le plus grand changement dans la

température de dénaturation de la protéine contient trois peptides, dont le peptide β-lg f1-8,

signe que ce peptide serait capable d’interagir avec la protéine et de provoquer une

modification de sa conformation.

Les travaux de Groleau et al. (2003) ont porté sur l’effet des conditions

physicochimiques sur les interactions peptides-peptides d’un hydrolysat trypsique de β-lg.

Les résultats ont mis en évidence un processus d’agrégation à pH acide qui impliquerait un

nombre limité de peptides, dont le peptide β-lg f1-8. Parmi les espèces retrouvées dans la

fraction précipitée, les fragments β-lg f1-8 et f15-20 sont des peptides hautement

hydrophobes, ce qui pourrait expliquer leur interaction à pH 4,0. De l’α-la non hydrolysée a

également été retrouvée dans le précipité, indiquant que la protéine pourrait interagir avec

29

elle-même ou avec certains peptides à pH acide. Les mécanismes expliquant ces résultats

ne sont cependant pas déterminés par les auteurs.

Plus récemment, dans le cadre d’essais préliminaire (non-publiés), il a été observé

que la mise en contact de solutions d’IPL et de protéines isolées avec le peptide β-lg f1-8

modifiait la composition protéiques des isolats, particulièrement lors du contact avec l’α-la.

Ceci suggère donc que l’interaction du peptide β-lg f1-8 avec l’α-la pourrait être utilisée

comme approche de fractionnement des protéines de lactosérum.

2.4 Interactions protéines-‐peptides

L’étude des interactions protéines-protéines et protéines-peptides, comme celles entre l’α-la

et le peptide β-lg f1-8, est d’une grande importance puisque ces interactions jouent un rôle

clé dans de nombreuses fonctions cellulaires. En effet, plusieurs processus comme la

transduction de signaux, la réplication et la réparation de l’ADN, l’expression de certains

gènes et le fonctionnement de certaines voies métaboliques dépendent de ces interactions

(Petsalaki et al., 2009; London et al., 2010). Les connaissances sur la nature de ces

interactions ainsi que les méthodes pour les évaluer sont également importantes dans le

cadre de ces travaux. En effet, elles devraient permettre de mieux comprendre les effets

observés lors de la mise en contact du peptide β-lg f1-8 avec l’α-la. Dans cette section, les

principaux types d’interactions retrouvées dans ce phénomène seront présentés, en plus des

principales méthodes utilisées pour les caractériser.

2.4.1 Nature des interactions

2.4.1.1 Interactions électrostatiques

Les deux principaux types d’interactions retrouvés dans les cas d’interactions protéines-

peptides sont les interactions électrostatiques et les interactions hydrophobes. Les

interactions électrostatiques représentent les forces d’attraction et de répulsion entre

30

molécules ou groupes de molécules chargées. Selon la loi de Coulomb, qui est utilisée pour

quantifier ces interactions, les molécules de charges opposées auront tendance à s’attirer,

alors que des charges similaires provoqueront de la répulsion (Creighton, 1993). Ces

interactions sont d’un grand intérêt puisqu’elles jouent un rôle important dans plusieurs

processus impliquant des protéines comme le repliement protéique, les changements de

conformation induits par le pH, la formation de gels, etc. (Hünenberger et al., 2001).

Il existe plusieurs types d’interactions électrostatiques comme les forces de Van der

Waals, les interactions dipôles-dipôles et les liens hydrogène (liens H). De plus, les

interactions électrostatiques entre les groupements acides (chargés négativement) et

basiques (chargés positivement) des acides aminés sont appelées ponts salins. Ces liaisons

entre les groupements carboxyliques (acide aspartique, acide glutamique ou C-terminal) et

les résidus azotés (arginine, lysine, histidine ou N-terminal) influencent la conformation des

protéines (Guy, 2011). Dans le cas des interactions protéines-peptides, ce sont surtout les

liens H qui sont en cause. Ces liens sont de faible intensité et se produisent lorsqu’un atome

d’hydrogène, qui est déjà lié à un atome (C, O, N), est également attiré par un autre atome

par le biais d’une interaction électrostatique. Généralement, le dipôle contenant l’hydrogène

qui possède une charge partielle positive, interagit avec la charge négative de l’autre atome

(Creighton, 1993). Une illustration de ce type de liaison est présentée à la figure 2.12.

Les paramètres physicochimiques qui influencent le plus les interactions

électrostatiques sont la force ionique du milieu et le pH. En effet, une force ionique élevée

nuit aux interactions électrostatiques, car les ions en solution masquent les charges des

protéines ou des peptides, ce qui diminue les interactions possibles entre les groupements

chargés (Guy, 2011). Étant donné que des groupements chargés sont impliqués dans le cas

d’interactions électrostatiques, le pH a aussi une grande influence sur leur impact. En effet,

les protéines et peptides en solution deviennent fortement chargés et les répulsions

intermoléculaires sont maximales lorsque le pH est éloigné de leur pI. À l’inverse, un pH

près du pI diminuera les répulsions entre les unités protéiques (ou peptidiques), favorisant

leur rapprochement (Pace et al., 2004).

31

2.4.1.2 Interactions hydrophobes

Les interactions hydrophobes peuvent être vues comme la tendance spontanée de

groupements non polaires à se regrouper pour minimiser leur contact avec l’eau dans une

solution aqueuse (Creighton, 1993; Meyer et al., 2006). Les interactions hydrophobes

provoquent généralement la formation de solutés peu solubles, étant généralement la cause

de la coalescence ou floculation dans des systèmes colloïdaux. De plus, un grand nombre

de processus d’auto-assemblage est causé par ces interactions, que ce soit la formation de

micelles, l’arrangement en bicouches lipidiques ou l’agrégation de protéines ou de peptides

(Meyer et al., 2006). Dans la structure des protéines et peptides, les interactions

hydrophobes surviennent généralement entre les acides aminés possédant un groupement

latéral non polaire aromatique ou aliphatique (tryptophane, leucine, isoleucine,

phénylalanine, etc.), lesquels se regroupement généralement au centre de la structure pour

former une zone hydrophobe (Creighton, 1993; Guy, 2011). Comme mentionné

précédemment, la β-lg possède un cavité hydrophobe qui peut lier certaines molécules

hydrophobes de nature lipidique (Diarrassouba et al., 2013) ou peptidique (Barbeau et al.,

1996).

Figure 2.12 : Interactions entre molécules d’eau par le biais de liens hydrogène (Source : http://biobook.nerinxhs.org/bb/cells/chemistry.htm)

32

L’action des interactions hydrophobes est dépendante de la température, étant plus

importante à température élevée (Meyer et al., 2006). En effet, l’eau est moins structurée à

haute température, ce qui provoque une baisse de solubilité des molécules non polaires.

Tout comme les interactions électrostatiques, les interactions hydrophobes sont influencées

par la force ionique de leur milieu aqueux, car la présence de certains ions fait augmenter la

tension superficielle de l’eau. La forte présence de ces ions provoque ainsi une diminution

de la solubilité des molécules non polaires et favorise leur précipitation (phénomène de

« salting-out ») (Guy, 2011).

2.4.2 Méthodes de caractérisation

Il existe une grande variété de méthodes pour déterminer l’occurrence d’interactions

protéines-peptides. Certaines méthodes permettent d’évaluer directement l’impact de ces

interactions sur la structure de la protéine, alors que d’autres permettent d’observer les

effets sur ses paramètres physicochimiques (solubilité, température de dénaturation, etc.).

Un résumé des principales méthodes retrouvées dans la littérature est présenté au tableau

2.6. Il est possible d’y retrouver les principaux types de méthodes (calorimétriques,

spectroscopiques et chromatographiques), l’effet mesuré par la méthode et les informations

qu’il est possible de retirer des résultats.

33

Tableau 2.6 : P

rinc

ipal

es m

étho

des p

erm

etta

nt d

e dé

tect

er la

pré

senc

e d’

inte

ract

ions

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es-‐p

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impa

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ur la

pro

téin

e

34

Cette revue de littérature permet donc de constater que l’étude des interactions

protéines-peptides est importante, car cela permet d’obtenir beaucoup d’informations sur la

structure et les propriétés des protéines. Dans le cas de l’α-la, des variations structurales lui

permettent d’interagir avec de nombreux ligands. Les différentes interactions étudiées

jusqu’à présent, principalement le cas des complexes HAMLET, fournissent des

informations importantes qui seront utiles afin de vérifier l’occurrence des interactions

entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la et de mieux les comprendre.

