Interação entre um péptido β-amilóide, responsável pela ... · Às minhas irmãs de...

Interação entre um péptido β-amilóide, responsável pela

doença de Alzheimer, e modelos biomembranares

Andreia Filipa Costa Cuco

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Bioengenharia e Nanossistemas

Orientadoras: Doutora Benilde de Jesus Vieira Saramago e Doutora Ana Paula Valagão Amadeu do Serro

Júri

Presidente: Professor Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca

Orientadora: Professora Doutora Benilde de Jesus Vieira Saramago

Vogal: Professora Doutora Amélia Maria Pina Soares Gonçalves da Silva

Novembro de 2014

III

A mente que se abre a uma nova ideia, jamais volta ao seu tamanho inicial.

ALBERT EINSTEIN

V

Agradecimentos

A elaboração desta dissertação só foi possível contando com a contribuição, apoio e cooperação de

diversas pessoas, às quais não poderia deixar de exprimir o meu mais sincero apreço e agradecimento.

Em primeiro lugar, quero agradecer à minha orientadora, Professora Doutora Benilde Vieira

Saramago, pelo incansável apoio e incentivo, pela disponibilidade e acompanhamento que sempre

demonstrou durante todo processo, por me acolher no seu grupo de trabalho.

À minha co-orientadora, Professora Doutora Ana Paula Serro, pelos conhecimentos transmitidos,

pela disponibilidade de auxílio e pela motivação transmitida ao longo de todo o trabalho.

À Professora Doutora Amélia Gonçalves da Silva, pela cedência do laboratório e equipamento, pela

enorme disponibilidade para apoiar e auxiliar nos longos dias de trabalho, pela ajuda na interpretação

dos resultados e pelo otimismo demonstrado.

À Professora Doutora Anabela Fernandes, por todo o apoio e disponibilidade, pela ajuda na

interpretação de resultados e pela cedência do laboratório e equipamento.

Ao Professor Doutor José Paulo Farinha pela cedência do laboratório e equipamento, pela

disponibilidade e ajuda na interpretação dos resultados.

Ao Professor Eduardo Melo pela disponibilidade, opiniões e troca de ideias.

Um enorme obrigado também ao José Restolho, Patrizia Paradiso, Sara Matias e Tânia Ribeiro pela

disponibilidade em auxiliar-me no trabalho dos diversos equipamentos e pelo apoio.

Mas, sem dúvida, que há muito a agradecer a outras pessoas que contribuíram para a elaboração

desta dissertação por outros motivos.

Um obrigado gigante aos meus colegas de laboratório: Ana Rita Valente, Andreia Pimenta, José

Restolho, Marina Esteves, Patrizia Paradiso e Vanessa Moreira, pelos incontáveis momentos de

gargalhadas, de descontração, pelo apoio quando começa tudo a parecer difícil.

Um obrigado particular a pessoas que foram mais do que colegas de mestrado, foram amigos: Ana

Rita Valente, Gonçalo Adriano e Mariana Pina, mesmo que os nossos caminhos não se voltem a cruzar,

levo-vos comigo, foram essenciais nestes dois anos no IST. Obrigado, por tudo!

Aos meus incansáveis amigos, um enorme obrigado. Em especial: Miguel Vidigal, pelo amigo que

é, pela preocupação, pela amizade incondicional, por mesmo longe estar sempre perto; ao “Jardel Luís”

(Luís Carlos), por mesmo do outro lado do mundo me transmitir um apoio incondicional; ao Henrique

Pernes, pela ajuda, pelo apoio, pelo incentivo e pela enorme paciência; ao Flávio Sá, por me tornar os

momentos mais aflitivos em momentos mais descontraídos.

VI

Às minhas irmãs de coração: Cláudia Azevedo Ferreira, Joana Pereira e Joana Rodrigues, pela

amizade incondicional, por nunca me deixarem ir a baixo, por acreditarem sempre em mim, pelas

gargalhadas, por cada momento nosso. “Os amigos nunca são para as ocasiões. São para sempre.”

Um obrigado especial à Joana Pereira, por seres a melhor amiga que podia ter, por seres a ‘irmã

de pais diferentes”, por saberes o que penso sem ser preciso falar, por mesmo longe nunca me deixares

sozinha: “Porque eu nunca tinha pedido uma irmã, mas a vida encarregou-se de te trazer”. És a certeza

do ‘para sempre’ e a família que eu escolhi.

À minha extraordinária família por todo o amor que sempre me transmitiram, por saberem que

sempre estarão lá para mim Por sempre acreditarem em mim.

À minha mãe, por ser um apoio inabalável no momento de aflição, por acreditar em mim, por nunca

me deixar desistir, por ser um porto de abrigo, por fazer tão bem o papel de mãe, por nunca me ter

deixado ir abaixo. Obrigado minha mãe!

Ao meu pai, para quem as palavras me parecem sempre escassas. Obrigado por todos estes anos

ter acreditado em mim e no meu sucesso, por me mostrar sempre que eu era capaz de ir mais além,

por me ter ensinado que com esforço e dedicação tudo se consegue. Obrigado por ser o melhor pai do

mundo, mas também por ser a melhor pessoa que conheço. “Não escolhi ser tua filha, apenas tive

sorte”. Obrigado pai, és o maior amor da minha vida! “Olha lá para cima, ela está a ver-nos.”.

E em conjunto, ao meu pai e à minha mãe por sempre me terem proporcionado o privilégio de viver

numa família e lar feliz. O que sinto por vocês é incondicional. Conseguimos, esta vitória é nossa!

E um agradecimento especial, a quem por infelicidade da vida não pode ouvir nem ler estas

palavras, mas a quem me deu amor incondicional em vida e, agora, me ilumina o caminho. À minha

estrela guia que me acompanha sempre, de quem as saudades são infinitas. À minha querida avó

Ricardina, a quem dedico esta dissertação.

VIII

Resumo

A doença de Alzheimer caracteriza-se pela formação de placas no cérebro compostas por

agregados de péptido β-amilóide (Aβ). A neurotoxicidade de Aβ parece relacionar-se com a sua

interação com a membrana celular, que pode ser influenciada pela conformação do péptido ou pela

composição lipídica da membrana. As jangadas lipídicas são microdomínios ricos em esfingomielina

(SM) e colesterol (Chol) que têm sido associados a interações específicas com Aβ.

Usou-se uma mistura equimolar de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), SM e Chol

como um modelo de membrana com jangada lipídica para estudar a interação com o fragmento

peptídico Aβ25-35. Investigou-se o efeito do colesterol estudando a interação de Aβ25-35 com a mistura

POPC/SM (1:1) e o efeito do pH. As técnicas experimentais utilizadas foram: Análise de Localização

de Nanopartículas (NTA) e Dicroísmo Circular, para caracterização de Aβ25-35, e Microbalança de Cristal

de Quartzo com Dissipação (QCM-D), Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) e Balança de

Langmuir, para caracterizar a interação lípido-péptido.

O Aβ25-35 a baixas concentrações adsorve à região polar da monocamada, afetando pouco a

organização dos lípidos. O aumento da concentração de Aβ25-35 conduz à formação de domínios ricos

em péptido, em ambas as misturas lipídicas, sendo mais forte na presença de colesterol e a pH=4

(agregados peptídicos de menor dimensão). Nos lipossomas suportados, a interação com Aβ25-35 é

favorecida em POPC/SM(1:1) e o aumento da concentração peptídica não afeta os lipossomas. Nos

lipossomas em suspensão, a baixas concentrações o péptido estabiliza os lipossomas enquanto o

aumento da concentração de Aβ25-35 conduz à sua destruição.

PALAVRAS-CHAVE: Jangada lipídica, Péptido β-amilóide, Lipossoma, Monocamada de

Langmuir, QCM-D, DSC

X

Abstract

Alzheimer’s disease is characterized by plaque formation, in brain, composed by amyloid-β peptide

(Aβ) aggregates. The Aβ neurotoxicity seems to be related to its interaction with the cell membrane

which can be influenced by the peptide conformation or the lipid membrane composition. Lipid rafts are

microdomains rich in sphingomyelin (SM) and cholesterol (Chol), which have been associated with

specific interactions with Aβ peptide.

Used an equimolar mixture of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline (POPC), SM and

Chol as a membrane model for studying lipid raft interaction with Aβ25-35 peptide fragment, at different

concentrations. Investigated the effect of cholesterol studying the interaction between Aβ25-35 and

POPC/SM (1:1) mixture, and the pH effect by pH changes between 4 and 7. The experimental

techniques used were: Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) and Circular Dichroism, to Aβ25-35

characterization, and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D), Differential Scanning

Calorimetry (DSC) and Langmuir Monolayers, to characterize the lipid-peptide interaction.

At low Aβ25-35 peptide concentrations, the peptide is adsorbed in the polar region of the monolayers,

slightly affecting the organization of lipids. The increase of Aβ25-35 concentration leads to the formation

of peptide rich domains in both lipid mixtures, being stronger in the presence of Chol and at pH=4

(peptide aggregates smaller). In supported liposomes, the interaction with Aβ25-35 is favored POPC/SM

(1: 1) and increasing concentrations of peptide did not affect the liposomes. In suspended liposomes,

at low concentrations the peptide stabilizes the liposomes while increasing the Aβ25-35 concentration

leads to their destruction.

KEYWORDS: Lipid rafts, Amyloid β-Peptide, Liposome, Langmuir Monolayers, QCM-D, DSC

XII

Índice

Lista de Quadros ................................................................................................................. XV

Lista de Figuras ................................................................................................................. XVII

Lista de Abreviaturas .......................................................................................................... XXI

Lista de Símbolos ............................................................................................................ XXIV

Capítulo I – Introdução .......................................................................................................... 1

1.1. Motivação ................................................................................................................ 1

1.2. Estado da Arte ........................................................................................................ 1

1.2.1. A doença de Alzheimer .................................................................................... 1

1.2.2. As membranas lipídicas e os péptidos β-amilóides .......................................... 2

1.3. Conteúdo ................................................................................................................ 4

Capítulo II – Fundamentos Teóricos ...................................................................................... 5

2.1. Membranas Celulares ............................................................................................. 5

2.2. Jangadas lipídicas ................................................................................................... 7

2.3. Modelos Biomembranares....................................................................................... 9

2.3.1. Modelos para jangadas lipídicas .....................................................................11

2.4. Péptido β-amilóide: fragmento (1-42) e fragmento (25-35) .....................................12

2.4.1. Agregação Peptídica .......................................................................................14

2.5. Interação entre modelos biomembranares e péptido Aβ ........................................14

2.6. Técnicas Experimentais .........................................................................................16

2.6.1. Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação (QCM-D) .......................16

2.6.2. Balança de Langmuir ......................................................................................18

2.6.3. Análise de Localização de Nanopartículas ......................................................20

2.6.4. Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) .................................................20

2.6.5. Dicroísmo Circular ...........................................................................................21

XIII

Capítulo III – Materiais e Métodos Experimentais .................................................................22

3.1. Materiais ................................................................................................................22

3.2. Preparação dos Lipossomas ..................................................................................23

3.3. Preparação de Soluções Peptídicas .......................................................................23

3.4. Preparação de Soluções Lipídicas .........................................................................25

3.5. QCM-D ...................................................................................................................25

3.6. Balança de Langmuir .............................................................................................26

3.7. NTA ........................................................................................................................28

3.8. DSC .......................................................................................................................28

3.9. Dicroísmo Circular ..................................................................................................29

Capítulo IV – Resultados e Discussão ..................................................................................30

4.1. Caracterização dos Modelos Lipídicos ...................................................................30

QCM-D ..........................................................................................................................30

Balança de Langmuir ....................................................................................................32

DSC ..............................................................................................................................37

4.2. Caracterização das soluções peptídicas ................................................................38


NTA ...............................................................................................................................40

DSC ..............................................................................................................................42

Dicroísmo Circular .........................................................................................................39

4.3. Efeito do Péptido β-amilóide nas misturas lipídicas ................................................42

QCM-D ..........................................................................................................................42


DSC ..............................................................................................................................55

Capítulo V – Conclusões e Trabalho Futuro .........................................................................57

Referências bibliográficas ....................................................................................................60

XV

Lista de Quadros

Quadro 1. Condições limite para estimar a viscosidade do filme, o módulo de distorção e a espessura no software QTools 3. ........................................................................................................................... 26 Quadro 2. Concentrações usadas para lípidos e misturas lipídicas nas isotérmicas 𝝅-A. ................... 27 Quadro 3. Valores de lift-off e do colapso das monocamadas dos lípidos puros (Colesterol, Esfingomielina e POPC), a pH=4 e pH=7 e 25ºC. ................................................................................ 36 Quadro 4. Valores médios e desvio padrão das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM (1:1) ao longo do processo de interação com 10 µM (cima) e 80 µM (baixo) de Aβ25-35 a 37ºC e pH=7, obtidos a partir da modelação por QTools 3. ........................................................................................ 48 Quadro 5. Valores médios e desvio padrão das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol (1:1:1) ao longo do processo de interação com 10 µM (cima) e 80 µM (baixo) de Aβ25-

35 a 37ºC e pH=7, obtidos a partir da modelação por QTools 3. ........................................................... 48

XVII

Lista de Figuras

Figura 1. Modelo de Mosaico Fluído para a membrana celular. Adaptado de [53]. ............................... 5

Figura 2. Estrutura química de um glicerofosfolípidos: fosfatidil colina (PC). Adaptado de [62]. ........... 6

Figura 3. Estrutura química da esfingomielina. Adaptado de [62]. ......................................................... 6

Figura 4. Estrutura química do colesterol. Adaptado de [62]. ................................................................. 7

Figura 5. Esquema representativo de jangadas lipídicas. As jangadas lipídicas podem ter diferentes

composições lipídicas e proteícas (jangada lipídica 1 e jangada lipídica 2). Adaptado de [81]. ............ 8

Figura 6. Representação esquemática da Bicamada Fosfolipídica Suportada, num substrato sólido.

Adaptado de [98]. .................................................................................................................................... 9

Figura 7. Representação esquemática de uma membrana lipídica negra. Adaptado de [98]. ............. 10

Figura 8. Representação esquemática de uma monocamada de Langmuir. Adaptado de [81]. .......... 10

Figura 9. Representação esquemática de SAMs, com um substrato de ouro. Adaptado de [98]. ....... 11

Figura 10. Representação esquemática de uma vesícula fosfolipídica (lipossoma). Adaptado de [107].

............................................................................................................................................................... 11

Figura 11. Diagrama de Fase do POPC, esfingomielina e colesterol a três importantes temperaturas

(23, 34 e 46ºC). Adaptado de [115]. ...................................................................................................... 12

Figura 12. Representação da sequência do péptido β-amilóide (1-42), (1-40) e (25-35), identificando os

terminais C e N. Adaptado de [129, 130]. ............................................................................................. 13

Figura 13. Exemplo de uma isotérmica 𝝅 –A de um fosfolípido, com os estados de organização

adotados pelas moléculas presentes na interface ar/líquido ao longo da compressão. Adaptado de

[178]. ...................................................................................................................................................... 19

Figura 14. Exemplo de um termograma típico de uma experiência DSC (DMPC Brain Lipid), onde se

mostra um pico correspondente a uma transição de fase. ................................................................... 21

Figura 15. Esquema das camadas dos cristais de quartzo a usar na QCM-D, com revestimento. 1) Ouro,

2) Crómico, 3) Quartzo. ......................................................................................................................... 25

Figura 16. Exemplo da variação da frequência (azul) e da dissipação (vermelho) da harmónica 3 para

uma experiência típica de adsorção de lipossomas no cristal de quartzo, a 37ºC e pH=7. Esquerda:

POPC/SM (1:1), 1.12 mM; Direita: POPC/SM/Chol (1:1:1), 1.12 mM. ................................................. 30

Figura 17. Valor médio e desvio padrão da variação da frequência (esquerda) e dissipação (direita) da

harmónica 3 para a mistura binária POPC/SM (1:1) e para a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1)

1.12 mM, a 37ºC e pH=7. ...................................................................................................................... 31

Figura 18. Espessura (esquerda) e viscosidade (direita) da bicamada lipídica de POPC/SM (1:1) e

POPC/SM/Chol (1:1:1), 1.12 mM, a 37ºC e pH=7. ............................................................................... 32

Figura 19. Isotérmicas -A a 25ºC, numa subfase aquosa, a pH=7. Lipidos Puros (curvas contínuas):

POPC (curva 1), esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3). Misturas Lipídicas (curvas

descontínuas): POPC/SM (1:1) (curva 4) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (curva 5). ..................................... 33

XVIII

Figura 20. Isotérmica -A experimental vs. Isotérmica -A teórica, a 25ºC e numa subfase aquosa a

pH=7. Lípidos Puros: POPC (curva 1) e esfingomielina (curva 2). Linha Descontínua: POPC/SM (1:1)

Teórica. .................................................................................................................................................. 34


pH=7. Lípidos Puros: POPC (curva 1), esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3). Linha

Descontínua: POPC/SM/Chol (1:1:1) Teórica. ...................................................................................... 35

Figura 22. Efeito do pH nas isotérmicas -A dos lípidos puros, numa subfase aquosa: POPC (curva 1),

esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3) (A.), e nas isotérmicas das misturas lipídicas POPC/SM

(1:1) (curva 4) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (curva 5) (B.), a pH=4 (linha descontínua) e pH=7 (linha

contínua) e 25ºC. ................................................................................................................................... 36

Figura 23. Termograma dos lipossomas em suspensão da mistura binária POPC/SM (1:1) (cinzento

escuro) e da mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) (cinzento claro) 1.12 mM, em HEPES (pH=7). 37

Figura 24. Isotérmica -A do fragmento peptídico Aβ25-35, a 25ºC, numa subfase aquosa a pH=7, para

as concentrações de 1, 2 e 4 µM de péptido β-amilóide (25-35). ......................................................... 38

Figura 25. Espectro de dicroísmo circular do fragmento peptídico Aβ25-35 80 µM, a pH=4 (esquerda) e

pH=7 (direita). ........................................................................................................................................ 39

Figura 26. Efeito do pH no número de agregados de fragmento peptídico Aβ25-35 em solução a 1, 4 e 25

µM, a 22ºC. pH=4: Cinzento escuro; pH=7: Cinzento claro. ................................................................. 40

Figura 27. Efeito do pH na agregação peptídica a 1 µM (roxo), 4 µM (vermelho) e 25 µM (verde) de

fragmento peptídico Aβ25-35, a 22ºC. pH=4: Linha descontínua; pH=7: Linha contínua. ...................... 41

Figura 28. Termograma do péptido β-amilóide (25-35) 50µM, a pH=7. ............................................... 42

Figura 29. Exemplo de um ensaio de QCM-D da interação entre a mistura binária POPC/SM (1:1) com

80 µM de Aβ25-35, a 37ºC e pH=7. Esquerda: variação da frequência. Direita: variação da dissipação.

