Inhibitoren der AChE, BuChE und der Amyloid-β€¦ · Prof. Pia Vuorela aus Turku, Finnland, und...

Inhibitoren der AChE, BuChE und der Amyloid-β-

Aggregation vom Pyridylenhydrazon-Typ

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Michaela Prinz

aus Landau/Isar

Würzburg 2012

Eingereicht am:……………………………

bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie

1. Gutachter:…………………….……….

2. Gutachter:……………………………….

der Dissertation

1. Prüfer:…………………………………..

2. Prüfer: ………………………………….

3. Prüfer: ………………………………….

des Öffentlichen Promotionskolloquiums

Tag des Öffentlichen Promotionskolloquiums:……………

Doktorurkunde ausgehändigt am:………………………….

Teile der Arbeit wurden bereits in folgender Form veröffentlicht:

Orginalarbeiten

Alptüzün, V.; Prinz, M.; Hörr, V.; Scheiber, J.; Radacki, K., Fallarero, A.; Holzgrabe, U.

Interaction of (benzylidene-hydrazono)-1,4-dihydropyridines with β-amyloid, acetylcholine, and

butyrylcholine esterases.

Bioorganic Medicinal Chemistry, 2010, 18 (5), 2049-2059.

Karlsson, D.; Fallarero, A.; Brunhofer, G.; Guzik, P.; Prinz, M.; Holzgrabe, U.; Erker, T.; Vuorela, P.

Identification and characterization of diarylimidazoles as hybrid inhibitors of butyrylcholinesterase

and amyloid beta fibril formation.

European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2012, 45 (1-2), 169-183.

Ignasik, M.; Bajda, M.; Guzior, N.; Prinz, M.; Holzgrabe, U.; Malawska, B.

Design, synthesis and evaluation of novel 2-(aminoalkyl)-isoindoline-1,3-dione derivatives as dual

binding site acetylcholinesterase inhibitors.

Archiv der Pharmazie, 2012, 345 (7), 509-516.

Prinz, M.; Parlar, S.; Byraktar G.; Alptüzün, V.; Erciyas, E.; Fallarero, A.; Karlsson D.; Vuorela, P.;

Burek, M.; Förster, C.; Turunc, E.; Amagan, G.; Yalcin, A.; Holzgrabe, U.

1,4-Substituted 4-(1H)-pyridylene-hydrazone-type inhibitors for AChE, BuChE and amyloid-β

aggregation crossing the blood-brain-barrier.

Journal of Medicinal Chemistry, eingereicht.

Abstrakta und Kongressmitteilungen

Prinz, M.; Hoerr, V.; Alptüzün, V.; Scheiber, J.; Holzgrabe, U.

Duo derivatives lead to multitarget molecules affecting Alzheimer’s Disease (AD).

DPhG-Jahrestagung, Bonn, 2008.

JCF-Würzburg, ChemSyStM, Würzburg, 2008.


Combating Alzheimer’s Disease (AD) by multitarget molecules.

ISMC, Wien, 2008.


DUO derivatives affect multiple targets in the cascade of Alzheimer’s disease (AD).

DPhG-Jahrestagung, Jena, 2009.


Multitarget approach towards Alzheimer’s Disease based on DUO derivatives.

DPhG-Jahrestagung, Braunschweig, 2010.

JCF-Würzburg, ChemSyStM, Würzburg, 2010.

Prinz, M.; Alptüzün, V.; Parlar, S.; Fallarero, A.; Vuorela, P.; Burek, M.; Förster, C.; Holzgrabe, U.

Alzheimer’s Disease: New promising compounds with multiple effects and blood-brain-mobility.

DPhG/OePhG-Jahrestagung, Innsbruck, 2011.

Karlsson, D.; Fallarero, A.; Brunhofer, G.; Guzik, P.; Prinz, M.; Holzgrabe, U.; Erker, T.; Vuorela, P.

Identification and characterization of imidazoles and thienothiazines as selective inhibitors of

butyrylcholinesterase.

PharmSciFair, Prag, 2011.

Bajda, M.; Guzior, N.; Ignasik, M.; Prinz, M.; Holzgrabe, U.; Malawska, B.

Design, synthesis and biological evaluation of new heterodimeric derivatives acting as dual binding

site cholinesterase inhibitors with beta amyloid antiaggregation activity.

ISMC, Berlin, 2012.

Chen, X.; Kuzmanovic, N.; Prinz, M.; Holzgrabe, U.; Koenig, B.; Decker, M.

Investigation of physicochemical and pharmacological activities of photochromic tacrine derivatives:

Their inhibition of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) by both ring-open

and ring-closed forms.

ISMC, Berlin, 2012.

Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von November 2007 bis Juni 2012 am Institut für

Pharmazie und Lebensmittelchemie der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg auf

Anregung und unter der Anleitung von Frau Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe. Ihr gilt mein besonderer Dank

für die sehr freundliche Aufnahme in den Arbeitskreis, die interessante und abwechslungsreiche

Themenstellung sowie ihre Unterstützung in jeder Phase der Promotion und ihr Vertrauen in mich

selbstständig und eigenverantwortlich zu arbeiten.

Weiterhin möchte ich mich bei meinen Kooperationspartnern bedanken:

Prof. Ercin Erciyas aus Izmir, Türkei, und seinen Mitarbeitern, vor allem Dr. Vildan Alptüzün

und Sülünay Parlar für die sehr gute, freundschaftliche Zusammenarbeit, sowie den

wissenschaftlichen und kulturellen Austausch.

Prof. Pia Vuorela aus Turku, Finnland, und ihren Mitarbeitern, vor allem Adyary Fallarero

und Daniela Karlsson für die schnellen Testungen der synthetisierten Verbindungen und die

nette Zusammenarbeit.

Prof. Carola Förster aus der Uniklinik Würzburg und ihren Mitarbeitern, vor allem

Dr. Malgorzata Burek für die interessante Zusammenarbeit, spannenden Diskussion und die

biologischen Tests für die Bluthirnschranke.

Prof. Christoph Sotriffer und seinen Mitarbeitern, im Besonderen Manuel Krug, der die

quantenmechanischen Rechnungen übernommen hat, für die Bereitschaft mir immer wieder

weiter zu helfen.

Prof. Barbara Malawska und ihren Mitarbeitern für die Validierung des ThT-Tests mit Peptid.

Prof. Ayfer Yalcin aus Izmir, Türkei, und ihren Mitarbeitern, vor allem Ezgi Turunc und Guliz

Armagan für die ROS-Testungen

Bei Frau Möhler und Frau Ebner möchte ich mich für all die bürokratischen, organisatorischen

und zwischenmenschlichen Informationen bedanken, ohne die ich nie auf dem neuesten Stand

geblieben wäre. Ein herzlicher Dank geht auch an Frau Möhler für die kulinarischen

Hilfestellungen, mündlich wie schriftlich.

Sehr herzlich bedanken möchte ich mich bei dem gesamten AK Holzgrabe aus dem alten und

neuen Gebäude. Mit euch wurde es nie langweilig, man konnte immer auf euch zählen und viele

lustige außeruniversitäre Aktivitäten, sei es feucht-fröhlich, kulturell oder kulinarisch, erleben.

Besonders danke ich Dr. Eva Kugelmann, Benjamin Schäfer, Christina Juli, Christine Top, Katja

Heinig, Florian Seufert und Oliver Wahl, dass sie die unzähligen Stunden im Praktikum so

angenehm und lustig gemacht haben.

Vielen Dank auch an Gülşah Bayraktar, die mir die Türkei näher gebracht hat und meine Zukunft

aus dem Kaffeesatz gelesen hat. Herzlicher Dank auch an Michalina Ignasik, für das Interesse an

meiner Arbeit und die lustigen Abende.

Anna Kucharski möchte ich für die Hilfe im chaotischen Laboralltag danken

Lina Pogorelaia danke ich für ihre unglaublichen Heinzelmännchen-Tätigkeiten, ohne die nichts

funktionieren würde. Vielen Dank auch für die interessanten, lustigen und manchmal auch

mütterlichen Gespräche.

Mein Dank geht auch an Dr. Eberhard Heller und Dr. Curd Schollmayer, die mir bei vielen

synthetischen und spektroskopischen Problemen, sei es an der Uni oder bei einem Schoppen, zur

Seite gestanden haben.

Ein ganz großes Dankeschön an alle meine Laborkollegen! Besonders herzlich bedanken möchte

ich mich bei meinem alten, Maximilian Tischer, und neuen, Georg Hiltensperger, direkten

Laborkollegen. Vielen Dank, dass ihr meine Eigenheiten ertragen habt und es eine lustige,

diskussionsreiche (wissenschaftlich und privat) und unvergessliche Zeit geworden ist. Ein ganz

besonderer Dank gilt auch Christina Juli, Christine Topf und Dr. Jens Schmitz für unsere

zahlreichen privaten Gespräche und Freundschaftsdienste. Herzlichen Dank auch an Ines Schmidt,

Andreas Hartung (mein Laptop bedankt sich nochmal extra) und Jessica Klöckner. Ohne euch alle

wäre die Zeit nicht das gewesen, was sie war. Vielen Dank, dass aus Arbeitskollegen Freunde

geworden sind.

Das größte Dankeschön geht an meine Eltern und meine Schwester Sonja, ohne die so vieles nicht

möglich gewesen wäre. Schwesterherz, wir halten einfach zusammen. Vielen Dank für Eure nie

endende Unterstützung. Ohne Euch wäre ich nicht so weit gekommen!

I

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

II

1 Einleitung ............................................................................................................................. 1 1.1 Morbus Alzheimer ................................................................................................................. 2 1.1.1 Geschichtliches zu Morbus Alzheimer .................................................................................. 2 1.1.2 Prävalenz ............................................................................................................................... 2 1.2 Mechanismen und Angriffspunkte der Alzheimer-Krankheit ............................................... 3 1.2.1 Pathogenese ........................................................................................................................... 3 1.2.2 Therapie ................................................................................................................................. 4 1.2.2.1 Die cholinerge Hypothese ..................................................................................................... 4 1.2.2.2 Beeinflussung der Exzitotoxizität .......................................................................................... 7 1.2.3 Neue Angriffsmöglichkeiten ................................................................................................. 8 1.2.3.1 Die genetische Hypothese. .................................................................................................... 8 1.2.3.2 Die metabolische Hypothese ................................................................................................. 8 1.2.3.3 Die anti-inflammatorische Hypothese ................................................................................... 9 1.2.3.4 Der Einfluss von oxidativem Stress ....................................................................................... 9 1.2.3.5 Die -Protein-Hypothese ....................................................................................................... 9 1.2.3.6 Die Amyloid-Hypothese ...................................................................................................... 11 1.2.3.6.1 Bildung des Amyloid-β-Peptids .......................................................................................... 11 1.2.3.6.2 Amyloide Fibrillen .............................................................................................................. 13 1.2.3.7 Zusammenspiel von Aβ und -Protein ................................................................................ 15 1.3 Aktuelle Arzneistoffe in der „Pipeline“ ............................................................................... 17 1.3.1 Wirkstoffe in Klinischen Phasen ......................................................................................... 17 1.3.2 Universitäre Grundlagenforschung ...................................................................................... 18 2 Zielsetzung.......................................................................................................................... 19 2.1 „Multi-target“-Ansatz .......................................................................................................... 20 2.2 Leitstruktur .......................................................................................................................... 20 3 Synthese der Zielverbindungen ........................................................................................ 23 3.1 Syntheseschema zu den 1,4-substituierten 1,4-Dihydropyridin- Hydrobromiden ..... 24 3.2 Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid ............................................................... 25 3.2.1 Versuche zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid ......................................... 25 3.2.2 Optimierung der Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid .................................... 27 3.2.3 Mikrowellen-unterstützte Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid ...................... 30 3.2.3.1 Vorteile Mikrowellen-unterstützter Synthese ...................................................................... 30 3.2.3.2 Mikrowellen-unterstützte Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid ...................... 31 3.2.4 Einsatz von verschiedenen Hydrazinderivaten zur Synthese von 4-

Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid ......................................................................................... 32 3.2.5 Besonderheiten zur Struktur von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid................................. 32 3.3 Synthese der einfach substituierten Pyridylhydrazon-Hydrochloride ................................. 34 3.3.1 Synthese ............................................................................................................................... 34 3.3.2 NMR-spektroskopische Betrachtungen ............................................................................... 35 3.4 Synthese der 1,4-substituierten Pyridylhydrazon-Hydrobromide ....................................... 38 3.4.1 Synthese ............................................................................................................................... 38 3.4.2 NMR-spektroskopische Betrachtungen ............................................................................... 39 3.5 Synthese von Keto-Derivaten .............................................................................................. 42 3.5.1 Synthese der Ketogruppe in Benzylposition ....................................................................... 42 3.5.2 Synthese der Ketogruppe mit einem Methylenspacer zum Phenylring ............................... 44 4 Biologische Aktivität ......................................................................................................... 47 4.1 Inhibition der AChE/BuChE-Aktivität ................................................................................ 48 4.1.1 Messverfahren der Cholinesterase-Aktivität ....................................................................... 48 4.1.2 Berechnung der IC50-Werte ................................................................................................. 49 4.1.2.1 Aktivität der AChE .............................................................................................................. 49 4.1.2.2 Sigmoidale Dosis-Wirkungsbeziehung und Richtigkeit des Testsystems ........................... 50 4.1.3 AChE/BuChE – Hemmung der 1,4-substituierten Pyridylhydrazon- Hydrobromide 51 4.1.4 Diskussion der Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) ..................................................... 53

INHALTSVERZEICHNIS

III

4.1.4.1 Einfluss der Substitution an der Hydrazinyl-Seite (siehe Abb. 46) .....................................53 4.1.4.2 Einfluss der Substitution an der Pyridin-Seite (siehe Abb. 47) ...........................................55 4.1.4.3 Selektivität bzgl. AChE/BuChE (siehe Tabelle 5) ..............................................................56 4.1.5 Erklärung der SAR anhand der Proteinstruktur von AChE und BuChE ..............................57 4.2 Inhibition von Fibrillen ........................................................................................................59 4.2.1 Ansätze zur Messung der Fibrilleninhibition .......................................................................59 4.2.1.1 Aß-Peptid und für die Fibrillenbildung entscheidende Aminosäuren ..................................59 4.2.1.1.1 Synthese des verkürzten Peptids ..........................................................................................59 4.2.1.2 Einfluss der AChE auf die Fibrillenbildung .........................................................................60 4.2.2 Messverfahren der Fibrillen-Konzentration .........................................................................61 4.2.3 Berechnung von IC50-Werten aus dem Thioflavin T – Test .................................................63 4.2.3.1 Konzentration der Fibrillen ..................................................................................................63 4.2.3.2 Sigmoidale Dosis-Wirkungs-Beziehung und Richtigkeit des Testsystems ..........................64 4.2.4 Fibrillen-Hemmung der 1,4-substituierten Pyridylhydrazon- Hydrobromide ............65 4.2.5 Diskussion der Struktur-Wirkungs-Beziehungen .................................................................67 4.3 Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ...........................................................................................70 4.3.1 Bestimmung der Lipophilie ..................................................................................................71 4.3.2 Messverfahren zur Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ............................................................71 4.3.3 Mögliche Auswirkungen der Adhäsion an Polymere ...........................................................73 4.4 ROS-Testung ........................................................................................................................73 4.4.1 ROS-Hemmung ....................................................................................................................73 4.4.2 Hemmung der Lipidperoxidation (LP) .................................................................................75 4.5 Aktivität in Zellen ................................................................................................................75 5 Zusammenfassung .............................................................................................................. 76 6 Summary ............................................................................................................................. 81 7 Experimenteller Teil .......................................................................................................... 86 7.1 Synthese ...............................................................................................................................87 7.1.1 Allgemeine Angaben ............................................................................................................87 7.1.1.1 Verwendete Geräte ...............................................................................................................87 7.1.1.2 Chromatographie ..................................................................................................................88 7.1.1.3 Chemikalien und Lösungsmittel ...........................................................................................88 7.1.2 Synthesevorschriften und analytische Daten ........................................................................89 7.1.2.1 Synthese von 4-Pyrdidyl-hydrazin-Hydrochlorid 1 .............................................................89 7.1.2.1.1 Freisetzung der 4-Chlorpyridin-Base ...................................................................................89 7.1.2.1.2 Synthese von 4-Pyrdidyl-hydrazin-Hydrochlorid 1, modifiziert nach Mann et al.122 ..........89 7.1.2.2 Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 2 – 14 in Analogie zur Synthese

von Verbindung 9 nach Douglas et al.132 .............................................................................90 7.1.2.3 Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 2A – 14O, modifiziert nach

Holzgrabe et al.198 ................................................................................................................94 7.1.2.3.1 Substituent am Pyridin-N = Benzyl (Edukt: Benzylbromid) ...............................................96 7.1.2.3.2 Substituent am Pyridin-N = 2-Ethylphenyl (Edukt: (2-Bromethyl)benzol) .......................100 7.1.2.3.3 Substituent am Pyridin-N = 3-Propylphenyl (Edukt: (3-Brompropyl)benzol) ...................103 7.1.2.3.4 Substituent am Pyridin-N = 4-Butylphenyl (Edukt: 4-Bromobutylphenyl) .......................108 7.1.2.3.5 Substituent am Pyridin-N = 5-Pentylphenyl (Edukt: 5-Bromopentylphenyl) ....................110 7.1.2.3.6 Substituent am Pyridin-N = 4-Fluorbenzyl (Edukt: 4-Fluorbenzylbromid) .......................112 7.1.2.3.7 Substituent am Pyridin-N = 2-Iodbenzyl (Edukt: 2-Iodbenzylbromid) .............................114 7.1.2.3.8 Substituent am Pyridin-N = 2-Brombenzyl (Edukt: 2-Brombenzylbromid) ......................116 7.1.2.3.9 Substituent am Pyridin-N = 4-Brom-2-Fluorbenzyl (Edukt: 4-Brom-2-Fluorbenzylbromid)

............................................................................................................................................118 7.1.2.3.10 Substituent am Pyridin-N = 2,5-Dimethylbenzyl (Edukt: 2,5-Dimethylbenzylbromid) ....120 7.1.2.3.11 Substituent am Pyridin-N = 2-Methylnaphthyl (Edukt: 2-Bromomethylnaphthalen) ........122 7.1.2.3.12 Substituent am Pyridin-N = Pentyl (Edukt: 1-Brompentan) ..............................................124

INHALTSVERZEICHNIS

IV

7.1.2.3.13 Substituent am Pyridin-N = N-(3-propyl)-phthalimid (Edukt: N-(3-Brompropyl)-phthalimid) ........................................................................................................................ 126

7.1.2.3.14 Substituent am Pyridin-N = N-(5-pentyl)-phthalimid (Edukt: N-(5-Brompentyl)-phthalimid) ........................................................................................................................ 128

7.1.2.3.15 Substituent am Pyridin-N = Cinnamyl, (Edukt: (3-Bromprop-1-en-1-yl)-benzol) ............ 130 7.1.2.4 Synthese der Zwischenstufen für die Ketoderivate ........................................................... 133 7.1.2.4.1 -Bromacetophenon (15a)/-Iodacetophenon (15b) nach137 ............................................ 133 7.1.2.4.2 1-Brom-3-phenyl-2-propanon (16) nach140 ....................................................................... 133 7.1.2.4.3 Ethyl 3-brompropionat (17) nach138 .................................................................................. 133 7.1.2.4.4 3-Brom-N-methoxy-N-methylpropanamid (18) nach141 .................................................... 134 7.1.2.4.5 (2-Bromethoxy)(tert-butyl)dimethylsilan (19) nach142 ...................................................... 134 7.1.2.4.6 N-methoxy-N-methyl-2-phenylacetamide (20) nach141 ..................................................... 135 7.1.2.4.7 2-Benzyl-1,3-dithiolan (21) nach138 ................................................................................... 135 7.2 Biologische Methoden ....................................................................................................... 136 7.2.1 Allgemeine Angaben ......................................................................................................... 136 7.2.2 Untersuchung der Inhibition der AChE (Ellman’s-Test)148 ............................................... 136 7.2.2.1 Reagenzien und Materialien .............................................................................................. 136 7.2.2.2 Durchführung der Messungen ........................................................................................... 137 7.2.2.3 Auswertung der Messungen .............................................................................................. 138 7.2.3 Fibrilleninhibition .............................................................................................................. 138 7.2.3.1 Synthese des verkürzten Peptids165,166 ............................................................................... 138 7.2.3.2 Thioflavin-T-Test (in Analogie zu Levine et al.175) .......................................................... 139 7.2.3.2.1 Reagenzien und Materialien .............................................................................................. 139 7.2.3.2.2 Durchführung der Messungen ........................................................................................... 140 7.2.3.2.3 Auswertung der Messungen .............................................................................................. 141 7.2.4 Bestimmung des logP-Wertes ........................................................................................... 141 7.2.4.1 Reagenzien und Materialien .............................................................................................. 141 7.2.4.2 Durchführung .................................................................................................................... 142 7.2.4.3 Auswertung und Bestimmung der logP-Werte .................................................................. 142 7.2.5 Blut-Hirn-Schrankengängigkeit - Quantifizierung ............................................................ 143 7.2.5.1 Reagenzien und Materialien .............................................................................................. 143 7.2.5.2 Durchführung .................................................................................................................... 143 7.2.5.3 Auswertung........................................................................................................................ 144 8 Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 145 9 Anhang ............................................................................................................................. 160 9.1 Biologische Aktivitäten ..................................................................................................... 161 9.2 ROS Daten ......................................................................................................................... 164 9.3 pKS-, logP-Werte und Reinheit ......................................................................................... 165 9.4 Abkürzungen ..................................................................................................................... 166 9.5 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ............................................................................... 167 9.6 Übersicht über die Produkte .............................................................................................. 171

1

1 EINLEITUNG

EINLEITUNG

2

1.1 Morbus Alzheimer

1.1.1 Geschichtliches zu Morbus Alzheimer

Morbus Alzheimer ist die am häufigsten auftretende Form einer neurodegenerativen

Demenzerkrankung. Die erste Beschreibung der Alzheimer-Krankheit wurde 1906 von dem

deutschen Psychiater und Neuropathologen Alois Alzheimer auf der Versammlung Südwestdeutscher

Irrenärzte in Tübingen als „eigenartige Erkrankung der Hirnrinde“ vorgetragen. 1907 veröffentlichte

er seine Ergebnisse erstmals in der „Allgemeinen Zeitschrift für Psychiatrie“. An der Patientin

Auguste Deter diagnostizierte er eine auffallende Gedächtnisschwäche, die mit Desorientierung und

Halluzinationen verknüpft war. Da die Frau erst 50 Jahre alt war, bezeichnete Alzheimer diese Form

als präsenile Demenz. Er untersuchte post mortem das Gehirn der Patientin und entdeckte eine dünne

Hirnrinde, Ablagerungen eigentümlicher Stoffwechselprodukte in Form von Plaques, neurofibrilläre

und arteriosklerotische Veränderungen.1 Die Krankheit wurde 1910 von Emil Kraeplin offiziell nach

Alzheimer benannt.2,3

Heutzutage ist die Alzheimer-Krankheit in den Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Neurologie

nach ICD 10 Code F00-03 folgendermaßen definiert: „Die Alzheimer-Erkrankung ist ein Syndrom als

Folge einer meist chronischen oder fortschreitenden Krankheit des Gehirns mit Störung vieler höherer

kortikaler Funktionen, einschließlich Gedächtnis, Denken, Orientierung, Auffassung, Rechnen,

Lernfähigkeit, Sprache und Urteilsvermögen. Das Bewusstsein ist nicht getrübt….“.4

1.1.2 Prävalenz

Im Jahr 2011 waren allein in den USA 5.4 Millionen Menschen an der Alzheimer-Krankheit erkrankt.5

Die Prävalenz bei Menschen, die älter als 65 Jahre sind lag bei 13 %, bei über 85-Jährigen sogar bei

43 %. Die Zahlen für Deutschland sind sehr ähnlich (siehe Abb. 1), d. h. mit zunehmendem Alter

steigt die Wahrscheinlichkeit an Alzheimer zu erkranken rapide an.6

Abb. 1: Erkrankungshäufigkeit der Alzheimer-Krankheit 2010 in Deutschland.6

(www.deutsche-alzheimer.de/fileadmin/alz/pdf/factsheets/FactSheet01_10.pdf)

0

10

20

30

40

6570

7580

85

1.5 3 612

24

2.5 5 9

18

36Erkrankungs-

häufigkeit[%]

Alter [Jahre]

Alzheimer-Krankheit

Demenz

EINLEITUNG

3

Es gibt Prognosen, die aussagen, dass sich bis zum Jahr 2050 die Zahl an Neuerkrankungen aufgrund

des demographischen Wandels verdoppeln wird.7 Die Folge daraus sind unabsehbare ökonomische

Aufwendungen für die Pflege- und Gesundheitsversorgung der Patienten. Betroffen sind in absoluten

Zahlen mehr Frauen, was aber nur an deren höherer Lebenserwartung liegt. In relativen Zahlen liegt

eine gleich große Wahrscheinlichkeit für Männer und Frauen an der Alzheimer-Krankheit zu

erkranken vor.5

1.2 Mechanismen und Angriffspunkte der Alzheimer-Krankheit

1.2.1 Pathogenese

Die eigentliche Ursache für die Alzheimer-Krankheit ist bis heute unklar. Es sind jedoch zwei

charakteristische Merkmale bei jedem Erkrankten deutlich erkennbar: Im Gehirn bilden sich in den

Nervenzellen neurofibrilläre Bündel und außerhalb der Neuronen Amyloid-Ablagerungen, sog.

amyloide Plaques (siehe Abb. 2), die hauptsächlich im Hippocampus und im Cortex zu finden sind.

Mit dem Fortschreiten der Erkrankung verteilen diese sich im gesamten Gehirn. Plaques und

Neurofibrillen lassen sich sowohl bei normalen Alterungsprozessen als auch bei anderen

neurodegenerativen Erkrankungen finden, allerdings nicht so ausgeprägt wie bei der Alzheimer-

Krankheit.8,9 Im weiteren Verlauf der Krankheit kommt es sodann zum Absterben von Neuronen, was

schlussendlich zum Tod führt.

Neuron

amyloide

Plaques

Neurofibrillen

Abb. 2: Alzheimer-Neuron mit intrazellulären Neurofibrillen und extrazellulären amyloiden Plaques.

Bei der Alzheimer-Erkrankung unterscheidet man zwei verschiedene Formen: Familiäre (FAD) und

sporadische Alzheimer-Krankheit. Die erbliche familiäre Form tritt in weniger als 5 % der Fälle v.a.

im frühen Lebensalter auf. Als Ursache werden hierfür verschiedene genetische Mutationen diskutiert

(siehe Kapitel 1.2.3.1). Die sporadische Form der Alzheimer-Krankheit tritt bei älteren Patienten auf

und ist meist in Folge des normalen Alterungsprozesses begleitet von diversen anderen Erkrankungen,

die die Diagnose erschweren.

EINLEITUNG

4

1.2.2 Therapie

1.2.2.1 Die cholinerge Hypothese

In den 1980er Jahren schien es bewiesen, dass ein Mangel an Acetylcholin die Ursache für die

Alzheimer-Krankheit ist.10 Diese Hypothese war der erste Erklärungsansatz für die Alzheimer-

Krankheit und führte zu den im Moment zugelassenen Arzneistoffen.11 Der Ansatz beruht auf einem

Verlust von cholinerger Aktivität in dem Gehirn von Alzheimer Patienten, welcher auf eine

verringerte Konzentration des Neurotransmitters Acetylcholin (ACh), eine verringerte cholinerge

Rezeptordichte und/oder den Verlust von cholinergen Neuronen zurückgehen kann.12

Wie in Abb. 3 dargestellt, wird Cholin mit Acetyl-Coenzym-A über die Cholin-Acetyltransferase

(ChAT) zu Acetylcholin umgesetzt, welches in Vesikeln gespeichert und aus diesen in den

synaptischen Spalt freigesetzt wird. Dort wird ACh entweder von postsynaptischen muskarinischen

oder nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren (mAChR/nAChR) gebunden oder mittels

Acetylcholinesterase (AChE) wieder in Cholin und Acetat gespalten. Cholin kann im Anschluss über

einen Natrium-Cholin-Symporter erneut in die Synapse aufgenommen werden.13

Abb. 3: Cholinerge Synapse.

Möglichkeiten zur Steigerung der ACh-Konzentration wäre die Verabreichung von Acetylcholin-

Vorläufern oder Agonisten für die cholinergen Rezeptoren, die die gleiche oder einen stärkeren Effekt

auslösen als ACh.14 Diese Möglichkeiten wurden aber aufgrund fehlender Effektivität oder zu starker

Nebenwirkungen wieder fallen gelassen.15,16 Es gibt aber in neuerer Zeit wieder das Ziel, M1-selektive

allostere Agonisten17 oder M2-selektive Antagonisten zu entwickeln.18

Eine andere Möglichkeit zur Steigerung der ACh-Konzentration ist die Inhibition des Abbaus von

ACh durch Hemmung der AChE im synaptischen Spalt.14 Die AChE hat eine sehr hohe katalytische

EINLEITUNG

5

Aktivität (Wechselzahl 25000 s-1), was notwendig ist, da sie die durch ACh ausgelöste neuronale

Transmission beendet. AChE wird in Säugetieren durch ein einzelnes Gen kodiert, wobei aber durch

alternatives Spleißen und post-translationaler Assoziation drei Formen entstehen, die ähnliche

katalytische Eigenschaften haben: T (tailed), R (read through) und H (hydrophobic). AChET ist die

Hauptform in Gehirn und Muskeln und wird als hydrophile Form beschrieben. Im ZNS ist sie an den

„Prolin-reichen Membrananker“ (PRiMA) gebunden, um eine symmetrische Form auszubilden und als

interzelluläres Enzym zu fungieren.19 Die AChE ist aus 537 Aminosäuren aufgebaut und gehört zu den

Hydrolasen.

Charakteristisch für die AChE ist eine tiefe Furche (20 Å tief), die in das Innere des Enzyms ragt und

das aktive Zentrum beherbergt. In diesem Spalt sitzen 14 aromatische Aminosäuren, die über Kation-

π-Wechselwirkungen dafür verantwortlich sind, das Substrat bzw. die Spaltprodukte an- und

abzutransportieren. Das aktive Zentrum selbst besteht aus der Substrat-Bindungsstelle (anionisches

Zentrum), einem Tryptophan, welches über π-Elektronen den kationischen Stickstoff des AChs

bindet, und einer katalytischen Triade (esteratisches Zentrum). Im esteratischen Zentrum findet nun

die Hydrolyse des Acetylcholins statt. Die AChE gehört zu den Serin Proteasen, d. h. ihre katalytische

Triade besteht aus Serin, Glutaminsäure und Histidin. Die hydrolytische Spaltung von Acetylcholin

läuft wie folgt ab (siehe Abb. 4): Das dem Serin benachbarte Histidin übernimmt dessen

Hydroxylproton, wenn der Sauerstoff nucleophil das Substrat (hier ACh) am Carbonylkohlenstoff des

Cholins angreift. Die Aufgabe der Glutaminsäure besteht darin, den positiv geladenen Stickstoff des

Histidins im Übergangszustand zu stabilisieren. Als nächstes erfolgt eine Umesterung, bei der Cholin

frei wird und der Acetylrest an das Serin gebunden wird. In einem weiteren Schritt erfolgt die

Hydrolyse des Acetylrests, der als Essigsäure vom Serin abgespalten wird und somit das aktive

Zentrum für eine weitere Umsetzung regeneriert.20,21 Da das aktive Zentrum der AChE in einer tiefen

Tasche liegt, wird aufgrund der hohen Wechselzahl angenommen, dass es zusätzlich mehrere „Türen“

gibt, zu denen Reaktanden ein- bzw. austreten können.22,23

Neben dem katalytisch aktiven Zentrum weist die AChE eine weitere Bindungsstelle auf: Die

periphere anionische Seite (peripheric anionic site = PAS), welche am Eingang der Furche liegt. Die

entscheidende Aminosäure ist auch hier ein Tryptophan, das mit ACh wechselwirken kann und es so

an das aktive Zentrum dirigiert.24 Die PAS bietet eine Möglichkeit für den Angriff potenzieller

allosterer Modulatoren.25

Neben der AChE findet man im Gehirn auch einen geringen Anteil an Butyrylcholinesterase

(BuChE), oft auch Pseudocholinesterase genannt. Die BuChE ist eine weitaus weniger spezifische

Cholinesterase, d. h. sie vermag auch andere Cholinester zu spalten und arbeitet viel langsamer als die

AChE. Butyrylcholin (BuCh) ist ein synthetisches Produkt, wird aber zur Unterscheidung von BuChE

und AChE eingesetzt. Die Verteilung von BuChE im Körper ist gegensätzlich zur AChE, d. h. sie

kommt hauptsächlich im Blut und in der Leber und nur in geringen Anteilen im Gehirn vor.26

EINLEITUNG

6

Abb. 4: Katalytische Triade der AChE mit ACh als Substrat.

AChE-Inhibitoren sind im Moment die einzigen Wirkstoffe, die gegen leichte bis mittelschwere

Alzheimer-Krankheit eingesetzt werden können, wobei sie aber die Alzheimer-Krankheit auch nur

symptomatisch und mit geringer Effizienz bekämpfen.14 Die entsprechenden Wirkstoffe sind im

Folgenden aufgeführt (siehe Abb. 5): Tacrin (Cognex®) war einer der ersten AChE-Inhibitoren

(1993), wurde aber aufgrund seiner Hepatotoxizität wieder vom Markt genommen. Donepezil

(Aricept®, 1996), ein Piperidinderivat, ist ein nicht-kompetitiver AChE-Inhibitor. Die positive

Wirkung von Donepezil auf die kognitiven Fähigkeiten ist zwar signifikant, aber gering. Es wirkt

selektiv auf die AChE und interagiert mit der katalytisch aktiven Bindetasche, sowie mit der

peripheren anionischen und der Cholin-bindenden anionischen Seite.27 Rivastigmin (Exelon®, 1998),

ein Carbamatderivat, ist ein kompetitiver Acetylcholinesterase-Inhibitor. Er hemmt sowohl die AChE

(katalytisch aktive Bindetasche) als auch die BuChE. Dies könnte erklären, warum Rivastigmin

sowohl einen positiven Einfluss auf die kognitiven und funktionellen Fähigkeiten sowie auf die

Verhaltensauffälligkeiten von Alzheimer-Patienten hat.28 Galantamin (Reminyl®, 1999), ein tertiäres

EINLEITUNG

7

Pflanzenalkaloid, ist gleichzeitig ein nicht-kompetetiver AChE-Inhibitor (interagiert mit der Cholin-

bindenden anionischen Seite und mit der katalytisch aktiven Bindetasche) und ein allosterer Modulator

nikotinischer Rezeptoren, wobei die klinische Relevanz hierfür noch ungeklärt ist.29

Abb. 5: Strukturen von AChE-Inhibitoren gegen die Alzheimer-Krankheit.

1.2.2.2 Beeinflussung der Exzitotoxizität

Die Neurodegeneration bei der Alzheimer-Krankheit geht mit einer glutamatergen Dysfunktion einher,

was zu einer starken Aktivierung des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptors (NMDA-Rezeptor), einem

ionotropen Glutamat-Rezeptor, führt. Dadurch kommt es zu einer pathologischen intrazellulären

Akkumulation von Ca2+-Ionen. Zurzeit wird der nicht-kompetitive NMDA-Rezeptor Antagonist

Memantin (Axura®, Ebixa®) (siehe Abb. 6) bei mittelschwerer bis schwerer Alzheimer-Krankheit

eingesetzt.21,30 Jedoch kann die neuroprotektive Wirkung dieses Arzneistoffs die Neurodegeneration

nur verlangsamen – der Krankheitsverlauf wird nicht verändert.

Abb. 6: Struktur von Memantin.

EINLEITUNG

8

1.2.3 Neue Angriffsmöglichkeiten

Aufgrund der bislang unzureichenden Möglichkeiten in den Krankheitsverlauf einzugreifen, ist es

unabdingbar neue Angriffspunkte der Alzheimer-Krankheit zu identifizieren und dafür Wirkstoffe zu

entwickeln. Im Folgenden werden die unterschiedlichen Hypothesen kurz erläutert:

1.2.3.1 Die genetische Hypothese.

Die genetische Hypothese beruht auf der Tatsache, dass bei Patienten, die in jungen Jahren an

Alzheimer erkranken mit relativ hoher Wahrscheinlichkeit eine Mutation in drei Genen auftritt, die für

das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP), Präsenilin 1 (PS1/PSEN1) und Präsenilin 2 (PS2/PSEN2)

kodieren.31 Diese Form der Alzheimer-Krankheit bezeichnet man als autosomal dominante Alzheimer-

Krankheit.

Tritt die Alzheimer-Krankheit bei Älteren (> 60 Jahre) auf, wurde das 4-Allel des Apolipoprotein-E

(APOE4) kodierenden Gens als Hauptrisikofaktor identifiziert. Allerdings konnte bis heute der genaue

Mechanismus der Beteiligung dieses Proteins an der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit nicht

aufgeklärt werden. Bekannt ist, dass nur 15 % der Bevölkerung mindestens ein 4-Allel tragen,

wohingegen dieser Wert bei Alzheimer-Patienten bei 40 % liegt.32 Der Schwerpunkt der Forschung

liegt im Moment einerseits auf der Abschwächung der toxischen Effekte von APOE4 durch

Umwandlung in eine APOE3-ähnliche Struktur33 und auf der Steigerung der APOE3-Expression.34

1.2.3.2 Die metabolische Hypothese

Epidemiologische Studien zeigen, dass Patienten mit einem metabolisches Syndrom ein erhöhtes

Risiko besitzen an Morbus Alzheimer zu erkranken.35

Rückgreifend auf die genetische Hypothese, lässt sich ein Zusammenhang zwischen einem erhöhten

Cholesterol-Level im Gehirn von Alzheimer-Patienten und dem APOE4 herstellen, da dieses der

wichtigste Cholesterol-Carrier ist. Allerdings spielen hierbei auch äußere Einflüsse, wie

Bluthochdruck, Adipositas oder Hirnschlag eine große Rolle, so dass es schwierig ist, dies als

alleiniges Merkmal zu identifizieren. Des Weiteren ist es schwierig, über Statine, welche bekannte

Cholesterolsenker sind, die Cholesterol-Konzentration im Gehirn zu regulieren, da hierbei nur eine

sehr geringe therapeutische Breite neuroprotektiv wirkt. Dennoch sind viele Statine in der Pipeline als

potenzielle Anti-Alzheimer-Wirkstoffe.36

Kontrovers diskutiert ist ein Zusammenhang einer veränderten zerebralen Glukose-Metabolismus-

Rate, einer Insulin-Resistenz und veränderter Konzentration an APOE4.37,38,39 Eine Studie mit dem

Insulin-Sensitizer Rosiglitazon wurde allerdings frühzeitig eingestellt, da sich kein Therapieerfolg

zeigte.40

Auch im Bereich der Anti-Histaminika zeigt sich ein Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit.