35

3. Hypothèse et objectifs

La revue de littérature a permis de démontrer que des interactions sont possibles entre le

peptide β-lg f1-8 et l’α-la. Cependant, il est aussi possible de penser que, selon les

conditions physicochimiques, ces interactions sont susceptibles d’affecter la capacité

d’auto-assemblage du peptide, de même que les propriétés physicochimiques de l’α-la. En

raison de la nature fortement hydrophobe de ce peptide, son potentiel d’interaction est

fortement dépendant de la température. De plus, l’α-la possède dans sa structure plusieurs

sites de liaisons avec des molécules hydrophobes. Ainsi, les interactions entre les deux

molécules étant potentiellement de nature hydrophobe, ces dernières sont susceptibles

d’affecter le profil de dénaturation thermique de l’α-la.

Ce travail repose donc sur l’hypothèse qu’en raison du caractère hydrophobe et de

la forte capacité du peptide ββ-lg f1-8 à floculer, sa mise en contact avec l’α-la induira

un changement au niveau des propriétés physicochimiques des deux molécules.

Deux objectifs généraux ont été définis dans le cadre de ces travaux afin de vérifier cette

hypothèse, soit :

3.1- Déterminer l’effet de la température et de la présence d’α-la sur le processus de

floculation du peptide β-lg f1-8.

3.2- Caractériser l’impact de l’interaction entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la sur la

solubilité de la protéine à différents pH et sur son profil de dénaturation thermique.

37

4. Effet de la température sur l’auto-‐assemblage du peptide β-‐lg f1-‐8 en présence d’α-‐lactalbumine

4.1 Objectifs spécifiques et approche méthodologique

L’objectif général de cette section expérimentale était de déterminer l’effet de la

température et de la présence d’α-la sur le processus de floculation du peptide β-lg f1-8 en

cours de concentration par osmose inverse (OI).

Plus spécifiquement, les travaux visaient à :

- Évaluer l’effet de la température sur le phénomène d’auto-assemblage du peptide β-

lg f1-8.

- Caractériser l’effet de la présence d’α-la sur les propriétés d’auto-assemblage du

peptide β-lg f1-8 en fonction de la température.

L’approche méthodologique développée afin de rencontrer ces objectifs a été basée

sur l’observation de la turbidité en cours d’OI de l’hydrolysat trypsique complet (HTC) seul

et en présence d’α-la, à 4 oC, 25 oC et 55 oC.

38

4.2 Matériel et méthodes

4.2.1 Produits et matériel utilisés

L’IPL (BiproTM, 95 % protéine, p/p) et l’α-la (BiopureTM, lait bovin, 92,5 % protéine, p/p)

qui ont été utilisées provenaient de Davisco Food International Inc. (Le Sueur, MN, USA).

La trypsine (pancréas bovin, type VI) usilisée pour l’hydrolyse provenait de Neova

Technologies (Abbotsford, BC, Canada). Les solutions de phases mobiles pour les analyses

HPLC ont été préparées dans l’eau de grade HPLC (PureLab Ultra, Elga Labwater,

Marlow, UK) et filtrées avec des membranes de nylon de 0,2 µm (Whatman, Dassel,

Germany).

4.2.2 Méthodes

4.2.2.1 Préparation de l’hydrolysat

L’hydrolysat trypsique a été préparé à l’échelle laboratoire selon la méthode décrite par

Pouliot et al. (2009). Une solution d’IPL (10 %, p/v) a été préparée en dissolvant 200 g de

poudre dans 2 L d’eau déminéralisée additionnée de 0,01 M de CaCl2. Le pH de la solution

a été ajusté à 8,0 avec du NaOH 2 N et la température stabilisée à 45 oC. L’hydrolyse a été

initiée par l’ajout d’une solution de trypsine (10 %, p/v) dissoute dans du HCl 0,001 N. Le

ratio enzyme:substrat était de 1:700. Le pH de la solution a été maintenu à pH 8,0 avec du

NaOH 2 N et la méthode pH-stat a été utilisée pour arrêter l’hydrolyse à un degré

d’hydrolyse (DH) de 5,6 % (del Toro & García-Carreño, 2002). La réaction a été arrêtée

par UF à l’aide d’un système Prep/Scale-TFF (Millipore Corporation, Billerica, MA) et

d’une membrane de polyéthersulfone de 10 kDa (Millipore Corporation). La filtration a été

effectuée à 45 oC à une pression de 1,4 bar. Le perméat récolté, représentant l’hydrolysat

trypsique complet (HTC), a été maintenu à 4 oC jusqu’à son utilisation.

4.2.2.2 Osmose inverse

La concentration par OI de l’HTC a été réalisée à l’aide d’un module Sepa ST (Osmonics,

Vista, CA) équipé de coupons membranaires à usage unique de 300 Da (MX07, Osmonics).

39

La vérification du débit à l’eau des membranes a été effectuée à 25 oC, avant et après la

réalisation du bloc expérimental. Les coupons membranaires n’étaient pas humidifiés

préalablement aux essais d’OI. Pour les analyses préliminaires sans α-la, le système de

filtration a été placé dans un bain d’eau à température pièce (23 oC), dans un système

thermostaté ajusté à 58 oC ou dans un bain de glace (4 oC). Pour les analyses sur l’impact

de l’α-la, le système d’OI était placé dans un bain thermostaté ajusté à 25 ou 55 oC. Un

volume de 200 mL d'HTC a été placé dans le module sous agitation jusqu’à l’atteinte de la

température désirée (voir figure 4.1). Les échantillons contenant de l’α-la (200 mL, 1 %,

p/v) étaient préparés la veille et laissés sous agitation à 4 oC toute la nuit. Le pH des

hydrolysats n’a pas été modifié avant l’étape de filtration, afin de reproduire le plus

fidèlement possible le procédé réalisé à l’échelle pilote. Les filtrations se sont déroulées à

une pression de 6,9 bars. Le volume de perméat et un échantillon pour les analyses

turbidimétriques ont été relevés toutes les 30 min pendant 240 min. Pour chacun des

traitements, l’expérience a été réalisée en triplicata. Le débit moyen a été évalué à partir de

l’équation suivante :

4.2.2.3 Analyses HPLC

Les différents lots d’hydrolysats produits ont été analysés par HPLC (1100 Series, Agilent

Technologies, Palo Alto, CA) pour vérifier l’homogénéité de leur profil peptidique. Le

système était équipé d’un détecteur UV-visible (modèle G1314A) à une longueur d’onde de

214 nm, d’un dégazeur (modèle G1312A), d’une pompe binaire (modèle G1379A), d’un

injecteur (modèle G1329A) et d’un module de chauffage de la colonne (modèle G1330B).

L’acquisition des données s’est faite à l’aide du logiciel Chem Station (version B.01.03,

Agilent Technologies). La phase stationnaire était une colonne Luna C18 (250 × 2 mm,

Phenomenex, Torrance, CA). La phase mobile était constituée du solvant A (0,10 % v/v,

Débit moyen (ml/min) = V180 (mL)180 min

où :V180 = Volume de perméat récolté après 180 min d'OI

40

acide trifluoroacétique (TFA) dans de l’eau) et du solvant B (90 % v/v, acétonitrile (ACN);

10 % v/v, eau; 0,10 % v/v, TFA). Les échantillons d’hydrolysats liquides ont été dilués

dans un rapport 1:2 avec du solvant A, pour un volume d’injection de 50 µL. L’élution des

composantes a été réalisée avec un gradient de solvant B allant de 1 à 40 % en 90 min., puis

avec une montée jusqu’à 100 % B de 90 à 125 min. Ce niveau a été ensuite maintenu

pendant 20 min. Le débit d’élution était de 0,2 mL/min. L’analyse HPLC des différents

lots hydrolysats obtenus par hydrolyse trypsique a démontré que leur profil peptidique et

leur teneur en peptide β-lg f1-8 étaient semblables (résultats non présentés) et ne pouvaient

donc pas influencer les résultats de manière importante.

4.2.2.4 Suivi de la floculation du peptide

Lors d’essais préliminaires, l’apparition de la floculation a été observée visuellement par

des prélèvements du rétentat d’OI à toutes les 30 min. Le facteur de concentration critique

(FCC) a été déterminé par la formule suivante :

Pour les analyses avec α-la, l’absorbance à 500 nm (A500) des échantillons de

rétentat d’OI, prélevés à toutes les 30 min, ont été analysés à l’aide d’un spectrophotomètre

UV-visible Multiscan Spectrum, modèle 1500 (Thermo Electron, Vantaa, Finland).

L’acquisition des données a été effectuée par le logiciel SkanIT, version 2.1.86 (Thermo

Electron).