(1) Injeção de POPC/SM (1:1) 1.12 mM, durante 7 minutos; (2) Injeção de tampão de HEPES, para

enxaguamento, durante 10 minutos; (3) Injeção de Aβ25-35, durante 7 minutos; (4) Injeção de tampão de

HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos. .............................................................................. 43

Figura 30. Exemplo de um ensaio de QCM-D da interação entre a mistura ternária POPC/SM/Chol

(1:1:1) com 80µM de Aβ25-35, a 37ºC e pH=7. Esquerda: variação da frequência. Direita: variação da

dissipação. (1) Injeção de POPC/SM/Chol (1:1:1) 1.12 mM, durante 7 minutos; (2) Injeção de tampão

de HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos; (3) Injeção de Aβ25-35, durante 7 minutos; (4)

Injeção de tampão de HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos. .......................................... 43

Figura 31. Valores médios e desvio padrão da variação da frequência (esquerda) e da dissipação

(direita), em diferentes harmónicas, relativos à interação entre a mistura binária POPC/SM (1:1) 1.12

mM e 10 µM (azul), 25 µM (verde), 50 µM (laranja) e 80 µM (amarelo) de péptido Aβ25-35, a 37ºC e

pH=7. ..................................................................................................................................................... 44

Figura 32. Valores médios e desvio padrão da variação da frequência (esquerda) e da dissipação

(direita), em diferentes harmónicas, relativos à interação entre a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1)

1.12 mM e 10 µM (azul), 25 µM (verde), 50 µM (laranja) e 80 µM (amarelo) de péptido Aβ25-35, a 37ºC

e pH=7. .................................................................................................................................................. 45

Figura 33. Valores da variação da frequência (esquerda) e dissipação (direita) para a harmónica 3, a

37ºC e pH=7, após injeção de 1.12 mM de POPC/SM (1:1) (em cima) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (em

baixo), enxaguamento com tampão de HEPES, injeção de 10, 25, 50 e 80 µM de Aβ25-35 e, novamente,

XIX

enxaguamento com tampão de HEPES. A intensidade do cinzento nas barras corresponde às injeções

indicadas nas caixas. ............................................................................................................................ 46

Figura 34. Iisotérmicas -A do efeito da concentração de Aβ25-35 em interação com POPC/SM (1:1), a

25ºC, numa subfase aquosa a pH=7. A seta vermelha significa o aumento da concentração do péptido

Aβ25-35 na subfase. ................................................................................................................................. 49

Figura 35. Exemplo de comportamento das isotérmicas -A do efeito da concentração de Aβ25-35 em

interação com POPC/SM/Chol (1:1:1), a 25ºC, numa subfase aquosa a pH=7. A seta vermelha significa

o aumento da concentração do péptido Aβ25-35 na subfase. ................................................................. 50


pH=7, da interação entre a monocamada lipídica POPC/SM/Chol (1:1:1) com 2 μM (A.) e 4 μM (B.) de

péptido Aβ25-35. ...................................................................................................................................... 51

Figura 37. Efeito do colesterol na formação da monocamada lipídica na presença de diferentes

concentrações de Aβ25-35, numa subfase aquosa a pH=7 e 25ºC, para pressões superficiais de 10 e 30

mN/m. .................................................................................................................................................... 52

Figura 38. Isotérmicas -A da mistura POPC/SM (1:1) (esquerda) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (direita) em

interação com 1 e 4 µM de Aβ25-35, a 25ºC, numa subfase aquosa a pH=4 (linha descontínua) e pH=7

(linha contínua). ..................................................................................................................................... 54

Figura 39. Efeito do pH na variação da área da monocamada de POPC/SM (1:1) (esquerda) e

POPC/SM/Chol (1:1:1) (direita) em interação com 0.25, 0.5, 1, 2 e 4 µM de Aβ25-35, a 25ºC. Valores

médios para pressão superficial de 30mN/m. ....................................................................................... 54

Figura 40. Termogramas para POPC/SM (1:1) 1.12mM obtidos, a pH=7, com várias concentrações de

Aβ25-35. ................................................................................................................................................... 55

Figura 41. Temperatura de transição de fase da mistura POPC/SM (1:1) em função da concentração

de solução peptídica adicionada, a pH=7. ............................................................................................ 56

XXI

Lista de Abreviaturas

Aβ péptido β-amilóide (amyloid-β peptide)

Aβ25-35 Fragmento peptídico β-amilóide (25-35)

Aβ1-40/42 Péptido β-amilóide (1-40) ou (1-42)

AFM Microscopia de força atómica (atomic force microscopy)

APP Proteína precursora amilóide

Chol Colesterol

DLPG 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoglicerol

DMPA 1,2-ditetradecanoil-sn-glicero-3-fosfato

DMPC 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DMPG 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol

DMPS 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DMSO Dimetilsulfóxido

DOPC 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DPLC 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DPPC 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DRM Membrana resistente a detergentes (detergent resistant membrane)

DSC Calorimetria diferencial de varrimento (differential scanning calorimetry)

FT-IR Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (Fourier transform infrared

spectroscopy)

GPI Glicofosfatidil inositol

GUV Vesículas unilamelares gigantes

HEPES ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etanossulfónico)

HFIP 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (hexafluorisopropanol)

LMV Vesículas multilamelares grandes

XXII

LUV Vesículas unilamelares grandes

PC Fosfatidil colina

PE Fosfatidil etanolamina

PG Fosfatidil glicerol

PI Fosfatidil inositol

PS Fosfatidil serina

POPC 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina

POPG 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol

PTFE Politetrafluoretileno

NMR Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (nuclear magnetic ressonance

spectroscopy)

NTA Análise de localização de nanopartículas (nanoparticle tracking analysis)

QCM-D Microbalança de cristal de quartzo com dissipação (quartz crystal microbalance with

dissipation)

SAM Monocamada auto-montada

SDS Docedil sulfato de sódio

SLB Bicamada lipídica suportada

SM Esfingomielina

TFA Trifluoroacético

TFE Trifluoroetanol

XXIV

Lista de Símbolos

Tt Temperatura de Transição de Fase

Lβ Fase líquida lamelar

Lα Fase líquida cristalina

LO Fase lamelar líquida-ordenada

Ld Fase lamelar líquida-desordenada

Lb Fase sólida ordenada

f Frequência de ressonância

D Dissipação de energia

Δf Variação da frequência de ressonância

ΔD Variação da dissipação de energia

Edis Energia dissipada

Est Energia armazenada

Δm Massa adsorvida

Cf Constante de sensibilidade característica do sensor

n Número da harmónica

ω Frequência angular

ρI Densidade do líquido

ɳI Viscosidade do líquido

ρf Densidade do filme

µf Elasticidade do filme

ɳf Viscosidade do filme

A0 Lift-off da monocamada

𝜋 Pressão superficial

ɣo Tensão superficial da água pura (ou seja, da subfase sem monocamada)

XXV

ɣ Tensão superficial da superfície ocupada pela monocamada

Cp Capacidade calorífica

N.A. Não avaliável

1

Capítulo I – Introdução

1.1. Motivação

A doença de Alzheimer afeta cada vez mais a população mundial e é caracterizada pela formação

de placas no cérebro compostas por agregados de péptidos β-amilóides (Aβ). Alguns autores defendem

que a agregação destes péptidos é uma das causas para o desenvolvimento desta doença

neurodegenerativa. A neurotoxicidade dos péptidos Aβ na doença de Alzheimer relaciona-se com a

interação destes péptidos com os lípidos que constituem a membrana celular, afetando a sua

integridade e conduzindo a uma possível apoptose celular [1-3].

Existem microdomínios membranares que podem desempenhar um papel crucial no fenómeno de

agregação peptídica uma vez que estão associados a doenças neurodegenerativas. Estes

microdomínios são designados por jangadas lipídicas. A composição mais comum para um modelo de

jangadas lipídicas é uma mistura equimolar de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC),

esfingomielina (SM) e colesterol (Chol) [4-6].

O principal objetivo desta investigação é compreender os fenómenos de interação existentes entre

os lípidos presentes na membrana celular e os péptidos Aβ, bem como entender o papel desta interação

na doença de Alzheimer. Deste modo, procurou-se estudar se a interação entre os péptidos Aβ e os

lípidos presentes na membrana celular ocorria preferencialmente em domínios ricos em colesterol

(jangadas lipídicas), em comparação com membranas mais fluídas sem a presença de colesterol. O

fragmento peptídico β-amilóide (25-35) (Aβ25-35) foi utilizado para estudar esta interação membrana

celular-péptido.

As técnicas experimentais utilizadas foram: a Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação

(QCM-D), para deteção de mudanças na massa e nas propriedades viscoelásticas dos lipossomas

suportados na presença e ausência de colesterol, e a influência da concentração de péptido Aβ;

Balança de Langmuir, para estudar o efeito do colesterol e do pH na interação lípido-péptido; Análise

de Localização de Nanopartículas (NTA), para estudar o efeito da concentração de péptido Aβ na

agregação peptídica, e a influência do pH nesta agregação; Calorimetria Diferencial de Varrimento

(DSC), para detetar mudanças na transição de fase dos lípidos em interação com o péptido Aβ; e,

finalmente, Dicroísmo Circular, para estudar a conformação do péptido Aβ em solução, bem como a

influência do pH na sua conformação.

1.2. Estado da Arte

1.2.1. A doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns, sendo caracterizada

por uma perda neuronal. A doença de Alzheimer consiste num distúrbio cerebral progressivo e fatal,

que conduz à atrofia do hipocampo e do córtex cerebral [7-9].

Uma das características desta doença neurodegenerativa é a formação de placas no cérebro

compostas principalmente por agregados de péptidos β-amilóides, exibindo uma estrutura de folha β;

2

a agregação peptídica é considerada como uma das causas para o desenvolvimento desta doença.

Considera-se, assim, que a inibição deste processo de agregação é uma potencial abordagem

terapêutica para o tratamento da doença de Alzheimer [1, 10]. As placas senis são compostas por uma

mistura de péptidos β-amilóides (1-40) (Aβ1-40) ou de péptidos β-amilóides (1-42) (Aβ1-42); contudo, o

fragmento peptídico Aβ1-42 predomina na doença de Alzheimer, apresentando este fragmento uma

maior tendência de agregação, comparativamente com o fragmento Aβ1-40 [11,12].

1.2.2. As membranas lipídicas e os péptidos β-amilóides

Diversos estudos indicam a existência de uma relação direta entre a composição e estrutura da

membrana celular e a tendência de agregação e neurotoxicidade dos péptidos β-amilóides [13-19].

Segundo alguns autores, a toxicidade (ou neurotoxicidade) dos péptidos β-amilóides, possivelmente

responsáveis pela doença de Alzheimer, pode estar relacionada com a interação destes péptidos com

a membrana celular, sendo importante compreender este fenómeno de interação [20, 21]. Segundo

Peters et al., a membrana celular é o primeiro local de interação entre o péptido β-amilóide e os

neurónios, sendo considerada o local onde a atividade neurotóxica destes péptidos se inicia [22]. Deste

modo, diversos são os mecanismos que têm sido apresentados como sendo possíveis causas para a

neurotoxicidade da interação do péptido β-amilóide com a membrana lipídica [23].

Vários autores afirmam que a neurotoxicidade da interação existente entre péptido β-amilóide e a

membrana lipídica pode estar associada a um aumento da permeabilidade da bicamada fosfolipídica,

à desregulação da homeostasia do cálcio e, ainda, à formação de canais iónicos devido aos agregados

de péptido Aβ. Kawahara et al., usando uma cultura de células neuronais, concluíram que as moléculas

de péptido Aβ1-40, em solução, podem interagir com a membrana celular, formando canais iónicos

seletivos [24]. A presença destes péptidos na membrana lipídica pode ainda conduzir à oxidação dos

lípidos presentes na membrana, conduzindo diretamente à perda da sua integridade. Além disso, vários

autores defendem que as ligações eletrostáticas dos péptidos Aβ ao grupo polar dos fosfolípidos pode

contribuir para o seu comportamento neurotóxico [19-21, 25-28].

Segundo diversos autores, a integridade da membrana lipídica é influenciada pela interação

existente entre a membrana lipídica e o péptido β-amilóide, conduzindo à diminuição da estabilidade e

aumento da fluidez da membrana celular e, eventualmente, à apoptose de células neuronais. Além

disso, estas interações membrana celular-péptido Aβ podem ser influenciadas pela conformação do

péptido, pelas propriedades físico-químicas da membrana celular e, ainda, pela sua composição lipídica

[29-31]. Estudos de modelação molecular sugeriram que o péptido β-amilóide in vivo é capaz de dar

origem a oligómeros simples ou a agregados de oligómeros. Aliados a estudos cristalográficos, estes

estudos de modelação molecular sugeriram que existe uma potencial interação entre os oligómeros e

a membrana celular [32]. D’Errico et al. e Dante et al., por sua vez, propuseram que a forma monomérica

do fragmento peptídico Aβ25-35 provoca menos alterações em membranas de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-

glicero-3-fosfocolina/1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPC/POPG) e 1,2-dilauroil-sn-

glicero-3-fosfatidilcolina/1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPLC/DLPG), contendo colesterol.

D’Errico et al. afirmaram, ainda, que a presença de DLPG na membrana lipídica não afeta a interação

3

desta com o péptido, concluindo que a inserção de péptidos na membrana lipídica é uma consequência

de interações hidrofóbicas [33, 34]. Outros autores concluíram que o péptido β-amilóide interatua

diretamente com os lípidos presentes na superfície da membrana lipídica, alterando as suas

propriedades mecânicas, as propriedades de coesão dos componentes membranares e a

permeabilidade da membrana lipídica, podendo este facto ser uma consequência da formação de

estruturas moleculares péptido-lípido na membrana celular [21, 35].

Como foi referido anteriormente, a presença de péptidos β-amilóides na membrana lipídica pode

conduzir à oxidação dos lípidos presentes na membrana. De facto, diversos autores estudaram, in vivo,

o papel do stress oxidativo na influência que os péptidos β-amilóides têm em doenças

neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. Segundo Betterfield et al. e Perluigi et al., os

péptidos Aβ1-42 estão diretamente associados à geração de radicais livres, que conduzem a danos

oxidativos dos lípidos presentes na membrana celular [36, 37]. Butterfield et al. demonstraram ainda

que o stress oxidativo não ocorre no cérebro in vivo, se o único resíduo de metionina na posição 35 do

péptido Aβ1-42 não estiver presente [38]. Veradarajan et al., por sua vez, demonstraram que o stress

oxidativo associado ao péptido Aβ1-42 em células neuronais é um processo que ocorre por via catalítica,

devido à reação em cadeia que é produzida na membrana lipídica [39].

A quantidade de péptido β-amilóide em interação com a membrana lipídica é também um fator a ter

em atenção. Quando a quantidade de péptido Aβ aumenta na membrana lipídica, estes péptidos

adotam a conformação de folha β, em vez de hélice α, conduzindo à geração de mais agregados

amilóides tóxicos no cérebro [40, 41]. De facto, Chakravarthy et al, usando tecidos do hipocampo e do

córtex frontal de cérebro humano pos-mortem, verificaram que um cérebro de um paciente com doença

de Alzheimer apresenta consideravelmente mais agregados de péptido Aβ1-42, que um cérebro de um

paciente sem esta doença. Estes autores utilizaram anticorpos monoclonais específicos para péptidos

Aβ para detetarem estes agregados [42].

De modo a estudar o fenómeno de interação existente entre os péptidos β-amilóides e a membrana

lipídica, diversos autores recorreram à utilização do fragmento Aβ25-35, uma vez que se trata de um

fragmento que apresenta um comportamento muito idêntico ao fragmento peptídico completo Aβ1-42 e

que, além disso, tem a capacidade de se movimentar na bicamada fosfolipídica, afetando fortemente a

sua dinâmica, principalmente na região apolar da membrana [31, 43-46]. Segundo Wood and Müller, o

fragmento peptídico Aβ25-35 representa a região biologicamente ativa do fragmento completo e agrega

mais facilmente do que outros fragmentos, mantendo o nível de toxicidade igual ao do péptido Aβ1-42.

Os efeitos do fragmento peptídico Aβ25-35 têm sido estudados por vários autores, usando modelos

biomembranares, como monocamadas ou bicamadas fosfolipídicas (exemplo: lipossomas) [47]. Por

sua vez, Mizkabekov et al. e Qi et al., demonstraram a capacidade do fragmento Aβ25-35 promover a

formação de canais iónicos em bicamadas fosfolipídicas planares e em membranas celulares,

respetivamente [48, 49]. Clementi et al, demonstrou ainda que o fragmento Aβ25-35, na forma não

agregada, é capaz de invadir as células neuronais do cérebro de um rato, conduzindo à sua morte [8].

Atualmente, a relação existente entre as características e mecanismos de ação dos péptidos β-

amilóides e a composição das bicamadas fosfolipídicas com as quais interatuam ainda não está

4

perfeitamente compreendida. Uma das razões é o facto de os resultados obtidos no estudo da interação

entre o fragmento peptídico Aβ25-35 e modelos biomembranares serem, por vezes, contraditórios.

Também o comportamento anfifílico destes péptidos tem sido considerado um importante fator na

interação péptido-lípido, existindo estudos que afirmam que as interações hidrofóbicas e eletrostáticas

são determinantes para os péptidos conduzirem a uma atividade disruptiva da membrana lipídica.

Torna-se, assim, necessário o desenvolvimento de mais estudos para compreender o verdadeiro papel

do fragmento peptídico β-amilóide (25-35) na doença de Alzheimer [8, 47].

1.3. Conteúdo

O presente trabalho é dividido em 4 capítulos principais. O primeiro capítulo, Fundamentos Teóricos,

tem como objetivo fornecer uma introdução em relação a vários tópicos: Membranas Celulares,

focando-se nos seus principais constituintes lipídicos; Jangadas Lipídicas, e o seu papel nas células;

Modelos Biomembranares, onde se apresenta os vários modelos para estudar as biomembranas e

modelos para estudar jangadas lipídicas; Péptido β-amilóide: fragmento (1-42) e fragmento (25-35), as

suas propriedades, funções, conformações e tendência de agregação peptídica; Interação entre

modelos biomembranares e péptidos Aβ, apresentando-se conclusões de diversos autores sobre esta

interação lípido-péptido; Técnicas Experimentais, onde são explicados os princípios de cada técnica

experimental utilizada na presente investigação.

O segundo capítulo, Materiais e Métodos, inclui os materiais e a descrição das técnicas

experimentais utilizadas para estudar as interações entre as membranas modelo e os péptidos Aβ, isto

é, Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação (QCM-D), a Balança de Langmuir e a

Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC), bem como as técnicas de preparação das soluções

peptídicas, das soluções lipídicas e dos lipossomas, e, ainda, as técnicas utilizadas para estudar a

influência do pH na conformação do péptido Aβ e o efeito da concentração e pH na agregação

peptídica, isto é, Dicroísmo Circular e Análise de Localização de Nanopartículas (NTA), respetivamente.

No capítulo Resultados e Discussão apresenta-se os resultados da interação entre o fragmento

peptídico Aβ25-35 com os dois modelos biomembranares: lipossomas (suportados ou em suspensão) e

monocamadas de Langmuir de POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1). Discutiu-se o efeito da

concentração do péptido Aβ nesta interação, bem como o efeito do colesterol. Além disso, discutiu-se

o efeito do pH na agregação peptídica e na interação péptido Aβ-modelos biomembranares, na

presença e ausência de colesterol, bem como o efeito do pH na conformação do fragmento peptídico

Aβ25-35 em solução.

O último capítulo, Conclusões e Trabalho Futuro, é o resumo das conclusões e suposições feitas de

acordo com os resultados obtidos através das técnicas experimentais utilizadas no presente estudo.

Neste capítulo sugere-se ainda possíveis direções para pesquisas futuras neste tema.

5

Capítulo II – Fundamentos Teóricos

2.1. Membranas Celulares

A zona primária de contacto entre uma dada célula e o seu ambiente envolvente é designada por

membrana celular. A membrana celular, também designada por membrana plasmática, membrana

citoplasmática ou membrana lipídica, define a estrutura externa de cada célula, separando o citoplasma

do ambiente envolvente, e funciona como uma barreira, regulando a saída e a entrada de material e

informação. As células eucariotas possuem ainda membranas subcelulares que dividem o citoplasma

em múltiplos compartimentos, designados por organelos, permitindo que cada função celular ocorra

eficientemente e simultaneamente em diferentes partes da célula. A conservação de energia da célula

e a comunicação célula-célula são outras duas propriedades da membrana celular; as funções

desempenhadas por esta membrana devem-se, essencialmente, às propriedades físicas que possui.

A membrana celular é flexível, o que permite a alteração da sua forma durante o crescimento e

movimento celular, e seletivamente permeável, armazenando compostos e iões importantes em

concentrações adequadas para a homeostasia celular; além disso, a membrana celular é uma estrutura

frágil e que se fecha sobre si mesma, permitindo que ocorram fusões com vesículas de exocitose e a

formação de vesículas de endocitose, sem perdas significativas de componentes celulares [50-52].

Figura 1. Modelo de Mosaico Fluído para a membrana celular. Adaptado de [53].

Atualmente, a estrutura da membrana celular é descrita pelo Modelo de Mosaico Fluído (Figura 1),

proposta por Singer e Nicholson, em 1972. De acordo com este modelo, a membrana celular consiste

numa bicamada fosfolipídica fluída, com proteínas a flutuar livremente. Segundo o Modelo de Mosaico

Fluído, a membrana celular é uma estrutura dinâmica e fluída, permitindo movimento; é

maioritariamente composta por fosfolípidos, formando a bicamada, com uma espessura de 5 a 8 nm,

onde se encontram diferentes moléculas distribuídas. As moléculas fosfolipídicas, que compõem a

membrana de uma célula eucariota, são moléculas anfipáticas, isto é, possuem uma terminação polar

e uma terminação apolar; enquanto a terminação polar é hidrofílica, preferindo o meio aquoso, a

terminação apolar é hidrofóbica, evitando-o. Assim, a bicamada fosfolipídica é uma estrutura estável

em meio aquoso, devido às interações hidrofílicas com este meio e, em especial, às interações

hidrofóbicas entre as cadeias alquílicas presentes no interior da bicamada [51, 54-56].

6

Cada tipo de membrana celular possui um grupo característico de proteínas, o que lhe confere

funções específicas. Na membrana celular, as proteínas mais comuns são as proteínas

transportadoras, que formam canais através da membrana celular, permitindo a passagem de solutos

orgânicos e de iões [55, 57]. Além destas, na membrana celular é possível encontrar proteínas

transmembranares e proteínas periféricas. As proteínas transmembranares ou integrais atravessam a

membrana de um lado ao outro, estando fortemente ligadas à membrana celular através de interações

hidrofóbicas. As proteínas periféricas, por seu lado, não atravessam a membrana, encontrando-se

numa das superfícies da membrana celular e são estabilizadas por interações electroestáticas e por

ligações de hidrogénio com o grupo polar dos fosfolípidos [58, 59].

Relativamente aos lípidos presentes na membrana celular, as principais classes lipídicas são:

glicerofosfolípidos e esfingolípidos [51]. Os glicerofosfolípidos (Figura 2) são compostos derivados do

ácido fosfatídico e podem ser designados, conforme o álcool presente na parte polar, por: fosfatidil

colina (PC), fosfatidil glicerol (PG), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidil inositol (PI) e fosfatidil serina

(PS) [51, 60, 61]

Figura 2. Estrutura química de um glicerofosfolípidos: fosfatidil colina (PC). Adaptado de [62].

Os esfingolípidos são estruturalmente semelhantes aos glicerofosfolípidos, mas, em vez de glicerol,

possuem esfingosina que é um aminoácido de cadeia longa. São uma família de lípidos anfipáticos que

derivam de ceramida; diferem na composição do grupo polar e são muito relevantes nas células

nervosas. A esfingomielina (Figura 3) é considerada um fosfolípido, uma vez que possui o grupo fosfato

[63].

Figura 3. Estrutura química da esfingomielina. Adaptado de [62].

Outro lípido presente nos tecidos biológicos é o colesterol (Figura 4), que pertence à família dos

esteróides. O colesterol é um dos constituintes da membrana celular das células eucariotas e é um

lípido anfipático, com um grupo hidroxilo polar. Este constituinte da membrana celular regula o estado

físico da bicamada fosfolipídica, aumenta a espessura da membrana celular e está envolvido,

diretamente, na formação de microdomínios na membrana, designados por jangadas lipídicas. O

colesterol não se encontra distribuído aleatoriamente na membrana celular e interatua com os

fosfolípidos. Quando estas interações ocorrem abaixo da temperatura de transição de fase (Tt),

correspondente à transição da fase de gel para a fase líquida cristalina, as cadeias de hidrocarbonetos

tornam-se mais fluídas, isto é, ocorre uma fluidificação da membrana lipídica; contrariamente, quando

estas interações ocorrem acima da Tt, as cadeias de hidrocarbonetos tornam-se mais rígidas, isto é,

7

ocorre um efeito condensante na membrana lipídica. O colesterol é vulnerável à oxidação, conduzindo

à formação de diversos produtos de oxidação, designados por COPs (Produtos da Oxidação do

Colesterol) [64-68].

Figura 4. Estrutura química do colesterol. Adaptado de [62].