Erfolgversprechend war hier lange Zeit Dimebon41, was aber in Klinische-Phase-III-Studien aufgrund

von nicht zufriedenstellender Wirkung versagte.42

EINLEITUNG

9

1.2.3.3 Die anti-inflammatorische Hypothese

Die anti-inflammatorische Hypothese beruht auf epidemiologischen Studien, die eine verringerte

Prävalenz der Alzheimer-Krankheit bei langjähriger Einnahme von nichtsteroidalen Antiphlogistika

(NSAIDs) belegen. Die protektiven Effekte scheinen direkt mit der Dauer der Einnahme

zusammenzuhängen.43 In einem Überblick über retrospektive und prospektive Studien konnte gezeigt

werden, dass eine regelmäßige Einnahme von NSAIDs über einen Zeitraum von mehr als zwei Jahren

das Risiko an der Alzheimer-Krankheit zu erkranken signifikant senkt.44 Des Weiteren wurde in

Studien gezeigt, dass dieser protektive Effekt auf bestimmte NSAIDs (Ibuprofen, Flurbiprofen,

Indomethacin und Diclofenac – nicht jedoch Acetylsalicylsäure) begrenzt ist und zudem nur bei

Personen mit APOEε4–Allel auftritt.45

Weiterhin ist bekannt, dass die eigentlich zu bevorzugenden COX-2-Inhibitoren (Cyclooxygenase-

Inhibitoren) wie Celecoxib oder Rofecoxib keinen positiven Effekt auf die Alzheimer-Krankheit

ausüben. Allerdings zeigt auch Naproxen, ein COX-1-selektiver Inhibitor, nicht den gewünschten

Effekt.46 Auf der anderen Seite gibt es eine steigende Zahl an Studien, die vermuten lassen, dass sich

einige Aspekte der Immunantwort positiv auf die Alzheimer-Krankheit auswirken.47 So könnte ein

Prostaglandin-E2-Rezeptor-Antagonist die mikrogliale Phagozytose von Amyloid- fördern und

gleichzeitig einen potenziellen oxidativen Schaden herabsetzen.48

1.2.3.4 Der Einfluss von oxidativem Stress

Oxidativer Stress kann schon in einem sehr frühen Stadium der AD festgestellt werden. In der Regel

kann man reaktive Sauerstoffspezies (ROS) schon nachweisen, bevor amyloide Plaques oder

Neurofibrillen gebildet waren. 49 ROS schädigen die Zellen in vitro und in vivo und beschleunigen den

Zelltod. Es wird vermutet, dass die ROS nur zur Krankheit beitragen und nicht diese verursachen,

dennoch ist es von Vorteil, das Alzheimer-geschädigte Gehirn vor zusätzlichen negativen Einflüssen

zu bewahren.50,51 Deshalb können auch Antioxidantien einen Beitrag zur Behandlung von AD leisten.

1.2.3.5 Die -Protein-Hypothese

Die filamentöse, hyperphosphorylierte Form des -Proteins ist der Hauptbestandteil der Neurofibrillen,

welche sich in Neuronen und in neuronalen Projektionen befinden und eines der zwei

Hauptcharakeristika der Alzheimer-Krankheit darstellt (siehe Kapitel 1.2.1).52 Das -Protein bindet

und stabilisiert Mikrotubuli, während hyperphosphoryliertes -Protein die Struktur der Mikrotubuli

zerstört.53,54 Die Präsenz und die Korrelation mit dem kognitiven Status festigt die wichtige Rolle des

abnormalen -Proteins in Demenz-Erkrankungen.55

Das -Protein gehört zu den Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAP). Mikrotubuli bilden mit den

Mikrofilamenten und Intermediärfilamenten das Zytoskelett eukaryoter Zellen und sind somit für die

Form und Bewegung einer Zelle verantwortlich. Zusätzlich steuern sie die Bewegung von

intrazellulären Strukturen, was u. a. für den schnellen axonale Transport in Neuronen von Bedeutung

EINLEITUNG

10

ist.56 Das -Protein ist für die Langzeitstabilisierung der Mikrotubuli verantwortlich. Mikrotubuli

bestehen aus - und β-Tubulinen, die Dimere und längere Protofibrillen ausbilden und wachsen

hauptsächlich an ihrem positiven Ende, indem zwei Tubulindimere gebunden werden. Es liegt hierbei

ein Gleichgewicht zwischen der GTP-Hydrolyse und der Polymerisierung vor, da GDP-assoziierte

Enden schnell depolymerisieren. Diese dynamische Instabilität wird kurzzeitig über die Ca2+-

Konzentration geregelt, langfristig über die Phosphorylierung der MAP, wobei die Bindung der

Proteine an die Mikrotubuli das Gleichgewicht in Richtung Polymerisation verschiebt.57 Eine weitere

Funktion des -Proteins ist die Vernetzung der Mikrotubuli mit anderen zellulären Strukturen.58 Das -

Protein scheint allerdings nicht von essenzieller Bedeutung zu sein, da eine Inaktivierung des Gens,

welches auf dem langen Arm von Chromosom 17 sitzt,59 durch homologe Rekombination nur zu einer

reduzierten Anzahl von Mikrotubuli in einigen Axonen führt.60

Das filamentöse, hyperphosphorylierte -Protein bildet nun den Hauptbestandteil der neurofibrillären

Bündel. Es lassen sich drei verschiedene Filamente unterscheiden:59 Paarweise Bündel, die

spiralförmig angeordnet sind (paired helical filaments = PHF),61 gerade Filamente62 und „twisted

ribbon-like“-Filamente. Bei der Alzheimer-Krankheit sind diese Ablagerungen nur in den Neuronen

zu finden und bestehen zu 95 % aus den paarweisen und zu 5 % aus den geraden Filamenten,63 die alle

sechs Isoformen des -Proteins enthalten. Bei der kortikobasalen Degeneration dagegen kommen sie

in Neuronen und Gliazellen vor und bestehen aus „twisted ribbon-like“-Filamenten, die nur die

Isoformen mit „repeat regions“ enthalten.

Das -Protein, das die paarweise spiralförmigen Ablagerungen bildet, ist im Gegensatz zu normalem

-Protein in adultem Gehirn hyperphosphoryliert.64 Die veränderte Phosphorylierung ist ein sehr

frühes Ereignis in der Bildung der Neurofibrillen65 und verhindert, dass das -Protein an die

Mikrotubuli binden kann, lagert sich selbst an normal-phosphoryliertes Protein an und beginnt mit der

Bildung von PHF (siehe Abb. 7).66-68 Es wird vermutet, dass diese veränderte Phosphorylierung durch

ein Ungleichgewicht zwischen Proteinkinasen und Proteinphosphatasen hervorgerufen wird. Für das

-Protein sind das zwei Funktionen mit Phosphorylierungsseiten: Serin- und Threonin-Reste.69 Es sind

mehr als zehn Serin/Threonin-Proteinkinasen bekannt (Prolin und nicht-Prolin gerichtete Kinasen64),

die in vitro das -Protein phosphorylieren, wobei allerdings die Glykogen-Synthasekinase (GSK) 3β

am Wahrscheinlichsten in die Hyperphosphorylierung mit eingebunden ist.70 Bei den bekannten

Protein-Phosphatasen (PP) sind es vier Phosphatasen, wobei die PP2A wohl die entscheidende Rolle

bei der Dephosphorylierung von hyperphosphoryliertem -Protein spielt,71 obwohl ihre Aktivität in

einem Gehirn mit Alzheimer-Krankheit deutlich verringert ist.72,73 Die verringerte Aktivität ist

zurückzuführen auf eine erhöhte Expression der PP2A-Inhibitoren-I1PP2A und -I2

PP2A.68

EINLEITUNG

11

Abb. 7: Hyperphosphoryliertes -Protein bildet Neurofibrillen.

1.2.3.6 Die Amyloid-Hypothese

1.2.3.6.1 Bildung des Amyloid-β-Peptids

Der Hauptbestandteil amyloider Plaques ist das Amyloid-β-Peptid (Aβ), das aus dem Amyloid-

Vorläufer-Protein (APP) gebildet wird. APP kann auf zwei verschiedene Arten gespalten werden

(siehe Abb. 8), nämlich einerseits in einem pathogenen, andererseits in einem nicht-pathogenen Weg:

Abb. 8: Entstehung der amyloiden Plaques aus dem Amyloid-Vorläufer-Protein (APP).

Einerseits kann es durch die -Sekretase innerhalb der Aβ-Domäne gespalten werden, womit

gleichzeitig die extrazelluläre Ablagerung unterbunden wird. Auf der anderen Seite kann es durch die

β-Sekretase zu einem membran-gebundenen Fragment gespalten werden, welches 99 Aminosäuren

lang ist. Dieses wird durch die γ-Sekretase innerhalb der transmembranen Domäne gespalten und setzt

Aβ frei.30

Das APP ist ein integrales Membranprotein, das in vielen Geweben exprimiert wird – hohe

Konzentrationen liegen jedoch nur in den Synapsen der Neuronen vor. APP spielt eine wichtige Rolle

bei der synaptischen Transmission und neuronalen Plastizität in Zusammenhang mit dem Erlernen von

bestimmten Verhaltensweisen sowie der Erinnerungsfähigkeit.74 Das APP-kodierende Gen ist auf dem

EINLEITUNG

12

Chromosom 21 lokalisiert. Die ersten Genmutationen, die ursächlich für die vererbbare Form der

Alzheimer-Krankheit sind, wurden ebenfalls im APP-kodierenden Gen gefunden.75,76 Die prä-mRNA

wird alternativ gespleißt, sodass drei Hauptformen des Proteins entstehen: APP770, APP751 und APP695.

Der Fokus in der Alzheimer-Forschung liegt auf APP695, da man diese Isoform hauptsächlich im

Gehirn findet.77 Neben dem APP sind im menschlichen Körper zwei sehr ähnliche Proteine zu finden,

die auch Amyloid-Vorläufer-ähnliche Proteine genannt werden (APLP1 u. APLP2).

Interessanterweise bilden die Fragmente dieser Proteine keine amyloiden Plaques aus.78 Die -

Sekretase wie auch die β-Sekretase spaltet nun eine große extrazelluläre Domäne ab, wobei der

Unterschied zwischen den beiden Spaltprodukten nur 17 Aminosäuren beträgt. Der Rest des APP ist

weiterhin an die Membran gebunden und wird als C-terminales Fragment bezeichnet. Im Folgenden

wird nun durch die γ-Sekretase ein weiteres Fragment abgespalten. Die Länge hierbei variiert und für

den pathogenen Weg über die β-Sekretase werden hier die Aβ-Peptide in ihren unterschiedlichen

Längen freigesetzt (Aβ39-42).74

Der Angriff der -Sekretase erfolgt sehr nahe an der membran-überspannenden Domäne zwischen

Lys613 und Leu614 innerhalb der kritischen Aβ-Region, weshalb auf diesem Weg eine Aβ-Peptid-

Bildung ausgeschlossen ist. Das entstehende lösliche Protein besteht aus 612 Aminosäuren und heißt

sAPP. Die Aktivität der -Sekretase kann durch Substanzen, die die Proteinkinase C aktivieren, wie

z. B. metabotrope Glutamat-Rezeptor-Agonisten, gesteigert werden.79 Die Forschung geht hier im

Moment in Richtung der Aktivierung der rezeptor-induzierten Spaltung von APP durch -Sekretase.

Vielversprechende Ziele sind hierbei der PACAP-Rezeptor (Pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide) PAC1 und vielleicht der Serotonin-Rezeptor-Subtyp 5-HT6. Eine weitere Möglichkeit

sind die früher in der metabolischen Hypothese schon vermuteten Statine, welche auch die Aktivität

der -Sekretase steigern. Eine weitere Möglichkeit wäre die Konzentration von Enzymen zu steigern,

welche die gleiche Funktion wie die -Sekretase erfüllen. Ein Beispiel hierfür ist ADAM10

(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10), was allerdings nicht so selektiv

arbeitet.80

Die β-Sekretasen dagegen greifen zwischen den Aminosäureresten 596 und 597 an. Dies

kennzeichnet den N-Terminus des Aβ-Peptids und setzt das sogenannte sAPPβ frei. Die

Aspartylproteasen BACE1 und BACE2 wurden als die zugehörigen Enzyme identifiziert und ihre

Konzentration und Aktivität sind bei der Alzheimer-Krankheit erhöht.81 Es lässt sich zudem

feststellen, dass eine Überexpression der BACE1 auch zu erhöhter Konzentration von Aβ führt.82

Deshalb wird in neueren Arbeiten bereits relativ erfolgreich versucht β-Sekretase-Inhibitoren

herzustellen.83

Der letzte Schritt ist jeweils die Spaltung über γ-Sekretasen. Der Begriff γ-Sekretasen ist etwas

irreführend, da es sich nicht in dem Sinne um Proteasen handelt, sondern um einen Zusammenspiel

vieler einzelner Proteine. Hauptbestandteil ist der Präsenilin-Komplex, der sich aus vier Kernproteinen

zusammensetzt: PS1/PS2, APH1 („anterior pharynx defective 1“), Nicastrin und PEN2 („presinilin

EINLEITUNG

13

enhancer 2“). Zusätzlich modulieren noch mehrere endogene Proteine diesen Komplex. Darunter

zählen z. B. transmembranes Handelsprotein 21-KD (TMP21), CD147 Antigen, γ-Sekretase-

Aktivierungsprotein (gSAP) und GPCR3.84 In diesen Schritt einzugreifen ist schwierig, da Präsenilin-1

auch eine große Rolle im Notch-Signalweg spielt und Inhibitoren hier sehr negative Auswirkungen

zeigen würden, da die Zellen nicht mehr richtig auf äußere Signal reagieren könnten.85

1.2.3.6.2 Amyloide Fibrillen

Eine offensichtliche Möglichkeit in die Bildung der Aβ-Fibrillen einzugreifen ist natürlich die

Inhibierung der Plaque-Bildung bzw. das Auflösen bereits vorhandener Ablagerungen. Die

biophysische Definition von Amyloid beinhaltet extrazelluläre Filamente jeglicher Polypeptide mit

einem Durchmesser von ungefähr 10 nm und einer β-Faltblattstruktur.86 Die amyloiden Plaques in der

Alzheimer-Krankheit bestehen aus einem 39-42 Aminosäuren langem Peptid, wobei den größten

Anteil das Fragment 1-42 ausmacht. Dieses Peptid bildet zwei β-Faltblattstrukturen aus, die aus den

Resten von ca. 18-26 und ca. 31-42 bestehen.87 Entscheidend für die Bildung von Fibrillen bzw. die

Möglichkeit der Anlagerung sind die Aminosäuren 16-20.88 Die β-Faltblattstruktur der

Amyloidfibrillen verläuft senkrecht zur Fibrillenachse und die einzelnen β-Faltblattstrukturen lagern

sich parallel in Reihe an.89 Zwischen den beiden β-Faltblattstrukturen stehen die Aminosäuren Phe19

(Peptid 1) und Gly38 (Peptid 2) sowie Ala21 (Peptid 1) und Val36 (Peptid 2) in Kontakt miteinander

und es besteht eine Salzbrücke zwischen den Resten Asp23 (Peptid 1) und Lys28 (Peptid 2) (siehe

Abb. 9).

Abb. 9: Schematische Darstellung der Aβ-Fibrillen.87 Links ist die Seitenansicht abgebildet, rechts die

Frontansicht. Mit freundlicher Genehmigung der PNAS (Copyright (2005) National Academy of

Sciences, U.S.A.).

Zu Beginn einer Anlagerung eines Aβ-Monomers an die Fibrillen finden allerdings nur hydrophobe

Wechselwirkungen statt. Die Aminosäuren 17-21 weisen eine hydrophobe Ausdehnung auf, die durch

ein neues Monomer kompensiert werden kann. In einem zweiten Schritt bilden sich dann die

EINLEITUNG

14

H-Brücken aus. Stabilisiert wird das zuletzt hinzugekommene Monomer über ein neues Monomer,

d. h. der Prozess ist selbsterhaltend.87

Die Bildung dieser Fibrillen läuft jedoch nicht linear ab. Es werden zunächst verschiedene

Aggregationsintermediate bzw. Oligomere gebildet, die entweder einem pathogenen Verlauf folgen

oder nicht (siehe Abb. 10).90 Über eine entartete Aβ-Struktur entstehen zuerst β-Faltblatt-Intermediate,

von denen eine Ausbildung in der Lage ist Oligomere zu formen, die sich dann weiter über

Protofibrillen zu Fibrillen zusammenlagern. Die Strukturen sind bis hin zu den Protofibrillen noch

löslich und erst die Fibrillen an sich bilden Ablagerungen.91

Abb. 10: Schematische Darstellung der Entstehung der Fibrillen über verschiedene Intermediate,

modifiziert nach91 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier Limited.

Es ist nicht sicher geklärt, ab welchem Zeitpunkt die Strukturen toxisch sind. Es wird vermutet, dass

evtl. schon ab der Entartung der Konformation neurotoxische Effekte auftreten.92 Neuere

Untersuchungen zeigen sogar, dass das kugelförmige β-Faltblatt-Intermediat neurotoxisch ist und

beim Übergang in die Fibrillenform die Toxizität abnimmt.93 Betrachtet man im nächsten Schritt die

Oligomerbildung, so bildet Aβ(1-40) vorwiegend kleinere Aggregate (Monomere bis Tetramere) als

Aβ1-42 (Pentamere/Hexamere). Diese Tatsache erklärt, dass es für Aβ(1-42) einfacher ist sich zu

Protofibrillen zusammen zu lagern.94 Die Ursache hierfür sind die zwei zusätzlichen hydrophoben

Reste (Ile41 und Ala42) am C-Terminus, die die Anlagerung aufgrund hydrophober Wechselwirkung

erleichtern. Während bis zur Bildung der Oligomere die strukturelle Veränderungen mit starken

Konformationsänderungen einhergehen, so ist die weitere Entwicklung eher weniger davon betroffen

und es wird nur die Packungsdichte durch zusätzliche H-Brücken erhöht.93

Die Fibrillenbildung wird von vielen weiteren Faktoren beeinflusst. Durch den hydrophoben

Anlagerungsbereich spielt für die Ausbildung verschiedener Formen die Umgebung eine große Rolle.

Einen Einfluss darauf hat die Phospholipiddoppelschicht, an die ein Aβ-Monomer binden kann und

welche eine Konformationsänderung auslöst. Was passiert ist abhängig vom pH-Wert, der

Salzkonzentration, dem Phospholipid usw. Das Phosphatidylinositol ist wohl das Phospholipid, das

den stärksten induzierenden Effekt in Richtung β-Faltblatt aufweist. Die Bindung an die Membran

EINLEITUNG

15

führt auch dazu, dass bei weiterem Wachstum die Membran destabilisiert wird und die Fibrillen somit

zelltoxisch sind.95

Ebenso eine Auswirkung auf die Struktur von Aβ haben Ganglioside. Ganglioside sind in der

Zellplasmamembran vorhanden und modulieren die Zellsignaltransduktion. Es wurde gezeigt, dass bei

der Alzheimer-Krankheit eine erhöhte Konzentration des Gangliosids GM1 vorliegt96 und somit eine

Veränderung der normalen Konformation induziert wird.97

Es gibt verschiedene Strategien, um in die Amyloid-Bildung einzugreifen und potenzielle

Therapeutika zu entwickeln:

Zum einen kann man β-Faltblatt-bindende Substanzen zum Einsatz bringen, welche aufgrund

ihrer sterischen Ausdehnung eine weitere Zusammenlagerung unterbinden. Man erzielte hier

bereits positive Ergebnisse in vitro mit Amyloid-bindenden Farbstoffen wie Kongorot,

Chrysamine G oder Thioflavin S, welche aber alle nicht als Wirkstoffe zur Verfügung stehen, da

sie die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können.98

Es ist auch möglich, Sequenz-spezifische Substanzen als β-Faltblatt-Brecher-Peptide

einzusetzen: Kleine Peptidstrukturen, die eine ähnliche Struktur wie die hydrophoben Reste in Aβ

aufweisen, können daran binden und eine weitere Anlagerung verhindern. Das Problem hierbei ist,

dass die Peptide selbst Aggregate bilden und so einen Einsatz als Wirkstoff ausschließen.88

Polyphenole stabilisieren gewisse Intermediate und können so eine Fibrillenbildung verhindern.

Dazu gehören (-)-Epigallocatechin-3-gallat, Curcumin und polyphenolisches Traubenkernextrakt.

Zudem weisen sie anti-oxidative und anti-inflammatorische Eigenschaften auf, die sich positiv auf

die Alzheimer-Krankheit auswirken.99

Schließlich bietet sich noch die Möglichkeit einer Immunotherapie. Obwohl im Gehirn nur 0,1 %

der Plasmakonzentration von Immunglobulin G vorhanden ist, ist es möglich über eine Antikörper-

Antigen-Bindung eine Phagozytose auszulösen100 oder allein durch die Antikörperbindung an

fibrilläres Aβ dieses in Monomere umzuwandeln.101 Es bestehen die Möglichkeiten einer aktiven

Immunisierung (Impfung) über Peptide, die B- und T-Zellen Epitope enthalten oder auch einer

passiven Immunisierung über monoklonale Antikörper.102

1.2.3.7 Zusammenspiel von Aβ und -Protein

Einige Jahre lang waren die Meinungen zu der Ursache von Alzheimer in drei Gruppen gespalten. Es

gab als Hauptursachen den Mangel an ACh, die Aβ-Plaques und die Neurofibrillen. Durch die auf den

Markt gekommenen AChEIs wurde die cholinerge Hypothese zu Anfang sehr unterstützt. Es zeigt sich

jedoch immer mehr, dass es nicht ausreicht an einem Punkt anzugreifen und dass die Alzheimer-

Krankheit keine Krankheit ist, die durch das eine oder das andere verursacht wird, sondern dass es ein

Zusammenspiel aus allen drei Ansätzen ist. Es ist noch ungeklärt wie der ACh-Mangel integriert ist,

EINLEITUNG

16

jedoch hat man den Zusammenhang zwischen Aß-Fibrillen und hyperphosphoryliertem -Protein

mittlerweile hergestellt:

In Alzheimerpatienten kann eine geringere Konzentration an Leptin nachgewiesen werden als in

gesunden Menschen,103 das bedeutet, es muss in den Mechanismus mit eingebunden sein. Leptin wird

endogen im Gehirn produziert104 und moduliert die Aβ-Produktion sowie die Protein

Hyperphosphorylierung.105 In Abb. 11 ist dargestellt, was eine erhöhte Konzentration an Aβ für

Auswirkungen hat: Aβ hemmt den „mammalian target of Rapamycin“-Komplex 1 (mTORC1),

wodurch die Proteinkinase B (AkT) inaktiviert wird.106 Dadurch wird die Glycogen-Synthase-

Kinase-3β (GSK3 β) aktiviert, indem sie an Tyr216 phosphoryliert werden kann107 und

hyperphosphoryliert anschließend das -Protein.108 Der gehemmte mTORC1 reguliert wiederum die

Biosynthese von Leptin auf der Ebene der Translation.109 Sinkt die Konzentration von Leptin, so

hemmt dies nicht mehr die β-Sekretase und es wird noch mehr Aβ produziert.110 Gleichzeitig hemmt

Aβ nicht nur mTORC1, sondern steigert die Konzentration des „Suppressor of cytokine signaling-3“

(SOCS3),111 eine Phosphatase, die in die Beendigung des Signal-Transduktionsweges einbezogen ist.

Dadurch wiederum kann der Leptinrezeptor nicht mehr dephosphoryliert werden und wird dadurch

gehemmt. Die Inhibition des Leptin-Rezeptors durch eine erhöhte Konzentration an SOCS3 ist als

Leptin-Resistenz bekannt.112

Abb. 11: Schematisches Zusammenspiel von Aβ und Leptin und deren

Einfluss auf die Hyperphosphorylierung des -Proteins.

EINLEITUNG

17

1.3 Aktuelle Arzneistoffe in der „Pipeline“

1.3.1 Wirkstoffe in Klinischen Phasen

Aufgrund der fehlenden Therapeutika und der stetig steigenden Zahl an Erkrankungen steht die

Alzheimer-Krankheit bei vielen Wirkstoffentwicklern im Mittelpunkt. Es gibt eine Fülle von neuen

Wirkstoffen, die auf verschiedene Angriffspunkte der Alzheimer-Krankheit ausgerichtet sind.

Interessant ist hierbei, dass vor allem der Effekt von vielen atypischen Neuroleptika auf die

Alzheimer-Krankheit getestet wird, ohne dabei das genaue Ziel des Wirkstoffes zu kennen. Die

folgende Übersicht (Abb. 11) zeigt eine Auswahl von derzeitigen potenziellen Therapeutika, denen

eindeutig ein bestimmter Mechanismus zugeordnet werden kann.113

Cholinerge Hypothese: Immunotherapie:

AChE/BuChE-Inhibitoren aktive Immunotherapie

Muskarin-Rezeptor-Modulatoren passive Immunotherapie

Nikotin-Rezeptor-Modulatoren Andere:

Amyloid-Hypothese: Cholesterinsenker

β-Sekretase-Inhibitoren Serotoninrezeptormodulatoren

γ-Sekretase-Inhibitoren ROS-Inhibitoren

anti-Aβ-Aggregation Hormone

-Sekretase-Aktivatoren Neuroprotektiva

-Hypothese: Andere

-Protein-Fibrillen-Inhibitoren

Kinase-Inhibitoren

Abb. 12: Neue Therapeutika für die Alzheimer-Krankheit in klinischen Studien II-IV.

EINLEITUNG

18

1.3.2 Universitäre Grundlagenforschung

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Verständnis von der Pathogenese von Krankheiten

entscheidend verbessert. Der Fokus zur Entwicklung von neuen Wirkstoffen hat sich von einer zufällig

wirksamen Struktur zur gezielten Adressierung einzelner Angriffspunkte von Krankheiten verschoben.

Einerseits wurde dadurch die Entwicklung zielorientierter und konkreter, vielleicht auch etwas

weniger komplex und einfacher, allerdings wurde das „Große Ganze“ mitunter außer Acht gelassen.

Zum einen muss man beachten, dass der potenzielle Wirkstoff in vivo eventuell sein Ziel gar nicht

erreicht, d. h. dass das „target“ in vivo in einer anderen, für den Liganden ungünstigen, Umgebung

vorliegt. Zum anderen, beeinflusst der Wirkstoff zwar einen speziellen Angriffspunkt, das heißt aber

noch nicht, dass er die Krankheit an sich effektiv verändert, da womöglich noch andere Einflüsse eine

große Rolle spielen.114 Betrachtet man die komplexen Hintergründe der Alzheimer-Krankheit, so

muss man davon ausgehen, dass es schwierig wird, einen selektiven Wirkstoff der auf ein einziges,

krankheitsspezifisches Angriffsziel gemünzt ist, zu entwickeln, welcher die Alzheimer-Krankheit

heilt. Die bislang dominierende Hypothese einer Wirkstofffindung, „ein Protein, ein Wirkstoff, eine

Krankheit“, muss also als veraltet anerkannt werden und neue Alternativen gefunden werden.115

Ansatzpunkte hierfür wären die Behandlung mit mehreren Medikamenten, die jeweils einen

Angriffspunkt adressieren, allerdings ist die Compliance hierbei schwierig. Eine andere Möglichkeit

ist der Einsatz von mehreren Wirkstoffen in einem Medikament, was allerdings aufgrund der

unterschiedlichen Bioverfügbarkeit, Pharmakokinetik, ADMET-Eigenschaften usw. der einzelnen

Wirkstoffe sehr schwierig ist. Eine vielversprechendere Möglichkeit ist die Entwicklung von

Wirkstoffen, die nun nicht mehr auf ein „target“ abzielen, sondern gleich mehrere positiv beeinflussen

können. Dieser „multi-target“-Ansatz ist die Herausforderung für die Wirkstoffforschung in neuester

Zeit. Die Schwierigkeiten dieser Methode bestehen in der Kombination der richtigen Wirksamkeit an

den einzelnen „targets“ sowie auch hier in der Selektivität, da ein Einfluss auf nicht in die Krankheit

involvierte Systeme zu Nebenwirkungen führen kann. Entscheidend ist hierbei, dass exakt die

Krankheit beeinflussenden Rezeptoren, Gewebe, Zellen, Proteine etc. positiv verändert werden und

zur Heilung der Krankheit führen. Besonders für die neurodegenerativen Erkrankungen hat sich in

letzter Zeit gezeigt, dass es viele pathogene Faktoren gibt, wie sie oben für die Alzheimer-Krankheit

vorgestellt wurden. In einer „multi-target“-Strategie sollte es also möglich sein, die Bekämpfung

dieser verschiedenen pathogenen Faktoren in einem Wirkstoff zu vereinen.114

19

2 ZIELSETZUNG

ZIELSETZUNG

20

2.1 „Multi-target“-Ansatz

Aufgrund der oben geschilderten Diversität in der Pathologie der Alzheimer-Krankheit sollte versucht

werden verschiedene Angriffsmöglichkeiten der Alzheimer-Krankheit in einem Wirkstoff zu vereinen.

Um in die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit einzugreifen, gibt es die Möglichkeit der Inhibition

der AChE bzw. BuChE, eine Hemmung der Aβ-Fibrillen, ein Eingriff in die APP-Spaltung, Hemmung

der -Protein-Phosphorylierung, die Hemmung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) und viele mehr.

In dieser Arbeit wurden als Ansatzpunkt bereits bestehende AChE-Inhibitoren gewählt.

Ausgewählt wurde nun ausgehend von der Leitstruktur der AChEIs (siehe Abb. 13) die

Weiterentwicklung dieser AChEIs zu einem kombinierten Wirkstoff, der die AChE wie auch die

Fibrillen hemmt. Dazu sollte gleichzeitig eine Inhibition der BuChE durch diese Substanzen erfolgen.

Die Kontrolle der inhibitorischen Aktivität erfolgt mit Ellman’s Test.

Aufgrund des sehr kostenintensiven Thioflavin-T-Tests für die Fibrillenbildung mit Aβ(1-42) sollte

ein kostengünstigeres Testsystem für die Fibrillenbildungshemmung etabliert werden. Dazu sollte das

vollständige Peptid Aβ (1-42) durch ein kürzeres Peptid, welches die gleichen Eigenschaften der

Fibrillenbildung aufweist, ersetzt werden. Durch ein kürzeres Peptid ist es möglich, dies zu

synthetisieren und in Folge dessen kostengünstigere Untersuchungen an der Fibrillenbildung

vorzunehmen. Dazu gilt es als Erstes, den entscheidenden Aminosäureausschnitt für die

Fibrillenbildung zu identifizieren und das bestehende Testsystem dann darauf zu übertragen. Im

Weiteren sollten die Substanzen dann bezüglich dieser zwei Angriffspunkte optimiert werden.

Zum Schluss sollte noch die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit durch ein geeignetes Testsystem

überprüft werden. Dazu wird eine geeigneter Assay ausgewählt und die quantitative Analyse mit einer

geeigneten Methode ermöglicht.

2.2 Leitstruktur

In früheren Arbeiten wurden bereits AChE-Inhibitoren optimiert. Den Ausgangspunkt stellen die

symmetrischen DUO-Verbindungen (siehe Abb. 13 A) dar, welche als ditopische Inhibitoren agieren

und somit sowohl mit der aktiven Bindestelle als auch mit der peripheren interagieren.116,117 Da die

DUO-Verbindungen zwar eine sehr gute Hemmung der AChE aufweisen, aber zu groß für die Furche

am aktiven Zentrum der AChE sind,23 wurden Verbindungen synthetisiert, die nur noch einen Teil

dieser Struktur beinhalten (siehe Abb. 13 B).116 Diese Substanzen hemmen einerseits die AChE im

nanomolaren Konzentrationsbereich wie auch die Amyloid-β-Fibrillenbildung. Aufgrund der positiven

Ladung im Molekül ist es nicht möglich, dass diese Substanzen die Blut-Hirn-Schranke überwinden.

Deshalb wurde der Pyridinring gegen einen Piperidinring ausgetauscht, wodurch die positive Ladung

für die Interaktion mit der AChE erhalten wird, da der Stickstoff unter physiologischen Bedingungen

teilweise protoniert vorliegt (siehe Abb. 13 C). Durch den Verlust der Aromatizität kann das Molekül

aber nun nicht mehr mit den Fibrillen wechselwirken und es wirkt sich auch negativ auf die Aktivität

gegen die AChE aus. In einem nächsten Schritt wurde festgestellt, dass der Methylenspacer zwischen

ZIELSETZUNG

21

dem Ring und dem Oxim nicht benötigt wird – die Aktivität steigt sogar wieder, wenn das Oxim direkt

am Ring hängt (siehe Abb. 13 D). Abschließend wurde statt dem Oxim ein Hydrazon eingeführt und

dem Ring teilweise seine Aromatizität zurückgegeben (siehe Abb. 13 E), wodurch wieder beide

Anforderungen erfüllt wurden: Die unprotonierte Form (Transportform) kann die Blut-Hirn-Schranke

überwinden und die protonierte Form hemmt die AChE wie auch die Amyloid-β-Fibrillenbildung

durch das ausgedehnte konjugierte System.

IC50-Werte [µM]

für AChE-Inhibition

0.34

0.18

19.13

12.05

5.66

Abb. 13: Verlauf der Leitstrukturfindung.

Die hemmende Wirkung auf die Fibrillenbildung von E (siehe Abb. 13) kann durch ein “π-π-stacking”

der Substanzen mit den Fibrillen erklärt werden.116 Der Mechanismus der Inhibition der AChE

erschließt sich aus „molecular modeling“, welches folgende Interaktionen bestätigt: „π-π-stacking“

zwischen dem Benzylsubstituenten an der Hydrazinseite und Trp84 der AChE, einer “face-to-face”-

Interaktion (π-π- and Kation-π-Wechselwirkungen) zwischen dem Pyridiniumring und entweder

Tyr334 oder Phe332, sowie einer “face-to-face”-Wechselwirkung zwischen dem Substituenten am

Pyridinring und Trp279. Dieser Substituent kann entweder ein zweiter Pyridinring118 oder ein anderer

aromatischer Rest sein.116 Allerdings konnte bis jetzt kein Molekül gefunden werden, dessen

Phenylring perfekt mit Trp279 interagiert.

ON

N+ N+

NO

RR

ON

N+

Cl

Cl

Br-

ON

N

Cl

Cl

HCl

Cl

Cl

NN

N

ON

Cl

ClN

HBr

HCl

DUOA

B

C

D

E

ZIELSETZUNG

22

Um aussagekräftige Struktur-Wirkungs-Beziehungen definieren zu können ist es deshalb nötig eine

Substanzbibiliothek zu erstellen, in der verschiedene Reste sowohl an der Hydrazinseite als auch an

der Pyridinseite eingeführt werden. Die Derivate sollten insbesondere unterschiedliche Spacerlängen

wie auch aromatische Reste (Phenyl, Anthranyl oder Phthalimide) mit variierenden

Substitutionsmustern wie z. B. Halogene, Nitro-, Methyl- oder Methoxygruppen enthalten (siehe Abb.

14). Die verschiedenen Derivate sollten dann auf AChE- und BuChE-Aktivität sowohl als auf die

Hemmung der Fibrillenbildung bzw. deren Auflösen und eine mögliche protektive Wirkung bezüglich

ROS getestet werden.

Abb. 14: Leitstruktur mit zu variierenden Resten.

23

3 SYNTHESE DER ZIELVERBINDUNGEN

SYNTHESE

24

3.1 Syntheseschema zu den 1,4-substituierten 1,4-Dihydropyridin-

Hydrobromiden

Start der Synthese ist die Freisetzung der Base aus 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid, gefolgt von einer

nucleophilen Substitution des Chlorids durch Hydrazin, wobei 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

erhalten wird. Im nächsten Schritt wird dieses mit einem entsprechenden Aldehyd umgesetzt, um

Pyridylenhydrazon-Hydrochloride zu erhalten. Im letzten Schritt wird der Pyridinstickstoff mittels

Arylalkylbromiden alkyliert (siehe Abb. 15).

Abb. 15: Syntheseschema der Zielverbindungen.

Von den Zielverbindungen wurden verschiedenste Derivate synthetisiert (siehe Abb. 16).

Abb. 16: Derivate der Zielverbindungen.

2 3

14

R1

R1 = Hal, Me, OMe, NO25 - 13

R =

4

A - E

K

N

O

O

L

M, N

n

n = 1 - 5

R2

R2 = Hal, Me

F - J

n

n = 3, 5

R' =

O

R NN

NHBrR'

2A-14O

SYNTHESE

25

3.2 Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

3.2.1 Versuche zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

Zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid wurde eine Vielzahl von Reaktionsbedingungen

getestet, um das Produkt in ausreichender Menge isolieren zu können. Eine Übersicht findet sich in

Abb. 17. Die Reaktionen wurden jeweils dünnschichtchromatographisch und NMR-spektroskopisch

verfolgt.

Abb. 17: Versuche zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid:

a) Smith et al.119, b) Frank et al.120, c/d) Ochiai et al.121, e) Mann et al.122

N

Cl

NH2NH2 H2OHCl +

N

HN

HCl

NH2

N

NH2

+ NaNO2HCl

N

N+N

O

H

H

-H2O

N

N+N

SnCl2/HCl

N

HNNH2

HCl

N

Cl

HClH2O2

AcOHN+

Cl

HCl

O-

NH2NH2 H2O

N

HNNH2

HCl

N

H2O2

AcOHN+

O-

NH2NH2 H2O

N

HNNH2

N

Cl

NH2NH2 H2OHCl

N

HN

HCl

NH2

Base

N

Cl

a)

b)

c)

d)

e)

SYNTHESE

26

Der erste Versuch (siehe Abb. 17a) erfolgte nach einem Patent von Smith et al.: Zu 4-Chlorpyridin-

Hydrochlorid wurde Hydrazinhydrat im fünffachem Überschuss in Ethanol gegeben und unter

Rückfluss erhitzt.119 Bereits bei Zugabe der entsprechenden Menge Hydrazinhydrat trat eine sich mit

der Zeit intensivierende Rotfärbung ein und nach 12 h war kein Umsatz zu einem Produkt mehr

erkennbar. NMR-spektroskopisch zeigte sich, dass eine Polymerisation stattgefunden hatte. Eine

mögliche Erklärung hierfür ist, dass durch die Basizität des Hydrazins in einem ersten Schritt die freie

Base von 4-Chlorpyridin entsteht. Die freie Base hat durch die positive Partialladung am Kohlenstoff

in Position 4 und der negativen Partialladungen am Stickstoff die Möglichkeit zur Polymerisation. Es

entsteht also eine Konkurrenz zwischen der Dimerisierungsreaktion und dem nucleophilen Angriff des

Hydrazins an Position 4 des Pyridinringes. Aufgrund des stark basischen Milieus durch den

Überschuss an Hydrazin wird ein Teil des 4-Chlorpyridins dimerisieren, aber der Überschuss sollte die

Hydrazinylierung bevorzugen (siehe Abb. 18).123

Abb. 18: Schematische Darstellung des Mechanismus der Polymerisierung von 4-Chlorpyridin.

Außerdem kann durch den hohen Überschuss an Hydrazinhydrat als Nebenreaktion eine Zincke-

analoge124 Ringöffnung des Dimers stattfinden (siehe Abb. 19).