FCC = VI

VRF

où :VI = Volume initial (mL)VRF = Volume de rétentat à l'apparition de la floculation (mL)

41

4.2.2.5 Analyses statistiques

Les figures et les analyses statistiques présentées dans cette section ont été réalisées à l’aide

du logiciel GraphPad Prism 5, version 5,04 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Les valeurs moyennes (n = 3) des débits moyens à la figure 4.3 ont subi une analyse de la

variance (ANOVA) suivi d’un test de Bonferroni (p ≤ 0,5) pour comparer tous les

traitements entre eux. Les valeurs moyennes (n = 3) d’absorbance en fonction du temps

(figure 4.4) ont subi une analyse de la variance à deux facteurs par la procédure Mixed

(Mixed ANOVA) suivi d’un test de Bonferonni (p ≤ 0,5) pour comparer tous les

traitements entre eux.

Figure 4.1 : Schéma du montage expérimental utilisé pour l’osmose inverse (OI) des mélanges peptidiques. 1) Alimentation en azote; 2) Module d’OI; 3) Bain thermostaté; 4) Contenant récepteur du perméat; 5) Plaque agitatrice; 6) Élément chauffant; 7) Pinces de fermeture du module; 8) Barreau magnétique; 9) Support de la membrane; 10) Disque membranaire; 11) Joints d’étanchéité.

42

4.3 Résultats et discussion

4.3.1 Effet de la température sur l’auto-‐assemblage du peptide β-‐lg f1-‐8

L’impact de la température sur la floculation du peptide β-lg f1-8 a été déterminé en

comparant le débit moyen de l’OI (figure 4.2a), le temps moyen de floculation (figure 4.2b)

et le FCC (figure 4.3c) à trois différentes températures (4 ± 2, 23 ± 2, 58 ± 2 oC). Comme le

démontrent ces résultats, le débit moyen augmente lorsque la température devient plus

élevée. À l’inverse, le temps moyen de floculation est plus élevé à basse température et

diminue lorsque la température augmente. Par contre, le FCC ne varie pas autant que les

deux autres paramètres, restant relativement stable aux trois niveaux de température.

L’augmentation du débit en fonction de la température peut être attribuée à la

viscosité des fluides qui a tendance à diminuer lorsque la température augmente (Fogel’son

& Likhachev, 2001). De plus, Goosen et al. (2002) ont démontré qu’une augmentation de la

température avait un effet sur le débit en modifiant certains paramètres de la membrane,

dont la taille des pores. Comme le débit de filtration augmente avec la température, le

rétentat se concentre donc plus rapidement à température plus élevée. Selon Guy et al.

(2011), la floculation du peptide β-lg f1-8 dépend de sa concentration. Ces observations

expliquent pourquoi le temps de floculation diminue alors que le débit augmente, puisqu’à

température plus élevée, la concentration critique menant à l’agrégation des unités de

peptide β-lg f1-8 est atteinte plus rapidement. Les résultats de FCC obtenus semblent donc

confirmer ceux de Guy et al. (2011), qui ont également permis de déterminer que la

température n’a pas un effet significatif sur le processus d’auto-assemblage et n’influence

donc pas directement la formation des feuillets β. Ceci pourrait donc expliquer la stabilité

des valeurs de FCC observées dans les trois séries d’OI. Un débit de filtration plus élevé

signifie donc que le rétentat se concentre plus rapidement, ce qui diminue le temps

nécessaire pour atteindre la concentration critique du peptide β-lg f1-8. Par contre, même si

la floculation se produit plus rapidement, le niveau de concentration du rétentat atteint

lorsqu’elle se produit (FCC) reste sensiblement le même aux trois températures étudiées.

43

Figure 4.2 : Débit moyen (a) du temps moyen de floculation (b) et du facteur de concentration critique (FCC) (c) pour les OI effectuées sur l’hydrolysat trypsique complet (HTC) (10 %, p/v) à basse température (4 ± 2 oC), température ambiante (23 ± 2 oC) et température élevée (58 ± 2 oC). Les valeurs sont des moyennes ± SD (n = 2).

a b

c

44

Suite à ces résultats, il a été décidé de poursuivre les travaux en excluant les

analyses à 4 oC, car le débit de filtration à cette température est très faible. De plus,

l’utilisation d’un bain thermostaté avec de la glace ne permettait pas un maintien de la

température aussi efficace que les deux autres traitements. Il a également été décidé

d’effectuer les filtrations à 55 oC plutôt qu’à 58 oC, et ce, pour éviter de trop s’approcher de

la température de dénaturation thermique de l’α-la.

4.3.2 Effet de la présence de l’α-‐la sur le processus d’auto-‐assemblage du peptide β-‐lg f1-‐8 à 25 et 55 oC

La figure 4.3 présente les valeurs de débits moyens pour les quatre traitements d’OI

effectués. Tout comme pour les résultats présentés à la section précédente, il est observé

que le débit est significativement plus élevé lorsque l’OI est réalisée à 55 oC plutôt qu’à 25 oC. Par contre, même si une certaine diminution du débit est observée en présence d’α-la,

les valeurs ne sont pas significativement différentes de celles des filtrations sans protéine.

Les travaux d’Andersen et al. (2008) ont montré que la présence d’α-la (10 %, p/v)

provoque une augmentation de la viscosité de solutions aqueuses, même si cet effet est

moins important que dans le cas de la β-lg. Dans le cadre de ces essais, il semblerait donc

que cet effet n’ait pas été assez important pour causer des différences significatives sur les

flux de perméation des OI.

45

Durant les analyses préliminaires en absence d’α-la, le phénomène de floculation

était très rapide, ainsi le moment précis où l’apparition de la floculation était observable

visuellement et a été utilisé pour marquer le départ du processus de floculation (FCC). Pour

les analyses en présence d’α-la, l’utilisation de la turbidimétrie a permis de constater que

l’apparition de la floculation était un processus plus graduel. La figure 4.4a présente

l’évolution de la turbidité du rétentat d’OI (A500) en fonction du temps pour les quatre

traitements d’OI. La figure 4.4b illustre également l’évolution de la turbidité des différents

rétentats, mais en fonction du facteur de concentration (FC). Ce facteur, qui est le rapport

entre le volume initial d’hydrolysat dans la cellule de filtration et le volume de rétentat au

temps de prélèvement, représente l’avancement de la concentration du rétentat durant la

Figure 4.3 : Débits moyens des traitements d’OI de l’hydrolysat trypsique complet (HTC) (10 %, p/v) à 25 oC sans α-‐la (OI 25-‐SA) et avec α-‐la (OI 25-‐AA), puis à 55 oC sans α-‐la (OI 55-‐SA) et avec α-‐la (OI 55-‐AA). Les valeurs sont des moyennes ± SEM (n = 3).

46

filtration. En effet, comme le débit moyen des différentes filtrations varie selon la

température, il est fort probable que, pour un temps donné, les rétentats des quatre

traitements de filtration ne soient pas tous aussi concentrés. Étant donné que la

concentration est un élément clé dans le processus d’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8,

l’utilisation de ce facteur s’avère donc importante pour l’analyse des résultats.

Figure 4.4 : Évolution de l’A500 en fonction du temps (a) et du facteur de concentration (b) des traitements d’OI des hydrolysats trypsiques complets (HTC) (10 %, p/v) à 25 oC sans α-‐la (OI 25-‐SA) et avec α-‐la (OI 25-‐AA), puis à 55 oC sans α-‐la (OI 55-‐SA) et avec α-‐la (OI 55-‐AA). Les valeurs sont des moyennes ± SEM (n = 3).

a

b

47

La figure 4.4a montre que l’augmentation de la turbidité est nettement plus

importante pour le traitement OI 55-SA que pour les trois autres traitements. Selon les

analyses statistiques effectuées pour comparer l’évolution de la turbidité en fonction du

temps des traitements OI 25-AA, OI 25-SA et OI 55-AA, ces filtrations ne sont pas

significativement différentes à tous les temps analysés. Par contre, les valeurs d’A500 des

temps 210 (p ≤ 0,05) et 240 min (p ≤ 0,0001) du traitement OI 55-SA sont

significativement différentes des trois autres. La figure 4.4b démontre, quant à elle, que les

quatre traitements d’OI n’ont pas autant concentré le rétentat, celui à 55 oC sans α-la étant

le plus performant avec un FC final environ 30 % plus élevé que les autres traitements.

Comme dans la section précédente, les résultats obtenus par spectrophotométrie

démontrent qu’une augmentation de la température accélère la floculation du peptide β-lg

f1-8, mais sans influencer le processus global d’auto-assemblage. En effet, l’évolution de la

turbidité en fonction du FC montre que le traitement à 25 oC sans α-la n’atteint pas le même

niveau de concentration que le traitement équivalent à 55 oC, ce qui rejoint toujours les

conclusions de Guy et al. (2011). L’ajout d’α-la (1 %, p/v) ne semble pas non plus

influencer les résultats à 25 oC, puisque l’A500 maximale et le FC final ne sont pas

significativement différents pour les deux traitements à cette température. Par contre,

l’ajout d’α-la à 55 oC provoque une modification du profil de floculation du peptide β-lg f1-

8. En effet, même si seulement les deux dernières mesures de la courbe OI 55-SA (figure

4.4a) sont significativement différentes, il est possible d’observer que l’ajout de l’α-la

ramène l’évolution de la turbidité au même niveau qu’à 25 oC. Il est possible que le débit

moyen légèrement plus faible observé pour le traitement à 55 oC avec α-la puisse avoir

ralenti la floculation en réduisant la concentration du rétentat, ce qui peut être observé à la

figure 4.4b. Par contre, comme cette variation n’est pas significative, le débit seul ne peut

pas expliquer la diminution globale de la turbidité du rétentat.