A proporção relativa das três classes lipídicas presentes na membrana celular varia de acordo com

a espécie e o tipo de célula; tipicamente, os esfingolípidos representam 10 a 20% mol, o colesterol

representa cerca de 30 a 40% mol e os glicerofosfolípidos 40 a 60% mol do total dos lípidos presentes

na membrana celular [62].

A membrana lipídica apresenta uma distribuição assimétrica entre as duas monocamadas que a

compõem; a composição lipídica de cada monocamada é diferente. Tipicamente, a PC e a

esfingomielina encontram-se no lado exterior da membrana, enquanto PS, PG e PI se situam no interior

da membrana celular [62, 68, 69].

As interações entre as cadeias de acilo são fracas, sendo este o princípio básico da dinâmica da

membrana celular, permitindo o movimento dos lípidos e a formação de estruturas transitórias. Existem

diferentes formas de ordenar as cadeias de acilo dos lípidos, sendo estas responsáveis pelas

diferenças existentes na fluidez, estrutura e flexibilidade da membrana celular. O comportamento de

fase depende diretamente da temperatura e do tipo de lípido presente. Na fase gel lamelar (Lβ), as

cadeias de acilo encontram-se completamente estendidas e ordenadas e a espessura da bicamada

fosfolipídica é máxima; esta fase só ocorre em sistemas modelo. Na fase líquida cristalina (Lα), as

cadeias de acilo apresentam uma conformação desordenada e elevadas taxas de movimento intra e

intermolecular. A fase líquida ordenada é considerada uma fase intermédia entre as fases Lβ e Lα; esta

fase apresenta uma difusão rotacional livre das moléculas lipídicas, tal como acontece na fase Lα, e

cadeias de acilo completamente estendidas em configuração trans, como na fase Lβ [68, 62, 69, 70].

2.2. Jangadas lipídicas

A formação e a deteção de jangadas lipídicas em biomembranas têm sido alvo de atenção devido

ao possível papel que estas estruturas desempenham em diversos eventos celulares [71]. As jangadas

lipídicas são microdomínios da membrana celular, ricos em esfingomielina e colesterol, que possuem,

normalmente, um diâmetro inferior a 100 nm [72, 73]. Estes microdomínios membranares são um lugar

preferencial para interações lípido-lípido e interações lípido-péptido, criando uma plataforma de

sinalização que está envolvida em diversas funções neuronais, sendo as jangadas lipídicas

fundamentais para o desenvolvimento e funcionamento neuronal [71, 74, 75].

8

As principais funções das jangadas lipídicas estão associadas à mediação do transporte

membranar, transdução do sinal e comunicação com o citoesqueleto. As jangadas lipídicas

proporcionam ainda locais específicos para interações com toxinas, para a adesão celular, para

respostas imunitárias ou para a regulação do citoesqueleto e são, igualmente, vias importantes para o

processo de proliferação e apoptose [69, 71, 76, 77]. Alterações na estrutura e nas atividades das

jangadas lipídicas podem estar associadas a doenças neurodegenerativas, como a doença de

Alzheimer, uma vez que estes microdomínios membranares podem desempenhar um papel importante

na agregação peptídica [71, 76].

As proteínas periféricas ancoradas por glicofosfatidil inositol (GPI) e as proteínas sinalizadoras para

transdução do sinal através da membrana celular são frequentemente associadas às jangadas

lipídicas. Além destas, existem ainda proteínas transmembranares ancoradas a lípidos através de

interações fracas; a sua incorporação na membrana celular depende da afinidade específica em relação

às jangadas lipídicas [77-80]. No esquema da Figura 5, encontra-se a representação das moléculas

presentes nas jangadas lipídicas.

Figura 5. Esquema representativo de jangadas lipídicas. As jangadas lipídicas podem ter diferentes composições

lipídicas e proteícas (jangada lipídica 1 e jangada lipídica 2). Adaptado de [81].

A primeira evidência da existência de jangadas lipídicas in vivo foi a deteção, em células, de

microdomínios designados por Membranas Resistentes a Detergentes (DRMs). As DRMs são frações

de membrana ricas em colesterol e esfingomielina e são resistentes à solubilização por Triton X-100.

No entanto, este processo de extração pode ser problemático uma vez que pode causar modificações

no estado físico dos lípidos, e levar à remoção de algumas proteínas ou lípidos. Além disso, exige a

existência de marcadores internos, o controlo da depleção do colesterol e o uso de mais do que um

detergente. As DRMs são diferentes das jangadas lipídicas nativas em tamanho, composição e

abundância no organismo [69, 76, 79, 82-85].

A monitorização de jangadas lipídicas em células vivas pode ser feita recorrendo a diferentes

técnicas como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que se baseia nas

mudanças de orientação dos grupos polares do lípido devido à formação de microdomínios, ou a

Calorimetria Diferencial de Varrimento, avaliando a existência de microdomínios através da

determinação da imiscibilidade de fase [86-88].

Jangada lipídica 1 Jangada lipídica 2

9

2.3. Modelos Biomembranares

O estudo do comportamento das membranas celulares faz-se frequentemente utilizando modelos

simplificados [89]. Os modelos membranares biomiméticos imitam a situação in vivo, e, de acordo com

Makky et. al., podem consistir em diferentes sistemas organizados, como monocamadas ou bicamadas

planares ou curvas (lipossomas) [90]. As membranas biomiméticas são formadas por misturas de

fosfolípidos, cuja composição se assemelha à composição real da membrana celular em causa. Através

destas é possível estudar processos biológicos in vitro, funções de proteínas, deposição de lipossomas,

entre outros estudos biofísicos [91-93].

a) Bicamadas Lipídicas Suportadas (SLBs) também conhecidas como bicamadas planares

suportadas (Figura 6), são um modelo biológico muito popular para mimetizar as membranas celulares,

podendo ser usadas para compreender as propriedades intrínsecas dos lípidos e para diferentes

estudos biomiméticos, biofísicos ou bioquímicos [94-96]. Estas bicamadas são suportadas em

substratos sólidos; entre a SLB e o substrato sólido encontra-se uma camada aquosa com 10 a 20 Å

de espessura [94, 97]. Os substratos usados para as SLBs depende da técnica a que a bicamada

lipídica se destina e são tipicamente de mica, vidro de borosilicato, óxido de titânio, ouro, platina, silício

oxidado e dióxido de silício (ou sílica). Existem, também, diversos métodos para a deposição dos lípidos

no substrato sólido e para a formação das SLBs: técnica de Lagmuir-Blodgett (LB) e técnica de Lagmuir-

Schaefer (LS), e a adsorção e fusão de vesículas lipídicas a partir de uma suspensão aquosa. Esta

última técnica aparenta ser o método mais simples e popular; a fusão é controlada pela composição,

pH, força iónica, pressão osmótica, tamanho e carga da superfície das vesículas. A partir deste método,

é possível obter uma bicamada estável, permitindo o uso de técnicas analíticas de superfície para

provar a existência de interações [95, 98].

Figura 6. Representação esquemática da Bicamada Fosfolipídica Suportada, num substrato sólido. Adaptado de

[98].

b) Bicamadas Fosfolipídicas Planares, também conhecidas como membranas lipídicas negras

(Figura 7), têm sido usadas para investigar diversos processos biofísicos. Trata-se de um modelo de

bicamada que envolve a formação de uma membrana ao longo de um orifício com 1 mm de diâmetro,

num material hidrofóbico, como o polietileno ou o teflon. Comparativamente às SLBs, as membranas

lipídicas negras não são suportadas por um substrato, encontrando-se em meio aquoso, onde está

presente um elétrodo de referência. O método mais popular para a formação deste modelo envolve a

deposição da solução lipídica sobre o orifício, e a formação de uma dupla camada com curvatura.

10

Contudo, este modelo tem a desvantagem de produzir membranas instáveis e com um curto período

de vida [98].

Figura 7. Representação esquemática de uma membrana lipídica negra. Adaptado de [98].

c) Monocamadas de Langmuir (Figura 8) são um filme organizado de moléculas anfipáticas,

com a espessura equivalente à espessura da molécula, na interface ar/líquido. O espalhamento de

moléculas anfifílicas numa superfície líquida é realizado colocando uma determinada quantidade de

solução num solvente volátil e não miscível na subfase, e com elevado coeficiente de espalhamento.

Os grupos polares ficam em contacto com a subfase aquosa e as cadeias de hidrocarbonetos apolares

apontam para o ar. Após a evaporação do solvente, a monocamada é comprimida e neste processo as

moléculas podem adotar diferentes estados de organização. Esta compressão conduz a alterações na

pressão superficial1 (𝜋) da interface ar/líquido, que são monitorizadas usando uma placa de Wilhelmy.

Este modelo biomembranar tem como vantagem permitir o controlo preciso do estado físico e da

organização/orientação das moléculas depositadas na interface ar/líquido, além de ser um modelo

físico bastante simples. Embora seja um modelo biomembranar pouco realista comparativamente aos

modelos de bicamadas lipídicas, as monocamadas de Langmuir são uma plataforma bastante útil no

estudo detalhado de interações moleculares em interfaces hidrofóbicas/hidrofílicas [99, 100].

Figura 8. Representação esquemática de uma monocamada de Langmuir. Adaptado de [81].

d) Monocamadas Auto-montadas (SAMs) (Figura 9) podem ser consideradas como sendo

cristais moleculares de duas dimensões. A sua estrutura é determinada pelas interações substrato-

moléculas e molécula-molécula; a superfície do substrato controla a montagem das entidades

moleculares, forçando as moléculas a ocupar uma localização específica. A estrutura das SAMs tem

semelhanças com a membrana biológica, sendo uma ferramenta versátil para a realização de

1 Pressão Superficial: é o resultado das interações entre as moléculas na interface ar/líquido, isto é, varia em

função da área disponível na subfase para cada molécula. Relaciona-se com as alterações da tensão superficial.

11

modificações superficiais; contudo, tratando-se de uma monocamada, é um modelo menos realista que

os modelos baseados em bicamadas [101-103]. As SAMs são obtidas através da modificação do

substrato com alcanotióis, de forma a obter uma superfície hidrofóbica, facilitando a formação de uma

membrana híbrida. As SAMs, comparativamente com as SLBs, são mais rígidas, devido ao

acoplamento com o substrato, normalmente de ouro; uma vez que se trata de um material relativamente

inerte, o ouro resiste à oxidação e a outras contaminações [98, 104]. As monocamadas podem ser

estudadas e analisadas por técnicas como a QCM-D; contudo, algumas técnicas rápidas e sensíveis,

como a espectroscopia NMR, não apresentam resultados tão bons para monocamadas, como

apresentam para bicamadas [98, 104, 105].

Figura 9. Representação esquemática de SAMs, com um substrato de ouro. Adaptado de [98].

e) Lipossomas, ou vesículas fosfolipídicas unilamelares ou multilamelares (Figura 10), em

suspensão ou adsorvidos/suportados num dado substrato, são um dos modelos mais adequados para

estudar a membrana lipídica das células biológicas [77, 106]. A deposição dos lipossomas é usada para

criar bicamadas homogéneas ou camadas vesiculares estáveis, dependendo do material do substrato

e do tamanho do lipossoma [91, 106, 107]. Os lipossomas são um sistema muito semelhante às células

nativas, sendo a bicamada fosfolipídica um meio de separação entre o espaço extracelular e o líquido

intracelular. [107, 108].

Figura 10. Representação esquemática de uma vesícula fosfolipídica (lipossoma). Adaptado de [107].

2.3.1. Modelos para jangadas lipídicas

São conhecidas diferentes composições lipídicas para mimetizar o comportamento de fase das

jangadas lipídicas. As bicamadas lipídicas podem ser classificadas em três fases, conforme a sua

fluidez: fase lamelar líquida-ordenada (Lo), fase lamelar líquida-desordenada (Ld) e fase sólida

ordenada (Lb) [77]. De facto, sabe-se que um local rico em esfingomielina e colesterol resulta na

formação de uma Lo e que esta coexiste com domínios ricos em glicerofosfolípidos não saturados numa

12

Ld. Assim, a separação de fase entre as fases Ld e Lo, na presença de colesterol, é essencial para a

simulação de jangadas lipídicas [109-111].

As misturas lipídicas ternárias constituídas por dois lípidos com diferentes temperaturas de fusão

e ricas em colesterol têm sido usadas na composição de membranas modelo para simular as jangadas

lipídicas [111]. Geralmente, o comportamento de fase das misturas modelo é representado como um

diagrama de fase ternário a uma temperatura constante, sendo a temperatura fisiológica (37ºC) ou a

temperatura ambiente (25ºC) as mais comuns. As misturas lipídicas ternárias apresentam uma

composição lipídica muito mais simples do que as membranas celulares mas o seu comportamento de

fase produz uma simulação satisfatória do comportamento de fase in vivo [77, 109, 112-115].

As misturas equimolares de glicerofosfolípidos/esfingolípidos/colesterol são consideradas misturas

canónicas de jangada lipídica, por apresentarem composição semelhante às DRMs extraídas das

células. As composições mais comuns destas misturas são: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina/ 1,2-

dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina/colesterol (DOPC/DPPC/Chol) e por DOPC/SM/Chol [71, 113].

Analisando as Tt, o 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) é a melhor opção para um lípido

com baixa Tt, porque é a fosfatidil colina mais relevante na membrana celular, capaz de ser obtida por

extração a partir de fontes biológicas. Para um lípido com elevada T t, a esfingomielina deverá ser a

opção mais adequada, uma vez que permite a ligação do hidrogénio com o grupo hidroxilo do colesterol

e está presente na membrana nativa de diferentes tipos de células [77, 116].

Assim, para o presente estudo, será utilizada uma mistura lipídica ternária de POPC/SM/Chol para

mimetizar as jangadas lipídicas, na proporção de 1:1:1. Na Figura 11, é possível observar o diagrama

de fase ternária dos três componentes, a temperaturas relevantes (23ºC, 34ºC e 46ºC). Além desta

mistura, a mistura binária de POPC/SM, na proporção de 1:1, será utilizada para estudar a influência

do colesterol; nesta mistura binária podemos separar um domínio rico em esfingomielina mais rígido e

um domínio rico em POPC mais fluído [109, 115].

Figura 11. Diagrama de Fase do POPC, esfingomielina e colesterol a três importantes temperaturas (23, 34 e

46ºC). Adaptado de [115].

2.4. Péptido β-amilóide: fragmento (1-42) e fragmento (25-35)

Os péptidos β-amilóides são compostos por 39 a 43 aminoácidos e formam-se a partir da clivagem

proteolítica da proteína precursora amilóide (APP), por ação das enzimas β- e γ-secretase [9, 117-120].

13

A principal função não patológica dos péptidos β-amilóides é a regulação do transporte de colesterol

[121, 121]. A parte central destes péptidos possui zonas de resíduos hidrofóbicos (17-21 e 30-40/42);

estes resíduos associam-se numa estrutura tipo gancho de cabelo (hairpin) para interagir uns com os

outros [123]. Os péptidos β-amilóides ocorrem em várias isoformas que diferem entre si pelo número

de aminoácidos no terminal C (Figura 12); péptidos Aβ1-42 é, juntamente com péptidos Aβ1-40, a forma

mais comum em espécies in vivo (Figura 12) [12, 122, 124, 125].

Segundo Vieira et. al. [126], os péptidos β-amilóides apresentam conformações hélice α em

solventes orgânicos apolares, e folha β, em solventes orgânicos polares; no seu estado solúvel, a

transição estrutural de hélice α para folha β pode conduzir à agregação molecular e à formação de

fibrilas [126, 127]. Os péptidos Aβ1-42, no estado monomérico, agregam-se em oligómeros solúveis de

baixo peso molecular. Estes oligómeros podem acumular-se, formando protofibrilas oligoméricas que,

por sua vez, podem transformar-se em fibras insolúveis que constituem as placas amilóides presentes

em doentes com doença de Alzheimer [9, 13, 127, 128].

Figura 12. Representação da sequência do péptido β-amilóide (1-42), (1-40) e (25-35), identificando os terminais

C e N. Adaptado de [129, 130].

Em particular, os péptidos Aβ1-42 possuem propriedades tensioativas e têm tendência para a

acumulação e agregação peptídica. A presença de lipossomas diminui a agregação peptídica, uma vez

que a interação entre os péptidos Aβ1-42 e os lipossomas é favorecida pela quantidade de fosfolípidos

presentes na bicamada: quanto mais lipossomas estiverem presentes, maior será a interação entre os

péptidos Aβ1-42 e os lipossomas e, consequentemente, menor a interação entre péptidos. Estes

péptidos interatuam com modelos da membrana celular, através da sua ligação a lípidos, sendo esta

interações explicadas na secção 2.5 [47, 131, 132].

O fragmento peptídico Aβ25-35 formado por 11 aminoácidos, está partcialmente localizado no

domínio hidrofóbico e apresenta as mesmas propriedades de toxicidade, alterações morfológicas e de

agregação que o péptido de comprimento total. Este fragmento peptídico (GSNKGAIIGLM) representa

o fragmento β-amilóide mais pequeno processado in vivo por proteases no cérebro [8, 133] e é

suficiente para conduzir à formação de fibrilas de péptido Aβ e à degeneração neuronal. Além disso,

os agregados do fragmento peptídico Aβ25-35 apresentam atividade neurotrófica e anfifílica, tal como o

fragmento completo [132, 134-138]. A estrutura secundária do fragmento peptídico Aβ25-35 depende de

fatores como a concentração e o pH. Loew [139] demonstrou que a estrutura secundária do fragmento

peptídico Aβ25-35 a uma concentração elevada e a pH=7 era essencialmente hélice α e folha β, enquanto

que a pH=4 a estrutura secundária incluía também espiral aleatória (random coil). Outros autores

confirmaram que a pH=7 e a uma elevada concentração peptídica este fragmento adotava a estrutura

folha β, mas a concentrações peptídicas mais baixas predominava a estrutura volta β (β turn) [140].

Sendo menos complexo do que o péptido completo Aβ1-42, mas apresentando as mesmas

14

características, o fragmento peptídico Aβ25-35 é um modelo muito atraente para estudar a agregação

dos péptidos Aβ1-42 e as interações destes péptidos, envolvidos na doença de Alzheimer, com modelos

biomembranares [137, 141].

2.4.1. Agregação Peptídica

As mudanças estruturais que ocorrem num péptido e a sua cinética são influenciadas pela

hidrofilicidade do ambiente e pela presença de lípidos em solução [142, 143]. Os péptidos β-amilóides

possuem uma elevada tendência de agregação em fibrilas amilóides, sendo estes agregados insolúveis

compostos principalmente por agregados de folha β. O processo de agregação destes péptidos passa

pela transformação de monómeros livres e solúveis em fibrilas amilóides insolúveis. De acordo com

Labbé et al. [140], esta agregação é devida à formação de estruturas ordenadas organizadas em folha

β, em resultado do estabelecimento de uma rede de ligações de hidrogénio, envolvendo os grupos CO

e NH. O processo de agregação amilóide é alvo de pesquisas biológicas e biofísicas, devido ao seu

papel em doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer [144, 145].

Os solventes fluorados, como hexafluorisopropanol (HFIP), são utilizados para estabilizar a estrutura

monomérica dos péptidos β-amilóides. O pré-tratamento das soluções com HFIP leva a um significativo

melhoramento da solubilidade do péptido β-amilóide, favorecendo o estado monomérico do péptido em

solução, devido à dissolução dos agregados peptídicos, tornando a solução mais homogénea. Deste

modo, o procedimento normal para o pré-tratamento com HFIP consiste na dissolução dos péptidos

neste álcool, conduzindo a uma solução livre de agregados e à evaporação de álcoois [125-127, 137,

146]. Este pré-tratamento tem ainda como objetivo a manutenção da estrutura hélice α do péptido β-

amilóide [125].

Existem, ainda, outras propostas para a preparação de soluções peptídicas, evitando a agregação.

O péptido β-amilóide pode ser dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO). Para a desagregação de um

péptido, isto é, para obter o estado monomérico deste, é possível recorrer também a uma dissolução

utilizando trifluoroacético/trifluoroetanol/hexafluorisopropanol (TFA/TFE/HFIP) [35, 127, 147-150].

2.5. Interação entre modelos biomembranares e péptido Aβ

O estudo dos efeitos dos péptidos β-amilóides em membranas lipídicas pode ser feito recorrendo a

modelos biomembranares e, ao longo dos vários anos de investigação, surgiram diversas propostas

para mecanismos de neurotoxicidade dos péptidos β-amilóide.

Segundo Terzi et al. [151], o péptido Aβ1-40 pode ligar-se à superfície da membrana celular carregada

negativamente através de ligações de atração eletrostática. Logo, a concentração de péptido Aβ1-40 à

superfície da membrana celular é maior do que em solução. Se os potenciais negativos da superfície

celular aumentarem, existe maior possibilidade de os péptidos se ligarem à superfície celular

electrostaticamente, aumentando a velocidade de agregação peptídica [15].

Ding et al. [46] estudaram as interações entre péptidos β-amilóides com bicamadas lipídicas

suportadas. Os autores concluíram que a interação entre péptidos Aβ1-40 e a bicamada lipídica inicia-

15

se com uma ligação muito forte do péptido no estado monomérico à membrana e que, posteriormente

a um período de incubação de 20 horas a 22ºC, há formação de oligómeros na membrana, verificando-

se agregação peptídica. O tamanho destes oligómeros depende diretamente da concentração de

péptido em solução.

Por seu lado, Sabaté et al. [131], utilizando lipossomas como modelo biomembranar, demonstraram

que a presença de péptidos β-amilóides pode conduzir à disrupção da membrana celular. Este efeito

de disrupção é mais forte na presença de membranas carregadas negativamente, uma vez que a

interação entre os péptidos β-amilóides e os lipossomas é favorecida pela presença de fosfolípidos

negativos na bicamada.

Ambroggio et al. [35], estudaram a estabilidade dos modelos biomembranares, representados por

vesículas unilamelares gigantes (GUVs), expostos a uma solução de péptido β-amilóide (1-42). Este

estudo revelou que o fragmento (1-42) conduz à disrupção das GUVs, compostas por POPC ou

POPC/SM/Chol (1:1:1). Demonstrou-se assim que a estabilização da membrana lipídica é diretamente

alterada quando as GUVs são expostas aos péptidos. Assim, os autores concluíram neste estudo que

diminuição da estabilização da membrana lipídica é resultado da interação entre péptidos e lípidos.