Abb. 19: Zincke-analoge Ringöffnung des Dimers von 4-Chlorpyridins.

Der zweite Versuch (siehe Abb. 17b) erfolgte in Anlehnung an die Synthese von 3-Hydrazinylpyridin-

Hydrochlorid nach Frank et al.120 Zu 4-Aminopyridin in kalter konzentrierter Salzsäure (0 °C) wird ein

1.1-facher Überschuss an NaNO2 in Wasser zugetropft. Durch die salzsaure Lösung bildet sich aus

dem Nitrit das Nitrosylkation, welches am primären aromatischen Amin elektrophil angreifen kann.

Nach der Abspaltung von Wasser wird die Diazoverbindung erhalten. Diese Reaktionsmischung wird

anschließend tropfenweise zu einer Lösung von SnCl2 in Wasser (0 °C) in 2-fachem Überschuss

gegeben, um die Diazoverbindung zum 4-Hydrazinylpyridin zu reduzieren. Das Produkt sollte nach

beendeter Reaktion ausfallen. Allerdings kann in dem Fall von 4-Aminopyridin das Nitrosylkation den

SYNTHESE

27

Stickstoff des primären Amins nicht angreifen, da dieser über mesomere Grenzstrukturen in der

salzsauren Lösung bereits eine positive Ladung trägt (siehe Abb. 20) und eine Umsetzung zum

gewünschten Produkt konnte nicht stattfinden.

Abb. 20: verhinderte Diazotierung durch mesomere Grenzstrukturen.

Eine weitere Möglichkeit (siehe Abb. 17c) ist die Substitution in Position 4 über ein N-Oxid des

Pyridins. Dieses wurde mit der klassischen Methode dargestellt (Erhitzen mit 30 % H2O2 in

Essigsäure).121 Der Angriff des Hydrazins erfolgte nun jedoch selektiv an Position 2 des Pyridinrings

und substituierte nicht das Chlorid. Der Versuch, in unsubstituiertem Pyridin Hydrazin in Position 4

einzuführen, wurde aufgrund des schlechten Verhältnisses zwischen 2- und 4-substituiertem Pyridin

nicht weiter verfolgt.

Der vierte Versuch (siehe Abb. 17d) erfolgte nach Mann et al., wobei von der freien Base von

4-Chlorpyridin ausgegangen wird.122 In Anlehnung an diese Vorschrift kann das Produkt isoliert

werden, wie in Alptüzün et al. 2009125 so veröffentlicht wurde: Zur freien Base von 4-Chlorpyridin

wird Hydrazinhydrat in 1,5-fachen Überschuss in 1-Propanol gelöst und 18 h unter Rückfluss erhitzt.

Das Produkt fällt beim Abkühlen aus. Das Problem hierbei ist die Extraktion der freien Base, da diese

sehr instabil ist und die Polymerisierung wie in Abb. 18 dargestellt, mit jeder Base, die zur

Darstellung von 4-Chlorpyridin verwendet wird, möglich ist.

3.2.2 Optimierung der Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

Ausgehend von den Synthesevorschriften von Smith et al.119 und Mann et al.122 wurde versucht mit

Variationen der Reaktionsbedingungen die Polymerisierung zu unterdrücken. Die Veränderungen

ausgehend vom Hydrochlorid sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Es wurde dabei festgestellt,

dass je höher der Äquivalentanteil von Hydrazinhydrat ist, desto schneller tritt die Polymerisierung

ein, was an dem erhöhten pH-Wert liegen muss. Setzt man das Hydrazinhydrat nur äquimolar ein, d. h.

ein Äquivalent für die Freisetzung der freien Base und eines zur Substitution, so verläuft der

Polymerisierungsprozess erheblich langsamer. Allerdings ist dieser Schritt immer noch der

vorherrschende und es findet keine Substitution statt. Verringert man die Temperatur, so verlangsamt

sich zwar die Polymerisierung, aber die Energie reicht für eine Substitution nicht aus. Es zeigt sich

allerdings, dass das Lösungsmittel einen entscheidenden Beitrag leistet. Je polarer das Lösungsmittel,

desto förderlicher wirkt sich das auf die Polymerisierung aus. Arbeitet man mit unpolareren

Lösungsmitteln, so löst sich das Edukt nicht mehr und die entstandenen Spuren der freien Basen

stehen in einem ungünstigen Verhältnis zum vorhandenen Hydrazin.

SYNTHESE

28

Auch die Variation der Zugabeart führte nicht zum gewünschten Erfolg, da am Ende doch immer ein

Überschuss an Hydrazin vorhanden ist, da dessen Abreaktion zu langsam ist. Schlussendlich erhielt

man immer das rote Polymerisierungsprodukt.

Edukt 1 / Edukt 2

Temp. [°C]

Dauer [h]

Lösungs-mittel

Vorgehensweise Edukt 1 vorgelegt, Edukt 2 zugegeben

1 / 5 78 12 EtOH einfache Zugabe 1 / 5 40 12 EtOH einfache Zugabe 1 / 5 20 12 EtOH einfache Zugabe 1 / 5 20 12 EtOH Zutropfen über 30 min 1 / 2 20 12 EtOH einfache Zugabe 1 / 2 20 12 EtOH Zutropfen über 30 min 1 / 2 78 12 EtOH Zutropfen über 30 min bei 20 °C, danach erhitzen 1 / 2 78 12 EtOH Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C,

danach ein weiteres Äquivalent zugeben und erhitzen. 1 / 2 78 12 i-PrOH Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C,

danach ein weiteres Äquivalent zugeben und erhitzen. 1 / 2 78 12 n-PrOH Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C,

danach ein weiteres Äquivalent zugeben und erhitzen. 1 / 2 78 12 n-PrOH Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C,

danach auf 78 °C erhitzen und das weitere Äquivalent über 30 min zugeben.

1 / 2 78 12 MeOH Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C, danach ein weiteres Äquivalent zugeben und erhitzen.

1 / 2 78 12 H2O Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C, danach ein weiteres Äquivalent zugeben und erhitzen.

1 / 2 78 12 ACN Zutropfen eines Äquivalents innerhalb 30 min bei 20 °C, danach ein weiteres Äquivalent zugeben und erhitzen.

Tabelle 1: Variation der Reaktionsbedingungen zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin aus 4-

Chlorpyridin-Hydrochlorid (Edukt 1) und Hydrazinhydrat (Edukt 2).

Aufgrund der Instabilität der freien Base wurde in verschiedenen Ansätzen versucht, die Base des 4-

Chlorpyridins in situ herzustellen, indem man erst eine andere Base zusetzte und dann direkt in einer

Eintopfreaktion das Hydrazinhydrat zugegeben wurde. Das Problem hierbei war, dass aufgrund der

dann schon vorhandenen Base die Zugabe von Hydrazinhydrat den pH-Wert noch weiter erhöht hat

und wieder die Polymerisation ablief. Ein anderer Grund für das Misslingen der Reaktion war, dass

die eingesetzte Base zu schwach war, das 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid zu deprotonieren und die Base

somit keinen Einfluss hatte. Die Reaktionsparameter waren hierbei immer 1 Äquivalent

4-Chlorpyridin-Hydrochlorid, 1.1 Äquivalent Hydrazinhydrat zugegeben über 30 min in n-Propanol

und anschließender Erhitzung unter Rückfluss für 12 h. Die durchgeführten Variationen sind in

Tabelle 2 zusammen gefasst:

SYNTHESE

29

Base Konzentration Dauer Na2CO3 1 – 10 M 6 h

Trieethylamin 1 – 3 M 15 min Hünig-Base 1 – 3 M 15 min

NaOH 0.5 – 3 M 1 min – 1 h Tabelle 2: In situ – Erzeugung der freien Base von 4-Chlorpyridin Hydrochlorid mit

verschiedenen Basen und anschließender Zugabe von Hydrazinhydrat.

Da auch dieser Weg nicht zum Erfolg geführt hat, wurde daraufhin doch der Weg über die Isolierung

der instabilen freien Base von 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid gegangen. Die einzelnen Variationen der

eingesetzten Basen, die Temperaturen und Zeiten sind aus Tabelle 3 ersichtlich. Es spielt bei der

Extraktion der zeitliche Faktor eine sehr große Rolle. Je länger sich die freie Base in der alkalischen

Lösung befindet, desto stärker ist die Polymerisation; deswegen ist es sinnvoll nur kurz zu extrahieren

und einen eventuellen Verlust an freier Base hinzunehmen, als vorschriftsmäßig zu extrahieren und

einen großen Anteil polymerisiertes 4-Chlorpyridin zu erhalten. Weiterhin ist es wichtig, dass alle

verwendeten Lösungen auf 4 °C gekühlt werden, um eine vorschnelle Polymerisierung möglichst zu

verhindern.

Base Dauer Temp. Resultat 1 - 10 M Na2CO3 12 h RT/RF Hydrochlorid

1 – 5 % TEA/Hünig 5 min RT Freie Base 0,1 % Ammoniak 1 min RT Rotfärbung 0,1 – 1 M NaOH 30 min RT Hydrochlorid

1,5 M NaOH 30 min RT Freie Base + Hydrochlorid 1,5 M NaOH 45 min RT Rotfärbung 1,5 M NaOH 5 min 40 °C Rotfärbung 2 M NaOH 1 min RT Freie Base + Rotfärbung 2 M NaOH 1 min 4 °C Freie Base + Gelbfärbung 2 M NaOH 1 s 4 °C Freie Base (92 %)

Tabelle 3: Variationen zur Extraktion von 4-Chlorpyridin.

Des Weiteren ist es wichtig, dass das Extraktionsmittel einen niedrigen Siedepunkt hat, damit eine

Verdampfung des Lösungsmittels ohne Erwärmung möglich ist, da dies wieder das Risiko der

beschleunigten Polymerisierung birgt. Das Lösungsmittel Chloroform erfüllt diese Anforderungen

nicht, d. h. entweder muss zur Verdampfung erwärmt werden oder über die Dauer der Verdampfung

N

Cl

HCl

N

Cl

Base

SYNTHESE

30

tritt bereits wieder Polymerisation ein. Eine Möglichkeit ist Diethylether, welcher bei einer

Temperatur des Wasserbads von unter 15 °C und einem Druck von 100 mbar verdampft werden kann

und eine Polymerisierung somit weitestgehend verhindert wird.

Das weitere Vorgehen verläuft nach der Vorschrift von Mann et al.,122 (siehe Abb. 21) wobei hier

höhere Ausbeuten durch Variation des Lösungsmittels erreicht werden konnten. Es zeigte sich, dass

auch hier polarere Lösungsmittel eher ungeeignet sind. Das Lösungsmittel Acetonitril ist allerdings

geeignet und hat zusätzlich den Vorteil eines niedrigeren Siedepunkts als i-Propanol. Erwähnenswert

ist, dass sich auch hier n-Propanol nicht durch i-Propanol ersetzt werden kann.

Abb. 21: Nucleophile Substitution von 4-Chlorpyridin mit Hydrazin.

3.2.3 Mikrowellen-unterstützte Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

3.2.3.1 Vorteile Mikrowellen-unterstützter Synthese

Der Einsatz von Mikrowellentechnik in der organischen Synthese ist eine relativ neue Technik. Gedye

et al. veröffentlichte 1986 die erste Arbeit über Mikrowellen-unterstützte organische Synthese.126

Nachdem die ersten Untersuchungen in modifizierten Haushaltsmikrowellen durchgeführt wurden,

gibt es mittlerweile speziell auf die Anforderungen der organischen Synthese zugeschnittene Geräte.

Diese Mikrowellengeräte gewährleisten einen konstanten Energieeintrag über die gesamte

Reaktionszeit und es können Temperatur, Druck und Aufheizrate genau geregelt und überwacht

werden. Die Vorteile der Mikrowellentechnik sind eine Verkürzung der Reaktionszeit, verbesserte

Produktausbeuten und verminderte Nebenreaktionen.127

Mikrowellenstrahlung kann zwar chemische Reaktionen nicht direkt induzieren, da dazu ihre Energie

zu gering ist, liefert aber einen viel effizienteren Energieübertrag auf Reaktionslösungen durch

„dielektrische Erhitzen“ als sonst übliche Heizquellen dies können.128 Für die Wärmeentwicklung sind

vor allem dipolare Polarisation und ionische Leitung verantwortlich, d. h. dass sich polare

Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol, Chloroform usw., besonders gut als Lösungsmittel für

Mikrowellen-unterstützte Synthesen eignen. Bei unpolaren Lösungsmitteln ist es deshalb nötig,

zusätzlich Mikrowellenstrahlung-absorbierende Substanzen wie Siliciumcarbid oder „Weflon“-

Scheiben (Polytetrafluorethylen/Graphit) zuzugeben. Im Gegensatz zu üblichen Heizquellen wie Öl-

oder Wasserbad, die das Reaktionsgefäß von außen nach innen aufwärmen, sorgt die

Mikrowellenstrahlung dafür, dass die Reaktionsmischung von innen gleichmäßig erhitzt wird und

Temperaturgradienten sowie Wandeffekte innerhalb einer Reaktionslösung wegfallen. Dieser Effekt

wird als „thermo-kinetischer Effekt“ bezeichnet.129

SYNTHESE

31

3.2.3.2 Mikrowellen-unterstützte Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

Die klassische Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid wurde direkt auf die Mikrowellen-

synthese übertragen, d. h. es wurden als Ausgangsstoffe 4-Chlorpyridin als freie Base und

Hydrazinhydrat verwendet, sowie Temperatur und Lösungsmittel aus der klassische Methode

beibehalten. Leider beschleunigte die Mikrowelle hier nicht die Reaktion zum gewünschten Produkt,

sondern die Polymerisierung und innerhalb kürzester Zeit wurde eine dunkelrote Färbung beobachtet.

Weitere Untersuchungen ermöglichten aber nun eine Synthese des 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorids

direkt aus dem 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid. Den Vorteil bringen hier im Gegensatz zur

konventionellen Synthese die polareren Lösungsmittel (siehe Tabelle 4). Die Synthese mit i-Propanol

und 10 % Wasser als Lösungsmittel ist in der Tat die effektivste ihrer Art, da auch eine

Produktausbeute von 90 % erhalten wurde. Das Problem hierbei war, dass diese Synthese nur mit

minimalen Mengen an Edukt das gewünschte Produkt reproduzierbar lieferte (50 mg Edukt in 50 ml

Lösungsmittelgemisch). Bei dem Versuch, den Ansatz zu verdoppeln, reduziert sich die Ausbeute auf

ca. 60 %, obwohl an den Konzentrationen der Ausgangsstoffe nichts verändert wurde. Bei einem

weiteren „up-scaling“ verringerten sich die Ausbeuten noch mehr, so dass in diesem Fall der

klassische Syntheseweg der sinnvollste ist.

Lösungs- mittel

Temp. [°C

Druck [bar]

Dauer[h]

Effekt

n-Propanol 97 1 2 Rotfärbung n-Propanol 120 2 2 leichte Rotfärbung n-Propanol 130 3 1 Rotfärbung i-Propanol 82 1 2 leichte Rotfärbung i-Propanol 110 3 1 leichte Rotfärbung i-Propanol 130 5 1 leichte Gelbfärbung

Ethanol 78 1 1 Rotfärbung Methanol 65 1 1 Rotfärbung Methanol 100 4 0.5 Rotfärbung i-Propanol

+ 10 % Wasser

120 4 3 weiße Kristalle

Tabelle 4: Variationen an der Mikrowelle zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin

aus 4-Chlorpyridin und Hydrazinhydrat.

SYNTHESE

32

3.2.4 Einsatz von verschiedenen Hydrazinderivaten zur Synthese von 4-

Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

Einer weitere Variation der Synthese liegt im Einsatz von verschiedenen Hydrazinderivaten.

Eingesetzt wurde bisher das Hydrazin-Monohydrat (98 %), das damit 64-65 % Hydrazin enthält. Eine

Möglichkeit bot der Einsatz von Hydrazinsalzen. Hydrazin-Monohydrochlorid und Hydrazinsulfat

wurden in der Vorschrift von Smith et al. statt des Hydrazinhydrats eingesetzt, allerdings konnten

damit keine Veränderungen im Reaktionsverlauf festgestellt werden.

1 M Hydrazin-Lösung in THF konnte nicht verwendet werden, da sich 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid

darin nicht löste, bzw. als Gemisch mit anderen trockenen Lösungsmitteln die gewünschten

Konzentrationen nicht erreicht werden konnten.

3.2.5 Besonderheiten zur Struktur von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid

4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid ist ein planares Molekül - die Stickstoffatome des Hydrazins liegen

in einer Ebene mit dem Pyridinring. Die Bindung zwischen dem Pyridinring und dem Hydrazinrest ist

nicht frei drehbar, da das freie Wasserstoffatom des sekundären Amins im Kristall eine H-Brücke mit

dem Chlorid eingeht.130 Auch in Lösung erkennt man eine Rotationsbarriere.

Im zugehörigen 1H-NMR-Spektrum stellt sich dies folgendermaßen dar: Bei 300 K erscheinen die vier

Protonen des Pyridinrings als vier einzelne Dubletts mit einer Kopplungskonstante von 3J = 5.5 Hz

(siehe Abb. 22). Durch die Rotationsbarriere werden die Protonen des Pyridins diastereotop und man

erhält somit vier einzelne Signale. Die einzelnen „Seiten“ des Moleküls können nicht genauer

zugeordnet werden, da weder im HMBC-Experiment (heteronuclear multiple bond correlation) noch

im NOESY-Experiment (Nuclear Overhauser effect spectroscopy), noch im ROESY (Rotating-frame

Overhauser effect spectroscopy) eine Kopplung zwischen den Wasserstoffatomen des Hydrazinrestes

und den Protonen bzw. Kohlenstoffen des Pyridinrings einer Seite zuzuordnen ist. Auch im 13C-NMR-

Spektrum erkennt man fünf einzelne Signale.

Misst man die Probe bei einer Temperatur über 60 °C, so kann man feststellen, dass die

Rotationsbarriere überwunden wird und H-2 und H-5 sowie H-3 und H-4 jeweils chemisch äquivalent

werden und als breites Singulett erscheinen (siehe Abb. 22). Aufgrund dieses Effekts wurde die freie

Enthalpie der Rotationsbarriere (G) bestimmt. Dazu wurde die Temperatur als 1000/T gegen den

Abstand der koaleszierenden Signale aufgetragen (siehe Abb. 23) und extrapoliert.

SYNTHESE

33

327 K

319 K

300 K

Abb. 22: 1H-NMR von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid in DMSO bei verschiedenen Temperaturen.

Abb. 23: Zusammenhang zwischen Temperatur und Abstand der Signale in Verbindung 2.

Aus den dadurch erhaltenen Grenzwerten kann mit Hilfe der Gleichung 1131 die freie Enthalpie

berechnet werden. Sie liegt in diesem Fall bei 65,7 kJ/mol für die Rotation des Hydrazinrests.

∆ 8,314 ∙ ∙ 22,96 ln

Gleichung 1131

G = freie Enthalpie Tc = Koaleszenztemperatur δ = Abstand der Signale

0102030405060

3.1 3.2 3.3

1000/T [K-1]

Pyortho

0255075

100125150

3 3.1 3.2 3.3

1000/T [K-1]

Pymeta

SYNTHESE

34

3.3 Synthese der einfach substituierten Pyridylhydrazon-Hydrochloride

3.3.1 Synthese

Abb. 24: Syntheseschema zur Darstellung der einfach substituierten Pyridylhydrazon-Hydrochloride.

Die Synthese erfolgte nach der Vorschrift von Douglas et al.132 Hierbei findet eine nucleophile

Addition von einem entsprechenden Aldehyd an 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid statt (siehe Abb.

24). Das entstehende Halbaminal spaltet sodann Wasser ab und die Schiffsche Base wird frei gesetzt

(siehe Abb. 25).

Abb. 25: Bildung der Schiffschen Base aus einem Aldehyd und einem primären Amin.

Folgende Verbindungen wurden synthetisiert (siehe Abb. 26):

Abb. 26: Übersicht über die Variationen an der Hydrazinylseite der Pyridylhydrazone.

N

HNNH2

HClR N

N

NHHClR O

H

+

1 2-14

O

F

F ClO

2 (68 %) 3 (12 %) 4 (44 %) 5 (50 % / 69 % Lit.)

7 (58 %)

11 (64 %)

8 (46 %) 9 (65 %)

12 (64 %)

6 (66 %)

O2N13 (68 %)

Cl

Cl10 (67 %)

14 (31 %)

NN

NHPy

Ph1

R n

HCl

SYNTHESE

35

Dazu wurde Verbindung 1 in einem Lösungsmittelgemisch (EtOH/Wasser/NEt3) gelöst und

1.1 Äquivalente des entsprechenden Aldehyds zugegeben. Abhängig von der Reaktivität des Aldehyds

wurde entweder bei Raumtemperatur gerührt oder unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionen wurden

dünnschichtchromatographisch verfolgt und das Produktgemisch säulenchromatographisch gereinigt.

Die substituierten Pyridylhydrazone wurden alle als weißes bis hellgelbes Pulver erhalten. Die

erzielten Ausbeuten lagen zwischen 12 – 68 % (siehe Abb. 26).

3.3.2 NMR-spektroskopische Betrachtungen

Die Pyridylhydrazone wurden durchgehend als Hydrochloride isoliert, können jedoch in Abhängigkeit

des pH-Wertes auch als freie Base vorliegen. Im Folgenden werden die Unterschiede der beiden

Formen diskutiert:

In Abb. 27 ist beispielhaft ein Spektrum der Verbindung 2 als freie Base abgebildet. Die Signale der

Protonen in meta-Position am Pyridinring (rot gekennzeichnet) weisen kein klares Dublett auf, da hier

wahrscheinlich die 4J-Kopplung zum exocylischen NH-Proton (δ = 10.9 ppm) die Aufspaltung

beeinflusst. Die zugehörigen Kopplungskonstanten konnten nicht bestimmt werden. Im COSY-

Experiment (correlated spectroscopy) ist eine Kopplung zwischen dem Hydrazin-NH und den meta-

Protonen des Pyridinrings zu sehen, was belegt, dass hier die Pyridylform und nicht die

Dihydropyridinform (siehe Abb. 28) vorliegt. Weitere Kopplungen zwischen NH und den Protonen

des Pyridins sind nicht vorhanden. Für den obigen Befund spricht auch die Tatsache, dass es sich bei

den entsprechenden Protonen um chemisch äquivalente Protonen handelt, was in der

Dihydropyridinform nicht der Fall wäre. Im Gegensatz zur Dihydropyridinform ist der Pyridinring in

der Pyridylform frei drehbar.

NH bei 10.9 ppm

Abb. 27: 1H-NMR-Spektrum der Verbindung 2 als freie Base.

N

HN

N

H H

H

H

H

SYNTHESE

36

Cis-Rotamere (siehe Abb. 28) bzw. cis-Isomere (siehe Abb. 28) sind sterisch ungünstiger und werden

deshalb nicht beobachtet.

Abb. 28: Theoretisch mögliche Tautomere und cis-/trans-Isomere der Verbindung 2.

Vergleicht man das Spektrum des Hydrochlorids mit dem Spektrum der freien Base der Verbindung 2

(siehe Abb. 29), so fällt eine starke Verbreiterung, Tieffeld-Verschiebung und Aufspaltung der

Signale auf. Mittels eines NOESY-Experiments lassen sich die Protonen an den Stickstoffen eindeutig

zuordnen. Das NH-Proton am Pyridinring (δ = 14.2 ppm) koppelt nur mit den H-Pyortho. Das Hydrazin-

Proton (δ = 13.1 ppm) zeigt dagegen ein Kreuzsignal mit den H-Pymeta (rot), sowie mit H-Imin (blau).

Interessanterweise wird zusätzlich ein Kreuzsignal zwischen dem Hydrazin-Proton und den ortho-

Phenylprotonen (gelb) beobachtet, welches durch einen Relay-Effekt verursacht sein könnte.

H-Pyortho

H-Imin

H-Benzyl H-Pymeta

Abb. 29: Vergleich der freien Base von Verbindung 2 und dem Hydrochlorid.

N

HN

N

SYNTHESE

37

Die Ladung der protonierten Spezies verursacht die starke Verbreiterung und Verschiebung der

Signale, da die Ladung über das gesamte Molekül verteilt ist (siehe Abb. 30). Aufgrund des

vorhanden Doppelbindungscharakters zwischen dem Pyridinring und dem Hydrazinylrest (vgl. Abb.

30 zweite mesomere Struktur), ist eine freie Drehung um diese Bindung nicht mehr möglich und die

Protonen des Pyridins sind diastereotop. Aufgrund dieser Diastereotopie sind die gegenüberliegenden

Protonen nicht mehr chemisch äquivalent, sondern liefern je ein individuelles Signal.

Abb. 30: Verteilung der Ladung in der protonierten Verbindung 2.

Über die Kopplungen im COSY-Experiment kann man nun die jeweils stärker Tieffeld-verschobenen

meta- und ortho-Protonen des Pyridinrings einer „Seite“ zuordnen, sowie die etwas weiter Hochfeld-

verschobenen der anderen „Seite“. Welche „Seite“ dem Proton des NHs zugewandt ist, konnte erst

durch ein ROESY-Experiment (Rotating-frame Overhauser effect spectroscopy) bestimmt werden, da

weder im HMQC- (Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation), HMBC-, TOCSY- (total

correlation spectroscopy) noch im NOESY-Experiment eine Zuordnung möglich war. In Abb. 31 ist

der Intensitätsunterschied zwischen der Kopplung des NHs und den verschiedenen Seiten der H-Pymeta

dargestellt – der Unterschied ist klein, aber signifikant. Davon ausgehend, ist es naheliegend, dass das

hochfeldverschobene Proton zu der NH-zugewandten Seite zugeordnet werden muss.

Abb. 31: Intensitätsunterschied im ROESY-Experiment zwischen der Kopplung vom NH zu den zwei

H-Pymeta (rot gekennzeichnet im Spektrum).

Auch hier kann die Rotationsbarriere durch Temperaturerhöhung überwunden werden. Die

Aktivierungsenergie wurde analog zu Kapitel 3.2.5 berechnet und liegt bei 63,7 kJ/mol.

SYNTHESE

38

F

I Br

F

Br

N

O

O

N

O

O

NN

NPy

HBr

m

R'

Ph2

2A-14A 2B, 5B, 6B, 10B, 12B, 13B 2C-14C 2D, 6D, 10D, 12D, 13D

2E, 6E, 12E, 13E 2F, 4F, 9F 2G, 9G 2H, 4H, 7H, 9H

2I, 4I, 9I 2J, 4J, 9J 2K, 5K, 12K 2L, 12L

2M, 11M, 12M, 14M 2N, 6N 2O, 5O, 6O, 9O, 12O, 13O

Ph1

R n

A B C D

E F G H

KJI L

M N O

3.4 Synthese der 1,4-substituierten Pyridylhydrazon-Hydrobromide

3.4.1 Synthese

Abb. 32: Syntheseschema zur Darstellung der disubstituierten Pyridylhydrazon Hydrobromide.

Der letzte Schritt der Synthese zu den gewünschten Produkten ist eine N-Alkylierung des Pyridin-

Stickstoffs nach Menshutkin.133,134 Hierbei wird in einer SN2-Reaktion mit einem Phenylalkylbromid

der Stickstoff des Pyridins quarternisiert. Da nicht genauer analysiert wurde, ob die Verbindungen als

Hydrochlorid oder Hydrobromid ausfallen, bzw. durch die säulenchromatographische Aufreinigung

die freie Base isoliert wurde, erfolgte im Anschluss ein Umsalzen bzw. Fällung als Hydrobromid

(siehe Abb. 32). Ausgehend von den Zwischenprodukten 2-14 (siehe Kapitel 3.3.1, Abb. 26) wurden

folgende Endprodukte synthetisiert (siehe Abb. 33):

Abb. 33: Endstufen 2A-14M.

Zahlen (siehe Abb. 26)

Buchstaben

SYNTHESE

39

Die Synthese der Zielverbindungen erfolgte mit drei unterschiedlichen Methoden.

Methode A:

Bei dieser klassischen Methode wurde zu den Zwischenstufen (2-14) in trockenem DMF

2 Äquivalente des entsprechenden Alkylbromids gegeben. Abhängig von der Reaktivität der Edukte

wurde entweder keine Base oder 1 Äquivalent NEt3 oder Hünig-Base zugegeben und das

Reaktionsgemisch unter Rückfluss erhitzt. Das Fortschreiten der Reaktionen wird

dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach beendeter Reaktion das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Das Produktgemisch wird säulenchromatographisch gereinigt, als Hydrobromid gefällt und

ergab Ausbeuten von 12 - 75 %.

Methode B:

Die Methode erfolgte in Analogie zu Methode A, allerdings das Reaktionsgemisch in einem

Bombenrohr auf 80 °C erhitzt. Mit dieser Methode wurden Ausbeuten von 25 – 92 %.

Methode C:

Bei der Mikrowellen-unterstützten Methode wurde zu den Zwischenstufen (2-14) in ACN

2 Äquivalente des entsprechenden Alkylbromids gegeben. Abhängig von der Reaktivität der Edukte

wurde entweder keine Base oder 1 Äquivalent NEt3 oder Hünig-Base zugegeben und das

Reaktionsgemisch in einem Bombenrohr in der Mikrowelle auf 100 °C erhitzt. Das Fortschreiten der

Reaktionen wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Während des Abkühlens fällt das Produkt

entweder direkt als Salz aus, oder es wird mit unpolaren Lösungsmitteln überschichtet und so gefällt.

Durch säulenchromatographische Reinigung wurde die freie Base isoliert und anschließend das

Hydrobromid mit HBr gefällt. Die erzielten Ausbeuten lagen zwischen 13 und 80 %.

3.4.2 NMR-spektroskopische Betrachtungen

Ausgehend von den einfach substituierten Pyridylhydrazonen sind Struktur-relevante Anhaltspunkte

bereits vorgegeben: Weist die Struktur im Pyridylhydrazon Doppelbindungscharakter auf, so sind die

Protonen nicht mehr chemisch äquivalent. Ebenso deutet ein Proton am Hydrazinrest auf eine

E-Isomerie hin (helle Farben). Durch die Substitution am Pyridin wird das Molekül nun in seine

Dihydropyridinform gezwungen, da ansonsten Partialladungen auftreten würden. Diese Struktur wird

durch die chemisch nicht äquivalenten H-Pymeta (hellrot) bestätigt. Aus sterischen Gründen wird davon

ausgegangen, dass das Molekül hauptsächlich in E-Form vorliegt. Zusätzlich erkennt man im 1H-

Spektrum einen weiteren Satz von Signalen (dunkle Farben). Diese entsprechen der Z-Isomerie bzgl.

des Imins (siehe Abb. 34). Die beiden Isomere liegen in diesem Fall in dem Verhältnis 1/5 vor (Z/E).

Betrachtet man die vollständige Substanzbibliothek, so variieren die Verhältnisse von 1/4 - 1/20.

Durch quantenmechanische Berechnungen konnte bestätigt werden, dass die CH=N Bindung, welche

aufgrund der Konjugation nur teilweise Doppelbindungscharakter aufweist, drehbar ist und eine

Rotationsbarriere von 40 kcal/mol aufweist.

SYNTHESE

40

N

NN

N

NN

Py

P h1

Py

Ph1

Ph2

Ph2

Z E

Ab

b. 3

4: V

ergl

eich

der

fre

ien

Bas

e vo

n V

erbi

ndun

g 2A

und

dem

Hyd

robr

omid

.

Nic

ht p

roto

nier

t

Pro

toni

ert

SYNTHESE

41

Eine Drehung um die N-N-Bindung kann ausgeschlossen werden, da es hier zu einem „H-H-Clash“

zwischen dem H-Imin und dem H-Pymeta kommen würde (siehe Abb. 35). Die Berechnungen hierzu

wurden im Arbeitskreis von Prof. Sotriffer, Würzburg, durchgeführt (Software: MOE 2010.10 mit der

Basis MMFF94s; Gaussian 2003 mit der Basis STO-3G und 6-31G).

Abb. 35: „H-H-Clash“ bei einer Drehung um die N-N-Bindung.

Betrachtet man auch hier wieder die protonierte Form der Verbindung, so lassen sich dieselben

Aussagen wie bei den einfach substituierten Pyridylhydrazonen treffen: Die Signale verbreitern und

verschieben sich aufgrund der Ladungsverteilung im Molekül (siehe Abb. 36).

Abb. 36: Verteilung der Ladung in der protonierten Verbindung 2A.

Zusätzlich sind die Protonen am Pyridinring aufgrund des Doppelbindungscharakters der C-N-

Bindung nicht chemisch äquivalent, allerdings liegt hier nur das E-Isomer vor, da dies aufgrund des

zusätzlichen Protons nun sterisch begünstigter ist. Auch hier kann man über ein COSY-Experiment die

stärker Tieffeld-verschobenen H-Py einer „Seite“ am Ring zuordnen, sowie die weniger Tieffeld-

verschobenen H-Py der anderen. Ein NOESY-Experiment bestätigt, dass das zusätzliche Proton an den

Hydrazin-Stickstoff gebunden ist. Auch hier wurde analog zu Kapitel 3.2.5 die Aktivierungsenergie

bzgl. der Rotation um die Bindung zum Hydrazin berechnet, welche für die Verbindung 2A mit

67,9 kJ/mol im gleichen Bereich wie die der Vorstufen liegt.

NN

N

HH

SYNTHESE

42

3.5 Synthese von Keto-Derivaten

Um die Substanzbibliothek zu erweitern, sollten verschiedene Linker an der Pyridinseite eingeführt

werden, die aus einem Spacer mit einer Ketogruppe und einem Phenylrest bestehen (siehe Abb. 37).

Durch Variation der Position am Spacer sollte der Einfluss einer Ketogruppe untersucht werden.

Abb. 37: Struktur der Ketoderivate.

3.5.1 Synthese der Ketogruppe in Benzylposition

Abb. 38: Syntheseschema zur Ketogruppe in Benzylposition.

Das erste Derivat sollte eine direkte Verknüpfung zwischen dem Pyridin-Stickstoff und dem

Benzoylring sein (siehe Abb. 38a)). Die Quarternisierung des Stickstoffs erfolgt hierbei durch eine

nucleophile Substitution des Benzoylchlorids. Das Produkt ist jedoch bei Raumtemperatur nicht stabil,

O

Cl 2

abs. THF-20 0 °C

N

O

R HCl

O

CHCl30 °C rt

Br2 oder I2

O

Br/I 2

abs. THF-20 0 °C

N

R HBr

a)

b)

HO

O

Br

SOCl2

C2O2Cl2

SOBr2

Br

O

Br AlCl3

N

RHBr

O

O

instabil

c)O

Br

abs. THF-20 0 °C/ RF

120 h

2

15a/b (75 %/18 %)

SYNTHESE

43

was auch schon für ähnliche Verbindungen von Voronkov et al.135 beobachtet wurde, und wurde

deshalb nicht weiter untersucht.

Die Acylpyridiniumsalze sollten eine weitere Möglichkeit sein, eine Ketogruppe in die Kette

einzubauen (siehe Abb. 38b)). Hierzu erfolgte ein Synthese nach King et al.,136 wobei in einer

„Eintopf“-Reaktion der Methylrest halogeniert und direkt zur Quarternisierung eingesetzt wird.

Allerdings führte hier weder die direkte Anwendung der Vorschrift, noch die diverse Variationen zum

Erfolg. Auch die Isolierung des Zwischenproduktes137 (15a/b) zeigte keine Verbesserung. Folgende

Veränderungen wurden vorgenommen: Iod wurde gegen Brom ausgetauscht, die Reaktionszeiten und

–temperaturen in einem weiten Bereich verändert und die Lösungsmittel gegen DMF, ACN und

Toluol ausgetauscht. Des Weiteren wurden verschiedene Hilfsbasen zugesetzt (Hünig, NEt3,

Ammoniak). In einem weiteren Schritt wurde die Reaktion in den erwähnten verschiedenen Varianten

in der Mikrowelle durchgeführt und unterschiedliche Aufheizraten, Reaktionsdauer und

Reaktionstemperatur verwendet. Allerdings konnte auch so das Produkt nicht erhalten werden. Ein

Grund für das Misslingen könnte die Substitution des Pyridinring in Position 4 sein, jedoch ist keine

mechanistische Erklärung bekannt.

Die dritte Möglichkeit ist die Position der Ketogruppe mit einer Ethylengruppe zwischen dem Keton

und dem Pyridinring (siehe Abb. 38c)). Das Edukt für die Quarternisierung wird hierbei über eine

Friedel-Crafts-Acylierung von einem Säurehalogenid und Benzol hergestellt.138 Das Säurehalogenid

kann nur als Säurebromid hergestellt werden, da bei der Reaktion von 3-Brompropionsäure mit

Thionylchlorid oder Oxalylchlorid gleichzeitig ein teilweiser Austausch des Bromids gegen ein

Chlorid stattfindet. Leider war es nicht möglich, das Säurebromid an Benzol zu koppeln, da bei der

Reaktion HBr eliminiert wurde.

SYNTHESE

44

3.5.2 Synthese der Ketogruppe mit einem Methylenspacer zum Phenylring

Abb. 39: Syntheseschema 1 für eine Ketogruppe mit jeweils einer Methylengruppe als Spacer.

Die Synthese eines Ketons in -Stellung zum Pyridin (siehe Abb. 39a)) ergab wie in Kapitel 3.5.1

Abb. 38a ein instabiles Produkt, weshalb keine weitere Identifizierung erfolgte.

Die Synthesevariante für 1-Brom-3-phenylaceton (16) erfolgte nach Paul et al.139 (siehe Abb. 39b1)).

Durch den Einsatz von Kupferbromid erhielt man allerdings diverse Bromierungen, wobei es nicht

möglich war, die Produkte voneinander zu trennen. Der zweite Syntheseweg nach Choi et al.140 (siehe

Abb. 39b2)) führte über eine Mehrfachbromierung mit Br2/HBr und einer folgenden selektiven

Debromierung mit Aceton, wodurch das gewünschte Produkt (16) erhalten wurde. Allerdings war es

weder durch klassisches Erhitzen mit Base, noch durch Erhitzen im Bombenrohr, noch in der

Mikrowelle (Methodenbeschreibung siehe Kapitel 3.4.1) möglich, das Produkt 16 an die

Zwischenstufe 2 zu koppeln.

Eine weitere Möglichkeit war eine Ethylengruppe zwischen Pyridin und Keton. Hierfür sollte 4-Brom-

1-phenylbutanon synthetisiert werden. Dazu wurden verschiedene Synthesevarianten getestet (siehe

Abb. 40):

O

CuBr2O O O

Br

Br

Br

Br

1. Br2/HBr

2. AcetonO

Br

a)

b)

2N

RO

16

16 (75 %)

O

Br2

N

RHBr

O

instabil

1)

2)

Br

SYNTHESE

45

Abb. 40: Syntheseschema 2 für eine Ketogruppe mit jeweils einer Methylengruppe als Spacer.

