INSTITUTO OSWALDO CRUZ PATRÍCIA MELLO FERRÃO · Obrigada por compartilhar comigo seu alto-astral...

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

PATRÍCIA MELLO FERRÃO

Estudo da modulação de proteínas de

de TGF-β: uma abordagem prote

Orientadoras: Dra. Leila de Mendonça Lima

Dra. Mariana Caldas Waghabi


Graduação em Biologia Celular e Molecular


Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi em resposta ao estímulo

: uma abordagem proteômica.

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo

Cruz como parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Biologia Celular e Molecular

. Leila de Mendonça Lima

. Mariana Caldas Waghabi

RIO DE JANEIRO

2009


em resposta ao estímulo

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo

Cruz como parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Biologia Celular e Molecular

Ficha catalográfica elaborada pela

Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ

F395

Ferrão, Patrícia Mello.

Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi em resposta ao estímulo de TGF-β: uma abordagem proteômica / Patrícia Mello Ferrão. – Rio de Janeiro, 2009.

xx, 136f. : il. ; 30cm

Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-

Graduação em Biologia Celular e Molecular, 2009. Bibliografia: f. 112-136

1. TGF-β. 2. Trypanosoma cruzi 3. Fosforilação de proteínas. 4.

Fosfoproteômica. I. Título.

CDD 616 9363


Pós-Graduação em



estímulo de TGF

ORIENTADORAS: Dr a. Leila de Mendonça Lima

Dra. Mariana Caldas Waghabi

Aprovada em: 06/11/2009

EXAMINADORES:

Drª. Tânia Cremonini de Araújo

Dr. Adeílton Alves Brandão

Dr. Gilberto Barbosa Domont

Drª. Claudia Masini d`Avila Levy

Dr. Richard Hemmi Valente (IOC/FIOCRUZ)

ii




Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi

estímulo de TGF -β: uma abordagem prote ômica.

. Leila de Mendonça Lima

. Mariana Caldas Waghabi

06/11/2009

Tânia Cremonini de Araújo-Jorge (IOC/FIOCRUZ) – Presidente

Adeílton Alves Brandão (IOC/FIOCRUZ) – Titular

Gilberto Barbosa Domont (IQ/UFRJ) – Titular

d`Avila Levy (IOC/FIOCRUZ) – Revisora e Suplente

Richard Hemmi Valente (IOC/FIOCRUZ) - Suplente

Biologia Celular e Molecular

Trypanosoma cruzi em resposta ao

ômica.

Presidente

Revisora e Suplente


estímulo de TGF

Estudos recentes mostraram que TGFaguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao seu ciclo de vida. Trabalhos anteriores demonstraram que TGF-β latente, utilizandoT. cruzi se ligam e internalizam TGFrelacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. ao questionamento de quais moléculas de processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGFNeste sentido, o presente projeto tem por principal objetmoléculas responsivas ao estímulo de TGFfosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de (cepa Y), incubadas ou não com TGFexponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGFpara maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. Em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF- β (1, 5, 15, 30 e 60 minutos) foi testado e concludiferenças entre os padrõunidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiva dos perfis em géis bidimensionais de 7 cm com faixa de pH 3bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosfestudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGFforam identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as protechoque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGFcorrelacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular disparada por TGFcomportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em nossas análises. Por último, foi avaliado se efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGFpromoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidosmecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGFfonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas.

iii

Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi

estímulo de TGF -β: uma abordagem prote ômica.

RESUMO

Estudos recentes mostraram que TGF-β está envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do

el na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seu ciclo de vida. Trabalhos anteriores demonstraram que T. cruzi

latente, utilizando-o na invasão às células hospedeiras e que amastigotas de se ligam e internalizam TGF-β recombinante, estando este evento

relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGFNeste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estímulo de TGF-β através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de (cepa Y), incubadas ou não com TGF-β, foram preparados durante a fase

al de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGFpara maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. Em seguida, o tempo ótimo de

β (1, 5, 15, 30 e 60 minutos) foi testado e concludiferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiva dos perfis em géis bidimensionais de 7 cm com faixa de pH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGFforam identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as protechoque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína,

-α, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF

ar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular disparada por TGF-β, em concordcomportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em nossas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-β a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGFpromoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-β, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas.

Trypanosoma cruzi em resposta ao

ômica.

á envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do

el na patologia chagásica, também se observou que esta citocina como um regulador de diferentes etapas de

T. cruzi é capaz de ativar na invasão às células hospedeiras e que amastigotas de

recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em

Este conjunto de informações nos levou poderiam estar envolvidas nos

processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-β. ivo a caracterização de

és de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi

, foram preparados durante a fase al de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-β

para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. Em seguida, o tempo ótimo de (1, 5, 15, 30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as

es de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiva dos perfis em géis

linear. A avaliação dos perfis orilação entre os tempos

estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-β foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína,

ção eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-β. Buscamos

ar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível , em concordância com o

comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em nossas análises. a culturas de epimastigotas teria algum

efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-β promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24

contribui para a elucidação dos β, proporcionando uma

fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas.

Study of protein modulation in

Recent studies show that TGFcardiopathy. High levels of TGFshown to be peculiar aspects of patients with chronic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas disbe intimately associated with the parasite´s life cycle. Previous works have shown that latent TGF-β, using it in the process of hforms are able to bind and internalize recombinant TGFtheir capacity to proliferate and differentiate into trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken togetheto which T. cruzi molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGFresponsive molecules through a phoprotein extracts from T. cruziwere prepared from parasites in the exponential growth phase. We determined that 5 ng/ml of TGF-β was the dose that induceevents. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1exclusively through 2-DE gels (7cm pH 3showed differences in phosphorylation patterns during the timewhich led us to maintain a timepossible TGF-β responsive proteins were identified by mass spectrometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydrogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factortheir phosphorylation and/or expression levels modulated by TGFcorrelate the function already described in the literature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGFphosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGFeffect on parasite proliferation. We found that TGFto 73% in parasite growth in the first 24 hours of culture. The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mechanisms related to TGFsignaling in T. cruzi, providing a source of new potential therapeutic targets against Chagas disease.

iv

Study of protein modulation in Trypanosoma cruzi in response to TGF

stimuli: a proteomic approach.

ABSTRACT

Recent studies show that TGF-β is involved in the acute and chronic chagasic cardiopathy. High levels of TGF-β and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chronic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas disease, this cytokine was also observed to be intimately associated with Trypanosoma cruzi as a regulator of different stages of the parasite´s life cycle. Previous works have shown that T. cruzi

, using it in the process of host cell invasion. In addition, amastigote forms are able to bind and internalize recombinant TGF-β, and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate into trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken together, this set of information raises the question as

molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGF-β. Therefore, this work aims to characterize TGFresponsive molecules through a phosphoproteomic approach. For this purpose, total

T. cruzi epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGFwere prepared from parasites in the exponential growth phase. We determined that 5

was the dose that induced the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1-DE analysis, leading us to evaluate these profiles

DE gels (7cm pH 3-10 non-linear). The profiles obtained showed differences in phosphorylation patterns during the time-which led us to maintain a time-kinetics study. Gel images wer

responsive proteins were identified by mass spectrometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydrogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factor-1α, eukaryotic initiation factortheir phosphorylation and/or expression levels modulated by TGFcorrelate the function already described in the literature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGF-β, in agreement with theiphosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGF-β to epimastigotes cultures would have some effect on parasite proliferation. We found that TGF-β addition led to an increase of up

in parasite growth in the first 24 hours of culture. The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mechanisms related to TGF

, providing a source of new potential therapeutic targets against

in response to TGF -β

is involved in the acute and chronic chagasic and the activation of its signaling pathway were

shown to be peculiar aspects of patients with chronic Chagas disease. Besides its ease, this cytokine was also observed to

as a regulator of different stages of T. cruzi is able to activate

ost cell invasion. In addition, amastigote , and this event is related to

their capacity to proliferate and differentiate into trypomastigote forms at the end of r, this set of information raises the question as

molecules are involved in the processe of cellular proliferation and . Therefore, this work aims to characterize TGF-β

sphoproteomic approach. For this purpose, total epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF-β,

were prepared from parasites in the exponential growth phase. We determined that 5 d the highest number of phosphorylation

events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed

ng us to evaluate these profiles linear). The profiles obtained

-course under study, kinetics study. Gel images were analyzed and

responsive proteins were identified by mass spectrometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydrogenases, enolases, cyclophilin

, eukaryotic initiation factor-5a and others had their phosphorylation and/or expression levels modulated by TGF-β. We tried to correlate the function already described in the literature for each protein with their

, in agreement with their phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we

to epimastigotes cultures would have some addition led to an increase of up

in parasite growth in the first 24 hours of culture. The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mechanisms related to TGF-β

, providing a source of new potential therapeutic targets against

v

Trabalho realizado no Laboratório de

Gênomica Funcional e Bioinformática

(LAGFB/IOC), sob a orientação das

doutoras Leila de Mendonça Lima e

Mariana Caldas Waghabi

vi

Aos meus avós, pelo carinho,

confiança e apoio e a minha mãe,

pela dedicação e ternura.

vii

“Só existem dois dias no ano em que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o

outro se chama amanhã. Portanto, hoje é o dia certo para amar, acreditar, fazer e

principalmente viver”.

DALAI LAMA

"Assim como a semente traça a forma e o destino da árvore, os teus próprios

desejos é que te configuram a vida".

EMMANUEL

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais volta ao seu tamanho original”.

ALBERT EINSTEIN

"Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima”.

LOUIS PASTEUR

viii

Agradecimentos

À Deus, por sua sabedoria infinita, que ensina com a paciência e o amor que jamais

poderemos alcançar. A Ele que nos dá saúde e forças para que diariamente

possamos ter a oportunidade de errarmos e nos reerguemos, bastando apenas ser

esta a nossa vontade.

À minha mãe Marília e irmã Marina, pela convivência não mais de todos os dias,

mas ainda assim, sempre juntas comigo no meu coração. A minha tia Sandra, pelo

exemplo de pessoa boa, honesta e generosa que sempre foi. Ao meu pai Paulo, que

apesar da distância, por tantas vezes auxiliou na expansão dos meus pensamentos

e idéias. Aos meus avós, Laura e Francisco, por todo amor, carinho e confiança

incomensuráveis depositados em mim durante todo a minha vida. Obrigada por

sempre acreditarem em mim!

Às minhas queridas Suzi e Lola, companheiras de todas as horas, que com alegria e

simplicidade me lembram a todo o momento a alegria de viver. Ao Zoé, meu

pequeno, que ainda vive, no meu coração.

Às minhas velhas amigas Thaís Vilela e Gabriela Vasquez, que me acompanham há

tanto tempo e com quem compartilho as alegrias, as tristezas e as últimas

novidades. Vocês são minhas jóias raras!

À minha queridíssima amiga Tatiana Gutierrez, aquisição mais sólida e valiosa dos

tempos de fundão, com quem vibro a cada nova conquista pessoal e profissional.

Obrigada por compartilhar comigo seu alto-astral e pensamentos positivos. Ah, e

curte bem essa vida de casada!

Ao Diego, a maior e melhor surpresa da minha vida. Quem poderia imaginar que

daquela conversa informal num domingo de 2x2 no maraca poderia começar uma

história de amor tão bonita e tão forte, que até hoje me enche de orgulho e

felicidade. Ainda me pego por aí, sonhando acordada e suspirando quando meus

pensamentos voam até você. Você ainda mexe muito comigo... Te amo, amo, amo

demais!

ix

À minha orientadora Mariana Waghabi, pilar incontestável da idealização e

construção desta dissertação. Sem você, nada disso teria acontecido. Apesar dos

momentos turbulentos, gostaria que soubesse que tenho grande admiração por

você, pela sua paixão e envolvimento com a pesquisa, por você ser uma

pesquisadora talentosa e dedicada. Muito obrigada por tudo que me ensinou, pela

paciência que teve comigo e por ter me confiado à realização deste trabalho.

À minha orientadora Leila de Mendonça Lima, por ter me dado a oportunidade de

estar aqui hoje, tornando possível todo o conhecimento e experiência que adquiri ao

longo desses últimos anos. Pela contribuição intelectual à dissertação, através de

seu raciocínio lógico e capacidade notável de enxergar os resultados além.

Às meninas do lab 101:

À Palominha, minha doce menina, futura gêninha da pesquisa. Trabalhar com você

é fácil e prazeroso. Confio cegamente em tudo o que você faz. Te adoro

incondicionalmente, como se fosse minha irmã!

À Fabi, com seus trejeitos engraçados, sempre de bom-humor e disposta a ajudar

pessoas perfeccionistas e minuciosas (ou como ela diria, pessoas chatas e lerdas)

como eu. Muito obrigada pela ajuda valiosa com a cultura das epis e outros

experimentos da dissertação!

À Melissa, aluna sênior do laboratório, que, apesar dos momentos ranzinzas, é um

amor de pessoa e ótima companhia, ouvindo, dando bons conselhos e incentivando

a todas. Além, é claro, de ser uma ótima consultora de modas (chique demais essa

menina!).

À Talita, menina doidinha, sempre perdida num monte de afazeres dentro e fora do

laboratório. Obrigada por tudo que me ensinou nesses últimos 5 anos. Torço muito

para que você alcance suas aspirações profissionais e, acima de tudo, que seu

coração esteja tranqüilo e apaixonado como está hoje!

x

À Cris, a novata do grupo, pelas conversas maduras e pelo exemplo de virar a mesa

e dar a volta por cima.

Às meninas do lab 106:

À Márcia, por ser uma pessoa que naturalmente esbanja simpatia e acessibilidade.

Você é acima de tudo uma pessoa sincera, que não tem medo de expor seus

sentimentos e emoções. O coração imenso de mãe que você guarda no peito é sem

dúvida seu maior tesouro. Continue sempre a pessoa amiga, que cativa a todos

onde passa.

À Luciana, pela animação diária e histórias divertidas, que tornam o dia-a-dia leve e

agradável. Além, é claro, de sua prestatibilidade ímpar, estando sempre disposta a

ajudar (e como ajudou)!

À galera do lab 105:

Ao Marcos, Vanessa e Renata pelo alto-astral e energia que passam pra mim, por

serem sempre atenciosos e prestativos nos momentos que precisei de ajuda.

Marcelo e Teca, obrigada pelas idéias e sugestões construtivas dadas ao trabalho

durante as apresentações nos seminários de laboratório.

Aos amigos, Leonardo, Marcos, Aline e Andressa pelas conversas, conselhos e

amizade.

À dona Neiva, cuja ajuda silenciosa é de extrema importância para a realização do

trabalho de todos do laboratório.

Aos meninos do lab 201, pelos momentos descontraídos nas festinhas do

laboratório.

Às pesquisadoras Cristina Pessolani e Ana Gisele Neves-Ferreira, pela contribuição

intelectual dada ao desenvolvimento desta dissertação.

xi

À Claudia Levy, pela revisão desta dissertação, por aceitar participar da banca

avaliadora e por, assim como na minha monografia, enriquecer com idéias e

sugestões os trabalhos que realizo.

Um agradecimento super, hiper, ultra, mega especial a todos (Paloma, Fabiane,

Melissa, Luciana, Talita, Leonardo e Márcia) que bravamente participaram da

maratona do processamento de 200 “spots” em uma semana! Serei eternamente

grata pela ajuda (e deverei para sempre favores em troca)!

Agradeço ao Instituto Oswaldo Cruz pelo apoio financeiro, através do qual recebi

minha bolsa de mestrado e pela oportunidade de realizar este trabalho, que tanto

acrescentou no meu amadurecimento profissional.

Às plataformas de Eletroforese 2D (RTP02C) e de Espectrometria de massas -

PDTIS/Fiocruz, que viabilizaram a realização deste trabalho.

xii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

°C - grau Celsius

µm - micrômetro

1,3-BPGA - 1,3-bifosfo-D-ácido glicérico

1DE - eletroforese unidimensional

2DE - eletroforese bidimensional

ACN - acetonitrila

ADP- adenosina difosfato

AHADH - desidrogenase L-alfa-hidróxi-ácida aromática

AKR- aldo-ceto redutase

ALK1 – “activin receptor-like kinase 1”

ALK2 – “activin receptor-like kinase 2”

ATP - adenosina trifosfato

BMP – proteínas morfogênicas do osso

BPG- bifosfoglicerato

BSA – albumina de soro bovino

CBB – “coomassie brilliant blue”

CDC – “Centers for Disease Control and Prevention”

Cdc42- “cell division cycle 42”

CHAPS – 3-[(3-cholamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato

CK2- “casein kinase 2”

Clp – “caseinolytic protease”

cm - centímetro

CRM1 – “chromosome region maintenance 1”

Da - dalton

DNA – ácido desoxirribonucléico

DTT – ditiotreitol

EF-1α – “elongation factor 1α” (fator de elongamento-1α)

EIF-5A – “eukaryotic initiation factor 5a” (fator eucariótico de iniciação da tradução –

5a)

ERK- “extracellular signal-regulated kinase”

Fos- “fructo oligosaccharide”

FtsH – “filamentation temperature-sensitive”

g – aceleração da gravidade

xiii

GAPDH - gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GDF – fatores de crescimento e diferenciação

GDP- guanosina difosfato

gp63s- glicoproteína 63

GTP- guanosina trifosfato

h – hora

HIV – “human imunodeficiency vírus” (vírus da imunodeficiência humana)

Hsp – “heat shock protein” (proteína de choque térmico)

IEF – “isoelectric focusing” (focalização isoelétrica)

IgE – imunoglobulina E

IPG – gradiente imobilizado de pH

JNK- Jun N-terminal kinase

kb - quilobase

kDa – quilodalton

LAP – “latency associated peptide” (peptídeo associado à latência)

M – molar

mA - miliamper

MALDI – “matrix assisted laser desorption ionization” (desorção/Ionização a Laser

Assistido por Matriz)

MAPKs- “mitogen activated protein kinase”

MH2- “MAD homolog 2”

mL – mililitro

mm - milímetro

mM – milimolar

mRNP – “messenger ribonucleoprotein”

MS – espectrometria de massas

MW– massa molecular

MyoD- “Myogenic diferentiation”

NAC - complexo associado ao polipeptídeo nascente

NAD(P)- nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NTA – ácido nitrilotriacético

OD – “optical density” (densidade óptica)

OMS - Organização Mundial de Saúde

OPAS – Organização Pan-Americana de Saúde

p/v – peso/volume

xiv

PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida

pb (s) – par(es) de base

PBS – “phophate buffered saline” (salina tamponada com fosfato)

PDI - proteína dissulfeto isomerase

PDTIS – Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde

PGFS- prostaglandina F sintase

pH - potencial hidrogeniônico

pI - ponto isoelétrico

PI3K- fosfatidilinositol 3 quinase

PMF – “peptide mass fingerprint”

PP2A- proteína fosfatase 2A

PPIase - peptidil-prolil isomerase

PPM – parte por milhão

PTM- “post-translational modifications” (modificações pós-traducionais)

qsp – quantidade suficiente para

RNA – ácido ribonucléico

rpm – rotações por minuto

SDS – dodecil sulfato de sódio

Smad – união dos nomes “Mothers against decapentaplegic” (MAD) e SMA de

Caenorhabditis elegans

SnoN- “Ski-related novel protein N”

T - tempo

TAT - tirosina aminotransferase

TBP – tributilfosfina

TCA – ácido tricloro acético

TcMPX - triparedoxina peroxidase mitocondrial

TCTP - proteína tumoral traducionalmente controlada

TEA - trietanolamina

TEMED – N,N,N’,N’ – tetrametiletilenodiamina

TFA – ácido trifluoro acético

TGF-β – “transforming growth factor beta” (fator transformador de crescimento beta)

TOF – “time of flight” (tempo de vôo)

TR- tripanotiona redutase

TRIS - tris-hidroxi-metil-amino-metano

TriX - triparedoxina

xv

TβRI - receptor para TGF-β tipo I

TβRII - receptor para TGF-β tipo II

TβRIII - receptor para TGF-β tipo III

v – volts

v/v – volume/volume

WB - western-blot

WHO – “World Health Organization” (Organização Mundial da Saúde)

µg – micrograma

µL – microlitro

xvi

LISTA DE TABELAS MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Solução Inorgânica do meio de cultura LIT 25

3.2 Solução Orgânica do meio de cultura LIT 25

3.3 Meio de cultura LIT 25

3.4 Tampão de amostras de proteína em gel SDS-PAGE (1X) 27

3.5 Géis 12% SDS-PAGE para “strips” de 7cm 27

3.6 Tampão de corrida Laemmli 27

3.7 Parâmetros para focalização isoelétrica 28

3.8 Tampão de Equilíbrio I 29

3.9 Tampão de Equilíbrio II 29

3.10 Comprimentos de onda ideais para emissão e excitação da fluorescência dos corantes ProQ Diamond e Sypro Ruby

31

3.11 Parâmetros utilizados nas buscas do Mascot 35

RESULTADOS

4.1 Identificação das proteínas moduladas por TGF-β 47

4.2 Valores dos “spots” responsivos a TGF-β nos tempos estudados 55

DISCUSSÃO

5.1 Comportamento das proteínas em resposta a TGF-β 95

xvii

LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO

1.1 Mapa da distribuição geográfica da doença de Chagas 01

1.2 Manifestações clínicas da doença de Chagas 03

1.3 Formas evolutivas de T. cruzi 04

1.4 Ciclo Biológico de T. cruzi 05

1.5 Superfamília TGF-β 07

1.6 Via clássica de sinalização por TGF-β 10

1.7 Vias alternativas de sinalização por TGF-β 12

RESULTADOS

4.1 Curva de crescimento das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi 37

4.2 Padronização da dose ótima de incubação com TGF-β 39

4.3 Padronização do tempo ótimo de incubação com TGF-β 41

4.4 Perfis bidimensionais dos extratos protéicos de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β nos tempos de estudo

43

4.5 Quantidade total de “spots” protéicos em cada condição estudada 45

4.6 Mapa protéico do extrato das epimastigotas tratadas com TGF-β por 1 minuto

46

4.7 Comportamento das proteínas de choque térmico 61

4.8 Comportamento da proteína da DnaK 62

4.9 Comportamento da proteína Hsc70 63

4.10 Comportamento da proteína GrpE 64

4.11 Comportamento da proteína Ciclofilina A 65

4.12 Comportamento da proteína β-Tubulina 67

4.13 Comportamento da proteína Prostaglandina F2α sintase 69

4.14 Comportamento da proteína Aldo-ceto redutase 70

4.15 Comportamento da proteína Enolase 71

4.16 Comportamento das proteínas GAPDH e Malato desidrogenase 73

4.17 Comportamento das proteínas dissulfeto isomerase e desidrogenase aromática L-α hidroxiácida

74

4.18 Comportamento da proteína Tirosina aminotransferase 75

4.19 Comportamento das proteínas Hipotéticas 77

4.20 Comportamento da proteína hipotética (“spot” 17) 78

4.21 Comportamento do complexo associado ao polipeptídeo nascente 80

xviii

4.22 Comportamento do fator de iniciação eucariótica – 5a 81

4.23 Comportamento do fator de elongamento – 1α 82

4.24 Comportamento da proteína Cruzipaína 83

4.25 Comportamento da subunidade proteolítica do complexo hslvu 84

4.26 Comportamento da proteína Triparedoxina peroxidase 85

4.27 Comportamento do fator de liberação de histamina dependente de IgE 87

4.28 Proliferação das epimastigotas após adição de TGF-β ao meio de cultura

88

xix

ÍNDICE

Conteúdo Página

RESUMO iii

ABSTRACT iv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS xii

LISTA DE TABELAS xvi

LISTA DE FIGURAS xvii

1. INTRODUÇÃO 01

1.1 Doença de Chagas. 01

1.2 Trypanosoma cruzi. 03

1.3 Fator Transformador de Crescimento beta (TGF-β). 06

1.3.1 A superfamília TGF-β. 06

1.3.2 Receptores de TGF-β. 08

1.3.3 Via de sinalização clássica por TGF-β. 09

1.3.4 Vias alternativas de sinalização por TGF-β. 11

1.3.5 Genes e fatores de transcrição responsivos a TGF-β 13

1.3.6 Papel do TGF-β na doença de Chagas. 15

1.3.7 Papel de TGF-β na biologia do T.cruzi. 16

1.4 Modificações pós-traducionais. 18

1.4.1 Fosforilação de Proteínas: Aspectos Gerais. 19

1.5 Fosforilação em Trypanosoma cruzi. 20

1.6 Fosfoproteômica. 21

1.7 Proteoma de T.cruzi. 22

2. OBJETIVOS 24

2.1 Objetivos Gerais 24

2.2 Objetivos Específicos 24

3. MATERIAL E MÉTODOS 25

3.1 Cultivo dos parasitos. 25

3.2 Preparo das amostras, Lise e Extração das Proteínas. 26

3.3 Precipitação e Dosagem das Proteínas. 26

3.4 Eletroforese Unidimensional. 27

xx

3.5 Eletroforese Bidimensional. 28

3.5.1 Focalização Isoelétrica (IEF, 1ª Dimensão). 28

3.5.2 Eletroforese em SDS/PAGE (2ª Dimensão) 29

3.6 Coloração dos Géis e Obtenção das Imagens. 30

3.7 Análise de Imagens. 31

3.8 Retirada e Processamento dos “spots”. 32

3.9 Identificação de proteínas por Espectrometria de Massas. 34

3.10 Identificação dos peptídeos. 35

3.11 Proliferação de epimastigotas em resposta a adição de TGF-β. 36

4. RESULTADOS 37

4.1 Curva de crescimento das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi.

37

4.2 Padronização da dose ótima de TGF-β. 38

4.3 Padronização do tempo ótimo de incubação com TGF-β. 40

4.4 Perfis bidimensionais de fosforilação e expressão de proteínas de formas epimastigotas de T. cruzi em resposta a TGF-β.