Ambroggio et al. também demonstraram, através de Microscopia de Força Atómica (AFM), que o

fragmento amilóide (1-42) forma estruturas hexaméricas em membranas celulares modelo, estando

este resultado de acordo com Lin et al. [152, 153].

Através de modelos biomembranares computacionais, Vestergaard et al. [154] investigaram a

interação dos péptidos β-amilóides com membranas lipídicas e as possíveis transformações

morfológicas resultantes. Os autores concluíram que as espécies oligoméricas do péptido Aβ1-42 se

localizam mais perto da superfície da membrana enquanto as fibrilas têm uma localização variada.

Demonstraram que a presença de péptido Aβ1-42 conduz a um aumento da área da superfície da

membrana, induzindo a transformação vesicular dos lípidos, devido aos péptidos mediarem a fusão da

membrana.

Outro estudo por simulação foi desenvolvido por Qiu et al. [155] que investigaram as interações

entre os péptidos β-amilóides e membranas enriquecidas ou não em colesterol, verificando o papel

crucial que o colesterol tem na prevenção da formação de estruturas folha β e da disrupção da

membrana.

Relativamente ao fragmento peptídico β-amilóide (25-35), também diferentes estudos foram

realizados usando modelos biomembranares. Em 1995, Terzi et al. [156], descobriram que a adição de

lipossomas de POPC/POPG a uma solução de péptido Aβ25-35 induzia uma transição na formação do

péptido de espiral aleatória para folha β.

Mason et al. [157], em 1996, afirmaram que o fragmento Aβ25-35 incorporado em lipossomas de

POPC apresenta os seus resíduos 25 a 27 localizados na parte hidrofílica da membrana, enquanto os

restantes resíduos apolares se localizam no interior do lipossoma (parte hidrofóbica).

16

Martinez-Senac et al. [158], estudaram a influência de diferentes composições de lípidos, na forma

de lipossomas, na estrutura do fragmento peptídico Aβ25-35, usando a técnica de espectroscopia de FT-

IR (espectroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier). Os autores concluíram que os

lipossomas compostos por fosfolípidos com carga negativa, como 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-

fosfatidilserina (DMPS) ou 1,2-ditetradecanoil-sn-glicero-3-fosfato (DMPA), aceleram a agregação

peptídica, enquanto os lipossomas formados por fosfolípidos zwiteriónicos, como 1,2-dimiristoil-sn-

glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), diminuem a tendência de agregação. Através deste estudo, os

autores provaram que a interação entre estes péptidos e os fosfolípidos que formam a

membrana/modelo biomembranar tem uma natureza eletrostática.

De modo a entender o papel do colesterol, Labbé et al. [140], estudaram a interação entre o

fragmento peptídico Aβ25-35 e membranas modelo de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina /1,2-

dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPC/DMPG), na presença e na ausência de colesterol.

Concluíram que o péptido interage com os fosfolípidos, alterando a fluidez e elasticidade da membrana,

sendo esta interação beneficiada na ausência de colesterol.

Triulzi et al. [159] modificaram o fragmento peptídico Aβ25-35 com uma cadeia alifática C18 no

terminal N do péptido de modo a estudar a agregação do péptido Aβ25-35 quando há formação de uma

monocamada de Langmuir na interface ar/líquido. Os autores concluíram que a pressões superficiais

baixas, a estrutura da monocamada apresenta uma pequena contribuição de folha β, mas que essa

contribuição aumenta significativamente quando a pressão superficial aumenta e a monocamada passa

para a fase de líquido-condensado (LC).

Lao et al. [160] estudaram a interação entre o fragmento peptídico Aβ25-35 e modelos

biomembranares de fosfolípidos aniónicos e colesterol. Os autores afirmaram que o fragmento Aβ25-35

interage preferencialmente com os grupos polares dos lípidos e que perturba pouco o núcleo de

hidrocarbonetos quando os péptidos são adicionados aos lipossomas já existentes; contudo, no caso

de os péptidos serem incluídos nos lipossomas durante a sua formação, os autores concluíram que os

péptidos penetram no interior da bicamada fosfolipídica do modelo biomembranar.

2.6. Técnicas Experimentais

2.6.1. Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação (QCM-D)

A Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação permite determinar de forma precisa e em

tempo real a massa e as propriedades viscoelásticas de um filme depositado sobre um sensor de

quartzo. Trata-se de uma técnica que é aplicada com sucesso para medição de processos de adsorção

em ambientes líquidos e gasosos [106, 161] e numa série de estudos relacionados com a conformação

e agregação de proteínas, por exemplo para quantificação da agregação de péptidos amilóides numa

dada interface sólido/líquido [162-165].

A QCM-D permite a medição simultânea das alterações que ocorrem na frequência de ressonância

do cristal (f) e na dissipação de energia (D) [162]. Uma possível alteração na frequência de ressonância

do cristal está relacionada com a massa adsorvida no cristal, isto é, a presença de biomoléculas na

17

solução que entra em contacto com o cristal de quartzo, leva à formação de um filme na superfície

deste, alterando a frequência de ressonância; por outro lado, a dissipação de energia está relacionada

com as propriedades viscoelásticas do filme adsorvido no cristal [108].

O princípio de funcionamento da QCM-D baseia-se essencialmente no facto dos cristais de quartzo

serem piezoelétricos, o que conduz a uma deformação mecânica quando expostos a um campo elétrico

oscilatório e a uma onda de cisalhamento que se propaga através da amostra [108, 128]. Enquanto a

variação da frequência de ressonância (Δf) é obtida antes de desligar a fonte, a variação da dissipação

de energia (ΔD) é obtida depois. Este processo é repetido a cada segundo, permitindo obter resultados

em tempo real [108, 128, 162, 166].

O parâmetro de dissipação é definido através da Equação 1:

(1)

onde 𝐸𝑑𝑖𝑠é a energia dissipada durante uma oscilação e 𝐸𝑠𝑡 é a energia armazenada pelo filme durante

a mesma oscilação [167].

Para camadas rígidas ideais, que estão acopladas à oscilação do cristal e distribuídas

homogeneamente sobre a superfície, comportando-se como um filme elástico, verificam-se alterações

na frequência e na velocidade proporcionais à massa adsorvida, sendo o fator de dissipação

desprezado. Para esta hipótese ser considerada válida, os valores de dissipação devem ser inferiores

a 1 × 10−6, para frequências na ordem dos 5 MHz [128, 167, 168]. Neste caso existe uma relação direta

entre Δf e a massa adsorvida (Δm), dada por (Equação 2):

(2)

onde 𝐶𝑓é uma constante de sensibilidade característica do sensor utilizado (para o caso dos cristais de

quartzo, a 5 MHz, 𝐶𝑓 = 17,7 𝑛𝑔. 𝐻𝑧−1. 𝑐𝑚−2) e n é o número da harmónica [107]. Esta equação designa-

se por Equação de Sauerbrey [106, 168].

Se o filme formado no cristal de quartzo não for rígido e fino, a Equação de Sauerbrey não é válida,

sendo necessário introduzir modificações nesta equação para ter em conta as propriedades

viscoelásticas do material adsorvido. Estas modificações baseadas na aplicação do Modelo de Voigt

conduzem à Equação 3 [165, 169]:

(3)

st

dis

E

ED

2

fn

Cm

f

f

f

II

f

Jn

Cfm

"

1

18

onde ω é a frequência angular, 𝜌𝐼 é a densidade do líquido, 𝜂𝐼 é a viscosidade do líquido, 𝜌𝑓 é a

densidade do filme e, por fim, 𝐽𝑓" é dado pelo quociente

𝜔.𝜂𝑓

𝜇𝑓2+𝜔2.𝜂𝑓

2 em que 𝜇𝑓 é a elasticidade do filme e

𝜂𝑓 é a viscosidade do filme.

2.6.2. Balança de Langmuir

A técnica de Langmuir é muito importante na preparação de monocamadas de moléculas biológicas,

que podem simular as membranas celulares [170-173]. A principal vantagem do método de Langmuir

é a formação de monocamadas homogéneas, compactas, de espessura e organização controladas.

Além disso, este método exige tempos de preparação curtos e permite também estudar fenómenos de

adsorção. Uma das principais características desta técnica é a possibilidade de transferir para

substratos sólidos as monocamadas formadas (técnica de Langmuir-Blodgett), permitindo o recurso a

uma vasta gama de técnicas de caracterização de superfícies que podem ser usadas para estudar a

estrutura dos filmes formados a partir da técnica de Langmuir, como AFM [171, 172, 174-177].

O método de Langmuir baseia-se na formação de um filme/monocamada na interface ar/líquido.

Nesta técnica, de modo geral, são utilizadas moléculas anfifílicas que apresentam uma porção

hidrofóbica e uma porção hidrofílica bem definidas [175]. As moléculas orgânicas, como os lípidos,

fosfolípidos ou glicolípidos, orientam-se na interface ar/líquido de modo a minimizar a energia livre e

formar uma monocamada insolúvel. A organização destas monocamadas, bem como a qualidade do

filme, depende de diversos parâmetros: pH, temperatura, velocidade, tipo de deposição e as

propriedades termodinâmicas da interface ar/líquido [172, 177].

Quando a área da monocamada é reduzida através de um sistema de compressão, usando uma ou

duas barreiras movíveis (compressão assimétrica ou simétrica, respetivamente), a distância

intermolecular diminui e a pressão superficial aumenta. A força exercida pela monocamada por unidade

de comprimento é designada por pressão superficial (𝜋) (Equação 4):

(4)

onde 𝛾0 é a tensão superficial do líquido puro e 𝛾 a tensão superficial da superfície ocupada pela

monocamada. O diagrama que representa a variação da pressão superficial em função da área

ocupada por molécula, obtido a temperatura constante, designa-se por isotérmica Pressão Superficial

vs. Área por molécula (𝜋-A) (Figura 13). A análise destas isotérmicas fornece informação sobre a

estrutura, interações, transições de fase e compressibilidade da monocamada [172, 173].

Durante a compressão das barreiras, verifica-se uma variação da pressão superficial. Esta variação

deve-se às mudanças de organização que ocorrem nas moléculas presentes na subfase. Assim, antes

de se verificar o início do aumento da pressão superficial, designado por lift-off (A0), as moléculas

encontram-se num estado gasoso (G); neste estado as moléculas não interagem entre si. Quando a

monocamada é sujeita a compressão, verifica-se um aumento da pressão superficial e

consequentemente uma diminuição da área disponível por molécula, indicando a ocorrência de uma

mudança de estado gasoso para um estado líquido-expandido (LE); neste estado as moléculas

interatuam entre si mas ainda se encontram distanciadas umas das outras, embora já se encontrem

0

19

organizadas perpendicularmente à interface ar/líquido. A continuidade da compressão da monocamada

pode conduzir, posteriormente, a um aumento abrupto da pressão superficial que leva a uma mudança

de estado de líquido-expandido para um estado líquido-condensado (LC). Neste estado de

organização, as moléculas presentes na subfase tendem a interagir entre si a curtas distâncias e sendo

a sua orientação perpendicular à interface ar/líquido mais densa e compacta. O estado máximo de

organização das moléculas presentes na interface ar/líquido designa-se por estado sólido (S). A

compressão da monocamada conduz ao colapso da mesma, em que a área imediatamente anterior

corresponde à área mínima absoluta que as moléculas que formam a monocamada ocupam. O colapso

da monocamada corresponde ao colapso da monocamada, em que esta tende a deformar-se na

subfase [81]. Na Figura 13 apresenta-se um exemplo de uma isotérmica 𝜋-A, onde é possível identificar

os estados que as moléculas adquirem durante o processo de compressão.

Figura 13. Exemplo de uma isotérmica 𝝅 –A de um fosfolípido, com os estados de organização adotados pelas

moléculas presentes na interface ar/líquido ao longo da compressão. Adaptado de [178].

A partir da isotérmica obtida através da técnica de Langmuir, é possível estudar a interação de

péptidos com monocamadas lipídicas. Esta técnica permite introduzir os péptidos num ambiente

específico (a pH e temperatura controlados), e variar a concentração da solução peptídica conforme o

objetivo do estudo. Uma vantagem importante das monocamadas de Langmuir é a possibilidade de

investigar a gama de áreas moleculares que ocorre nas membranas naturais evitando as

transformações mesomórficas que podem ocorrer nas bicamadas dos lipossomas. Além disso, é

também possível simular a pressão superficial típica das membranas biológicas (30-35 mN/m) e estudar

a estabilidade do péptido na monocamada ou na interface ar/líquido, uma vez que a velocidade de

formação da monocamada é controlada [81, 173].

Área (Å2/molécula)

Pre

ssã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)

20

2.6.3. Análise de Localização de Nanopartículas

A técnica de Análise de Localização de Nanopartículas (NTA) permite visualizar e medir, em tempo

real, o tamanho (entre 10 nm e 1 µm) de partículas presentes numa determinada solução; além disso,

esta técnica permite calcular o número de nanopartículas existentes na solução e obter informações

relativamente ao índice de refração, fluorescência e potencial zeta das nanopartículas [179, 180].

A técnica de NTA relaciona o grau de movimento Browniano com o diâmetro hidrodinâmico das

nanopartículas (consideradas esféricas), permitindo determinar a distribuição de tamanho das

nanopartículas, num curto espaço de tempo. Recorrendo a um microscópio, esta técnica determina a

posição das nanopartículas presentes na solução através da deteção da luz que estas dispersam

quando o laser incide sobre as mesmas [179, 181, 182]. Utiliza-se um feixe laser de 635, 535 ou 404

nm para iluminar as nanopartículas presentes na solução em análise. Geralmente, as nanopartículas

em solução são mais pequenas do que o comprimento de onda da luz utilizado, e a informação sobre

a morfologia das nanopartículas é pequena; assim, estas partículas atuam como pontos de dispersão

de luz, permitindo observar o seu movimento Browniano. Ajustada ao microscópio, existe uma câmara

de CCD (Electron Multiplying Charged Coupled Device), usada para realizar uma gravação da zona

com nanopartículas onde o laser incide. O movimento Browniano, por sua vez, é obtido através de um

software associado à técnica de NTA, que permite determinar o movimento do centro de cada partícula

no plano x, y. Assim, é possível observar e gravar, simultaneamente, um vídeo das partículas

visualizadas através da técnica de NTA, bem como obter um gráfico de distribuição de tamanho das

nanopartículas, recorrendo a um software de análise [180, 181, 183].

2.6.4. Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC)

A técnica de Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) assenta na medição dos fluxos de calor

associados a transições que ocorrem nos materiais, em função da temperatura ou do tempo. O DSC

permite caracterizar os parâmetros termodinâmicos que controlam interações não covalentes e a

estabilidade de moléculas biológicas [184]. O DSC é uma técnica padrão usada para o estudo das

transições de fase dos sistemas lipídicos e das interações entre modelos de bicamada lipídica e outras

moléculas [86].

A técnica de DSC baseia-se no registo da diferença entre a capacidade calorífica, Cp, do conteúdo

presente na célula da amostra e do conteúdo da célula de referência, num dado intervalo de

temperaturas e a uma dada taxa de varrimento. A célula que contém a amostra e a célula que contém

a referência são submetidas à mesma sequência de ciclos aquecimento/arrefecimento. O principal

parâmetro que retiramos desta técnica é a temperatura de fusão das amostras analisadas; esta

temperatura corresponde à temperatura média do pico de transição de fase. Além disso, pode também

obter-se a entalpia de transição desde que seja possível traçar uma linha de base adequada entre o

início e o fim do aquecimento. O DSC permite avaliar a reversibilidade do comportamento térmico da

amostra [86, 185].

No aparelho de DSC, a amostra e a referência são analisadas ao mesmo tempo, devido ao

posicionamento do bloco de aquecimento. No decorrer de uma experiência de DSC, a amostra e a

21

referência são mantidas num ambiente fechado e isoladas da atmosfera e do ambiente exterior através

de um fluxo de azoto gasoso; este fluxo permite criar uma atmosfera seca e remover os gases libertados

pela amostra, quando esta é submetida a altas temperaturas [86,184].

Na Figura 14, apresenta-se um exemplo de um termograma obtido através de um ensaio de DSC.

O pico presente neste termograma corresponde à temperatura de fusão, isto é, à temperatura de

transição de fase da solução analisada.

Figura 14. Exemplo de um termograma típico de uma experiência DSC (DMPC Brain Lipid), onde se mostra um

pico correspondente a uma transição de fase.

2.6.5. Dicroísmo Circular

O dicroísmo circular é uma técnica de espectroscopia que se baseia na absorção diferencial dos

componentes esquerdo e direito da luz polarizada circularmente [186, 187]. Na prática, a radiação

polarizada no plano é dividida em dois componentes polarizados circularmente (esquerdo e direito),

pela passagem de um modulador que se encontra submetido a um campo elétrico alternado; este

modulador consiste num cristal de quartzo e numa placa fina de um material isotrópico, como o quartzo,

acoplada ao cristal. O campo elétrico alternado vai, então, induzir mudanças estruturais no cristal de

quartzo que conduz à transmissão de luz polarizada circularmente na placa. O equipamento de

dicroísmo circular não recombina os dois componentes, mas deteta-os separadamente, e a diferença

de absorção das duas polarizações (dicroísmo circular) medida em função do comprimento de onda

origina o espectro de dicroísmo circular da molécula em estudo [188].

A técnica dicroísmo circular pode ser usada para analisar e determinar a estrutura secundária dos

péptidos em solução. Esta análise é realizada na região de comprimento de onda entre 180 e 250 nm

do espectro de UV, uma vez que esta corresponde à zona de absorção das ligações peptídicas. Deste

modo, o dicroísmo circular permite avaliar a contribuição de cada tipo de estrutura secundária (hélice

α, folha β, volta β e espiral aleatória) através da comparação do espectro obtido com espectros já

determinados anteriormente de péptidos semelhantes ao péptido em análise [186, 188].

22

Capítulo III – Materiais e Métodos Experimentais

3.1. Materiais

Os lípidos 1-palmitoíl-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) (referência: 850457P) e

esfingomielina (Cérebro SM, porcina) (SM) (referência: 860062P) foram fornecidos pela Avanti Polar

Lipids, Inc.; o colesterol (Chol) (referência: C8667), por sua vez, foi fornecido pela Sigma – Aldrich, Co.

O fragmento peptídico β-amilóide (25-35) (95% de pureza) (referência: SY130531_9) foi fornecido

pela Intavis. O tratamento deste péptido foi realizado usando o álcool 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol

(HFIP) (referência: 105228) fornecido pela Sigma-Aldrich, Co.

Foram ainda utilizados outros compostos químicos fornecidos pela Sigma - Aldrich: ácido 4-(2-

hidroxietil)piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) (referência: H7637), dimetilsulfóxido (DMSO)

(referência: D8779), docedil sulfato de sódio (SDS) (referência: L3771), clorofórmio (referência:

528730), acetato de sódio (referência: S8750). Além destes, utilizou-se Cloreto de Sódio (NaCl)

(referência: 12159.1211) fornecido pela Panreac, Hellmanex ® II (referência: 320.002) fornecido pela

Hellma Gmbh & Co KG, ácido acético (referência: 4001), 99% de pureza, fornecido pela Glacial

Reagent Grade.

Foram preparadas duas soluções tampão, usando água Milli-Q. A solução tampão de pH=4 foi

preparada adicionando ácido acético e acetato de sódio de modo a obter as concentrações finais de

1.2 M e 1 M, respetivamente. Para os ensaios de dicroísmo circular, o tampão pH=4 foi preparado com

concentrações finais de 19 mM para o ácido acético e de 13 mM para o acetato de sódio. Por sua vez,

a solução tampão de pH=7 foi preparada adicionando HEPES e NaCl de modo a obter concentrações

finais de 10 mM e 0.1 M, respetivamente.

As soluções lipídicas e as soluções peptídicas foram preparadas a pH=4 e pH=7 a partir das duas

soluções tampão.

Para filtrar os tampões de HEPES e de ácido acético/acetato de sódio, utilizaram-se filtros

Chromafil® Xtra PVDF-20/25 (referência: 729218), fornecidos pela Macherey Nagel, com diâmetro de

25 mm e tamanho de poro de 0.20 µm, e seringas esterilizadas (referência: CH010L), fornecidas pela

Chirana.

Para todas as soluções, foi utilizada água Milli-Q (resistividade de 18 MΩ.cm e pH=5.7.

Foram utilizados, no extrusor, filtros de policarbonato com 600, 200 e 100 nm de diâmetro fornecidos

pela Nuclepore, Whatman.

Os cristais de quartzo revestidos a ouro (AT – cut, 4.95MHz, 14mm de diâmetro) para as

experiências de QCM-D foram fornecidos pela Q-Sense AB.

23

3.2. Preparação dos Lipossomas

O protocolo fornecido pela Avanti Polar Lipids, Inc. foi utilizado como suporte de apoio à preparação

dos lipossomas [189].

A quantidade de lípidos necessária para obter uma solução lipídica com concentração final de 3.195

mM, foi dissolvida em clorofórmio e, posteriormente, colocada num balão de fundo redondo. Após a

secagem da mistura lipídica no balão através de um fluxo brando de azoto, obteve-se um filme lipídico

seco e uniforme. O filme lipídico foi mantido sob vácuo, durante toda a noite, de forma a eliminar todos

os vestígios orgânicos do solvente.