MgBr

MgBr

1) Benzylbromid als Grignardreagenz

O

O

Br

Br

O

Br

OHBr

ON

O

Br

O

Br

2) Alkylrest als Grignardreagenz

Cl

O

BrMgO

Si

BrMgO

BrMg

OH

RR

N

O

BrMgO

Si

BrMgO

BrMg

O

O

R

3) Corey-Seebach

S

S 1. n-BuLi/LDA/t-BuLi

2.

BrO S

SO

HgCl2, Aceton

4) Gilman-van Ess

OH

OLi

O

O

O

O

R

17

18

BrO

Si19

20

21

SYNTHESE

46

Ein möglicher Weg zur Synthese von 4-Brom-1-phenylbutan-2-on ist eine Grignard-Reaktion138 von

Benzylmagnesiumbromid als Grignard-Reagenz und 3-Brompropionylbromid (aus 3-Brompropion-

säure mit Thionylbromid nach138) bzw. 3-Brompropionsäureethylester (17) (aus 3-Brompropionsäure

und Ethanol/ Schwefelsäure nach138) (siehe Abb. 40-1). Hierbei entstand jeweils das zweifach

substituierte Produkt. Auch unter Vorlage der Carbonylstruktur wurde kein einfach substituiertes

Produkt erhalten. Die Umsetzung des Grignard-Reagenz mit 3-Brom-N-methoxy-N-

methylpropanamid (18) (aus 3-Brompropionylbromid und N,O-Dimethylhydroxylamin nach141) – ein

Weinrebamid – sollte aufgrund der schlechteren Abgangsgruppe und des erst bei der Hydrolyse

freigesetztem Keton keine Disubstitution ermöglichen. In diesem Fall wurde aber nur das Edukt

zurück isoliert (siehe Abb. 40-1).

Eine andere Strategie ist den Alkylrest als Grignard-Reagenz einzusetzen. Variiert wurde hierbei mit

verschiedenen Resten am Alkylbromid (tert-Butyldimethylsilylether (19) (aus 2-Bromethanol und

tert-Butyldimethylsilylchlorid mit Imidazol nach142), Ethylether und Alkenylrest). Die Ether reagierten

mit Benzoylchlorid als Carbonylkomponente ebenfalls zum disubstituierten Produkt, während der

Alkenylrest sich in keiner Weise umsetzen ließ. Der Austausch von Benzoylchlorid gegen das

Weinrebamid dazu (20) (aus Phenylacetylchlorid und N,O-Dimethylhydroxylamin nach141) führte

weder mit den Ethern noch mit dem Alkenylrest zu einer Umsetzung (siehe Abb. 40-2). Ein Grund für

die Inaktivität des Alkenylrestes könnte dessen Dimerisierung sein.143

Ein weiterer Ansatz war die Synthese des 4-Brom-1-phenylbutan-2-ons nach Corey-Seebach et al.144

Hierbei wird die Carbonylgruppe mit Hilfe eines Dithiols zum Nucleophil umgepolt

(Phenylacetaldehyd wird mit 1,3-Dithiopropan und Trifluorboran in Diethylether umgesetzt) und

anschließend das Thioacetal mit einer starken Base abgespalten. Zum Einsatz kamen hierbei die Basen

n-BuLi, LDA sowie tert-BuLi, welche aber an der Benzylposition angreifen und somit den

Deprotonierungsschritt am Thioether verhindern. Eine Reaktion zum gewünschten Produkt konnte

deshalb nicht stattfinden (siehe Abb. 40-3).

Als letzte Methode wurde nach Gilman und van-Ess et al.145 vorgegangen (siehe Abb. 40-4). Warum

diese Methode nicht zu dem gewünschten Produkt geführt hat, ist unbekannt.

47

4 BIOLOGISCHE AKTIVITÄT

BIOLOGISCHE AKTIVITÄT

48

4.1 Inhibition der AChE/BuChE-Aktivität

4.1.1 Messverfahren der Cholinesterase-Aktivität

Die Aktivität der AChE bzw. der BuChE wird durch die hydrolytische Spaltung von ACh oder eines

ACh-Analogons bestimmt (siehe Abb. 41). Im Folgenden wird genauer auf die Bestimmung der

Aktivität der AChE eingegangen, da das Messprinzip für die BuChE identisch ist.

Abb. 41: Hydrolytische Spaltung von Acetylcholin zu Essigsäure und Cholin.

Die Aktivität der Acetylcholinesterase kann in verschiedenen Verfahren bestimmt werden. Dazu wird

üblicherweise die Konzentration enzymatisch gebildeter Abbauprodukte des Substrats oder die

Restkonzentration an Substrat bestimmt. Eine Methode ist die „Hestrin‘s-Methode“, die auf der

Umsetzung von unverbrauchtem Acetylcholin mit alkalischer Hydroxylaminlösung zu

Acetylhydroxamsäure und die anschließende Bestimmung der Komplexbildung mit Fe(III), welcher

photometrisch bestimmt werden kann, beruht.146 Eine andere Möglichkeit ist die Quantifizierung der

freigesetzten Essigsäure durch die Messung der pH-Änderung während der Hydrolyse nach Michel.147

Die erstgenannte Methode liefert Ergebnisse, die 10-15 % zu niedrig liegen und die zweite Methode

ist für Mikro-Ansätze nicht geeignet.

Deshalb wird in diesem Fall die Aktivität der AChE bzw. BuChE mittels Ellman’s Test148 bestimmt.

Bei dieser Methode wird Acetylthiocholin (ATC), ein ACh-Analogon, von AChE als Substrat

umgesetzt und mit Wasser zu Essigsäure und Thiocholin gespalten. Das Thiocholin geht eine Reaktion

mit Dithionitrobenzoesäure (DTNB) ein, spaltet die Disulfidbindung und es entsteht das 5-Thio-2-

nitrobenzoat-Anion, welches eine gelbe Farbe hat und spektrophotometrisch detektiert werden kann

(siehe Abb. 42).

Es wird nun in Phosphatpuffer (pH 8) das Enzym mit dem potenziellen Inhibitor vorgelegt und fünf

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird Ellman’s Reagenz (DTNB) zugegeben

und als letzter Schritt, welcher auch die Reaktion startet, ATC zugegeben. Die Absorptionssteigerung

wird bei einer Wellenlänge von 412 nm verfolgt und ist proportional zur AChE-Aktivität. Das

Ausmaß der Reaktion ist bereits mit bloßem Auge zu erkennen; eine schwache bis fast keine Färbung

ist ein Indiz für starke Inhibition.


49

Abb. 42: Farbreaktion des Ellman’s Test.

4.1.2 Berechnung der IC50-Werte

4.1.2.1 Aktivität der AChE

Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ist die Extinktion (Eλ) proportional zur Konzentration (c) (siehe

Gleichung 2)

∙ ∙

Gleichung 2

Es kann deshalb mittels Extinktion die Konzentration an farbigem Produkt berechnet werden. Die

Entstehung des 5-Thio-2-nitrobenzoat-Anions erfolgt in einer Reaktion erster Ordnung (siehe

Gleichung 3), wodurch man indirekt über die Steigung der Absorption den Geschwindigkeits-

koeffizienten (k) der Hydrolyse von ATC erhält.

Gleichung 3

In der folgenden Abbildung (Abb. 43) ist beispielhaft eine Graphik der spektroskopischen Messung

der Verbindung 2A dargestellt:

Eλ = Extinktion ελ = Absorptionskoeffizient c = Konzentration d = Schichtdicke

v = Geschwindigkeit [A] = Konzentration k = Koeffizient


50

Abb. 43: Steigung der Absorption beim Ellman’s Test mit Verbindung 2A

als Inhibitor in verschiedenen Konzentrationen.

4.1.2.2 Sigmoidale Dosis-Wirkungsbeziehung und Richtigkeit des Testsystems

Wird die Steigung einer Gerade mit Inhibitor ins Verhältnis mit dem Geschwindigkeitskoeffizienten

der Reaktion ohne Inhibitor gesetzt, so erhält man prozentuale Aktivitäts- bzw. Inhibitionswerte.

Durch Auftragen dieser gegen den Logarithmus der Konzentrationen des Inhibitors, erhält man eine

sigmoidale Dosis-Wirkungskurve, die die prozentuale Inhibition der AChE bzw. BuChE durch einen

potenziellen Inhibitor (siehe Abb. 44) ausdrückt. Die IC50-Werte wurden mithilfe des

Datenanalyseprogramms Origin® 8.6 berechnet und entsprechen der Konzentration des Hemmstoffes

bei einer 50 %-igen Hemmung. Hierbei wird aus den Dreifachbestimmungen der Mittelwert gebildet

und über einen „sigmoidalen Fit“ die entsprechende Funktion erhalten, aus der dann der IC50-Wert mit

der Abweichung berechnet wird. Über die Ergebnisdatei kann gleichzeitig die Genauigkeit der Kurve

bestimmt werden, was in dem Beispiel von Verbindung 2A (siehe Abb. 44) ein R² von 0.99974 ergibt.

Um genaue Ergebnisse zu erhalten ist es wichtig, dem Programm genügend Daten zur Verfügung

gestellt werden. Insbesondere müssen die Daten einen weiten Konzentrationsbereich abdecken, damit

jeweils die Plateaus erreicht werden und genügend Daten im Bereich der halb-maximalen Hemmung

vorhanden sein, damit die Auswertung sinnvolle Ergebnisse liefert.

Abb. 44: Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve der Verbindung 2A im Ellman’s Test.

0

0.5

1

1.5

2

0 1 2 3 4 5

Abs

orpt

ion

t [min]

Leerwert ohne InhibitorInhibitor (versch. Konz.)Blindwert ohne AChE


51

Als Referenz für die Richtigkeit der Inhibition der AChE im Ellman’s Test wurde der starke AChE-

Inhibitor Tacrin vermessen und mit publizierten IC50-Literaturwerten verglichen, welche sich in einem

weiten Bereich von 0.0098 – 0.05 µM befinden149-152. Die große Abweichung liegt vermutlich an den

unterschiedlichen Versuchsbedingungen (AChE aus verschiedenen Tierspezies). Die erhaltenen IC50-

Werte von 0.045 ± 0.003 µM sind in guter Übereinstimmung mit den Dissertationsarbeiten von Dr. M.

Staudt (0.048 ± 0.001 µM)153 und Dr. P. Kapkovà (0.044 ± 0.004 µM)154, da diese unter gleichen

Bedingungen gearbeitet haben.

4.1.3 AChE/BuChE – Hemmung der 1,4-substituierten Pyridylhydrazon-

Hydrobromide

Die Testungen an der BuChE wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Pia Vuorela an der Abo Akademi

University in Turku, Finnland durchgeführt. Der Test entspricht dem Ellman’s Test148, beschrieben in

Kapitel 4.1.1, wobei AChE durch BuChE ersetzt wurde.116 Um die Struktur-Wirkungsbeziehungen zu

vervollständigen werden neben den hergestellten Verbindungen auch Substanzen aus der Kooperation

mit Dr. Vildan Alptüzün und Sülünay Parlar von der EGE University in Izmir, Türkei (siehe Abb. 45)

mit in die Diskussion aufgenommen und mit * gekennzeichnet.

Abb. 45: Übersicht über die Strukturen von Dr. Vildan Alptüzün und Sülünay Parlar.

Eine Übersicht der Daten ist im Folgenden zu finden (siehe Tabelle 5). Die vollständigen Daten mit

Standardabweichungen sind im Anhang (Kapitel 9.1) zu finden.

O15

NN

NHPy

Ph1

R n

HCl

O

16

Cl

17Br

18 19

20

OH

21

NN

NPy

Ph1

Rn

HBr

mR'

Ph2

P

Cl

Cl

Hemmung der Cholinesterasen AChE und BuChE

R R‘

2 3 4 5 6 15* 7 8 16* 9 10 17* 11 12 18* 19* 20* 13 14 21*

A

12 10 1.29 3.58 2.77

12.5 0.27 2.60 9.63

4.56 >10 >1

0.86 2.40 2.79

6.04 >10 >1

1.63 3.35 2.06

0.12 >10 >1

1.30 2.45 1.88

1.87 8.34 4.46

2.25 1.42 0.63

7.25 >10 >1

3.11 4.22 1.36

6.78 >10 >1

>10 5.71 <1

0.89 >10 >1

1.95 2.99 1.53

2.04 >10 >1

B

1.34 >10 >1

3.52 8.31 2.36

>10 >10

3.26 >10 >1

1.98 8.63 4.34

3.45 9.12 2.64

6.95 >10 >1

2.56 >10 >1

>10 >10

>10 >10

1.71 >10 >1

2.76 >10 >1

C

3.85 >10 >1

4.12 >10 >1

0.24 9.66 40.25

7.84 8.38 1.07

1.25 >10 >1

>10 >10

2.31 1.58 >10 >1

0.83 8.75 10.54

0.51 >10 >1

0.98 7.43

5.60 >10 >1

7.74 1.19 >10 >1

1.21 8.76 7.24

4.98 >10 >1

>10 5.55

0.09 >10 >1

1.98 >10 >1

1.87 >10 >1

D

6.31 >10 >1

2.75 >10 >1

>10 >10 >1

5.32 >10 >1

>10 >10

>10 >10

2.34 >10 >1

3.21 >10 >1

E

>10 >10

8.87 >10 >1

>10 >10

>10 >10

>10 >10

>10 >10

7.67 >10 >1

5.67 >10 >1

F

>10 2.98 1.72 0.58

4.65 >10 >1

G

>10 5.76 >10 >1

H

5.67 >10 >10

0.99 1.64 1.66

2.72 8.18 3.01

I

>10 >10 >10

8.29 6.01 0.72

P*

>10 4.12 <1

>10 1.07 <1

3.84 0.64 6.01

>10 3.64 <1

4.66 >10 >1

3.78 >10 >1

>10 0.63 <1

8.43 1.49 0.18

>10 2.67 <1

>10 3.90 <1

7.89 5.94 0.75

8.95 >10 >1

J

5.78 8.74 4.56

K

>10 8.27 >10 >1

>10 7.31 <1

1.12 2.32 2.07

L

>10 >10

M

>10 2.98 >10 >1

2.49 >10 >1

8.12

N

>10 7.58 9.78 1.29

O

0.82 7.89 9.62

2.32 9.82 4.23

4.17 1.49 1.08 2.82 2.61

1.65

F

Cl

FI

Br

Tabelle 5: IC50-Werte [µM] für die Hemmung der AChE und BuChE, sowie die Selektivität AChE/BuChE.

52

BIO

LO

GIS

CH

E A

KT

IVIT

ÄT


53

4.1.4 Diskussion der Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR)

Ausgehend von einem pH-Wert von 7.4 im Testsystem und einem pKS-Wert der Substanzen von ca.

8.8, ist davon auszugehen, dass der Großteil der Substanzen protoniert vorliegt und somit mit den

Cholinesterasen wechselwirken kann (weitere Details in Kapitel 4.3).

4.1.4.1 Einfluss der Substitution an der Hydrazinyl-Seite (siehe Abb. 46)

Abb. 46: Einfluss des Substituenten an der Hydrazinyl-Seite auf die Cholinesteraseaktivität in

Vergleich zu Verbindung 2A: gefüllter Pfeil AChE, ungefüllter Pfeil BuChE.

Pfeil nach oben: Aktivität steigt; Pfeil nach unten: Aktivität sinkt; Pfeil nach rechts: Aktivität

unverändert.

O

F

F Cl

O2A 3A 4A 5A

7A 11A8A 9A 12A

6A

O2N13A

Cl

Cl10A

14A

NN

N

HBrR

O22A*

O

23A*

Cl

24A*Br

25A* 26A* 27A*

OH

28A*


54

Durch Vergleich der IC50-Werte der Verbindungen der Substanzbibliothek können folgende Struktur-

Wirkungs-Beziehungen formuliert werden (siehe Abb. 46 und Tabelle 5):

a) Eine Verlängerung der Methylenkette zwischen Phenylring und dem Hydrazonrest von Methyl zu

Propyl (2-4) steigert die hemmende Wirkung an der AChE um eine Zehnerpotenz. Der Einfluss auf die

BuChE ist nicht erwähnenswert (z. B. 2C/3C/4C).

b) Die Einführung einer Methoxygruppe in ortho-Position des Phenylrings zeigt keinen Einfluss auf

das inhibitorische Potenzial an der AChE (z. B. 2A, 5A). Sogar der Einfluss einer Diortho-Substitution

ist unwesentlich (15A). Eine Para-methoxy-Substitution jedoch steigert die Wirksamkeit (6A).

Allerdings ist der Effekt nicht immer so ausgeprägt wie in der A-Serie. Die BuChE-Aktivität bleibt

unbeeinflusst.

c) Eine Halogensubstitution (7-10 und 16) steigert die Hemmung an beiden Enzymen. Auch hier hat

eine Disubstitution wieder keinen signifikanten Einfluss (z. B. 10A/10B). Festzuhalten ist, dass die

para-Chlor-substitutierte Verbindung (9A) den besten AChE-Inhibitor darstellt, während ein ortho-

Chlor-substituiertes Molekül (16A) die beste Hemmung an der BuChE zeigt. Dieser Effekt kann nicht

auf die Fluor-substituierten Substanzen übertragen werde, da hierbei die meta-substituierten

Verbindungen beide Enzyme am besten hemmen.

d) Die Methylsubstitution (11, 12, 18, 19) zeigt den gleichen Effekt für die Disubstitution, was eine

niedrigere inhibitorische Aktivität für beide Enzyme bedeutet. (z. B. 19A/B). Die meta-subsituierten

Verbindungen zeigen den größten positive Effekt bezogen auf beide Cholinesterasen (z. B. 11A).

e) Die Einführung einer Hydroxylgruppe (20) induziert einen starken Abfall der hemmenden Wirkung

bei beiden Enzymen (z. B. 17A/B). Ein Grund hierfür könnte sein, dass das phenolische OH bei einem

pH-Wert von 7.4 teilweise deprotoniert wird.

f) Die para-Nitro-substituierten Verbindungen (13) sind die aktivsten der Bibliothek was die AChE

betrifft (z. B. 13C: IC50 = 0.09 µM). Die BuChE-Aktivität bleibt dagegen unberührt.

g) Die Naphthyl-Substitution (14 und 21) zeigen ebenso eine signifikante Selektivität bezüglich der

AChE (14C/21C).


55

4.1.4.2 Einfluss der Substitution an der Pyridin-Seite (siehe Abb. 47)

Abb. 47: Einfluss des Substituenten an der Pyridyl-Seite auf die Cholinesteraseaktivität bzgl.

Verbindung 2A: gefüllter Pfeil AChE, ungefüllter Pfeil BuChE.


unverändert.


56

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5

IC50

[µM

]

Anzahl der C-Atome im Spacer

9A-9E

BuChE

AChE


Wirkungs-Beziehungen formuliert werden (siehe Abb. 47 und Tabelle 5):

a) Die Variation der Kettenlänge zwischen dem Phenylrest und dem Pyridinrest (A-E) zeigte eine

optimale Hemmung der AChE bei einem Propylenlinker. Bezogen auf die BuChE haben die

Verbindungen mit dem kürzesten Spacer, also die Benzylderivate die beste inhibitorische Wirkung,

wobei sie sich nicht sehr von der AChE Hemmung unterscheiden (siehe Abb. 48).

Abb. 48: Korrelation der IC50-Werte für AChE/BuChE und Spacerlänge der Verbindungen 9A-E

modifiziert nach Prinz et al.155 (mit vorläufiger Genehmigung von ACS, Copyright 2012).

b) Eine Halogenierung des Phenylrings (F-I) ergibt im Großen und Ganzen eine verminderte

Inhibition bezogen auf die AChE (z. B. 2F/2G/2I). Die einzige Ausnahme ist die ortho-Brom-

substituierte Verbindung (11H), die beide Enzyme mit einem IC50-Wert von 1 µM hemmt. Von

Bedeutung sind die Dichlor-substituierten Verbindungen, welche selektiv gegenüber der BuChE sind

und nur eine geringe Aktivität an der AChE aufweisen (z. B. 4P/5P)

c) Die Ausweitung des konjugierten Systems mit einem Propylenphenyl-Spacer (O) zeigte eine

verbesserte Aktivität an beiden Enzymen (28O).

d) Alle anderen Derivate wiesen eine Verschlechterung an beiden Enzymen auf (L-N)

4.1.4.3 Selektivität bzgl. AChE/BuChE (siehe Tabelle 5)

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Substanzen beide Cholinesterasen hemmen, wobei die

inhibierende Wirkung auf die AChE etwa eine Zehnerpotenz niedriger – bei etwa 0.5 µM – liegt als

bei der BuChE – 5 µM. In Bezug auf den „multi-target“-Ansatz ist dies ein zufriedenstellendes

Ergebnis, da man auf beide Cholinesterasen einen Einfluss ausüben kann. Interessant ist, dass die

Nitro-Verbindungen 13 relativ selektiv auf die AChE wirken, wobei sie hier durchaus den besseren

Inhibitoren der Bibliothek zuzuordnen sind und auf die Aktivität der BuChE nahezu keinen Einfluss

nehmen. Einen größeren inhibitorischen Einfluss auf die AChE, als auf die BuChE zeigen auch die

Verbindungen, die einen längeren Spacer am Pyridinrest haben (Verbindungen C/D). Den


57

umgekehrten Effekt, d. h. eine bessere Hemmung der BuChE als der AChE zeigen die

dichlorsubstitutierten Verbindungen (P). Es ist also durchaus möglich, mit kleinen strukturellen

Veränderungen die Aktivität an den Cholinesterasen zu steuern und so zwar einen Multi-target-Ansatz

zu verfolgen, aber durch detaillierte SAR erhält man auch ein weitgehendes Verständnis für die

Wirkungsweise an den Cholinesterasen.

4.1.5 Erklärung der SAR anhand der Proteinstruktur von AChE und BuChE

Wie in Kapitel 1.2.2.1 bereits erwähnt, ist der ca. 20 Å tiefe, hydrophobe Furche der AChE, welcher

zum aktiven Zentrum der AChE führt, ein zentrales Strukturelement der AChE. Die aromatischen

Aminosäuren in dieser Furche bilden die Bindungsstelle für quartäre Ammoniumreste.156 Bekannt ist,

dass Hemmstoffe der AChE wie Tacrin oder Donepezil mit Kation-π-Wechselwirkungen zwischen

den protonierten Stickstoffen und Tryptophan (Trp84) und Phenylalanin (Phe330) in diesem Spalt

gebunden werden. Dazu kommen „π-π-stacking“ zwischen den aromatischen Resten der Inhibitoren

und den aromatischen Aminosäuren (Trp84 und Phe330) sowie ionische Wechselwirkungen zwischen

den protonierten Stickstoffen der Hemmstoffe und der anionischen Asparaginsäure (Asp72).157 Für die

Vorläufer der Substanzen 2A-14N, den DUO-Variationen (siehe Abb. 13) gilt, dass sie einen

Benzylrest aufweisen, der das „π-π-stacking“ ausbildet, sowie der geladene Pyridiniumring die

Kation-π-Wechselwirkung, allerdings mit Tyr334 statt mit Trp84, welches dagegen mit dem

Benzylrest am Oxim (DUO) / Hydrazin (diskutierte Substanzen) wechselwirkt.118 Zusätzlich gibt es

eine weitere „face-to-face“-Wechselwirkung (π-π- und Kation-π-Wechselwirkung) zwischen dem

Substituenten des Pyridiniumrings (hier wieder ein Pyridiniumring) und Trp279, welche allerdings

wegen der positiven Ladung räumlich nicht richtig ausgerichtet ist. In den Derivaten 2A-14N ist dieser

Rest nun durch einen ungeladenen aromatischen Rest ausgetauscht und sollte eine bessere

Wechselwirkung aufweisen. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit der hier diskutierten

Verbindungen ist ein vergleichbarer Bindungsmodus wahrscheinlich. Bestätigt wird dies durch die

Nitro-Derivate (13), welche sowohl in den Untersuchungen von Kapkovà et al.118 als auch in diesen

Tests (siehe Tabelle 5) eine höhere inhibitorische Wirkung aufweisen. Des Weiteren besteht für die

Chlor-substituierten Verbindungen laut Kapkovà et al. ein anderer Bindungsmodus, was sich für die

hier diskutierten Verbindungen in der Unterschiedlichkeit der Aktivitäten für diese Substanzen

ausdrücken könnte. Untersucht wurde dies für die Verbindung 4P von Alptüzün et al.,116 wobei

festgestellt wurde, dass der Propylphenylrest nicht die richtige Orientierung aufweist, was aber nicht

zwangsläufig auf die restlichen Verbindungen übertragbar ist (siehe Abb. 49).

Verglichen mit der AChE hat die BuChE einen größeren Spalt der zum aktiven Zentrum führt,

weshalb eine größere Auswahl an Substraten als bei der AChE akzeptiert wird158 (siehe Abb. 50159).

Aufgrund der sehr ähnlichen Struktur des Spalts zum aktiven Zentrum, ist es nicht möglich darauf

aufbauende SAR zu definieren.


58

20 Å

Abb. 49: Schematische Darstellung des Bindemodus einer Beispielsubstanz in der AChE-Bindetasche.

PAS = Periphere anionische Seite; AS = anionische Substratbindestelle; ACS =Acylbindestelle; OH =

Oxyaniontasche; ES = esteratisches Zentrum.118,160,161.

Abb. 50: Stereoansicht der Überlagerung der aktiven Zentren von nativer BuChE (türkis), TcAChE

(blau) und DmAChE (grün).159 Mit freundlicher Genehmigung der American Society for Biochemistry

and Molecular Biology.


59

4.2 Inhibition von Fibrillen

4.2.1 Ansätze zur Messung der Fibrilleninhibition

4.2.1.1 Aß-Peptid und für die Fibrillenbildung entscheidende Aminosäuren

Ausgehend von der Theorie, dass zur Fibrillenbildung bei Aβ nicht das vollständige Peptid

entscheidend ist, sondern nur kleinere Abschnitte davon, wurden die entscheidenden

Aminosäuresequenzen von Tjernberg et al.162 u. a. untersucht. Das Ziel dieser Forschung war

eigentlich die Idee, nachdem die für die Fibrillenbildung verantwortliche Sequenz gefunden ist, ein

Peptid zu entwickeln, welches sich an diese Struktur anlagert und die Fibrillenbildung hemmt. Durch

Bindungsstudien, wie einzelne Aβ-Abschnitte an Aβ binden, konnte die Aminosäuresequenz 16-20 als

Auslöser für die Fibrillenbildung identifiziert werden.162 Wie in der Einleitung bereits beschrieben,

sind jedoch auch noch weitere Aminosäuren (18-26 sowie 31-42) entscheidend an der Stabilität von

Fibrillen beteiligt. Aufgrund der Beobachtung, dass bereits dieses kleine Peptid, bestehend aus fünf

Aminosäuren Aggregate bildet, wurden weitere Experimente durchgeführt, mit dem Ergebnis, das die

kürzeste Fibrillen-bildende Sequenz aus den zehn Aminosäuren Aβ (14-23) besteht.163 Diese Resultate

wurden direkt verwendet und aufgrund des hohen Kostenfaktors für das vollständige Aβ (1-42)

erfolgreich ein neues Testsystem etabliert, bei dem die Fibrillen von einem kürzeren, selbst

synthetisierten Peptid gebildet werden. Auf der Grundlage der hauptverantwortlichen Aminosäuren für

eine mögliche Anlagerung nach Tjernberg et al. (AS 16-20)88 und den mindestens notwendigen

flankierenden Aminosäuren für die Fibrillenbildung (AS 14-23)163 wurde ein Peptid bestehend aus elf

Aminosäuren (13-21) synthetisiert.164 Ausgehend von diesem Peptid und dem vollständigen Aβ (1-42)

wurde jeweils die Möglichkeit der Fibrillenbildung, sowie der Einfluss potenzieller Inhibitoren

gemessen. Nach einer erfolgreichen Übertragung des Testsystems von Aβ (1-42) auf das

Peptid (13-23) wurde im Anschluss die hemmende Wirkung der 1,4-disubstituierten Pyridylhydrazon

Hydrobromide nur noch an diesem gemessen.

4.2.1.1.1 Synthese des verkürzten Peptids

Das Peptid, bestehend aus den Aminosäuren HHQKLVFFAED wurde mit Hilfe einer automatisierten

Peptidsynthese an fester Phase (SPPS: Solid Phase Peptide Synthesis165) hergestellt. Das hier

verwendete Verfahren (siehe Abb. 51) folgte dem Fmoc-Protokoll,166 d. h. die verwendeten

Aminosäuren wurden als Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-geschützte Derivate im vierfachen

Überschuss eingesetzt. Im ersten Schritt wird hierbei eine N-terminal geschützte Aminosäure über ihre

Carboxylgruppe an ein modifiziertes Polymer-Harz (Wang-Harz) gebunden. Im nächsten Schritt wird

die Schutzgruppe der Aminofunktion entfernt, indem mit 20 %iger Piperidin-Lösung gespült wird und

die folgende Aminosäure, die wiederum N-terminal geschützt ist, wird an die erste Aminosäure

gekuppelt. Die Amidkupplung erfolgt über die Säureaktivierung mittels N,N‘-Diisopropyl-

carbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol (DIC/HOBt). Entschützung und Kupplung werden nun so lange

wiederholt, bis die gewünschte Sequenz als harzgebundenes Peptid vorliegt. Im letzten Schritt wird


60

schließlich das Peptid vom Harz abgespalten (TFA/CH2Cl2 = 1:1 mit einem Zusatz von 2,5 %

Triisopropylsilan). Mit Hilfe von Et2O kann das Peptid als Trifluoracetat-Salz ausgefällt und isoliert

werden. Die Vorteile einer automatisierten Synthese sind eine höhere Reinheit und Ausbeute als dies

bei der Synthese in Lösung möglich ist.

Abb. 51: Synthese des verkürzten Peptids mit Hilfe von SPPS.

4.2.1.2 Einfluss der AChE auf die Fibrillenbildung

In senilen Plaques findet man AChE und Aβ kolokalisiert, was darauf beruht, dass amyloide Plaques

außerhalb der Nervenzellen gebildet werden und in diesem Bereich auch hauptsächlich die AChE zu

finden ist.167 Inestrosa et al. untersuchten 1996 den Einfluss von AChE auf die Aβ-Fibrillenbildung,

wobei sich zeigte, dass AChE die Fibrillenbildung steigert.168 Bartolini et al. untersuchten den Einfluss

von AChE-Inhibitoren auf die Fibrillenbildung mit AChE und stellten fest, dass hier eine Inhibition

der AChE mit einer Hemmung der Fibrillenbildung einhergeht. Allerdings gilt das nur für Inhibitoren

der AChE, die an deren periphere anionische Seite (PAS) binden.169 Der Einfluss von 1,4-

substituierten Pyridylhydrazon Hydrobromiden auf die Fibrillenbildung in Kombination mit AChE

wurde beispielhaft für einige Substanzen an Aβ (1-42) untersucht und ergab nur eine sehr geringe

Verbesserung der Fibrillenhemmung. (Daten hierzu sind in Kapitel 4.2.4 zu finden.) Dies ist

verwunderlich, da die Substanzen wie in Kapitel 4.1.5 beschrieben an diese Seite binden. Diese

Unstimmigkeit konnte jedoch bis jetzt nicht geklärt werden.

Eine Übertragung auf das verkürzte Peptid war nicht möglich, d. h. es konnte durch Zugabe von AChE

keine gesteigerte Fibrillenbildung beobachtet werden. Diese Tatsache legt nahe, dass die AChE nicht

die direkt für die Fibrillenbildung verantwortlichen Aminosäuren beeinflusst, sondern dass hier ein

anderer Mechanismus zu Grunde liegt, für welchen eine andere Peptidsequenz nötig ist. Eine


61

Vermutung hierfür wäre eine Wechselwirkung mit den Aminosäuren 31-42, und eine so verursachte

Destabilisierung der Fibrillen. Möglich ist auch, dass eine Kombination aus Aminosäuren des

vollständigen Amyloid β für eine Stabilisierung mit AChE nötig sind.170

4.2.2 Messverfahren der Fibrillen-Konzentration

Die Bestimmung der Aβ-Fibrillen-Konzentration erfolgt mit Hilfe von Farbstoffen, die sich an die

Fibrillen anlagern und dadurch ihre Eigenschaften verändern. Als qualitativer Test für die Existenz

von Fibrillen wird Kongorot eingesetzt, wobei durch die Bindung an die Fibrillen eine optische

Anisotropie induziert wird und das Absorptionsmaximum von 490 nm auf 540 nm steigt.171 Der

Bindungsmechanismus ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wird vermutet, dass zwischen den

zwei negativ geladenen Sulfonatgruppen in Kongorot und zwei positiv geladenen Aminosäurereste

von zwei β-Faltblättern eine ionische Wechselwirkung zustande kommen kann. In diesem Fall liegt

Kongorot senkrecht zum β-Faltblatt und parallel zur Fibrillenachse (siehe Abb. 52 a). Möglich wäre

auch, dass sich Kongorot parallel zwischen die β-Faltblatt-Struktur einlagert und somit senkrecht zur

Fibrillenachse steht (siehe Abb. 52 b).136 Das in seiner Struktur sehr ähnliche Suramin dagegen verhält

sich nicht neutral zur Fibrillenbildung, sondern fördert diese sogar.172,173

Abb. 52: Schematische Darstellung der möglichen Bindungsmodi von Kongorot mit Amyloid -

Fibrillen.

NN

NN

H2N

H2N

SO3-

SO3-

N+

N

N

N

N

H2NNH2

SO3--O3Sa)

b)

Kongorot -Faltblatt

N+

N+


62

Die Quantifizierung der Fibrillen erfolgt mit Hilfe des Farbstoffes Thioflavin T (siehe Abb. 53). Es

ist schon seit ca. 60 Jahren bekannt, dass Thioflavin T an Aβ-Fibrillen174 bindet, allerdings konnte erst

LeVine et al. 1993 den entscheidenden Schritt zur Quantifizierung der Fibrillen machen, in dem er die

Verschiebung des Fluoreszenzmaximums untersuchte.175 Die Methode beruht darauf, dass sich das

Absorptionsmaximum von 412 nm auf 449 nm verschiebt, sobald Thioflavin T an die Fibrillen bindet.

Außerdem ergibt sich bei der Verwendung dieser Wellenlänge als Anregungswellenlänge ein

Emissionsmaximum bei 482 nm. Die entstehende Fluoreszenz und Intensitätszunahme ist proportional

zur Fibrillenkonzentration. Die Veränderung ist darauf zurückzuführen, dass das Molekül in

gebundenem Zustand in seiner Rotationsfreiheit eingeschränkt ist.176 Dabei wird angenommen, dass

hierbei der gleiche Bindungsmodus wie für Kongorot (vgl. Abb. 52b) vorliegt.177 Um die

Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit der Literatur zu erhalten, ist es von entscheidender Bedeutung,

die eingesetzte Konzentration von Aβ entsprechend der Literatur zu wählen (100 µM).

Abb. 53: Struktur von Thioflavin T.

Zur Bestimmung der Aktivität potenzieller Inhibitoren wird folgendermaßen vorgegangen:

Die Inhibitoren werden mit Thioflavin T und ggf. AChE in einem Phosphatpuffer pH 7.4 gemischt.

Anschließend wird Aβ bzw. das verkürzte Peptid zugegeben. Es wird nun die Steigerung der

Fluoreszenzintensität bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm und einer Emissionswellenlänge

von 482 nm über 300 min gemessen.

Im Falle der Bestimmung der Auflösung von bereits aggregiertem Aβ bzw. Peptid wird dieses zuerst

im Puffer mit ThT und ggf. AChE inkubiert (120 min) und anschließend der Inhibitor zugegeben.

Anschließend wird die Abnahme der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm und

einer Emissionswellenlänge von 482 nm über 120 min gemessen.


63

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 50 100 150 200 250 300

Flu

ores

zen

zin

ten

sitä

t

t [min]

Blindwert ohne Aβ

Leerwert ohne Inh.

Inhibitor (versch. Konz.)

4.2.3 Berechnung von IC50-Werten aus dem Thioflavin T – Test

4.2.3.1 Konzentration der Fibrillen

Da die Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Konzentration der Fibrillen ist (siehe Gleichung

4), besteht ein direkter Zusammenhang zwischen gebundenem Thioflavin T und der Konzentration an

Fibrillen.178

~ ∙ ∙

Gleichung 4

Die Konzentration an Fibrillen steigt mit der Zeit an, erreicht ein Maximum und nimmt wieder etwas

ab, da durch die Größe der Fibrillen die Randbereiche, in denen sich ThT einlagern kann, weniger

werden.179 Anschließend bleibt die Fluoreszenz nahezu konstant. Dieser Bereich ab ca. 150 min wird

für die Berechnung herangezogen, um ein möglichst reproduzierbares Ergebnis zu erhalten. In Abb.

54 ist beispielhaft der Verlauf der Fluoreszenzintensität für Verbindung 2A als Inhibitor der

Fibrillenbildung dargestellt. Je höher die Konzentration des Inhibitors ist, desto schwächer die

Fluoreszenz. Es wurden jeweils Zweifachbestimmungen durchgeführt, die gemittelt und anschließend

korrigiert wurden, in dem die Grundfluoreszenz des Puffers ohne Aβ abgezogen wurde. Die so

berechneten Werte wurden mit den Werten, die sich bei Messung der Fibrillen ohne Inhibitor ergaben,

ins Verhältnis gesetzt und so die prozentuale Inhibition bestimmt.

5 µM

50 µM

500 µM

Abb. 54: Verlauf der Fluoreszenzintensität beim ThT-Test mit Verbindung 2A

als Inhibitor in verschiedenen Konzentrationen.

In Analogie hierzu wird die Auflösung bereits vorgebildeter Bestimmung nach 120 min bestimmt.

Iλ = Intensität (λEx = 449 nm, λEm = 482 nm) ε = Koeffizient Q = Quantenausbeute c = Konzentration der Fibrillen


64

4.2.3.2 Sigmoidale Dosis-Wirkungs-Beziehung und Richtigkeit des Testsystems

Die Berechnung der IC50-Werte erfolgt analog zu Kapitel 4.1.2.2.

Der Standardfehler kann hierbei nicht als normale Standardabweichung berechnet werden, da es sich

um eine prozentuale Berechnung handelt und nicht um absolute Werte. Deshalb wurde der

Standardfehler folgendermaßen berechnet (Standardabweichungen der einzelnen Faktoren werden als

Kleinbuchstaben angegeben):180

1) Fluoreszenz Probe (S) – Fluoreszenz Blindwerts (B) = korrigierte Fluoreszenz Probe (Skorr):

2) Fluoreszenz Kontrolle (C) – Fluoreszenz Nullwert (Z) = korrigierte Fluoreszenz Kontrolle (Ckorr):

3) Die Aktivität wurde als Quotient von Skorr und Ckorr berechnet, weshalb dies auch für den

Standardfehler angewendet wurde:

1

Als Referenz für die Richtigkeit der Hemmung der Fibrillenbildung bzw. der Auflösung wurde der

bekannte Inhibitor Curcumin verwendet und mit bekannten IC50-Literaturwerten verglichen. Der

IC50-Wert für die Fibrillenbildung mit Aβ (1-42) liegt laut Literatur bei 0.81 ± 0.0004 µM181, welcher

mit dem hier gemessenen Wert von IC50 = 0.89 ± 0.03 µM gut übereinstimmt. Ebenso stimmen die

Literaturwerte (IC50 = 1.0 ± 0.015 µM181) für die Auflösung von Fibrillen mit den ermittelten (IC50 =

1.21 ± 0.023 µM) überein. Für das verkürzte Peptid wurde ein IC50-Wert von 1.13 ± 0.04 µM für

Inhibition der Fibrillenbildung, sowie ein IC50-Wert von 1.43 ± 0.06 µM für die Auflösung der

Fibrillen ermittelt. Die Werte liegen etwas höher als die mit vollständigem Aβ, sind aber in der

gleichen Größenordnung. Somit kann das verkürzte Peptid anstelle von Aβ verwendet werden.