41

4.5 Análises dos perfis bidimensionais diferenciais de formas epimastigotas de T. cruzi em resposta ao TGF-β.

44

4.5.1 Quantidade total de “spots” protéicos em cada condição estudada 44

4.5.2 Identificação dos “spots” presentes nos mapas proteômicos de extratos de epimastigotas de T. cruzi.

45

4.5.3 Proteínas moduladas após a adição de TGF-β. 53

4.6 Proliferação das epimastigotas após adição de TGF-β. 88

5. DISCUSSÃO 89

6. CONCLUSÕES 111

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 112

Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Doença de Chagas

A Doença de Chagas, identificada pelo brasileiro Carlos Chagas em 1909, há

exatos 100 anos, é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e é

apontada como a maior causa de miocardite aguda e cardiomiopatia crônica

progressiva em regiões endêmicas da America Latina (Moncayo & Silveira, 2009).

Estimativas epidemiológicas recentes indicam que cerca de 12 milhões de pessoas

estão infectadas com T. cruzi e que haja de 100.000 a 200.000 novos casos por ano,

com 20 a 40 mil mortes ao ano (Fapesp, 2008).

A distribuição geográfica da doença (Figura 1.1), incluindo seus reservatórios

e vetores, se estende do sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e Chile. Dessa

forma, a infecção cobre praticamente toda a América, onde 90 milhões de pessoas

encontram-se expostas a infecção (Coura & Dias, 2009).

Os mecanismos de transmissão da doença de Chagas podem ser divididos

em dois grupos: (1) mecanismos principais, por via vetorial (triatomíneos), transfusão

sanguínea, alimentos contaminados e transmissão placentária; (2) mecanismos

secundários, por acidentes laboratoriais, transplantes de órgãos, transmissão sexual

e compartilhamento de seringas por usuários de drogas (Prata, 2001; Coura, 2007;

Coura & Dias, 2009). Devido ao movimento de migração populacional, um número

cada vez maior de casos de importação da doença de Chagas tem sido detectado

em áreas não endêmicas, como América do Norte e várias partes da Europa, Ásia e

Oceania (Schmunis, 2007).

___________________________________________________________________

Figura 1.1: mapa da distribuição geográfica destacando (em vermelho) os países onde a doença de Chagas é endêmica. Fonte: Organização Mundial de Saúde (1996).

Introdução

2

A doença de Chagas possui duas fases sucessivas: aguda e crônica. A fase

aguda inicia-se após um período de incubação de 7 a 10 dias e tem como principais

características a curta duração (1 a 3 meses) e a presença de parasitos no sangue

circulante do indivíduo infectado. Em alguns casos, são encontrados chagomas de

inoculação e/ou o sinal de romaña (figura 1.2), que são lesões na porta de entrada

do parasita, geradas principalmente em resposta à ruptura das células hospedeiras

pelo T. cruzi. Apesar disso, a sintomatologia pode passar despercebida, podendo

ser confundida com uma gripe comum. Os sintomas mais comuns são febre, astenia,

cefaléia, dores no corpo e anorexia, mas também pode ser observada a presença de

miocardite aguda em aproximadamente 80 a 90% dos casos agudos. A resposta

imune forte e específica associada à resposta imune inata controla a infecção

aguda, que evolui para a fase crônica. A cardiomiopatia chagásica é ainda uma

doença incurável, sendo segundo dados da Organização Pan-Americana de Saúde

(OPAS) uma das principais causas de doenças do miocárdio na América Latina

(Zeledon, 1997).

A fase crônica pode ser dividida em duas formas clínicas: (i) a indeterminada

(assintomática, mas com sorologia positiva), e a (ii) determinada, na qual sinais e

sintomas clínicos (figura 1.2) são observados em cerca de 30% dos indivíduos

infectados. As manifestações clínicas da doença de Chagas crônica estão

relacionadas com patologias envolvendo o coração, esôfago e intestino (Coura,

2007). Alterações cardíacas são as manifestações mais sérias e frequentes da

doença de Chagas crônica e afetam cerca de 20 a 40% dos indivíduos, em geral,

anos ou décadas após a infecção inicial (Rassi et al., 2009). A doença cardíaca

chagásica é também a causa mais comum de cardiomiopatia na América Latina e,

em áreas endêmicas, é a causa principal de morte cardiovascular entre pacientes de

30 a 50 anos (Rassi et al., 2000). A cardiomiopatia chagásica está geralmente

associada ao aumento do coração através de uma fibrose exacerbada e disfunções

que incluem arritmias, distúrbios de condução elétrica e falência congestiva do

coração (Higuchi et al., 1999).

Introdução

3

___________________________________________________________________

Figura 1.2: Manifestações clínicas características das fases aguda (a) e crônica (b e c) da doença de Chagas. a. Sinal de romanã, caracterizado como um edema unilateral bipalpebral (imagem retirada do endereço eletrônico http://www.jyi.org/features/ft.php?id=185). b. Chapa radiográfica e c. coração dissecado, revelando a cardiomegalia característica de pacientes com cardiomiopatia chagásica crônica (as imagens b e c foram retiradas de Gilles, 2000). 1.2. Trypanosoma cruzi

O T. cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas e pertence à família

Trypanosomatidae, que compreende um grande grupo de parasitos flagelados

heteroxênico capazes de causar doenças em humanos e outros animais (De Souza,

2002). Este parasito possui um ciclo de vida complexo, que se caracteriza pela

presença de vários estágios de desenvolvimento observados em hospedeiros

vertebrados e invertebrados (Kirchhoff, 1993; De Souza, 2002). Durante seu ciclo de

vida, três diferentes formas evolutivas de T. cruzi podem ser facilmente identificadas

(figura 1.3) por microscopia ótica em preparações coradas com Giemsa ou por

microscopia de fase, sendo elas: (a) Amastigotas, que também são conhecidas

como esferomastigotas, micromastigotas ou forma leishmanial. São formas

replicativas, que apresentam morfologia arredondada com flagelo curto e

cinetoplasto anterior ao núcleo. Estudos com amastigotas, obtidas de fontes

variadas, mostraram que as mesmas também são infectivas para células de

vertebrados (de Carvalho & de Souza, 1986; Andrews, 1990); (b) Epimastigotas, que

possuem formato fusiforme com 20 a 40 µm de comprimento, são formas flageladas

replicativas e apresentam o cinetoplasto em forma de disco côncavo, localizado

anteriormente ao núcleo. Estas formas de T. cruzi são observadas principalmente no

intestino de hospedeiros invertebrados. Epimastigotas são também encontradas

dentro de células de vertebrados durante o processo de diferenciação amastigota-

tripomastigota, sendo denominadas formas “epimastigotas- like” (Almeida-de-Faria et

al., 1999); (c) Tripomastigotas são as formas infectivas clássicas e apresentam

morfologia alongada com comprimento aproximado de 25 µm e um diâmetro de 2

µm. Estas formas apresentam cinetoplasto redondo e flagelo longo localizados na

região posterior e anterior ao núcleo, respectivamente. Elas são observadas em (i)

a b cc

células tissulares e no san

nas fezes, e na urina do hospedeiro invertebrado, (iii) na fase estacionária de

crescimento de culturas axênicas, e (iv) na fase líquida de culturas celulares. Essa

forma é incapaz de se dividir.

___________________________________________________________________

Figura 1.3: Formas evolutivas de Procopio et al., 1999), http://www.fiocruz.br/~ccs/arquivosite/estetica/chagas.htm) e http://www.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2004/Trypanosomiasis/morphology.htm).

O ciclo biológico (figura 1.4) começa quando o hospedeiro invertebrado se

alimenta do sangue do hospedeiro vertebrado. Os hospedeiros invertebrados são

membros das famílias Hemiptera e Reduvidae, como

infestans, Panstrongylus megistus

formas tripomastigotas presentes

pelo inseto. Sabe-se que é

tripomastigotas sanguíneas se transforma em epimastigotas e em formas

arredondadas. No intestino, as epimastigotas se dividem repetidam

processo denominado fissão binária. Essas formas podem se prender às células

intestinais através de hemidesmossomas, e no reto, uma certa parte das

epimastigotas se transforma em tripomastigotas metacíclicas, que são eliminadas

com as fezes e urina sendo capazes de infectar os hospedeiros vertebrados

& Azambuja, 1991; Zeledon, 1997; Kollien & Schaub, 2000)

Tem sido demonstrado que formas tripomastigotas podem se transformar em

formas arredondadas que possuem um flagelo livre. Esta forma, que aparece no

estômago do vetor invertebrado, é capaz de se transformar tanto em pequenas

epimastigotas que iniciam um pr

longas epimastigotas que se movem para a região mais posterior do trato digestivo

do inseto. Aparentemente essas formas longas de epimastigotas são incapazes de

se dividirem. Alguns dias após a ingestão do sang

transformarem em tripomastigotas são encontradas no reto. Com base na

4

células tissulares e no sangue de hospedeiros vertebrados, (ii) no intestino posterior,



forma é incapaz de se dividir.

___________________________________________________________________

Figura 1.3: Formas evolutivas de T. cruzi. a. tripomastigotas sanguíneas (imagem retirada de , b. epimastigotas (imagem retirada do endereço eletrônico

z.br/~ccs/arquivosite/estetica/chagas.htm) e c. amastigotas (imagem retirada de http://www.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2004/Trypanosomiasis/morphology.htm).


angue do hospedeiro vertebrado. Os hospedeiros invertebrados são

membros das famílias Hemiptera e Reduvidae, como Rhodinus prolixus

Panstrongylus megistus, entre outros. Durante o repasto sanguíneo, as

formas tripomastigotas presentes no sangue do hospedeiro vertebrado são ingeridas

se que é no estômago do inseto onde a maior parte das


arredondadas. No intestino, as epimastigotas se dividem repetidam




rina sendo capazes de infectar os hospedeiros vertebrados

& Azambuja, 1991; Zeledon, 1997; Kollien & Schaub, 2000).




epimastigotas que iniciam um processo de multiplicação no intestino, como em



se dividirem. Alguns dias após a ingestão do sangue, as amastigotas capazes de se


Introdução

gue de hospedeiros vertebrados, (ii) no intestino posterior,



___________________________________________________________________

tripomastigotas sanguíneas (imagem retirada de epimastigotas (imagem retirada do endereço eletrônico

amastigotas (imagem retirada de http://www.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2004/Trypanosomiasis/morphology.htm).


angue do hospedeiro vertebrado. Os hospedeiros invertebrados são

Rhodinus prolixus, Triatoma

, entre outros. Durante o repasto sanguíneo, as

no sangue do hospedeiro vertebrado são ingeridas

inseto onde a maior parte das


arredondadas. No intestino, as epimastigotas se dividem repetidamente por um




rina sendo capazes de infectar os hospedeiros vertebrados (Garcia




ocesso de multiplicação no intestino, como em



ue, as amastigotas capazes de se


Introdução

5

informação disponível até o momento parece que tanto epimastigotas como

amastigotas são capazes de se transformar em tripomastigotas (Garcia & Azambuja,

1991; Kollien & Schaub, 2000). As formas tripomastigotas metacíclicas eliminadas

nas fezes e urina do hospedeiro invertebrado são capazes de penetrar nas células

dos vertebrados, onde se transformarão em amastigotas. Estas se dividem

repetidamente por fissão binária e dão origem às tripomastigotas, que são capazes

de romper as células hospedeiras, sendo liberadas no espaço intercelular, podendo

tanto infectar células adjacentes como alcançar a corrente sanguínea

(tripomastigotas sanguíneos), invadindo novos tecidos ou serem ingeridas pelo

inseto vetor durante novo repasto sanguíneo, iniciando assim um novo ciclo (De

Souza, 2002).

___________________________________________________________________

Figura 1.4: Ciclo biológico de T. cruzi (imagem retirada do endereço eletrônico http://www.cdc.gov/).

Introdução

6

1.3. Fator Transformador de Crescimento beta (TGF- β)

1.3.1. A superfamília TGF- β

O Fator Transformador de Crescimento beta (“Transforming growth factor

beta” - TGF-β) pertence a uma superfamília que compreende um grande número de

fatores de crescimento polipeptídicos estruturalmente relacionados, capazes de

regular uma vasta série de processos celulares, como proliferação celular,

determinação de linhagem, diferenciação, motilidade, adesão e morte (Lawrence,

1995; Massague, 1998).

A superfamília TGF-β (figura 1.5) engloba uma ampla variedade de proteínas

sinalizadoras, incluindo isoformas do TGF-β, proteínas morfogênicas do osso

(BMPs), fatores de crescimento e diferenciação (GDFs), activinas, inibinas e

substância inibidora Mülleriana (Roberts & Sporn, 1993; Piek et al., 1999; Moustakas

& Heldin, 2005). Os ligantes TGF-β apresentam moléculas relacionadas estrutural e

funcionalmente, codificadas por diferentes genes, e suas isoformas são designadas

TGF-β, TGF-β2 e TGF-β3 (Burt & Law, 1994).

Introdução

7

Figura 1.5: Superfamília TGF-β (imagem retirada do endereço eletrônico http://www.rndsystems.com/dam_public/5895.pdf).

A atividade biológica do TGF-β depende de sua interação com receptores

específicos que transduzem o sinal bioquímico, resultando em um efeito biológico.

Somente a molécula ativa é capaz de se ligar ao seu receptor, e este mecanismo

representa um sistema típico de interação ligante-receptor, seguido de transdução

de sinal e culminando em um efeito final.

Introdução

8

O TGF-β é sintetizado sob uma forma latente contendo domínios C- e N-

terminais, que são clivados intracelularmente antes de serem secretados pelas

células, mas mantêm-se associados por interações eletrostáticas como um

complexo não-covalente (Murphy-Ullrich & Poczatek, 2000). No entanto, para

exercer seu efeito biológico, a forma latente precisa sofrer uma alteração na sua

conformação passando a um estado ativado. A forma latente é produzida por

diferentes tipos celulares, entre eles, macrófagos, plaquetas, fibroblastos e células

do baço. A síntese de TGF-β tem caráter heterogêneo: células T e monócitos

sintetizam principalmente TGF-β, e células do sistema nervoso central sintetizam

altos níveis de TGF-β3 (Moustakas et al., 2002). A maioria das células em cultura

produz TGF-β latente. No entanto, tanto células T ativadas quanto células

fagocíticas mononucleares ativadas podem secretar a forma ativa de TGF-β (Chen

et al., 2001).

Como os outros membros desta superfamília, a forma latente é uma proteína

homodimérica, cujas cadeias de aproximadamente 12,5 kDa são mantidas por

pontes dissulfeto. A latência é conferida pelo peptídeo de 75 kDa, denominado LAP

(“latency associated peptide”), localizado na região N-terminal da sequência do

precursor e que permanece ligado não-covalentemente ao TGF-β após sua

secreção (Massague, 1990; Lyons & Moses, 1990; Taipale et al., 1996).

A forma latente pode ser ativada por diferentes fatores incluindo proteases,

endoglicosidases e mudanças de pH ou temperatura (Hall et al., 1992). É possível

que, em condições fisiológicas (in vivo), um mecanismo em particular de ativação de

TGF-β latente seja dominante em relação aos outros.

1.3.2. Receptores de TGF- β

Uma vez ativado, o TGF-β pode então ser reconhecido pelos seus receptores

específicos de superfície, desencadeando o processo de sinalização intracelular.

TGF-β apresenta três receptores de superfície, sendo eles denominados: receptor

para TGF-β tipo I (TβRI), receptor para TGF-β tipo II (TβRII) e receptor para TGF-β

tipo III (TβRIII), que existem em virtualmente todos os tipos celulares estudados. Os

receptores do tipo I (53 kDa) e do tipo II (75 kDa) são serina/treonina quinase

transmembranares. Após a ligação ao TGF-β, TβRI é fosforilado pelo TβRII, que

detém as funções de sinalização, sendo mediador da maioria dos efeitos biológicos

Introdução

9

de TGF-β (Massague, 1998; Lijnen et al., 2000). TβRII é constitutivamente

fosforilado. Em mamíferos, cinco receptores do tipo II e sete do tipo I foram

identificados como ligantes da superfamília de TGF-β (Lutz & Knaus, 2002). Todos

são receptores transmembranares que contém um domínio intracelular

serina/treonina quinase. Além do TβRI, já foram descritos outros receptores de tipo I,

como ALK1 e ALK2 que transmitem a sinalização gerada pela ligação ao TGF-β

(Massague, 1998).

1.3.3. Via de sinalização clássica por TGF- β

A ligação inicial de TGF-β ativo ao TβRII, é seguida pelo recrutamento de

TβRI, formando um complexo heterotetramérico (Massague, 1998; Lutz & Knaus,

2002). TβRI é transfosforilado na sua região justamembranar, rica em glicina e

serina, denominada GS-Box. Esta fosforilação é mediada por TβRII, o que leva a

ativação de TβRI. Esta ativação não é devida a um aumento da atividade quinase,

mas é baseada na criação de um sítio de ligação para as proteínas Smad, que

representam o substrato para TβRI (Lutz & Knaus, 2002).

A ligação do TGF-β aos seus receptores de superfície não resulta apenas na

sinalização, mas também na endocitose do ligante associado ao receptor, que são

direcionados intracelularmente para a via de degradação nos compartimentos

tardios da via endocítica (Massague, 1998; Lutz & Knaus, 2002). O mecanismo

preciso da endocitose do receptor de TGF-β ainda é controverso. Alguns grupos

sugerem que esta internalização ocorre por endocitose mediada por clatrina (Anders

et al., 1997), outros por endocitose mediada por receptor independente de clatrina

ou ainda pela via das cavéolas (Zwaagstra et al., 2001). O receptor pode ainda,

dependendo do estímulo externo, retornar à superfície celular e participar de uma

nova cascata de sinalização intracelular (Mitchell et al., 2004).

Na via de sinalização clássica de TGF-β (figura 1.6) participam as proteínas

Smad, que compõem uma família de fatores de transcrição, sendo os substratos

para o receptor de tipo I (TβRI). Essas proteínas apresentam peso molecular entre

42 e 60 kDa e podem ser divididas em três sub-famílias: (i) Smads ativadas pelo

receptor (R- Smad) incluindo Smads ativadas por BMP (Smad 1, 5 e 8) e por TGF-β

(Smad 2 e 3); (ii) o mediador comum Smad4 (Co- Smad), e (iii) as Smad inibitórias,

Smad 6 e 7 (I-Smad) (Massague, 1998). TβRI causa a fosforilação das R-Smads no

Introdução

10

motivo SSXS da porção C-terminal que é conservado entre todas as R-Smads,

causando a dissociação do receptor e a formação de um sítio âncora para Smad 4,

formando então um complexo heteromérico. O complexo de Smads é translocado

para o núcleo, onde se associa a co-fatores e co-moduladores que se ligam ao DNA

para ativar a transcrição de determinados genes responsivos a TGF-β. A escolha

dos genes alvo é determinada pela composição do complexo de transcrição formado

(Massague & Chen, 2000; Lutz & Knaus, 2002).

Esta via clássica das Smads é conservada evolutivamente e é regulada por

diversos eventos de fosforilação, transporte núcleo-citoplasmático, degradação

proteassomal mediada por ubiquitina e, finalmente, por Smads inibitórias ((I)-Smads)

(Shi & Massague, 2003). As proteínas Smad são os únicos substratos conhecidos

para TβRI capazes de promover funções de sinalização celular em resposta a TGF-

β. Embora outras proteínas também sejam capazes de interagir com o receptor e

mediar o processo de sinalização, a característica de transmissão de sinal

diretamente do receptor para a maquinaria transcricional é única das Smads (Piek et

al., 1999). Por isso, a via clássica de Smads foi por muito tempo considerada como a

única via responsiva a TGF-β.

As proteínas Smad inibitórias são induzidas pela sinalização por Smad,

acumuladas no núcleo e podem ser então exportadas do núcleo após estímulo das

células por TGF-β ou BMP. Em seguida, elas se ligam aos receptores do tipo I e

exercem feedback negativa, através do bloqueio da fosforilação de proteínas R-

Smads e da formação do complexo R-Smad–Smad 4, estimulando a defosforilação

do receptor pelo recrutamento de fosfatases e promovendo a ubiquitinação e

degradação lisossomal do receptor (Moustakas & Heldin, 2005).

Figura 1.6: via clássica de sinalização por TGF-β (imagem retirada de Derynck & Zhang, 2003).

Introdução

11

1.3.4. Vias alternativas de sinalização por TGF- β

A via de Smads representada acima é de extrema importância para a

execução precisa de programas tissulares durante o desenvolvimento animal. Tem

sido firmemente estabelecido que as vias das Smads são mediadoras centrais da

transdução de sinais dos receptores dos membros da superfamília de TGF-β ao

núcleo (Barolo et al., 2002; Waite & Eng, 2003). Contudo, novas evidências

bioquímicas e de desenvolvimento apóiam a idéia de que, alternativamente, vias

não-dependentes de Smads também participam na sinalização por TGF-β

(Moustakas & Heldin, 2005).

A sinalização por vias independentes de Smads (figura 1.7) possui três

mecanismos gerais que contribuem para as respostas fisiológicas em resposta a

TGF-β: (1) vias de sinalização independentes de Smads modificam diretamente (ex.:

fosforilam) as Smads, e assim, modulam a atividade de efetores centrais; (2) as

proteínas Smad interagem e modulam diretamente a atividade de outras proteínas

sinalizadoras (ex.: quinases), deste modo, transmitindo sinais a outras vias; (3) os

receptores de TGF-β interagem diretamente com proteínas não-Smad ou fosforilam

as mesmas, iniciando uma sinalização paralela que colabora com a via das Smads

na produção de respostas fisiológicas.

Assim, transdutores de sinal não-Smad sob o controle de TGF-β fornecem

regulação quantitativa da via de sinalização e servem como pontos de interação

cruzada com outras importantes vias de sinalização, como as da tirosina quinase,

receptores acoplados a proteína G ou outros receptores de citocinas. A seguir,

daremos um breve relato sobre as vias alternativas já descritas na literatura.

Algumas evidências científicas relatam a associação de TGF-β a outras vias

de sinalização, incluindo as vias MAPKs, ERK, JNK, p38, PI3K, fosfatases PP2A e

ainda membros da família Rho. Algumas dessas vias regulam a ativação de Smads,

como descrito anteriormente, mas outras podem induzir respostas não relacionadas

à transcrição (Derynck & Zhang, 2003). A ativação dessas vias com cinética lenta

pode ser resultado de respostas geradas a partir da transcrição induzida pelas

Smads, entretanto, a rápida ativação (5 a 15 minutos), sugere independência da

transcrição por essas proteínas (Massague & Wotton, 2000).

Estudos científicos usando células deficientes em Smad 4 apóiam a

possibilidade da ativação da via MAPK que é independente de Smads (Engel et al.,

Introdução

12

1999). Além disso, receptores de TGF-β do tipo I mutados, deficientes na ativação

de Smads, ativam a sinalização por p38MAPK em resposta a TGF-β (Yu et al.,

2000). Os mecanismos de ativação de ERK, JNK ou p38MAPK por TGF-β e suas

consequências biológicas ainda estão pouco caracterizadas. A ativação induzida por

TGF-β das vias de ERK e JNK pode resultar na fosforilação de Smads e regular a

ativação das mesmas (de Caestecker et al., 1998); (Engel et al., 1999); (Kretzschmar

et al., 1999); (Funaba et al., 2002). Já a ativação da sinalização de Ras/Erk MAPK

por TGF-β pode induzir a expressão de TGF-β1, amplificando assim a resposta e

induzindo respostas secundárias à TGF-β (Yue & Mulder, 2000). A ativação das vias

MAPK por TGF-β pode também afetar respostas de transcrição através de efeitos

diretos sobre os fatores de transcrição que interagem com as proteínas Smad

(Massague & Chen, 2000; Itoh et al., 2000; Moustakas et al., 2001).

Dependendo da linhagem celular, outras vias de sinalização podem ser

induzidas. TGF-β pode rapidamente ativar GTPases semelhantes a Rho (“Rho-like

GTPases”), incluindo RhoA, Rac e Cdc42, apesar da ativação atrasada de RhoA e

Cdc42 (devido à síntese de novo de proteínas) ter sido também observada

(Bhowmick et al., 2001; Bakin et al., 2002; Edlund et al., 2002).

Figura 1.7: vias alternativas de sinalização por TGF-β (imagem retirada de Derynck & Zhang, 2003).