Gurgel et al. (2001) ont démontré que l’α-la pouvait interagir avec de courts

peptides à l’aide de trois mécanismes distincts, dont un via des interactions hydrophobes.

Groleau et al. (2003) ont également mentionné dans leurs travaux que la précipitation de

l’α-la au sein d’un mélange peptidique à pH 4,0 pouvait être liée à l’interaction de la

48

protéine avec des peptides hydrophobes, dont le peptide β-lg f1-8. Il est donc possible que

dans les rétentats contenant l’α-la, celle-ci fixe des molécules de peptide β-lg f1-8 ce qui

diminue la quantité d’unités peptidiques disponibles pour le processus de floculation et

retarde l’élévation de la turbidité. Comme cet effet est remarqué à 55 oC et que le peptide β-

lg f1-8 possède un fort caractère hydrophobe (Guy, 2011), il est donc probable que ces

interactions soient de nature hydrophobe puisqu’elles sont favorisées à haute température

(Meyer et al., 2006). Par contre, la présence d’autres peptides hydrophobes au sein de

l’hydrolysat (β-lg f15-20, f142-148) et la capacité de l’α-la de lier également des peptides

plus polaires permettent de penser que d’autres éléments pourraient avoir participé au

ralentissement du processus de floculation du peptide β-lg f1-8. Davantage d’analyses

seront donc nécessaires afin de déterminer avec plus de précision l’effet de l’α-la sur l’auto-

assemblage du peptide β-lg f1-8. De plus, une meilleure caractérisation des interactions

entre les deux molécules serait également nécessaire, bien que les interactions hydrophobes

semblent être prédominantes.

4.4 Conclusion

Les résultats obtenus dans ce bloc expérimental ont permis de confirmer certains résultats

obtenus par Guy et al. (2011) et ce, en démontrant que la température n’a pas d’effet direct

sur le processus d’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8. Le seul effet observé est

l’apparition plus rapide de la floculation due à la concentration plus rapide du peptide β-lg

f1-8 en OI, laquelle est provoquée par un flux de perméation plus élevé. Par contre, l’ajout

d’α-la à 55 oC provoque des changements importants du profil de turbidité du rétentat. En

effet, le facteur de concentration atteint après 240 min de filtration est près de 13 %

inférieur lorsque l’α-la est ajoutée. De plus, les valeurs d’A500 dans le temps diminuent au

même niveau que celles des filtrations à 25 oC. Ces résultats suggèrent donc que la

présence de l’α-la a un impact sur le processus de floculation du peptide β-lg f1-8 à haute

température, signe de probables interactions hydrophobes entre les deux molécules.

49

5. Effet de la présence du peptide β-‐lg f1-‐8 sur les propriétés physicochimiques de l’α-‐lactalbumine

5.1 Objectifs spécifiques et approche méthodologique

L’objectif général de cette partie expérimentale était d’évaluer l’impact de l’interaction

entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la sur la solubilité de la protéine et sur son profil de

dénaturation thermique à différents pH.

Plus spécifiquement, les travaux visaient à :

- Déterminer la solubilité de l’α-la seule ou en présence du peptide β-lg f1-8 en

fonction du pH.

- Caractériser le comportement thermique par calorimétrie différentielle à balayage

(DSC) de l’α-la seule et en présence du peptide β-lg f1-8 entre 25 et 100 oC et ce, à

des valeurs de pH de 4,5 et 7,0.

L’approche méthodologique pour réaliser ces objectifs consistait en deux blocs

expérimentaux, le premier étant l’observation de l’évolution de la turbidité de solutions

d’α-la seule, d’α-la avec le peptide β-lg f1-8 et avec l’HTC, à des pH entre pH 2,0 et 9,0. Le

second bloc expérimental a consisté à déterminer le profil de dénaturation thermique par

DSC entre 25 et 100 oC de l’α-la seule et avec le peptide β-lg f1-8 à pH 4,5 et 7,0.

50

5.2 Matériel et méthodes

5.2.1 Produits et matériel utilisés

L’IPL (BiproTM, 95 % protéine, p/p) et l’α-la (lait bovin, BiopureTM) utilisés pour les

analyses de turbidité provenaient de Davisco Food International Inc. (Le Sueur, MN, USA).

La trypsine (pancréas bovin, type VI) utilisée pour l’hydrolyse provenait de Neova

Technologies (Abbotsford, BC, Canada). L’α-la (lait bovin, type 1, ≥ 85 %) utilisée pour

les analyses DSC provenait de Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Les tampons et

solutions de phases mobiles ont été préparés dans l’eau de grade HPLC (PureLab Ultra,

Elga Labwater, Marlow, UK) et filtrés avec des membranes de nylon de 0,2 µm (Whatman,

Dassel, Germany).

5.2.2 Méthodes

5.2.2.1 Préparation du peptide β-‐lg f1-‐8

L’hydrolysat trypsique a été préparé suivant les mêmes étapes qu’à la section 4.2.2.1, mais

à l’échelle pilote selon la méthode de Pouliot et al. (2009). Une solution d’IPL (10 %, p/v)

a été préparée en dissolvant 10 Kg de poudre dans 100 L d’eau déminéralisée et en ajoutant

0,01 M de CaCl2. Le pH de la solution a été ajusté à 8,0 avec du NaOH 2 N et la

température stabilisée à 45 oC. L’hydrolyse a débuté par l’ajout d’une solution de trypsine

(10 %, p/v) dissoute dans du HCl 0,001 N. Le ratio enzyme:substrat était de 1:700. Le pH

de la solution a été maintenu à pH 8,0 avec du NaOH 2 N et la méthode pH-stat a été

utilisée pour contrôler l’hydrolyse jusqu’à un degré d’hydrolyse (DH) de 5,6 % (del Toro &

García-Carreño, 2002). La réaction a été arrêtée par UF à l’aide d’un système GE Niro

(Hudson, WI) et d’une membrane de polyéthersulfone avec un seuil de coupure de 10 kDa

(Osmonics, Vista, CA). La filtration a été effectuée à 45 oC à une pression de 6,9 bars. Le

perméat récolté a été concentré par OI sur le même système, mais avec une membrane de

polyamide de 300 Da (DesalTM RO membrane, Osmonics) et à une pression de 17,2 bars.

La solution peptidique concentrée a été lyophilisée et entreposée à température pièce. Pour

obtenir le peptide β-lg f1-8, l’HTC a été réhydraté dans l’eau de grade HPLC à une

concentration à de 5 % (p/v), puis centrifugé à 5000 × g pendant 12 min à 20 oC. Pour

51

augmenter la pureté du peptide β-lg f1-8, le culot a été resuspendu dans un même volume

d’eau HPLC, puis centrifugé quatre (4) autres fois dans les mêmes conditions. Le peptide

purifié a été lyophilisé et conservé à -20 oC.

5.2.2.2 Analyses HPLC

La méthode HPLC utilisée pour les analyses de pureté du peptide β-lg f1-8 a été la même

que celle décrite a la section 4.2.2.3. Les échantillons lyophilisés ont été analysés suivant

leur mise en solution dans la phase mobile A à une concentration de 2 mg/mL, puis un

volume de 50 µL a été injecté dans la colonne (résultats non-présentés).

5.2.2.3 Détermination de la solubilité de l’α-‐la par turbidimétrie

Des solutions d’α-la (1 %, p/v), de l’HTC (5 %, p/v), du peptide β-lg f1-8 (10 mg/mL) et de

combinaisons d’α-la avec les autres produits (1 %, p/v d’α-la avec 5 %, p/v de l’HTC ou 10

mg/mL du peptide β-lg f1-8) ont été préparées en triplicata. Les solutions ont été agitées

pendant 15 min à température de la pièce, puis le pH a été ajusté à 2,0 avec du HCl 2 N. À

partir de cette valeur, le pH a été augmenté de pH 2,0 à 9,0 avec du NaOH 1 N. La turbidité

a été évaluée à chaque intervalle de pH par la mesure de l’absorbance à 500 nm (A500) à

l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible Multiscan Spectrum, modèle 1500 (Thermo

Electron, Vantaa, Finland). L’acquisition des données a été effectuée par le logiciel SkanIT,

version 2.1.86 (Thermo Electron).