Für die Fibrillenbildung in Gegenwart von AChE wurde als Referenz Bartolini et al.169 herangezogen

und die optimale Konzentration an AChE übernommen (Verhältnis Aβ/AChE 100/1). Aufgrund der

Vergleichbarkeit mit den bisherigen Messergebnissen wurde nicht der pH-Wert 8.0 wie von Bartolini

et al. verwendet, sondern weiterhin der Phosphatpuffer mit pH = 7.4. Dies führte dazu, dass statt einer

10-fach höheren Aggregation von Aβ in Gegenwart von AChE im Vergleich zur Aggregation von Aβ

ohne AChE, wie von Bartolini et al. beobachtet, nur ein 3-facher Anstieg erreicht wurde. Aufgrund

der Anzahl der bereits vorangegangenen Messungen, des hohen Kostenfaktors von Aβ und des trotz

allem signifikanten Anstieg der Fluoreszenz mit AChE wurden die Testungen nach dieser Methode

durchgeführt.

Der nächste Schritt sollte die Übertragung des Einflusses von AChE auf die Fibrillenbildung von Aβ

auf das verkürzte Peptid (HHQKLVFFAED) sein. Dies konnte allerdings nicht erfolgreich

durchgeführt werden. Trotz pH-Variation sowie Variation der AChE-Konzentration war kein Anstieg

der Fluoreszenz feststellbar. Eine Erklärung hierfür sind die Untersuchungen von Alvarez et al.170,


65

wobei festgestellt wurde, dass für die Bindung der AChE an die Fibrillen mehr als nur die in dem

Peptid vorhandenen Aminosäuren benötigt werden (siehe Kapitel 4.2.1.2).

4.2.4 Fibrillen-Hemmung der 1,4-substituierten Pyridylhydrazon-

Hydrobromide

Die folgende Tabelle (Tabelle 6) zeigt die IC50-Werte ausgewählter Verbindungen jeweils für Aβ, das

kürzere Peptid (HHQKLVFFAED) und den Zusatz von AChE in Kombination mit Bildung bzw.

Auflösung der Fibrillen:

Bildung

der Fibrillen

Auflösung der

Fibrillen

Bildung der

Fibrillen

Auflösung der

Fibrillen

Bildung der

Fibrillen mit AChE

R R‘ Aβ (1-42) Peptid Aβ (1-42) 2A

7.1 ± 1.2

8.7 ± 0.9

10.2 ± 1.1

10.9 ±1.2

6.8 ± 1.0

2C 5.1

±0.8 5.7

±0.9 6.6

±0.9 8.1

±1.1 5.9

±0.9

5C 3.9

±0.9 4.4

±1.1 5.4

±0.8 5.8

±0.9 4.3

±0.7

Tabelle 6: Vergleich der IC50-Werte zwischen Aß, verkürztem Peptid und Zusatz von AChE [µM].

Wie schon bei der Referenzsubstanz Curcumin liegen die IC50-Werte auch hier bei dem verkürzten

Peptid für die Fibrillenbildung, sowie deren Auflösung geringfügig höher als die IC50-Werte für Aβ,

stellen aber keine signifikante Abweichung dar. Die Substanzen bewirken sowohl eine Hemmung der

Fibrillenbildung als auch eine Auflösung bereits gebildeter Fibrillen.

Wie in Tabelle 6 auch zu erkennen ist, weist die Anwesenheit von AChE keinen signifikanten

Unterschied in der Hemmung der Fibrillenbildung durch die Substanzen auf. Eine Erklärung hierfür

konnte nicht gefunden werde, da nach den Bindungsmodus, beschrieben in Kapitel 4.1.5, die

Substanzen an die PAS der AChE binden und wie von Bartolini et al. gezeigt, sollten sich solche

Inhibitoren der AChE auch auf die Fibrillenbildung auswirken.169

Aufgrund des hohen Kostenfaktors wurden die IC50-Werte für die vollständige Substanzbibliothek nur

an dem verkürzten Peptid ermittelt. Die vollständigen Daten mit Standardabweichungen sind im

Anhang (siehe Kapitel 9.1) zu finden. Eine Übersicht über die IC50-Werte ist im Folgenden dargestellt

(Tabelle 7).

Hemmung der Bildung der Peptidfibrillen

R R‘

2 3 4 5 6 15* 7 8 16* 9 10 17* 11 12 18* 19* 20* 13 14 21*

A 10 21 12.5 5.5 35 24 10 5.6 39 14 12 27 14 50 16 15 99 3.6 10 8.9

B 38 46 39 15 130 25 44 58 90 50 23 26

C 6.6 9 8 2.6 1.9 65 2.1 15.5 >100 1.7 4.6 12 3.6 3.9 6.2 65 65 1.6 2.9 13

D >100 89 96 27 >100 >100 18 >100

E 100 130 >100 48 >100 >100 71 >100

F 23 19 12

G 23 >100

H >100 >100 6.7 >100

I >100 >100 >100

P* 9.2 47 32 35 116 >100 >100 >100 26 >100 23 30

J >100 >100 >100

K 21 31 >100 2.5

L >100 95

M >100 45 36 85

N >100 48

O 4.9 3.0 4.4 2.3 7.5 1.4

F

Cl

Tabelle 7: IC50-Werte [µM] für die Hemmung der Peptidfibrillenbildung.

66

FI

Br

BIO

LO

GIS

CH

E A

KT

IVIT

ÄT


67

O

F

F Cl

O2A 3A 4A 5A

7A 11A8A 9A 12A

6A

O2N13A

Cl

Cl10A

14A

NN

N

HBrR

O22A*

O

23A*

Cl

24A*Br

25A* 26A* 27A*

OH

28A*

4.2.5 Diskussion der Struktur-Wirkungs-Beziehungen

Ausgehend von einem pH-Wert von 7.4 im Testsystem und einem pKS-Wert der Substanzen von ca.

8.8, ist davon auszugehen, dass der Großteil der Substanzen protoniert vorliegt (weitere Details in

Kapitel 4.3).


Wirkungs-Beziehungen formuliert werden (siehe Abb. 55):

Abb. 55: Einfluss des Substituenten an der Hydrazinyl-Seite auf die Hemmung der Fibrillenbildung:


unverändert.


68

Einfluss der Substitution an der Hydrazinyl-Seite (siehe Abb. 55):

a) Eine Verlängerung des Spacers (2-4) wirkt sich auf dieser Seite negativ auf die inhibitorische

Wirkung aus (Bsp.: 2C/3C/4C).

b) Halogensubstitutionen am Phenylring zeigen auch einen negativen Einfluss auf die Hemmung

der Fibrillen (Bsp.: 23A/B), wobei hierbei eine Substitution mit Fluor auszuschließen ist

(Bsp.: 7A/8A). Ursächlich könnte der +M-Effekt des Chlorsubstituenten sein.

c) Ortho-disubstituierte Verbindungen am Phenylring weisen ebenso eine verschlechterte

Wirkung auf (Bsp.: 10A).

d) Positiv dagegen erscheint eine Methoxy-Substitution (Bsp.: 5A/5C).

e) Eine Methyl-Substitution wirkt sich allerdings wieder negativ aus (Bsp.: 12A/12B).

f) Eine erweitertes aromatisches System über einen Naphthylrest hat keinen Einfluss auf die

Hemmung (Bsp.: 14A/21A).

g) Eine Nitro-Substitution in para-Stellung zeigt sehr positive Auswirkungen auf die

Fibrillenhemmung (Bsp.: 13A-D). Ursächlich hierfür könnte der ausgeprägte –I-Effekt der

Nitrogruppe sein, welcher ein komplett durchkonjugiertes System fördert.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich ein bis zum Phenylring durchkonjugiertes System

positiv auf die Hemmung der Fibrillen auswirkt. Substituenten mit einem –I-Effekt erweisen sich als

günstig für die Inhibition, während Substituenten mit einem +I- oder einem +M-Effekt eher einen

negativen Einfluss zeigen.


69

Abb. 56: Einfluss des Substituenten an der Pyridyl-Seite auf die Hemmung der Fibrillenbildung: Pfeil

nach oben: Aktivität steigt; Pfeil nach unten: Aktivität sinkt; Pfeil nach rechts: Aktivität unverändert.

Einfluss der Substitution an der Pyridyl-Seite (siehe Abb. 56):

a) Eine Verlängerung des Spacers an dieser Position wirkt sich bis zu einer Kettenlänge von

n = 3 sehr positiv auf die Hemmung der Fibrillen aus (Bsp. 2C/3C/4C). Verlängert man die

Kette weiter, so erhält man wieder erhöhte IC50-Werte (Bsp.: 2D/E).

b) Eine Substitution am Phenylring (F-J) zeigt keinen bis ungünstigen Einfluss auf die

inhibitorische Wirkung.

c) Eine Erweiterung des aromatischen Systems dagegen über die Einführung eines

Phenylethyliden-Restes steigert die Hemmung der Fibrillen (Bsp.: 2O/5O/6O). Ebenso wird

hier wieder ein drei Kohlenstoff langer Spacer erreicht.

d) Die Einführung eines Phthalimids erscheint nicht sinnvoll (Bsp. 2M/2N), wogegen ein

Naphthylrest keinen Einfluss auf die Hemmung zeigt (Bsp.: 2K).


70

Die Interpretation dieser Ergebnisse ist nicht so eindeutig, wie dies auf Hydrazinyl-Seite ist. Dennoch

kann man sagen, dass eine gewisse räumliche Ausbreitung hier entscheidend für die Hemmung ist, da

die inhibitorische Wirkung für jeweils den Spacer mit der Propylengruppe am Ausgeprägtesten ist.

Das System zeigt so gut wie keine Reaktion auf eine Substitution am Aromaten, was vermuten lässt,

dass dies nicht die entscheidende Stelle am Molekül für die Interaktion mit den Fibrillen darstellt.

Zusammenfassend kann man für die Inhibition der Fibrillenbildung sagen, dass ein ausgedehntes

aromatisches System sehr sinnvoll erscheint. Die Substanzen zeigen teilweise 50 %ige Wirkung im

mikromolaren Bereich, was bedeutet, dass auch dieses „Target“ mit den 1,4-substituierte

Pyridylhydrazon-Hydrobromiden erfolgreich inhibiert werden kann.

4.3 Blut-Hirn-Schrankengängigkeit

Damit Wirkstoffe gegen die Alzheimer-Krankheit effektiv wirken können, ist es von entscheidender

Bedeutung, dass sie die Blut-Hirn-Schranke (BBB = Blood-Brain-Barrier) überwinden. Bei der

Entwicklung von Wirkstoffen steht man deshalb vor der Problematik, dass die Substanzen einerseits

hydrophil sein müssen, um über das Blut zum Gehirn transportiert zu werden, andererseits aber

lipophil genug, um die BBB ohne Nutzung eines aktiven Transporters zu überwinden.

Die 1,4-disubstituierten Pyridylhydrazon-Hydrobromide besitzen nun die Möglichkeit bei

physiologischem pH-Wert beide Bedingungen zu erfüllen (siehe Abb. 57). Die berechneten pKS-

Werte liegen zwischen 8.4 und 9.0 (siehe Kapitel 9.3), d. h. ausgehend von einem biologischen pH-

Wert von 7.4 liegen die protonierte und die unprotonierte Form nach der Henderson-Hasselbalch-

Gleichung in einem Verhältnis von ca. 95:5 vor. Unter der Annahme, dass die unprotonierte und damit

lipophilere Form wahrscheinlich die BBB penetrieren kann, können sich die Substanzen im Gehirn

anreichern. Dies gilt es zu prüfen.

LogP-Wert-Betrachtungen stellen eine weitere erste Einschätzung dar. Substanzen, die zentral-nervös

wirken sollen, sollten bei einem Molekülgewicht von ca. 400 g/mol einen logP-Wert von 1.5 bis 2.5

aufweisen. Prinzipiell gilt, je höher der logP-Wert ist, desto wahrscheinlicher findet eine passive

Diffusion ins Gehirn statt.182,183 Aus diesem Grund wurden beispielhaft einige logP-Werte der 1,4-

disubstituierten Pyridylhydrazon Hydrobromide bestimmt.

Abb. 57: Protonierbarkeit der Verbindungen 2A – 22O.


71

4.3.1 Bestimmung der Lipophilie

Der logP-Wert ist der Logarithmus des Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten. Octanol simuliert

die Lipidphase und ein Puffersystem die biologisch wässrige Phase. Die Verteilung einer Substanz in

einem Gemisch dieser beiden Phasen wird nach mehrstündigem Schütteln spektrophotometrisch

gemessen. Da dieses Verfahren sehr zeitaufwändig und schlecht reproduzierbar ist, wurde der logP-

Wert mit Hilfe von HPLC (Hochleistungschromatographie) bestimmt, und zwar indirekt mittels des

Kapazitätsfaktors k‘, welcher mit dem logP-Wert korreliert.184-186 Als Referenzsubstanzen wurden

2-Phenylethanol, Benzol, N,N-Dimethylanilin, Toluol, Biphenyl und Anthracen mit bekannten logP-

Werten im Bereich 1.36 bis 4.45187 von vermessen. Aus diesen Ergebnissen wurde eine

Kalibriergerade (R² = 0.9941) erstellt, mit deren Hilfe die logP-Werte der synthetisierten Substanzen

bestimmt wurden. Sie lagen im Bereich von 4.4 und 6.3.

In der folgenden Tabelle (Tabelle 8) sind beispielhaft ermittelte logP-Werte zusammengefasst

(ausführliche Daten befinden sich in Kapitel 9.3). Die hier untersuchten Substanzen weisen eindeutig

höhere logP-Werte auf (logP >5), als oben beschrieben.183 Die Beschränkung auf logP = <2.5 ist

jedoch nur in Bezug auf die Wasserlöslichkeit zu sehen und die genannte Grenze stellt keine

Einschränkung dar. Der Unterschied in den berechneten (Programm: ChemBioDraw Ultra) und

experimentell bestimmten logP-Werten kommt zustande, weil für die Berechnung der logP-Werte von

der deprotonierten Form ausgegangen wird und die protonierte Form keinen Einfluss darauf nehmen

kann, weil dies mit diesem Programm nicht berechnet werden kann.

Verbindung 2A 2C 5C 10A 10B 10C logP berechnet 4.47 5.17 5.04 5.59 5.87 6.29

logP experimentell 2.89 3.14 2.76 3.44 3.68 3.79 Tabelle 8: Übersicht über die bestimmten logP-Werte.

Es ist allerdings schwierig, allein von den logP-Werten direkt auf eine Blut-Hirn-Schrankengängigkeit

zu schließen. Für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke spielen viele Faktoren eine Rolle. Dazu

zählen mögliche Transporter, eine mögliche Bindung der Substanzen an Proteine oder Größe des

Moleküls.188

4.3.2 Messverfahren zur Blut-Hirn-Schrankengängigkeit

Da die logP-Werte in einem für die BBB-Penetration geeigneten Bereich lagen, wurde die tatsächliche

BBB-Passage mit Hilfe eines Transwell-Assays bestimmt. Die biologischen Untersuchungen hierfür

wurden im Arbeitskreis von Prof. Carola Förster im Universitätsklinikum Würzburg durchgeführt.

Hierzu werden, wie bei Förster et al. beschrieben,189 in einer sog. Transwell-Kammer murine cerebrale

Endothelzellen (cEND) auf Kollagen in einem Nährmedium („Dulbecco’s modified Eagle’s Medium“

(DMEM) mit 2 % fötalem Kälberserum (FCS)) zu einer dichten Schicht angezüchtet (siehe Abb. 58).

Um die Zellpassage der Substanzen zu bestimmen, wird zu den Zellen die Substanz gegeben und nach

4 Stunden jeweils die Konzentration der Substanz oberhalb und unterhalb der Zellschicht mittels

HPLC (RP18-Säule, Puffer (8.13 mM, pH 3.0/MeOH 35/65)) bestimmt.


72

0

5

10

Übe

rsta

nd

nur

Fil

ter

mit

Kol

lage

n

mit

Zel

len1

mit

Zel

len2

Flä

che

x 10

000

2A

2C

5C

Abb. 58: Schematische Darstellung des Aufbaus einer „Transwell-Kammer“.

Es wird eine Kalibriergerade der zu untersuchenden Substanz erstellt und mit Hilfe dieser jeweils die

Konzentration in den einzelnen Kammern des Systems bestimmt. Die Kalibriergerade lieferten in

jedem Fall ein R2 > 0.997 (siehe Kapitel 7.2.5.2).

Da die Addition der Substanzmenge in der inneren und äußeren Kammer nicht die ursprünglich

eingesetzte Menge ergab, wurde davon ausgegangen, dass die Verbindungen an die Kammerwand und

den Filter adhärieren (siehe Abb. 59). Die Transwellplatten und -einsätze bestehen aus Polystyrol

(PS), der Filter selbst aus Polyethylenterphthalat (PET). Leider war es nicht möglich, durch ein

Austauschen der Materialien die Adhäsion zu reduzieren. Die Substanzen adhärieren an Polypropylen

oder Polycarbonat genauso wie an PS. Teflon-beschichtete Transwells standen nicht zur Verfügung.

Abb. 59: Veranschaulichung der Adhäsion an den Filter / Transwell-Wand: Bereits der Filter allein

stellt laut dieser Darstellung den größten Widerstand für die Zellen dar, weswegen von Adhäsion

ausgegangen werden muss.


73

Aus diesem Grund wurde die Berechnungsgrundlage verändert und die Verhältnisse zwischen der

prozentualen Durchlässigkeit mit und ohne Zellen berechnet (siehe Gleichung 5).

% ä ß

ß

∙ 100

Gleichung 5

Der normalisierte Durchgang durch die Zellen in Prozent ist in folgender Tabelle (Tabelle 9)

dargestellt:

2A 2C 5C % 86 92 89

Tabelle 9: prozentualer Durchgang der Verbindungen durch die Zellen.

Aufgrund dieser hohen Prozentwerte kann man sagen, dass die die Durchgängigkeit durch die Zellen

gewährleistet ist. Daraus wiederum kann man schließen, dass die Substanzen die BBB tatsächlich

überwinden können und ihre Wirkung im Gehirn erzielen.

4.3.3 Mögliche Auswirkungen der Adhäsion an Polymere

Aufgrund des Auftretens der Adhäsion in diesem Versuch, muss man sich Gedanken machen,

inwieweit diese Ergebnisse Auswirkungen auf die anderen Testsysteme haben, die zur Bestimmung

der AChE/BuChE-Hemmung oder der Fibrillenbildungsinhibition verwendet wurden. Während der

Testungen mit diesen Assays sind keine ähnlichen Effekte aufgefallen. Allerdings kann nicht mit

Sicherheit ausgeschlossen werden, dass diese dort nicht auch auftreten. Um eine konkrete Aussage

bezüglich dieser anderen Testsysteme treffen zu können, müsste dies noch genauer untersucht werden.

4.4 ROS-Testung

4.4.1 ROS-Hemmung

Oxidativer Stress und die Bildung von „reactive oxygen species“ (ROS) wirken neurotoxisch. Auch

bei der Alzheimer-Krankheit entstehen Glutamat-induziert ROS.190 Mit Hilfe eines Dichlorfluorescein-

Assays (DCF-Assay) kann die Konzentration vorhandener ROS in Synaptosomen gemessen

werden.191 Dabei wird Dichlordihydrofluorescein-diacetat (DCFH-DA) zu Synaptosomen gegeben.

Durch in den Zellen vorhandene Esterasen wird der Ester in DCFH-DA gespalten und das entstehende

Dichlordihydrofluorescein (DCFH) wird von ROS zu DCF oxidiert, welches fluoresziert. Über die

Fluoreszenzintensität kann indirekt die Menge an ROS gemessen werden (siehe Abb. 60). Gibt man

nun einen potenziellen ROS-Inhibitor zu, so tritt eine verringerte Fluoreszenz auf.

cmit = Konzentration mit Zellen cohne = Konzentration ohne Zellen


74

Abb. 60: Schematische Darstellung des DCF-Assays.

Die Testungen wurden im Arbeitskreis von Prof. Ayfer Yalçin in Izmir, Türkei, durchgeführt.

Beispielhafte Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle (Tabelle 10) angegeben. Die vollständigen

Daten befinden sich im Anhang (Kapitel 9.2). In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden,

dass die Substanzen eine Hemmung zwischen 2 und 20 % für cInh = 0.1 mM und zwischen 10 und 40

% für cInh = 1 mM aufweisen. Dies ist zwar ein geringer, aber doch signifikanter Effekt.

% Hemmung der ROS-Produktion (cInh = 0.1 mM)

R R‘

2A

77.25

2C

73.13

5C

67.15

Tabelle 10: % Hemmung der ROS-Produktion bei einer Inhibitorkonzentration von 0.1 mM.

COOH

O O O

ClClOO

COOH

HO O OH

ClClEsterase

ROS

COOH

HO O O

ClCl

DCFH-DA DCFH

DCF - f luoreszierend


75

4.4.2 Hemmung der Lipidperoxidation (LP)

Eine andere Methode zur Messung einer verminderten ROS-Konzentration ist die Bestimmung der

Konzentration von Malondialdehyd (MDA) nach Draper und Hadley,192 welcher das Endprodukt der

Lipidperoxidation darstellt. Das Prinzip der Methode besteht darin, den Farbstoff, der durch die

Reaktion von Thiobarbitursäure (TBA) und MDA entsteht, spektrophotometrisch zu erfassen.

Die Testungen wurden ebenfalls im Arbeitskreis von Prof. Ayfer Yalçin in Izmir, Türkei,

durchgeführt. Die vollständigen Daten befinden sich im Anhang (Kapitel 9.2)

Zusammengefasst kann man sagen, dass die Substanzen eine Hemmung unter 10 % für cInh = 0.1 mM

und zwischen 30 und 50 % für cInh = 1 mM aufweisen. Dies ist ebenfalls ein geringer, jedoch

signifikanter Effekt.

4.5 Aktivität in Zellen

Mitochondrien spielen die Hauptrolle der Zellorganellen im Alterungsprozess - sie sind die

Hauptenergiequelle der Zellen aufgrund der zentralen Rolle bei der ATP (Adenosintriphosphat)-

Produktion, Hauptquelle von physiologisch verursachtem oxidativem Stress und kritische Regulatoren

der Apoptose während des Alterns.193 Die mitochondriale Dysfunktion ist Teil der AD.194

Um zu untersuchen, ob die Substanzen auch einen Einfluss auf lebende Zellen haben, d. h., ob sie

tatsächlich in die Zellen migrieren und dort die Aß-Fibrillenbildung und die AChE inhibieren, wurden

sie zu transfizierten HEK-Zellen gegeben. Die Wirksamkeit wird einerseits durch die positive

Auswirkung auf das mitochondriale Membranpotenzial nachgewiesen und andererseits durch

steigende ATP-Level in der Zelle. Die zugehörigen Untersuchungen wurden in dem Arbeitskreis von

Prof. Kristina Leuner in Erlangen bzw. Frankfurt/Main durchgeführt.

Erste Testungen wurden mit den Verbindungen 2B, 4C, 9F, 10C, 11A durchgeführt. Dabei zeigten 4C

und 9F Aktivität. Um genauere Aussagen treffen zu können, sind allerdings weitere Experimente

nötig, die im Moment durchgeführt werden.

76

5 ZUSAMMENFASSUNG

ZUSAMMENFASSUNG

77

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und biologischen Testung von Anti-Alzheimer-

Substanzen, die nicht nur auf einen Angriffspunkt der Krankheit abzielen, sondern an mehreren

krankheitsauslösenden bzw. krankheitsfördernden Punkten inhibierend wirken können. Zurzeit gibt es

keinen Wirkstoff, der die Alzheimer-Krankheit heilt. Die Wirkstoffe, die auf dem Markt sind, wirken

nur symptomatisch und können den Krankheitsverlauf höchstens verlangsamen. Zu den wichtigsten

verfügbaren Arzneimitteln gehören die Acetylcholinesterasehemmer Donezepil, Rivastigmin und

Galantamin. Es zeigte sich jedoch, dass allein durch die Hemmung der Acetylcholinesterase nicht die

erwartete Verbesserung im Krankheitsbild eintrat. Aktuell wird vermehrt an Muskarin-Rezeptor-

Modulatoren geforscht, welche ebenfalls die Konzentration an ACh ansteigen lassen sollen.

Pathologisch von Bedeutung sind bei der Alzheimer-Krankheit einerseits Neurofibrillen, die aus

aggregiertem, d. h. hyperphosphoryliertem -Protein bestehen und sich innerhalb der Neuronen

befinden, sowie amyloide Plaques, welche hauptsächlich aus dem Peptid Amyloid-β (1-42) bestehen

und sich außerhalb der Neuronen ablagern. Aus diesen Fakten lassen sich schon mehrere

Angriffspunkte für neue Wirkstoffe ableiten. Ein Weg besteht darin, in die Bildung der Ablagerungen

einzugreifen oder bereits gebildete Plaques wieder aufzulösen, wobei man beachten muss, dass

Neurofibrillen und amyloide Plaques unterschiedliche Strukturen besitzen. Für das -Protein wäre eine

Möglichkeit, in Phosphorylierung einzugreifen und hier bestimmte Phosphatasen zu hemmen. Der

Schwerpunkt der Arbeit lag aber auf die Hemmung der Aβ-Fibrillen ausgerichtet. Auch hier gibt es die

Möglichkeit, bereits in der Bildung von Aβ (1-42) einzugreifen, welches aus dem Amyloid-Precursor-

Protein gebildet. Hierbei gibt es einen nicht-pathogenen Weg, welcher mit Hilfe von - und γ-

Sekretase das APP spaltet und zu nicht amyloiden Peptiden führt, sowie den pathogenen Weg, welcher

durch die Spaltung des APP durch β- und γ-Sekretase zu Amyloidfibrillen führt. Für die

Zusammenlagerung des Peptides Aβ (1-42) ist hauptsächlich eine nur aus fünf Aminosäure bestehende

Sequenz verantwortlich: Die Aminosäuren KLVFF. Die in dieser Arbeit synthetisierten Verbindung

greifen an diesem Punkt an.

Zusätzlich ist aber auch immer noch die Hemmung der Acetylcholinesterase von entscheidender

Bedeutung. Aufgrund der verminderten Acetylcholinkonzentration bei der Alzheimer-Krankheit ist

eine Hemmung der Acetylcholinesterase unabdingbar. Aufgrund des reduzierten Vorkommens von

Acetylcholinesterase im Gehirn bei der Alzheimer-Krankheit ist auch die Butyrylcholinesterase ein

wichtiger Angriffspunkt. Deshalb war es auch Ziel dieser Arbeit zusätzlich diese beiden „Targets“ zu

adressieren.

Einen weiteren Beitrag zum vermehrten Sterben von Neuronen leisten die reaktiven Sauerstoffspezies

(ROS), die im Verlauf der Alzheimer-Krankheit vermehrt gebildet werden. Die Hemmung der ROS

weist einen protektiven Effekt für die Neuronen auf. Deshalb wurden die Substanzen auf ihre

Fähigkeit, ROS zu hemmen, getestet.

Als Leitstruktur dienten bereits bekannte Acetylcholinesteraseinhibitoren der DUO-Reihe, welche

sukzessive abgewandelt wurden, bis die entscheidenden Strukturmerkmale für eine

ZUSAMMENFASSUNG

78

Acetylcholinesterasehemmung herausgefiltert waren. Wichtig für die Interaktion mit der

Acetylcholinesterase ist ein quartärer Stickstoff sowie aromatische Reste in seiner näheren Umgebung.

Durch die Pyridylen-Hydrazone ist dies gewährleistet. Aufgrund dessen wurde eine

Substanzbibliothek synthetisiert, die nun die Acetylcholinesterasehemmung mit einer Inhibition der

Fibrillenbildung verbindet (siehe Abb. 61).

Westlich Östlich

Abb. 61: Synthetisierte Verbindungen.

Der Syntheseweg zu den Zielverbindungen ist in Abb. 62 dargestellt. Aus 4-Chlorpyridin-

Hydrochlorid wurde zuerst die freie Base freigesetzt und diese mit Hydrazin-Hydrochlorid zu

4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid umgesetzt. Dieses reagierte im nächsten Schritt mit dem

entsprechenden Aldehyd in einer SN2-Reaktion zu den Zwischenstufen 2-14, die nun einen variablen

Rest an der Hydrazinylgruppe tragen. Im letzten Schritt erfolgte die Quarternisierung mit Hilfe des

entsprechenden Alkylbromids, wodurch am Pyridylrest derivatisiert wurde und schlussendlich die

Verbindungen 2A-14O erhalten wurden. Dieser letzte Schritt, welcher anfangs durch klassische

Erhitzung zum Rückfluss in DMF durchgeführt wurde, konnte zuerst durch die Durchführung im

Bombenrohr zeitlich verkürzt werden und schließlich in der Mikrowelle optimiert werden, was zu

einer Reduktion der Reaktionszeit von 500 h auf 3 h führte.

2-4

14

R1

R1 = Hal, Me, OMe, NO25 - 13

R =

n = 0-2

n

A - E

K

N

O

O

L

M, N

n

n = 1 - 5

R2

R2 = Hal, MeF - J

n

n = 3, 5

R' =

O

ZUSAMMENFASSUNG

79

Abb. 62: Syntheseschema zu den Verbindungen 2A-14O.

Die Testung der Substanzen bezüglich ihrer AChE- und BuChE-Hemmung erfolgte mittels Ellman’s

Test. Die Messungen ergaben folgende Struktur-Wirkungsbeziehungen: Fast alles Substanzen

hemmen die Acetylcholinesterase in niedrigen mikromolaren bis hin zu nanomolaren

Konzentrationen. Die IC50-Werte für die Butyrylcholinesterase liegen durchschnittlich eine

Zehnerpotenz höher. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Verlängerung des Spacers zwischen

Phenylring und Hydrazonrest (westliches Molekülende) sich positiv auf die inhibitorische Wirkung an

beiden Enzymen auswirkt. Eine para-Nitro-Substitution steigert die Inhibition an der AChE zu den

aktivsten Substanzen der Bibliothek (z. B. 13C: IC50 (AChE) = 0.09 µM; IC50 (BuChE) = >10 µM).

Die Aktivität an der BuChE bleibt davon unbeeinflusst, was dieses Substitutionsmuster zu AChE-

selektiven Inhibitoren werden lässt. Auch die Naphthyl-substituierten Derivate weisen eine

Selektivität bzgl. der AChE auf. Die Substituentenvariationen am Pyridinrest der Substanzen

(östliches Molekülende) zeigten, dass ein Propylenspacer sich positiv auf die Hemmung der AChE

auswirkt, jedoch nicht auf die BuChE, wobei die Unterschiede zwar signifikant, aber nicht

entscheidend sind. Eine Dichlorsubstitution am Phenylrest auf dieser Seite zeigt eine Selektivität bzgl.

BuChE (z. B. 5J: IC50 (AChE) = 3.84 µM; IC50 (BuChE) = >0.64 µM).

Für die Testung der hemmenden Wirkung bezüglich der Fibrillen wurde zuerst das Testsystem mit Aβ

(1-42) aufgebaut und anschließend auf ein verkürztes, elf Aminosäuren langes Peptid

(HHQKLVFFAED), das mit Hilfe eine Peptidsynthesizers hergestellt wurde, übertragen. Die Methode

beruht darauf, dass sich das Absorptionsmaximum von zugesetztem Thioflavin T von 412 nm nach

449 nm verschiebt, sobald Thioflavin T an die Fibrillen bindet. Die entstehende Fluoreszenz bei 482

nm (Emissionsmaximum) ist proportional zur Fibrillenkonzentration. Eine verminderte Fluoreszenz

zeigt somit eine Hemmung der Fibrillenbildung an. Als Referenzsubstanz dient Curcumin. Es gibt nun

zwei Möglichkeiten zur Durchführung des Tests: Einerseits kann die Hemmung der Fibrillenbildung

gemessen werden, indem zeitgleich zum Peptid Inhibitor zugegeben wird, andererseits kann auch die

Auflösung bereits bestehender Fibrillen gemessen werden, indem erst später Inhibitor zugesetzt wird.

Für die hier untersuchten Substanzen lieferte die Untersuchung sehr ähnliche IC50-Werte für beide

ZUSAMMENFASSUNG

80

Methoden, und zwar IC50-Werte von 1 bis 100 µM. Erwähnenswert ist, dass ein Spacer zwischen dem

Phenylring und dem Pyridylring mit einer Länge einer Propylengruppe sich als optimal erwiesen hat.

Dabei spielt es keine Rolle, ob der Spacer aus Einfachbindungen (Bsp: 13C: IC50 = 1.6 µM) oder einer

zusätzlichen Doppelbindung besteht (Bsp: 13O: IC50 = 1.4 µM).

Nimmt man nun wieder Bezug auf den „Multi-target-Ansatz“, so lassen sich folgende Ergebnisse

festhalten: Die Verbindung eines elektronen-ziehenden Substituenten am Phenylring an der

Hydrazonseite mit einem Propylrest zwischen dem Phenylring und dem Pyridinrest ist vorteilhaft für

die Kombination der Hemmung der Acetylcholinesterase und der Inhibiton der Aβ-Fibrillen (vgl.

13C). Während viele Substanzen selektiv gegenüber der Acetylcholinesterase sind, gibt es nur wenige,

die selektiv die Butyrylcholinesterase hemmen. Eine Hemmung aller drei Angriffspunkte im niedrigen

mikromolaren Bereich zeigten nur wenige Substanzen, und zwar die Verbindung mit jeweils einem

Naphthylrest sowohl an der Hydrazon- als auch der Pyridin-Seite (14K: IC50 (AChE) = 1.12 µM; IC50

(BuChE) = 2.32 µM; IC50 (Fibrillen) = 2.5 µM).

Zusätzlich wurden die Substanzen auf eine mögliche ROS-Hemmung von Kooperationspartnern

getestet. Sie zeigten einen kleinen aber signifikanten Beitrag zur Reduzierung der ROS.

Um erfolgreiche Wirkstoffe gegen die Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, ist deren Blut-Hirn-

Schrankengängigkeit von entscheidender Bedeutung. Deshalb wurde von den Substanzen mittels

HPLC der logP-Wert bestimmt. Die logP-Werte der Substanzen liegen in einem Bereich von 3.2 bis

4.4. Aufgrund dieser Ergebnisse und der berechneten pKS-Werte, welche im Bereich von 8.3 bis 10.2

liegen, kann davon ausgegangen werden, dass die Substanzen auf Grund der „sink“-Bedingungen die

Blut-Hirn-Schranke überqueren können. Um eine definitive Aussage zur Blut-Hirn-

Schrankengängigkeit treffen zu können, wurde ein Transwell-System mit cerebralen Endothelzellen

entwickelt, die die Blut-Hirn-Schranke simulieren. Die Endothelzellen bilden hierbei eine dichte

Monoschicht auf dem Filter aus, wobei die Substanzen nicht zwischen den Zellen hindurch

diffundieren können, sondern den Weg durch die Zelle nehmen müssen. Die Messungen ergaben, dass

die Substanzen zu ca. 90 % durch die Zellen diffundieren können und somit erfolgreich die Blut-Hirn-

Schranke überqueren können.

81

6 SUMMARY

SUMMARY

82

The thesis is dealing with the synthesis and biological evaluation of substances combating

Alzheimer’s disease by using a multi-target approach. Currently no active substance is available which

is able to treat Alzheimer’s disease. Drugs on the market act symptomatically only and at most slow

down the course of the disease. Most of them are the acetylcholinesterase inhibitors donezepil,

rivastigmine and galantamine. However, they revealed, that inhibiting the acetylcholinesterase does

not significantly improve the disease. A new approach are muscarinic receptor modulators which

should increase the ACh concentration.

Two pathological main findings govern Alzheimer’s disease: The neurofibrils, consisting of

aggregated hyperphosphorylated -proteins which are; the amyloid plaques, which are generally

formed by the peptide amyloid β (1-42), sedimenting in the exterior of neurons. These facts define the

targets: 1) the fibrils whose formation can be prevented and redissolving of prebuild plaques or fibrils.

2) the -protein whose phosphorylation can be avoided by inhibiting particular phosphatases. Though,

the main focus of the thesis was the inhibition of Aβ-fibrils. There is the chance to inhibit directly the

formation of Aβ (1-42), which governed by the cleavage product of amyloid-precursor-protein (APP).

There are two ways of APP-cleavage: In the non-pathogenic way, - and γ-secretase split Aβ to non-

amyloidogenic products. The pathogenic way leads to amyloid fibrils as APP is cleaved by β- und γ-

secretase. Responsible for the assembly of the peptide Aβ (1-42) is in principal a sequence consisting

of only five amino acids: KLVFF, which is the target of the compounds in this study.

Additionally, the inhibition of the acetylcholinesterase is still of importance. Regarding the reduced

concentration of acetylcholinesterase in the brain of Alzheimer patients, an inhibition of

acetylcholinesterase is very important in order to increase the ACh concentration. As the concentration

of acetylcholinesterase in AD brain is less than in healthy brain and butyrylcholinesterase

concentration is increased, also butyrylcholinesterase is an important target. Thus, the aim of this work

was to address both cholinesterases.

The reactive oxygen species (ROS), which augment during the course of AD, also contribute to an

increased death of neuronal cells. Inhibiting ROS shows a protecting effect on neurons, thus the

synthesized compounds were also tested on ROS inhibition.

Starting point was the lead structure of the known acetylcholinesterase inhibitors of the DUO-series,

which was successively modified to filter the crucial structural characteristics of the inhibition of

acetylcholinesterase. Important for the interaction with acetylcholinesterase is a quaternary nitrogen as

well as an aromatic moiety nearby. This is combined in the pyridylene-hydrazones. Therefore a library

of substances has been synthesized and evaluated for the inhibition of acetylcholinesterase and fibril

formation. (See Figure 1).

SUMMARY

83

Western Eastern

Figure 1: Synthesized compounds.

The synthesis pathway is illustrated in Figure 2. The free base of 4-chloropyridine-hydrochloride was

produced and reacted with hydrazine-hydrochloride to give 4-hydrazinylpyridine-hydrochloride. Next,

a corresponding aldehyde was added and the intermediates 2-14 including a variable moiety on the

side of the hydrazinyl-group, were formed by a SN2-reaction. Finally the quaternization reaction with

the corresponding alkylbromide was performed in order to introduce the residues at the side of the

pyridyl moiety to achieve the final compounds 2A-14O. This step was carried out by classical heating

to reflux in DMF, but could be improved by carrying out the reaction in a pressure vessel and even

better in the microwave; here the reaction time could be reduced from 500 h to 3 h.