Introdução

13

1.3.5. Genes e fatores de transcrição responsivos a TGF-β

TGF-β ativa a transcrição por meio de interações físicas e da ajuda funcional

de Smads ligadoras de DNA com sequências específicas de fatores de transcrição e

com os co-ativadores CBP e p300 (Derynck & Zhang, 2003). Uma vez que o

complexo de Smad se liga ao DNA, ele pode controlar a transcrição de genes alvo

alterando a estrutura do nucleossoma, e assim, remodelando o molde de cromatina.

Através de seu domínio MH2, as Smads podem se ligar aos co-ativadores

p300/CBP, que possuem atividade histona acetil transferase, e também aos co-

repressores TGIF, c-ski e SnoN, que recrutam histonas desacetilases (Derynck et

al., 1998; Massague & Wotton, 2000). A atividade transcricional do domínio MH2 da

Smad se manifesta em fusões com o domínio de ligação ao DNA Gal4p, e exige a

presença de uma co-Smad. Smads e co-Smads podem recrutar o conjunto

necessário de co-ativadores ou co-repressores para orquestrar uma resposta

transcricional. (Massague & Chen, 2000).

O número de fatores de transcrição que se ligam ao DNA, com os quais as

Smads podem interagir funcionalmente é impressionante. Muitos genes são ativados

em resposta ao TGF-β, enquanto outros são transcricionalmente reprimidos. Assim,

dependendo do fator de transcrição com o qual interagem, do promotor e do

contexto intracelular, mecanismos distintos levam a sinalização mediada por Smad e

determinam se essas proteínas irão ativar ou reprimir a transcrição.

TGF-β inibe a progressão do ciclo celular através da regulação da transcrição

dos reguladores do ciclo celular. Entre eles, c-Myc e membros da família Id são

regulados negativamente por TGF-β. Em células onde a expressão do c-Myc é

regulada negativamente por TGF-β, a Smad3 reprime a transcrição de c-Myc em

associação com os fatores de transcrição E2F4 e E2F5, e o co-repressor p107. Este

complexo é pré-montado no citoplasma e, em resposta ao TGF-β, é translocado

para o núcleo, onde, em associação com a Smad4, se liga a um sítio de ligação

E2F-Smad no promotor c-Myc e reprime a expressão de c-Myc. Na regulação

negativa de Id1, a Smad3 ativada por TGF-β induz diretamente a expressão de

ATF3, e então, a Smad3 junto a ATF3 formam um complexo que reprime o promotor

Id1. Da mesma forma, SIP1 induzida por TGF-β, regula negativamente a expressão

de E-caderina. TGF-β também inibe a diferenciação de mioblastos, osteoblastos e

adipócitos através da repressão funcional de fatores de transcrição-chave que

conduzem essas vias de diferenciação. Smad3 reprime a transcrição por

Introdução

14

Runx2/CBFA1 na diferenciação dos osteoblastos; MyoD e outros fatores de

transcrição miogênicos básicos hélice-alça-hélice nos mioblastos e CCAAT/proteínas

estimuladoras de ligação na diferenciação dos adipócitos. A repressão ou ativação

da transcrição pelas Smads depende também do tipo de célula e da sequência

promotora a qual se ligam (Derynck & Zhang, 2003).

TGF-β pode também causar a rápida inibição da transcrição de genes, como

o da fosfatase ativadora de CdK Cdc25A (Iavarone & Massague, 1997), mediando

efeitos anti-proliferativos. A ativação transcricional por TGF-β da PAI-1 (Chang &

Goldberg, 1995), receptores de ácido retinóico (Chen et al., 1996), α2 de colágeno(I)

e outros genes (Chang & Goldberg, 1995) parece precisar da atividade da AP-1.

Além disso, um repressor contendo Fos (“Fos-containing repressor”) foi relacionado

à regulação negativa da protease secretora transina/estromalisina por TGF-β (Kerr

et al., 1990). Não é certo que as Smads participem em todas, ou até mesmo na

maioria das respostas gênicas por TGF-β (Massague, 1998).

Vários genes responsivos a TGF-β têm sido descritos, mas apenas uma

fração desses tem as características de uma resposta transcricional imediata.

p15Ink4b e p21Cip1 são inibidores quinase dependentes de ciclina, cuja rápida indução

em resposta a TGF-β medeia a parada do ciclo celular. “Clusters” de sítios do tipo

Sp1 próximos ao sítio de início da transcrição de p15Ink4b e p21Cip1 contam como

regiões responsivas a TGF-β em ensaios de gene repórter.

A expressão estimulada por TGF-β de colágenos intersticiais e outras

proteínas da matriz extracelular revelam um papel importante do TGF-β nos

processos de desenvolvimento e regenerativos (Massague, 1990; Roberts et al.,

1990; Roberts & Sporn, 1993). As regiões responsivas a TGF-β dos genes que

codificam as proteínas da matriz extracelular, como α1 do colágeno (I) (Ritzenthaler

et al., 1993), α2 de colágeno (I) (Rossi et al., 1988; Inagaki et al., 1994), inibidor do

ativador de plasminogênio do tipo 1 (PAI-1) (Keeton et al., 1991; Riccio et al., 1992),

elastina (Marigo et al., 1994), e perlecan (Iozzo et al., 1997) se assemelham aos

sítios Sp1 ou aos sítios CTF/NF-I.

Introdução

15

1.3.6. Papel do TGF- β na Doença de Chagas

O TGF-β foi inicialmente descrito como fator transformador de crescimento e

proliferação de células tumorais (Todaro et al., 1980). No entanto, estudos

posteriores indicaram que ele apresentava uma função pleiotrópica, podendo

desempenhar atividades proliferativas e anti-proliferativas, sendo capaz tanto de

inibir como estimular o crescimento de um mesmo tipo celular, dependendo das

condições da cultura e do grau de confluência das células (Massague, 1998).

Além da ação na proliferação celular, o TGF-β é uma das principais citocinas

envolvidas na regulação da formação e degradação de matriz extracelular

(Massague, 1998), induzindo a expressão de vários componentes de matriz, como

fibronectina, laminina, colágeno, vitronectina e trombospondina. A inibição da

degradação de matriz é devida à diminuição da atividade proteolítica pericelular

(Taipale et al., 1996).

A produção exacerbada de TGF-β na infecção pelo T. cruzi foi inicialmente

descrita por Silva e colaboradores em 1991. Este estudo demonstrou que células do

baço de camundongo apresentam no oitavo dia de cultura in vitro um aumento na

produção de TGF-β, variando aproximadamente de 2 ng/ml na cultura não infectada

para 5 ng/ml na cultura infectada por T. cruzi. Além disso, o TGF-β se mostrou como

um potente inibidor de INF-γ, sendo responsável pelo aumento da replicação de

T.cruzi dentro dos macrófagos.

Estudos demonstraram o envolvimento do TGF-β na cardiopatia chagásica

aguda e crônica, com exacerbação de seus níveis plasmáticos e da ativação da sua

via de sinalização celular como aspectos peculiares de pacientes nos estágios mais

avançados da doença (Araujo-Jorge et al., 2002; Waghabi et al., 2002).

A cardiopatia chagásica está geralmente associada ao aumento do coração

através de uma fibrose exacerbada e disfunções incluindo arritmias, distúrbios de

condução elétrica e falência congestiva do coração (Higuchi et al., 1999). A fibrose é

uma das manifestações mais significativas da cardiopatia chagásica crônica (CCC) e

encontra-se associada com infiltrados inflamatórios e cardiomiócitos em

degeneração (Andrade et al., 1989; Rossi & Bestetti, 1995; Rossi, 2001). Além de

sua participação na produção de proteínas da matriz extracelular e conseqüente

fibrose, TGF-β pode modular outras manifestações cardíacas, incluindo a

proliferação e morte dos cardiomiócitos. A sinalização por TGF-β está relacionada a

Introdução

16

resposta de hipertrofia dos cardiomiócitos à estimulação pelo receptor β1-

adrenérgico (Rosenkranz, 2004), a qual pode amplificar o crescimento hipertrófico

após o infarto do miocárdio e causar a transição entre uma hipertrofia adaptativa e

uma hipertrofia descompensada.

1.3.7. Papel de TGF-β na biologia do T. cruzi

Diversos estudos foram desenvolvidos demonstrando claramente que TGF-β

desempenha várias funções não somente na progressão da doença de Chagas,

como também no controle em diferentes etapas do ciclo de vida e infectividade de T.

cruzi (Waghabi et al., 2002; Waghabi et al., 2005a; Waghabi et al., 2005b; Waghabi

et al., 2007; Araujo-Jorge et al., 2008).

Sabe-se que o T. cruzi é capaz de ativar diretamente TGF-β latente (Waghabi

et al., 2005b), e com isto, dispara sua via de sinalização dependente de Smad,

sendo a ativação desta via necessária durante os eventos de invasão à célula

hospedeira (Ming et al., 1995; Hall & Pereira, 2000). Estudos com cardiomiócitos

infectados in vitro por T. cruzi demonstram que formas amastigotas de T. cruzi são

capazes de captar e internalizar TGF-β do hospedeiro, estocando-o, o que sugere

um novo papel de TGF-β no ciclo celular do parasito: seu uso no momento de

sinalizar a parada da proliferação e iniciar a diferenciação para formas

tripomastigotas (Waghabi et al., 2005a), podendo refletir uma dependência do

parasito por uma molécula da célula hospedeira que pode ser usada para regular

seu próprio ciclo intracelular.

Esses resultados também sugerem a presença de receptores para TGF-β na

superfície celular de T. cruzi, assim como a existência de uma via de sinalização

intracelular capaz de transduzir os efeitos de TGF-β. Genes ortólogos para os

receptores serina/treonina quinase canônicos (TβRI e TβRII) e proteínas Smads já

foram identificadas no parasito helminto Schistosoma mansoni, mas não foram

encontradas após análises “in silico” do genoma de T. cruzi (Waghabi et al., 2005a).

Sendo assim, espera-se que neste microorganismo deva ocorrer uma via alternativa

de sinalização por TGF-β e que seus possíveis receptores celulares sejam distintos

dos já descritos para mamíferos.

Introdução

17

Como descrito acima, muitas vias de sinalização Smad-independentes são

conhecidas por serem ativadas ou moduladas por TGF-β em células eucarióticas.

Entre estas estão incluídas Jun-kinase, p38MAP-kinase, Ras/MEK/ERK, Rho-A/

p160ROCK e PP2A/S6kinase. Alguns estudos mostraram a presença de homólogos

de Ras (Razani et al., 2001), Rho (Dong et al., 2000) e ERK (Sasaki et al., 2001;

Tang et al., 2003) em T. cruzi e T. brucei, sugerindo que pelo menos algumas

dessas vias alternativas de TGF-β possam ser funcionais nesses parasitos, embora

os mecanismos envolvidos nesta ativação, assim como suas consequências

biológicas, ainda não estejam elucidados (Derynck & Zhang, 2003).

O novo papel do TGF-β da célula hospedeira descrito nesses trabalhos

acrescenta complexidade para a biologia do T. cruzi, com implicações adicionais

para esta citocina na Doença de Chagas. De forma geral, o TGF-β parece: (1) ser

ativado na superfície da célula hospedeira a partir de TGF-β latente, mecanismo

este mediado pelo parasito, (2) induzir sinalização via receptores de TGF-β da célula

hospedeira, favorecendo assim a invasão celular, (3) ser captado e estocado

intracelularmente pelos parasitos, participando do processo de diferenciação de

formas amastigotas para tripomastigotas, e (4) desencadear a fibrose na

cardiomiopatia chagásica.

Outro estudo recente mostra que o bloqueio da via de sinalização intracelular

de TGF-β nas células hospedeiras, pela ação de um inibidor do receptor de TGF-β

tipo I (TbRI), SB-431542, é capaz de inibir a invasão de T. cruzi e induzir um retardo

na proliferação de formas amastigotas e na diferenciação destas formas em

tripomastigotas ao final do ciclo, mostrando mais uma vez o envolvimento de TGF-β

no ciclo de vida de T. cruzi (Waghabi et al., 2007). A reversão da capacidade do

TGF-β em desenvolver fibrose no miocárdio infectado pelo T. cruzi foi testada in vivo

utilizando-se o modelo murino através do uso de SB-431542. Foi observada uma

redução dos níveis de parasitemia, das taxas de mortalidade, dos infiltrados

inflamatórios e carga parasitária no coração dos animais infectados tratados na fase

aguda da doença (Waghabi et al., 2009).

A atividade final de TGF-β sempre parece ser dependente de eventos de

sinalização celular, ativação e degradação de genes responsivos e, em todos estes

aspectos, a fosforilação de proteínas ocorre como processo-chave. Daremos a

seguir um breve relato sobre fosforilação de proteínas.

Introdução

18

1.4. Modificações pós-traducionais

Após serem sintetizadas, as proteínas podem sofrer alterações, denominadas

modificações pós-traducionais (“post translational modifications” - PTM). As PTMs

alteram as ligações covalentes, modificando as propriedades de uma proteína,

através de clivagem proteolítica. As PTMs de uma proteína podem determinar seu

estado de atividade, localização, reciclagem (“turnover”) e interação com outras

proteínas, além de alterarem as estruturas terciárias e quaternárias da proteína

modificada (Mann & Jensen, 2003).

Muitas PTMs foram descobertas durante estudos de proteínas individuais com

a ajuda de técnicas moleculares clássicas, como a deleção de aminoácidos

carreadores da modificação. Para a análise dessas modificações em uma única

proteína é interessante primeiro obtê-la pura, em grandes quantidades, o que

normalmente é feito pelo uso dos métodos de purificação cromatográfica,

precipitação com anticorpos específicos ou ambas as técnicas combinadas. A

análise de modificações é, em geral, feita pela comparação da sequência de

aminoácidos obtida experimentalmente para a proteína possivelmente modificada

com a sequência de aminoácidos previamente conhecida da proteína intacta. Desta

forma, o primeiro passo é a identificação da proteína a ser estudada, o que pode ser

feito com alta sensibilidade pelo reconhecimento de anticorpos (western blot) ou por

técnicas de espectrometria de massas (MS) (Mann & Jensen, 2003).

A espectrometria de massas tem continuamente aumentado a sensibilidade

de detecção das PTMs. A MS mede a razão massa/carga, fornecendo o peso

molecular e o padrão de fragmentação de peptídeos derivados de proteínas. Dessa

forma, a MS constitui um método geral para a identificação de modificações que

alteram a massa molecular de uma proteína. Por essa razão, tem sido vastamente

utilizada para mapear a estrutura primária completa de proteínas individuais (Carr et

al., 1989; Ling et al., 1991; Roepstorff, 1997).

O novo campo da Proteômica é também promissor na identificação de PTMs.

A técnica tem sido bastante valiosa na resolução e identificação de grandes

conjuntos de proteínas presentes em organelas ou em todo um organismo em

estudo, a partir de um único experimento. A eletroforese bidimensional separa as

populações de proteínas com base em suas cargas e massas moleculares. A

Introdução

19

técnica oferece resolução suficiente para separar diretamente os diferentes estados

modificados de cada proteína presente na amostra (Mann & Jensen, 2003).

A intensidade da coloração dos “spots” protéicos presentes nos géis

bidimensionais reflete fortemente a quantidade da proteína contida no gel,

especialmente para proteínas similares. Dessa forma, o método é capaz de gerar

informações sobre a proporção relativa dos vários estados modificados de uma

proteína. Entre algumas das principais modificações pós-traducionais temos:

acetilação, metilação, glicosilação, acilação, deamidação, ubiquitinação e

fosforilação (Mann & Jensen, 2003).

1.4.1. Fosforilação de Proteínas: Aspectos Gerais

Desde o isolamento da fosfoserina em 1932, descrita primeiramente como

ácido fosfórico serina, a fosforilação de proteínas tornou-se uma das modificações

pós-traducionais mais estudadas e biologicamente relevantes. A fosforilação é uma

modificação reversível, que afeta o enovelamento e, consequentemente, a atividade

de proteínas, regulando funções essenciais como divisão celular, transdução de

sinal, atividade enzimática, entre outras (Paradela & Albar, 2008).

A presença ou ausência de grupamentos fosfato nas cadeias laterais de

aminoácidos, tais como serina, treonina e tirosina, é usada para modular a atividade

biológica da proteína e propagar sinais em vias e redes de sinalização celular

(Cohen, 1992; Cohen, 2000). Sendo a fosforilação um processo dinâmico, os sítios

de fosforilação não podem ser preditos a partir da análise da sequência genômica de

um organismo, requerendo medições analíticas para a verificação experimental

desses sítios de modificação. A análise de sítios de fosforilação pelo uso de

espectrometria de massas já é desafiadora quando apenas uma proteína é

analisada, e torna-se uma tarefa ainda mais difícil quando se propõe executar

medições em escala proteômica (fosfoproteômica) (Goshe, 2006).

A fosforilação e a defosforilação nos resíduos S (serina), T (treonina) e Y

(tirosina) são as modificações mais conhecidas envolvidas na ativação e inativação

reversível de atividades enzimáticas e modulação de interações moleculares em vias

de sinalização nos eucariotos (Pawson, 2002). Contudo, a fração de proteínas

fosforiladas é geralmente muito pequena in vivo (<0.1%) e a reversão desta

Introdução

20

modificação ocorre de maneira rápida. Assim, para detecção específica de

peptídeos fosforilados é indispensável o uso de inibidores de fosfatases (Seo & Lee,

2004).

1.5. Fosforilação em Trypanosoma cruzi

Com o desenvolvimento do projeto genoma de T. cruzi, estima-se que

aproximadamente 2% de seu genoma codifica para proteínas quinases, sugerindo

um importante papel regulatório para estas proteínas no controle das funções e

desenvolvimento deste parasito (Parsons et al., 2005).

Recentemente, um estudo comparativo dos quinomas de tripanossomatídeos

mostrou que T. brucei, T. cruzi e Leishmania major possuem 176, 190 e 199 genes

preditos como codificantes para proteínas quinases, respectivamente (Parsons et al.,

2005; Naula et al., 2005). Dessas quinases, aproximadamente 12% são exclusivas

dos tripanossomatídeos (Parsons et al., 2005; Naula et al., 2005), não tendo sido

ainda identificadas no genoma de outros organismos. Entre as proteínas fosfatases,

T. brucei, T. cruzi e L. major possuem 78, 86 e 88 genes, respectivamente.

Aproximadamente 40% dos genes codificantes para fosfatases são atípicos, sem

nenhum ortólogo claro identificado no genoma de outros eucariotos (Brenchley et al.,

2007). As diferenças significativas identificadas entre as quinases de T. cruzi e da

célula hospedeira sugerem que a inibição específica de enzimas do parasito pode

ser alcançada, podendo representar uma nova abordagem terapêutica no controle

da doença de Chagas.

Apesar da importância da fosforilação de proteínas em muitos processos

celulares, poucos estudos identificaram sítios de fosforilação em proteínas dos

tripanossomatídeos (Nakayasu et al., 2009). Recentemente, a análise proteômica de

formas amastigotas e promastigotas de L. donovani permitiu a identificação de 73

fosfoproteínas com diversas funções biológicas. Contudo, os sítios específicos de

fosforilação dessas proteínas ainda não foram identificados (Morales et al., 2008).

Outro estudo proteômico em L. donovani identificou 18 sítios de fosforilação

provenientes de 16 fosfopeptídeos distintos (Rosenzweig et al., 2008).

Introdução

21

1.6. Fosfoproteômica

Em geral, a análise das modificações pós-traducionais pode ser feita por um

método combinando eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. No

caso de fosfoproteínas, o poder único de resolução da eletroforese bidimensional

permite a separação de diferentes formas modificadas de uma mesma proteína em

“spots” distintos no gel (Gianazza et al., 1989). Fosforilações heterogêneas de

proteínas geram uma série de “spots” com o mesmo peso molecular, mas com

diferentes valores de ponto isoelétrico (pI). Estes “spots” provenientes de uma

mesma proteína são visualizados como uma espécie de linha horizontal pontilhada

no gel.

As análises de modificações pós-traducionais são mais difíceis do que a

identificação direta de proteínas, pelas seguintes razões: (a) métodos altamente

sensíveis são requeridos para detecção, devido à baixa estequiometria. Por

exemplo, já que apenas 5 a 10% do substrato da proteína quinase é fosforilado, são

necessários métodos para detectar a proteína modificada em níveis muito baixos

(<5-10 fmol); (b) já que a ligação covalente entre a modificação pós-traducional e a

cadeia lateral de aminoácidos é tipicamente instável, é muitas vezes difícil manter o

peptídeo em seu estado modificado durante a preparação da amostra e

subseqüente ionização durante a espectrometria de massas, e (c) modificações pós-

traducionais são frequentemente transientes na homeostase dinâmica da natureza

(Seo & Lee, 2004).

Corantes fluorescentes foram recentemente desenvolvidos para detectar

proteínas, incluindo proteínas modificadas pós-traducionalmente, com alta

sensibilidade e linearidade. Um desses corantes se chama ProQ Diamond

(Molecular Probes) e é usado para detecção de fosfoproteínas. O ProQ Diamond

liga-se direta e especificamente a(s) molécula(s) de fosfato das fosfoproteínas em

níveis tão baixos como 1 ng e é totalmente compatível com outros corantes e com a

espectrometria de massas (Steinberg et al., 2003; Schulenberg et al., 2004; Agrawal,

2009).

Portanto, a combinação de eletroforese bidimensional com ProQ Diamond

permite a análise quantitativa de fosfoproteínas em uma escala global, sendo este

um grande avanço no campo da fosfoproteômica.

Introdução

22

1.7. Proteoma de T. cruzi

Durante o processo de diferenciação das formas evolutivas de T. cruzi

ocorrem mudanças no seu padrão de expressão protéica, como já descrito na

literatura na diferenciação das promastigotas para amastigotas em espécies de

Leishmania (Bente et al., 2003). Algumas proteínas estágio-específicas

desempenham papéis importantes na infectividade e sobrevivência, podendo ser

considerados como alvos racionais para o desenho de drogas. Com o intuito de

entender as bases moleculares da diferenciação do parasito, trabalhos anteriores se

interessaram pela identificação de proteínas específicas, expressas nas diferentes

formas do parasito (Parodi-Talice et al., 2004; Paba et al., 2004).

A abordagem proteômica é uma ferramenta valiosa para o estudo de padrões

globais de expressão gênica (Hancock et al., 1999; Tyers & Mann, 2003). Esta

metodologia tem sido empregada no estudo dos tripanossomatídeos (Paba et al.,

2004; Parodi-Talice et al., 2004; Atwood et al., 2005; Magalhaes et al., 2008; Ferella

et al., 2008; Sodre et al., 2009; Ayub et al., 2009) e sua aplicação tem se mostrado

particularmente importante, já que nestes organismos a regulação da expressão

gênica ocorre principalmente ao nível pós-transcricional (Clayton & Shapira, 2007).

Todos os genes codificantes para proteínas em tripanossomatídeos estão

organizados em grandes unidades policistrônicas de transcrição que geram RNAs

precursores policistrônicos, onde estes são então processados a RNAs

monocistrônicos pelo mecanismo de “trans-splicing”. Supõe-se que nesses

microorganismos a regulação gênica ocorra apenas através do controle da

estabilidade e/ou tradução de RNAs específicos (Graham & Barry, 1995; Vanhamme

& Pays, 1995).

Além disso, modificações pós-traducionais desempenham um papel

importante na modulação da função de proteínas nesses parasitos. Juntas, essas

considerações apóiam as análises proteômicas como uma abordagem ideal para

avaliar os níveis de expressão protéica em diferentes estágios ou sob tratamentos

específicos nos tripanossomatídeos. Além disso, uma abordagem proteômica para

T. cruzi se torna ainda mais significante dado o fato de que o projeto genoma para

este parasito já foi concluído (El-Sayed et al., 2005; Degrave et al., 2001; Luchtan et

al., 2004).

Introdução

23

Análises proteômicas em larga escala ou “high-throughput” são ainda

incompletas, uma vez que as metodologias disponíveis não possuem faixa dinâmica

suficiente para identificar e quantificar todas as proteínas expressas por um

organismo. Nos estudos realizados até o momento, estima-se que aproximadamente

50% de todo espectro possível de proteínas pode ser mapeado dentro de 67 grupos

de proteínas mais abundantes (Atwood et al., 2005). Um número maior de proteínas

de baixa abundância pode ser revelado após a depleção dessas proteínas altamente

abundantes, antes da realização da análise proteômica. Análises do proteoma de T.

cruzi revelam a operação de várias vias estágio-específicas, previamente não

documentadas e que podem ser alvos apropriados para o desenvolvimento de novas

drogas contra a Doença de Chagas. Entre os alvos mais interessantes estão as vias

propostas para geração de energia em amastigotas e epimastigotas.

Adicionalmente, a identificação das proteínas expressas em abundância em formas

tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi forneceram uma nova fonte substancial de

candidatos para o desenvolvimento de vacinas (Atwood et al., 2005).

Possíveis novos candidatos poderiam surgir do mapeamento de vias de

transdução de sinais essenciais para sobrevivência e desenvolvimento desses

parasitos, porém ausentes em seus hospedeiros vertebrados. A fosforilação de

proteínas desempenha um papel importante em diversas vias de sinalização de T.

cruzi, e seu estudo pode constituir fonte para a detecção de novos alvos

terapêuticos contra a doença de Chagas.