5.2.2.4 Analyses calorimétriques (DSC)

L’étude calorimétrique de l’α-la seule et en présence du peptide β-lg f1-8 a été effectuée par

DSC selon la méthode de Barbeau et al. (1996). L’appareil était un DSC Pyris 1 de

PerkinElmer (Woodbridge, ON, Canada). Le balayage de température a été fait de 5 à

100 oC avec une augmentation de 5 oC/min. Les échantillons ont été préparés à température

pièce et placés dans des cupules en acier inoxydable à large volume (LVC) d’une capacité

de 60 µL (PerkinElmer, Shelton, CT). Un volume d’échantillon de 40 µL a été pipeté dans

les cupules. Les solutions d’α-la seule (15 mg/50 µL) et les solutions d’α-la en présence du

52

peptide β-lg f1-8 (15:1,0 mg/50 µL) ont été préparées dans un tampon acétate 0,5 M pour

les analyses à pH 4,5 et dans un tampon phosphate 0,5 M pour les analyses à pH 7,0. Ces

valeurs ont été choisies pour les raisons suivantes : le pI de l’α-la est à pH 4,5 (forme apo-

α-la) et le comportement thermique de l’α-la a déjà été étudié à pH 7,0 (Relkin & Mulvihill,

1996; Permyakov & Berliner, 2000; McGuffey, 2004; Fernández et al., 2012). Un résumé

des conditions de préparation des échantillons est présenté au tableau 5.1.

À cause du faible volume des échantillons, leur pH final n’a pas été mesuré après leur

préparation. La calibration du système a été effectuée avec un standard d’indium, alors

qu’une capsule vide scellée a été utilisée comme référence. Des échantillons contenant les

tampons et le peptide β-lg f1-8 seul ont aussi été analysés et aucune réponse endothermique

n’a été observée (résultats non présentés). La température de dénaturation (TD) et

l’enthalpie de dénaturation (ΔHD) ont été calculées par le logiciel de l’appareil.

Description des

paramètres et des

échantillons

Sans α-‐lactalbumine Avec α-‐lactalbumine

Sans peptide

β-‐lg f1-‐8

Avec peptide

β-‐lg f1-‐8

Sans peptide

β-‐lg f1-‐8

Avec peptide

β-‐lg f1-‐8

Tampon acétate

0,5 M, pH 4,5

Volume de

40 μL

1,0 mg peptide 15 mg protéine 15,0 mg pro. +

1,0 mg pep.

50 μL de tampon 50 μL de tampon 50 μL de tampon

Triplicata Volume de 40 μL Volume de 40 μL Volume de 40 μL

Triplicata Triplicata Triplicata

Tampon phosphate

0,5 M, pH 7,0

Volume de

40 μL

1,0 mg peptide 15 mg protéine 15,0 mg pro. +

1,0 mg pep.

50 μL de tampon 50 μL de tampon 50 μL de tampon

Triplicata Volume de 40 μL Volume de 40 μL Volume de 40 μL

Triplicata Triplicata Triplicata

Tableau 5.1 : Préparation des échantillons pour les analyses DSC.

53

5.2.2.5 Analyses statistiques

Les figures et les analyses statistiques présentées dans cette section ont été réalisées à l’aide

du logiciel GraphPad Prism 5, version 5,04 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Les valeurs moyennes (n = 3) d’absorbance à la figure 5.1b ont subi une analyse de la

variance à deux facteurs par la procédure Mixed (Mixed ANOVA) suivi d’un test de

Bonferroni (p ≤ 0,5), cette fois-ci en comparant les résultats des mélanges (α-la + peptide β-

lg f1-8 et α-la + HTC) avec les résultats obtenus pour l’α-la seule (valeurs de référence).

Les valeurs moyennes (n = 3) des paramètres analysés en DSC ont subi une analyse de la

variance à deux facteurs (ANOVA) avec un test de Bonferonni (p ≤ 0,5) pour comparer

tous les traitements entre eux.

54

5.3 Résultats et discussion

5.3.1 Effet de la présence du peptide β-‐lg f1-‐8 sur la solubilité de l’α-‐la en fonction du pH

Le profil de turbidité de l’α-la a été établi par turbidimétrie entre pH 2,0 et pH 9,0 afin de

vérifier si sa mise en contact avec le peptide β-lg f1-8 ou l’HTC pouvait influencer sa

solubilité (figure 5.1a). Pour des fins de comparaison, les profils de turbidité aux mêmes pH

de solutions d’HTC et du peptide β-lg f1-8 sans α-la sont également présentés à la figure

5.1b.

Dans le cas de la protéine seule, le profil de turbidité (figure 5.1a) présente deux

zones où l’A500 est presque nulle et où l’α-la demeure soluble, soit avant pH 4,0 et après pH

5,0. Entre ces deux pH, l’élévation soudaine de l’A500 résulte de l’opacification de la

solution causée par la précipitation de la protéine. L’α-la est reconnue pour être une

protéine généralement soluble, sauf dans la région de son pI (pH 4,2-4,8) où elle précipite.

En effet, c’est dans cette zone de pH qu’elle passe sous sa forme décalcifiée (apo-α-la),

laquelle est plus hydrophobe et donc moins soluble (Schneider, 2008).

Les profils de turbidité de l’α-la en présence du peptide β-lg f1-8 et de l’HTC

(figure 5.1a) sont sensiblement différents de celui de la protéine seule. En effet, le mélange

contenant l’HTC (5 %, p/v) présente une diminution significative (p ≤ 0,0001) d’environ 75

% de la valeur d’A500 à pH 5,0 par rapport à la protéine seule. Cette diminution en présence

de l’HTC signifie que ce mélange de peptides interfère dans le processus de floculation de

l’α-la à son pI et améliore sa solubilité.

55

Figure 5.1 : Évolution de la turbidité de solutions d’α-‐la seule (1 %, p/v), d’α-‐la avec le peptide β-‐lg f1-‐8 (1 %, p/v + 10 mg/mL) et d’α-‐la avec l’hydrolysat trypsique complet (HTC) (1 %, p/v + 5 %, p/v) (a) et de solutions d’HTC (5 %, p/v) et de peptide β-‐lg f1-‐8 (10 mg/mL) sans α-‐la (b) entre pH 2,0 et pH 9,0. Les valeurs sont des moyennes ± SEM (n = 3).

a

b

56

Pour ce qui est du mélange α-la:peptide β-lg f1-8 (10 mg/mL), l’A500 suit le même

profil que la protéine seule jusqu’à pH 5,0, puis reste significativement plus élevée jusqu’à

pH 9,0 (p ≤ 0,0001) (figure 5.1a). Si la présence du peptide β-lg f1-8 n’avait aucun effet sur

l’α-la, l’A500 de la solution aurait diminué suite à la resolubilisation de la protéine au-delà

de son pI et le profil de turbidité observé aurait normalement été équivalent à celui du

peptide β-lg f1-8 seul (figure 5.1b). Cependant, les valeurs d’A500 du mélange α-la:peptide

à pH ≥ 5,0 restent élevées et sont même supérieures à celles du peptide β-lg f1-8 seul, ce

qui signifie que la présence du peptide β-lg f1-8 diminue la solubilité de l’α-la.

Dans le cas du profil de turbidité du peptide β-lg f1-8 seul (figure 5.1b), il

correspond aux observations de Guy et al. (2011) puisque la turbidité de la solution

augmente en fonction du pH. Cela signifie que l’auto-assemblage en feuillets β des unités

peptidiques progresse lorsque le pH augmente, ce qui favorise leur floculation et contribue

à augmenter l’opacité de la solution. Le profil observé pour l’HTC seul (figure 5.1b)

concorde également avec les résultats des travaux effectués précédemment sur le peptide β-

lg f1-8 (Guy et al., 2011). En effet, il a été démontré que la conformation en feuillet β et les

noyaux d’agrégation formés par l’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 étaient très stables

lorsque la concentration critique de 2,0 mg/mL était atteinte. Des analyses en CD ont

montré la forte présence de feuillets β dans des solutions diluées avec une concentration

initiale ≥ 2,0 mg/mL. Par contre, les solutions de concentration initiale ≤ 2,0 mg/mL, puis

diluées à une concentration de 0,4 mg/mL, ont présenté une plus forte teneur en peptides

sous forme aléatoire. Dans le cas de l’HTC utilisé pour les présents travaux, il est donc

probable que la trop faible concentration initiale en peptide β-lg f1-8 et la dilution par

l’ajout de NaOH 1 N n’ait pas permis l’apparition d’une floculation stable, ce qui pourrait

expliquer la faible A500 aux différents pH de l’analyse.