2-4

14

R1

R1 = Hal, Me, OMe, NO25 - 13

R =

n = 0-2

n

A - E

K

N

O

O

L

M, N

n

n = 1 - 5

R2

R2 = Hal, MeF - J

n

n = 3, 5

R' =

O

SUMMARY

84

Figure 2: Synthetic scheme of the compounds 2A-14O.

The inhibitory activity of the compounds towards AChE and BuChE were performed with Ellman’s

test. The following structure-activity-relationships could be derived: Almost all substances inhibit the

acetylcholinesterase in a low micromolar to a nanomolar range of concentration. The IC50 value for

butyrylcholinesterase is about one order of magnitude higher. With regard to the AChE, the

enlargement of the spacer between the phenyl ring and the hydrazone rest (western part of the

molecule) has a positive influence on the inhibitory activity on both enzymes. A para-nitro-

substitution increases the inhibition at AChE and gives the most active substances of the library. (e. g.

13C: IC50 (AChE) = 0.09 µM; IC50 (BuChE) = >10 µM). The activity against the BuChE is not

affected. Thus, the compounds are to selective inhibitors of the AChE. The naphthyl-substituted

derivatives show some selectivity towards AChE, too. Variations of the substituents at the pyridyl part

(eastern part of the molecule) revealed that a spacer consisting of a propylene group has a very

positive influence on the inhibition of AChE, but not of the BuChE. The differences are significant,

but not essential. A dichloro-substitution at the phenyl moiety at this part of the molecules shows

selectivity with regard to BuChE. (e. g. 5J: IC50 (AChE) = 3.84 µM; IC50 (BuChE) = >0.64 µM).

In order to determine the inhibition of fibril formation, the Thioflavin T assay was first established

with Aβ (1-42) and afterwards transferred to a shortened peptide containing only eleven amino acids

(HHQKLVFFAED). This peptide was synthesized with a peptide synthesizer. The assay is based on a

shift of the maximum of absorption of Thioflavin T from 412 nm to 449 nm when it is bound to the

fibrils. The generated fluorescence at 482 nm (maximum of emission) is proportional to the

concentration of fibrils. Thus, a reduced fluorescence indicates an inhibition of fibril formation. There

are two possibilities to carry out the test: On the one hand, the fibril formation can be determined

while the inhibitor is added simultaneously. On the other hand, fibril disaggregation can be measured

by adding the inhibitor after the fibrils have already been formed. With regard to the substances

studied here the IC50-values for both methods were quite similar and resulted in IC50-values of 1 to

100 µM. Of note, best activity was found for compounds consisting of a spacer with the length of a

propylen group between the phenyl ring and the pyridyl ring. It does not matter, whether the spacer

SUMMARY

85

consists of single bonds (e. g. 13C: IC50 = 1.6 µM) or an additional double bond (Bsp: 13O: IC50 = 1.4

µM).

In summary, combining an electron-withdrawing substituent at the phenyl ring on the site of the

hydrazon with a propylene spacer between the phenyl ring an the pyridyl rest is of advantage when

both targets – acetylcholinesterase and Aβ fibril formation – should be equally inhibited (see 13C).

While many substances are selective towards acetylcholinesterase, only a few inhibit the

butyrylcholinesterase selectively. An inhibition of all of the three targets in a low micromolar range of

concentration could only be revealed for few compounds, e. g. for compound 14K with naphthyl-

substitution on both sides: IC50 (AChE) = 1.12 µM; IC50 (BuChE) = 2.32 µM; IC50 (fibrils) = 2.5 µM).

Additionally the substances were tested on a possible ROS-inhibition, however, they showed only

little, but significant influence on a reduced production of ROS.

In order to develop successfully new compounds against Alzheimer’s disease, their blood-brain-

penetration is very important. For this reason the logP-value of the substances has been determined by

a HPLC method. The logP-values range from 3.2 to 4.4. Due to these results and the calculated pKA-

values, which ranged between 8.3 and 10.2, it can be assumed that the substances are able to cross the

blood-brain-barrier because of sink-conditions. In order to verify this statement, a transwell-assay with

cerebral endothelial cell monolayer has been developed to simulate the blood-brain-barrier. The

measurements of some representative compounds revealed a diffusion rate through the cells of about

90 %, indicating the blood-brain-penetration of the compounds.

86

7 EXPERIMENTELLER TEIL

EXPERIMENTELLER TEIL

87

7.1 Synthese

7.1.1 Allgemeine Angaben

7.1.1.1 Verwendete Geräte

Schmelzpunkte:

Schmelzpunktapparatur MPD350:BM 3.5, Fa. Sanyo Gallenkamp BV, Holland.

Alle angegebenen Schmelzpunkte sind unkorrigiert.

IR-Spektren:

Jasco FT-IR-Spektrometer 6100, Fa. Jasco GmbH, Gross-Umstadt, Deutschland.

Alle Spektren wurden mit einer Diamant-ATR-Einheit aufgenommen.

Die Banden sind in cm-1 angegeben.

1H-NMR-Spektren:

Bruker Kernresonanzspektrometer AV 400 (400.132 MHz),

Fa. Bruker BioSpin MRI GmbH, Ettlingen, Deutschland.

Als interner Standard werden die Mittelpunkte der Restsignale der deuterierten Lösungsmittel

verwendet (DMSO-d6: 2.50 ppm). 13C-NMR-Spektren:

Bruker Kernresonanzspektrometer AV 400 (100.613 MHz),

Fa. Bruker BioSpin MRI GmbH, Ettlingen, Deutschland.

Als interner Standard werden die Mittelpunkte der Restsignale der deuterierten Lösungsmittel

verwendet (DMSO-d6: 39.52 ppm).

Zur Beschreibung der Multiplizität (M) der spektroskopischen Daten werden folgende Abkürzungen

verwendet:

s = Singulett, d = Dublett, dd = Dublett vom Dublett, dt = Dublett vom Triplett, t = Triplett,

quar = Quartett, quin = Quintett, m = Multiplett, bs = breites Signal.

Die chemischen Verschiebungen sind in ppm, die Kopplungskonstanten J in Hz angegeben.

Die Angaben entsprechen folgendem Schema: δ (M, J).

Mikrowelle:

Milestone MLS-Ethos 1600, Mikrowellen-Laborsysteme, Leutkirch, Deutschland

Reaktionen im offenen System wurden in Dreihalskolben durchgeführt.

Reaktionen im geschlossenen System wurden in einem Bombenrohr aus Polytetrafluorethylen (PTFE,

3.0 cm Innendurchmesser, 18 cm Länge) ummantelt mit einem Polyetheretherketon-Rohr (PEEK)

durchgeführt.


88

7.1.1.2 Chromatographie

Dünnschichtchromatographie:

DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland.

DC-Fertigplatten SIL 625 UV254, Fa. Macherey-Nagel, Düren, Deutschland.

Säulenchromatographie: Kieselgel 60, 0.063-0.2 mm (70-320 mesh), Fa. Merck, Darmstadt,

Deutschland.

7.1.1.3 Chemikalien und Lösungsmittel

Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden von folgenden Firmen bezogen:

Acros Organics, Geel, Belgien.

Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland.

VWR International, Darmstadt, Deutschland.

DMF wurde über Phosphorpentoxid bei 40 mbar destilliert. Es wurde ausschließlich demineralisiertes

Wasser verwendet.


89

7.1.2 Synthesevorschriften und analytische Daten

7.1.2.1 Synthese von 4-Pyrdidyl-hydrazin-Hydrochlorid 1

Abb. 63: Struktur von 4-Pyrdidyl-hydrazin-Hydrochlorid 1.

7.1.2.1.1 Freisetzung der 4-Chlorpyridin-Base

2.0 g (13 mmol) 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid werden in 200 ml Et2O (0 °C) suspendiert und nach

Zugabe von 150 ml einer wässrigen 2 M NaOH-Lösung (0 °C) sofort extrahiert. Anschließend wird

erneut zweimal mit je 100 ml Et2O (0 °C) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, über

Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wobei die Temperatur des

Wasserbades maximal 15 °C betragen darf. Das erhaltene Öl kann bis zur weiteren Verwendung

bei -20 °C maximal 1 h gelagert werden.

7.1.2.1.2 Synthese von 4-Pyrdidyl-hydrazin-Hydrochlorid 1, modifiziert nach Mann et al.122

1.25 (11 mmol) 4-Chlorpyridin werden in 5 ml 1-Propanol gelöst und 0.75 ml (15 mmol) Hydrazin-

Hydrat unter Rühren bei Raumtemperatur zugetropft. Anschließend wird 12 h unter Rückfluss erhitzt

und das Produkt nach dem Abkühlen 24 h bei 4 °C aufbewahrt. Der entstandene weißliche bis gelbe

Niederschlag wird abfiltriert und aus EtOH umkristallisiert.

Ausbeute: 1.6 g (86 % / Lit.: 85 %122)

Summenformel: C5H8ClN3 MR: 145.59 g/mol Smp: 241-243 °C (Lit.: 238 °C195)

IR-Daten [cm-1]: 682, 813, 832, 967, 1049, 1213, 1373, 1473, 1538, 1594, 1644, 2083, 2929, 3021

1HNMR (DMSO-d6, δ [ppm]):

4.91 (2H, s, NH2), 6.77 (1H, bs, H-Pymeta), 7.10 (1H, bs, H-Pymeta‘), 7.99 (1H, bs, H-Pyortho),

8.15 (1H, bs, H-Pyortho‘), 9.81 (1H, bs, NH), 13.24 (1H, s, HCl)196

13CNMR (DMSO-d6, δ [ppm], J [Hz]):

103.8 (1C, C-Pymeta), 106.2 (1C, C-Pymeta‘), 137.8 (1C, C-Pyortho), 139.8 (1C, C- H-Pyortho‘),

158.9 (1C, C-Pyipso)196


90

7.1.2.2 Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 2 – 14 in Analogie zur

Synthese von Verbindung 9 nach Douglas et al.132

Abb. 64: Struktur der Verbindungen 2-14.

1 g (6.9 mmol) Verbindung 1 wird in 25 ml eines Lösungsmittelgemisches aus EtOH, H2O und NEt3

(49: 49: 2) gelöst und 1.1 Äquivalente (7.6 mmol) des entsprechenden Aldehyds zugegeben. Im

Anschluss wird die Reaktionsmischung entweder 12 h bei Raumtemperatur gerührt (Methode A), 12 h

unter Rückfluss erhitzt (Methode B) oder 36 h unter Rückfluss erhitzt (Methode C). Nach beendeter

Reaktion wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt säulenchromatographisch

gereinigt (CHCl3 / MeOH / NEt3 10:89.8:0.2, Rf = 0.3 - 0.5). Alle Verbindungen werden als weißliche

bis gelbe Feststoffe in Ausbeuten von 12 – 68 % isoliert. Die analytischen und spektroskopischen

Daten sind in Tabelle 11 - Tabelle 14 aufgeführt.


91

Nr. Name Summen-formel

MR [g/mol] Aldehyd Meth.

2 Benzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-hydrazon-

Hydrochlorid C12H12ClN3 233.70 Benzaldehyd A

3 2-Phenylacetaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C13H14ClN3 247.72

2-Phenylacet-aldehyd

C

4 3-Phenylpropylaldehyd 4-(1H)-pyridylen-


3-Phenylpropyl-aldehyd

B

5 2-Methoxybenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C13H14ClN3O 263.72

2-Methoxybenz-aldehyd

A

6 4-Methoxybenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C13H14ClN3O 263.72

4-Methoxybenz-aldehyd

A

7 3-Fluorbenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C12H11ClFN3 251.69

3-Fluorbenz-aldehyd

A

8 4-Fluorbenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C12H11ClFN3 251.69

4-Fluorbenz-aldehyd

A

9 4-Chlorbenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C12H11Cl2N3 268.14

4-Chlorbenz-aldehyd

A

10 2,6-Dichlorbenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C12H10Cl3N3 302.59

2,6-Dichlorbenz-aldehyd

B

11 3-Methylbenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-


3-Methylbenz-aldehyd

A

12 4-Methylbenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-


4-Methylbenz-aldehyd

A

13 4-Nitrobenzaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C12H11ClN4O2 278.69

4-Nitrobenz-aldehyd

A

14 2-Naphthaldehyd 4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrochlorid C16H14ClN3 283.76 2-Naphthaldehyd

C

Tabelle 11: Analytische Daten der Verbindungen 2-14.

Nr. IR [cm-1] Smp. [°C]

(Lit.) Ausbeute [g]

(Lit.)

2 822, 1009, 1117, 1190, 1311, 1422, 1490, 1532, 1585, 1615, 1907, 2092, 2873, 3076, 3202

201-203 (200)197 1.1 (68 %)

3 743, 818, 993, 1079, 1104, 1192, 1209, 1312, 1525, 1594, 2833, 2977, 3024, 3085, 3194 189-194 0.2 (12 %)

4 746, 808, 987, 1080, 1103, 1186, 1210, 1317, 1453, 1495, 1599, 1639, 2835, 3081, 3157 97-100 0.8 (44 %)

5125 824, 1026, 1080, 1126, 1196, 1251, 1334, 1465, 1492, 1533, 1592, 2099, 2602, 3083, 3212

202-203 (205)

0.9 (50 %)(69 %)

6 816, 989, 1022, 1080, 1114, 1170, 1244, 1301, 1508, 1595, 1616, 2603, 2831, 3094, 3207

189-190 (187-188)197 1.2 (66 %)

7 681, 764, 807, 994, 1036, 1121, 1210, 1482, 1535, 1594, 1913, 2497, 2603, 2947, 3072, 3205 188-205 1.0 (58 %)

8 819, 1008, 1035, 1082, 1171, 1230, 1397, 1475, 1507, 1607, 2495, 2601, 2946, 3093, 3208 198-203 0.8 (46 %)

9 816, 1003, 1082, 1117, 1185, 1299, 1339, 1401, 1479, 1490, 1598, 1633, 2834, 3078, 3185

217-219 (215-217)132 1.2 (65 %)

10116 770, 991, 1122, 1193, 1209, 1315, 1421, 1439, 1498, 1584, 1614, 2832, 2882, 3075, 3228

241-242 (242)

1.2 (58 %) (67 %)

11 778, 822, 1035, 1116, 1171, 1302, 1479, 1537, 1615, 1914, 2496, 2602, 2945, 3072, 3206 208-209 1.1 (64 %)

12 811, 990, 1035, 1117, 1171, 1313, 1475, 1495, 1509, 1591, 1619, 2602, 2879, 3096, 3198

205-207 (206-207)197 1.1 (64 %)

13 746, 816, 1035, 1084, 1129, 1171, 1246, 1336, 1497, 1593, 1637, 2496, 2602, 3072 , 3208

233-237 (276-277)197 1.3 (68 %)

14 826, 993, 1035, 1124, 1172, 1248, 1318, 1397, 1498, 1594, 1617, 2496, 2881, 3081, 3203

262-265 0.6 (31 %)

Tabelle 12: IR-Daten der Verbindungen 2-14.


92

H

-Cl

11.0

2 (b

s)

10.4

9 (b

s)

10.4

4 (b

s)

11.1

6 (b

s)

10.8

4 (b

s)

10.9

6 (b

s)

11.2

6 (b

s)

11.7

7 (b

s)

11.1

7 (b

s)

11.9

1 (b

s)

11.0

9 (b

s)

10.4

3 (b

s)

11.1

9 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.22

(d,

6.3

)

8.15

(d,

6.3

)

8.12

(d,

6.3

)

8.20

(d,

6.3

)

8.18

(d,

6.3

)

8.23

(d,

6.2

)

8.24

(d,

6.4

)

8.26

(d,

6.5

)

8.20

(d,

6.3

),

8.25

(d,

6.3

)

8.26

(d,

6.4

)

8.28

(d,

5.6

)

8.31

(d,

6.5

)

8.25

(d,

6.4

)

H-P

y met

a

7.00

(d,

6.3

)

6.82

(dd

, 6.3

/1.4

)

6.78

(d,

6.3

)

6.98

-7.0

1 (m

)

6.95

-6.9

9 (m

)

7.01

(d,

6.2

)

7.06

(d,

6.4

)

7.14

(d,

6.5

)

6.96

(dd

, 6.3

/1.4

),

7.03

(dd

, 6.3

/1.4

)

7.17

(d,

6.4

)

7.08

(d,

5.6

)

7.17

(d,

6.5

)

7.07

(d,

6.4

)

CH

=N

8.00

(s)

7.39

(t

, 5.8

)

7.18

-7.

33 (

m)

8.35

(s)

7.95

(s)

7.96

(s)

8.05

(s)

8.11

(s)

8.21

(s)

8.14

(s)

8.06

(s)

8.19

(s)

8.17

(s)

H-P

h1 n

-

3.59

(d,

5.8

)

2.55

(dt

, 7.6

, 5.

2),

2.83

(d,7

.6)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

H-P

h1 o

rtho

7.69

-7.7

1 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.18

-7.3

3 (m

)

7.88

(d

d, 7

.7/1

.7)

7.64

(d,

8.8

)

7.51

-7.5

5 (m

)

7.78

(d

d, 8

.8/5

.6)

7.76

(d,

8.5

)

-

7.56

(s)

, 7.

52 (

d, 7

.6)

7.67

(d,

7.9

)

8.27

(d,

8.9

)

8.07

(s)

, 8.

02

(dd,

8.6

/1.5

)

H-P

h1 m

eta

7.35

-7.4

3 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.18

-7.3

3 (m

)

7.08

(d,

7.7

),

7.33

-7.3

8 (m

)

6.95

-6.9

9 (m

)

7.45

(d

t, 7.

9/5.

8)

7.27

(t,

8.8)

7.49

(d,

8.5

)

7.50

-7.6

1 (m

)

7.32

(t,

7.6)

7.31

(d,

7.9

)

7.98

(d,

8.9

)

7.91

-7.9

7 (m

)

H-P

h1 p

ara

7.35

-7.4

3 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.18

-7.3

3 (m

)

6.98

-7.0

1 (m

)

-

7.14

-7.2

0 (m

)

-

-

7.37

(t,

8.1)

7.20

(d

, 7.6

)

-

-

-

H-P

h1 R

-

-

-

3.85

(s)

3.79

(s)

-

-

-

-

2.34

(s)

2.40

(s)

-

7.51

-7.5

7 (m

),

7.91

-7.9

7 (m

)

Nr.

2 3 4 5125

6 7 8 9

1011

6

11

12

13

14

Tab

elle

13:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2-14

.


93

Tab

elle

14:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2-

14.

C-P

y ort

ho

148.

9

149.

0

148.

8

148.

4

148.

8

149.

9

145.

1

146.

2

149.

3

144.

8

148.

4

147.

2

148.

8

C-P

y met

a

106.

6

106.

2

106.

1

106.

6

106.

5

107.

2

107.

0

107.

1

106.

9,

107.

4

106.

8

106.

6

107.

3

106.

8

C-P

y ip

so

150.

5

150.

9

150.

8

150.

7

150.

6

150.

4

151.

8

152.

1

150.

7

152.

4

150.

8

146.

8

150.

6

CH

=N

140.

2

143.

2

143.

8

136.

2

140.

3

138.

7 (d

, 3.1

)

139.

6

141.

5

134.

7

143.

5

140.

8

139.

2

140.

3

C-P

h1 n

38.8

31.8

, 33

.1

- - - - - - - - - -

C-P

h1 i

pso

134.

6

137.

3

140.

8

122.

5

127.

2

137.

6

(d, 8

.2)

135.

2

133.

4

131.

7

133.

9

131.

8

126.

9

132.

9

C-P

h1 o

rtho

125.

9

128.

4

128.

0

124.

7, 1

56.7

127.

5

112.

1 (d

, 22.

0),

122.

6 (d

, 2.5

)

128.

5 (d

, 8.4

)

128.

1

133.

5

123.

8,

126.

7

126.

0

126.

9

126.

9,

126.

4

C-P

h1 m

eta

128.

4

128.

3

128.

1

111.

4,

130.

1

113.

9

130.

7 (d

, 8.2

),

162.

5 (d

, 243

.3)

115.

8

(d, 2

2.0)

128.

8

128.

4

128.

4,

137.

7

129.

0

123.

7

127.

8,

132.

3

C-P

h1 p

ara

128.

6

126.

5

125.

6

120.

4

159.

7

115.

5 (d

, 22.

0)

162.

5

(d, 2

47.2

)

133.

7

129.

2

130.

1

138.

4

140.

8

132.

6

C-P

h1 R

- - -

55.3

54.9

- - - -

20.3

20.6

-

126.

3,

127.

4

Nr.

2 3 4 5 6 7 8 9

1011

6

11

12

13

14


94

7.1.2.3 Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Verbindungen 2A – 14O, modifiziert nach

Holzgrabe et al.198

Abb. 65: Struktur der Verbindungen 2A-14O.

Literaturnachweis für Verbindung 10A, 10B und 10C: Alptüzün et al. 2010116

A B C D

E FF

G

I

H

Br

F

BrK

N

O

O

N

O

O

I J L

M N

NN

NPy

Ph1

Rn

HBr

mR'

Ph2

2A - 14O

O


95

Methode A:

1 mmol der Verbindungen 2-14 wird mit 2 Äquivalenten des entsprechenden Phenylalkylbromids

bzw. Alkylbromids in 5 ml trockenem DMF gelöst. Anschließend wird zur Reaktionsmischung ggf.

Hünig-Base oder NEt3 (siehe Tabelle 15) zugegeben und unter Rückfluss erhitzt. Nach beendeter


gereinigt (CHCl3 / MeOH / NEt3 10:89.8:0.2, Rf = 0.4 - 0.6). Im Anschluss wird das Hydrobromid der

Verbindung mit Hilfe von HBr gefällt.

Methode B:

1 mmol der Verbindungen 2-14 wird mit 2 Äquivalenten des entsprechenden Phenylalkylbromids

bzw. Alkylbromids in 5 ml DMF gelöst. Anschließend wird zur Reaktionsmischung ggf. Hünig-Base

oder NEt3 (siehe Tabelle 15) zugegeben und in einem Bombenrohr auf 80 °C erhitzt. Nach beendeter


gereinigt (CHCl3 / MeOH / NEt3 10:89.8:0.2, Rf = 0.4 - 0.6). Im Anschluss wird das Hydrobromid der

Verbindung mit Hilfe von HBr gefällt.

Methode C:

0.33 mmol der Verbindungen 2-14 wird mit 2 Äquivalenten des entsprechenden Phenylalkylbromids

bzw. Alkylbromids in 5 ml ACN gelöst. Anschließend wird zur Reaktionsmischung ggf. Hünig-Base

oder NEt3 (siehe Tabelle 15) zugegeben und in einem Bombenrohr in der Mikrowelle auf 100 °C

(Aufheizrate: 40 °C / min; 800 W) erhitzt. Nach beendeter Reaktion fällt das Produkt entweder direkt

aus (Methode C1), nach Überschichtung der ACN-Phase mit 2 ml Pentan (Methode C2) oder durch

Zugabe von 2 ml Et2O (Methode C3). Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und mit Et2O

gewaschen. Das Produkt wird säulenchromatographisch gereinigt (CHCl3 / MeOH / NEt3 10:89.8:0.2,

Rf = 0.4 - 0.6). Im Anschluss wird das Hydrobromid der Verbindung mit Hilfe von HBr gefällt.


96

7.1.2.3.1 Substituent am Pyridin-N = Benzyl (Edukt: Benzylbromid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2A Benzaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C19H18BrN3 368.27 72 A -

3A 2-Phenylacetaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C20H20BrN3 382.29 500 A Hünig

4A 3-Phenylpropylaldehyd (1-Benzyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C21H22BrN3 396.32 300 A -

5A 2-Methoxybenzaldehyd (1-Benzyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C20H20BrN3O 398.29 72 A -

6A 4-Methoxybenzaldehyd (1-Benzyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C20H20BrN3O 398.29 72 A -

7A 3-Fluorbenzaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17BrFN3 386.26 72 A -

8A 4-Fluorbenzaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17BrFN3 386.26 72 A NEt3

9A 4-Chlorbenzaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17BrClN3 402.71 72 A -

10A 2,6-Dichlorbenzaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C19H16BrCl2N3 437.16 300 A -

11A 3-Methylbenzaldehyd (1-Benzyl)-4-


12A 4-Methylbenzaldehyd (1-Benzyl)-4-


13A 4-Nitrobenzaldehyd (1-Benzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17BrN4O2 413.26 72 A -

14A 2-Naphthaldehyd (Benzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C23H20BrN3 418.33 500 B -

Tabelle 15: Analytische Daten der Verbindungen 2A-14A.


97

Nr. Aussehen IR [cm-1] Smp. [°C]

Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS m/z

(M+H)+

2A gelblicher

FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360,

2858, 2935, 3069

179-182 154 (42 %) 8.8 3.8 288

3A gelblicher

FS

690, 704, 749, 816, 1030, 1116, 1164, 1351, 1389, 1518, 1552, 1640, 2474, 2848, 2964, 3076, 3081

180-182 45 (12 %) 8.8 3.9 302

4A gelblicher

FS

692, 704, 745, 816, 1030, 1116, 1170, 1351, 1389, 1518, 1558, 1644, 2774, 2845, 2971, 3086, 3181

180-183 297 (75 %) 8.8 4.0 316

5A 125

gelblicher FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369,

2855, 2925, 3074

>250 (254)

151 (38 %) (73)

8.8 3.3 318

6A gelblicher

FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369,

2855, 2925, 3074

176-179 234 (59 %) 8.8 3.3 318

7A gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854,

2924, 2973, 3071

176-179 181 (47 %) 8.8 3.7 306

8A gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854,

2924, 2973, 3071

177-179 127 (33 %) 8.8 3.7 306

9A gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854,

2924, 2973, 3071

175-178 156 (39 %) 8.8 3.8 323

10A 116

gelblicher FS

702, 717, 779, 1001, 1117, 1159, 1342, 1422, 1455, 1509, 1544, 1639, 2765,

2788, 2884, 3024

183-186 170 (39 %)

(42) 8.8 3.9 357

11A gelblicher

FS

687, 705, 738, 841, 1000, 1082, 1167, 1201, 1346, 1387, 1513, 1557, 1639,

2841, 2913, 3062

178-180 152 (40 %) 8.8 3.9 302

12A gelblicher

FS

700, 737, 771, 810, 1033, 1075, 1126, 1204, 1348, 1519, 1549, 1637, 2857,

2937, 2978, 3072

179-182 149 (39 %) 8.8 3.9 302

13A oranger

FS

686, 702, 745, 820, 1009, 1161, 1203, 1336, 1456, 1514, 1544, 1639, 2363,

2817, 2896, 3065

182-185 119 (29 %) 9.0 3.8 333

14A gelblicher

FS

699, 741, 818, 839, 1033, 1097, 1168, 1198, 1328, 1386, 1513, 1550, 1637,

2365, 2907, 3064

>250 384 (92 %) 8.9 4.2 338

Tabelle 16: IR-Daten der Verbindungen 2A-14A.


98

H-P

h2

7.39

-7.4

6 (m

)

7.39

-7.4

6 (m

)

7.17

-7.4

5 (m

)

7.39

-7.4

9 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.38

-7.4

3 (m

)

7.39

-7.4

6 (m

)

7.39

-7.4

6 (m

)

7.40

-7.4

5 (m

)

7.39

-7.4

5 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.39

-7.4

7 (m

)

7.39

-7.4

5 (m

)

H-P

h2 m

5.51

(s)

5.51

(s)

5.45

(s)

5.49

(s)

5.49

(s)

5.52

(s)

5.51

(s)

5.51

(s)

5.53

(s)

5.51

(s)

5.50

(s)

5.55

(s)

5.53

(s)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.2

1 (b

s)

12.0

0 (b

s)

12.3

4

12.2

8 (b

s)

12.5

5

12.4

1 (b

s)

12.4

0 (b

s)

12.6

3 (b

s)

12.3

7 (b

s)

12.3

2 (b

s)

12.6

8 (b

s)

12.5

1 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.15

(d,

6.3

)

8.40

(d,

7.2

),

8.49

(d,

7.2

)

8.45

(d

d, 7

.3/2

.0),

8.

57

(dd,

7.3

/2.0

) 8.

43

(dd,

7.3

/1.5

),

8.55

(d

d, 7

.3/1

.5)

8.50

(d,

6.8

),

8.62

(d,

6.8

)

8.47

(d

d, 7

.2/1

.2),

8.

60

(dd,

7.2

/1.2

)

8.48

(d,

7.2

),

8.60

(d,

7.2

)

8.56

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.47

(d

d, 7

.2/1

.2),

8.

59

(dd,

7.2

/1.2

) 8.

45

(dd,

7.4

/1.3

),

8.57

(d

d, 7

.4/1

.3)

8.55

(d,

7.2

),

8.68

(d,

7.2

)

8.49

(d

d, 7

.2/1

.2),

8.

63

(dd,

7.2

/1.2

)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

6.82

(d

d, 6

.3/1

.4)

6.95

(d,

7.2

),

7.17

-7.4

5 (m

)

7.02

-7.0

7 (m

),

7.65

(d

d, 7

.3/2

.0)

7.05

-7.0

7 (m

),

7.63

(d

d, 7

.3/2

.7)

7.15

(d,

6.8

),

7.77

(d,

6.8

)

7.11

(d

d, 7

.2/2

.6),

7.

69

(dd,

7.2

/2.6

)

7.11

(d

, 7.2

),

7.71

(d,

7.2

)

7.15

(d

d, 7

.1/2

.2),

7.

53

(dd,

7.1

/2.2

) 7.

10

(dd,

7.2

/2.6

),

7.69

(d

d, 7

.2/2

.6)

7.07

(d

d, 7

.4/2

.7),

7.

66

(dd,

7.4

/2.7

)

7.20

(d,

7.2

),

7.80

(d,

7.2

)

7.14

(d

d, 7

.2/2

.6),

7.

77

(dd,

7.2

/2.6

)

CH

=N

8.28

(s)

7.39

(t

, 5.8

)

7.65

(t

, 5.2

)

8.59

(s)

8.22

(s)

8.28

(s)

8.27

(s)

8.26

(s)

8.53

(s)

8.24

(s)

8.23

(s)

8.38

(s)

8.26

(s)

H-P

h1 n

-

3.59

(d,

5.8

)

2.66

(dt

, 7.4

/5.2

),

2.87

(t,

7.4)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

H-P

h1 o

rtho

7.84

(d

d, 6

.6/2

.8)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.17

-7.4

5 (m

)

7.97

(d

d, 7

.8/1

.7)

7.78

(d

, 8.9

)

7.66

(d,

7.6

),

7.73

(d,

10.

1)

7.91

(d

d, 8

.8/5

.6)

7.87

(d,

8.5

)

-

7.66

(s)

, 7.

62 (

d, 7

.6)

7.73

(d

, 8.1

)

8.31

(d

, 8.9

)

8.44

(s)

, 8.

09

(dd,

8.7

/1.5

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.17

-7.4

5 (m

)

7.14

(d,

8.1

),

7.02

-7.0

7 (m

)

7.04

(d

, 8.9

)

7.50

-7.5

5 (m

)

7.33

(t

, 8.8

)

7.55

(d

, 8.5

)

7.61

(d

, 7.8

)

7.36

-7.3

7 (m

)

7.30

(d

, 8.1

)

8.11

(d

, 8.9

)

7.96

-8.0

2 (m

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.17

-7.4

5 (m

)

-

-

7.29

-7.

33(m

)

(d, 7

.6)

-

7.48

(t

, 7.8

)

7.3 -

-

-

H-P

h1 R

- - -

3.88

(s)

3.82

(s)

-

-

-

-

2.37

(s)

2.36

(s)

-

7.57

-7.6

9 (m

),

7.96

-8.0

2 (m

)

Nr.

2A

3A

4A

5A

6A

7A

8A

9A

10A

116

11A

12A

13A

14A

Tab

elle

17:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2A-1

4A.


99

C-P

h2

128.

0-12

8.9,

13

5.4

128.

0-12

8.9,

13

5.4

126.

0-12

9.1,

13

5.4

125.

7, 1

28.0

, 12

8.2,

128

.8,

129.

1, 1

35.3

125.

9, 1

28.0

-12

9.2,

135

.5

126.

1, 1

28.8

, 12

9.1

128.

0, 1

28.8

, 12

9.7,

135

.4

128.

0, 1

28.1

, 12

8.8,

136

.8

128.

3-12

9.3,

14

1.4

124.

8, 1

28.0

, 12

8.8,

129

.1,

129.

2, 1

38.2

127.

4-12

9.5,

13

5.4

124.

0, 1

28.8

, 12

9.1,

135

.3

122.

5, 1

26.9

-12

9.7,

133

.9

C-

Ph

2 m

60.1

60.1

60.1

60.1

60.0

60.1

60.1

60.2

60.5

60.1

60.1

60.5

60.1

C-

Py o

rth

o 14

3.1,

14

4.2

149.

0

143.

0,

144.

1

143.

7,

144.

2

142.

9,

144.

1

143.

3,

144.

3

143.

2,

144.

2 14

0.3,

14

1.3

143.

6,

144.

5

143.

1.

144.

2

143.

0,

144.

1 14

3.6,

14

4.5

143.

1,

144.

2

C-

Py m

eta

107.

4,

109.

1

106.

2

106.

7,

108.

4

107.

3,

109.

0

107.

1,

108.

9

107.

8,

109.

3

107.

4,

109.

1

107.

6,

109.

3 10

8.2,

10

9.9

107.

4,

109.

1

107.

3,

109.

1 10

8.0,

10

9.8

107.

5,

109.

2

C-

Py i

pso

153.

8

150.

9

153.

6

153.

5

153.

5

153.

9

153.

8

153.

8

154.

8

153.

7

153.

7

153.

9

153.

7

CH

=N

148.

1

143.

2

152.

6

143.

1

148.

1

146.

6 (d

, 2.7

)

146.

9

149.

4

148.

6

148.

2

148.

2

148.

1

148.

1

C-

Ph

1 n

38.8

31.4

,

33.5

- - - - - - - - - -

C-

Ph

1 ips

o

133.

4

137.

3

139.

5

120.

8

135.

6

136.

0

(d, 8

.1)

138.

6

144.

3

135.

1

135.

4

130.

72

139.

7

131.

1

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

128.

4

126.

0-12

9.1

132.

3, 1

57.9

128.

0-12

9.2

113.

2

(d, 2

2.0)

, 12

4.1

(d, 2

.5)

130.

1 (

d, 8

.7)

128.

9

132.

6, 1

33.2

127.

8 13

1.4

127.

4-12

9.5

128.

1, 1

28.4

126.

9-12

9.7

C-

Ph

1 met

a 12

8.0-

128.

9

128.

3

126.

0-12

9.1

112.

0,

135.

4

114.

4

130.

9

(d, 8

.1)

116.

0 (d

, 21.

8)

129.

1

128.

3-12

9.3

132.

8,

138.

2

127.

4-12

9.5

128.

1,

128.

4

126.

9-12

9.7,

13

5.4

C-P

h1 p

ara

129.

1

126.

5

126.

0-12

9.1

121.

3

133.

6

117.

4

(d, 2

2.0)

162.

5

(d, 2

47.2

)

140.

3

128.

3-12

9.3

133.

4

140.

7

145.

5

132.

7

C-P

h1 R

- - -

55.8

55.0

162.

4 (d

, 244

.1)

- - -

20.8

21.1

-

126.

9-12

9.7

Nr.

2A

3A

4A

5A

6A

7A

8A

9A

10A

11A

12A

13A

14A

Tab

elle

18:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2A

-14A

.


100

7.1.2.3.2 Substituent am Pyridin-N = 2-Ethylphenyl (Edukt: (2-Bromethyl)benzol)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2B Benzaldehyd (2-Ethylphenyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C20H20BrN3 382.29 50 B Hünig

5B 2-Methoxybenzaldehyd (2-

Ethylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H22BrN3O 412.31 48 B NEt3

6B 4-Methoxybenzaldehyd (2-


C21H22BrN3O 412.31 48 B NEt3

10B 2,6-Dichlorbenzaldehyd (2-


C20H18BrCl2N3 451.18 48 B NEt3

12B 4-Methylbenzaldehyd (2-Ethylphenyl)-

4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H22BrN3 396.31 48 B NEt3

13B 4-Nitrobenzaldehyd (2-Ethylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C20H19BrN4O2 427.28 18 B NEt3

Tabelle 19: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2B-13B.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2B gelber FS 695, 757, 764, 821, 1453, 1491, 1508, 1566, 1637,

2930, 3028, 3049 154 154 (63 %) 8.8 3.9 302

5B gelblicher

FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369,

2855, 2925, 3074

193 198 (58 %) 8.8 3.4 332

6B gelblicher

FS

695, 732, 823, 834, 1244, 1458, 1507, 1568, 1603, 1642, 1840, 3000, 3024,

3056

140 267 (76 %) 8.8 3.4 332

10B gelblicher

FS

686, 702, 745, 820, 1009, 1161, 1203, 1336, 1456,

11514, 1544, 1639, 2363, 2817, 2896, 3065

184-186 165 (39 %) 8.8 4.0 371

12B weißlicher

FS

702, 717, 779, 1001, 1117, 1159, 1342, 1422, 1455, 1509, 1544, 1639, 2765,

2788, 2884, 3024

179-182 151 (39 %) 8.8 4.0 316

13B oranger FS

700, 737, 771, 810, 1033, 1075, 1126, 1204, 1348, 1519, 1549, 1637, 2857,

2937, 2978, 3072

182-185 125 (25 %) 9.0 3.9 347

Tabelle 20: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2B-14B.


101

H-P

h2

7.18

-7.3

8 (m

)

7.39

-7.4

9 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.40

-7.4

5 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.39

-7.4

7 (m

)

H-P

h2 m

2.97

(t,

7.0)

3.

96 (

t, 7.

0)

2.98

(t,

7.0)

3.

98 (

t, 7.

0)

2.94

(t,

7.0)

3.

91 (

t, 7.

0)

2.95

(t,

7.0)

3.

93 (

t, 7.

0)

2.94

(t,

7.0)

3.

91 (

t, 7.

0)

2.95

(t,

7.2)

3.

91 (

t, 7.

2)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.3

4

12.2

8 (b

s)

12.6

3 (b

s)

12.3

7 (b

s)

12.6

8 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.45

(d

d, 7

.3/2

.0),

8.

57

(dd,

7.3

/2.0

)

8.43

(d

d, 7

.3/1

.5),

8.

55

(dd,

7.3

/1.5

)

8.56

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

7.10

(d

d, 7

.2/2

.6)

8.55

(d,

7.2

),

8.68

(d,

7.2

)

H-P

y met

a

6.06

(d

d, 7

.6/2

.7),

6.

92

(dd,

7.6

/2.7

),

7.02

-7.0

7 (m

),

7.65

(d

d, 7

.3/2

.0)

7.03

-7.0

7 (m

),

7.65

(d

d, 7

.3/2

.7)

7.15

(d

d, 7

.1/2

.2),

7.

53

(dd,

7.1

/2.2

)

7.07

(d

d, 7

.4/2

.6),

7.