Objetivos

24

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos Gerais

Nosso trabalho possui como principal objetivo a caracterização dos padrões

de fosforilação de proteínas de epimastigotas de T. cruzi em resposta a adição de

TGF-β ao meio de cultura, através de uma abordagem proteômica; e a identificação

de moléculas envolvidas na via de sinalização disparada por TGF-β nesse

microorganismo.

2.2. Objetivos Específicos

Para o alcance dos principais objetivos do nosso trabalho, temos como metas

específicas:

(1) Padronizar a dose ótima de indução de fosforilação nas proteínas de

epimastigotas de T. cruzi com TGF-β;

(2) Caracterizar o tempo ótimo de indução de fosforilação nas proteínas de

epimastigotas de T. cruzi com TGF-β;

(3) Analisar as diferenças entre os perfis unidimensionais dos extratos protéicos das

epimastigotas incubadas ou não nos tempos de 1, 5, 15, 30 e 60 minutos com TGF-

β a 4°C;

(4) Analisar as diferenças entre os perfis bidimensionais das epimastigotas

incubadas ou não nos tempos de 1, 5, 15, 30 e 60 minutos com TGF-β a 4°C;

(5) Identificar os “spots” referentes às proteínas que em resposta a TGF-β

apresentam alterações nos padrões de fosforilação e expressão;

(6) Observar o efeito na proliferação de epimastigotas após adição de 5 ng/ml de

TGF-β à cultura de T. cruzi.

Materiais e Métodos

25

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Cultivo dos parasitos

Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi da cepa Y foram mantidas em

cultura axênica em meio LIT (“Liver Infusion Tryptose”) (tabelas 3.1, 3.2 e 3.3) a

28°C. Passagens consecutivas foram realizadas sempr e no 7º dia de crescimento,

obtendo-se ao final do processo uma concentração de 5,0 x 106 células/mL.

Tabela 3.1: Preparo da solução inorgânica (2x) do meio de cultura LIT.

NaCl 8 g/L

KCl 0,8 g/L

Na2HPO4 16 g/L

O meio de cultura é esterilizado em autoclave.

Tabela 3.2: Preparo da solução orgânica (2x) do meio de cultura LIT.

Triptose 10 g/L

Liver Broth Infusion 10 g/L

O meio de cultura é esterilizado em autoclave.

Tabela 3.3: Preparo do meio de cultura LIT.

LIT Para preparo de 1 litro de

solução

Sol. Inorgânica 2x 445 ml

Sol. Orgânica 2x 445 ml

Glicose (0,2 g/ml) 10 ml

Hemina (450 mg/ml) 500 µl

Soro Fetal Bovino 100 ml


26

3.2. Preparo das Amostras, Lise e Extração das Prot eínas

Para o preparo de extratos de proteínas totais, os parasitos foram coletados

da cultura no quinto dia após a passagem, quando as epimastigotas encontram-se

no final da fase logarítimica de crescimento. Epimastigotas na concentração de

5x108 parasitos/ml passaram por dois ciclos de lavagem em PBS/BSA 0,1% seguido

por centrifugação a 720xg por 15 minutos, sendo finalmente ressuspensos nesta

mesma solução. Os parasitos foram então transferidos para microtubos. Para os

ensaios da dose ótima de TGF-β indutora de fosforilação de proteínas, foi

adicionado ou não TGF-β recombinante humano (R&D) nas concentrações de 1,25 /

2,5 / 5 e 10 ng/ml durante 15 minutos a 4ºC. Para avaliarmos o tempo ótimo de

indução de fosforilação, os parasitos foram incubados ou não com TGF-β (5 ng/ml)

nos tempos de 1, 5, 15, 30 ou 60 minutos a 4ºC. Após os tempos de incubação

acima determinados, os tubos foram centrifugados a 720xg por 5 minutos e lavados

duas vezes com PBS. O processo de lise dos parasitos se inicia após a retirada do

sobrenadante, quando então o sedimento é ressuspenso em 500 µl de tampão de

lise (PBS diluído 10x/coquetel de inibidores de protease 1:100 (Sigma)/coquetel de

inibidores de fosfatase 1:100 (Sigma). Em seguida, as células são completamente

lisadas com quatro ciclos de congelamento/descongelamento e armazenadas a uma

temperatura de – 70ºC.

3.3. Precipitação e Dosagem das Proteínas

As proteínas foram precipitadas com ácido tricloroacético a uma concentração

final de 17% por 10 minutos a -20ºC seguido de centrifugação por 10 minutos a uma

velocidade de 16.100xg. Após centrifugação, o sedimento foi lavado com solução

gelada de acetona/trietanolamina 1%. Em seguida, as amostras foram centrifugadas,

o sobrenadante descartado e o sedimento ressuspenso em tampão de focagem

isoelétrica (tampão IEF – 8M Uréia/2% CHAPS) contendo inibidores de fosfatase

(1:100; Sigma). A dosagem de proteínas foi realizada pelo Kit de dosagem RCDC -

BioRad (modificado de Lowry et al., 1951), segundo instruções do fabricante,

empregando-se BSA como padrão.


27

3.4. Eletroforese Unidimensional

Uma quantidade de 20 µg de amostra de extratos totais de epimastigotas de

T. cruzi foi misturada a tampão de amostra de proteína 1x (tabela 3.4) para um

volume final de 20 µl. A mistura foi em seguida aquecida a 100ºC por 5 minutos.

Posteriormente, as amostras foram submetidas à eletroforese em géis 12% SDS-

PAGE (tabela 3.5) de 7 centímetros em tampão de corrida Laemmli (Laemmli, 1970)

a 200 volts (tabela 3.6).

Tabela 3.4: Tampão para aplicação de amostras de proteína em gel SDS-PAGE (1X).

Tris-HCl (pH6,8) 62,5mM

SDS 2%

β-mercaptoetanol 5% (v/v)

Azul de bromofenol 0,002%

Glicerol 10% (v/v)

Tabela 3.5: Géis 12% SDS-PAGE para “strips” de 7cm.

Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 1,5mL

Acrilamida 30%/ Bis Acrilamida 0,8% 2,4mL

SDS 10% 60µL

APS 10% 60µL

TEMED 6µL

H2O Milli-Q 1,98mL

Tabela 3.6: Tampão de corrida Laemmli.

Tris-base 24,6 mM

Glicina 192 mM

SDS 3,48 mM


28

3.5. Eletroforese Bidimensional

3.5.1. Focalização Isoelétrica (IEF, 1ª dimensão)

Para a focalização isoelétrica foram utilizadas 100 µg (gel de 7 centímetros)

ou 500 µg (gel de 17 centímetros) de proteínas dos extratos de epimastigotas

obtidos como descrito acima, já solubilizadas na presença de agentes caotrópicos.

As amostras foram descongeladas a 4°C e a cada uma delas foram adicionados: o

agente redutor TBP para uma concentração final de 2 mM, 1% de anfólitos (p/v),

traços de azul de bromofenol e o volume final foi ajustado para 125 µl (géis de 7 cm)

ou 300 µl (géis de 17 cm) com tampão IEF. A mistura foi homogeneizada e mantida

à temperatura ambiente por uma hora, período suficiente para interação entre

amostra e reagentes. Ao término do período, as amostras foram colocadas em

contato por uma hora com tiras de gel (“strips” - ReadyStrip IPG Strip - BIO-RAD)

com gradiente de pH imobilizado na faixa de pH de 3 a 10 não-linear. As tiras de gel

foram colocadas cuidadosamente na cuba de focagem isoelétrica (BioRad). Após

uma hora, as tiras IPG são cobertas com 1 ml (7 cm) ou 2 ml (17 cm) de óleo mineral

e a cuba é colocada na célula de focalização isoelétrica (Protein IEF Cell - BioRad).

A reidratação ativa é realizada por 11 horas a 50 volts e após seu término, inicia-se

o programa de focalização isoelétrica apropriado, conforme instruções do fabricante,

descrito na tabela 3.7.

Tabela 3.7: Parâmetros para focalização isoelétrica.

Géis de 17 centímetros

Passo 1 : 250V – Corrente constante – 20 minutos

Passo 2 : 10000V – Corrente constante – 2,5 horas

Passo 3 : 10000V – 80000V - Rampagem Rápida

Passo 4 : 500V – Rampagem Rápida – 5 horas

Géis de 7 centímetros

Passo 1 : 250V – Corrente constante – 20 minutos

Passo 2 : 4000V – Corrente constante – 2 horas

Passo 3 : 4000V – 12500V - Rampagem Rápida

Passo 4 : 500V – Rampagem Rápida – 5 horas


29

3.5.2. Eletroforese em SDS/PAGE (2 a dimensão)

Uma etapa fundamental é aplicada às proteínas separadas por focalização

isoelétrica antes da corrida de segunda dimensão. O processo denominado

equilíbrio dos “strips” é responsável por: (1) manter a redução das pontes dissulfeto

e (2) alquilação dos grupos sulfidrilas resultantes dos resíduos de cisteína.

Dessa forma, ao final da focalização isoelétrica as tiras de IPG são incubadas

por 15min, sob leve agitação à temperatura ambiente no tampão de equilíbrio I

(tabela 3.8). Em seguida, o tampão de equilíbrio I é devidamente descartado e as

tiras IPG são incubadas com o tampão de equilíbrio II (tabela 3.9) por 15min à

temperatura ambiente, sob leve agitação.

Tabela 3.8: Tampão de Equilíbrio I.

Uréia 6 M

SDS 10% (p/v) 2%

Tris-HCl 1,5M pH 8,8 0,375 M

Glicerol 100% 20%

DTT 130 mM

Tabela 3.9: Tampão de Equilíbrio II.

Uréia 6 M

SDS 10% (p/v) 2%

Tris-HCl 1,5M pH 8,8 0,375 M

Glicerol 100% 20%

Iodoacetamida 135 mM

As tiras IPG são então lavadas em tampão Laemmli e aplicadas

cuidadosamente na superfície de géis 12% SDS-PAGE, onde as proteínas serão

separadas, perpendicularmente à primeira dimensão, de acordo com sua massa


30

molecular. Para os géis de 7cm foi utilizada uma voltagem constante de 200 volts;

para os géis de 17 cm utilizamos uma corrente de 20 mA durante 1h, e 40 mA até o

final da corrida, conforme instruções do fabricante.

3.6. Coloração dos Géis e Obtenção das Imagens

Após os ensaios de eletroforese uni- e bi-dimensionais, os géis foram corados

com corante fluorescente Pro-Q Diamond (Molecular Probes), que permite a

visualização das proteínas fosforiladas. O corante permite a detecção direta no gel

de grupamentos fosfatos ligados a resíduos de tirosina, serina ou treonina, sem a

necessidade de anticorpos ou radioisótopos. A coloração por ProQ Diamond permite

a detecção das fosfoproteínas em quantidades tão pequenas como 1 a 16 ng por

banda de géis unidimensionais. Para fosfoproteínas individuais (“spots” nos géis

bidimensionais), a força do sinal se correlaciona com o número de grupamentos

fosfatos, sendo linear por mais de três ordens de magnitude. Na seqüência, os géis

foram corados com o corante fluorescente Sypro Ruby (Molecular Probes), que se

liga covalentemente a aminoácidos básicos e ao esqueleto da cadeia polipeptídica,

permitindo a coloração da maioria das classes de proteínas, incluindo glicoproteínas,

fosfoproteínas, lipoproteínas, proteínas ligadoras de cálcio, proteínas fibrilares e

outras proteínas de difícil coloração. O corante possui taxa de quantificação linear de

mais de três ordens de magnitude e um limite mínimo de detecção variando entre

0,25 a 1 ng de proteína. Como a visualização das proteínas marcadas por estes

corantes só é possível através de aparelhos específicos, coramos por fim os géis

com Coomassie coloidal, que nos permite visualizar as proteínas (bandas e “spots”)

à olho nu, condição fundamental para a posterior retirada dos “spots” protéicos dos

géis, a fim de serem identificados por espectrometria de massas. O Coomassie

coloidal G-250 possui uma sensibilidade de detecção de até 10ng e melhores

contrastes podem ser obtidos lavando o gel em água após a coloração. As

colorações por ProQ, Sypro e Coomassie coloidal são completamente compatíveis

para análise dos peptídeos por espectrometria de massas. A captura das imagens

dos géis corados com ProQ Diamond e Sypro Ruby foi feita com o scanner Typhoon

Trio (Amersham Biosciences). Para os géis corados com Coomassie coloidal foi

utilizado o scanner GS-800 Calibrated Densitometer (BioRad). Os comprimentos de

onda considerados ideais de acordo com o fabricante para a excitação e emissão da


31

fluorescência dos corantes ProQ Diamond e Sypro Ruby (Molecular Probes), assim

como as fontes de excitação e emissão utilizadas pelo scanner Typhoon Trio para a

captura das imagens estão descritos abaixo (tabela 3.10).

Tabela 3.10: Comprimentos de onda ideais para emissão e excitação da fluorescência dos corantes ProQ Diamond e Sypro Ruby.

ProQ

Comprimento de onda

Sypro

Comprimento de onda

Excitação Máxima 555 nm 450 nm

Fonte de Excitação

(Typhoon Trio)

532 nm 488 nm

Emissão Máxima 580 nm 610 nm

Filtro de Emissão

(Typhoon Trio)

560 nm 640 nm

3.7. Análise das Imagens

Para identificação inequívoca das proteínas fosforiladas, demos atenção

especial ao ajuste da escala de cinza na imagem digitalizada. Para a otimização da

escala de cinza, é essencial a presença de controles negativo e positivo no gel para

proteínas fosforiladas. Por isso, utilizamos em nossos experimentos o marcador de

peso molecular PeppermintStick (Molecular Probes), que além de padrão de peso

molecular, contém duas proteínas fosforiladas (Ovoalbumina e β-caseína) e outras

quatro proteínas não fosforiladas (β-galactosidase, BSA, Avidina e Lisozima). As

imagens podem ser facilmente ajustadas focando no poço onde se encontram as

bandas do padrão de peso molecular e ajustando a escala de cinza de modo que as

proteínas fosforiladas apareçam como bandas escuras, enquanto que as proteínas

não fosforiladas aparecem praticamente como uma leve sombra no gel.

Para minimizar possíveis diferenças na quantidade de proteína aplicada no

gel é importante analisar em conjunto a imagem do gel corado também com Sypro

Ruby, e desse modo comparar a quantidade total de proteínas aplicada com a

quantidade total de fosfoproteínas. Através de uma análise raciométrica de cada

poço ou “spot” do gel é possível distinguir uma proteína minimamente fosforilada

expressa em grande quantidade de uma proteína altamente fosforilada expressa em


32

baixa quantidade. Para esse tipo de análise, medimos a intensidade de

fluorescência do sinal gerado por ProQ Diamond (P) e por Sypro Ruby (S), e

calculamos a razão P/S de cada spot ou poço do gel.

As imagens bidimensionais foram analisadas utilizando-se o programa

PDQuest (BioRad). A análise dos géis bidimensionais englobou as seguintes etapas:

normalização das imagens; detecção e quantificação dos spots; escolha de spots

referência (spots que estejam presentes em todos os géis a serem analisados);

alinhamento dos géis a partir da definição dos spots de referência; pareamento

automático entre os spots dos diferentes géis e a identificação dos spots

diferencialmente expressos.

Em nossas análises, foi utilizado o método de normalização denominado

“Total Density in Gel Image”, onde o valor de intensidade de pixel de cada “spot”,

medido em partes por milhão (ppm), é dividido pelo valor de intensidade total de

todos os pixels presentes na imagem. Este modelo de normalização assume que a

densidade total de uma imagem (incluindo densidade do background e densidade do

“spot”) será relativamente consistente de gel para gel, favorecendo a validação das

análises.

Neste trabalho, foram realizadas análises provenientes de comparações de

três experimentos independentes (triplicatas biológicas), entre as diferentes

condições estudadas (amostras tratadas ou não com TGF-β nos tempos de 1, 5, 15,

30 ou 60 minutos), observando a expressão qualitativa (presença ou não de

determinado “spot”) ou quantitativa em cada condição estudada.

3.8. Retirada e Processamento dos spots

Os “spots” protéicos de interesse foram excisados manualmente do gel, com

auxílio de ponteiras de 1 ml, cujas pontas foram cortadas com tesouras devidamente

limpas. Os spots de interesse foram transferidos para tubos novos previamente

lavados seqüencialmente em metanol/água milli-Q/metanol.

O processamento iniciou-se pela descoloração dos spots, adicionando-se a

cada tubo, contendo um spot coletado, 200 µL de uma solução de acetonitrila (ACN)

50% (p/v)/ bicarbonato de amônio 25 mM, pH 8.0. Esta etapa é feita por 16 h, com o


33

intuito de descorar completamente os “spots” e retirar o detergente SDS presente

nos géis de SDS-PAGE. Essa lavagem é repetida por mais duas vezes com o

mesmo volume e pelo tempo de 15 minutos cada, em agitação contínua. O

descorante é então removido e é adicionado a cada tubo um volume de 200µL da

solução de ACN 100% (solução de desidratação) por 5 minutos, sob agitação

contínua. Ao final desta etapa, os pedaços de géis tornam-se opacos. Em seguida,

os “spots” são colocados no evaporador a vácuo (Speed Vac) por 15 minutos, para

evaporação de toda a solução de acetonitrila. Posteriormente, foi realizada a etapa

de digestão tríptica, adicionando-se 10 µL da solução a 20 ng/µL de tripsina (Tripsin

Gold, Mass Spectrometry Grade – PROMEGA), de forma a cobrir completamente os

pedaços de gel. Os tubos são mantidos no gelo durante este procedimento de

digestão enzimática, garantindo que a mesma não sofra degradação. Após o

período de 1 h, todo o excesso de tripsina é removido e adiciona-se 20 µL de

solução de bicarbonato de amônio 50mM, disparando-se a digestão. Os tubos são

incubados por 16 h, a 37°C.

Aos tubos contendo as amostras é aplicado ultrasom por 10 minutos e em

seguida são agitados no vortex. Os 20 µL da solução acima são removidos para um

tubo limpo de 500 µL e o material restante re-extraído com 30 µL de solução de

ácido fórmico 5% (v/v) / ACN 50% (v/v). Os tubos são agitados em vortex por 20

segundos e a solução permanece no tubo durante 15 minutos a temperatura

ambiente. Após esse período, é novamente aplicado ultrasom por 2 minutos,

seguido por agitação no vortex. A solução contendo os peptídeos é removida e

unida aos 20 µL de solução reservada anteriormente em tubo de 500 µL. A extração

é repetida mais uma vez e todos os extratos são, ao final do processo, combinados

em um mesmo tubo, com um volume final de aproximadamente 60 µL. A amostra é

então concentrada no evaporador a vácuo até atingir o volume aproximado de 5-10

µL. Os peptídeos foram armazenados a -20ºC para posterior dessalinização.

Para retirar os possíveis contaminantes e sais que interferem na identificação

das proteínas por espectrometria de massas, além de concentrar a amostra protéica

para melhorar a sua identificação, utilizamos ponteiras contendo uma resina de fase

reversa (Zip Tip C18 - Millipore).

O ZipTip deve ser preparado previamente à sua utilização. Cada ponteira foi

umedecida em ACN 100% e equilibrada em uma solução de 0,1% TFA (ácido


34

trifluoroacético). Este procedimento é feito com sucessivas aspirações, de forma a

reter na resina os peptídeos e deixar no tubo os possíveis interferentes. Os

peptídeos são lavados com 0,1% TFA e finalmente eluídos em um novo tubo

utilizando uma solução de 0,1% TFA / ACN 50 %.

Depois de concentradas em Ziptip (Millipore), as amostras são co-

cristalizadas com uma matriz de ácido α-ciano-4-hidroxâmico em uma placa de aço

inox especialmente utilizada para a análise no espectrômetro de massas MALDI-

TOF-TOF. Foram misturadas quantidades iguais de amostra e matriz (0,3 µL)

estando a matriz à uma concentração de 1,0 mg/ ml diluída em solução 50% ACN

/0,3% TFA em água milliQ, sendo em seguida, armazenados para posterior análise

por espectrometria de massas.

3.9. Identificação de proteínas por Espectrometria de Massas

As amostras foram analisadas em espectrômetro de massas do tipo MALDI-

TOF-TOF 4700 Proteomics Analyser (Applied Biosystems) da Plataforma de

Espectrometria de Massas/PDTIS (Laboratório de Toxinologia, IOC-FIOCRUZ).

Inicialmente foi feita uma análise (MS) para determinar as massas dos peptídeos

trípticos referentes a cada “spot”. Em seguida, o equipamento faz uma nova

fragmentação (MS/MS) dos peptídeos com consequente geração de íons que, em

geral, podem ser íons y e íons b, ambos informativos e complementares entre si.

Assim, para cada peptídeo inicial (cuja massa já foi determinada) são gerados vários

valores de massa como produtos da fragmentação MS/MS. As diferenças entre

esses valores correspondem à massa dos aminoácidos que compõem o peptídeo,

permitindo a determinação de sua sequência. Após a conclusão da determinação

das massas dos diferentes peptídeos, os resultados foram capturados através do

software integrado ao equipamento (4000 Explorer Remote Client), sendo retirados

os picos de contaminantes. Os mesmos foram transferidos para um programa de

busca, visando à identificação das possíveis proteínas, como descrito abaixo.


35

3.10. Identificação dos peptídeos

Os resultados obtidos pelo espectrômetro de massas MALDI-TOF-TOF foram

analisados no programa Mascot Online (endereço eletrônico

www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS). Para

identificação dos peptídeos foram utilizados os parâmetros descritos na tabela

abaixo (tabela 3.11):

Tabela 3.11: Parâmetros utilizados nas buscas do Mascot.

Database: NCBInr

Taxonomy : All entries

Enzyme: Trypsin

Allow up to: 1 missed cleavages

Fixed modifications : none

Variable modifications : Acetyl (protein N-term), Carbamidomethyl (C), Deamidated (NQ), Gln

→Pyro-Glu (N-termQ), Glu →Pyro-Glu (N-termE) ,Oxidation (HW), Oxidation (M), Phospho (ST),

Phospho (Y).

Peptide tol. : ± 1.2 Da

MS/MS tol.: ± 0.6 Da

Peptide charge: +1 Da

Monoisotopic

Instrument : Maldi TOF-TOF

Overview : Report top 50 hits

Consideramos uma identificação encontrada no Mascot como positiva após

verificarmos os dados obtidos para alguns dos parâmetros do programa. Foram eles:

o valor do “score” obtido para a identificação (valores superiores a 42 foram

considerados), se a proteína encontrada era proveniente de um microorganismo da

mesma espécie em estudo ou, pelo menos, da família dos tripanossomatídeos, se

havia equivalência entre os pontos isoelétricos e massas moleculares teóricas e

experimentais e a porcentagem de cobertura das proteínas.


36

3.11. Proliferação de epimastigotas em resposta a a dição de TGF- β

Um total de 2,5x106 parasitos foi obtido a partir de uma cultura inicial de

epimastigotas na concentração de 5x106 parasitos/mL. Esta massa foi ressuspensa

em 500 µl de meio LIT e a solução final distribuída em placas de 24 poços mantidas

a 28ºC. Para testar o efeito de TGF-β sobre a proliferação das epimastigotas de T.

cruzi, 5 ng/mL de TGF-β foram ou não adicionados diariamente às culturas de

epimastigotas. A cada 24 horas (24, 48 e 72 horas) os parasitos foram quantificados

em câmara de Neubauer com diluição de 1:100 em PBS. As amostras (incubada ou

não com TGF-β) foram preparadas em duplicata nos poços da placa. Apresentamos

nos resultados o gráfico obtido da média e desvio padrão de três experimentos

independentes realizados.

Resultados

37

4. RESULTADOS

4.1. Curva de crescimento das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi

Epimastigotas de Trypanosoma cruzi da cepa Y foram mantidos em cultura

axênica em meio LIT a 28°C durante seis dias consec utivos após o inoculo, e

estimados diariamente por contagem em câmara de Neubauer (Figura 4.1).

A curva nos mostra que os parasitos apresentam crescimento exponencial ao

longo dos dias, onde entre o quinto e o sexto dias de cultura este aumento é

bastante reduzido. Assumimos o quinto dia de cultura (120 horas) como o final da

fase logarítimica de crescimento. Logo, utilizamos para nossos experimentos os

parasitos coletados neste dia, pois além de apresentarem-se em grande quantidade

no meio, asseguramos que a maioria das células ainda estão viáveis.

Figura 4.1: Curva de crescimento de epimastigotas cultivadas por seis dias consecutivos em meio LIT. Os parasitos foram quantificados após 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas a partir do momento da passagem. Os valores apresentados representam a média e o desvio padrão obtidos de três experimentos independentes (N=3).