Des travaux ont démontré que la thioflavin-T, un colorant utilisé dans la détection

de fibrilles amyloïdes, était capable de se fixer dans la structure en feuillets β de ces

fibrilles, entrainant une déstabilisation du processus d’agrégation (Krebs et al., 2005;

Schneider, 2008). L’efficacité de la thioflavin-T et d’un autre colorant (quercetin) pour

bloquer le processus de floculation de l’α-la entre pH 4,0 et 6,0 a également été étudié, mais

57

aucun impact significatif n’a pu être observé (Schneider, 2008). L’hydroxyl-propyl-β-

cyclodextrine (HPβCD), une molécule composée d’un anneau de sept molécules de propyl-

glucose formant une cavité centrale hydrophobe et une surface hydrophile, a également été

utilisée dans ces travaux. Il a été démontré que le centre hydrophobe de cette molécule

pourrait interagir avec les acides aminés hydrophobes exposés au pI de l’α-la, bloquant

ainsi les interactions protéines-protéines menant à sa précipitation (Schneider, 2008). Dans

cette optique, il est donc possible que le peptide β-lg f1-8 retrouvé dans l’hydrolysat

trypsique interagisse avec l’α-la et bloque l’accès aux zones hydrophobes exposées de la

forme décalcifiée. La diminution de la capacité d’interaction des unités protéiques entre-

elles, causée par des interactions avec les peptides, pourrait donc expliquer l’amélioration

de la solubilité de l’α-la à son pI.

Des études sur la formation de molécules H/BAMLET durant une digestion gastro-

intestinale simulée donnent des pistes d’explications intéressantes en regard de ces

observations. Les travaux de Sullivan et al. (2013) ont étudié le processus de formation de

ces molécules lors d’un traitement initial à pH acide (pH 2,5), suivi d’une remontée du pH

à 7,0 et d’une étape d’UF. Les résultats ont démontré que le passage à la forme apo-α-la ou

molten globule est essentiel pour la formation des complexes, mais que la descente à pH 2,5

et la présence d’interactions hydrophobes entre l’α-la et l’OA ne sont pas suffisantes. Par

contre, des analyses FTIR effectuées après la remontée à pH 7,0 et l’UF ont démontré que

la majorité de l’OA dans le rétentat était complexée et que les molécules BAMLET formées

ne traversaient pas la membrane. Dans le cas de nos travaux, il est donc possible que la

descente préalable à pH 2,0 favorise les interactions de nature hydrophobe entre le peptide

β-lg f1-8 et l’α-la et que la remontée du pH stabilise le complexe, lequel devient insoluble à

l’approche du pI de la protéine et le demeure par la suite. Pour déterminer qu’il s’agit bien

du comportement des deux molécules dans ces conditions, il serait intéressant de faire des

études en microscopie confocale à balayage laser (MCBL). Cette technique étant souvent

utilisée pour observer les structures dans les réseaux protéiques (Ako et al, 2009; Guéwol-

Guèdè, 2010), ce type de travaux permettrait de vérifier s’il y a vraiment présence

d’interactions entre les deux molécules ou si l’α-la est simplement entrappée dans la

structure formée par le peptide β-lg f1-8 (nanofibres, hydrogels).

58

Les effets différents observés sur la solubilité de l’α-la en présence d’HTC et du

peptide β-lg f1-8 sont un autre phénomène intéressant. En effet, les deux produits

provoquent des changements très différents au profil de turbidité de la protéine, surtout à

partir de son pI. Creusot & Gruppen (2008) ont étudié le peptide β-lg f1-45 qui possède des

propriétés d’auto-assemblage et de floculation se rapprochant de celles du peptide β-lg f1-8.

Ces auteurs ont utilisé le peptide β-lg f1-45 en vue de précipiter des protéines natives (β-lg,

α-la, BSA et caséines) pour ensuite les fractionner. Leurs résultats ont démontré que

l’utilisation de ce peptide seul provoque très peu d’agrégation des protéines, signe que sa

seule capacité de floculation n’est pas suffisante pour entrainer les protéines intactes. Les

auteurs ont conclu que ce peptide insoluble favorise les interactions peptides-peptides au

détriment des interactions protéines-peptides. Par contre, l’utilisation de fractions contenant

le peptide β-lg f1-45 et certains peptides solubles a mené au processus de précipitation

protéique recherché. Il semblerait donc qu’une certaine fraction de peptides solubles et

insolubles soit nécessaire pour favoriser les interactions protéines-peptides et faire

précipiter les protéines intactes. Bien que les mécanismes expliquant ce phénomène ne

soient pas encore élucidés, il est possible que le même effet puisse se retrouver dans le cas

du peptide β-lg f1-8, ce qui pourrait expliquer les résultats différents entre les mélanges α-

la:HTC et α-la:peptide β-lg f1-8. Il serait donc intéressant de fractionner différemment

l’hydrolysat et de refaire des essais afin de préciser l’effet du peptide β-lg f1-8 et de la

portion peptidique soluble de l’hydrolysat dans les changements observés sur la solubilité

de l’α-la.

59

5.3.2 Effet de la présence du peptide β-‐lg f1-‐8 sur le profil de dénaturation thermique de l’α-‐la

Tout comme dans les travaux de Barbeau et al. (1996) sur la β-lg, des analyses en DSC ont

été effectuées pour déterminer l’effet de la présence du peptide β-lg f1-8 sur la dénaturation

de l’α-la. Les thermogrammes obtenus pour l’α-la seule et pour le mélange α-la:peptide β-

lg f1-8 à pH 4,5 et 7,0 sont présentés à la figure 5.4.

Figure 5.2 : Thermogrammes obtenus par DSC de l’α-‐la seule et en présence du peptide β-‐lg f1-‐8. Les courbes illustrées sont la moyenne de trois analyses.

60

L’analyse de ces courbes permet de déterminer les principaux paramètres

thermodynamiques liés à la dénaturation thermique de l’α-la. La température de

dénaturation (TD), qui est la température maximale du pic endothermique, représente la

stabilité thermique de la protéine (Barbeau et al., 1996; McGuffey, 2004). Pour une analyse

thermodynamique plus complète, les valeurs d’enthalpie de dénaturation (ΔHD) ont

également été déterminées. L’enthalpie de dénaturation est généralement reliée à la quantité

d’énergie libérée lors du déplissement de la protéine. Cette libération d’énergie est due au

bris des liens qui maintiennent en place l’organisation de la structure secondaire de la

protéine, mais également de sa structure tertiaire et des interactions protéines-protéines

présentes. Cette information est obtenue par le calcul de l’aire sous le pic de dénaturation

thermique du thermogramme (Barbeau et al., 1996, Höhne et al, 2003b). Les valeurs TD et

ΔHD calculées à partir des thermogrammes obtenus lors des analyses de l’α-la seule et du

mélange α-la:peptide β-lg f1-8 sont présentées à la figure 5.3.

Étant donné que le peptide β-lg f1-8 n’est soluble qu’à des valeurs de pH inférieures

à 2,0, des essais à ce pH ont également été effectués. Par contre, la très grande

concentration d’α-la et de peptide β-lg f1-8 nécessaire dans l’échantillon pour obtenir un

signal de l’appareil a provoqué la formation de gels dans les solutions, rendant toute

analyse impossible. De plus, les travaux effectués sur le sujet ont démontré qu’à des valeurs

de pH aussi basses, aucun pic endothermique ne peut être détecté (Bernal & Jelen, 1984;

McGuffey, 2004). Les analyses à ce pH ont donc été abandonnées.

61

Les valeurs de TD obtenues pour l’α-la seule sont comparables à celles obtenues

dans la littérature, bien qu’elles soient légèrement différentes (61,5 oC à pH 4,5 et 63,1-64,0 oC à pH 7,0). Toutefois, les valeurs publiées varient grandement entre elles tel que présenté

précédemment dans le tableau 2.3. En effet, certains auteurs arrivent à la conclusion que les

valeurs TD et ΔHD augmentent en fonction du pH, alors que d’autres obtiennent des valeurs

plus élevées à pH 4,5. Comme mentionné à la section 2.2.2.1, tous les paramètres utilisés

en DSC peuvent avoir un impact sur la température de dénaturation de la protéine. Selon

McGuffey (2004), les variations de TD retrouvées dans la littérature s’expliquent surtout par

l’utilisation de tampons différents et de très hautes concentrations en protéines pour

compenser le manque de sensibilité des appareils. C’est d’ailleurs le cas pour nos travaux

où une concentration très élevée en α-la a été utilisée afin d’obtenir un signal suffisamment

élevé de l’appareil DSC. Ce paramètre a influencé particulièrement les valeurs ΔHD qui

sont largement inférieures à celles mesurées par McGuffey (2004) à pH 7,0 (51,34 kJ/mol

vs 261-309 kJ/mol).