66

(dd,

7.4

/2.6

)

7.20

(d,

7.2

),

7.80

(d,

7.2

)

CH

=N

8.19

(s)

8.59

(s)

8.12

(s)

8.60

(s)

8.59

(s)

8.68

(s)

H-P

h1 n

- - - - - -

H-P

h1 o

rtho

7.69

(d

, 7.4

)

7.97

(d

d, 7

.8/1

.7)

7.78

(d

, 8.9

)

-

7.73

(d

, 8.1

)

8.39

(d

, 8.9

)

H-P

h1 m

eta

7.47

-7.4

9 (m

)

7.02

-7.0

7 (m

) 7.

14 (

d, 8

.1),

7.06

(d

, 8.9

)

7.61

(d

, 7.8

)

7.30

(d

, 8.1

)

8.11

(d

, 8.9

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

) - -

7.48

(t

, 7.8

)

- -

H-P

h1 R

-

3.88

(s)

3.76

(s)

-

2.37

(s)

-

Nr.

2B

5B

6B

10B

12B

13B

Tab

elle

21:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2B–1

4B.


102

C-P

h2

126.

9-13

3.5

125.

7, 1

28.0

, 12

8.2,

128

.8,

129.

1, 1

35.3

125.

9, 1

28.0

-12

9.2,

135

.5

128.

3-12

9.3,

14

1.4

127.

4-12

9.5,

13

5.4

124.

0, 1

28.8

, 12

9.1,

135

.3

C-

Ph

2 m

36.2

, 58

.4

36.1

, 58

.5

36.2

, 59

.1

37.1

, 58

.4

36.8

, 58

.2

36.5

, 58

.3

C-

Py o

rth

o 14

3.1,

14

4.1

143.

7,

144.

2

142.

9,

144.

1 14

3.6,

14

4.5

143.

0,

144.

1 14

3.6,

14

4.5

C-

Py m

eta

106.

9,

108.

6

107.

3,

109.

0

107.

1,

108.

9 10

8.2,

10

9.9

107.

3,

109.

1 10

8.0,

10

9.8

C-

Py i

pso

153.

6

153.

5

153.

5

154.

8

153.

7

153.

9

CH

=N

144.

1

143.

1

148.

1

148.

6

148.

2

148.

1

C-

Ph

1 n

- - - - -

C-

Ph

1 ips

o

136.

6

120.

8

135.

6

135.

1

130.

72

139.

7

C-P

h1 o

rtho

126.

9-13

3.5

132.

3, 1

57.9

128.

0-12

9.2

132.

6, 1

33.2

127.

4-12

9.5

128.

1, 1

28.4

C-

Ph

1 met

a 12

6.9-

133.

5

112.

0,

135.

4

114.

4

128.

3-12

9.3

127.

4-12

9.5

128.

1,

128.

4

C-P

h1 p

ara

126.

9-13

3.5

121.

3

133.

6

128.

3-12

9.3

140.

7

145.

5

C-P

h1 R

-

55.8

55.0

-

21.1

-

Nr.

2B

5B

6B

10B

12B

13B

Tab

elle

22:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2B

-14B

.


103

7.1.2.3.3 Substituent am Pyridin-N = 3-Propylphenyl (Edukt: (3-Brompropyl)benzol)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2C Benzaldehyd (3-Propylphenyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C21H22BrN3 396.31 150 B NEt3

3C 2-Phenylacetaldehyd (3-Propylphenyl)-


C22H24BrN3 410.33 500 B NEt3

4C 3-Phenylpropylaldehyd (3-

Propylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C23H26BrN3 426.36 300 B NEt3

5C 2-Methoxybenzaldehyd (3-


C22H24BrN3O 426.33 150 B NEt3

6C 4-Methoxybenzaldehyd (3-


C22H24BrN3O 426.33 150 B NEt3

7C 3-Fluorbenzaldehyd (3-Propylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H21BrFN3 414.30 200 B NEt3

8C 4-Fluorbenzaldehyd (3-Propylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H21BrFN3 414.30 200 B NEt3

9C 4-Chlorbenzaldehyd (3-Propylphenyl)-


C21H21BrClN3 430.75 48 B NEt3

10C 2,6-Dichlorbenzaldehyd (3-


C21H20BrCl2N3 465.20 48 B NEt3

11C 3-Methylbenzaldehyd (3-Propylphenyl)-


C22H24BrN3 410.33 150 B NEt3

12C 4-Methylbenzaldehyd (3-Propylphenyl)-


C22H24BrN3 410.33 300 B NEt3

13C 4-Nitrobenzaldehyd (3-Propylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H21BrN4O2 441.30 12 B NEt3

14C 2-Naphthaldehyd (3-Propylphenyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C25H24BrN3 446.37 150 B NEt3

Tabelle 23: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2C-14C.


104


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2C gelblicher

FS

696, 742, 832, 1454, 1487, 1506, 1566, 1641, 2920, 2952,

3057 90 195 (62 %) 8.8 3.9 316

3C gelblicher

FS

690, 704, 749, 816, 1030, 1116, 1164, 1351, 1389, 1518, 1552, 1640, 2474, 2848, 2964,

3076, 3081

198 123 (68 %) 8.8 3.9 330

4C gelblicher

FS

692, 704, 745, 816, 1030, 1116, 1170, 1351, 1389, 1518, 1558, 1644, 2774, 2845, 2971,

3086, 3181

208 197 (75 %) 8.8 4.0 344

5C gelblicher

FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369, 2855, 2925,

3074

192 125 (54 %) 8.8 3.4 346

6C gelblicher

FS

700, 739, 820, 831, 1245, 1453, 1462, 1506, 1567, 1603,

1640, 2938 165 178 (72 %) 8.8 3.4 346

7C gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

176-177 165 (39 %) 8.8 3.8 334

8C Gelbes Öl

796, 748, 817, 1022, 1076, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3074

- 127 (41 %) 8.8 3.8 338

9C gelblicher

FS

792, 734, 802, 1018, 1081, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3044

176-181 295 (82 %) 8.8 3.9 351

10C gelblicher

FS

686, 702, 745, 820, 1009, 1161, 1203, 1336, 1456, 1514, 1544, 1639, 2363, 2817, 2896,

3065

183-186 196 (76 %) 8.8 4.0 385

11C gelblicher

FS

789, 746, 815,1012, 1086 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

188-190 159 (43 %) 8.8 4.0 330

12C gelblicher

FS

702, 717, 779, 1001, 1117, 1159, 1342, 1422, 1455, 1509, 1544, 1639, 2765, 2788, 2884,

3024

179-182 149 (39 %) 8.8 4.0 330

13C oranger

FS

700, 737, 771, 810, 1033, 1075, 1126, 1204, 1348, 1519, 1549, 1637, 2857, 2937, 2978,

3072

165 156 (52%) 8.8 3.8 361

14C gelblicher

FS

699, 741, 818, 839, 1033, 1097, 1168, 1198, 1328, 1386, 1513, 1550, 1637, 2365, 2907,

3064

176 384 (86 %) 8.9 4.3 352

Tabelle 24: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2C-14C.


105

H-P

h2

7.18

-7.3

1 (m

)

7.20

-7.3

2 (m

)

7.17

-7.

34(m

)

7.39

-7.4

9 (m

)

7.18

-7.3

1 (m

)

7.38

-7.4

3 (m

)

7.17

-7.3

5 (m

)

7.21

-7.2

9 (m

)

7.13

-7.3

1 (m

)

H-P

h2 m

2.14

(qi

, 7.6

),

2.61

(t,

7.6)

, 4.

30 (

t, 7.

6)

2.16

(qi

, 7.6

),

2.65

(t,

7.6)

, 4.

30 (

t, 7.

6)

2.11

(m

),

2.59

(m

),

4.24

(t,

7.2)

)

2.18

(qi

, 7.5

),

2.68

(t,

7.5)

, 4.

33 (

t, 7.

5)

2.10

(qi

, 7.6

),

2.61

(t,

7.6)

, 4.

28 (

t, 7.

6)

1.98

(qi

, 7.4

),

2.59

(t,

7.4)

, 3.

73 (

t, 7.

4)

2.10

-,.1

8 (m

),

2.59

-2.6

3 (m

),

4.30

(t,

7.2)

2.14

(qi

, 7.0

) 2.

61 (

t, 7.

0)

4.30

(t,

7.0)

2.14

(qi

, 7.4

) 2.

61 (

t, 7.

4)

4.32

(t,

7.4)

H-B

r

12.3

5 (b

s)

12.2

1 (b

s)

11.9

3 (b

s)

12.3

4

12.2

4 (b

s)

12.5

5

12.3

8 (b

s)

12.4

0 (b

s)

12.6

1(bs

)

H-P

y ort

ho

8.41

(d,

7.1

),

8.49

(d,

7.1

)

8.15

(d,

6.3

)

8.33

(d,

7.1

),

8.38

(d,

7.1

)

8.45

(d

d, 7

.3/2

.0),

8.

57

(dd,

7.3

/2.0

)

8.37

(d

, 7.2

),

8.45

(d

, 7.2

)

8.50

(d,

6.8

),

8.62

(d,

6.8

)

8.42

(d

, 6.9

),

8.49

(d

, 6.9

)

8.43

(d,

6.6

),

8.50

(d,

6.6

)

8.48

-8.5

4 (m

)

H-P

y met

a

7.09

(d

d, 7

.1/2

.3),

7.

65 (

dd,

7.1/

2.3)

6.82

(d

d, 6

.3/1

.4)

7.26

(d

d, 6

.3/1

.4)

6.91

(d

d, 7

.1/2

.4),

7.

17-7

.34

(m)

7.02

-7.0

7 (m

),

7.65

(d

d, 7

.3/2

.0)

7.03

-7.0

5 (m

),

7.59

(d

, 7.3

)

7.15

(d,

6.8

),

7.77

(d,

6.8

)

7.10

(d

d, 7

.3/2

.3),

7.

65

(dd,

7.3

/2.3

)

7.11

(d,

4.9

),

7.66

(d,

4.9

)

7.13

-7.3

1 (m

) 7.

46-7

.50

(m)

CH

=N

8.28

(s)

7.39

(t

, 5.8

)

7.64

(t

, 5.0

)

8.59

(s)

8.23

(s)

8.28

(s)

8.29

(s)

8.27

(s)

8.48

-8.5

4 (m

)

H-P

h1 n

-

3.61

(d,

5.8

)

2.67

(m

),

2.88

(t,

7.5)

-

-

-

-

-

-

H-P

h1 o

rtho

7.83

-7.8

6 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.17

-7.3

4 (m

)

7.97

(d

d, 7

.8/1

.7)

7.79

(d

, 8.8

)

7.66

(d,

7.6

),

7.73

(d,

10.

1)

7.91

(d

d, 8

.8/5

.6)

7.87

(d,

8.3

)

-

H-P

h1 m

eta

7.48

-7.5

0 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.17

-7.3

4 (m

)

7.14

(d,

8.1

),

7.02

-7.0

7 (m

)

7.03

-7.0

5 (m

)

7.50

-7.5

5 (m

)

7.17

-7.3

5 (m

)

7.55

(d

, 8.3

)

7.62

(d,

8.0

)

H-P

h1 p

ara

7.48

-7.5

0 (m

)

7.24

-7.3

5 (m

)

7.17

-7.

34(m

)

-

-

7.29

-7.

33(m

)

7.92

(d

d, 8

.9/5

.6)

-

7.46

-7.5

0 (m

)

H-P

h1 R

- - -

3.86

(s)

3.82

(s)

-

-

-

-

Nr.

2C

3C

4C

5C

6C

7C

8C

9C

10C

Tab

elle

25:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2C–1

0C.


106

H-P

h2

7.39

-7.4

5 (m

)

7.18

-7.3

1 (m

)

7.21

-7.3

3 (m

)

7.17

-7.3

1 (m

)

H-P

h2 m

2.18

(qi

, 7.5

),

2.68

(t,

7.5)

, 4.

33 (

t, 7.

5)

2.08

-2.2

1 (m

),

2.69

-2.7

6 (m

) 4.

29 (

t, 7.

2)

2.16

(m

),

2.62

(m

),

4.33

(t,

7.2)

2.11

-2.1

8 (m

),

259-

2.63

(m

),

4.30

(t,

7.2)

H-B

r

12.3

7 (b

s)

12.3

0 (b

s)

12.5

4(bs

)

12.4

0 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.47

(d

d, 7

.2/1

.2),

8.

59

(dd,

7.2

/1.2

)

8.39

(d

, 7.2

),

8.47

(d

, 7.2

)

8.47

(d,

6.0

),

8.56

(d,

6.0

)

8.40

-8.4

2 (m

) 8.

50 (

d, 7

.4)

H-P

y met

a

7.10

(d

d, 7

.2/2

.6),

7.

69

(dd,

7.2

/2.6

)

7.07

(d

d, 7

.1/2

.5),

7.

62

(dd,

7.1

/2.5

)

7.15

(d,

6.0

),

7.77

(d,

6.0

)

7.09

(d

d, 7

.1/2

.4),

7.

72

(dd,

7.1

/2.4

)

CH

=N

8.24

(s)

8.25

(s)

8.36

(s)

8.25

(s)

H-P

h1 n

-

-

-

-

H-P

h1 o

rtho

7.66

(s)

, 7.

62 (

d, 7

.6)

7.73

(d,

8.1

)

8.12

(d

, 8.9

)

8.10

(d

d, 8

.4/1

.5)

8.40

-8.4

2 (m

)

H-P

h1 m

eta

7.36

-7.3

7 (m

)

7.18

-7.3

1 (m

)

8.32

(d

, 8.9

)

7.96

-8.0

2 (m

)

H-P

h1 p

ara

7.3 -

-

-

H-P

h1 R

2.37

(s)

2.36

(s)

-

7.58

-7.6

0 (m

),

7.95

-8.0

2 (m

)

Nr.

11C

12C

13C

14C

Tab

elle

26:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

10C

–14C

.


107

C-P

h2

128.

2-12

8.9,

13

5.4

128.

0-12

8.9,

13

5.4

126.

0-12

9.1,

13

5.4

125.

7, 1

28.0

, 12

8.2,

128

.8,

129.

1, 1

35.3

125.

9, 1

28.0

-12

9.2,

135

.5

126.

1, 1

28.8

, 12

9.1

128.

0, 1

28.8

, 12

9.7,

135

.4

128.

0, 1

28.1

, 12

8.8,

136

.8

128.

3-12

9.3,

14

1.4

124.

8, 1

28.0

, 12

8.8,

129

.1,

129.

2, 1

38.2

127.

4-12

9.5,

13

5.4

124.

0, 1

28.8

, 12

9.1,

135

.3

122.

5, 1

26.9

-12

9.7,

133

.9

C-P

h2 m

31.6

, 34.

3,

57.4

30

.6, 3

4.8,

57

.8

31.6

, 31.

7,

57.2

31.8

, 34.

6,

57.2

31.6

, 33.

5,

57.2

31.6

, 31.

6,

57.4

31.6

, 31.

8,

57.4

31

.4, 3

4.2,

57

.7

31.6

, 34

.4, 5

6.0

31.6

, 31.

8,

57.4

31.6

, 31.

8,

57.3

31

.6,

34.2

, 57.

7

31.6

, 31

.8, 5

7.4

C-P

y ort

ho

143.

1,

144.

2

149.

0

143.

0,

144.

1

143.

7, 1

44.2

142.

9, 1

44.1

143.

3, 1

44.3

143.

2, 1

44.2

140.

3, 1

41.3

143.

6,

144.

5

143.

1. 1

44.2

143.

0, 1

44.1

143.

6,

144.

5

143.

1,

144.

2

C-P

y met

a

107.

1,

108.

8

106.

2

106.

7, 1

08.4

107.

3, 1

09.0

106.

9, 1

08.5

107.

8, 1

09.3

107.

4, 1

09.1

107.

6, 1

09.3

108.

2,

109.

9

107.

4, 1

09.1

107.

3, 1

09.1

108.

0,

109.

8

107.

5,

109.

2

C-P

y ip

so

153.

7

150.

9

153.

6

153.

5

153.

5

153.

9

153.

8

151.

8

154.

8

153.

7

153.

7

153.

9

153.

7

CH

=N

148.

1

143.

2

152.

6

143.

1

148.

1

146.

6 (d

, 2.7

)

146.

9

149.

4

148.

6

148.

2

148.

2

148.

1

148.

1

C-P

h1 n

38.8

31.4

, 33.

5

- - - - - - - - - -

C-

Ph

1 ips

o

133.

4

137.

3

139.

5

120.

8

135.

6

136.

0

(d, 8

.1)

138.

6

144.

3

135.

1

135.

4

130.

72

139.

7

131.

1

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

128.

4

126.

0-12

9.1

132.

3, 1

57.9

128.

0-12

9.2

113.

2

(d, 2

2.0)

, 12

4.1

(d, 2

.5)

130.

1 (

d, 8

.7)

128.

9

132.

6, 1

33.2

127.

8 13

1.4

127.

4-12

9.5

128.

1, 1

28.4

126.

9-12

9.7

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

128.

3

126.

0-12

9.1

112.

0, 1

35.4

114.

4

130.

9

(d, 8

.1)

116.

0 (d

, 21.

8)

129.

1

128.

3-12

9.3

132.

8,

138.

2

127.

4-12

9.5

128.

1,

128.

4

126.

9-12

9.7,

13

5.4

C-P

h1 p

ara

127.

4

126.

5

126.

0-12

9.1

121.

3

133.

6

117.

4

(d, 2

2.0)

162.

5

(d, 2

47.2

)

140.

3

128.

3-12

9.3

133.

4

140.

7

145.

5

132.

7

C-P

h1 R

- - -

55.8

55.4

162.

4 (d

, 244

.1)

- - -

20.8

21.1

-

126.

9-12

9.7

Nr.

2C

3C

4C

5C

6C

7C

8C

9C

10A

11C

12C

13C

14C

Tab

elle

27:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2C

-14C

.


108

7.1.2.3.4 Substituent am Pyridin-N = 4-Butylphenyl (Edukt: 4-Bromobutylphenyl)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2D Benzaldehyd (4-butylphenyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C22H24BrN3 410.30 0.25 C3 -

6D 4-Methoxybenzaldehyd (4-butylphenyl)-


C23H26BrN3O 440.32 0.25 C1 -

10D 2,6-Dichlorbenzaldehyd (4-

butylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C22H22BrCl2N3 479.19 0.25 C1 -

12D 4-Methylbenzaldehyd (4-butylphenyl)-


C23H26BrN3 424.32 0.25 C1 -

13D 4-Nitrobenzaldehyd (4-butylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C22H23BrN4O2 455.29 0.25 C2 -

Tabelle 28: Analytische Daten der Verbindungen 2D-13D.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2D gelblicher

FS

699, 748, 775, 801, 820, 1464, 1477, 1492, 1561, 1636,

28863, 2922, 3026 138 164 (61 %) 8.9 3.9 330

6D gelblicher

FS

699, 742, 819, 834, 1239, 1459, 1502, 1567, 1604, 1638, 2835, 2856, 2918, 3002, 3024,

3059

92 184 (59 %) 8.8 3.4 360

10D gelblicher

FS

686, 702, 745, 820, 1009, 1161, 1203, 1336, 1456, 1514, 1544, 1639, 2363, 2817, 2896,

3065

183-186 154 (52 %) 8.8 4.0 399

12D gelblicher

FS

702, 727, 748, 821, 1456, 1505, 1565, 1640, 2854, 2941,

3027 116 135 (63 %) 8.8 4.0 344

13D oranger

FS

689, 702, 749, 823, 1326, 1479, 1499, 1566, 1591, 1637,

2922, 2990, 3062 137 108 (29 %) 9.0 3.9 375

Tabelle 29: IR-Daten der Verbindungen 2D-13D.


109

H-P

h2

7.39

-7.4

6 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.40

-7.4

5 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.39

-7.4

7 (m

)

H-P

h2 m

1.51

(qi

, 7.4

),

1.64

(qi

, 7.4

) 2.

57 (

t, 7.

4)

3.71

(t,

7.4)

1.51

(qi

, 7.4

),

1.64

(qi

, 7.4

) 2.

58 (

t, 7.

4)

3.68

(t,

7.4)

1.53

(qi

, 7.5

),

1.65

(qi

, 7.5

) 2.

57 (

t, 7.

5)

3.75

(t,

7.5)

1.53

(qi

, 7.3

),

1.66

(qi

, 7.3

) 2.

59(t

, 7.3

) 3.

71 (

t, 7.

3)

1.54

(qi

, 7.4

),

1.70

(qi

, 7.4

) 2.

61(t

, 7.4

) 3.

82 (

t, 7.

4)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.2

8 (b

s)

12.6

3 (b

s)

12.3

2 (b

s)

12.6

8 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.43

(dd

, 7.3

/1.5

),

8.55

(dd

, 7.3

/1.5

)

8.56

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.45

(dd

, 7.4

/1.3

),

8.57

(dd

, 7.4

/1.3

)

8.55

(d,

7.2

),

8.68

(d,

7.2

)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

7.05

-7.0

7 (m

),

7.63

(d

d, 7

.3/2

.7)

7.15

(d

d, 7

.1/2

.2),

7.

53

(dd,

7.1

/2.2

)

7.07

(d

d, 7

.4/2

.7),

7.

66

(dd,

7.4

/2.7

)

7.20

(d,

7.2

),

7.80

(d,

7.2

)

CH

=N

8.28

(s)

8.22

(s)

8.53

(s)

8.23

(s)

8.38

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.84

(d

d, 6

.6/2

.8)

7.78

(d

, 8.9

)

-

7.73

(d

, 8.1

)

8.31

(d

, 8.9

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.04

(d

, 8.9

)

7.61

(d

, 7.8

)

7.30

(d

, 8.1

)

8.11

(d

, 8.9

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

-

7.48

(t,

7.8)

-

-

H-P

h1 R

-

3.82

(s)

-

2.36

(s)

-

Nr.

2D

6D

10D

12D

13D

C-P

h2

128.

0-12

8.9,

13

5.4

125.

9, 1

28.0

-12

9.2,

135

.5

128.

3-12

9.3,

14

1.4

127.

4-12

9.5,

13

5.4

124.

0, 1

28.8

, 12

9.1,

135

.3

C-P

h2 m

28.1

, 29.

4 35

.5, 6

4.6

28.3

, 29.

1,

35.4

, 64.

3 28

.1, 2

9.6,

35

.3 6

4.5

28.2

, 29.

1,

35.4

, 64.

4 28

.7, 2

9.4,

35

.4, 6

4.4

C-P

y ort

ho

143.

1, 1

44.2

142.

9, 1

44.1

143.

6,

144.

5

143.

0, 1

44.1

143.

6,

144.

5

C-P

y met

a

107.

4, 1

09.1

107.

1, 1

08.9

108.

2, 1

09.9

107.

3, 1

09.1

108.

0, 1

09.8

C-

Py i

pso

153.

8

153.

5

154.

8

153.

7

153.

9

CH

=N

148.

1

148.

1

148.

6

148.

2

148.

1

C-P

h1 i

pso

133.

4

135.

6

135.

1

130.

72

139.

7

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

128.

0-12

9.2

132.

6, 1

33.2

127.

4-12

9.5

128.

1, 1

28.4

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

114.

4

128.

3-12

9.3

127.

4-12

9.5

128.

1,

128.

4

C-P

h1 p

ara

129.

1

133.

6

128.

3-12

9.3

140.

7

145.

5

C-P

h1 R

-

55.0

-

21.1

-

Nr.

2D

6D

10D

12D

13D

Tab

elle

30:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2D–1

3D.

Tab

elle

31:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2D

-13D

.


110

7.1.2.3.5 Substituent am Pyridin-N = 5-Pentylphenyl (Edukt: 5-Bromopentylphenyl)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2E Benzaldehyd (5-pentylphenyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C23H26BrN3 424.31 0.25 C2 -

6E 4-Methoxybenzaldehyd (5-

pentylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C24H28BrN3O 454.33 0.25 C1 -

10E 2,6-Dichlorbenzaldehyd (45-

pentylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C23H24BrCl2N3 493.20 0.25 C1 -

12E 4-Methylbenzaldehyd (5-pentylphenyl)-


C24H28BrN3 438.33 0.25 C2 -

13E 4-Nitrobenzaldehyd 5-pentylphenyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C23H25BrN4O2 469.31 0.25 C2 -

Tabelle 32: Analytische Daten der Verbindungen 2E-13E.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2E gelblicher

FS

699, 748, 775, 801, 824, 1464, 1477, 1490, 1561, 1636, 2863,

2922, 3024 137 169 (55 %) 8.9 4.0 344

6E gelblicher

FS

698, 746, 819, 834, 1248, 1459, 1504, 1567, 1604, 1638, 2835, 2855, 2918, 2997, 3024,

3059

108 197 (67 %) 8.8 3.5 374

10E gelblicher

FS

686, 702, 745, 820, 1009, 1161, 1203, 1336, 1456, 1514, 1544, 1639, 2363, 2817, 2896,

3065

169 172 (65 %) 8.8 4.1 413

12E gelblicher

FS

702, 727, 748, 821, 1456, 1505, 1565, 1640, 2854, 2941,

3027 115 125 (56 %) 8.8 4.1 358

13E oranger

FS

689, 702, 749, 823, 1326, 1479, 1499, 1566, 1591, 1637,

2922, 2990, 3062 123 138 (80 %) 9.0 4.0 389

Tabelle 33: IR-Daten der Verbindungen 2E-13E.


111

H-P

h2

7.39

-7.4

6 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.40

-7.4

5 (m

)

7.38

-7.4

6 (m

)

7.39

-7.4

7 (m

)

H-P

h2 m

1.

24 (

qi, 7

.4),

1.5

7 (q

i, 7.

4),

1.65

(qi

, 7.4

), 2

.54

(t, 7

.4),

3.

67 (

t, 7.

4)

1.24

(qi

, 7.4

), 1

.51

(qi,

7.4)

, 1.

64 (

qi, 7

.4),

2.5

8 (t

, 7.4

),

3.68

(t,

7.4)

1.24

(qi

, 7.4

), 1

.51

(qi,

7.4)

, 1.

64 (

qi, 7

.4),

2.5

7 (t

, 7.4

),

3.71

(t,

7.4)

1.24

(qi

, 7.4

), 1

.51

(qi,

7.4)

, 1.

64 (

qi, 7

.4),

2.5

7 (t

, 7.4

),

3.71

(t,

7.4)

1.24

(qi

, 7.4

), 1

.54

(qi,

7.4)

, 1.

70 (

qi, 7

.4),

2.6

1 (t

, 7.4

),

3.82

(t,

7.4)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.2

8 (b

s)

12.6

3 (b

s)

12.3

2 (b

s)

12.6

8 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.43

(d

d, 7

.3/1

.5),

8.

55

(dd,

7.3

/1.5

)

8.56

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.45

(d

d, 7

.4/1

.3),

8.

57

(dd,

7.4

/1.3

)

8.55

(d,

7.2

),

8.68

(d,

7.2

)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

7.05

-7.0

7 (m

),

7.63

(d

d, 7

.3/2

.7)

7.15

(d

d, 7

.1/2

.2),

7.

53

(dd,

7.1

/2.2

)

7.07

(d

d, 7

.4/2

.7),

7.

66

(dd,

7.4

/2.7

)

7.20

(d,

7.2

),

7.80

(d,

7.2

)

CH

=N

8.28

(s)

8.22

(s)

8.53

(s)

8.23

(s)

8.38

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.84

(d

d, 6

.6/2

.8)

7.78

(d

, 8.9

)

-

7.73

(d

, 8.1

)

8.31

(d

, 8.9

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.04

(d

, 8.9

)

7.61

(d

, 7.8

)

7.30

(d

, 8.1

)

8.11

(d

, 8.9

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

-

7.48

(t

, 7.8

)

-

-

H-P

h1 R

-

3.82

(s)

-

2.29

(s)

-

Nr.

2E

6E

10E

12E

13E

C-P

h2

128.

0-12

8.9,

13

5.4

125.

9, 1

28.0

-12

9.2,

135

.5

128.

3-12

9.3,

14

1.4

127.

4-12

9.5,

13

5.4

124.

0, 1

28.8

, 12

9.1,

135

.3

C-P

h2 m

27.1

, 30.

9, 3

1.4,

35

.7, 6

4.3

27.5

, 30.

5, 3

1.7

35.7

, 64.

5 27

.1, 3

0.1,

31

.1, 3

5.3,

64

.3

27.3

, 30.

9, 3

1.6,

35

.7, 6

4.3

27.4

, 30.

9,

31.4

, 35.

6,

64.3

C-P

y ort

ho

143.

1, 1

44.2

142.

9, 1

44.1

143.

6, 1

44.5

143.

0, 1

44.1

143.

6, 1

44.5

C-P

y met

a

107.

4, 1

09.1

107.

1, 1

08.9

108.

2, 1

09.9

107.

3, 1

09.1

108.

0, 1

09.8

C-

Py i

pso

153.

8

153.

5

154.

8

153.

7

153.

9

CH

=N

148.

1

148.

1

148.

6

148.

2

148.

1

C-P

h1 i

pso

133.

4

135.

6

135.

1

130.

72

139.

7

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

128.

0-12

9.2

132.

6, 1

33.2

127.

4-12

9.5

128.

1, 1

28.4

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

114.

4

128.

3-12

9.3

127.

4-12

9.5

128.

1,

128.

4

C-P

h1 p

ara

129.

1

133.

6

128.

3-12

9.3

140.

7

145.

5

C-P

h1 R

-

55.0

-

21.1

-

Nr.

2E

6E

10E

12E

13E

Tab

elle

34:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2E –

13E

.

Tab

elle

35:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2E

-13E

.


112

7.1.2.3.6 Substituent am Pyridin-N = 4-Fluorbenzyl (Edukt: 4-Fluorbenzylbromid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2F Benzaldehyd (4-Fluorbenzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17BrFN3 386.26 0.5 C3 -

4F 3-Phenylpropylaldehyd (4-Fluorbenzyl)-


C21H21BrFN3 414.31 0.5 C3 -

9F 4-Chlorbenzaldehyd (4-Fluorbenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C19H16BrClFN3 420.70 0.5 C3 -

Tabelle 36: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2F-9F.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2F Gelblicher

FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360, 2858, 2935,

3069

194 121 (45%)) 8.8 3.8 306

4F Gelblicher

FS

692, 704, 745, 816, 1030, 1116, 1170, 1351, 1389, 1518, 1558, 1644, 2774, 2845, 2971,

3086, 3181

152 136 (48 %) 8.8 3.9 334

9F Gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

176-178 105 (36 %) 8.8 3.8 340

Tabelle 37: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2F-9F.


113

H-P

h2

7.25

-7.3

5 (m

) 7.

64 (

dd, 7

.5/4

.9)

7.21

-7.3

2 (m

) 7.

50 (

t, 4.

9)

7.28

(t,

8.9)

, 7.

50-7

.56

(m)

H-P

h2 m

5.55

(s)

5.43

(s)

5.49

(s)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.0

0 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.40

(d,

7.1

) 8.

48 (

d, 7

.1)

8.39

(d,

7.2

) 8.

48 (

d, 7

.2)

8.47

(d,

7.3

) 8.

59 (

d, 7

.3)

H-P

y met

a

6.93

(d,

7.1

),

7.37

(d,

7.1

)

6.93

(dd

, 7.1

/2.1

) 7.

36 (

dd, 7

.1/2

.1)

7.11

(dd

, 7.2

/2.5

) 7.

71 (

dd, 7

.2/2

.5)

CH

=N

8.08

(s)

7.64

(t,

4.9)

8.26

(s)

H-P

h1 o

rtho

.25-

7.35

(m

)

7.21

-7.3

2 (m

)

7.87

(d,

8.6

)

H-P

h1 m

eta

.25-

7.35

(m

)

7.21

-7.3

2 (m

)

7.50

-7.5

6 (m

)

H-P

h1 p

ara

.25-

7.35

(m

)

7.21

-7.3

2 (m

)

H-P

h1 n

2.72

-2.7

9 (m

),

2.87

(t,

7.5)

Nr.

2F

4F

9F

C-P

h2

115.

4 (d

, 2 J =

68)

13

1.5

(d, 3 J

= 2

8),

131.

0 26

1.7

(1 J =

260

)

115.

9 (d

, 2 J =

64)

13

0.5

(d, 3 J

= 1

6),

131.

6 26

2.7

(1 J =

288

)

116.

2 (d

, 2 J =

88)

, 13

0.5

(d, 3 J

= 3

2),

132.

4 16

1.2(

d, 1 J

= 2

12)

C-P

h2 m

58.9

59.2

62.0

C-P

y ort

ho

142.

2, 1

43.3

142.

9, 1

43.9

143.

1,

144.

1

C-P

y met

a

106.

9 10

9.0

106.

7, 1

08.6

107.

6,

109.

3

C-P

y ip

so

152.

9

152.

9

146.

8

CH

=N

140.

7

140.

7

135.

2

C-P

h1 i

pso

153.

9

153.

6

153.

8

C-

Ph

1 ort

ho

128.

2

128.

4

129.

0

C-P

h1 m

eta

128.

8

128.

4

129.

1

C-P

h1 p

ara

129.

1

126.

0

131.

5

C-P

h1 n

31.3

, 33.

5

Nr.

2F

4F

9F

Tab

elle

39:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2F–9

F.

Tab

elle

38:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2F

-9F

.


114

7.1.2.3.7 Substituent am Pyridin-N = 2-Iodbenzyl (Edukt: 2-Iodbenzylbromid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2G Benzaldehyd (2-Iodbenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C19H17BrIN3 494.17 0.5 C2 -

9G 4-Chlorbenzaldehyd (2-Iodbenzyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H16BrClIN3 528.61 0.5 C2 -

Tabelle 40: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2G-9G.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2G Gelblicher

FS

698, 746, 819, 834, 1248, 1459, 1504, 1567, 1604, 1638, 2835, 2855, 2918, 2997, 3024,

3059;

165-167 131 (38%)) 8.8 3.9 413

9G Gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

165-168 157 (38 %) 8.8 3.9 447

Tabelle 41:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2G-9G.


115

H-P

h2

7.14

-7.3

1 (m

) 7.

47 (

dt, 7

.6/1

.2)

7.74

(dd,

7.3

/2.7

) 7.

99 (

dd, 7

.8, 1

.8)

77.1

4-7.

31 (

m)

7.47

(dt

, 7.6

/1.2

) 7.

74(d

d, 7

.3/2

.7)

7.99

(dd

, 7.8

, 1.8

)

H-P

h2 m

5.54

(s)

5.53

(s)

H-B

r

12.3

5(bs

)

12.4

0 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.34

(dd

, 7.3

/1.3

) 8.

51 (

dd, 7

.3/1

.3)

8.34

(dd

, 7.3

/1.3

) 8.

50 (

dd, 7

.3/1

.3)

H-P

y met

a

7.11

(dd

, 7.7

/1.3

),

7.14

-7.3

1 (m

)

7.10

(dd

, 7.7

/1.3

),

7.14

-7.3

1 (m

)

CH

=N

8.30

(s)

8.29

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.85

(d,

8.5

)

7.88

(d,

8.5

)

H-P

h1 m

eta

7.53

-7.5

8 (m

)

7.56

(d,

8.5

)

H-P

h1 p

ara

7.53

-7.5

8 (m

)

Nr.

2G

9G

C-P

h2

99.1

,, 12

9.1,

129

.5,

130.

7, 1

37.2

, 138

.9

99.1

,, 12

9.1,

129

.5,

130.

7, 1

37.2

, 138

.9

C-P

h2 m

61.8

61.9

C-P

y ort

ho

143.

8, 1

44.8

143.

5, 1

44.8

C-P

y met

a

107.

6, 1

09.2

107.

5, 1

09.2

C-P

y ip

so

147.

1

147.

0

CH

=N

134.

9

135.

2

C-P

h1 i

pso

153.

8

153.

9

C-

Ph

1 ort

ho

129.

0

129.

0

C-P

h1 m

eta

129.

1

129.

1

C-P

h1 p

ara

130.

9

136.

9

Nr.

2G

9G

Tab

elle

43:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2G–9

G.

Tab

elle

42:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2G

-9G

.


116

7.1.2.3.8 Substituent am Pyridin-N = 2-Brombenzyl (Edukt: 2-Brombenzylbromid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2H Benzaldehyd (2-Brombenzyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17Br2N3 447.17 0.5 C3 -

4H 3-Propylphenylaldehyd (2-

Brombenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H21Br2N3 475.21 0.5 C3 -

7H 3-Fluorbenzaldehyd (2-Brombenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C19H16Br2FN3 465.16 0.5 C3 Hünig

9H 4-Chlorbenzaldehyd (2-Brombenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C19H16Br2ClN3 481.61 0.5 C1 -

Tabelle 44: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2H-9H.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2H Gelblicher

FS

698, 746, 819, 834, 1248, 1459, 1504, 1567, 1604, 1638, 2835, 2855, 2918, 2997, 3024,

3059;

198 138 (45%) 8.8 3.9 366

4H Gelblicher

FS

696, 732, 752, 812, 11798, 1453, 1483, 1519, 1600, 1647,

2850, 2917, 3024 Öl 112 (36 %) 8.8 3.9 395

7H Gelblicher

FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369, 2855, 2925,

3074

176-179 124 (39 %) 8.8 3.8 385

9H Gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

175-178 156 (39 %) 8.8 3.9 401

Tabelle 45:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2H-9H.


117

H-P

h2

7.38

(dt

, 7.7

/1.7

) 7.

47 (

dt, 7

.5, 1

.2)

7.87

-7.8

9 (m

)

7.38

(dt

, 7.7

/1.7

) 7.

47 (

dt, 7

.5, 1

.2)

7.87

-7.8

9 (m

)

7.38

(dt

, 7.7

/1.7

) 7.

47 (

dt, 7

.5, 1

.2)

7.87

-7.8

9 (m

)

7.38

(dt

, 7.7

/1.7

) 7.

47 (

dt, 7

.5, 1

.2)

7.87

-7.8

9 (m

)

H-P

h2 m

5.59

(s)

5.55

(s)

5.60

(s)

5.60

(s)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.4

4(bs

)

12.3

6 (b

s)

12.4

0 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.37

(dd

, 7.2

/1.3

) 8.

52 (

dd, 7

.2/1

.3)

8.37

(dd

, 7.2

/2.0

) 8.

52 (

dd, 7

.2/2

.0)

8.37

(dd

, 7.2

/1.3

) 8.

52 (

dd, 7

.2/1

.3)

8.37

(dd

, 7.2

/1.3

) 8.

52 (

dd, 7

.2/1

.3)

H-P

y met

a

7.14

(dd

, 7.

2/2.

6),

7.25

(dd

, 7.2

/2.6

)

7.14

(dd

, 7.

2/2.

5),

7.25

(dd

, 7.2

/2.5

)

7.14

(dd

, 7.

2/2.

6),

7.25

(dd

, 7.2

/2.6

)

7.14

(dd

, 7.

2/2.