0

20

40

60

80

100

120

140

0 24 48 72 96 120 144

Epi

mas

tigot

asx

10e6

/mL

Tempo (horas)

Resultados

38

4.2. Padronização da dose ótima de TGF- β

Com o intuito de avaliar qual seria a dose ótima de TGF-β capaz de induzir a

maior fosforilação de proteínas em formas epimastigotas de T. cruzi, iniciamos

nossos estudos com um ensaio utilizando diferentes doses desta citocina. Para tal,

massas de 5x108 epimastigotas foram incubadas por 15 minutos com doses de 1,25

/ 2,5 / 5 ou 10 ng/ml de TGF-β, e em seguida, foram preparados os extratos de

proteínas totais das epimastigotas. Para avaliarmos qual seria a dose ótima de

indução de fosforilação de proteínas em resposta a TGF-β, delimitamos o volume de

cada canal (“lane”) do gel, utilizando ferramentas do programa Quantity One

(BioRad), tanto na imagem do gel corado com ProQ, como na imagem do gel corado

com Sypro. Calculamos então a razão (P/S) entre o valor da intensidade de pixels

totais do poço corado com ProQ (P) e o valor da intensidade de pixels totais do poço

corado com Sypro (S), com a intenção de normalizar os valores obtidos.

Os resultados obtidos (Figura 4.2) nos permitiram inferir que a dose ótima de

incubação com TGF-β, ou seja, aquela capaz de induzir o maior número de eventos

de fosforilação de proteínas nas formas epimastigotas de T. cruzi, foi a de 5 ng/ml.

Sendo assim, adotamos 5 ng/ml como a dose ótima de indução de

fosforilação em todos os nossos experimentos.

Resultados

39

Figura 4.2: A. Géis SDS-PAGE12% de 7cm corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagens do gel unidimensional contendo extratos de proteínas totais de epimastigotas, que foram previamente incubados com as doses de 0 (controle), 1,25, 2,5 5 e 10 ng/ml de TGF-β. Marcadores de massa molecular (MM) indicados na figura, em kDa. B. Gráfico representativo dos valores de intensidade relativa de pixels da razão ProQ/Sypro de um único experimento (N=1).

ProQ Sypro

M.M. C 1,25 2,5 5 10

116,2

66,2

45

23,6

18

14,4

45

23,6

M.M. C 1,25 2,5 5 10

0,9

0,95

1

1,05

1,1

1,15

1,2

C 1,25 2,5 5 10

Inte

nsi

dade

Rel

ativ

a TG

F-β

/CT

R

Dose de TGF-β adicionada

A

B

Resultados

40

4.3. Padronização do tempo ótimo de incubação com T GF-β

A partir da avaliação da dose ótima de TGF-β, realizamos um ensaio para

avaliar qual seria o tempo ideal de indução com esta citocina, ou seja, o tempo de

incubação com TGF-β capaz de induzir o maior número de eventos de fosforilação

de proteínas de formas epimastigotas de T. cruzi. Para tal, incubamos ou não

massas de 5x108 epimastigotas por 1, 5, 15, 30 ou 60 minutos com 5 ng/ml da

citocina em estudo, a 4ºC. O procedimento é feito em baixa temperatura com o

objetivo de retardar os eventos iniciais de fosforilação, que costumam ocorrer muito

rapidamente na situação fisiológica natural (in vivo). Contudo, incubamos ou não

massas de 5x108 epimastigotas por 1 ou 5 minutos com 5 ng/ml de TGF-β também a

28ºC, temperatura normal de cultivo de formas epimastigotas de T. cruzi.

Verificamos que o perfil unidimensional das amostras mantidas a 28ºC é bastante

semelhante àqueles das amostras incubadas a 4ºC (dados não mostrados).

O mesmo procedimento de normalização utilizado para a análise da dose

ótima foi aplicado na verificação do tempo ótimo de incubação com TGF-β. Nossas

análises, utilizando géis unidimensionais (Figura 4.3), indicaram que não há

diferenças significativas entre as amostras estimuladas e não estimuladas (controle)

de cada tempo estudado. As diferenças entre as amostras estimuladas com TGF-β

nos diferentes tempos estudados também parecem ser muito sutis, através da

análise unidimensional. Assim, optamos por concentrar nossos esforços na análise

do tempo ótimo de indução com TGF-β exclusivamente através de géis

bidimensionais, que permitem uma maior resolução das amostras em estudo, além

da visualização de diferenças pontuais encontradas em cada proteína estudada ao

longo do tempo.

Resultados

41

Figura 4.3: A. Géis SDS-PAGE12% de 7cm corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagens do gel unidimensional contendo extratos de proteínas totais de epimastigotas, que foram previamente incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml nos tempos de 1, 5, 15, 30 e 60 minutos. Marcadores de massa molecular (MM) indicados na figura, em kDa. B. Gráfico representativo dos valores da razão de intensidade de pixels de amostras tratadas com TGF-β/Controle não tratado para cada tempo estudado. N=2.

4.4. Perfis bidimensionais de fosforilação e expres são de proteínas de formas

epimastigotas de T. cruzi em resposta a TGF-β

Amostras de epimastigotas foram incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml nos

tempos de 1, 5, 15, 30 ou 60 minutos a 4ºC, e o extrato protéico preparado como já

descrito acima. As proteínas foram resolvidas em géis bidimensionais (2DE) de 7cm

(faixa de pH 3-10 NL) e coradas com ProQ e Sypro (Figura 4.4). Ao avaliarmos as

imagens dos géis bidimensionais corados com ProQ podemos perceber que, em

todos os tempos estudados, há uma menor variação no número de “spots” protéicos

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

C1 1 C5 5 C15 15 C30 30 C60 60

TEMPO (MIN)

45

23,6

116,2

66,2

45

23,6

1814,4

Raz

ão In

ten

sida

de P

roQ

/Syp

ro

ProQ Sypro

A

B

Resultados

42

fosforilados nas porções mais ácidas (região de pH 3 a 5) e mais alcalinas (região de

pH 10) dos géis.

Na região de pH 5 a 8 há uma maior variação no perfil de fosforilação entre os

tempos estudados. Ao comparar as imagens, vemos que de 1 a 15 minutos há uma

concentração mais forte de “spots” no centro dos géis tratados com TGF-β, contra

uma fosforilação mais fraca nesta mesma região nos géis da amostra controle. Nos

tempos de 30 e 60 minutos parece haver defosforilação parcial de alguns “spots”

nesta região central em relação aos tempos mais curtos de incubação. Nestes

tempos mais longos de indução observamos uma fosforilação menos acentuada das

proteínas de ambas as amostras (tratadas ou não com TGF-β) e vemos também que

os perfis dessas amostras parecem se igualar.

Os perfis de expressão das proteínas nas diferentes condições estudadas

foram evidenciados através da coloração das proteínas totais por Sypro.

Observamos que, em todos os tempos estudados, os “spots” protéicos encontram-se

dispersos nos géis, sendo encontrados praticamente em todas as faixas de pH

estudadas, principalmente na região de pH 4 a 10. Contudo, a maior concentração

de proteínas encontra-se na faixa de pH 4 a 7.

Assim como nas análises unidimensionais, também preparamos géis

bidimensionais com extratos de epimastigotas incubados ou não com TGF-β a 5

ng/ml por 1 minuto a 28ºC. Verificamos que o perfil bidimensional das amostras

incubadas ou não com TGF-β por 1min a 28ºC se apresenta com um perfil

intermediário aos perfis das amostras incubadas ou não com TGF-β por 5 e 15

minutos a 4ºC (dados não mostrados). É importante ressaltar que nossos resultados

são baseados na análise de triplicatas biológicas de cada uma das amostras

estudadas. Consideramos apenas como dados dignos de avaliação em nosso

trabalho àqueles que foram reprodutíveis em todas as replicatas ou em pelo menos

duas das replicatas biológicas obtidas para cada amostra.

Resultados

43

Figura 4.4: Géis SDS-PAGE12% de 7cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas biológicas dos géis bidimensionais dos extratos de proteínas totais de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5ng/ml nos tempos de 1, 5, 15, 30 e 60 minutos. Marcadores de massa molecular indicados na figura, em kDa. N=3.

Resultados

44

4.5. Análises dos perfis bidimensionais diferenciai s de formas epimastigotas

de T. cruzi em resposta ao TGF-β

4.5.1. Quantidade total de “spots” protéicos em cad a condição estudada

As imagens dos géis bidimensionais (Fig. 4.4) foram analisadas através do

programa PDQuest (BioRad). A quantidade total de “spots” presente em cada

condição foi obtida através de uma das ferramentas do programa, denominada

“Experiment Summary”. Recolhemos os valores obtidos das replicatas de cada

condição estudada e calculamos a média e o desvio padrão destes valores,

representados graficamente na figura 4.5.

Em todos os tempos estudados observamos um maior número de eventos de

fosforilação nas amostras tratadas com TGF-β quando comparadas a seus

respectivos controles. Podemos também observar que no tempo de 1 minuto

ocorrem mais eventos de fosforilação do que nos outros tempos estudados. Os

tempos de 30 e 60 minutos apresentam quantidades semelhantes de eventos de

fosforilação, sendo estas inferiores as dos tempos menores de incubação nas

amostras tratadas com TGF-β. Após 30 minutos observamos uma tendência do

número de “spots” fosforilados em se igualar entre as amostras controle e tratadas

com TGF-β.

Com base nestes dados, calculamos a média do percentual de aumento de

fosforilação pela adição de TGF-β na cultura nos diferentes tempos. Observamos

que nos tempos de 5 e 15 minutos ocorrem os maiores aumentos no índice de

fosforilação quando os parasitos são tratados com TGF-β (58% e 41%,

respectivamente), seguido do tempo de 1 minuto (13%) e dos tempos de 30 e 60

minutos (9% e 5%, respectivamente).

Por termos observado diferenças nos perfis de fosforilação entre os tempos

estudados, resolvemos não mais selecionar um único tempo para análise, e sim

realizar um estudo de cinética de tempo.

Resultados

45

Figura 4.5: Gráfico dos valores das médias e desvios da quantidade de “spots” fosforilados das amostras tratadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml nos tempos de 1, 5, 15, 30 e 60 minutos. Quantidade de “spots” determinada após análise das imagens dos géis no programa PDQuest (BioRad). N=3.

4.5.2. Identificação dos “spots” presentes nos mapa s proteômicos de extratos

de epimastigotas de T. cruzi que respondem a TGF- β

Para a identificação dos “spots” por espectrometria de massas preparamos

géis de 17 centímetros, possibilitando a resolução de quantidades maiores (500 µg)

de proteínas totais. Pela análise prévia das imagens obtidas em cada um dos

tempos estudados, escolhemos o tempo de 1 minuto como melhor indutor de

fosforilação de proteínas em resposta a TGF-β. Logo, preparamos géis

bidimensionais de 17 centímetros com extratos totais de epimastigotas de T. cruzi,

que foram previamente incubados ou não com 5 ng/ml de TGF-β por 1 minuto a 4ºC

(N=2).

O mapa protéico obtido (Figura 4.6) apresentou boa resolução. Os “spots” de

interesse, ou seja, aqueles que apresentaram diferenças significativas na sua

fosforilação e/ou expressão em resposta a TGF-β, foram retirados. As proteínas

identificadas por espectrometria de massas foram analisadas no Mascot, como

descrito em “Materiais e Métodos”. As identificações encontram-se na tabela 4.1.

0

20

40

60

80

100

120

1 5 15 30 60

CTR

TGF

Méd

ia d

a Q

uant

idad

e d

e “s

po

ts” f

osf

orila

do

s

Tempo (min)

Resultados

46

Figura 4.6: Gel SDS-PAGE12% de 17cm com faixa de pH de 3-10 não linear corado por Coomassie coloidal. Gel bidimensional do extrato proteínas totais de epimastigotas incubada com TGF-β no tempo de 1 minuto. O mapa protéico representado acima apresenta circulados os “spots” identificados em nosso trabalho, cujos valores de fosforilação e/ou expressão variam significativamente nos diferentes tempos estudados. Marcadores de massa molecular indicados na figura, em kDa. N=2.

116,25

66,2

45,0

23,6

18,0

3 10 NL

55

52

53

73

6059

38

39

51

48

42

40

8

23

9

89

10

102 87 3

45

6 7 1516

17

19 20

27

25 26 28

29

31

3232a

2

Resultados

47

Tabela 4.1: Identificação das proteínas moduladas por TGF-β.

Identificação Número nº Acesso gene (T.cruzi CL Brenne r) pI teor pI exp MW teor MW exp Score Cob (%) Peptideos I dentificados

R.VLENTEGFR.T (Ions score 29)

K.ETAENFLGR.K (Ions score 30)

K.DAGTIAGLNVIR.V (Ions score 54)

R.GVNPDEAVALGAATLGGVLR.G (Ions score 99)

R.VLENTEGFR.T (Ions score 20)

K.DAGTIAGLNVIR.V (Ions score 38)

K.EISEVVLVGGMTR.M Oxidation (M) (Ions score 23)

R.GVNPDEAVALGAATLGGVLR.G (Ions score 85)

K.GDDKPVIQVQFR.G Deamidated (NQ) (Ions score 23)

K.AVVTVPAYFNDSQR.Q Deamidated (NQ) (Ions score 28)

K.ATNGDTHLGGEDFDNR.L Deamidated (NQ) (Ions score 41)

R.AVHDVVLVGGSTR.I (Ions score 40)

R.VEIIANDQGNR.T (Ions score 31)

R.TTPSYVAFTDTER.L (Ions score 68)

K.GDDKPVIQVQFR.G (Ions score 62)

K.KAVVTVPAYFNDSQR.Q (Ions score 34)

K.AVVTVPAYFNDSQR.Q (Ions score 83)


R.FEELCGDLFR.G Carbamidomethyl (C) (Ions score 22)


R.VEIIANDQGNR.T (Ions score 47)

R.TTPSYVAFTDTER.L (Ions score 76)

K.GDDKPVIQVQFR.G (Ions score 79)

K.KAVVTVPAYFNDSQR.Q (Ions score 40)

K.AVVTVPAYFNDSQR.Q (Ions score 49)


R.FEELCGDLFR.G Carbamidomethyl (C) (Ions score 36)


Proteínas de choque térmico

123 8%5,44 5,4 73,7 83,2

Tc00.1047053510439.61

5,4 70,9 80,5 198 7%5,75

5,75 5,6 70,9 81 154 8%

24%

6,19 5,3 40,8 83,6 450 24%

6,19 5,2 40,8 84 446

gi|71406304

HSP70, precursor mitocondrial

Tc00.1047053507029.30gi|71407515

4

5

Tc00.1047053511211.170

87

102

gi|1236033

HSP70

Resultados

48


R.AVGVILQSVAEQSR.K (Ions score 37)

R.GLIDGETSDYNR.E (Ions score 34)

R.AAVQEGIVPGGGVALLR.A (Ions score 79)

K.ALDSLLGDSSLTADQR.T (Ions score 41)

K.VLENNDVTVGYDAQR.D (Ions score 85)

R.NVIIEQSYGAPK.I (Ions score 47)

R.AVGVILQSVAEQSR.K (Ions score 64)

R.GYISPYFVTDAK.A (Ions score 21)

R.GLIDGETSDYNR.E (Ions score 49)

R.AAVQEGIVPGGGVALLR.A (Ions score 27)

K.ALDSLLGDSSLTADQR.T (Ions score 63)

K.VLENNDVTVGYDAQR.D (Ions score 99)

K.SQTFSTNADNQR.N Deamidated (NQ) (Ions score 60)

R.ATLSEPDVEAGITLEDR.Q (Ions score 32)

R.VLSGVELEAVNR.V (Ions score 60)

K.AIELMGQALR.I Oxidation (M) (Ions score 28)

K.AMYWAQR.A Oxidation (M) (Ions score 23)

R.ALDLNPENVR.A (Ions score 52)

R.SYGISSFGK.D (Ions score 34)

K.TPASSEFPSGHISIVLK.V (Ions score 55)

M.SYKPHHATVPTNPK.V Acetyl (Protein N-term) (Ions score 44)

K.VFFDVSIGGQSAGR.V (Ions score 70)

K.NFGYAGSGFHR.I (Ions score 94)

K.FADESFAGK.A (Ions score 10)

R.INVYFDEATGGR.Y (Ions score 44)

R.YLTASALFR.G (Ions score 21)

R.INVYFDEATGGR.Y (Ions score 80)

R.AVLIDLEPGTMDSVR.A Oxidation (M) (Ions score 62)

R.FPGQLNSDLR.K (Ions score 66)

K.LAVNLVPFPR.L (Ions score 61)

Proteínas de citoesqueleto

89 11%6,2 24,3 19,8

8,9 18,7

4,88 4,7 30,1 83,5 87 10%

58,8 159 10%4,91 4.2 41,5

17%

HSP60

59,3 74,6 258 13%6 5,73 5

gi|71665064gi|71665068

Tc00.1047053507641.280

7 5,73 5,1 59,3 74,5 345

59GRPE gi|71401098 Tc00.1047053509045.20 8,49

gi|122054742

beta-tubulina Tc00.1047053506563.40

gi|185681399

gi|71659715 14 2098,44

4,69 4,7

27%

4,74 4,4 49,6 66,4 60 4%

38,5 266 10%49,4

Proteínas de choque térmico (Cont.)

Tc00.1047053511257.10Tc00.1047053509543.50

gi|71649573gi|71408185

2DNAK

Tc00.1047053508409.210Tc00.1047053510143.24

gi|71663660gi|71420437

10HSC70

73Ciclofilina A

(Peptidil-prolil cis-trans-isomerase)

Tc00.1047053506925.300

Resultados

49


6,03 6 42,2 67,8 81 3% K.ETYGVPEELTDDEVR.D (Ions score 81)

5,83 42,2 81 3% K.ETYGVPEELTDDEVR.D (Ions score 81)

M.ATFPELLRPLK.L Acetyl (Protein N-term) (Ions score 34)

R.IPAYFAASGEK.E (Ions score 55)

K.ETYGVPEELTDDEVR.D (Ions score 109)

R.QSGPYAGTTIDTR.C Gln->pyro-Glu (N-term Q) (Ions score 24)

R.YDFEEADQQIR.E (Ions score 83)

K.FIANPDLVER.A (Ions score 61)










R.QSGPYAGTTIDTR.C (Ions score 29)







R.QSGPYAGTTIDTR.C Deamidated (NQ) (Ions score 82)







R.QSGPYAGTTIDTR.C Deamidated (NQ) (Ions score 29)



Proteínas envolvidas em processos metabólicos

gi|945108gi|25006239gi|71659766gi|61741938

Tc00.1047053508461.80Prostaglandina F2a sintase /

desidrogenase (Old Yellow Enzyme)

6,03

15

25

18%6,03 6,3

18%

6,2 42,2 67,5 358 18%

42,2

5,83 6,4 42,2 48,6 203 9%

48,6 285 18%6,03 6,1

6,03

6,03

42,2 357

6,5 42,2 49,5 262

42,2 48,6 415

29

28

26

16

12%

Resultados

50


R.WAIEAGYR.H (Ions score 41)

R.HIDTAYFYNNEK.G (Ions score 77)

K.NHVLGEIAK.K (Ions score 24)

R.QIDELNEDKR.F Gln->pyro-Glu (N-term Q) (Ions score 42)

R.QIDELNEDKR.F (Ions score 35)

R.MGAEVYHSLK.S Oxidation (M) (Ions score 23)

K.QYNLTFK.S (Ions score 25)

K.AQVVGDDLTVTNVSR.I (Ions score 77)

R.SAVPSGASTGIHEACELR.D Carbamidomethyl (C) (Ions score 24)

K.AGSFNEALR.M (Ions score 37)

K.AQVVGDDLTVTNVSR.I Deamidated (NQ) (Ions score 84)

K.INQIGTITEAIEASK.F (Ions score 40)

20a 5,59 6,9 37,6 58,6 34 4% K.AQVVGDDLTVTNVSR.I (Ions score 36)

GAPDH 39 gi|120679 Tc00.1047053506943.50 8,87 9,5 39 45,1 79 4%R.VPTPDVSVVDLTFTAAR.D (Ions score 79)

8,96 9,6 34,1 37,4 42 3% R.RLPIGPITTVEK.E (Ions score 42)

8,82 34 42 3% R.RLPIGPITTVEK.E (Ions score 42)

7,79 7,1 29,5 46,3 51 5% K.AAADLTGVEAVQYPR.I (Ions score 53)

7,79 29,5 76 5% K.AAADLTGVEAVQYPR.I (Ions score 78)

K.NAAIFSEHGR.L (Ions score 57)

R.EAIKDDAYLDGEFMTTVQQR.G Oxidation (M) (Ions score 15)

R.EAVATWWR.N (Ions score 18)

R.KHVEDIVR.L (Ions score 18)

K.GKDPNATFTSVADFETTVPR.V (Ions score 56)

K.NLVVPGWR.L (Ions score 37)

13%6,6 46,4 58 173

5,59

5,92

46,1 51 122 10%

177

37,6 118 9%

67 9%gi|7109725 6,82 7 33,7 41,5

gi|71665461gi|5566209

Tc00.1047053504105.140

gi|71659493 Tc00.1047053510187.3027Tirosina aminotransferase

gi|14279174gi|189396135

13%48Aldo-ceto redutase 7,18 7,9 32,4 31,1

Malato desidrogenasegi|2961256gi|71423452

31Proteína dissulfeto

isomerasegi|71410849

5,82 6,3

Tc00.1047053511287.49

Enolase

32Desidrogenase aromática L-

alfa hidroxi-ácida

20

19

51 Tc00.1047053511293.69

Tc00.1047053509505.10

Proteínas envolvidas em processos metabólicos (Cont .)

Resultados

51


R.LILNYDVDPAR.I (Ions score 37)

R.IGFLGLGTESSTDNSAGSIIVR.G (Ions score 21)

R.ADKDFSSLLSR.K (Ions score 24)

K.EFVVAHIGSR.N (Ions score 22)

K.SYPLNTPSQR.L (Ions score 23)

R.YEYGLEAR.Y (Ions score 37)

R.LEYEEVLR.M (Ions score 45)

R.YEYGLEAR.Y (Ions score 26)

R.AVSGVVPETESR.V (Ions score 55)

R.VEEVPTTAETPETPVPAEK.T (Ions score 113)

K.VSIVATDIFTGNK.M (Ions score 96)

K.MEDQAPTTHNVDVPFVK.T Deamidated (NQ); Oxidation (M) (Ions score 75)

K.TSTYSVLDIQEDR.T (Ions score 131)

R.DNLDMPPNAELAAQIK.E Oxidation (M) (Ions score 94)

K.SVNFAQER.Y Deamidated (NQ) (Ions score 36)

K.IGGIGTVPVGR.V (Ions score 73)

R.FIPISGWQGDNMIDK.S Oxidation (M) (Ions score 26)

K.IGGIGTVPVGR.V (Ions score 19)

R.VETGTMKPGDVVTFAPANVTTEVK.S Oxidation (M) (Ions score 23)

K.SIEMHHEQLAEATPGDNVGFNVK.N Oxidation (M) (Ions score 65)

K.NSWTTQWGEDGYIR.I (Ions score 108)

K.NSWTTQWGEDGYIR.I Oxidation (HW) (Ions score 71)

K.NSWTTQWGEDGYIR.I Deamidated (NQ); 2 Oxidation (HW) (Ions score 38)

R.KGDTVVLIGDR.Q (Ions score 56)

R.LEASLIVCGR.E Carbamidomethyl (C) (Ions score 25)

R.ALIDVDGYDAEK.I (Ions score 77)

Proteínas hipotéticas

Proteínas associadas ao processo de tradução

Proteases/peptidades

106 2%

54,7 67,6 99 10%

93,6 40,5 69

15,7 394 35%4,82

167 17%

4,86 3,9

6,46,17

4,85 3,9

93 43,6 54 2%

1%

4,66 4,1 19,5 30,6

4,2 18

Sub-unidade proteolítica do complexo Hslvu

Fator de elongação 1 alfa

Tc00.1047053509429.320gi|11363088 5,63 3,9 49,6 53,3

5,2 22,8 22,8 157 15%6,77

105 4%

61 123 18%7,55 9,6 43,5

7,55 6,6 43,5 41,9Fator de elongação 1 alfa

Tc00.1047053510119.20gi|1929445gi|52424046gi|704459

38

Tc00.1047053506925.120

40Complexo associado a

peptídeo nascentegi|71419111

Tc00.1047053510579.70Tc00.1047053510241.60

23

Proteína hipotética

gi|71405542 Tc00.1047053507569.10

Tc00.1047053511903.40

89 gi|71409780 Tc00.1047053504423.30

gi|71416273 Tc00.1047053506275.20

17Proteína hipotética gi|71661816

53Fator de iniciação

eucariótico 5agi|71659667

32a

Cruzipaína

gi|704459

55

Resultados

52


R.GGLGQMNIPILADK.T Oxidation (M) (Ions score 52)

K.SYGVLKEEDGVAYR.G (Ions score 81)

K.EEDGVAYR.G (Ions score 18)

R.QITVNDLPVGR.D Gln->pyro-Glu (N-term Q) (Ions score 52

R.QITVNDLPVGR.D (Ions score 64)

K.GSYIEVGGEDYGIAANVDEDAGEGAK.G (Ions score 121)

R.VVDVVHNNR.Y (Ions score 45)

K.NSYMAHIR.G Oxidation (M) (Ions score 20)

Proteínas envolvidas na regulação do estresse oxida tivo

Proteínas envolvidas na transdução de sinal

5,71 22,7 209 19%

52Fator de liberação de

histamina dependente de IgE

gi|71407834Tc00.1047053506207.50Tc00.1047053510065.30

25%4,52 1844.0 19,5 18,7

Tc00.1047053507259.10Tc00.1047053487507.10

gi|17224953gi|71396508gi|58176947

60Tryparedoxina peroxidase

Resultados

53

4.5.3. Proteínas moduladas após a adição de TGF- β

A partir de nossas análises foi possível observar que a adição de TGF-β às

culturas de epimastigotas de T. cruzi induziu tanto a fosforilação de determinadas

proteínas, principalmente nos primeiros minutos após a introdução da citocina,

quanto o aumento ou redução na expressão relativa de proteínas do extrato total de

T. cruzi. Para esses “spots” que sofreram algum tipo de modulação (seja no perfil de

fosforilação seja no perfil de expressão) obtivemos, através do programa PDQuest

(BioRad), os seus valores de intensidade de pixel quando corados com ProQ e com

Sypro, respectivamente. Dessa forma, para cada “spot” obtivemos dois valores de

média de intensidade: um referente ao seu nível de fosforilação (ProQ) e outro

referente ao seu nível de expressão (Sypro).