Figure 5.3 : Effet du pH sur l’α-‐la seule et en présence du peptide β-‐lg f1-‐8 sur la température (a) et l’enthalpie (b) de dénaturation. Les valeurs sont des moyennes ± SEM (n = 3). Dans un même graphique, les résultats marqués d’une lettre différente sont significativement différents (p ≤ 0,5).

a b

62

Selon Biliaderis (1983), une trop grande concentration en protéine favorise les

interactions protéines-protéines durant le chauffage, provoquant ainsi une certaine

agrégation. L’agrégation protéique est un phénomène exothermique, à l’inverse de la

dénaturation qui est un processus endothermique. La détermination de ΔHD devient donc

plus complexe, car le pic observé sur le thermogramme est la somme d’un processus

endothermique (positif) et exothermique (négatif). Les analyses statistiques démontrent tout

de même un impact significatif du pH sur les paramètres thermodynamiques, ce qui permet

d’obtenir certaines informations. La plus faible valeur ΔHD obtenue à pH 4,5 (39,25

kJ/mol) démontre par exemple que la structure secondaire de la protéine devient moins

structurée par le passage vers sa forme décalcifiée (Griko et al., 1994; McGuffey, 2004).

Ainsi, il y a moins de liens à briser au sein de la molécule ce qui demande moins d’énergie

et se traduit par un pic endothermique moins important (Ragone, 2001).

Les analyses statistiques démontrent également qu’il n’y a aucune différence

significative entre les valeurs pour l’α-la seule et le mélange α-la:peptide β-lg f1-8 pour les

deux paramètres étudiés. Il semble donc que la mise en contact de l’α-la avec le peptide β-

lg f1-8 ne provoque pas de modification du profil de dénaturation thermique de la protéine.

Par contre, cela ne signifie pas qu’il n’y a pas d’interactions entre les deux molécules. Des

études en DSC et en CD ont démontré que les molécules HAMLET, obtenues par la mise

en contact de l’α-la et de l’OA, ont une stabilité thermique égale ou légèrement inférieure à

la protéine native selon les conditions expérimentales (teneur en Ca2+, force ionique du

tampon, présence d’EDTA, etc.) (Fast et al., 2005). En effet, cette association donnerait un

complexe ne possédant pas une stabilité thermique optimale, mais qui serait assez stable au

niveau cinétique pour se former et demeurer ordonné (kinetically trapped complex). Étant

donné le caractère hydrophobe du peptide β-lg f1-8 et la nature hydrophobe des interactions

menant à la formation des complexes HAMLET, une association entre le peptide et l’α-la

suivant le même processus serait envisageable. Ainsi, cette mise en contact pourrait

expliquer les résultats obtenus par DSC dans la présente étude, soit une absence de

changements significatifs dans le profil de dénaturation thermique de la protéine.

63

L’absence de modification du profil de dénaturation thermique de l’α-la par l’ajout

du peptide β-lg f1-8 à pH 7,0 peut également être expliquée par le fait que normalement, la

protéine s’y trouve sous sa forme holo-α-la calcifiée. Barbana et al. (2008) ont démontré

que l’holo-α-la n’est pas capable de lier des molécules d’acides gras et donc de former le

complexe HAMLET avec l’OA. Si le principe d’interaction du peptide β-lg f1-8 avec l’α-la

se rapproche de celui de l’OA, il est donc peu probable qu’il puisse interagir avec la

protéine à pH 7,0 et provoquer une modification de son profil de dénaturation. Un

chauffage des échantillons ou l’utilisation d’apo-α-la à pH 7,0 pourrait éventuellement

permettre de vérifier cette hypothèse.

5.4 Conclusion

Les résultats présentés dans cette section ont permis de démontrer que la présence du

peptide β-lg f1-8 provoque des changements au niveau de la solubilité de l’α-la à différents

pH. La mise en contact de l’α-la avec l’HTC a provoqué une augmentation de la solubilité

de la protéine à son pI, tandis que le mélange α-la:peptide β-lg f1-8 a causé une forte

diminution de sa solubilité à des valeur de pH supérieures au pI. Ces différences entre les

profils de turbidité suggèrent que l’action du peptide varie selon qu’il est compris dans une

fraction contenant des peptides solubles ou non. Étant donné que les effets des substrats sur

la solubilité de l’α-la sont principalement observés autour de son pI et qu’il s’agit d’une

région où la protéine devient plus hydrophobe (forme apo), il est probable que ces

interactions soient de nature hydrophobe. Par contre, en DSC, la présence du peptide β-lg

f1-8 n’influence pas le profil de dénaturation thermique de l’α-la puisqu’aucun changement

significatif n’a été mesuré pour les valeurs TD et ΔHD à pH 4,5 et pH 7,0. Il serait donc

intéressant de fractionner davantage l’HTC afin de déterminer, avec plus de précision, quels

sont les impacts possibles de son contenu peptidique sur l’α-la et quelle est la part du

peptide β-lg f1-8 sur ces impacts.

65

6. Discussion générale

L’hydrolyse enzymatique des protéines du lactosérum est une pratique de plus en plus

courante puisqu’elle permet d’obtenir une large variété de peptides, dont certains possèdent

une activité fonctionnelle et/ou biologique. En outre, l’hydrolyse trypsique de la β-lg libère

le peptide β-lg f1-8, un fragment qui possède un fort caractère hydrophobe et dont la

capacité d’auto-assemblage permet la formation de nanofibres et d’hydrogels. Des travaux

antérieurs ont démontré que des fractions peptidiques contenant ce peptide pouvaient

modifier le profil de dénaturation thermique de la β-lg (Barbeau et al., 1996), mais aussi de

provoquer la floculation de l’α-la (Groleau et al., 2003). Dans le cadre d’essais

préliminaires, il a aussi été observé que la mise en contact du peptide β-lg f1-8 avec des

protéines du lactosérum réduisait le contenu en protéines solubles des solutions,

principalement leur teneur en α-la. À partir de ces observations, suggérant l’occurrence

d’interactions entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la, nos travaux visaient à étudier l’impact de

ces interactions sur certaines propriétés physicochimiques des deux molécules. Dans un

premier temps, l’effet de la température et de la présence d’α-la sur le processus de

floculation du peptide β-lg f1-8 a été étudié en cours de concentration par osmose inverse

afin d’évaluer leurs effets sur le phénomène d’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8

(objectif 1). Les principaux résultats obtenus ont montré que :

- La température n’a pas d’effet direct sur le processus d’auto-assemblage du peptide β-lg

f1-8 au cours de sa concentration par OI. Par contre, une augmentation de la température

accélère sa floculation en augmentant le débit de filtration, ce qui permet de concentrer

le rétentat plus rapidement et par conséquent, d’atteindre la concentration critique du

peptide β-lg f1-8 plus rapidement.

- L’ajout d’α-la n’a pas d’impact significatif sur les débits de filtration, autant à 25 oC

qu’à 55 oC, bien qu’une légère diminution ait été observée en présence de la protéine à

ces deux températures. Cet effet pourrait s’expliquer par la capacité de l’α-la à

augmenter la viscosité des solutions contenant le peptide β-lg f1-8.

66

- À 55 oC, l’ajout de l’α-la aux solutions de peptides retarde de façon significative

l’apparition de la floculation du peptide β-lg f1-8. Étant donné que la diminution du

débit causée par l’ajout de la protéine n’est pas significative, ce retard pourrait

s’expliquer par l’établissement d’interactions entre l’α-la et le peptide β-lg f1-8,

diminuant ainsi la teneur en peptide libre dans le rétentat. Il serait alors nécessaire

d’atteindre un plus haut niveau de concentration du peptide pour observer sa floculation

dans le rétentat. Ce phénomène ayant été observé uniquement à 55 oC, les interactions

pourraient être de nature hydrophobe puisque ces dernières sont favorisées à haute

température.

Le deuxième objectif de nos travaux visait à caractériser l’effet de la présence d’α-la

sur les propriétés d’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 en fonction de la température en

étudiant l’impact de l’interaction des deux molécules sur la solubilité de l’α-la à différents

pH et sur son profil de dénaturation thermique. Les principaux résultats obtenus lors de

cette étude ont démontré que :

- La solubilité (A500) de l’α-la en fonction du pH est typique de la protéine, avec une forte

diminution dans la région de son pI (pH 4,0-5,0), indiquant sa précipitation due à

l’augmentation des interactions protéines-protéines suite à la diminution de sa capacité à

lier le calcium.

- La mise en contact de l’hydrolysat trypsique complet (HTC) améliore fortement (≈ 75

%) la solubilité de la protéine dans la région de son pI. Cette amélioration pourrait être

attribuée à des interactions entre les peptides de l’HTC, contenant le fragment β-lg f1-8,

avec la région hydrophobe de l’α-la qui est davantage exposée à son pI. Ces interactions

pourraient ainsi interférer avec les interactions protéines-protéines entre les unités d’α-

la, ce qui entraînerait une amélioration de sa solubilité.