Posteriormente, o filme lipídico foi hidratado com 10mL de tampão de HEPES e mantido em banho

termostatizado a 65ºC, durante uma hora. Durante os primeiros 10 minutos, o balão que contém o filme

lipídico seco foi submetido a agitação manual; no restante tempo, este balão foi submetido a agitação

vórtex, de 10 em 10 minutos, de forma obter a dissolução completa do filme. Por sua vez, o banho

termostatizado foi mantido a 65ºC, de forma a assegurar uma temperatura superior, em pelo menos

10ºC, à temperatura de transição de fase das jangadas lipídicas. Diversos estudos afirmam que a

temperatura de extrusão dos lipossomas POPC/SM (1:1) deve variar entre 65 a 70ºC, baseado no facto

da transição de fase da esfingomielina variar dos 37 a 55ºC [109, 118]. Após este processo, obteve-se

uma suspensão de vesículas multilamelares grandes (LMV’s); esta suspensão foi, então, submetida a

cinco ciclos de aquecimento/arrefecimento, usando o banho termostatizado a 65ºC e azoto líquido,

respetivamente, de forma a ocorrer a disrupção das LMV’s.

As vesículas unilamelares grandes (LUV’s) foram obtidas a partir da extrusão de LMV’s. Para tal, a

suspensão passou através de filtros de policarbonato, com tamanho de poro de 600, 200 e 100 nm,

cerca de 20 vezes, sequencialmente: 600 nm de diâmetro - 5 vezes, 200 nm de diâmetro - 5 vezes, e

100 nm de diâmetro - 10 vezes. No final de todo o processo, obtiveram-se as LUV’s com uma

distribuição de tamanho a variar entre120 a 140 nm.

A solução de lipossomas foi diluída, com tampão de HEPES, para uma concentração final 1.12 mM

e foi, posteriormente, armazenada a 4/5ºC e usada no período máximo de sete dias após a sua

preparação, uma vez que os lípidos possuem uma cadeia de hidrocarbonetos com ligações de éster

sujeitas a uma hidrólise espontânea e o POPC, em particular, possui duas cadeias de hidrocarbonetos

com ligações de éster [190].

3.3. Preparação de Soluções Peptídicas

O filme seco de péptido β-amilóide (25-35) foi preparado com a concentração final de 0.849 mM:

10 mg de Aβ25-35 (90% de Aβ25-35 + 10% de água e contra iões, para garantir que a neutralidade

elétrica do péptido é mantida) foram dissolvidos em HFIP, com o objetivo de evitar a agregação

peptídica, através de um septo de borracha, num volume final de 10 mL. Uma vez que o frasco do

péptido não suportava o volume final pretendido de HFIP, adicionou-se apenas uma parte deste

volume;

24

Após o péptido Aβ25-35 estar em solução, o septo de borracha foi perfurado com uma agulha,

de forma a libertar o vácuo existente;

A solução peptídica de Aβ25-35 em HFIP foi incubada à temperatura ambiente, durante 30

minutos. A solução final é límpida e incolor;

Seguidamente, removeu-se o septo de borracha, cuidadosamente, de forma a não permitir que

este entre em contacto com o HFIP;

Adicionou-se o restante volume de HFIP, até perfazer 10 mL;

A solução foi sujeita a agitação vórtex e ultrassons, durante 10segundos, de forma a assegurar

a solubilização total do péptido;

A solução-mãe de Aβ25-35 foi distribuída por 40 tubos Eppendorf (0.250 mL de solução-mãe em

cada);

Os tubos Eppendorf foram deixados abertos, na hote, durante toda a noite, de forma a evaporar

o HFIP;

Transferiram-se, depois, os tubos Eppendorf para o forno de vácuo e deixou-se a solução

peptídica secar, durante 1 hora, sem aquecimento. Este passo garantiu a remoção total de qualquer

vestígio de HFIP ou humidade;

O filme peptídico seco formado em cada tubo Eppendorf foi armazenado a -20ºC.

Preparou-se, posteriormente, uma solução peptídica com uma concentração final peptídica de

80µM:

Retirou-se o tubo Eppendorf, contendo o filme peptídico seco, do congelador e deixou-se

arrefecer, à temperatura ambiente, durante 30 minutos;

Adicionou-se 400 µL de tampão ao tubo Eppendorf, para dissolver o filme peptídico;

O tubo Eppendorf, seguidamente, foi sujeito a 10 segundos de ultrassons e 20 minutos de

agitação vórtex;

A solução peptídica foi colocada um tubo de polipropileno, previamente lavado com solução

tampão;

Adicionou-se novamente 1000 µL de solução tampão ao tubo Eppendorf que é novamente

sujeito a 20 minutos de agitação vórtex e, seguidamente, a solução é colocada no tubo de

polipropileno. Este passo é realizado duas vezes.

Adiciona-se, ao tubo de polipropileno que contém já a solução peptídica, o volume de tampão

necessário para perfazer o volume final de 4.080mL.

A solução peptídica preparada com uma concentração final de 80 µM foi, posteriormente, diluída,

usando tampão pH=7 ou pH=4, de forma a obter as concentrações peptídicas utilizadas nas diferentes

técnicas.

25

3.4. Preparação de Soluções Lipídicas

Preparou-se soluções de lípidos puros (POPC, esfingomielina e colesterol) com concentração final

de 0.5 mM:

A quantidade de lípido necessária foi pesada num balão de 5 mL;

O volume final de 5 mL foi acertado com uma solução de clorofórmio e metanol (4:1), de forma

a dissolver os lípidos;

A solução-mãe de cada lípido foi, então, distribuída em frascos e estes foram armazenados

4/5ºC.

3.5. QCM-D

O equipamento utilizado no desenvolvimento do presente trabalho foi a Q-Sense E4 (Q-Sense AB),

equipada com 4 câmaras de medida ligadas a uma bomba de fluxo (Ismatec IPC-N4).

Antes de cada ensaio na QCM-D, os cristais de quartzo revestidos a ouro (Figura 15) foram

submetidos a dois ciclos de exposição a UV-Ozono, no equipamento PSD Series UVOzone Cleaning

& Sterilization da Novascan. Após cada ciclo de exposição a UV-Ozono, com a duração de 15 minutos,

os cristais de quartzo foram lavados com água Milli-Q e, posteriormente, secos usando um fluxo brando

de azoto. Este processo de limpeza teve o objetivo de remover possíveis contaminantes presentes na

superfície dos cristais e torná-los mais hidrofílicos.

Figura 15. Esquema das camadas dos cristais de quartzo a usar na QCM-D, com revestimento. 1) Ouro, 2)

Crómico, 3) Quartzo.

O comportamento da frequência e da dissipação para a frequência de ressonância fundamental e

3º, 5º, 7º e 9º harmónica foram monitorizadas usando o software QSoft 401. No início de cada ensaio,

verificou-se que a dissipação para cada cristal, em ar, era próxima do valor expectável (35 x 10-6).

Cada ensaio iniciou-se com a realização de uma linha de base; esta foi obtida com a passagem de

tampão de HEPES a uma velocidade 0.100 mL/min, durante cerca de 7 minutos, seguida de 10 minutos

de estabilização. Verificou-se que a dissipação obtida estava dentro do desvio de 20% da dissipação

nominal para o valor da frequência fundamental para um meio aquoso (350 x 10-6).

Todos os ensaios foram realizados a 37ºC e a uma velocidade de 0.100 mL/min. Em todos os

ensaios, após o período de estabilização posterior à linha de base, monitorizou-se a passagem de 3

mL de solução de lipossomas (POPC/SM ou POPC/SM/Chol), com uma concentração de 1.12 mM.

26

Posteriormente à estabilização da frequência e da dissipação, faz-se passar tampão de HEPES,

durante 10 minutos, para enxaguamento (rinsing) da camada de lipossomas, isto é, para remover os

lipossomas que se encontravam fracamente adsorvidos ao cristal de quartzo. Após a estabilização,

adicionou-se 3 mL de solução peptídica ao sistema, deixando-se, novamente, estabilizar a dissipação

e a frequência. Por fim, faz-se uma nova passagem com tampão de HEPES, durante 10 minutos,

removendo assim as moléculas de péptido fracamente adsorvidas ou algumas moléculas de lípido

provenientes da eventual disrupção dos lipossomas.

Depois de cada ensaio, a QCM-D é sujeita a limpeza, com água Milli-Q, solução de dodecil sulfato

de sódio (SDS), novamente água Milli-Q, solução de 2% de Hellmanex, e, por fim, água Milli-Q e ar,

para remover vestígios de solução. Os cristais de quartzo usados em cada ensaio são colocados no

devido suporte numa solução SDS em água Milli-Q e sujeitos a ultrassons durante 10 minutos,

seguindo-se dois ciclos de 10 minutos em ultrassons apenas com água Milli-Q. No fim, os cristais de

quartzo são lavados novamente com água Milli-Q e secos através de um fluxo brando de azoto.

Para cada um dos ensaios realizados, analisou-se a variação da frequência e da dissipação para

as harmónicas 3, 5, 7 e 9, para a mesma composição lipídica, temperatura e concentração peptídica.

Na modelação viscoelástica, os dados obtidos foram tratados através do software QTools 3, para o

modelo de Voigt. Assim, considerou-se um filme com uma única camada e utilizou-se as harmónicas 3

a 9. Adaptaram-se os valores de visocidade e densidade da água (0.001 Pa.s e 1000 Kg/m3,

respetivamente) para o fluído e a densidade do filme de 1060 Kg/m3 [171]. No Quadro 1 encontram-se

os valores apropriados para os parâmetros estimados na modelação viscoelástica.

Quadro 1. Condições limite para estimar a viscosidade do filme, o módulo de distorção e a espessura no software QTools 3.

Parâmetro Valor mínimo Valor máximo Steps

Viscosidade (Pa.s) 0.0005 0.01 50

Módulo de Elasticidade (Pa) 1000 1x109 50

Espessura (m) 1x10-10 1x10-6 50

Foi, então, escolhida a melhor modelação para cada concentração em estudo, tendo em

consideração os valores mais baixos de Qui-Quadrado, bem como os dados que fazem sentido físico

para o modelo em estudo.

3.6. Balança de Langmuir

Utilizou-se um sistema KSV 5000 (KSV Instruments) constituído por uma micro tina de

politetrafluoretileno (PTFE) com área de 8400 mm2, um volume de 50 mL e equipada com uma barreira

móvel de PTFE, foi utilizada para obter as isotérmicas Pressão Superficial vs. Área por Molécula (𝜋-A)

dos lípidos puros (POPC, SM e Chol), das misturas lipídicas (POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1:)

e das misturas lipídicas em interação com o fragmento peptídico Aβ25-35, a diferentes concentrações.

27

Antes e depois de cada ensaio, procedeu-se à limpeza da microtina de PTFE, usando

dimetilsulfóxido (DMSO), etanol, água Milli-Q aquecida (≈50ºC) e água Milli-Q à temperatura ambiente.

Este procedimento de limpeza foi realizado cuidadosamente, de modo a garantir a total remoção de

resíduos de moléculas do ensaio ou vestígios de pó. A presença de possíveis contaminantes interferem

diretamente nos resultados obtidos, uma vez que se trata de um método experimental muito sensível,

sendo crucial a sua remoção. Posteriormente ao processo de limpeza, a micro tina foi preenchida por

tampão (HEPES para pH=7 ou ácido acético/acetato de sódio para pH=4). A temperatura foi mantida a

25ºC ± 1ºC. A pressão superficial foi medida usando uma placa de Wilhelmy. A ausência de

contaminantes na subfase foi verificada através da variação da pressão superficial do tampão,

comprimindo a subfase; esta variação não deve ser superior a 0.1 mN/m (𝜋 ≃ 0) antes do espalhamento

da solução lipídica ou peptídica.

O espalhamento das soluções lipídicas foi realizado usando uma microseringa. Este procedimento

deve ser realizado cuidadosamente, para garantir que os lípidos ficam na interface ar/líquido da subfase

aquosa. Posteriormente, fez-se 15 minutos de estabilização, onde ocorre a evaporação do solvente,

onde ocorre a interação das moléculas lipídicas. No caso das soluções peptídicas (0.25, 0.5, 1, 2 e 4

µM), estas são injectadas diretamente na subfase aquosa, usando uma microseringa. Neste caso, o

tempo de estabilização é de 75 minutos, onde o péptido Aβ25-35 difunde de forma homogénea na

subfase aquosa. Na interação lípido-péptido, primeiro foi injetado o péptido na subfase e, após 15

minutos de estabilização, foi realizado o espalhamento das soluções lipídicas na interface ar/líquido na

subfase aquosa. Neste caso, a evaporação da subfase decorre durante mais 60 minutos onde ocorre

a difusão do péptido de forma homogénea e a interação do mesmo com as moléculas lipídicas.

Posteriormente aos tempos de estabilização, procedeu-se à compressão lenta da monocamada a

uma velocidade de 10 mm/min monitorizando-se a variação da pressão superficial em função da área

ocupada por molécula.

No Quadro 2 são apresentadas as concentrações das misturas lipídicas utilizadas nos ensaios da

Balança de Langmuir.

Quadro 2. Concentrações usadas para lípidos e misturas lipídicas nas isotérmicas 𝝅-A.

POPC SM Chol POPC/SM (1:1) POPC/SM/Chol (1:1:1)

0.582 mM 0.659 mM 0.786 mM 0.615 mM 0.661 mM

Foi, então, possível estudar o comportamento das monocamadas lipídicas na presença e na

ausência do fragmento peptídico β-amilóide (25-35) a diferentes concentrações.

Foram realizadas sempre, no mínimo, três isotérmicas para cada lípido puro, mistura lipídica e

mistura peptídica, de forma a testar a sua reprodutibilidade, obtendo um desvio padrão inferior a 6%.

28

3.7. NTA

Os ensaios de Análise de Localização de Nanopartículas foram realizados usando um microscópio

e o software Capture, para visualização da solução em análise.

Foram preparados 2 mL de solução peptídica com concentrações finais de 1, 4 e 25 µM a pH=4 e a

pH=7 a 22ºC. O tampão de HEPES e o tampão de ácido acético/acetato de sódio usados para

preparação das soluções peptídicas foram sujeitos a centrifugação no equipamento Hermile Z323K,

usando filtros Centrifugal Filters Units, Amicon Ultra, durante 40 minutos a 20ºC e 8000 rpm.

Posteriormente, os tampões foram filtrados, duas vezes, com filtros da Chromafil® Xtra PVDF-20/25,

de tamanho de poro de 0.20 µm. Os tampões foram filtrados com o objetivo de evitar a presença de

poeiras em solução, uma vez que estas interferem diretamente com os resultados obtidos a partir da

técnica de NTA.

Injetou-se água Milli-Q através de uma seringa para verificar que não existia resíduos de outras

soluções na camara. Seguidamente, injetou-se, com cuidado para evitar a existência de bolhas de ar,

o volume suficiente de solução peptídica a analisar para preencher totalmente a camara. Realizaram-

se 15 medições para cada concentração de péptido a pH=4 e pH=7; entre cada medição, a amostra

em análise foi agitada com um pequeno toque na seringa para fazer passar a amostra de modo a evitar

que as 15 medições fossem realizadas sempre no mesmo local. As medições foram realizadas com

um nível de contraste de câmara de 8 e cada medição teve a duração de 90 segundos. Após cada

ensaio, lavou-se a camara com água Milli-Q até todos os resíduos de solução serem removidos da

mesma.

A partir do software Capture, obteve-se o gráfico da distribuição da concentração de fragmentos

presentes na solução peptídica em função do tamanho destas. Obteve-se, ainda, a quantidade de

péptido presente em cada concentração em estudo.

3.8. DSC

Realizaram-se 6 ciclos de varrimento, num intervalo de temperatura de 10ºC a 50ºC, três em

aquecimento e três em arrefecimento, a uma velocidade de 60ºC/hora, de modo a verificar a

reprodutibilidade dos resultados e a estabilização termodinâmica da amostra em análise. Antes de cada

ciclo, as amostras passam por um período de termostatização de 15 minutos. Estes parâmetros são

definidos através do software VP Viewer Experimental Parameter.

As medidas foram realizadas através do VP-DSC Micro-Calorimeter, da MicroCal®. Este

equipamento possui duas células: célula de referência e célula de amostra. A célula de referência é

preenchida com 0.5105 mL de tampão de HEPES 10 mM e a célula de amostra com 0.5105 mL das

diferentes amostras em análise. O enchimento destas células foi realizado usando uma seringa de

vidro. Após o seu enchimento, utilizou-se uma seringa de plástico de ajuste para retirar o excesso de

volume em ambas as células. A pressão na célula de referência e na célula de amostra é de 26 psi.

29

As amostras contendo lipossomas ou lipossomas e péptido β-amilóide foram preparadas

imediatamente antes da sua injeção diluindo o volume necessário de solução de lipossomas, usando o

tampão de HEPES, para uma concentração final de lipossomas de 1.12 mM. As amostras contendo

péptido β-amilóide foram preparadas com as seguintes concentrações peptídicas: 10, 25, 50 e 80 µM.

A amostra de tampão de HEPES 10 mM foi sujeita a desgaseificação, através do ThermoVac, da

MicroCal®, durante cerca de 10 minutos, de modo a minimizar a existência de bolhas de ar na amostra.

Quanto às amostras contendo lipossomas, estas não foram sujeitas a desgaseificação, uma vez que

os lipossomas são muito sensíveis e pode ocorrer a sua disrupção

No fim de cada ensaio, os termogramas obtidos foram analisados e modelados através do software

Origin 7.0, da OriginLab Corporation. A todos os termogramas obtidos foi subtraído o termograma

referente à linha de base do tampão de HEPES. Obteve-se, assim, a temperatura de transição de fase

para cada mistura de lipossomas e péptidos em estudo.

3.9. Dicroísmo Circular

Os espectros de dicroísmo circular do fragmento peptídico β-amilóide (25-35) em estudo foram

obtidos através do equipamento Applied Photophysics π*-180. Primeiro, registaram-se as linhas de

base com tampão de ácido acético/acetato de sódio 13mM, para o estudo a pH=4, e com tampão de

HEPES 10mM, para o estudo a pH=7. Realizaram-se 20 medições a comprimentos de onda entre 185

a 250 nm, para pH=4, e 195 e 250 nm, a pH=7, e espaçadas de 0.25 segundos. A diferença entre as

gamas de comprimento de onda utilizados nestes ensaios deve-se à concentração dos tampões usados

para cada pH, uma vez que estes interferem diretamente nos resultados dados pelo equipamento.

Estes ensaios foram efetuados a 21ºC, com uma largura de banda de 10 nm e um passo de 2.5 nm.

Os espectros de dicroísmo circular obtidos foram tratados através do software Pro-Data PiStar.

A solução peptídica em análise foi preparada com uma concentração final de 80 µM.

30

Capítulo IV – Resultados e Discussão

4.1. Caracterização dos Modelos Lipídicos

QCM-D

Na Figura 16 encontra-se um exemplo da variação da frequência e da dissipação da harmónica 3

durante uma experiência de adsorção de lipossomas a um cristal de quartzo. A escolha da harmónica

3 deveu-se a esta apresentar bons resultados, sem contribuições significativas de ruído devido a

oscilações exteriores. Além disso, é a harmónica com maior profundidade de penetração, permitindo

assim obter informação relativamente às características da interface/cristal.

Figura 16. Exemplo da variação da frequência (azul) e da dissipação (vermelho) da harmónica 3 para uma

experiência típica de adsorção de lipossomas no cristal de quartzo, a 37ºC e pH=7. Esquerda: POPC/SM (1:1), 1.12 mM; Direita: POPC/SM/Chol (1:1:1), 1.12 mM.

Observa-se uma variação negativa da frequência, seguida de uma estabilização, para ambas as

composições de lipossomas, embora na mistura ternária esta variação seja maior. Ao mesmo tempo,

verifica-se uma variação positiva na dissipação, seguida de estabilização. Este comportamento é

compatível com a formação de um filme de lipossomas na superfície do cristal de quartzo revestido a

ouro [107, 161, 162, 191-193]. Observa-se que em ambas as misturas lipídicas não há variação da

frequência nem dissipação após o enxaguamento, significando que a camada de lipossomas se

encontra devidamente adsorvida à superfície do cristal de quartzo. A dissipação na mistura

POPC/SM/Chol (1:1:1) é sempre superior à dissipação na mistura POPC/SM (1:1), estando este

comportamento de acordo com o facto da camada de lipossomas POPC/SM/Chol (1:1:1) ser mais

viscoelástica e dissipativa comparativamente com a camada lipídica na ausência de colesterol.

-10

0

10

20

30

40

50

60

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

0 20 40 60 80

ΔD

3(1

x10

-6)

Δf 3

(Hz)

Tempo (minutos)

Enxaguamento

POPC/SM (1:1)

-10

0

10

20

30

40

50

60

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

0 20 40 60 80

ΔD

3(1

x10

-6)Δf 3

(Hz)

Tempo (minutos)

Enxaguamento

POPC/SM/Chol (1:1:1)

31

Figura 17. Valor médio e desvio padrão da variação da frequência (esquerda) e dissipação (direita) da harmónica

3 para a mistura binária POPC/SM (1:1) e para a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) 1.12 mM, a 37ºC e pH=7.

Na Figura 17 mostra-se a média e o desvio padrão da variação da frequência e da dissipação para

as duas misturas em estudo, a 37ºC e pH=7. O efeito do colesterol é evidente, uma vez que há uma

diferença considerável entre as duas misturas. Segundo Viitala et al., os lipossomas não apresentam

um comportamento rígido, ficando com uma forma achatada após a adsorção destes a uma superfície

de ouro, sendo que os lipossomas menos rígidos têm maior facilidade para achatarem [168]. Este

comportamento explica a diferença entre a variação de frequência da mistura POPC/SM (1:1) e

POPC/SM/Chol (1:1:1). A camada lipídica formada pela mistura de POPC/SM (1:1), a 37ºC e pH=7,

encontra-se na fase lamelar líquida-desordenada (Ld), havendo maior deformação dos lipossomas.

Assim, a área ocupada por estes lipossomas achatados é maior, deixando menos espaço para que

outros lipossomas adsorvam à superfície. Consequentemente, a massa de lipossomas POPC/SM

adsorvida é menor, traduzindo-se numa variação de frequência menor, comparativamente aos

lipossomas POPC/SM/Chol (1:1:1).