Tanto para as análises de fosforilação (ProQ), como para as de expressão

(Sypro) calculamos a razão (C/I) entre o valor da amostra controle (C) e da amostra

estimulada com TGF-β (I) e vice-versa (razão I/C) para cada “spot” de interesse.

Consideramos como expressão ou fosforilação significativas quando encontrado um

aumento ou uma redução superior a duas vezes o valor da intensidade de pixel do

“spot” tratado com TGF-β em relação a seu controle.

Nas análises de fosforilação calculamos, além da razão descrita acima, a

razão (P/S) da intensidade de pixel do “spot” corado por ProQ (P) pela intensidade

de pixel do “spot” corado por Sypro (S), de modo a normalizar a quantidade total de

fosforilação pela quantidade total de proteína presente no gel.

Estas análises demonstram que alguns “spots” apresentam diferenças quanto

ao seu nível de fosforilação, mantendo seus níveis de expressão constantes ao

longo do tempo estudado; outros - fosforilados ou não – apresentaram diferenças

apenas quanto aos seus perfis de expressão ao longo do tempo estudado; um

terceiro grupo apresentou alterações significativas tanto no nível de fosforilação

quanto de expressão. Estas proteínas foram classificadas em grupos funcionais e o

comportamento de cada uma delas ao longo do tempo encontra-se representado

graficamente nas figuras a seguir.

A cada “spot” do gel foi atribuído um número que permite a sua localização no

mapa proteômico (Figura 4.6). Algumas proteínas são identificadas em diferentes

Resultados

54

“spots” no gel e observamos que o comportamento de fosforilação e expressão

destes podem apresentar diferenças entre si.

Em nossas análises, quando encontramos diferentes “spots” (de mesma massa

molecular, que apresentavam apenas pequenas variações de pI), identificados como

uma proteína com seqüência idêntica de aminoácidos, relacionamos esses “spots”,

somando seus valores e os representando também unificados em gráficos. A nossa

intenção é mostrar o comportamento geral da proteína, já que no gel bidimensional

uma mesma proteína pode ser separada em vários “spots” horizontalmente

dispostos, devido a modificações pós-traducionais (como fosforilação) que essas

proteínas podem sofrer durante diversos processos celulares.

Os valores da média da intensidade de pixel (em ppm) dos “spots” em cada

tempo de estudo estão representados na tabela a seguir. Na tabela, as proteínas

estão organizadas em grupamentos funcionais (tabela 4.2).

Resultados

55

Tabela 4.2: Valores das médias da intensidade de pixels dos “spots” responsivos a TGF-β ao longo dos tempos estudados.

Identificação Número 1 min 5 min 15 min 30 min 60 min

Fosforilação 8,39 -1,39 0 1,76 -2,33

Expressão 1,02 1,01 -4,65 -1,75 -1,75

Fosforilação 3,22 0 0 4,23 2,43

Expressão 1,50 1,58 -1,91 4,23 2,43

Fosforilação 0 0 0 0 0

Expressão 1,04 6,15 -2,72 -3,35 -2,65

Fosforilação 1,95 1,09 1,11 2,05 1,48

Expressão 0 1,55 0,82 -3,78 -19,20

Fosforilação 0 0 0 0 -2,16

Expressão 0 0 0 0 5,72

Fosforilação 3,65 0 0 1,11 1,92

Expressão 1,62 0,85 -6,00 -3,27 -2,10

Fosforilação 0 0 0 0 0

Expressão 1,09 1,28 -3,20 -2,33 -3,55

DNAK 2 Expressão 3,90 3,13 -2,33 -3,18 0

Fosforilação 1,90 1,33 0,95 1,35 -1,88

Expressão 1,08 1,55 -1,39 1,14 1,22

GrpE 59 Expressão -1,65 0,93 5,34 2,83 2,24

Ciclofilina A 73 Expressão -1,2 1,11 -3,50 4,13 0,63

Proteínas de citoesqueleto

Fosforilação 1,06 2,88 1,08 2,13 -2,32

Expressão 2,23 3,39 1,71 -4,39 -2,38

Fosforilação 3,13 1,00 -2,86 1,33 -2,24

Expressão -1,35 1,27 -2,64 -1,41 -2,45

Valores positivos representam a média de ppm da razão TGF-beta/ Controle

Valores negativos representam a média de ppm da razão Controle/ TGF-beta

Proteínas de choque térmico

HSP70 precursor

mitocondrial

HSP70

HSP60

Proteina de interação a

Hsc70

beta Tubulina

9

42

7

10

87

102

6

4

5

3

Resultados

56


Proteínas de metabolismo

Fosforilação 6,36 0 0 0 3,91

Expressão 1,18 1,70 1,22 1,16 -2,2

Fosforilação 5,10 4,48 0 -1,21 3,72

Expressão -2,59 -1,19 1,64 0,95 -5

25 Expressão 1,51 1,00 -5 -5,16 -1,37

Fosforilação -2,26 -9,80 0 3,34 -2,67

Expressão 1,37 4,14 -2,99 -4,07 1,67

Fosforilação 0 0 0 0 1,55

Expressão 2,58 2,95 1,15 -4,0 1,18

29 Expressão -1,72 3,52 0 6,20 -1,98

Aldo-Ceto Redutase 48 Expressão -1,39 1,29 1,32 -2,70 -1,34

Fosforilação 3,26 -12,44 0 -3,59 1,61

Expressão -1,96 13,06 -3,80 1,48 1,32

Fosforilação 0 0 0 2,06 2,30

Expressão -1,34 -1,22 -2,78 -6,92 1,92

Fosforilação 3,42 -5,51 0,96 1,13 2,52

Expressão -2,55 2,34 1,12 0,95 -1,84

Fosforilação -3,09 2,12 17,79 1,66 24,07

Expressão 1,06 3,37 2,91 1,37 -5,86



Gliceraldeido 3 Fosfato

Desidrogenase

malato Desidrogenase

glicossomal

Prostaglandina F2 alfa

sintase/ Desidrogenase

(Old yellow enzyme)

39

51

19

20

Enolase

15

16

26

28

Resultados

57


Proteínas de metabolismo (Cont.)

Proteína dissulfeto

isomerase31

Expressão 1,09 8,07 1,07 1,05 1,32

Desidrogenase aromática

L-alfa hidroxi-ácida32

Expressão 0,99 2,70 -1,52 -1,86 0,97

Tirosina

aminotransferase27

Expressão 1,12 1,38 -3,06 1,69 1,19

Proteínas Hipotéticas

Fosforilação 1,79 -9,80 -8,74 -6,80 -4,02

Expressão 1,17 -0,90 5,17 16,71 1,29

Fosforilação -2 0,58 -1,64 2,05 4,28

Expressão -2,36 7,84 1,22 1,58 -3,55

17 Expressão 2,20 8,03 4,26 -3,78 7,24


Fosforilação 2,31 -17,39 -2,70 3,99 -1,89

Expressão 1,07 1,57 -1,30 1,38 1,04

Fosforilação -1,61 0,93 -1,42 -1,60 2,19

Expressão 1,46 -1,21 1,00 0,95 1,03

32a Expressão 0,95 24,62 1,13 -1,88 1,24

38 Expressão 1,09 4,20 -1,32 1,55 -3,51



Proteína Hipotética

Complexo associado ao

polipeptídeo nascente

Fator de Iniciação

eucariótico 5a

Fator de elongação 1 alfa

53

23

89

40

Resultados

58


Proteases/ Peptidases

Cruzipaina 8 Expressão -1,24 38,07 -4,00 -2,43 1,49

Sub-unidade proteolítica

do complexo Hslvu

55

Expressão 0,94 4,00 2,02 -1,38 -1,9

Proteínas de regulação de estresse oxidativo

Triparedoxina peroxidase60

Expressão -1,6 1,38 1,15 -1,39 11,82

Proteínas de Transdução de sinal

Fosforilação 1,90 -1,35 -7,70 4,58 18,58

Expressão 0,80 -1,23 1,00 1,82 -2,90



Fator de liberação de

Histamina dependente

de IgE

52

Resultados

59

• Proteínas de choque térmico: HSPs (“heat shock prot eins”)

No mapa proteômico encontramos 5 “spots” identificados como HSP70 (“heat

shock protein 70 kDa”), dentre estes, dois “spots” são diferencialmente fosforilados

(“spots” 4 e 5) e dois “spots” diferencialmente expressos (“spots” 3 e 4). A união dos

“spots” 4 e 5 gera um gráfico onde se observa um aumento na fosforilação em 1

minuto e expressão reduzida em 15 minutos. A união dos “spots” 3, 87 e 102 gera

um gráfico onde se observa um aumento na fosforilação em 1 e 30 minutos. A

expressão é aumentada em 1 minuto e reduzida em 15, 30 e 60 minutos (Figura

4.7).

No mapa proteômico encontramos 2 “spots” identificados como HSP60 (“heat

shock protein 60 kDa”); observamos que um “spot” é diferencialmente fosforilado

(“spot” 6) e dois “spots” diferencialmente expressos (“spots” 6 e 7) (Figura 4.7).

Resultados

60

Resultados

61

Figura 4.7: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localizam os “spots” de interesse (indicados por círculos e numerados). Gráficos da média do índice de variação (IV) de fosforilação e expressão dos “spots” de três replicatas biológicas, identificados como: C. HSP70 precursor mitocondrial (união dos “spots” 4 e 5); D. HSP70 (união dos “spots” 3, 102 e 87) e E. HSP60 (união dos “spots” 6 e 7).

Resultados

62

O “spot” 2 (figura 4.8) identificado como proteína DnaK tem sua expressão

aumentada nos tempos de 1 e 5 minutos em resposta a TGF-β.

Figura 4.8: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como DnaK (“spot” 2).

Resultados

63

O “spot” 10 (figura 4.9) identificado como proteína Hsc70 tem sua fosforilação

aumentada em 1 minuto em resposta a TGF-β.

Figura 4.9: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Hsc70 (“spot” 10).

Resultados

64

O “spot” 59 (figura 4.10) identificado como proteína co-chaperona GrpE tem

sua expressão aumentada nos tempos de 15, 30 e 60 minutos em resposta a TGF-β.

Figura 4.10: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como GrpE (“spot” 59).

Resultados

65

O “spot” 73 (figura 4.11) identificado como proteína Ciclofilina A tem sua

expressão reduzida em 15 minutos e aumentada em 30 minutos.

Figura 4.11: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Ciclofilina A (“spot” 73).

Resultados

66

• Proteínas de citoesqueleto ( β-tubulina).

No mapa proteômico observamos dois “spots” identificados como β-tubulina,

ambos diferencialmente fosforilados e expressos (“spots” 9 e 42).

O “spot” 9 (figura 4.12) apresenta um aumento na fosforilação em 5 e 30 minutos

e sofre defosforilação em 60 minutos. A sua expressão é aumentada em 1 e 5

minutos e reduzida em 30 e 60 minutos.

O “spot” 42 (figura 4.12) tem fosforilação aumentada em 1 minuto e é

defosforilado em 15 minutos. Sua expressão é reduzida em 15 minutos e 60

minutos.

Resultados

67

Figura 4.12: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). Gráficos da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como: C. β-Tubulina (“spot” 9) e D. β-Tubulina (“spot” 42).

Resultados

68

• Proteínas envolvidas em processos metabólicos

No mapa proteômico, foram observados nove “spots” identificados como

diferentes tipos de desidrogenases; dentre estes, cinco são diferencialmente

fosforilados (“spots” 15, 16, 26, 39 e 51) e seis diferencialmente expressos (“spots”

25, 26, 28 32, 39 e 51) (figura 4.13).

Os “spots” 15, 16, 25, 26, 28 e 29 foram identificados como prostaglandina F2α

sintase. A partir da união dos “spots” 15 e 16, observa-se que ocorre fosforilação

aumentada nos tempos de 1, 5 e 60 minutos e defosforilação em 15 e 30 minutos. A

expressão destas proteínas é rapidamente reduzida em 1 minuto, mas aumentada

em 5 minutos, tornando a reduzir em 15 e 60 minutos de indução com TGF-β(figura

4.13). A união dos “spots” 25, 26, 28 e 29 gera um gráfico (figura 4.13) onde se

observa defosforilação em 5 minutos e aumento na fosforilação em 30 minutos. A

sua expressão é aumentada em 5 minutos e reduzida em 15 e 30 minutos.

O “spot” 48 (figura 4.14) identificado como proteína aldo-ceto redutase tem sua

expressão reduzida apenas em 30 minutos, não sofrendo regulação nos demais

tempos de estudo.

No mapa proteômico, foram observados dois “spots” identificados como enolase,

onde ambos são diferencialmente fosforilados e expressos (“spots” 19 e 20). A união

dos “spots” 19 e 20 gera um gráfico (figura 4.15) onde se observa uma

defosforilação em 5 minutos e um aumento na fosforilação em 30 e 60 minutos. A

sua expressão é reduzida em 1, 15 e 30 minutos e aumentada em 5 minutos.

Resultados

69

Figura 4.13: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). Gráficos da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como: C. Prostaglandina F2α sintase (união dos spots 15 e 16); D. Prostaglandina F2α sintase (união dos “spots” 25, 26, 28 e 29).

Resultados

70

Figura 4.14: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como proteína aldo-ceto redutase (“spot” 48).

Resultados

71

Figura 4.15: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como enolase (união dos “spots” 19 e 20).

Resultados

72

O “spot” 39 (figura 4.16), identificado como gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

(GAPDH), tem sua fosforilação aumentada em 1 e 60 minutos e sofre defosforilação

em 5 minutos. Sua expressão é reduzida em 1 minuto e aumentada em 5 minutos. O

“spot” 51 (figura 4.16) identificado como malato desidrogenase glicossomal é

defosforilado em 1 minuto, mas tem sua fosforilação aumentada em resposta a TGF-

β nos tempos de 5, 15 e 60 minutos. Sua expressão é aumentada em 5 e 15 minutos

e reduzida em 60 minutos.

Na figura 4.17 identificamos o “spot” 31 como dissulfeto isomerase e o “spot” 32

como desidrogenase aromática L-alfa hidroxiácida. Ambos apresentam expressão

aumentada em 5 minutos e apenas o “spot” 32 apresenta expressão reduzida em 30

minutos (figura 4.17).

Resultados

73

Figura 4.16: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). Gráficos da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como: C. Gliceraldeido 3 fosfato desidrogenase (“spot” 39); D. Malato desidrogenase glicossomal (“spot” 51).

Resultados

74

Figura 4.17: A. Géis SDS-PAGE12% de 7cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). Gráficos da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como: C. Proteína dissulfeto isomerase (“spot” 31) e D. Desidrogenase aromática L-alfa hidroxiácida (“spot” 32).

Resultados

75

O “spot” 27 (figura 4.18) identificado como tirosina aminotransferase tem sua

expressão reduzida em 15 minutos em resposta a TGF-β.

Figura 4.18: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Tirosina aminotransferase (“spot” 27).

Resultados

76

• Grupo das proteínas hipotéticas.

No mapa proteômico, foram observados três “spots” identificados como proteínas

hipotéticas (figura 4.19); dois destes “spots” protéicos foram observados como

diferencialmente fosforilados (“spots” 23 e 89) e dois diferencialmente expressos

(“spots” 17 e 23).

O “spot” 17 (figura 4.20) tem sua expressão aumentada nos tempos de 1, 5, 15 e

60 minutos e reduzida em 30 minutos.

Resultados

77

Figura 4.19: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Proteínas Hipotéticas (união dos “spots” 23 e 89).

Resultados

78

Figura 4.20: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Proteína Hipotética (“spot” 17).

Resultados

79

• Proteínas associadas ao processo de tradução (fator de elongamento 1

alfa, fator de iniciação eucariótico 5a e complexo associado ao polipeptídeo

nascente).

O “spot” 40 (figura 4.21) identificado como subunidade do complexo associado ao

polipeptídeo nascente tem sua fosforilação aumentada em 1 minuto e sofre

defosforilação em resposta a TGF-β nos tempos de 5 e 15 minutos, sendo mais

marcante em 5 minutos. Já o “spot” 53 (figura 4.22) identificado como fator de

iniciação eucariótica 5a tem sua fosforilação aumentada apenas no tempo de 60

minutos em resposta a TGF-β, sem nenhuma alteração em sua expressão ao longo

do tempo estudado.

Resultados

80

Figura 4.21: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Complexo associado ao polipeptídeo nascente (“spot” 40).

Resultados

81

Figura 4.22: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Fator de iniciação eucariótico 5a (“spot” 53).

Resultados

82

No mapa proteômico observamos dois “spots” identificados como fator de

elongamento-1α, localizados em regiões distintas do gel 2DE (regiões 1 e 2

marcadas na figura 4.23), e os resultados demonstram que ambos são

diferencialmente expressos (“spots” 32a e 38), com expressão aumentada em 5

minutos. Além disto, o “spot” 38 também apresenta modulação no tempo de 60

minutos, no qual se observa uma redução de expressão.

Figura 4.23: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). Gráficos da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como: C. Fator de elongamento-1α (“spot” 32a) e D. Fator de elongamento-1α (“spot” 38).

Resultados

83

• Proteases e Peptidases (cruzipaína, e subunidade pr oteolítica do

complexo Hslvu).

O “spot” 8 (figura 4.24) identificado como cruzipaína tem sua expressão

aumentada em 5 minutos e reduzida em 30 minutos.

O “spot” 55 (figura 4.25) identificado como subunidade proteolítica do

complexo Hslvu tem sua expressão aumentada em 5 e 15 minutos.

Figura 4.24: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Cruzipaína (“spot” 8).

Resultados

84

Figura 4.25: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Subunidade proteolítica do complexo hslvu (“spot” 55).

Resultados

85

• Proteínas envolvidas na regulação do estresse oxida tivo (triparedoxina

peroxidase).

O “spot” 60 (figura 4.26) identificado como triparedoxina peroxidase é

modulado apenas em tempos tardios, apresentando sua expressão

aumentada em 60 minutos de incubação com TGF-β.

Figura 4.26: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Triparedoxina peroxidase (“spot” 60).

Resultados

86

• Proteínas envolvidas na transdução de sinal (fator de liberação de

histamina dependente de IgE).

O “spot” 52 (figura 4.27) identificado como fator de liberação de histamina

dependente de IgE sofre defosforilação em 15 minutos, mas volta a ter sua

fosforilação aumentada nos tempos de 30 e 60 minutos. Sua expressão é reduzida

em 60 minutos.

Resultados

87

Figura 4.27: A. Géis SDS-PAGE12% de 7 cm com faixa de pH de 3-10 não linear corados com ProQ (representado em verde) e Sypro (representado em vermelho). Imagem representativa de uma das três replicatas dos géis bidimensionais dos extratos totais de proteínas de epimastigotas incubadas ou não com TGF-β a 5 ng/ml no tempo de 1 minuto. B. Parte das imagens do painel A aumentada na região onde se localiza o “spot” de interesse (indicado por círculo e numerado). C. Gráfico da média do índice de variação (IV) de expressão do “spot” de três replicatas, identificado como Fator de liberação de Histamina dependente de IgE (“spot” 52).

Resultados

88

4.6. Proliferação das epimastigotas após adição de TGF-β

Realizamos ensaios in vitro com formas epimastigotas de T. cruzi cultivadas

na ausência (meio LIT) e presença de TGF-β (meio LIT aditivado diariamente com

5ng/ml TGF-β). Nossos resultados (figura 4.28) demonstram que a adição de TGF-β

no meio de cultura promove um aumento na proliferação das formas epimastigotas

em relação àquelas crescidas em meio LIT apenas.

Observamos um aumento na proliferação das epimastigotas principalmente

em 24 horas, tempo no qual observamos um aumento de 73% no crescimento dos

parasitos. Após este período ocorre uma queda neste estímulo, mas ainda

observamos que a adição de TGF-β favorece a proliferação dos parasitos,

resultando num aumento de 29 e 36% nos tempos de 48 e 72 horas,

respectivamente. Este dado foi reproduzido nas três replicatas biológicas realizadas

e demonstram claramente a participação direta de TGF-β na biologia do T. cruzi.

Figura 4.28: Gráfico representativo das médias e desvios do número de epimastigotas presentes nas culturas em meio LIT ou meio LIT acrescido de TGF-β nos tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. N=3. * p<0,05.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 24 48 72

Núm

ero

de

epi

mas

tigot

as x

10e4

/ml

Tempo de cultivo (horas)

LIT

TGFb

73%

29%

36% *

Discussão

89

5. DISCUSSÃO

A citocina TGF-β desempenha importantes funções, tanto na doença de

Chagas, como no ciclo de vida de T. cruzi. De forma sucinta, os dados atuais da

literatura indicam que TGF-β participa em pelo menos quatro diferentes processos

que influenciam o desenvolvimento da miocardiopatia da doença de Chagas: (a)

invasão de fibroblastos e miócitos cardíacos, (b) ciclo intracelular do parasita, (c)

regulação da inflamação e da resposta imunológica, (d), fibrose e remodelamento

cardíaco durante a doença aguda e crônica (Araujo-Jorge et al., 2008).

Com relação ao seu papel no ciclo intracelular de T. cruzi, TGF-β latente é

ativado pelo parasito na superfície da célula hospedeira (Waghabi et al., 2005b),

favorecendo sua invasão celular através da sinalização via receptores de TGF-β de

superfície (Ming et al., 1995; Waghabi et al., 2005b). Amastigotas de T. cruzi são

capazes de captar e estocar TGF-β da célula hospedeira e usar esta molécula para

regular a transição entre parada da proliferação e início da diferenciação para

tripomastigotas (Waghabi et al., 2005a). Apesar da importância desta citocina na

biologia do T. cruzi, ainda não são conhecidos os mecanismos moleculares exatos

de transdução dos sinais gerados por TGF-β, que o permitem exercer seus efeitos

finais no microorganismo.

Por essa razão, em nosso estudo visamos caracterizar os padrões de

fosforilação e expressão de proteínas de epimastigotas de T. cruzi em resposta a

adição de TGF-β e identificar moléculas do parasito que estejam relacionadas à via

de sinalização disparada por esta citocina.

Para isso, utilizamos uma abordagem fosfoproteômica, que permite analisar,

em um único experimento, um conjunto de proteínas possivelmente envolvidas na

via de sinalização de interesse. A fosforilação reversível de proteínas é um

mecanismo essencial para a regulação de diversos processos biológicos, incluindo,

enovelamento, transdução de sinal, atividade enzimática, proliferação, divisão e

diferenciação celular, entre outros (Paradela & Albar, 2008). A sinalização por TGF-β

envolve a fosforilação de uma série de moléculas, incluindo seus receptores e

proteínas transdutoras de sinal, que permite a ativação de sua via, e logo, a

efetivação de seu efeito final na célula. Assim, a caracterização do fosfoproteoma de

T. cruzi nas nossas condições de estudo se torna objeto de grande utilidade para a

identificação de uma série de proteínas responsivas a TGF-β, que podem participar

Discussão

90

de sua via intracelular de transdução de sinal. O uso do corante fluorescente ProQ

Diamond (Molecular Probes) viabilizou a detecção das fosfoproteínas nos géis

bidimensionais com alta sensibilidade e linearidade. A coloração seguinte dos géis

com o corante fluorescente Sypro Ruby (Molecular Probes) permitiu a avaliação do

grau de expressão das proteínas presentes no gel, estivessem elas fosforiladas ou

não.

Em nosso trabalho foi utilizada a forma evolutiva epimastigota de T. cruzi

(cepa Y). O uso desta forma é ideal para o desenvolvimento da tecnologia

proteômica, pois qualquer tipo de contaminante proveniente de outros tipos celulares

presente na amostra pode interferir seriamente na interpretação dos resultados. As

formas amastigotas e tripomastigotas são obtidas a partir de culturas de células de

mamíferos, sendo praticamente impossível obter total separação entre os

componentes celulares dos parasitos daqueles dos mamíferos. Em contrapartida, as

epimastigotas são mantidas em culturas axênicas, garantindo que todo material

avaliado pertença exclusivamente ao parasito e possibilitando um maior controle e

reprodutibilidade dos experimentos. Além disso, trabalhos recentes do grupo

demonstraram por diferentes tipos de ensaios biológicos que as formas

epimastigotas de T. cruzi também são capazes de responder ao estímulo de TGF-β

presente nas culturas (Waghabi, M.C., comunicação pessoal). A coleta dos parasitos

foi feita sempre no mesmo dia de cultivo e ainda na fase de crescimento

exponencial, assegurando que os parasitos estejam em plena atividade biológica,

condição fundamental para a realização de nossos ensaios experimentais.