- La mise en contact du peptide β-lg f1-8 avec l’α-la provoque une diminution de la

solubilité de la protéine aux valeurs de pH supérieures à son pI. Il est difficile de fournir

67

une explication claire à ce phénomène, mais il est probable que la variation du pH des

solutions (diminution à pH 2,0, puis remontée à pH 7,0) mène à la formation de

complexes insolubles suivant le principe de formation des complexes H/BAMLET.

- La mise en contact du peptide β-lg f1-8 seul ou au sein de l’HTC ne provoque pas le

même effet sur l’α-la. Il est donc possible que des interactions différentes s’établissent

avec la protéine selon la nature des peptides présents dans les mélanges.

- Les résultats obtenus par DSC pour la protéine seule sont différents de ceux rapportés

dans la littérature, surtout au niveau de l’enthalpie de dénaturation (ΔHD). Ces

différences sont principalement causées par la concentration trop élevée en α-la dans les

échantillons, ce qui a tendance à faire diminuer les signaux thermiques de dénaturation.

- Les analyses DSC ont démontré que la présence du peptide β-lg f1-8 n’influençait pas

les paramètres thermodynamiques (TD, ΔHD) de l’α-la à pH 4,5 et 7,0. Néanmoins, ces

résultats ne signifient pas qu’il y a absence d’interactions entre les deux molécules. En

effet, il existe des formes d’interactions protéines-ligands qui arrivent à former des

complexes stables (ex : molécules HAMLET), mais dont la résistance à la dénaturation

thermique est relativement équivalente à celle de la protéine native. Des interactions

entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la pourraient donc être établies, mais n’auraient pas

d’influence sur la stabilité thermique de la protéine.

Enfin, des résultats contradictoires ont été obtenus en turbidimétrie et DSC pour les

mélanges α-la:β-lg f1-8 à pH 7,0. En effet, la présence du peptide a modifié le profil de

solubilité de l’α-la à ce pH, alors qu’aucun effet n’a été détecté sur les valeurs de TD et ΔHD

de la protéine à ce même pH. Ce résultat pourrait s’expliquer par le très faible volume des

échantillons analysés en DSC, lequel n’a pas permis un ajustement préalable des solutions à

pH 2,0. Or, il est connu que les interactions entre l’α-la et des ligands se produisent

généralement lorsque l’α-la est sous sa forme apo ou molten globule qui apparaît surtout à

pH acide. En DSC, il est donc probable que les interactions protéines-peptides n’aient pas

été favorisées puisque les molécules ont été solubilisées directement à pH 7,0. Une autre

68

différence majeure entre les analyses de turbidité et celles en DSC est la température,

laquelle demeure constante pendant les analyses de turbidité alors qu’un gradient (5 oC/min) est appliqué en DSC. Comme les interactions hydrophobes sont favorisées à

température plus élevée et qu’elles sont probablement responsables des interactions entre

l’α-la et le peptide β-lg f1-8, elles n’ont donc pas été influencées de la même manière avec

les deux méthodes. Il serait donc intéressant de reprendre ces analyses sur une plus large

gamme de températures et de pH dans les deux cas, pour tenter cette fois-ci d’obtenir des

conditions optimales pour permettre les interactions entre l’α-la et le peptide β-lg f1-8.

L’hypothèse à la base de ces travaux de recherche était qu’en raison du caractère

hydrophobe et de la forte capacité du peptide β-lg f1-8 à floculer, sa mise en contact avec

l’α-la induirait un changement au niveau des propriétés physicochimiques des deux

molécules. Les résultats obtenus dans le cadre de ce travail permettent de confirmer cette

hypothèse. En effet, il a été démontré que la présence d’α-la dans le rétentat OI de

l’hydrolysat trypsique complet (HTC) avait pour effet de ralentir le processus de floculation

du peptide β-lg f1-8. Également, la mise en contact des deux molécules a entraîné une

modification de la solubilité de la protéine entre pH 2,0 et 9,0. Par contre, en présence de

peptide β-lg f1-8, aucun changement n’a été observé dans le profil de dénaturation

thermique de l’α-la à pH 4,5 et 7,0. Étant donné que les effets observés se sont

principalement manifestés à haute température et autour du pI de l’α-la, il est probable que

les interactions entre les deux molécules soient de nature hydrophobe.

69

7. Conclusion et perspectives

L’objectif à moyen terme de nos travaux était de vérifier si les propriétés d’agrégation du

peptide β-lg f1-8 pourraient mener à de nouvelles voies de fractionnement des protéines et

peptides du lactosérum, notamment dans le cas de l’α-la. Cet objectif reposait sur les

résultats d’essais préliminaires qui avaient démontré une certaine affinité entre cette

protéine et le peptide β-lg f1-8. Dans le présent travail, il a été démontré que le peptide β-lg

f1-8 peut influencer certaines propriétés physicochimiques de solutions d’α-la. Ce peptide

pourrait donc, éventuellement, être utilisé dans un procédé de fractionnement de l’α-la. Par

contre, des connaissances supplémentaires seraient nécessaires afin de mettre au point ce

type de procédé, soient :

- Déterminer la nature exacte des interactions entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la qui

mènent à la formation des complexes. Ces informations permettraient alors

d’identifier les paramètres à optimiser pour favoriser ces interactions et stabiliser les

complexes.

- Améliorer notre compréhension de l’effet du peptide β-lg f1-8 seul et des autres

peptides contenus dans l’HTC sur les paramètres physicochimiques de l’α-la. Cette

étape pourrait être réalisée en préparant des fractions peptidiques de nature

différente (ex : chargée, neutre, hydrophobe, etc.) à partir de l’HTC.

Pour réussir à réaliser ces objectifs, des analyses en spectroscopie infrarouge (FTIR)

et en fluorimétrie seraient nécessaires. Ces analyses permettraient de mieux comprendre les

interactions entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la en déterminant les impacts de leur mise en

contact sur la structure de l’α-la. Aussi, des analyses en microscopie confocale à balayage

laser permettraient de vérifier visuellement l’occurrence d’interactions entre les deux

molécules et d’observer le réseau protéines-peptides formé par ces interactions.

70

Le peptide β-lg f1-8 n’est certainement pas encore exploitable au niveau

commercial. Par contre, sa méthode de production est bien définie et sa purification à partir

de l’hydrolysat est très simple, ne nécessitant qu’une série de lavages avec de l’eau et des

étapes de centrifugation. De plus, cette méthode de purification, qui serait facilement

applicable en industrie, produit une fraction d’une très grande pureté (≥ 90 %) et permet de

retirer la presque totalité du peptide contenu dans l’HTC. En effet, alors que le peptide

correspond à environ 5,2 % de la masse totale de la β-lg, il est possible de le produire et de

le purifier en obtenant des rendements entre 2 et 5 %. En recherche, comme la production

d’hydrolysats afin d’obtenir des fractions peptidiques à activité biologique est de plus en

plus utilisée, les données sur le peptide β-lg f1-8 pourraient mener à de nouvelles méthodes

de fractionnement et de purification de peptides bioactifs. Étant donné le caractère

hydrophobe du peptide, il serait également intéressant de vérifier si des interactions sont

possibles avec des acides gras. Des essais préliminaires (non publiés) ont permis de réduire

la teneur en matière grasse d’un lactosérum issu de la production de cheddar de 0,48 %

(m/v) à 0,03 % (m/v). Ces essais ont été réalisés en ajoutant le peptide β-lg f1-8 au

lactosérum suivi de son acidification à pH 2,0, puis le mélange a subi un traitement

thermique modéré avant de remonter le pH et le centrifuger. Ces possibles interactions

entre le peptide β-lg f1-8 et des acides gras pourraient donc mener à la mise au point d’une

méthode de délipidation du lactosérum qui pourrait être utilisée lors de la production de

CPL et d’IPL.

Une fois bien compris, l’effet sur la solubilité observée lors du mélange de l’α-la

avec l’HTC pourrait avoir des applications au niveau industriel, particulièrement dans la

production de breuvages enrichis en α-la. En effet, l’augmentation de la solubilité de l’α-la

par les peptides de l’HTC pourrait permettre d’empêcher la floculation de la protéine dans

les cas où le pH des produits doit être ajusté à des valeurs près du pI de l’α-la. C’est en effet

le cas pour certaines boissons sportives où le pH, initialement très acide, doit être remonté

pour éviter une saveur astringente, ce qui peut entraîner la précipitation de l’α-la. Par

contre, même si les résultats de ces travaux de recherche suggèrent que des mélanges

peptidiques pourraient être utilisés comme agents stabilisants des protéines alimentaires,

cette approche demeure encore peu développée et mériterait d’être approfondie davantage.

71

8. Bibliographie

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