Relativamente ao aumento da dissipação, na injeção dos lipossomas, trata-se de uma característica

típica de uma camada viscoelástica. Desse modo, tornou-se necessário a modelação dos resultados

obtidos através da QCM-D. Através do software QTools 3, foi possível modelar os dados obtidos nos

ensaios e obter-se o valor da espessura e da viscosidade da bicamada lipídica formada nos cristais de

quartzo (Figura 18), aplicando um modelo viscoelástico, em oposição ao modelo Sauerbrey que se

utiliza para filmes rígidos [106, 168, 192, 194].

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM (1:1) POPC/SM/Chol (1:1:1)Δ

f 3(H

z)

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM (1:1) POPC/SM/Chol (1:1:1)

ΔD

3(1

x10

-6)

32

Figura 18. Espessura (esquerda) e viscosidade (direita) da bicamada lipídica de POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol

(1:1:1), 1.12 mM, a 37ºC e pH=7.

A mistura binária POPC/SM (1:1) forma uma bicamada lipídica com espessura de 106 ± 2 nm e a

mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) com espessura de 104 ± 2 nm. Verifica-se que a diferença entre

as espessuras das duas misturas é pouco significativa. No entanto, esperava-se que houvesse uma

diferença, uma vez que na mistura de POPC/SM (1:1) os lipossomas, após a adsorção, estão mais

deformados do que os lipossomas de POPC/SM/Chol (1:1:1). Assim, os resultados obtidos podem estar

diretamente influenciados pelas hipóteses feitas na modelação relativamente aos valores da densidade

do filme. Contrariamente, a viscosidade da bicamada lipídica aumenta com a presença do colesterol.

Na ausência de colesterol a bicamada lipídica tem uma viscosidade de 2.0 ± 0.1 mPa.s, aumentando

para 2.6 ± 0.2 mPa.s na presença de colesterol. Tal como verificado anteriormente [191], a presença

de colesterol na mistura lipídica conduz à formação de uma camada adsorvida de lipossomas de maior

viscosidade. Relativamente ao módulo de elasticidade, não foi possível obter este parâmetro para as

duas camadas lipídicas. Contudo, de acordo com a literatura, os lipossomas de POPC/SM/Chol (1:1:1)

apresentam um comportamento mais rígido, comparativamente com os lipossomas de POPC/SM (1:1),

devido à conformação molecular que o colesterol apresenta [195, 196].

Balança de Langmuir

Para caracterizar os modelos lipídicos, é necessário primeiro caracterizar os lípidos puros que

constituem as misturas lipídicas (Colesterol, Esfingomielina e POPC) e posteriormente caracterizar a

interação entre estes lípidos puros nas duas misturas lipídicas. Assim, na Figura 19 são apresentadas

as isotérmicas dos lípidos puros (curvas continuas) e das misturas lipídicas (curvas descontínuas), a

pH=7 e 25ºC.

0

20

40

60

80

100

120

140


Espessura

(nm

)

0

1

2

3

4

5


Vis

cosid

ade (

mP

a.s

)

33

Figura 19. Isotérmicas -A a 25ºC, numa subfase aquosa, a pH=7. Lipidos Puros (curvas contínuas): POPC (curva

1), esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3). Misturas Lipídicas (curvas descontínuas): POPC/SM (1:1) (curva

4) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (curva 5).

Comparando as isotérmicas correspondentes aos três lípidos puros (curvas 1 a 3, Figura 19)

verifica-se que o colesterol forma mais facilmente uma monocamada densa, devido à sua conformação

molecular, uma vez que este lípido apresenta uma conformação molecular rígida e pouco flexível devido

aos quatro anéis que possui. A área ocupada por uma molécula de POPC é maior que a área ocupada

por uma molécula de esfingomielina ou uma molécula de colesterol para pressões superficiais iguais.

O POPC é um lípido que possui uma cadeia acídica insaturada que não permite a formação de uma

monocamada tão densa como as monocamadas de esfingomielina ou de colesterol [179]. Durante o

processo de compressão, as moléculas lipídicas tendem a orientar-se perpendicularmente à interface

de modo a alcançarem uma conformação mais densa [198]. O comportamento das isotérmicas dos

lípidos puros POPC, esfingomielina e colesterol está de acordo com o comportamento apresentado

para estes lípidos por outros autores [199-203].

O valor da área molecular média a =0 designa-se vulgarmente por “lift-off” e representa-se por A0.

O “lift-off” corresponde ao estado em que a pressão superficial da monocamada começa a aumentar

quando comprimida. As isotérmicas -A da esfingomielina e do POPC indicam a formação de

monocamadas do tipo líquido-expandido a baixas pressões superficiais, uma vez que se observa um

declive menor. A isotérmica -A do colesterol apresenta-se muito abrupta, o que corresponde à

formação de uma monocamada muito densa e incompressível do tipo sólido, uma vez que o colesterol

tem a capacidade de formar uma monocamadas muito mais densa que o POPC e a esfingomielina. Por

outro lado, a zona final da isotérmica corresponde ao colapso da monocamada, isto é, à rutura da

monocamada destes lípidos ou ao colapso do estado organizado das moléculas lipídicas. Verifica-se

que o colapso da monocamada de POPC ocorre a pressões superficiais mais baixas que o colapso da

monocamada de esfingomielina. Esta situação deve-se a uma transição de fase do estado líquido-

expandido para um estado líquido-condensado das moléculas de esfingomielina, em que as moléculas

de esfingomielina se organizam de uma forma mais compacta. Esta transição de fase da esfingomielina

ocorre entre 20 e 30 mN/m. A transição de fase verificada na esfingomielina foi também observada por

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)

Área ocupada por molécula de lípido (Å2/molécula)

3

2

1

45

34

outros autores, tendo sido confirmada usando outras técnicas, como BAM (Brewster Angle Microscop)

ou microscopia de flurescência [197, 202]. No Quadro 3 são apresentados os valores do A0 e do colapso

das monocamadas dos lípidos puros.

Verifica-se na Figura 19 (curva 4 e 5) que a presença do colesterol em interação com POPC e a

esfingomielina conduz a um desvio da isotérmica para menores áreas, comparativamente à mistura

lipídica binária POPC/SM (1:1), ao mesmo valor de pressão superficial. Este comportamento deve-se

ao efeito condensante que o colesterol apresenta, tornando a monocamada mais densa e compacta.

O colesterol comporta-se como uma molécula moduladora, quando as moléculas se encontram num

estado desordenado, apresentando o seu efeito condensante [200]. O valor de A0 da isotérmica da

mistura lipídica POPC/SM (1:1) é de 103 Å2/molécula e da isotérmica da mistura lipídica POPC/SM/Chol

(1:1:1) é de 75 Å2/molécula. O colapso da monocamada da mistura POPC/SM (1:1) e da monocamada

da mistura POPC/SM/Chol (1:1:1) ocorre a 44 mN/m.

O comportamento apresentado pelas isotérmicas das misturas lipídicas POPC/SM (1:1) e

POPC/SM/Chol (1:1:1) demonstra que ambas as misturas lipídicas formam uma monocamada no

estado líquido-expandido. As monocamadas destas misturas lipídicas não atingem o estado líquido-

condensando, uma vez que a ligação dupla do POPC impede que ocorra uma organização mais

compacta da monocamada, inibindo a transição de fase da esfingomielina.

Com o objetivo de confirmar o comportamento da isotérmica da mistura binária POPC/SM (1:1) e

da mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), calculou-se a isotérmica teórica, a pH=7, destas misturas a

partir da combinação linear das isotérmicas dos lípidos puros, tendo em conta a proporção equimolar

em que se encontram (Figura 20 e Figura 21, respetivamente).

Figura 20. Isotérmica -A experimental vs. Isotérmica -A teórica, a 25ºC e numa subfase aquosa a pH=7. Lípidos

Puros: POPC (curva 1) e esfingomielina (curva 2). Linha Descontínua: POPC/SM (1:1) Teórica.

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)


2

1

POPC/SM (1:1)

35

Figura 21. Isotérmica -A experimental vs. Isotérmica -A teórica, a 25ºC e numa subfase aquosa a pH=7. Lípidos

Puros: POPC (curva 1), esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3). Linha Descontínua: POPC/SM/Chol (1:1:1) Teórica.

Na mistura binária POPC/SM (1:1) (Figura 20) verifica-se que há uma contribuição equivalente dos

dois lípidos na isotérmica da mistura, uma vez que se verifica uma sobreposição quase completa entre

as duas isotérmicas. Este resultado é compatível tanto com uma mistura ideal como com uma

separação de fases. No entanto, o ligeiro desvio que se observa a pressões superficiais mais elevadas

é consequência da inibição da transição de fase que ocorre devido à presença do POPC em interação

com a esfingomielina, confirmando uma miscibilidade parcial dos dois lípidos.

No caso da mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) (Figura 21) verifica-se um desvio negativo

bastante significativo da isotérmica experimental, relativamente à isotérmica teórica. Este

comportamento deve-se ao facto da isotérmica teórica da mistura POPC/SM/Chol (1:1:1) ser calculada

tendo em conta as áreas dos componentes puros em separado, isto é, admite o comportamento ideal

dos lípidos na mistura ternária. Deste modo, a isotérmica teórica é calculada sem ter em conta o efeito

condensante do colesterol, sendo este o efeito que conduz ao desvio da isotérmica experimental para

menores áreas.

Com o objetivo de compreender o efeito do pH, estudou-se também o comportamento das

isotérmicas de POPC, esfingomielina, colesterol e das misturas lipídicas POPC/SM (1:1) e

POPC/SM/Chol (1:1:1) a pH=4 e 25ºC (Figura 22).

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)


2

13

POPC/SM/Chol(1:1:1)

36

Figura 22. Efeito do pH nas isotérmicas -A dos lípidos puros, numa subfase aquosa: POPC (curva 1), esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3) (A.), e nas isotérmicas das misturas lipídicas POPC/SM (1:1) (curva 4) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (curva 5) (B.), a pH=4 (linha descontínua) e pH=7 (linha contínua) e 25ºC.

Na Figura 22A. observa-se o efeito do pH nas isotérmicas dos lípidos puros POPC, esfingomielina

e colesterol. Verifica-se que o pH influência de forma contrária o comportamento da monocamada de

POPC e de esfingomielina. A pH=4, a isotérmica da esfingomielina desvia para valores maiores de área

ocupada por molécula, enquanto a isotérmica do POPC desvia para valores de área menores. Por outro

lado, o comportamento da isotérmica do colesterol não sofre qualquer influência com a variação do pH.

Os valores de A0 e da pressão de colapso das monocamadas dos lípidos puros são apresentados

no Quadro 3, para pH=4 e pH=7.

Quadro 3. Valores de A0 e da pressão superficial do colapso das monocamadas dos lípidos puros (Colesterol,

Esfingomielina e POPC), a pH=4 e pH=7 e 25ºC.

Lípidos A0 (Å2/molécula) Colapso (mN/m)

pH=4 pH=7 pH=4 pH=7

Colesterol 44 ± 1 44 ± 2 42 ± 2 43 ± 1

Esfingomielina 93 ± 3 85 ± 2 54 ± 3 55 ± 1

POPC 116 ± 1 127 ± 1 44 ± 2 45 ± 1

Através do Quadro 3 é possível verificar o que foi afirmado anteriormente. Para a esfingomielina e

para o POPC observa-se uma variação do A0 das isotérmicas para menores e maiores áreas,

respetivamente, quando o pH é mais ácido. Assim, verifica-se que a pH=4 a esfingomielina atinge o

estado líquido-expandido a áreas mais elevadas, comparativamente a pH=7. Tal como acontece a

pH=7, verifica-se uma transição de fase de estado líquido-expandido para um estado líquido-

condensado entre 20 e 30 mN/m. O POPC, por sua vez, atinge o estado líquido-expandido a áreas

menores a pH=4, comparativamente a pH=7. Relativamente ao colapso, não se observa um efeito da

variação do pH, uma vez que não se verificam diferenças significativas entre os valores de cada lípido.

Este comportamento significa que a variação do pH não influencia significativamente a energia de

coesão da monocamada; o colapso depende da estabilidade da monocamada e das interações

moleculares existentes entre as moléculas que formam a monocamada.

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)


3

2

1

A.

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)


5

4

B.

37

Contrariamente ao que se verifica nos lípidos puros, não se verifica um efeito significativo da

variação do pH nas misturas lipídicas POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (Figura 22B.), uma vez

que se observa uma sobreposição quase completa das isotérmicas a pH=4 e pH=7. O efeito

condensante do colesterol, em interação com a esfingomielina e o colesterol é igual a pH=4 e a pH=7,

tal como era esperado uma vez que não se observou influência do pH na isotérmica do colesterol

(Figura 22A.). As variações verificadas a pH=4 no POPC e na esfingomielina são compensatórias entre

elas, não levando a um desvio da isotérmica da mistura binária a pH=4.

O comportamento das isotérmicas destas misturas lipídicas está de acordo com outros autores que

estudaram estas monocamadas numa subfase a pH=6, permitindo afirmar que a variação do pH não

influência de forma muito significativa as isotérmicas do POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1) no

estado puro [197, 199, 204].

DSC

O termograma da mistura lipídica binária POPC/SM (1:1) e da mistura lipídica ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1), a 1.12 mM e pH=7, encontram-se representados na Figura 23.

Figura 23. Termograma dos lipossomas em suspensão da mistura binária POPC/SM (1:1) (cinzento escuro) e da

mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) (cinzento claro) 1.12 mM, em HEPES (pH=7).

Na mistura binária POPC/SM (1:1), observa-se um pico largo que inicia a temperaturas inferiores a

10ºC, fora do intervalo de temperaturas que o calorímetro permite analisar, e termina perto dos 37ºC.

O pico correspondente à temperatura de transição de fase desta mistura é a 23,75ºC.

Segundo Ausili et al. [205], POPC é um lípido insaturado e apresenta uma temperatura de fusão de

-3ºC. A esfingomielina, por sua vez, sofre uma transição de fase de gel para uma fase líquida cristalina

com uma temperatura de fusão de 38ºC, em que o início desta transição ocorre a 32ºC. A mistura

destes dois lípidos, numa proporção equimolar, alarga a transição de fase da mistura lipídica.

Comparando os resultados por nós obtidos com os resultados de Ausili et al. [205], verifica-se que a

transição de fase demonstrada pelo pico do termograma de POPC/SM (1:1) termina perto da Tt da

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Cp (

kC

al/ºC

/mol)

Temperatura (ºC)


POPC/SM (1:1)

38

esfingomielina. Assim, é possível concluir que a mistura binária apresenta-se como um sistema

heterogenio com um domínio rígido mais rico em esfingomielina e outro domínio fluído rico em POPC.

Na presença do colesterol, não é possível observar nenhum pico no termograma, dentro do intervalo

de temperaturas estudado, que evidencie a existência de uma transição de fase para a mistura ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1). Este resultado está de acordo com outros autores que afirmam que o colesterol

estabiliza domínios ordenados líquidos uma vez que existe uma interação preferencial com as cadeias

de acilo da esfingomielina. A uma temperatura superior à temperatura de transição de fase, o colesterol

interfere com o movimento das cadeias de ácidos gordos dos fosfolípidos, tornando a membrana

lipídica menos fluída [114, 207-209].

4.2. Caracterização das soluções peptídicas


De modo a compreender a influência da concentração do péptido β-amilóide (25-35) em solução,

sem contacto com lípidos, recorreu-se à Balança de Langmuir para traçar as isotérmicas 𝜋-A a três

concentrações peptídicas diferentes: 1 µM, 2 µM e 4 µM (Figura 24). Apresentam-se os resultados para

pH=7, uma vez que não se verificaram diferenças significativas para pH=4, a 25ºC.

Figura 24. Isotérmica -A do fragmento peptídico Aβ25-35, a 25ºC, numa subfase aquosa a pH=7, para as

concentrações de 1, 2 e 4 µM de péptido β-amilóide (25-35).

Na Figura 24 verifica-se que ocorre a formação de uma monocamada de Gibbs, uma vez que o

fragmento peptídico Aβ25-35 tem um comportamento anfifílico solúvel em água. Independentemente da

concentração de péptido, não se verifica o colapso das monocamadas, o que significa que o que pode

estar a acontecer ao longo da compressão é o aumento da espessura da monocamada adsorvida na

interface ar/líquido, formando-se camadas múltiplas em cima umas das outras.

Verifica-se que para concentrações de 1 µM em péptido dissolvido na subfase, a pressão superficial

da monocamada não é significativamente afetada (≈0) porque a concentração superficial de péptido

-5

5

15

25

35

45

0 20 40 60 80

Pre

ssã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)

Área da superfície (cm2)

4µM Aβ25-35

2µM Aβ25-35

1µM Aβ25-35

39

Aβ25-35 é muito baixa. O aumento da concentração de péptido Aβ25-35, aumenta consequentemente a

concentração superficial da monocamada de péptido que se forma na interface ar/líquido. Assim, por

exemplo, para para uma área por molécula de 60 cm2/molécula só a 4 µM há uma concentração

superficial suficientemente elevada para conduzir ao aumento da pressão superficial. A uma área por

molécula mais baixa, como 25 cm2/molécula, a concentração superficial da monocamada é suficiente

para alterar a pressão superficial da interface ar/líquido, independentemente da concentração

peptídica.

Dicroísmo Circular

A estrutura secundária apresentada pelo fragmento peptídico β-amilóide (25-35) a pH=4 e pH=7 foi

estudada por Dicroísmo Circular (Figura 25).

Figura 25. Espectro de dicroísmo circular do fragmento peptídico Aβ25-35 80 µM, a pH=4 (esquerda) e pH=7

(direita).

No espectro de dicroísmo circular a pH=4 (Figura 25, à esquerda) obteve-se um pico mínimo a 198

nm, não se observando nenhum pico máximo significativo no espectro. Segundo estudos desenvolvidos

por outros autores, conclui-se que a pH=4 o péptido Aβ25-35 apresenta uma conformação

maioritariamente em espiral aleatória [210, 211].

Por outro lado, no espectro de dicroísmo circular a pH=7 (Figura 25, à direita) observa-se um pico

máximo a 203 nm e um pico mínimo a 228 nm, estando estes valores de acordo com os valores obtidos

por outros autores [126, 140, 212].

Segundo Labbé et al. [140], a forma do espectro do péptido Aβ25-35 a pH=7 corresponde a um

predomínio da conformação volta β, característica de soluções com baixas concentrações peptídicas.

Em soluções com elevada concentração peptídica, como é o presente caso, a estrutura secundária

predominante é a folha β. A estrutura secundária adotada pelo péptido depende diretamente da

concentração de péptido em solução [210, 213].

As diferenças encontradas na intensidade dos espectros de dicroísmo circular podem ser

justificadas pelo fato da agregação peptídica influenciar o espectro obtido, uma vez que um aumento

de agregados peptídicos conduz a uma diminuição da intensidade do espectro de dicroísmo circular

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

185 195 205 215 225 235 245

[Θ].

10

-3(d

eg.c

m2.d

mo

l-1)

Comprimento de Onda (nm)

pH=4

-50

-30

-10

10

30

50

195 205 215 225 235 245

[Θ].

10

-3(d

eg.c

m2.d

mo

l-1)

Comprimento de Onda (nm)

pH=7

40

[210]. A pH=4 observam-se muitos agregados de menores dimensões, comparativamente a pH=7, o

que justifica a intensidade do espectro para pH=4 ser muito menor.

NTA

Considerando que os agregados peptídicos formados em solução apresentam uma forma esférica

com densidades semelhantes, foi possível estimar o número de fragmentos presentes às

concentrações em estudo a pH=4 e pH=7, a 22ºC (Figura 26).

Figura 26. Efeito do pH no número de agregados de fragmento peptídico Aβ25-35 em solução a 1, 4 e 25 µM, a

22ºC. pH=4: Cinzento escuro; pH=7: Cinzento claro.

Não se verificam diferenças significativas no número de fragmentos com a variação do pH, tal como

era expectável. O objetivo era demonstrar que as soluções peptídicas são preparadas da mesma forma

para os dois pH’s em estudo, não influenciando o número de fragmentos peptídicas em solução e

consequentemente não influenciando os resultados obtidos nas restantes técnicas em que se variou o

pH. Além disso, verifica-se, tal como era esperado, um aumento no número de fragmentos com o

aumento da concentração de péptido em solução, havendo cerca de 9 x 10-7 fragmentos peptídicos/mL

a 1 µM, 2 x 10-6 fragmentos peptídicos/mL a 4 µM e 4 x 10-5 fragmentos peptídicos/mL 25 µM.

Não se verifica uma variação linear do número de fragmentos peptídicos com o aumento da

concentração de Aβ25-35, isto é, a massa detetada pela técnica de NTA nos domínios observados não

varia linearmente com a variação da concentração peptídica. Este comportamento pode significar que

a técnica de NTA não deteta o péptido no estado monomérico. A baixas concentrações peptídicas,

Aβ25-35 adota um estado monomérico ou um tamanho de agregados que não é detetado pela técnica

de NTA.

Estas conclusões permitem assim estudar a influência do pH na agregação peptídica, comparando

a concentração do tamanho mais provável de partículas em função do seu tamanho a pH=4 e pH=7, a

22ºC, e concentrações 1, 4 e 25 µM (Figura 27).

0,0E+00

1,0E-05

2,0E-05

3,0E-05

4,0E-05

5,0E-05

1 µM 4 µM 25 µM

Núm

ero

de fra

gm

ento

s p

eptídic

os/m

L

41

Figura 27. Efeito do pH na agregação peptídica a 1 µM (roxo), 4 µM (vermelho) e 25 µM (verde) de fragmento

peptídico Aβ25-35, a 22ºC. pH=4: Linha descontínua; pH=7: Linha contínua.

Através da Figura 27, verifica-se que o pH influencia diretamente o tamanho dos agregados do

fragmento peptídico β-amilóide (25-35). Independentemente da concentração do péptido, verifica-se

que a pH=7 os agregados peptídicos são consideravelmente maiores do que a pH=4, isto é, a pH=4 o

péptido apresenta uma menor tendência de agregação, estando este resultado de acordo com Loew

[139]. Este comportamento está de acordo com o observado no Dicroísmo Circular (Figura 25), em que

a pH=7 há maioritariamente uma conformação em folha β, havendo uma maior facilidade de formam

agregados.