Inicialmente verificamos que a dose ideal para indução de fosforilação das

proteínas de epimastigotas de T. cruzi é de 5 ng/ml. A escolha da dose foi feita a

partir da análise do perfil unidimensional dos extratos protéicos de T. cruzi, e por

esta abordagem, observamos apenas diferenças sutis no padrão diferencial das

bandas. Talvez a aplicação da metodologia bidimensional gerasse resultados mais

precisos do que aqueles obtidos, mas este processo seria extenso demais para o

período de realização do nosso trabalho. Dessa forma, resolvemos nos basear nos

resultados das imagens unidimensionais e optamos pela dose que mostrou uma

fosforilação um pouco mais acentuada, que é a de 5 ng/ml. Esta dose também

coincide com aquela usada pelo grupo em outros ensaios experimentais com as

diferentes formas de T.cruzi (Waghabi, M.C., comunicação pessoal).

Discussão

91

Determinamos em seguida o tempo ótimo de incubação das epimastigotas a

4ºC com TGF-β (5 ng/ml), capaz de induzir o maior número de eventos de

fosforilação nas proteínas do parasito. As análises em géis unidimensionais não

foram capazes de discriminar diferenças significativas entre os tempos estudados.

Sendo assim, optamos por realizar os experimentos em géis bidimensionais,

empregando todos os tempos acima.

As imagens dos géis bidimensionais mostraram que os perfis protéicos entre

os tempos estudados apresentavam diferenças na fosforilação e expressão em

função da adição de TGF-β. Esta informação indicou que cada tempo de estudo

poderia estar mostrando uma etapa da cascata de eventos disparada pela adição de

TGF-β no meio, e sendo assim, optamos por manter um estudo de cinética de

tempo.

O uso de “strips” com faixa de pH 3 a 10 é bastante abrangente, o que

permitiu a visualização da maioria das proteínas em um único gel. Como muitas

proteínas são focalizadas na região central da faixa de pH 3 a 10, usamos

gradientes não-lineares (NL), pois os mesmos permitem uma melhor resolução das

proteínas na faixa central de pH.

Cada experimento bidimensional foi realizado em triplicatas biológicas, para

que somente os dados reprodutíveis fossem selecionados. Notamos que no tempo

de 1 minuto houve a indução do maior número de “spots” fosforilados, tanto na

amostra não tratada (controle), quanto na tratada com TGF-β. A realização dos

experimentos a 4ºC retarda o desencadeamento de eventos da cascata de

sinalização disparada por TGF-β, e tal fato, permitiu a visualização dos efeitos

marcantes sobre a fosforilação de determinados grupos de proteínas em 1 minuto de

incubação. O fato de que em 1 minuto também se observa a maior indução de

fosforilação nas proteínas de epimastigotas não tratadas com TGF-β (controle) pode

ser explicada como uma resposta do parasito para se adaptar ao novo ambiente,

com temperatura mais baixa. A fosforilação ainda mais abundante nas proteínas de

epimastigotas tratadas com TGF-β por 1 minuto a 4ºC pode ser dada pela união de

dois novos fatores introduzidos: resposta rápida à baixa na temperatura e adição de

TGF-β no meio. Nos tempos mais longos de incubação (30 e 60 minutos) observa-se

que a fosforilação das proteínas de ambas as amostras (tratadas ou não com TGF-

β) é menos acentuada e que seus perfis tendem a se igualar. Este comportamento

Discussão

92

pode estar refletindo o término dos eventos moleculares relacionados à adição de

TGF-β ao meio. A resposta de adaptação ao choque térmico, neste momento, pode

ou não estar encerrada ou em vias de finalização.

Um total de 463 “spots” foram retirados de géis de 7 ou 17 cm corados com

Coomassie coloidal. Destes, 156 “spots” obtiveram identificação positiva, dos quais

38 foram destacados por apresentarem fosforilação e/ou expressão mais de duas

vezes aumentada(s) ou diminuída(s) em resposta a TGF-β. Entre os analisados em

nosso trabalho, 11 “spots” foram identificados como proteínas de choque térmico, 2

como proteínas de citoesqueleto, 14 como proteínas envolvidas em vias

metabólicas, 4 como proteínas associadas ao processo de tradução, 2 como

proteases/peptidases, 1 como proteína de regulação de estresse oxidativo, 1 como

uma proteína envolvida na transdução de sinal e 3 como proteínas hipotéticas.

É válido ressaltar que para a maioria dos “spots” responsivos a TGF-β, a

confirmação da identificação foi feita com pelo menos mais uma replicata biológica.

Além disso, as identificações obtidas são confirmadas por dados de outros mapas

proteômicos de T. cruzi obtidos em nosso laboratório (dados não publicados), e

também por outros mapas proteômicos de T. cruzi presentes na literatura (Paba et

al., 2004; Parodi-Talice et al., 2004; Sodre et al., 2009).

O projeto de sequenciamento do genoma de T. cruzi foi feito com base na

cepa CL Brener, que é um híbrido de dois genótipos possuindo, assim, alelos

distintos para a maioria dos genes. Mais de 50% do seu genoma consiste em

sequências repetidas, como retrotransposons e genes para grandes famílias de

moléculas de superfície, que incluem as trans-sialidases, mucinas, gp63s e uma

nova grande família (mais de 1300 cópias) de proteínas de superfície associadas à

mucina (El-Sayed et al., 2005).

As análises dos genomas de T. cruzi, T. brucei e Leishmania major (Tritryp)

mostram que esses organismos diferem de outros eucariotos no que diz respeito ao

seu sistema de reparo de DNA e ao início da replicação, reflexo do seu DNA

mitocondrial incomum. Embora o Tritryp não tenha identificado várias classes de

moléculas de sinalização, seus quinomas contêm um grande e diversificado conjunto

de proteínas quinases e fosfatases, cujo número e diversidade implicam em

interações previamente desconhecidas e em processos regulatórios, que podem ser

alvos de intervenção farmacológica (Atwood et al., 2005). Recentemente um grupo

Discussão

93

de pesquisadores (Nakayasu et al., 2009) identificou, por espectrometria de massas,

237 fosfopeptídeos provenientes de 119 proteínas distintas de epimastigotas de T.

cruzi. Os resultados indicam que a propagação de cascatas de sinalização celular

por proteínas quinases e fosfatases desempenha um papel importante nos

processos fisiológicos de T. cruzi, incluindo a motilidade celular, metabolismo,

transporte de íons, diferenciação e sobrevivência.

É interessante lembrar que o tratamento da doença de Chagas é atualmente

limitado a dois medicamentos, o nifurtimox e o benznidazol, que têm eficácia limitada

e causam efeitos colaterais graves (Urbina & Docampo, 2003; Wilkinson et al.,

2008). Além disso, não existe até o momento uma vacina contra T. cruzi para uso

em humanos (Garg & Bhatia, 2005; Dumonteil, 2007). Portanto, há uma necessidade

crítica de desenvolver novas estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar a

doença de Chagas. Em consonância com o interesse de desenvolver novos

fármacos, a verificação de que T. cruzi possui uma série de quinases que participam

de vias metabólicas não encontradas nos hospedeiros vertebrados, tem tornado

essas proteínas alvos moleculares interessantes para o tratamento da doença de

Chagas (Doerig, 2004; Nakayasu et al., 2009).

A análise das imagens dos géis bidimensionais pelo programa PDQuest

(BioRad) permitiu a atribuição de um valor numérico para o grau de fosforilação e

expressão de cada um dos “spots”. Apesar dos resultados gerarem valores precisos,

sabemos que a técnica apresenta limitações por ser baseada na quantificação de

proteínas através da avaliação de imagens. Este método de quantificação pode não

ser preciso o suficiente para gerar afirmações numéricas exatas. Deste modo, com o

intuito de tornar nossas análises menos suscetíveis a erros, nos concentramos

apenas na indicação de aumento ou redução da fosforilação e/ou expressão das

proteínas em estudo.

Nosso estudo identificou uma série de proteínas cuja fosforilação e/ou

expressão parece estar alterada após a incubação de formas epimastigotas, por

diferentes tempos, com TGF-β a 5 ng/ml. Essas proteínas são representadas nos

géis bidimensionais por um ou mais “spots”. Nos casos onde diferentes “spots” (de

mesma massa molecular, mas com pI diferentes) foram identificados para uma

mesma proteína com idênticas sequências de aminoácidos, seus valores foram

somados, na tentativa de avaliar o comportamento geral da proteína.

Discussão

94

Os padrões de fosforilação e expressão das proteínas de epimastigotas de T.

cruzi em resposta a adição de TGF-β foram determinados nos tempos de 1, 5, 15,

30 e 60 minutos de incubação a 4ºC. Tendo em vista os tempos de estudo podem

representar etapas sequenciais da resposta induzida por TGF-β, é possível associar

as proteínas que apresentaram fosforilação e/ou expressão alteradas em um tempo

de estudo com determinado passo da via, e ainda, propor interações e/ou

regulações das proteínas alteradas em tempos tardios pelas proteínas moduladas

nos tempos mais curtos de incubação. As proteínas cuja fosforilação e/ou expressão

foram moduladas em um ou mais tempo de estudo estão representadas na tabela

5.1.

Discussão

95

Tabela 5.1: Comportamento das proteínas em resposta a TGF-β.

Spot Identificação 1’ 5’ 15’ 30’ 60’ Proteínas de choque térmico 4+5 HSP70 precursor mitocondrial ��

3+87+102 HSP70 ��

6+7 HSP60 ��

2 DNAK ��

10 Proteína de interação Hsc70 ��

59 GrpE ��

73 Ciclofilina A ��

Proteínas de citoesqueleto 9 Beta Tubulina ��

42 Beta Tubulina ��

Proteínas de metabolismo 15+16

Prostaglandina F2 alfa sintase (PGF2S) ��

25+26+28+29 Prostaglandina F2 alfa sintase (PGF2S)

��

48 Aldo-ceto redutase (AKR) ��

19+20 Enolase ��

39 GAPDH ��

51 Malato desidrogenase glicossomal ��

31 Proteina dissulfeto isomerase (PDI)

��

32 Desidrogenase aromática L-alfa hidroxiácida (AHADH)

��

27 Tirosina aminotransferase (TAT)

��

Proteínas Hipotéticas 23+89 Hipotética ��

17 Hipotética ��


40 Complexo associado ao polipeptideo nascente (NAC) ��

53 Fator de iniciação eucariótico 5a (FIE-5a)

��

32a Fator de elongamento 1 alfa (EF-1α)

��

38 Fator de elongamento 1 alfa (EF-1α)

��

Proteases/ Peptidases

8 Cruzipaína (CZP) ��

55 Subunidade proteolítica do complexo hslvu

��

Discussão

96

Proteínas de regulação de estresse oxidativo 60

Triparedoxina peroxidase (TriX)

��

Proteínas de transdução de sinal 52

Fator de liberação de histamina dependente de IgE (FLHdIgE)

��

Tabela 5.1: tabela mostrando o comportamento nos padrões de fosforilação (setas verdes) e/ou expressão (setas vermelhas) de cada proteína ao longo dos tempos de estudo, em função da adição de TGF-β. O(s) número(s) do(s) “spot(s)” que representa(m) cada proteína está(ão) indicado(s) na coluna à esquerda. As proteínas estão ordenadas de acordo com as categorias funcionais indicadas nos resultados.

As proteínas de choque térmico foram inicialmente caracterizadas como

proteínas responsivas a alterações bruscas na temperatura ambiente e a situações

de estresse celular, mas também desempenham funções vitais no funcionamento

celular, como enovelamento, montagem, localização intracelular, secreção,

regulação e endereçamento de proteínas instáveis para a via de degradação

proteolítica (Bukau & Horwich, 1998; Nollen & Morimoto, 2002; Young et al., 2004;

Mayer & Bukau, 2005). As HSP70 são constitutivamente expressas e estão

localizadas em uma variedade de compartimentos celulares, como citoplasma,

membrana, no retículo endoplasmático, nas mitocôndrias e nos cloroplastos. O

precursor mitocondrial HSP70 (MPHSP70) exerce a função molecular de chaperona

junto a proteínas precursoras mitocondriais. Esses precursores são devidamente

enovelados pela MPHSP70 no citoplasma, o que permite sua translocação à matriz

mitocondrial, onde exercerão suas funções. A Hsc70 interage com a HSP70,

participando no processo de enovelamento protéico. Uma nova função putativa foi

sugerida para estas proteínas, mostrando que as HSP70 e Hsc70 de mamíferos são

capazes de se ligar seletivamente a certas sequências de RNA através do seu

domínio N-terminal de ligação ATP. A ligação a molécula de RNA parece ser

influenciada pela atividade da co-chaperonas HSP40 e pelo co-fator Bag (Zimmer et

al., 2001).

Trabalhos recentes demonstraram que TGF-β e chaperonas podem estar

diretamente relacionados. Bahn e colaboradores (2007) adicionaram TGF-β a

explantes de células epiteliais de ratos previamente aquecidos a 45ºC. Eles

verificaram que as chaperonas desempenham papel protetor na transição epitélio-

mesênquima induzida por TGF-β e estimulam a sobrevivência celular. Xin e

colaboradores (2005) evidenciaram um novo mecanismo para regulação da

sensibilidade de TGF-β dependente de CHIP (região carboxi-terminal da proteína de

Discussão

97

interação Hsc70). CHIP regula os níveis basais de Smad 3, através da degradação

ubiquitina-dependente desta proteína. Assim, CHIP é capaz de controlar a amplitude

da resposta celular induzida por TGF-β.

O rápido aumento na fosforilação das proteínas de choque térmico (HSP60,

HSP70 e HSP70 precursor mitocondrial e da proteína de interação Hsc70) pode ser

explicado como uma resposta combinada do parasito, onde o mesmo busca se

adaptar à variação de temperatura do meio (mudança de 28 para 4°C), e também

responder rapidamente ao estímulo com TGF-β. As proteínas de choque térmico

podem estar atuando como reguladores de outras moléculas, possivelmente

alterando suas conformações, o que pode resultar na translocação dessas

moléculas do citoplasma para outras organelas, mudança de conformação para um

estado ativo ou endereçamento para vias de degradação. A ligação às moléculas de

RNA pode, por sua vez, estar regulando positiva ou negativamente a expressão de

outras proteínas (através da estabilização ou desestabilização de mRNAs).

Nos procariotos, a proteína equivalente a HSP70 é denominada DnaK, e esta

também exerce a função de chaperona e de ligação ao RNA. O aumento rápido na

expressão dessas proteínas está provavelmente influenciando o aumento nas

atividades já descritas para as proteínas de choque térmico. A GrpE é o co-fator da

DnaK, auxiliando a proteína de choque térmico no enovelamento correto de

proteínas. A DnaK parece ser capaz de se ligar a certas sequências de RNA, em um

processo influenciado pela atividade da GrpE (Zimmer et al., 2001).

O aumento em tempos mais tardios na expressão da GrpE indica que ela

pode estar sendo regulada positivamente por outras moléculas responsivas ou

ativadas por TGF-β. Sua atividade deve estar relacionada tanto ao correto

enovelamento de proteínas, como também a um possível papel na estabilização de

moléculas de RNA, regulando a taxa de transcrição, e consequentemente, a

expressão de determinadas proteínas.

As ciclofilinas (ou peptidil-prolil isomerases - PPIases) pertencem a um grupo

de proteínas com atividade peptidil cis-trans isomerase, conhecidas coletivamente

como imunofilinas. As PPIases são enzimas que aceleram o enovelamento de

proteínas, catalisando a isomerização das ligações peptídicas anteriores aos

resíduos de prolina. As ciclofilinas são encontradas em todas as células de todos os

organismos procariotos e eucariotos estudados, entre eles, mamíferos, plantas,

Discussão

98

insetos, fungos e bactérias (Marks, 1996). As ciclofilinas são proteínas de 18 kDa,

estruturalmente conservadas, que compartilham um domínio comum de

aproximadamente 109 aminoácidos, cercado por domínios exclusivos de cada

membro da família, associados a compartimentalização subcelular e a

especialização funcional (Arevalo-Rodriguez et al., 2004). Estudos recentes têm

indicado uma série de funções celulares adicionais para as ciclofilinas, incluindo

papéis na sinalização celular e como chaperonas (Wang & Heitman, 2005).

A redução na sua expressão em 15 minutos de incubação com TGF-β pode

indicar que esta proteína esteja sendo negativamente regulada por outra molécula

direta ou indiretamente ativada por TGF-β em algum dos tempos anteriores de

estudo. A redução na sua atividade pode acarretar no retardamento do

enovelamento protéico, e assim, atrasar o correto endereçamento e ativação de

proteínas por ela reguladas. Pela sua função de chaperona, a redução na sua

expressão pode levar a diminuição na marcação de proteínas para vias de

degradação, gerando um aumento na abundância de certas proteínas. Contudo em

30 minutos, a sua expressão é aumentada sugerindo retorno da sua atividade

fisiológica.

Com relação às proteínas de citoesqueleto, temos que as α e β-tubulinas são

os principais componentes dos microtúbulos. As tubulinas delta são encontradas em

diversas localidades celulares, mas ao contrário das tubulinas α e β, elas não são

igualmente distribuídas entre os eucariotos. As delta tubulinas já foram localizadas

nos centríolos e desempenham uma função na formação do fuso mitótico durante a

mitose (Dutcher, 2001). Essas proteínas sofrem uma série de modificações pós-

traducionais, incluindo acetilação, tirosinação, fosforilação, poliglutaminação e

poliglicilação (Chapin & Bulinski, 1991). Os microtúbulos são os principais

componentes do citoesqueleto dos tripanossomatídeos e desempenham um papel

importante nas mudanças morfológicas associada do seu ciclo de vida (Kohl & Gull,

1998). O citoesqueleto dos tripanossomas é composto por um arranjo complexo de

microtúbulos, que incluem a rede subpelicular, o axonema, o corpo basal, o eixo

para-flagelar, a zona de aderência ao flagelo e os filamentos responsáveis pela

fixação do parasita às células hospedeiras (Robinson et al., 1991).

Alterações na expressão das tubulinas ocorrem durante o ciclo de vida dos

tripanosomatídeos, e são responsáveis por uma série de adaptações bioquímicas e

Discussão

99

morfológicas sofridas pelos parasitos. Estudos mostraram que a quantidade de

transcritos de α e β-tubulinas parece ser de 3 a 6 vezes maior em epimastigotas do

que em tripomastigotas e amastigotas, apesar de suas taxas de transcrição serem

bastante similares em epimastigotas e amastigotas (Bartholomeu et al., 2002). Um

estudo sobre a expressão dos genes de tubulina durante o crescimento de formas

epimastigotas do T. cruzi por Northern blot mostrou que há uma diminuição nos

níveis de mRNAs de α e β-tubulinas quando as epimastigotas passam da fase

logarítmica para a fase estacionária de crescimento (Gonzalez-Pino et al., 1999). As

alterações foram associadas com uma diminuição semelhante nas taxas de

transcrição para ambos os genes. Este estudo observou ainda que a expressão de

β-tubulina parece ser controlada em nível pós-transcricional.

A proteína β-tubulina é representada em nosso mapa proteômico pelos

“spots” 9 e 42, que apresentam comportamentos diferentes em seus padrões de

fosforilação e expressão ao longo de nosso tempo de estudo. Considerando que a β-

tubulina é uma proteína encontrada em diversas estruturas do parasito, e que os

dois “spots” que a representam em nosso mapa possuem pesos moleculares e

pontos isoelétricos bem distintos, é possível que estejamos analisando β-tubulinas

de diferentes localizações celulares, que exercem diferentes funções na estrutura

celular do parasito. O aumento rápido na expressão da β-tubulina representada pelo

“spot” 9 pode indicar que a mesma já existia pronta em vesículas ou organelas de

reserva. Um aumento rápido na taxa de transcrição de seu RNA também é possível,

apesar de parecer pouco provável pelo curto período de tempo que o parasito teria

para re-organizar sua maquinaria replicativa. Outra explicação seria a da redução na

taxa de degradação dos mRNAs, o que levaria a um aumento na quantidade de

proteínas traduzidas pela célula. A redução mais tardia na expressão de ambos os

“spots” pode ser por causa da regulação negativa das β-tubulinas por parte de

outras moléculas envolvidas direta ou indiretamente na via de sinalização por TGF-

β. Em resposta a TGF-β, as β-tubilinas podem estar alterando a organização dos

microtúbulos, permitindo a ocorrência de novas interações entre as moléculas das

epimastigotas.

Entre as proteínas envolvidas no metabolismo celular, a prostaglandina F2alfa

sintase (PGFS) é uma aldo-ceto redutase que pertence à família oxidorredutase

flavina-dependente (Kubata et al., 2000). Esta enzima localiza-se no citoplasma das

epimastigotas (Blehert et al., 1999) e, além da produção de prostaglandinas, tem a

Discussão

100

capacidade de reduzir tanto agentes tripanocidas (nifurtimox e outros) como

hidroperóxidos. Tem sido sugerido que a Prostaglandina F2 alfa sintase de T. cruzi

(TcPGFS) seja responsável pela maior parte da atividade antioxidante neste parasito

(Kubata et al., 2000). A PGFS catalisa a redução dependente de NADPH da 9,11-

endoperóxido a prostaglandina F2 alfa (Okano et al., 2002). A PGFS é uma proteína

com estrutura do tipo TIM barrel, e logo, possui um motivo conservado de ligação ao

fosfato. O fosfato vem do substrato ao qual a enzima se liga, ou de co-fatores, como

a riboflavina-5'-fosfato (FMN).

O aumento na sua fosforilação sugere maior atividade da PGFS, o que pode

estar levando ao aumento na síntese de prostaglandinas, que são compostos

lipídicos derivados de ácidos graxos, que se ligam a receptores de membranas,

como os receptores de membrana acoplados a proteína G. O aumento na síntese

das prostaglandinas pode estar associado a regulação de cálcio e ao controle do

crescimento e a proliferação celular.

As aldo-ceto redutases (AKR) são oxidoredutases monoméricas, amplamente

distribuídas em mamíferos, anfíbios, plantas, fungos, bactérias e protozoários

(Mathe et al., 1977; Samuelsson, 1979; Kubata et al., 2000; Ellis, 2002). As AKRs

formam uma superfamília de NAD(P)(H) oxidoredutases solúveis, cujo principal

objetivo é o de reduzir aldeídos e cetonas a álcoois primários e secundários. As

AKRs exibem ampla especificidade de substrato e catalisam a oxidação e/ou

redução de substratos, como as prostaglandinas, hormônios esteróides,

monossacarídeos, isoflavonóides, aldeídos alifáticos e aromáticos e hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos (McCracken et al., 1972; Dubois et al., 1998; Hayaishi, 2000;

Okano et al., 2002).

A redução na expressão da AKR indica que a mesma é negativamente

regulada por moléculas envolvidas ou ativadas na sinalização por TGF-β. A

identificação genérica da proteína como uma aldo-ceto redutase diminui nossas

chances de relacionar sua regulação negativa a moléculas ou vias específicas, já

que este grupo é formado por uma série de enzimas com funções diversificadas.

A enzima enolase (2-fosfo-D-glicerato hidrolase), também conhecida como

fosfopiruvato desidratase, é uma metaloenzima responsável por catalisar a

desidratação reversível da D-2-fosfoglicerato (PGA) a fosfoenolpiruvato (PEP), tanto

na glicólise como na gliconeogênese (Verlinde et al., 2001). A enolase é uma

Discussão

101

proteína com dobradamento do tipo TIM “barrel”, possuindo um motivo conservado

de ligação ao fosfato. O grupamento fosfato é proveniente tanto de seu substrato

como de co-fatores, como a riboflavina-5'-fosfato (FMN). A enolase também já foi

descrita como um componente estrutural do degradosoma de RNA de procariotos,

promovendo a degradação de moléculas de RNA nestes microorganismos (Kuhnel &

Luisi, 2001; Carpousis, 2002). Dessa forma, além de atuar como uma enzima

metabólica, a enolase parece também ser induzida por proteínas de choque térmico

(entre elas, a DnaK), como parte da resposta a situações de estresse celular.

A defosforilação da enolase pode estar relacionada à redução na sua

atividade, acarretando na perda de produção de energia e na regulação positiva ou

negativa da degradação de moléculas de RNA.