Para concentrações peptídicas mais baixas (1 e 4 µM), verifica-se que a distribuição de tamanho

dos agregados peptídicos é mais alargada, variando entre 50 e 800 nm. Para a concentração peptídica

mais elevada (25 µM), verifica-se que a distribuição de tamanho dos agregados é mais estreita,

comparativamente às concentrações mais baixas, variando entre 50 e 500 nm. A largura da distribuição

de tamanho dos agregados peptídicos pode estar relacionada com o processo de nucleação muito lento

e um crecimento muito rápido. Assim, a maiores concentrações peptídicas existem muitos núcleos em

solução, pelo que se formam mais agregados mas de menores tamanhos em relação a concentrações

peptídicas mais baixas.

Em ambos os pH’s em estudo verificou-se uma concentração média de 0.03 x 106 partículas/ml

para 1 µM de fragmento peptídico Aβ25-35 e de 0.05 x 106 partículas/ml para 4 µM. Para 25 µM de

fragmento peptídico Aβ25-35, verifica-se um aumento da concentração do tamanho mais provável para

0.5 x 106 partículas/ml a pH=4 e 0.65 x 106 partículas/ml para pH=7, sendo este aumento expectável

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 500 1000

Concentr

ação M

édia

(10

6part

ícula

s/m

l)

Tamanho de Partícula (nm)

1µM Aβ25-35

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 500 1000

Concentr

ação M

édia

(10

6part

ícula

s/m

l)


4µM Aβ25-35

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 500 1000

Concentr

ação M

édia

(10

6part

ícula

s/m

l)


25µM Aβ25-35

42

em relação às outras duas concentrações em estudo. Para esta concentração existe um grande número

de partículas em solução (ver Figura 26) permitindo a formação de muitos agregados de tamanhos

distintos. Nas concentrações de 1 e 4 µM o número de partículas em solução é significativamente

menor, formando-se menos agregados em relação à concentração de 25 µM, mas de maior tamanho.

DSC

Através da Calorimetria Diferencial de Varrimento, estudou-se a temperatura de transição do

fragmento peptídico β-amilóide (25-35) a 50 µM e pH=7 (Figura 28).

Figura 28. Termograma do péptido β-amilóide (25-35) 50µM, a pH=7.

No termograma da Figura 28, não se observa nenhum pico característico de uma transição de fase

do fragmento peptídico β-amilóide (25-35). Este resultado está de acordo com o esperado a partir dos

resultados obtidos por Dicroísmo Circular, uma vez que estes demonstram que nestas condições o

péptido adota a conformação folha β, não ocorrendo uma transição de fase de hélice α para folha β.

No entanto, Chu et al. [214] afirmam que a variação da temperatura conduz a uma variação da

conformação do péptido. Através da técnica de Espectroscopia FT-IR, os autores concluíram que o

aquecimento da solução peptídica (de 25 a 120ºC) conduz à formação de estruturas em folha β. Os

autores afirmam ainda que o péptido Aβ1-40 possui propriedades térmicas irreversíveis e uma baixa

estabilidade térmica, com uma temperatura de transição de 45ºC.

4.3. Efeito do Péptido β-amilóide nas misturas lipídicas

QCM-D

Estudou-se o efeito da interação entre a mistura binária POPC/SM (1:1) e a mistura ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1) com o fragmento peptídico β-amilóide (25-35), a pH=7 e 37ºC. A utilização

destas duas misturas lipídicas teve o objetivo de estudar também o efeito do colesterol na interação do

fragmento peptídico com os modelos biomembranares. Para tal, realizou-se a comparação da variação

da frequência e da dissipação para diferentes concentrações peptídicas, bem como a modelação dos

resultados para obter os parâmetros viscoelásticos.

0,1

0,14

0,18

0,22

0,26

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Cp (

kC

al/ºC

/mol)

Temperatura (ºC)

43

Na Figura 29 e 30 são representados dois exemplos de ensaios de QCM-D onde se mostra a

variação da frequência e da dissipação em função do tempo para as harmónicas 3 a 9, a 37ºC e pH=7.

Figura 29. Exemplo de um ensaio de QCM-D da interação entre a mistura binária POPC/SM (1:1) com 80 µM de

Aβ25-35, a 37ºC e pH=7. Esquerda: variação da frequência. Direita: variação da dissipação. (1) Injeção de POPC/SM (1:1) 1.12 mM, durante 7 minutos; (2) Injeção de tampão de HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos; (3) Injeção de Aβ25-35, durante 7 minutos; (4) Injeção de tampão de HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos.

Figura 30. Exemplo de um ensaio de QCM-D da interação entre a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) com

80µM de Aβ25-35, a 37ºC e pH=7. Esquerda: variação da frequência. Direita: variação da dissipação. (1) Injeção de POPC/SM/Chol (1:1:1) 1.12 mM, durante 7 minutos; (2) Injeção de tampão de HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos; (3) Injeção de Aβ25-35, durante 7 minutos; (4) Injeção de tampão de HEPES, para enxaguamento, durante 10 minutos.

Através da Figura 29 e 30 verifica-se que a introdução do fragmento Aβ25-35 não perturba

consideravelmente a estabilidade da camada de lipossomas adsorvida no cristal de quartzo, uma vez

que não se observam variações significativas na frequência e na dissipação na passagem do fragmento

Aβ25-35. Este comportamento verifica-se em todas as harmónicas em estudo. A utilização de várias

harmónicas permite ter a noção do comportamento dos processos em função da distância à superfície

do cristal de quartzo e não se utiliza a primeira harmónica uma vez que esta é muito irreprodutível [215].

Na Figura 31, para a mistura binária POPC/SM (1:1), e na Figura 32, para a mistura ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1), mostram-se as variações médias da frequência e dissipação, obtidas em vários

ensaios independentes, e que ocorrem quando se adiciona a solução do péptido à camada de

lipossomas adsorvida, a 37ºC e pH=7.

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

0 20 40 60 80 100 120

Δf (H

z)

Tempo (minutos)

(1)

(2) (3) (4)

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

ΔD

(1x10

-6)

Tempo (minutos)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9(1)

(2) (3) (4)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

0 20 40 60 80 100 120

Δf (H

z)

Tempo (minutos)

(1)

(2) (3) (4)

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

ΔD

(1x10

-6)

Tempo (minutos)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9(1)

(2) (3) (4)

44

Figura 31. Valores médios e desvio padrão da variação da frequência (esquerda) e da dissipação (direita), em

diferentes harmónicas, relativos à interação entre a mistura binária POPC/SM (1:1) 1.12 mM e 10 µM (azul), 25 µM (verde), 50 µM (laranja) e 80 µM (amarelo) de péptido Aβ25-35, a 37ºC e pH=7.

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM(1:1)

HEPES Aβ25-35 HEPES

Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM(1:1)


ΔD

(1x10

-6)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM(1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM(1:1)


ΔD

(1x10

-6)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM(1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM(1:1)


ΔD

(1x10

-6)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM(1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM(1:1)


ΔD

(1x10

-6)

45

Figura 32. Valores médios e desvio padrão da variação da frequência (esquerda) e da dissipação (direita), em

diferentes harmónicas, relativos à interação entre a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) 1.12 mM e 10 µM (azul), 25 µM (verde), 50 µM (laranja) e 80 µM (amarelo) de péptido Aβ25-35, a 37ºC e pH=7.

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM/Chol(1:1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM/Chol(1:1:1)


ΔD

(1x10

-6)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM/Chol(1:1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM/Chol(1:1:1)


ΔD

(1x10

-6)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM/Chol(1:1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM/Chol(1:1:1)


ΔD

(1x10

-6)

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

POPC/SM/Chol(1:1:1)


Δf (

Hz)

Harmónica 3

Harmónica 5

Harmónica 7

Harmónica 9

0

10

20

30

40

50

60

POPC/SM/Chol(1:1:1)


ΔD

(1x10

-6)

46

Na Figura 31 verifica-se que há um ligeiro aumento da frequência, quando o fragmento peptídico β-

amilóide (25-35) interage com a mistura binária POPC/SM (1:1), sendo mais evidente com o aumento

da concentração de péptido em contacto com a mistura lipídica. Quanto à dissipação, verifica-se que

esta se mantém praticamente constante, independentemente da concentração do péptido. Estas

variações são mais evidentes tanto na frequência como na dissipação para a harmónica 3.

Relativamente à mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) (Figura 32), as variações de frequência e

dissipação que ocorrem aquando da adição da solução peptídica são desprezáveis,

independentemente da concentração do péptido.

É importante notar que para ambas as misturas, a variação de frequência das várias harmónicas é

semelhante, o que significa que a alteração da camada adsorvida é constante ao longo da espessura

do filme.

Na Figura 33, comparam-se as variações de frequência e de dissipação, para a harmónica 3, obtidas

ao longo do processo de adsorção dos lipossomas (misturas binária POPC/SM (1:1) e ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1)), e respetiva interação com as soluções peptídicas a diferentes concentrações.

Figura 33. Valores da variação da frequência (esquerda) e dissipação (direita) para a harmónica 3, a 37ºC e pH=7,

após injeção de 1.12 mM de POPC/SM (1:1) (em cima) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (em baixo), enxaguamento com tampão de HEPES, injeção de 10, 25, 50 e 80 µM de Aβ25-35 e, novamente, enxaguamento com tampão de HEPES. A intensidade do cinzento nas barras corresponde às injeções indicadas nas caixas.

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

10 µM 25 µM 50 µM 80 µM

Δf 3

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60

10 µM 25 µM 50 µM 80 µM

ΔD

3(1

x10

-6)

POPC/SM(1:1)

HEPES

Aβ25-35

HEPES

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

10 µM 25 µM 50 µM 80 µM

Δf 3

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60

10 µM 25 µM 50 µM 80 µM

ΔD

3(1

x10

-6)


HEPES

Aβ25-35

HEPES

47

Através da Figura 33 verifica-se a existência de diferenças, embora pouco significativas, entre o

comportamento da mistura lipídica binária POPC/SM (1:1) e ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) quando

ocorre interação com o fragmento peptídico β-amilóide (25-35). Quando o péptido Aβ25-35 interage com

os lipossomas conduz a uma ligeira diminuição da frequência em cerca de -10 Hz no caso da mistura

binária POPC/SM (1:1) + Aβ25-35. No entanto, na mistura lipídica ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) + Aβ25-

35, a variação é praticamente nula. Verifica-se, portanto, que a interação do fragmento Aβ25-35 com a

camada de lipossomas adsorvida no cristal de quartzo revestido a ouro é mais evidente na mistura

lipídica POPC/SM (1:1). A variação positiva da frequência após a interação do péptido Aβ25-35 está de

acordo com estudos efetuados por outros autores que verificaram que, de acordo com o tipo de péptido

e a respetiva concentração, a frequência pode aumentar devido a uma rutura dos lipossomas

adsorvidos conduzindo à diminuição de massa adsorvida à superfície do cristal de quartzo revestido a

ouro ou à destabilização da camada adsorvida devido às interações dos lipossomas com os péptidos

[215-217]. Contudo, no presente caso, a diminuição de frequência é pouco significativa e não sugere

qualquer rutura de lipossomas mas sim uma ligeira fluidificação da bicamada que pode originar uma

deformação dos lipossomas adsorvidos com libertação de água intersticial.

A variação da dissipação, após interação do péptido Aβ25-35, é de cerca de 1 x 10-6 para a mistura

binária POPC/SM (1:1) e 0.5 x 10-6 para a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), estando estas

ligeiras variações dentro do erro, podendo ser consideradas desprezáveis. Independentemente da

concentração de péptido, verifica-se que a variação da dissipação é sempre superior em valor absoluto

na mistura POPC/SM/Chol (1:1:1), mantendo as suas propriedades viscoelásticas e dissipativas

mesmo em presença de péptido Aβ25-35. Relativamente ao efeito do péptido, verifica-se um ligeiro

aumento da dissipação na interação do péptido com a mistura POPC/SM (1:1) e a mistura

POPC/SM/Chol (1:1:1), à exceção da concentração peptídica de 10 µM, onde se observa uma ligeira

diminuição da dissipação.

Os desvios de frequência e dissipação resultantes do processo de enxaguamento para ambas as

misturas lipídicas em estudo é quase nulo, significando que os lipossomas ficam na sua maioria

irreversivelmente adsorvidos à superfície do cristal de quartzo revestido a ouro [217]. A ligeira variação

que ocasionalmente se verifica após o enxaguamento é resultante da remoção de alguns lipossomas

fracamente adsorvidos, que são arrastados pela solução tampão, ou, caso seja após a adição de

péptido Aβ25-35, pode resultar na desorção de fragmentos peptídicos. A variação da frequência e da

dissipação após o enxaguamento pode também dever-se à rutura parcial dos lipossomas mais

pequenos, havendo libertação de água a partir dos lipossomas para o meio envolvente. Contudo, para

isto se verificar é necessário que ocorra uma diminuição significativa de frequência e um aumento na

dissipação, o que não se verifica neste caso.

No Quadro 4 e 5 são apresentadas as propriedades viscoelásticas para a mistura binária POPC/SM

(1:1) e mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), respetivamente, em interação com concentrações de

péptido Aβ25-35 de 10 e 80 µM, obtidas a partir da modelação dos resultados experimentais, a 37ºC e

pH=7.

48

Quadro 4. Valores médios e desvio padrão das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM (1:1) ao

longo do processo de interação com 10 µM (cima) e 80 µM (baixo) de Aβ25-35 a 37ºC e pH=7, obtidos a partir da modelação por QTools 3.

Parâmetros Lipossomas HEPES Aβ25-35 HEPES

Viscosidade (mPa.s) 2.1 ± 0.2 2.1 ± 0.2 2.1 ± 0.2 2.0 ± 0.2

Módulo de Elasticidade (kPa) N.A. N.A. N.A. N.A.

Espessura (nm) 106 ± 2 107 ± 2 108 ± 2 109 ± 2



Módulo de Elasticidade (kPa) N.A. N.A. N.A. N.A.

Espessura (nm) 106 ± 2 107 ± 3 110 ± 4 112 ± 4

Quadro 5. Valores médios e desvio padrão das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol (1:1:1)

ao longo do processo de interação com 10 µM (cima) e 80 µM (baixo) de Aβ25-35 a 37ºC e pH=7, obtidos a partir

da modelação por QTools 3.



Módulo de Elasticidade (kPa) 5 ± 3 4 ± 3 5 ± 3 6 ± 1

Espessura (nm) 104 ± 3 103 ± 1 103 ± 1 103 ± 3



Módulo de Elasticidade (kPa) 6 ± 2 5 ± 1 5 ± 2 5 ± 2

Espessura (nm) 106 ± 4 106 ± 4 107 ± 5 107 ± 5

A espessura da camada de lipossomas com a composição POPC/SM (1:1) aumenta ligeiramente

como resultado da interação com o péptido Aβ25-35 para a concentração peptídica de 80µM, enquanto

que a viscosidade não se altera. Não foi possível obter valores razoáveis para o módulo de elasticidade

(N.A.: não avaliável), não sendo possível avaliar eventuais alterações da rigidez dos lipossomas.

No caso da camada de lipossomas com a composição POPC/SM/Chol (1:1:1), nenhuma das

propriedades viscoelásticas (espessura, viscosidade e módulo de elasticidade) sofreu alterações

significativas ao longo do processo de interação com o fragmento peptídico Aβ25-35.

Uma explicação possível para o pequeno aumento de espessura quando o péptido interage com

lipossomas de POPC/SM (1:1) pode ser uma ligeira desorganização da camada de lipossomas

provocada pela interação com o péptido Aβ25-35. Esta desorganização provoca repulsões

electroestáticas nos lípidos e o volume global dos lipossomas aumenta, conduzindo ao aumento da

espessura e à diminuição da viscosidade do filme, devido à libertação de água a partir do filme de

lipossomas adsorvido [218]. No entanto, é de realçar que a variação observada no nosso caso nas

propriedades viscoelásticas da camada dos lipossomas é muito pequena pelo que os efeitos descritos

são pouco significativos.

49

A interação preferencial do fragmento peptídico Aβ25-35, a concentrações elevadas, com os

lipossomas sem colesterol pode explicar-se pelo facto da mistura POPC/SM (1:1) a 37ºC e pH=7 se

encontrar numa fase líquida desordenada, enquanto o sistema de jangada lipídica apresenta domínios

ordenados de SM/Chol.


Estudou-se a interação do péptido β-amilóide (25-35) com uma monocamada lipídica. Para tal,

estudou-se o efeito da concentração do péptido, o efeito da composição lipídica, comparando a mistura

binária POPC/SM (1:1) e a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), e o efeito do pH da subfase na

interação lípido-péptido.

Na Figura 34 é apresentado o efeito da concentração de Aβ25-35 dissolvido na subfase no

comportamento da monocamada da mistura binária POPC/SM (1:1) e na Figura 35 o efeito da

concentração de Aβ25-35 dissolvido na subfase no comportamento da monocamada da mistura ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1), a pH=7 e 25ºC. Foi estudado o comportamento do efeito da concentração do

fragmento peptídico nas duas misturas lipídicas também a pH=4, sendo o sentido do efeito da

concentração idêntico ao obtido a pH=4.

Figura 34. Iisotérmicas -A do efeito da concentração de Aβ25-35 em interação com POPC/SM (1:1), a 25ºC, numa

subfase aquosa a pH=7. A seta vermelha significa o aumento da concentração do péptido Aβ25-35 na subfase.

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)


POPC/SM (1:1)

0,25 µM Aβ25-35

0,5 µM Aβ25-35

1 µM Aβ25-35

2 µM Aβ25-35

4 µM Aβ25-35

cA

50

Figura 35. Exemplo de comportamento das isotérmicas -A do efeito da concentração de Aβ25-35 em interação

com POPC/SM/Chol (1:1:1), a 25ºC, numa subfase aquosa a pH=7. A seta vermelha significa o aumento da

concentração do péptido Aβ25-35 na subfase.

Tanto no caso da monocamada da mistura lipídica binária, como no caso da monocamada da

mistura POPC/SM/Chol (1:1:1) verifica-se que o aumento da concentração do péptido Aβ25-35 conduz a

um desvio das isotérmicas para valores de área cada vez maiores. Na mistura binária POPC/SM (1:1)

verifica-se um desvio progressivo das isotérmicas com o aumento da concentração do péptido. Por

outro lado, na mistura POPC/SM/Chol (1:1:1) verifica-se que para concentrações mais baixas (0.25 a

1 µM), o péptido afeta pouco a monocamada lipídica, verificando-se alterações mais significativas para

2 e 4 µM de péptido Aβ25-35. Esta diferença de comportamento das duas misturas lipídicas observada

para baixas concentrações de péptido na subfase, deve-se ao efeito condensante que o colesterol

exerce, tornando a monocamada da mistura POPC/SM/Chol (1:1:1) mais compacta.

Atraves da Figura 34 e 35 verifica-se que a pressão superficial para o estado inicial da monocamada

(isto é, a área máxima ocupada pela monocamada) aumenta com o aumento da concentração peptídica

em interação com a monocamada lipídica. Este comportamento deve-se, essencialmente, ao fato de

antes da compressão da monocamada já se verificarem a existência de domínios peptídicos na

interface ar/líquido que conduzem ao aumento da pressão superficial inicial.

À medida que a monocamada é comprimida, a área disponível para as moléculas em solução vai

sendo cada vez menor, ocorrendo modificações na interface devido á redução da tensão superficial e

a um consequente aumento da pressão superficial, como verificámos. Quando a concentração de

péptido Aβ25-35 aumenta na subfase aquosa, a tensão superficial diminui e consequentemente a

pressão superficial aumenta. Para concentrações peptídicas mais pequenas, o péptido influencia pouco

o comportamento da isotérmica, observando-se apenas um pequeno desvio da isotérmica para valores

maiores de área ocupada por molécula. Este comportamento deve-se ao facto do péptido ficar

adsorvido na região polar da monocamada lipídica, afetando pouco a sua organização (formação de

uma dupla camada, isto é, uma camada de péptido adsorvida na base da monocamada lipídica).

Contudo, quando a concentração de péptido aumenta, formam-se na interface ar/líquido domínios ricos

em péptido, contribuindo assim para o aumento significativo da área da monocamada. Neste caso,

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)



0,25 µM Aβ25-35

0,5 µM Aβ25-35

1 µM Aβ25-35

2 µM Aβ25-35

4 µM Aβ25-35

cA

51

verifica-se uma coexistência de uma monocamada de Langmuir e uma monocamada de Gibbs. O efeito

observado do péptido β-amilóide numa monocamada de lípidos está de acordo com estudos de outros

autores [20, 35].

As Figuras 36A. e Fgiura 36B. comparam as isotérmica experimentais de interação lípido-péptido

Aβ25-35, para as concentrações peptídicas de 2 µM (A) e 4 µM (B), com as curvas teóricas calculadas a

partir da soma da isotérmica da monocamada da mistura lipídica com a respectiva isotérmica de péptido

Aβ25-35 obtida na ausência da mistura lipídica.

Para a concentração de 1 µM, a curva teórica (omitida) coincide com a isotérmica da monocamada

lipídica uma vez que a contribuição independente do pépitido é aproximadamente nula (Fiurag 24).

Assim, o desvio positivo da curva experimental relativamente à previsão teórica deverá ser atribuído à

reorganização da monocamada lipídica promovida pela interação/associação lípido-péptido Aβ25-35 que

ocorre na região polar da monocamada.

Para as concentrações peptídicas de 2 µM (A) e 4 µM (B) observa-se um desvio negativo da curva

experimental relativamente à previsão teórica. Este desvio negativo pode ser devido a um maior grau

de agregação do péptido induzido pelas cadeias lipídicas que comprimem e limitam lateralmente os

domínios peptídicos incorporados na monocamada.

A razoável proximidade entre a curva teórica e curva experimental, observada para concentrações

elevadas de péptido Aβ25-35, vem confirmar a contribuição dos domínios de agregados peptídicos para

o aumento de área da monocamada.

Figura 36. Isotérmica -A experimental vs. Isotérmica -A teórica, a 25ºC e numa subfase aquosa a pH=7, da

interação entre a monocamada lipídica POPC/SM/Chol (1:1:1) com 2 μM (A.) e 4 μM (B.) de péptido Aβ25-35.