A enzima glicosomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gGAPDH)

desempenha várias funções importantes no processo glicolítico. A GAPDH catalisa a

oxidação e a fosforilação da D-gliceraldeído-3-fosfato (GAP) a 1,3-bifosfo-D-ácido

glicérico (1,3-BPGA) na presença de NAD+ e de fosfato inorgânico (Tisdale &

Artalejo, 2007). Além da sua função no metabolismo da glicose, a GAPDH exerce

múltiplas atividades intracelulares, incluindo a participação na ativação da

transcrição (Zheng et al., 2003) no transporte vesicular (Tisdale, 2001), na fusão

membrana-membrana, na modulação do citoesqueleto, no reparo e replicação do

DNA, na apoptose (Tarze et al., 2007) e na exportação do tRNA (Tisdale & Artalejo,

2007).

Sua rápida ativação pode estar associada a um maior requerimento de

energia para a viabilização da resposta celular induzida por TGF-β. A GAPDH pode

também estar ativando ou ampliando a transcrição de genes, gerando ou

aumentando a expressão de proteínas que atuarão na via de sinalização de TGF-β.

Além disso, a GAPDH pode estar associada ao transporte de moléculas, permitindo

o surgimento de novas interações celulares.

A malato desidrogenase é uma proteína que se liga a NAD, sendo seus sítios

ativos altamente conservados, compartilhando um mecanismo catalisador comum

(Golding & Dean, 1998). A malato desidrogenase citosólica e a malato

desidrogenase mitocondrial trabalham juntas na maioria dos organismos

eucarióticos, permitindo a re-oxidação mitocondrial do NADH glicolítico produzido no

citosol. Contudo, os tripanossomatídeos são uma exceção, porque a maioria das

Discussão

102

enzimas glicolíticas, incluindo a GAPDH, estão presentes no glicosoma (Cannata &

Cazzulo, 1984). O sistema de trocas envolve principalmente as malato

desidrogenases glicosomal e mitocondrial (Cannata & Cazzulo, 1984; Cazzulo,

1994), e logo, uma malato desidrogenase citosólica se torna inútil para o que pode

ser considerado o papel mais importante desta enzima em outros organismos.

A malato desidrogenase encontrada no nosso estudo é glicosomal, e assim,

desempenha papel importante no metabolismo do T. cruzi. O decréscimo na sua

fosforilação sugere a redução na atividade desta proteína, o que deve estar afetando

a re-oxidação do NADH e, portanto, o transporte de elétrons e a produção de

energia pelo parasito.

As proteínas dissulfeto isomerases (PDIs) são tiol-dissulfeto oxidoredutases

que catalisam a formação, redução e isomerização de ligações dissulfeto,

dependendo do ambiente redox, e também podem funcionar como chaperonas

moleculares, auxiliando no enovelamento de proteínas, embora este mecanismo não

esteja completamente elucidado (Noiva & Lennarz, 1992; Ferrari & Soling, 1999;

Rubotham et al., 2005).

O aumento na sua expressão pode estar relacionado à sua maior ativação, o

que reflete na geração de uma série de reações envolvidas na formação e ruptura

de pontes dissulfeto, as quais desempenham papel importante no enovelamento e

estabilidade de proteínas.

No T. cruzi, a desidrogenase aromática L-alfa-hidróxi-ácida (AHADH) está

envolvida no catabolismo de aminoácidos aromáticos. Esta é uma enzima citosólica

muito ativa ligada a NAD (Nowicki et al., 1992), que reduz os alfa-oxiácidos

aromáticos para L-alfa-hidróxi-ácidos (Cazzulo Franke et al., 1999).

Embora a AHADH seja completamente incapaz de usar oxaloacetato ou

piruvato como substrato, esta enzima apresenta semelhanças na sua sequência de

aminoácidos com as enzimas malato desidrogenase e lactato desidrogenase, onde a

maior similaridade foi observada com a malato desidrogenase citosólica

(Montemartini et al., 1994). As epimastigotas, durante sua vida no intestino do

inseto, são quase que exclusivamente dependentes de aminoácidos e proteínas

como fontes de energia, porque a glicose presente no repasto sanguíneo é

rapidamente esgotada. A expressão diferencial da AHADH nas várias formas do

Discussão

103

parasito, com os níveis mais elevados da enzima nas formas do inseto (epimastigota

e tripomastigotas metacíclicos), está de acordo com a possibilidade de um

catabolismo de aminoácidos mais ativo realizado por essas formas. Isto significa que

elas devem ter suas vias catabólicas conectadas (pelo menos parcialmente) a um

ciclo de Krebs e a uma cadeia respiratória funcionais, permitindo a utilização de

aminoácidos como combustível (Nowicki & Cazzulo, 2008).

O aumento na expressão da AHADH deve estar relacionado ao aumento na

degradação de proteínas para geração de energia e de aminoácidos livres, processo

essencial, por exemplo, para aceleração no seu desenvolvimento e proliferação.

As epimastigotas de T. cruzi têm um conjunto intracelular considerável de

aminoácidos livres, que são utilizados na síntese de proteínas e na produção de

energia (Rohloff et al., 2003). As principais enzimas envolvidas na troca e eliminação

do nitrogênio do grupo amino são as aminotransferases, muitas das quais

transferem o grupo amino a 2- oxoglutarato para gerar L-glutamato. A tirosina

aminotransferase (TAT) de T. cruzi é muito abundante, representando 3% do total de

proteínas solúveis; o genoma de T. cruzi possui aproximadamente 70 cópias do

gene tat (Bontempi et al., 1993). Enquanto a TAT dos mamíferos prefere tirosina e

alfa-cetoglutarato como substratos (Iwasaki et al., 1973), a enzima de T. cruzi aceita

três alfa-cetoácidos (piruvato, a-cetoglutarato e oxaloacetato), todos os três

aminoácidos aromáticos e alanina como substratos (Montemartini et al., 1993). Esta

enzima tem uma ampla especificidade de substrato, utilizando de forma eficiente a

leucina, metionina, tirosina, fenilalanina, triptofano e alanina como doadores de

aminoácidos (Montemartini et al., 1993; Nowicki et al., 2001; Blankenfeldt et al.,

1999).

A redução na sua expressão sugere que a TAT esteja sendo negativamente

regulada por outra molécula direta ou indiretamente ativada por TGF-β em algum

dos tempos anteriores de estudo e indica uma diminuição na síntese de algumas

proteínas e menor produção de energia pela via da TAT.

Entre as proteínas envolvidas no processo de tradução, temos o complexo

associado ao polipeptídeo nascente (NAC), que se associa com ribossomos e

cadeias nascentes em uma estequiometria aparente de 1:1 (Wiedmann et al., 1994;

Funfschilling & Rospert, 1999; Rospert et al., 2002; Olesya, 2009). A NAC é um

complexo heterodimérico altamente conservado, presente em arqueobactérias,

Discussão

104

leveduras e células de mamíferos. O conhecimento sobre sua função in vivo ainda

apresenta várias lacunas a serem preenchidas. Alguns estudos especulam que a

NAC desempenha um papel no enovelamento de proteínas recém-sintetizadas,

protegendo-as da interação com fatores citosólicos inadequados. Estudos mostram

que a NAC pode contribuir para a fidelidade nos processos co-traducionais tais

como marcação de alvos e enovelamento (Wang et al., 1995). Há também

evidências de que a NAC interaja diretamente com a sequência de reconhecimento

de sinal e está envolvida na translocação correta de proteínas para o retículo

endoplasmático, através da regulação da acessibilidade do poro de translocação e

evitando a marcação errada de proteínas não secretórias (Lauring et al., 1995;

Moller et al., 1998). Além disso, um papel regulador da NAC na importação de

proteínas para a mitocôndria foi proposto (George et al., 1998; Funfschilling &

Rospert, 1999), no entanto, ainda não há evidência direta para apoiar esta hipótese.

A ativação da NAC em reposta a TGF-� pode estar relacionada à síntese de

proteínas corretamente enoveladas e ao endereçamento dessas moléculas ao

retículo endoplasmático e ao Golgi, onde provavelmente sofrerão modificações pós-

traducionais que permitirão o encaminhamento ao local onde exercerão suas

atividades celulares.

O fator eucariótico de iniciação da tradução 5A (EIF-5a) é uma proteína de 18

kDa, altamente conservada desde leveduras a células de mamíferos (Schnier et al.,

1991; Park et al., 1997; Caraglia et al., 2000). A EIF-5a promove a formação da

primeira ligação peptídica durante a fase inicial da síntese de proteínas (Hershey,

1991). Entretanto, a verdadeira função “in vivo” da EIF-5a, é apenas parcialmente

conhecida. Uma série de observações sugere que a EIF-5a desempenha um papel

essencial no crescimento e diferenciação celular. A EIF-5a pode ser uma proteína

bimodular, interagindo tanto com RNA quanto com proteínas, e presume-se assim,

que ela possua um papel importante na maquinaria de tradução (Park, 2006). Outras

funções foram propostas para a EIF-5a, incluindo a de co-fator celular da proteína

REV de HIV-1 (Ruhl et al., 1993), de um fator envolvido na exportação nuclear

(Lipowsky et al., 2000) e no “turnover” de mRNA (Zuk & Jacobson, 1998; Valentini et

al., 2002). A EIF-5a é encontrada no citoplasma em duas situações: uma é livre e a

outra é vinculada ao retículo endoplasmático (provavelmente o seu local de ação

apropriado) (Shi et al., 1996). No entanto, foi também recentemente relatado que a

EIF-5a pode se acumular nos filamentos intranucleares associados ao poro nuclear

Discussão

105

em células de mamíferos (Rosorius et al., 1999). Além disso, o fator interage com o

receptor nuclear geral de exportação CRM1 e é transportado do núcleo para o

citoplasma (Rosorius et al., 1999). Estes dados indicam que a EIF-5A pode também

funcionar como uma proteína de translocação núcleo-citoplasma de mRNAs

eventualmente correlacionados com a proliferação celular.

O aumento na fosforilação da EIF-5a indica uma resposta tardia desta

proteína à sinalização disparada por TGF-β. Sua ativação deve estar relacionada à

regulação da tradução de proteínas, e logo, a produção de novas proteínas, que

podem ser os efetores da resposta celular a TGF-β.

O fator de elongamento-1α (EF-1α) desempenha papel essencial na

biossíntese de proteínas eucarióticas (Billaut-Mulot et al., 1996). A EF-1α se liga a

aminoacil-tRNAs no sítio aceptor da subunidade ribossomal 80S através da hidrólise

de GTP (Moazed & Noller, 1989). A EF-1α possui uma série de outras funções além

da biossíntese de proteínas. Esta proteína foi encontrada em associação com a valil-

tRNA sintetase de mamíferos, complexadas a partículas mRNP, ligada a actina do

citoesqueleto da célula, ligada ao retículo endoplasmático ou ao aparato mitótico,

estando envolvida na degradação de proteínas ou em associação ao ribossomo

(Merrick, 1992). A EF-lα também tem sido relacionada a uma variedade de

processos, como a embriogênese, a divisão celular, a proliferação celular, o

envelhecimento e a transformação oncogênica (Janssen et al., 1994). Além disso,

uma quantidade considerável de EF-1α foi localizada no núcleo de diversos tipos de

células (Collings et al., 1994; Barbarese et al., 1995). Existe ainda a possibilidade da

EF-lα desempenhar um papel na regulação da transcrição (Blumenthal et al., 1972).

Grandes aumentos nos níveis de mRNA de EFlα são observadas em células

de cultura de rápida proliferação (Sanders et al., 1992), nos embriões (Krieg et al.,

1989) e em células tumorais humanas de proliferação rápida (Grant et al., 1992).

Estes dados indicam que o nível de expressão de EFlα se correlaciona com a taxa

de crescimento e proliferação celular (Condeelis, 1995). Ensaios de

imunofluorescência utilizando anticorpos para a EF-1α de T. cruzi (TCEF-1α),

visando estudar a distribuição celular da (TCEF-1α) durante o crescimento in vitro de

epimastigotas, revelaram que esta proteína é acumulada no núcleo de parasitos em

processo de envelhecimento mostrando níveis elevados de células binucleadas,

indicativo de parada na citocinese, e aqueles em processo de morte por apoptose,

Discussão

106

sugerindo, portanto, que a TCEF-1α é capaz de fazer a translocação entre

citoplasma e núcleo celular (Billaut-Mulot et al., 1996; Ouaissi, 2003).

No nosso estudo, a EF-1α tem sua expressão aumentada em resposta ao

TGF-β, podendo, portanto, estar participando da regulação da síntese de proteínas,

influenciando positivamente na proliferação das epimastigotas.

Entre as proteases/peptidases, temos a cruzipaína (CZP), uma cisteína

protease do tipo papaína, que parece ser maturada no complexo de Golgi (Engel et

al., 1998) e é altamente acumulada (Soares et al., 1992) e ativa (Cunha-e-Silva et

al., 2002) nos reservossomas, que contêm proteínas usadas na diferenciação para

tripomastigotas metacíclicos (Soares et al., 1992). A via que endereça a cruzipaína

aos reservossomas não é totalmente compreendida, porém trabalhos anteriores

sugerem que esta enzima seja transportada do complexo de Golgi através de

vesículas secretórias (Soares et al., 1992) em uma via independente de manose 6-

fosfato (Cazzulo et al., 1990). A CZP é expressa em diferentes níveis nas diferentes

formas evolutivas do parasito (Cazzulo et al., 1990; Martinez et al., 1991). Esta

enzima é a principal protease encontrada na forma epimastigota, sendo ativa pelo

menos dez vezes mais nesta forma do que nas amastigotas e tripomastigotas

(Campetella et al., 1990; Sant'Anna et al., 2008).

A endocitose e a reciclagem de proteínas são vias metabólicas essenciais

para o desenvolvimento do ciclo de vida do T. cruzi (De Souza, 2002). A via

endocítica está sob controle rigoroso de desenvolvimento nas diferentes fases do

ciclo de vida do parasito. As formas epimastigotas são altamente ativas e

armazenam macromoléculas obtidas do meio em estruturas denominadas

reservossomas (Soares & de Souza, 1991). Esta estrutura não foi observada em

formas tripomastigotas ou amastigotas (Soares & de Souza, 1991). Durante o

processo de diferenciação de formas epimastigotas em tripomastigotas metacíclicos,

a conversão da forma proliferativa para a forma infectante é realizada com consumo

de energia e é dependente da disponibilidade de aminoácidos, sendo necessário o

uso dos substratos resultantes da degradação de moléculas pela via endocítica

(Soares et al., 1989). Utilizando uma abordagem imunocitoquímica, a cruzipaína

também foi localizada na membrana plasmática e na bolsa flagelar do parasito

(Souto-Padron et al., 1990). Portanto, é possível que pelo menos uma fração da

CZP seja primeiramente endereçada para a superfície do parasito, e em seguida,

Discussão

107

internalizada como parte da via endocítica e encaminhada aos reservossomas. Já foi

descrita na literatura uma relação entre TGF-β e cruzipaína. A adição de cruzipaína

à macrófagos de murinos induziu um aumento na secreção de TGF-β (Stempin et

al., 2002). A cruzipaína foi sugerida ainda como a provável molécula ativadora de

TGF-β em Trypanosoma cruzi (Waghabi et al., 2005b).

A Cruzipaína também está envolvida na virulência do T. cruzi. Embora esteja

menos presente em amastigotas e tripomastigotas, a cruzipaína é um antígeno

imunodominante reconhecido nos soros de pacientes humanos com a doença de

Chagas crônica (Martinez et al., 1991; Cazzulo, 2002).

O aumento na expressão da cruzipaína pode estar associado ao aumento na

atividade desta proteína, que em resposta a TGF-β deve regular a degradação e

reciclagem de proteínas nos reservosomas de T. cruzi.

O complexo HslVU consiste em dois componentes: o componente HslU, que

atua como chaperona e ATPase (Rohrwild et al., 1996; Neuwald et al., 1999; Seong

et al., 2000), e o componente HslV, a treonina protease amino-terminal (Chuang et

al., 2005), que confere a atividade peptidase (Azim et al., 2005). A protease HslVU

está envolvida na proteólise de proteínas de vida curta, como a proteína inibidora da

divisão celular SulA (Cordell et al., 2003), o fator de choque térmico 32 (Kanemori et

al., 1997), e o ativador de transcrição RcsA (Torres-Cabassa & Gottesman, 1987). A

protease HslVU é considerada como um análogo de bactérias do proteassoma 26S

eucariótico (Rohrwild et al., 1996; Gille et al., 2003). Essas proteases desempenham

um papel essencial no controle dos níveis das principais proteínas reguladoras e na

eliminação de polipeptídeos anormais (Park et al., 2005).

O aumento na expressão da subunidade proteolítica do complexo Hsvlu deve

se relacionar ao aumento de sua atividade, e assim, esta molécula pode estar

desempenhando função semelhante a da cruzipaína, regulando a degradação de

proteínas do parasito.

A triparedoxina peroxidase (TriX) 1 é uma tiol-dissulfeto oxidorredutase

encontrada em parasitos tripanosomatídeos pertencentes à ordem Kinetoplastida. A

principal função biológica da TriX é a de regular o estresse oxidativo como um

componente da via da tripanotiona peroxidase (Alphey et al., 2003). Em Leishmania

e outros tripanosomatídeos, as enzimas da família triparedoxina peroxidase são

Discussão

108

consideradas as principais responsáveis pela detoxicação de peróxidos, protegendo

as células de danos causados pelo estresse oxidativo (Flohe et al., 2003). Estas

enzimas obtêm seus equivalentes redutores da tripanotiona, através da proteína

triparedoxina ditiol (Wyllie et al., 2008). Várias enzimas antioxidantes, incluindo a

triparedoxina peroxidase mitocondrial (TcMPX) são reguladas positivamente durante

a transformação da forma não infectiva do inseto (epimastigota) para a forma

infectiva tripomastigota metacíclica (Atwood et al., 2005; Piacenza et al., 2008).

O aumento tardio na expressão da triparredoxina peroxidase indica a

necessidade prévia da ativação de outras moléculas pela via de TGF-β. TGF-β está

envolvido na proliferação das epimastigotas e este evento é fruto de uma série de

interações moleculares. O aumento na proliferação das epimastigotas pode estar

associado aos primeiros sinais para a diferenciação das epimastigotas em

tripomatigotas que, como descrito na literatura, regula positivamente a triparredoxina

peroxidase. A ativação da triparredoxina peroxidase deve ocorrer em etapas

anteriores à diferenciação, ainda na fase de proliferação das epimastigotas.

O fator de liberação de histamina dependente de IgE está envolvido

primordialmente na resposta imunológica produzida por células do sistema de

defesa em eucariotos superiores, sendo também conhecida como proteína tumoral

traducionalmente controlada (TCTP). A TCTP é expressa em tecidos mitoticamente

ativos (Thiele et al., 2000). Em inúmeras situações experimentais e sistemas

biológicos, foi estabelecido que os níveis de TCTP são altamente regulados em

resposta a uma ampla gama de sinais extracelulares e às condições celulares.

Vários relatos destacaram a importância da TCTP para a progressão do ciclo celular

e a transformação maligna (Bommer & Thiele, 2004). Normalmente, os sinais de

crescimento (Bommer et al., 2002) e citocinas (Nielsen et al., 1998; Teshima et al.,

1998) foram relatados por rapidamente induzir a síntese desta proteína. Além disso,

a TCTP exerce uma função extracelular como fator de liberação de histamina e tem

atividade anti-apoptótica (MacDonald et al., 1995). A TCTP já foi caracterizada em

vários organismos parasitos, tais como subespécies de Plasmodium (Bhisutthibhan

et al., 1999; Walker et al., 2000) e vários vermes parasitos (Gnanasekar et al., 2002;

Rao et al., 2002). Em todos estes casos, a proteína do parasito é secretada no

organismo hospedeiro e é capaz de causar infiltrados inflamatórios de eosinófilos

(Gnanasekar et al., 2002; Rao et al., 2002) e / ou liberação de histamina de basófilos

(Rao et al., 2002; MacDonald et al., 2001).

Discussão

109

Várias condições de estresse, como privação de nutrientes (Bommer et al.,

2002; Bonnet et al., 2000), choque térmico, metais pesados, estresse de cálcio (Xu

et al., 1999) ou sinais pró-apoptóticos ou citotóxicos (Sinha et al., 2000) resultam

tanto na regulação positiva como negativa dos níveis de TCTP (Bommer et al., 2002;

Gachet et al., 1999). A adaptação rápida dos níveis da proteína TCTP a alterações

nas condições celulares nos mostra que tanto sua síntese como a degradação são

altamente reguladas, existindo várias evidências mostrando que a síntese de TCTP

é regulada, tanto no nível transcricional como traducional (Bommer et al., 2002).

TCTP possui uma região de ligação a tubulina e foi mostrado que em células

de mamíferos, parte desta proteína se liga aos microtúbulos durante a maior parte

do ciclo celular (Gachet et al., 1999). Os níveis de TCTP são regulados

positivamente durante a entrada das células no ciclo celular, e logo, acredita-se que

esta proteína seja importante para o crescimento e divisão celular. A maioria das

publicações descreve a TCTP como uma proteína citoplasmática, mas sua

localização nuclear também já foi relatada (Li et al., 2001).

A ativação desta proteína em formas epimastigotas de T.cruzi em resposta ao

TGF-β pode estar associada a uma série de processos celulares. Assim como as

proteínas de choque térmico, a TCTP pode estar sendo duplamente ativada: como

resposta à baixa na temperatura do ambiente e em resposta a adição de TGF-β ao

meio. Com relação à última, a TCTP pode estar envolvida na proliferação das

epimastigotas. Uma hipótese seria a da ligação desta proteína às tubulinas, de modo

a provocar re-estruturações no parasito e permitir que novas interações celulares

ocorram.

A fosforilação de proteínas está fortemente associada aos processos de

sinalização celular e de desenvolvimento nos eucariotos. Apesar do amplo espectro

de informação gerado pela fosfoproteômica, é extremamente desafiador conectar as

quinases em estudo com seus devidos alvos moleculares. O desafio de associar as

quinases a seus substratos reflete a complexidade das funções desempenhadas por

essas proteínas. As quinases tendem a exercer seus efeitos biológicos através da

fosforilação simultânea de múltiplos resíduos, muitas vezes em componentes de

complexos protéicos múltiplos. Embora estes eventos de fosforilação sejam

biologicamente significantes, a identificação das quinases responsáveis por eles se

torna extremamente difícil. Por isso, apesar de termos identificado uma série de

Discussão

110

proteínas responsivas a TGF-β, constitui tarefa difícil relacionar o papel de cada uma

delas na sinalização disparada por TGF-β.

Por último, fizemos um ensaio de proliferação das epimastigotas na presença

ou não de TGF-β nas culturas. A adição da citocina no meio promoveu um aumento

de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. Com 48

e 72 horas ainda é observado um aumento na proliferação devido à adição de TGF-

β, porém este já não é tão acentuado. Esse dado acrescenta importância ao papel

de TGF-β sobre a forma epimastigota de T. cruzi e reforça a relevância do nosso

estudo, mostrando que esta forma evolutiva também é influenciada positivamente

pela citocina em questão.

Considerações Finais

Este estudo integra um amplo conjunto de trabalhos elaborados em nosso

laboratório, que visam compreender a relação de TGF-β com o T. cruzi. Aprofundar

nosso conhecimento acerca de quais papéis TGF-β desempenha e de como os

mesmos são executados no parasito é uma oportunidade para entender melhor

como T. cruzi regula as diferentes etapas de seu ciclo de vida, e consequentemente,

como ele consegue se desenvolver nos seus hospedeiros vertebrados e

invertebrados. A compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à

sinalização por TGF-β em T. cruzi pode ser de grande relevância para a busca de

novos alvos que visem o tratamento ou até mesmo a cura da doença de Chagas.

Nosso estudo mostrou que algumas proteínas de epimastigotas de T. cruzi

respondem aos estímulos de TGF-β, mas o papel exato que elas desempenham na

sua via de sinalização continua sendo objeto de investigação em nosso laboratório.

De uma forma geral, podemos dizer que as epimastigotas respondem ao estímulo

de TGF-β, que por sua vez é capaz de interagir direta e indiretamente com proteínas

do parasito, alterando seus padrões de fosforilação e modulando seus níveis de

expressão. TGF-β deve, então, ativar ou desativar via(s) específica(s) do parasito,

podendo causar um aumento na sua proliferação, e possivelmente, regulando outras

funções celulares neste microorganismo.

Conclusões

111

7. CONCLUSÕES

Após a realização de nosso estudo, podemos concluir que:

� A dose de 5 ng/ml de TGF-β induziu o maior número de eventos de

fosforilação nas proteínas das epimastigotas de T. cruzi;

� A metodologia fosfoproteômica se mostrou eficaz na caracterização das

proteínas de epimastigotas de T. cruzi diferencialmente fosforiladas e/ou

expressas em resposta a TGF-β;

� No estudo de cinética de tempo, os perfis protéicos bidimensionais das

epimastigotas tratadas com 5 ng/ml de TGF-β por 1, 5, 15, 30 ou 60 minutos

apresentaram diferenças nos padrões de fosforilação e/ou expressão de

algumas proteínas;

� As proteínas responsivas à TGF-β estão relacionadas a diversas funções

celulares, entre elas, enovelamento protéico, resposta a choque térmico,

formação de citoesqueleto, síntese de proteínas, transdução de sinal, sendo

as mais abundantes envolvidas no metabolismo celular;

� TGF-β modulou positivamente o processo de proliferação das epimastigotas

de T. cruzi.

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