Para melhor compreender o efeito do colesterol na interação lípido-péptido Aβ25-35, apresentam-se

na Figura 36 as variações de área na monocamada lipídica, em percentagem (%), em função da

concentração de péptido Aβ25-35 na solução, observadas na mistura lipídica binária POPC/SM (1:1)

(curvas a cinzento escuro) e na mistura lipídica ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) (curvas a cinzento

claro). A percentagem de desvio de área a pressão superficial constante é calculado a partir da equação

5:

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)

Área por molécula de lípido (Å2/molécula)

POPC/SM/Chol(1:1:1) + 2µM Aβ25-35

(Teórico)


(Experimental)

POPC/SM/Chol(1:1:1)

2µM Aβ25-35

A.

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)

Área por molécula de lípido (Å2/molécula)


(Experimental)


(Teórico)

4µM Aβ25-35

POPC/SM/Chol(1:1:1)

B.

52

(5)

onde Acp é a área ocupada pela monocamada da mistura lipídica com Aβ25-35 e Ac0 é a área ocupada

pela monocamada da mistura lipídica.

Figura 37. Efeito do colesterol na formação da monocamada lipídica na presença de diferentes concentrações de

Aβ25-35, numa subfase aquosa a pH=7 e 25ºC, para pressões superficiais de 10 e 30 mN/m.

Verifica-se, através da Figura 37, que o aumento da concentração de péptido Aβ25-35 induz um

aumento de área por molécula, sendo esse aumento mais significativo para concentrações de péptido

superiores a 1 µM (observa-se um maior declive da recta). Verifica-se, igualmente, que a percentagem

de desvio de área da monocamada POPC/SM/Chol (1:1:1) + Aβ25-35 é maior do que a percentagem de

desvio de área da monocamada de POPC/SM (1:1) + Aβ25-35, observando-se assim um efeito direto da

presença do colesterol.

Os resultados apresentados evidenciam a existência de dois regimes de interação do péptido Aβ25-

35 com a monocamada lipídica:

Regime I: Para concentrações inferiores a 1 µM de péptido Aβ25-35 ocorre a adsorção ou a associação

do péptido com a região polar da monocamada, afetando pouco a área ocupada pelas moléculas

lipídicas (existem mais formas oligoméricas do péptido Aβ25-35).

Regime II: Para concentrações peptídicas iguais ou superiores a 1 µM de péptido Aβ25-35 verifica-se

que, além da fração adsorvida na região polar da monocamada de agregados peptídicos de menores

dimensões que corresponde à interação preferencial da monocamada lipídica com os agregados

peptídicos, o excesso de péptido Aβ25-35 deve penetrar na monocamada lipídica formando domínios

ricos em péptido. Estes domínios contribuem para o aumento significativo da área ocupada por

molécula de lípido que se verifica nas Figuras 34 e 35.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5

Concentração de Aβ25-35 (µM)

POPC/SM (1:1) π=10mN/m

POPC/SM (1:1) π=30mN/m

POPC/SM/Chol (1:1:1) π=10mN/m

POPC/SM/Chol (1:1:1) π=30mN/m

% ∆

𝐴 𝐴 𝜋

100

)(

0

0

C

Ccp

A

AAMédia

53

A definição destes dois regimes está de acordo com os resultados obtidos através da técnica de

NTA (Figura 26 e 27), em que se verificou-se que a baixas concentrações de péptido Aβ25-25 existem

poucos agregados peptídicos e que o número de agregados peptídicos de grandes dimensões aumenta

significativamente com o aumento da concentração de péptido.

Estes resultados mostram uma boa concordância com os modelos biomembranares computacionais

propostos Vestergaard et al. [154] para a interacção do péptido Aβ1-42 combiomembranas. Estes autores

concluíram que as espécies oligoméricas do péptido se localizam mais perto da superfície da

membrana enquanto as fibrilas têm uma localização variada. Demonstraram que a presença de péptido

Aβ1-42 conduz a um aumento da área da superfície da membrana, induzindo a transformação vesicular

dos lípidos, devido aos péptidos mediarem a fusão da membrana. Ding et al. [46] chegaram a

conclusões semelhantes ao estudar as interações do péptido Aβ1-40 com bicamadas lipídicas

suportadas. Os autores concluíram que estas interações se iniciam com uma ligação muito forte do

péptido no estado monomérico à membrana e que, posteriormente a um período de incubação de 20

horas a 22ºC ocorre a agregação peptídica com formação de oligómeros na membrana. O tamanho

destes oligómeros depende diretamente da concentração de péptido em solução.

A presença do colesterol na monocamada induz uma maior percentagem de desvio de área, uma

vez que a presença de domínios ricos em colesterol promove a interação da monocamada com o

péptido Aβ25-35. Comparativamente à monocamada da mistura lipídica POPC/SM (1:1), a monocamada

da mistura POPC/SM/Chol (1:1:1) apresenta mais domínios condensados, devido ao efeito que a

presença do colesterol induz na monocamada verificando-se assim que a interação do péptido Aβ25-35

é mais forte com domínios condensados do que com domínios expandidos. Este comportamento deve-

se ao facto dos domínios condensados apresentarem maior densidade de grupos polares disponíveis

para interagir com o péptido Aβ25-35.

Concluiu-se assim que a interação do péptido Aβ25-35 com a monocamada lipídica é promovida pela

presença do colesterol, tal como se verifica na Figura 34, 35 e 37. Este comportamento foi igualmente

verificado para pH=4.

A percentagem de desvio de área é maior à pressão superficial de 10 mN/m. Isto deve-se ao facto

das moléculas estarem na fase líquida expandida, estando mais desorganizadas, enquanto a 30 mN/m

já se encontram num estado mais organizad. Este comportamento verifica-se independentemente da

concentração de péptido em solução.

Segundo Abroggio et al., a interação do péptido β-amilóide com os lípidos conduz a uma

destabilização da monocamada de jangada lipídica [199]. Este comportamento verifica-se nos nossos

resultados obtidos com a balança de Langmuir, ao contrário dos ensaios de QCM-D onde a interação

do péptido com os lipossomas de composição POPC/SM/Chol (1:1:1) não provoca qualquer alteração

da bicamada (ver Figura 33).

Estudou-se, ainda, o efeito da variação do pH da subfase na interação das misturas lipídicas

POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1) com 0.25, 0.5, 1, 2 e 4 µM de péptido β-amilóide (25-35). Na

Figura 38 apresentam-se as isotérmicas obtidas apenas com as concentrações peptídicas de 1 e 4 µM.

54

Figura 38. Isotérmicas -A da mistura POPC/SM (1:1) (esquerda) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (direita) em interação

com 1 e 4 µM de Aβ25-35, a 25ºC, numa subfase aquosa a pH=4 (linha descontínua) e pH=7 (linha contínua).

Através da Figura 38 verifica-se, em ambas as misturas lipídicas, um desvio para maiores valores

de área ocupada por molécula de lípido a pH=4, em relação às isotérmicas obtidas a pH=7. Para a

Figura 39 escolheu-se a pressão superficial de 30 mN/m e comparou-se a percentagem de desvio de

área das monocamadas das misturas lipídicas POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1), em função da

concentração de péptido Aβ25-35 a dois valores de pH: 4 e 7.

Figura 39. Efeito do pH na variação da área da monocamada de POPC/SM (1:1) (esquerda) e POPC/SM/Chol

(1:1:1) (direita) em interação com 0.25, 0.5, 1, 2 e 4 µM de Aβ25-35, a 25ºC. Valores médios para pressão superficial de 30mN/m.

Através da Figura 39 é possível verificar que a percentagem de desvio de área é diretamente

influenciada pelo pH da subfase. Os resultados da Figura 39 mostram que para todas as concentrações

de péptido experimentadas, o aumento de área da monocamada lipídica induzido por interação com

Aβ25-35 é maior a pH=4 do que a pH=7, quer no caso da mistura lipídica binária POPC/SM (1:1) quer no

caso da mistura lipídica ternária POPC/SM/Chol (1:1:1). Outros autores confirmam que a variação do

pH induz um desvio de área da monocamada [218, 219]. Esta observação foi feita a uma pressão

superficial de 30 mN/m uma vez que nesta fase a monocamada já se encontra quase completamente

comprimida, estando já bastante estável, compacta e organizada.

Segundo os resultados de NTA apresentados nas Figuras 26 e 27, a pH=4 existe maior número de

agregados de péptido Aβ25-35 de pequenas dimensões, comparativamente a pH=7, verificando-se ainda

que quanto maior a concentração de péptido Aβ25-35, maior a tendência de agregação. Contudo, a

variação de área a pH=4 é maior que a variação de área a pH=7, o que parece contraditório com a

tendência de agregação do péptido Aβ25-35. Verificou-se, ainda, que a variação do pH não influencia a

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

Pre

ssão S

uperf

icia

l (m

N/m

)


POPC/SM (1:1)

1µM Aβ25-35 pH=4

1µM Aβ25-35 pH=7

4µM Aβ25-35 pH=4

4µM Aβ25-35 pH=7

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150

PR

essão S

uperf

icia

l (m

N/m

)



1µM Aβ25-35 pH=4

1µM Aβ25-35 pH=7

4µM Aβ25-35 pH=4

4µM Aβ25-35 pH=7

0

20

40

60

80

100

0,25 µM 0,5 µM 1 µM 2 µM 4 µM

pH=4

pH=7

0

20

40

60

80

100

0,25 µM 0,5 µM 1 µM 2 µM 4 µM

% ∆

𝐴 𝐴 𝜋

% ∆

𝐴 𝐴 𝜋

55

formação da monocamada de POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (ver Figura 38 e 39). Assim

sendo, a explicação para este comportamento é que a interação dos lípidos com agregados peptídicos

de menores dimensões parece ser mais eficiente, comparativamente à interação com os agregados de

maiores dimensões. Assim, o desvio das isotérmicas -A a pH=4 pode ser justificado por existir maior

número de agregados de menores dimensões, comparativamente a pH=7.

DSC

Com o objetivo de compreender o efeito da interação lípido-péptido na temperatura de transição

lipídica, fez-se variar a concentração da solução de péptido β-amilóide (25-35) adicionada à suspensão

de lipossomas de composição POPC/SM (1:1) entre 10 e 80 µM, a pH=7. A solução foi sujeita a 6 ciclos

consecutivos de aquecimento-arrefecimento, de modo a verificar a reversibilidade do comportamento

térmico da amostra (Figura 40). À exceção do primeiro ciclo aquecimento-arrefecimento, que foi

desprezado, os restantes ciclos apresentam-se sobreponíveis.

Uma vez que na Figura 23 não se identificou nenhum pico correspondente à temperatura de

transição de fase da mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), não se estudou a interação do fragmento

peptídico com esta mistura lipídica.

Figura 40. Termogramas para POPC/SM (1:1) 1.12mM obtidos, a pH=7, com várias concentrações de Aβ25-35.

Através da Figura 40, verifica-se que a adição de péptido Aβ25-35 aos lipossomas de POPC/SM (1:1)

conduz a um aumento da temperatura de transição de fase da mistura lipídica, uma vez que há um

desvio na posição do pico. Assim, verifica-se que a adição do péptido Aβ25-35 parece estabilizar os

lipossomas, tornando-os mais rígidos, uma vez que a sua transição de fase ocorre a temperaturas

maiores comparativamente aos lipossomas puros. Além disso, verifica-se também um aumento da

largura do pico para concentrações peptídicas de 10 e 25 μM, o que significa uma diminuição na

cooperatividade dos lipossomas. A curva correspondente à adição da solução peptídica de 50 μM

apresenta um pico de largura semelhante ao dos lipossomas puros mas a área debaixo do pico é

inferior, isto é, a entalpia associada à transição diminui. A forma da curva obtida para 80 μM não permite

identificar um máximo correspondente a uma temperatura de transição. Além disso, a diminuição da

capacidade calorífica observada sugere que há destruição dos lipossomas.

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Cp

(kC

al/ºC

/mo

l)

Temperatura (ºC)

POPC/SM (1:1)

POPC/SM (1:1) + 10µM Aβ25-35

POPC/SM (1:1) + 25µM Aβ25-35

POPC/SM (1:1) + 50µM Aβ25-35

POPC/SM (1:1) + 80µM Aβ25-35

56

A forma dos termogramas obtidos após a adição de péptido Aβ25-35 aos lipossomas POPC/SM (1:1),

em particular no caso da concentração de 50 μM, sugere a existência de vários picos sobrepostos, o

que poderá estar associado à existência de uma separação de fases na mistura.

Na Figura 41, representa-se a variação da temperatura de transição de fase da mistura de POPC/SM

(1:1), em função da concentração de péptido adicionado.

Figura 41. Temperatura de transição de fase da mistura POPC/SM (1:1) em função da concentração de solução

peptídica adicionada, a pH=7.

A temperatura de transição de fase apresenta um máximo para a concentração de 10 µM,

diminuindo para maiores concentrações embora permanecendo acima da temperatura de transição dos

lipossomas puros.

Outros autores verificaram que a interação de péptidos com lípidos conduz a uma alteração da

temperatura de transição de fase dos lípidos, que depende do tipo de lípido e do tipo de péptido [220-

222].

20

21

22

23

24

25

26

27

28

0 10 25 50

Te

mpera

tura

(ºC

)

Concentração de péptido Aβ25-35 (µM)

57

Capítulo V – Conclusões e Trabalho Futuro

Uma das principais características do péptido β-amilóide é a sua elevada tendência de agregação,

pensando-se que este facto tenha uma consequência direta na doença de Alzheimer. A fim de

caracterizar o péptido Aβ25-35 nas condições do presente trabalho, investigou-se o seu estado de

agregação e a estrutura, respetivamente com as técnicas de Análise de Localização de Nanopartículas

(NTA) e Dicroísmo Circular. O péptido Aβ25-35 apresenta uma maior tendência de agregação ao pH

fisiológico. A baixas concentrações (1 e 4 µM) os agregados peptídicos têm uma distribuição de

tamanho mais alargada (50 a 800 nm), comparativamente a altas concentrações (25 µM) (50 a 500

nm). A massa de péptido detetada na forma de agregados não varia linearmente com a concentração

real da solução, existindo um número muito superior de agregados para concentrações mais elevadas.

Este facto permite concluir que a baixas concentrações existe uma fração considerável de Aβ25-35 na

forma oligomérica e/ou monomérica. Quanto à conformação do péptido Aβ25-35, verificou-se que a

variação do pH influencia diretamente a conformação adotada. Assim, a pH=4 o péptido apresenta uma

estrutura secundária maioritariamente de espiral aleatória, enquanto que a pH fisiológico o péptido

adota uma estrutura secundária de folha β. O maior nível de associação das folhas β tem levado à

associação desta estrutura com a formação dos agregados peptídicos.

A interação do péptido Aβ25-35 com os modelos biomembranares foi estudada através da balança de

Langmuir, no caso das monocamadas lipídicas e usando a Microbalança de Cristal de Quartzo com

Dissipação (QCM-D) e Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC), para os lipossomas suportados

ou em suspensão, respetivamente. Apesar dos modelos biomembranares escolhidos serem

estruturalmente diferentes e as condições experimentais adotadas serem diferentes, a análise e

comparação dos resultados obtidos permitiram obter algumas conclusões coincidentes e

complementares relativamente às interações existentes entre o péptido Aβ e as misturas lipídicas

POPC/SM (1:1) e POPC/SM/Chol (1:1:1).

Os resultados obtidos com as monocamadas de Langmuir revelaram-se bastante interessantes,

evidenciando uma boa concordância com os modelos biomembranares computacionais de Vestergaard

et al. [154], assim como com os resultados experimentais de Ding et. al. [46].

As misturas lipídicas usadas como modelos biomembranares, quer a mistura binária POPC/SM (1:1)

quer a mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1) formam, a 25ºC, monocamadas do tipo líquido a duas

dimensões, embora o colesterol torne a monocamada de POPC/SM/Chol (1:1:1) mais densa e

compacta, devido ao efeito condensante do colesterol. A variação do pH, a 25ºC, não influencia o

comportamento das monocamadas destas misturas lipídicas. Verifica-se que o efeito do colesterol é

idêntico em monocamadas e em lipossomas adsorvidos ou em suspensão.

A interação do péptido Aβ25-35 com ambas as monocamadas lipídicas, a 25ºC, conduz a um aumento

da área ocupada por molécula que é mais significativo quanto maior for a concentração de péptido

Aβ25-35. Estes resultados permitem identificar dois regimes de interacção péptido-lípido. A baixas

concentrações, o péptido Aβ25-35, na forma de monómeros ou oligómeros, adsorve-se na região polar

da monocamada, afetando pouco a organização da monocamada lipídica – Regime I. Para

58

concentração peptídicas elevadas, existe uma concentração elevada de agregados que tendem a

penetrar na monocamada na forma de domínios ricos em Aβ25-35, contribuindo assim para um aumento

significativo da área da monocamada lipídica – Regime II. Esta interpretação é suportada pelos

resultados de NTA que indicam que a baixas concentrações existem poucos agregados e que o número

de agregados de grandes dimemsões aumenta significativamente com a concentração. Verifica-se

ainda que, para toda a gama de concentrações peptídicas estudada em monocamadas, a interação

péptido Aβ25-35 – lípido é mais forte na mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), onde, devido à presença

do colesterol, se formam jangadas lipídicas.

A pH=4 e 25ºC, o péptido Aβ25-35 conduz a um aumento de área das monocamadas lipídicas

ligeiramente superior ao observado a pH fisiológico. Este efeito é mais evidente na monocamada de

POPC/SM/Chol (1:1:1). Uma vez que a pH=4 existe uma maior quantidade de agregados de pequenas

dimensões do que a existente a pH=7 podemos concluir que a interação entre a monocamada lipídica

e os agregados de péptido Aβ25-35 de menores dimensões é mais eficiente.

Nos estudos com a QCM-D verificou-se que a interação do péptido Aβ25-35 com os lipossomas

POPC/SM (1:1) provocou um ligeiro aumento da espessura da camada que pode estar relacionado

com uma ténue rigidificação da camada dos lipossomas. No caso dos lipossomas de jangada lipídica,

a interação com o péptido Aβ25-35 não provocou qualquer alteração significativa nas propriedades

viscoelásticas da camada adsorvida. Considerando que as concentrações de péptido Aβ25-35 (10-80

µM) usadas neste estudo são elevadas, e admitindo um mecanismo de interacção semelhante ao

observado no Regime II da interacção péptido-monocamada lípidica, podemos concluir que os

agregados peptídicos de grandes dimensões não interactuam com os lipossomas suportados.

Quanto aos lipossomas em suspensão, só foi possível estudar o efeito do péptido Aβ25-35 sobre os

lipossomas de POPC/SM (1:1) uma vez que não se verificou a existência de uma transição de fase nos

lipossomas de POPC/SM/Chol (1:1:1), dentro do intervalo de temperaturas estudado (10 a 50ºC). O

efeito do péptido sobre os lipossomas de POPC/SM (1:1) depende acentuadamente da concentração

peptídica. A adição de baixas concentrações de péptido Aβ25-35 conduziu a um aumento da temperatura

da transição de fase da mistura lipídica, sugerindo que o péptido Aβ25-35 estabiliza os lipossomas em

suspensão, tornando-os mais rígidos. Esta observação confirma a ligeira rigidificação dos lipossomas

adsorvidos e está de acordo com o comportamento das monocamadas de Langmuir no regime de

baixas concentrações (Regime I) em que o péptido Aβ25-35 adsorve na região polar da monocamada

lipídica. No entanto, para concentrações peptídicas mais elevadas (80 µM), não se observou qualquer

transição de fase da mistura, evidenciando uma destruição dos lipossomas em suspensão. Este

resultado, por sua vez, compara com o observado na interacção das monocamadas para elevadas

concentrações de péptido (Regime II), onde a formação de domínios ricos em péptido Aβ25-35 levam à

disrupção da monocamada.

Os resultados obtidos com lipossomas em suspensão (DSC) para altas concentrações peptídicas

não coincidem com os obtidos com os lipossomas suportados (QCM-D), onde se verificou apenas uma

rigidificação lipossomas POPC/SM (1:1) após adição da solução peptídica de 80 µM. Assim, parece

59

poder concluir-se que os lipossomas num estado adsorvido resistem à adição de elevadas

concentrações de péptido Aβ25-35, enquanto os lipossomas em suspensão sofrem uma rutura.

Uma vez que as alterações provocadas pelo péptido Aβ25-35 nos lipossomas adsorvidos são

pequenas (QCM-D) e que não foi possível estudar o efeito deste péptido em lipossomas de jangada

lipídica em suspensão (DSC), decidimos não efetuar os estudos do efeito do pH com estas técnicas.

Alguns estudos futuros que poderiam complementar o estudo aqui apresentado seria a avaliação

da interação entre lipossomas adsorvidos e o péptido Aβ25-35 através de AFM, de modo a compreender

o efeito real do péptido na estrutura da camada de lipossomas adsorvidos. Seria também útil transferir

as monocamadas para um substrato sólido e observar as diferentes fases através da técnica de AFM.

A microscopia de ângulo de Brewster possibilitaria a observação da separação de fases nas

monocamadas lipídicas. Em termos de composição lipídica, seria interessante realizar ensaios de

QCM-D com lipossomas de POPC, de modo a compreender o efeito da ausência dos domínios lipídicos

mais rígidos na interação lipossomas-péptido Aβ25-35. Outra direção que poderia ser seguida seriam as

técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR): 31P-NMR e 1H-NMR. A técnica

de 31P-NMR seria útil para analisar o movimento do grupo polar dos fosfolípidos, permitindo

compreender o efeito do péptido β-amilóide relativamente à coexistência de diferentes fases na

membrana lipídica. A técnica de 1H-NMR, por sua vez, seria útil para determinar a organização das

cadeias de acilo dos fosfolípidos, de modo a compreender o efeito intramembranar do péptido β-

amilóide na membrana lipídica.

60

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Interação entre um péptido β-amilóide, responsável pela ... · Às minhas irmãs de...

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