6),

7.25

(dd

, 7.2

/2.6

)

CH

=N

8.29

(s)

7.79

(t,

5.2)

8.29

(s)

8.29

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.83

(d, 8

.5)

7.89

(d,

8.5

)

7.48

-7.5

5 (m

)

7.88

(d,

8.5

)

H-P

h1 m

eta

7.54

-7.5

7 (m

)

7.56

-7.6

0 (m

)

7.48

-7.5

5 (m

)

7.56

(d,

8.5

)

H-P

h1 p

ara

7.54

-7.5

7 (m

)

7.56

-7.6

0 (m

)

7.48

-7.5

5 (m

))

H-P

h1 n

2.66

(dt

, 7.

4/5.

2),

2.87

(t,

7.4)

Nr.

2H

4H

7H

9H

C-P

h2

122.

9, 1

28.6

, 13

0.4,

130

.9,

132.

4 , 1

34.3

12

2.9,

128

.6,

130.

4, 1

30.9

, 13

2.4,

134

.3

122.

9, 1

28.6

, 13

0.4,

130

.9,

132.

4 , 1

34.3

12

2.9,

128

.6,

130.

4, 1

30.9

, 13

2.4,

134

.3

C-P

h2 m

59.7

59.8

55.4

60.3

C-P

y ort

ho

143.

5, 1

44.7

143.

5, 1

44.7

143.

5, 1

44.7

143.

5, 1

44.7

C-P

y met

a

107.

4 10

9.2

107.

4 10

9.2

107.

4 10

9.2

107.

4 10

9.2

C-P

y ip

so

147.

0

147.

0

147.

0

147.

0

CH

=N

135.

2

135.

2

135.

2

135.

2

C-P

h1 i

pso

153.

9

139.

5

136.

0

(d, 8

.1)

153.

9

C-P

h1 o

rtho

129.

0

126.

0-12

9.1

113.

2

(d, 2

2.0)

, 12

4.1

(d, 2

.5)

129.

0

C-P

h1 m

eta

129.

1

126.

0-12

9.1

130.

9

(d, 8

.1)

129.

1

C-P

h1 p

ara

133.

3

126.

0-12

9.1

117.

4

(d, 2

2.0)

133.

3

C-P

h1 n

31.4

, 33.

5

Nr.

2H

4H

7H

9H

Tab

elle

46:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2H–9

H.

Tab

elle

47:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2H

-9H

.


118

7.1.2.3.9 Substituent am Pyridin-N = 4-Brom-2-Fluorbenzyl (Edukt: 4-Brom-2-

Fluorbenzylbromid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2I Benzaldehyd (4-Brom-2-Fluorbenzyl)-


C19H17Br2FN3 465.16 0.25 C3 NEt3

4I 3-Propylphenylaldehyd (4-Brom-2-

Fluor benzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H21Br2FN3 493.21 0.5 C3 NEt3

9I 4-Chlorbenzaldehyd (4-Brom-2-Fluor benzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-

Hydrobromid C19H16Br2FClN3 499.60 0.25 C3 NEt3

Tabelle 48: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2I-9I.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2I Gelblicher

FS

698, 746, 819, 834, 1248, 1459, 1504, 1567, 1604, 1638, 2835, 2855, 2918, 2997, 3024,

3059;

186-188 126 (47%) 8.8 3.9 384

4I Gelblicher

FS

696, 732, 752, 812, 11798, 1453, 1483, 1519, 1600, 1647,

2850, 2917, 3024 176-177 184 (42 %) 8.8 3.9 412

9I Gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

166-168 176 (75 %) 8.8 4.0 419

Tabelle 49:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2I-9I.


119

H-P

h2

76.9

1 (b

s)

7.19

-7.3

2 (m

)

6.89

(bs

) 7.

10-7

.32

(m)

76.8

9 (b

s)

7.12

-7.2

8 (m

)

H-P

h2 m

5.59

(s)

5.45

(s)

5.60

(s)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.4

4(bs

)

12.4

0 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.37

(dd

, 7.2

/1.3

) 8.

52 (

dd, 7

.2/1

.3)

8.24

(dd

, 7.3

/1.5

) 8.

38 (

dd, 7

.3/1

.5)

8.37

(dd

, 7.2

/1.8

) 8.

52 (

dd, 7

.2/1

.8)

H-P

y met

a

7.14

(dd

, 7.

2/2.

6),

7.25

(dd

, 7.2

/2.6

)

7.14

(dd

, 7.

2/2.

5),

7.25

(dd

, 7.2

/2.5

) 7.

14 (

dd,

7.2/

2.6)

, 7.

25 (

dd, 7

.2/2

.6)

CH

=N

8.29

(s)

7.73

(t,

5.0)

8.29

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.19

-7.3

2 (m

)

7.10

-7.3

2 (m

)

7.12

-7.2

8 (m

)

H-P

h1 m

eta

7.19

-7.3

2 (m

)

7.10

-7.3

2 (m

)

7.12

-7.2

8 (m

)

H-P

h1 p

ara

7.19

-7.3

2 (m

)

7.10

-7.3

2 (m

)

7.12

-7.2

8 (m

)

H-P

h1 n

2.66

-2.6

9 (m

) 2.

87 (

t, 7.

5)

Nr.

2I

4I

9I

C-P

h2

119.

3 (d

, 100

),

121.

8 (d

, 60)

, 12

3.0,

128

.3,

132.

2 (d

, 16)

119.

3 (d

, 100

),

121.

8 (d

, 60)

, 12

3.0,

128

.3,

132.

2 (d

, 16)

119.

3 (d

, 100

),

121.

8 (d

, 60)

, 12

3.0,

128

.3,

132.

2 (d

, 16)

C-P

h2 m

59.7

61.9

60.3

C-P

y ort

ho

143.

5, 1

44.7

143.

5, 1

44.6

143.

3, 1

44.4

C-P

y met

a

107.

4 10

9.2

107.

4 10

9.2

107.

5, 1

09.2

C-P

y ip

so

147.

0

147.

0

147.

0

CH

=N

135.

2

135.

2

135.

2

C-P

h1 i

pso

153.

9

153.

9

153.

9

C-P

h1 o

rtho

129.

0

129.

0

129.

0

C-P

h1 m

eta

129.

1

129.

1

129.

1

C-P

h1 p

ara

132.

4

133.

0

132.

8

C-P

h1 n

25.5

, 54.

3

Nr.

2I

4I

9I

Tab

elle

50:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2I–9

I.

Tab

elle

51:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2I

-9I.


120

7.1.2.3.10 Substituent am Pyridin-N = 2,5-Dimethylbenzyl (Edukt: 2,5-

Dimethylbenzylbromid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2J Benzaldehyd (2,5-Dimethylbenzyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C21H23BrN3 396.32 0.25 C1 NEt3

4J 3-Propylphenylaldehyd (2,5-

Dimethylbenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C23H27BrN3 424.38 0.25 C1 NEt3

9J 4-Chlorbenzaldehyd (2,5-

Dimethylbenzyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H22BrClN3 430.77 0.25 C1 NEt3

Tabelle 52: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2J-9J.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2J Gelblicher

FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360, 2858, 2935,

3069

179-182 122 (42%) 8.8 3.9 315

4J Gelblicher

FS

692, 704, 745, 816, 1030, 1116, 1170, 1351, 1389, 1518, 1558, 1644, 2774, 2845, 2971,

3086, 3181

179-183 192 (75 %) 8.8 3.9 343

9J Gelblicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3071

175-176 106 (36 %) 8.8 4.0 350

Tabelle 53:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2J-9J.


121

H-P

h2

7.39

-7.4

6 (m

)

7.36

-7.4

6 (m

)

7.37

-7.4

8 (m

)

H-P

h2 m

/R

2.41

(s)

5.

51 (

s)

2.43

(s)

5.

45 (

s)

2.41

(s)

5.

60 (

s)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.4

4(bs

)

12.4

0 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.24

(dd

, 7.3

/1.5

) 8.

38 (

dd, 7

.3/1

.5)

8.37

(dd

, 7.2

/1.8

) 8.

52 (

dd, 7

.2/1

.8)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

7.14

(dd

, 7.

2/2.

5),

7.25

(dd

, 7.2

/2.5

) 7.

14 (

dd,

7.2/

2.6)

, 7.

25 (

dd, 7

.2/2

.6)

CH

=N

8.28

(s)

7.73

(t,

5.0)

8.29

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.84

(d

d, 6

.6/2

.8)

7.84

(d

d, 6

.6/2

.4)

7.12

-7.2

8 (m

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.36

-7.4

6 (m

)

7.37

-7.4

8 (m

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

7.46

-7.4

9 (m

)

H-P

h1 n

2.66

-2.7

0 (m

) 2.

87 (

t, 7.

5)

Nr.

2J

4J

9J

C-P

h2

126.

9, 1

28.7

, 13

0.0,

131

.7,

135.

2, 1

40.5

126.

9, 1

28.7

, 13

0.0,

131

.7,

135.

2, 1

40.5

126.

9, 1

28.7

, 13

0.0,

131

.7,

135.

2, 1

40.5

C-P

h2 m

19.1

, 20

.8,

59.7

18.9

, 21

.9,

61.9

18.8

, 21

.3,

60.3

C-P

y ort

ho

143.

5, 1

44.7

143.

5, 1

44.6

143.

3, 1

44.4

C-P

y met

a

107.

4 10

9.2

107.

4 10

9.2

107.

5, 1

09.2

C-P

y ip

so

147.

0

147.

0

147.

0

CH

=N

135.

2

135.

2

135.

2

C-P

h1 i

pso

153.

9

153.

9

153.

9

C-P

h1 o

rtho

129.

0

129.

0

129.

0

C-P

h1 m

eta

129.

1

129.

1

129.

1

C-P

h1 p

ara

132.

4

133.

0

132.

8

C-P

h1 n

25.5

, 54.

3

Nr.

2J

4J

9J

Tab

elle

55:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2J

-9J.

Tab

elle

54:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2I–9

I.


122

7.1.2.3.11 Substituent am Pyridin-N = 2-Methylnaphthyl (Edukt: 2-Bromomethylnaphthalen)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2K Benzaldehyd (2-Methylnaphthyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C23H20BrN3 418.31 300 B NEt3

5K 2-Methoxybenzaldehyd (2-

Methylnaphthyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C24H22BrN3O 448.33 500 B NEt3

12K 4-Methylbenzaldehyd (2-

Methylnaphthyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C24H22BrN3 432.33 500 B NEt3

Tabelle 56: Analytische Daten der Verbindungen 2K-12K.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2K gelblicher

FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360, 2858, 2935,

3069

179-182 154 (42 %) 8.8 3.9 338

5K gelblicher

FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369, 2855, 2925,

3074

183 151 (73 %) 8.8 3.4 368

12K gelblicher

FS

700, 737, 771, 810, 1033, 1075, 1126, 1204, 1348, 1519, 1549, 1637, 2857, 2937, 2978,

3072

179-182 149 (39 %) 8.8 4.0 352

Tabelle 57: IR-Daten der Verbindungen 2K-14K.


123

H-P

h2

7.19

-7.2

0 (m

) 7.

39-7

.49

(m)

7.94

-8.0

1 (m

)

7.19

-7.2

0 (m

) 7.

39-7

.49

(m)

7.94

-8.0

1 (m

)

7.19

-7.2

0 (m

) 7.

39-7

.49

(m)

7.94

-8.0

1 (m

)

H-P

h2 m

5.51

(s)

5.49

(s)

5.50

(s)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.3

4

12.3

2 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.45

(d

d, 7

.3/2

.0),

8.

57

(dd,

7.3

/2.0

)

8.45

(d

d, 7

.4/1

.3),

8.

57

(dd,

7.4

/1.3

)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

7.02

-7.0

7 (m

),

7.65

(d

d, 7

.3/2

.0)

7.07

(d

d, 7

.4/2

.7),

7.

66

(dd,

7.4

/2.7

)

CH

=N

8.28

(s)

8.59

(s)

8.23

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.84

(d

d, 6

.6/2

.8)

7.97

(d

d, 7

.8/1

.7)

7.73

(d

, 8.1

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.14

(d,

8.1

),

7.02

-7.0

7 (m

)

7.30

(d

, 8.1

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

-

-

H-P

h1 R

-

3.88

(s)

2.36

(s)

Nr.

2K

5K

12K

C-P

h2

125.

1, 1

60.0

, 127

.3,

127.

5, 1

27.6

, 128

.0,

131.

8, 1

33.7

, 135

.2

125.

1, 1

60.0

, 127

.3,

127.

5, 1

27.6

, 128

.0,

131.

8, 1

33.7

, 135

.2

125.

1, 1

60.0

, 127

.3,

127.

5, 1

27.6

, 128

.0,

131.

8, 1

33.7

, 135

.2

C-

Ph

2 m

60.1

60.2

60.1

C-P

y ort

ho

143.

1, 1

44.2

143.

7, 1

44.2

143.

0, 1

44.1

C-P

y met

a

107.

4, 1

09.1

107.

3, 1

09.0

107.

3, 1

09.1

C-

Py i

pso

153.

8

153.

5

153.

7

CH

=N

148.

1

143.

1

148.

2

C-P

h1 i

pso

133.

4

120.

8

130.

72

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

132.

3, 1

57.9

127.

4-12

9.5

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

112.

0, 1

35.4

127.

4-12

9.5

C-P

h1 p

ara

129.

1

121.

3

140.

7

C-P

h1 R

-

55.8

21.1

Nr.

2K

5K

12K

Tab

elle

58:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2A–1

2K.

Tab

elle

59:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2K

-12K

.


124

7.1.2.3.12 Substituent am Pyridin-N = Pentyl (Edukt: 1-Brompentan)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2L Benzaldehyd (Pentyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H17BrIN3 348.28 3 C3 NEt3

12L 4-Chlorbenzaldehyd (Pentyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C19H16BrClIN3 382.73 3 C3 NEt3

Tabelle 60: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2L-12L.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2L Gelbliche

r FS

702, 717, 779, 1001, 1117, 1159, 1342, 1422, 1455, 1509, 1544, 1639, 2765, 2788, 2884,

3024

179-182 46 (13%)) 8.8 3.7 268

12L Gelbliche

r FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360, 2858, 2935,

3069

179-184 57 (15 %) 8.8 3.8 302

Tabelle 61:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2L-12L.


125

H-P

h2 m

0.93

(t,

7.0)

, 1.

28-1

.31

(m),

1.

62-1

.64

(m),

3.

58 (

t, 7.

2)

0.93

(t,

7.0)

, 1.

28-1

.31

(m),

1.

62-1

.64

(m),

3.

58 (

t, 7.

2)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.3

2 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.45

(d

d, 7

.4/1

.3),

8.

57

(dd,

7.4

/1.3

)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

7.07

(d

d, 7

.4/2

.7),

7.

66

(dd,

7.4

/2.7

)

CH

=N

8.28

(s)

8.23

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.84

(d

d, 6

.6/2

.8)

7.73

(d

, 8.1

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.30

(d

, 8.1

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

-

H-P

h1 R

2.36

(s)

Nr.

2L

12L

C-P

h2 m

14.1

, 22.

4, 2

9.7,

31.

1, 6

4.7

14.1

, 22.

4, 2

9.8,

31.

1, 6

4.7

C-P

y ort

ho

143.

1, 1

44.2

143.

1, 1

44.2

C-P

y met

a

107.

4, 1

09.1

107.

5, 1

09.2

C-P

y ip

so

153.

8

153.

7

CH

=N

148.

1

148.

1

C-P

h1 i

pso

133.

4

130.

72

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

127.

4-12

9.5

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

127.

4-12

9.5

C-P

h1 p

ara

129.

1

140.

7

Nr.

2L

12L

Tab

elle

63:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2L–1

2L.

Tab

elle

62:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2L

-12L

.


126

7.1.2.3.13 Substituent am Pyridin-N = N-(3-propyl)-phthalimid

(Edukt: N-(3-Brompropyl)-phthalimid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2M Benzaldehyd (N-(3-propyl)-

phthalimid)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C23H21BrN4O2 465.34 3 C2 NEt3

11M 3-Methylbenzaldehyd (N-(3-propyl)-


C24H23BrN4O2 479.37 3 C2 NEt3

12M 4-Methylbenzaldehyd (N-(3-propyl)-


C24H23BrN4O2 479.37 3 C2 NEt3

14M 2-Naphthaldehyd (N-(3-propyl)-phthalimid)-4-(1H)-pyridylen-

hydrazon-Hydrobromid C27H23BrN4O2 515.40 3 C2 NEt3

Tabelle 64: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2M-14M.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2M Weißlicher

FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360,

2858, 2935, 3069

179-182 166 (76%) 8.8 3.5 385

11M Weißlicher

FS

798, 746, 815, 1012, 1086, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854,

2924, 2973, 3071

178-180 122 (62 %) 8.8 3.8 399

12M Weißlicher

FS

702, 717, 779, 1001, 1117, 1159, 1342, 1422, 1455, 1509, 1544, 1639, 2765,

2788, 2884, 3024

179-182 105 (39 %) 8.8 3.6 399

14M Weißlicher

FS

699, 741, 818, 839, 1033, 1097, 1168, 1198, 1328, 1386, 1513, 1550, 1637,

2365, 2907, 3064

>250 168 (78 %) 8.8 4.1 435

Tabelle 65:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2M-14M.


127

H-P

h2

7.84

-7.9

4 (m

)

7.84

-7.9

2 (m

)

7.84

-7.9

2 (m

)

7.58

-8.2

1 (m

)

H-P

h2 m

2.16

(qi

, 6.9

),

3.64

(t,

6.9)

, 4.

32 (

t, 6.

9)

2.16

(qi

, 7.0

),

3.64

(t,

7.0)

, 4.

32 (

t, 7.

0

2.16

(qi

, 7.0

),

3.64

(t,

7.0)

, 4.

32 (

t, 7.

0 )

2.16

(qi

, 6.9

),

3.64

(t,

6.9)

, 4.

32 (

t, 6.

9)

H-B

r

12.5

4 (b

s)

12.5

4 (b

s)

12.4

6 (b

s)

12.5

1 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.41

(d,

6.8

),

8.49

(d,

6.8

)

8.41

(d,

7.1

),

8.49

(d,

7.1

)

8.41

(d,

7.1

),

8.49

(d,

7.1

)

8.43

(d,

7.1

),

8.49

(d,

7.1

)

H-P

y met

a

7.09

(d,

7.0

),

7.66

(d,

7.0

)

7.09

(d,

7.0

),

7.66

(d,

7.0

)

7.09

(d,

7.0

),

7.66

(d,

7.0

)

7.09

(d,

7.0

),

7.66

(d,

7.0

)

CH

=N

8.28

(s)

8.27

(s)

8.28

(s)

8.34

H-P

h1 o

rtho

7.84

-7.9

4 (m

)

7.64

-7.6

7 (m

)

7.68

-7.7

1(m

)

7.58

-8.2

1 (m

)

H-P

h1 m

eta

7.31

-7.3

5 (m

)

7.39

-7.4

2 (m

) 7.

64-7

.67

(m)

7.28

-7.3

2 (m

)

7.58

-8.2

1 (m

)

H-P

h1 p

ara

7.31

-7.3

5 (m

)

7.28

-7.3

0 (m

)

H-P

h1 n

2.36

(s)

2.34

(s)

7.58

-8.2

1 (m

)

Nr.

2M

11M

12M

14M

C-P

h2

123.

9, 1

32.2

, 13

2.6,

168

.9

123.

9, 1

32.2

, 13

2.6,

168

.9

123.

9, 1

32.2

, 13

2.6,

168

.9

123.

9, 1

32.2

, 13

2.6,

168

.9

C-P

h2 m

31.6

, 52.

7,

56.8

31.6

, 52.

7,

56.8

31.6

, 52.

7,

56.8

31.6

, 52.

7,

56.8

C-P

y ort

ho

143.

1, 1

44.2

143.

1, 1

44.2

143.

1, 1

44.2

143.

1, 1

44.2

C-P

y met

a

107.

4, 1

09.1

107.

4, 1

09.1

107.

4, 1

09.1

107.

4, 1

09.1

C-P

y ip

so

153.

8

153.

8

153.

8

153.

8

CH

=N

148.

1

148.

1

148.

1

148.

1

C-P

h1 i

pso

133.

4

135.

4

130.

72

131.

1

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

127.

8 13

1.4

127.

4-12

9.5

126.

9-12

9.7

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

132.

8,

138.

2

127.

4-12

9.5

126.

9-12

9.7,

13

5.4

C-P

h1 p

ara

129.

1

133.

4

140.

7

132.

7

C-P

h1 n

20.8

21.1

126.

9-12

9.7

Nr.

2M

11M

12M

14M

Tab

elle

66:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2M–1

4M.

Tab

elle

67:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2M

-14M

.


128

7.1.2.3.14 Substituent am Pyridin-N = N-(5-pentyl)-phthalimid

(Edukt: N-(5-Brompentyl)-phthalimid)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2N Benzaldehyd N-(5-pentyl)-


C25H24BrN4O2 493.40 1 C2 NEt3

6N 4-Methoxybenzaldehyd (N-(5-pentyl)-


C26H23BrN4O3 523.42 2 C2 NEt3

Tabelle 68: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2N-6N.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2N Gelblicher

FS

684, 704, 753, 815, 1031, 1121, 1161, 1352, 1387, 1518, 1549, 1638, 2360, 2858, 2935,

3069

179-182 108 (33%) 8.8 3.5 413

6N Gelblicher

FS

687, 705, 738, 841, 1000, 1082, 1167, 1201, 1346, 1387, 1513, 1557, 1639, 2841, 2913,

3062

178-180 134 (46 %) 8.8 3.4 443

Tabelle 69:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2N-6N.


129

H-P

h2

7.84

-7.9

4(m

)

7.87

-7.9

4(m

)

H-P

h2 m

1.21

-1.2

9 (m

),

1.60

-1.6

7 (m

),

1.83

(t,

6.9)

, 3.

57 (

t, 6.

9)

1.23

-1.2

9 (m

),

1.60

-1.6

7 (m

),

1.83

(t,

6.9)

, 3.

57 (

t, 6.

9)

H-B

r

12.4

0 (b

s)

12.2

8 (b

s)

H-P

y ort

ho

8.48

(d,

7.1

),

8.60

(d,

7.1

)

8.43

(d

d, 7

.3/1

.5),

8.

55

(dd,

7.3

/1.5

)

H-P

y met

a

7.11

(d,

7.1

),

7.69

(d,

7.1

)

7.05

-7.0

7 (m

),

7.63

(d

d, 7

.3/2

.7)

CH

=N

8.28

(s)

8.22

(s)

H-P

h1 o

rtho

7.84

-7.9

4(m

)

7.78

(d

, 8.9

)

H-P

h1 m

eta

7.39

-7.4

6 (m

)

7.04

(d

, 8.9

)

H-P

h1 p

ara

7.47

-7.4

9 (m

)

-

H-P

h1 R

3.82

(s)

Nr.

2N

6N

C-P

h2

123.

7,

132.

0,

132.

2 , 1

67.8

12

3.7,

13

2.0,

13

2.2,

167

.8

C-P

h2 m

25.0

, 29.

9,

31.8

, 41.

3, 6

5.1

25.0

, 29.

9,

31.8

, 41.

3, 6

5.1

C-P

y ort

ho

143.

1, 1

44.2

142.

9, 1

44.1

C-P

y met

a

107.

4, 1

09.1

107.

1, 1

08.9

C-P

y ip

so

153.

8

153.

5

CH

=N

148.

1

148.

1

C-P

h1 i

pso

133.

4

135.

6

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

128.

0-12

9.2

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

114.

4

C-P

h1 p

ara

129.

1

133.

6

C-P

h1 R

55.0

Nr.

2N

6N

Tab

elle

70:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2N

–6N

.

Tab

elle

71:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2N–6

N.


130

7.1.2.3.15 Substituent am Pyridin-N = Cinnamyl, (Edukt: (3-Bromprop-1-en-1-yl)-benzol)

Nr. Name Summen-

formel MR

[g/mol] Dauer

[h] Meth. Base

2O Benzaldehyd (Cinnamyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C21H20BrN3 394.31 0.5 C1 -

5O 2-Methoxybenzaldehyd (Cinnamyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C22H22BrN3O 424.33 1 C1 -

6O 4-Methoxybenzaldehyd (Cinnamyl)-4-(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid

C22H22BrN3O 424.33 1 C1 -

9O 4-Chlorbenzaldehyd (Cinnamyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C21H19BrClN3 428.75 0.5 C1 -

12O 4-Methylbenzaldehyd (Cinnamyl)-4-

(1H)-pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C22H22BrN3 408.33 1 C1 -

13O 4-Nitrobenzaldehyd (Cinnamyl)-4-(1H)-

pyridylen-hydrazon-Hydrobromid C21H19BrN4O2 439.30 0.5 C1 -

Tabelle 72: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2O-13O.


Ausbeute [mg]

pKS logP ESI MS

m/z (M+H)+

2O gelblicher

FS

696, 742, 832, 1454, 1487, 1506, 1566, 1641, 2920, 2952,

3057 90 135 (43 %) 8.8 3.9 314

5O gelblicher

FS

701, 734, 766, 817, 1028, 1085, 1161, 1355, 1385, 1519, 1548, 1637, 2369, 2855, 2925,

3074

198-200 176 (56 %) 8.8 3.5 344

6O gelblicher

FS

700, 739, 820, 831, 1245, 1453, 1462, 1506, 1567, 1603,

1640, 2938 125 178 (72 %) 8.8 3.4 344

9O gelblicher

FS

792, 734, 802, 1018, 1081, 1164, 1203, 1350, 1387, 1519, 1550, 1640, 2854, 2924, 2973,

3044

167-169 135 (38 %) 8.8 3.9 349

12O gelblicher

FS

702, 717, 779, 1001, 1117, 1159, 1342, 1422, 1455, 1509, 1544, 1639, 2765, 2788, 2884,

3024

187-188 149 (45 %) 8.8 4.0 329

13O oranger

FS

700, 737, 771, 810, 1033, 1075, 1126, 1204, 1348, 1519, 1549, 1637, 2857, 2937, 2978,

3072

163-165 126 (34%) 8.8 3.8 349

Tabelle 73: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2O-14O.


131

H-P

h2

7.18

-7.3

1 (m

)

7.39

-7.4

9 (m

)

7.18

-7.3

1 (m

)

7.21

-7.2

9 (m

)

7.18

-7.3

1 (m

)

7.21

-7.3

3 (m

)

H-P

h2 m

2.14

(qi

, 7.6

),

2.61

(t,

7.6)

, 4.

30 (

t, 7.

6)

2.18

(qi

, 7.5

),

2.68

(t,

7.5)

, 4.

33 (

t, 7.

5)

2.10

(qi

, 7.6

),

2.61

(t,

7.6)

, 4.

28 (

t, 7.

6)

2.14

(qi

, 7.0

) 2.

61 (

t, 7.

0)

4.30

(t,

7.0)

2.08

-2.2

1 (m

),

2.69

-2.7

6 (m

) 4.

29 (

t, 7.

2)

2.16

(m

),

2.62

(m

),

4.33

(t,

7.2)

H-B

r

12.3

5 (b

s)

12.3

4

12.2

4 (b

s)

12.4

0 (b

s)

12.3

0 (b

s)

12.5

4(bs

)

H-P

y ort

ho

8.41

(d,

7.1

),

8.49

(d,

7.1

)

8.45

(d

d, 7

.3/2

.0),

8.

57

(dd,

7.3

/2.0

)

8.37

(d

, 7.2

),

8.45

(d

, 7.2

)

8.43

(d,

6.6

),

8.50

(d,

6.6

)

8.39

(d

, 7.2

),

8.47

(d

, 7.2

)

8.47

(d,

6.0

),

8.56

(d,

6.0

)

H-P

y met

a

7.09

(d

d, 7

.1/2

.3),

7.

65 (

dd,

7.1/

2.3)

7.02

-7.0

7 (m

),

7.65

(d

d, 7

.3/2

.0)

7.03

-7.0

5 (m

),

7.59

(d

, 7.3

)

7.11

(d,

4.9

),

7.66

(d,

4.9

)

7.07

(d

d, 7

.1/2

.5),

7.

62

(dd,

7.1

/2.5

)

7.15

(d,

6.0

),

7.77

(d,

6.0

)

CH

=N

8.28

(s)

8.59

(s)

8.23

(s)

8.27

(s)

8.25

(s)

8.36

(s)

H-P

h1 n

-

-

-

-

-

-

H-P

h1 o

rtho

7.83

-7.8

6 (m

)

7.97

(d

d, 7

.8/1

.7)

7.79

(d

, 8.8

)

7.87

(d,

8.3

)

7.73

(d,

8.1

)

8.12

(d

, 8.9

)

H-P

h1 m

eta

7.48

-7.5

0 (m

)

7.14

(d,

8.1

),

7.02

-7.0

7 (m

)

7.03

-7.0

5 (m

)

7.55

(d

, 8.3

)

7.18

-7.3

1 (m

)

8.32

(d

, 8.9

)

H-P

h1 p

ara

7.48

-7.5

0 (m

)

-

-

-

-

-

H-P

h1 R

-

3.86

(s)

3.82

(s)

-

2.36

(s)

-

Nr.

2O

5O

6O

9O

12O

13O

Tab

elle

74:

1 H-N

MR

-Dat

en d

er V

erbi

ndun

gen

2O-1

3O.


132

C-P

h2

128.

2-12

8.9,

13

5.4

125.

7, 1

28.0

, 12

8.2,

128

.8,

129.

1, 1

35.3

125.

9, 1

28.0

-12

9.2,

135

.5

128.

0, 1

28.1

, 12

8.8,

136

.8

127.

4-12

9.5,

13

5.4

124.

0, 1

28.8

, 12

9.1,

135

.3

C-P

h2 m

31.6

, 34.

3,

57.4

31.8

, 34.

6,

57.2

31.6

, 33.

5,

57.2

31

.4, 3

4.2,

57

.7

31.6

, 31.

8,

57.3

31

.6,

34.2

, 57.

7

C-P

y ort

ho

143.

1,

144.

2

143.

7, 1

44.2

142.

9, 1

44.1

140.

3, 1

41.3

143.

0, 1

44.1

143.

6,

144.

5

C-P

y met

a

107.

1,

108.

8

107.

3, 1

09.0

106.

9, 1

08.5

107.

6, 1

09.3

107.

3, 1

09.1

108.

0,

109.

8

C-P

y ip

so

153.

7

153.

5

153.

5

151.

8

153.

7

153.

9

CH

=N

148.

1

143.

1

148.

1

149.

4

148.

2

148.

1

C-P

h1 n

- - - - -

C-

Ph

1 ips

o

133.

4

120.

8

135.

6

144.

3

130.

72

139.

7

C-P

h1 o

rtho

128.

0-12

8.9

132.

3, 1

57.9

128.

0-12

9.2

128.

9

127.

4-12

9.5

128.

1, 1

28.4

C-P

h1 m

eta

128.

0-12

8.9

112.

0, 1

35.4

114.

4

129.

1

127.

4-12

9.5

128.

1,

128.

4

C-P

h1 p

ara

127.

4

121.

3

133.

6

140.

3

140.

7

145.

5

C-P

h1 R

-

55.8

55.4

-

21.1

-

Nr.

2O

5O

6O

9O

12O

13O

Tab

elle

75:

13C

-NM

R-D

aten

der

Ver

bind

unge

n 2O

-13O

.


133

7.1.2.4 Synthese der Zwischenstufen für die Ketoderivate

7.1.2.4.1 -Bromacetophenon (15a)/-Iodacetophenon (15b) nach137

2 g (16 mmol) Acetophenon werden in 50 ml Chloroform gelöst und auf 0 °C gekühlt. Innerhalb von

1 h wird 1 Äquivalent Br2 bzw. I2 bei 0 °C zugetropft. Die Reaktionsmischung wird auf RT erwärmt

und 4 h gerührt. Nach beendeter Reaktion wird das entstandene Produkt abfiltriert und mit Chloroform

gewaschen.

15a 15b

Ausbeute 2.4 g (75 % / Lit.: 80 %137) 0.7 (18 %)

Summenformel C8H7BrO C8H7IO

MR 199.04 g/mol 246.05 g/mol

Smp 165 - 167 °C (Lit.: 165-166 °C137) 169-170 °C 1HNMR

(DMSO-d6, δ [ppm])

4.51 (2H, s, CH2); 7.58-7.63 (3H,

m, H-Phmeta/para); 7.91 (2H, d, 3J =

8.1, H-Phortho)

4.38 (2H, s, CH2); 7.59-7.65 (3H, m,

H-Phmeta/para); 7.93 (2H, d, 3J = 8.0, H-

Phortho) 13CNMR

(DMSO-d6, δ [ppm])

32.0, 128.7, 128.8, 133.6, 134.9,

189.8

16.6, 128.7, 128.8, 133.3, 135.8, 194.2

Tabelle 76: Analytische Daten der Verbindungen 15a und 15b.

7.1.2.4.2 1-Brom-3-phenyl-2-propanon (16) nach140

Zu einer Mischung aus 1 g Phenylaceton (7.5 mmol), 5 ml Eisessig und 1 ml konzentrierter HBr

wurde 2.5 g Brom (16.5 mmol), gelöst in 5 ml Eisessig, gegeben und für 6 h bei Raumtemperatur

gerührt. Im Anschluss wurden 15 ml Aceton zugegeben und 24 h gerührt. Das Reaktionsgemisch

wurde dreimal mit je 50 ml Dichlormethan extrahiert, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel

im Vakuum abgezogen. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (5 % Ethylacetat /

95 % Hexan; Rf = 0.3).

Ausbeute: 0.95 g (60 % / Lit.: 76 %140)

Summenformel: C9H9BrO

MR: 213.07 g/mol 1H-NMR: 3.89 (2H, s, PhCH2), 3.96 (2H, s, CH2Br), 7.22-7.34 (5H, m, H-Ph) 13C-NMR: 33.3, 46.8, 127.5, 128.7, 129.3, 133.3, 199.1

7.1.2.4.3 Ethyl 3-brompropionat (17) nach138

1 g (6.5 mmol) 3-Brompropionsäure werden in 50 ml Ethanol gelöst und mit 1 ml konz. H2SO4

versetzt. Anschließend wird 1 h unter Rückfluss erhitzt. Nach beendeter Reaktion wird das

Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Die Reaktionsmischung wird in DCM/H2O 1:1 aufgenommen

und noch zweimal mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4


134

getrocknet und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Das Produkt ist ein weißlicher

Feststoff.

Ausbeute: 0.94 g (80 %)

Summenformel: C5H9BrO

MR: 181.03 g/mol 1H-NMR: 1.28 (3H, t, 3J = 7.1, CH3), 2.73 (2H, t, 3J = 7.9; BrCH2CH2); 3.65 (2H, t, 3J = 7.9; BrCH2);

4.11 (3H, t, 3J = 7.1, CH3CH2) 13C-NMR: 14.3, 27.8, 37.4, 61.4, 173.5

7.1.2.4.4 3-Brom-N-methoxy-N-methylpropanamid (18) nach141

1 g (6.5 mmol) 3-Brompropionsäure wird zu 1.5 g (6.5 mmol) Thionylbromid in trockenem DMF

gegeben und 2h bei 80 °C gehalten. Nach dem Abkühlen wurde zur Reaktionsmischung 400 mg

(6.5 mmol) N,O-Dimethylhydroxylamin zugegeben, 10 min gerührt und dann 1.5 ml Triethylamin

zugetropft und eine weitere Stunde gerührt. Im Anschluss wurde das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt, das Reaktionsgemisch mit DCM/H2O extrahiert und die vereinigten organischen

Lösungsmittel über Na2SO4 getrocknet. Das Produkt wurde nach entfernen des Lösungsmittels im

Vakuum als weißlicher Feststoff erhalten.

Ausbeute: 0.75 g (60 %)

Summenformel: C5H10BrNO2

MR: 196.04 g/mol 1H-NMR: 2.69-3.71 (3H, m, NCH3/O=CCH2), 3.56 (2H, t, 3J = 7.2BrCH2), 3.66 (3H, s, OCH3) 13C-NMR: 28.6, 31.4, 31.8, 63.5, 174.1

7.1.2.4.5 (2-Bromethoxy)(tert-butyl)dimethylsilan (19) nach142

Zu 1 g (8 mmol) 2-Bromethanol in 10 ml DMF werden 1.45g (9.6 mmol) Dimethyl-tert-

butylsilylchlorid sowie 1.4 g (20 mmol) Imidazol gegeben und anschließen 24 h bei Raumtemperatur

gerührt. Im Anschluss wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, das Reaktionsgemisch mit

DCM/H2O extrahiert und die vereinigten organischen Lösungsmittel über Na2SO4 getrocknet. Das

Produkt wurde nach entfernen des Lösungsmittels im Vakuum als weißlicher Feststoff erhalten.

Ausbeute: 1.6 g (85 %)

Summenformel: C8H19BrOSi

MR: 239.23 g/mol 1H-NMR: 0.31 (6H, s, SiCH3), 0.98 (9H, s, SiCCH3), 3.54 (2H, t, 3J = 7.2; BrCH2), 4.31 (2H, t, 3J =

7.2, OCH2) 13C-NMR: -2.2, 25.9, 30.6, 32.5, 69.6


135

7.1.2.4.6 N-methoxy-N-methyl-2-phenylacetamide (20) nach141

1 g (8.1 mmol) Phenylessigsäure wird zu 1.9 g (8.1 mmol) Thionylchlorid in trockenem DMF gegeben

und 2h bei 80 °C gehalten. Nach dem Abkühlen wurde zur Reaktionsmischung 500 mg (8.1 mmol)

N,O-Dimethylhydroxylamin zugegeben, 10 min gerührt und dann 1.5 ml Triethylamin zugetropft und

eine weitere Stunde gerührt. Im Anschluss wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, das

Reaktionsgemisch mit DCM/H2O extrahiert und die vereinigten organischen Lösungsmittel über

Na2SO4 getrocknet. Das Produkt wurde nach entfernen des Lösungsmittels im Vakuum als weißlicher

Feststoff erhalten.

Ausbeute: 0.86 g (64 %)

Summenformel: C9H11NO2

MR: 165.19 g/mol 1H-NMR: 2.74 (3H, s, NCH3), 3.65 (3H, s, OCH3), 7.63-7.71 (3H, m, H-Phmeta/para), 8.04 (2H, d, 3J =

7.5, H-Phortho) 13C-NMR: 34.5, 63.3, 127.7, 128.9, 132.1, 168.2

7.1.2.4.7 2-Benzyl-1,3-dithiolan (21) nach138

Zu 1 g (8.3 mmol) Phenylacetaldehyd und 0.8 g (8.3 mmol) 1,2-Ethandithiol wird unter starkem

Rühren 1 ml Bortrifluorid-Etherat gegeben. Es wird 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließen

hydrolysiert. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Phasen vereinigt

und über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und dar Rohprodukt

säulenchromatographisch aufgereinigt (EE; Rf = 0.7)

Ausbeute: 1.05 g (60 %)

Summenformel: C11H16S2

MR: 196.33 g/mol 1H-NMR: 2.78-2.84 (4H, m, SCH2), 3.25 (2H, d, 3J = 7.4, SCHCH2), 3.95 (1H, t, 3J = 7.4, SCHCH2),

7.27-7.29 (3H, m, H-Phortho/para), 7.39-7.41 (2H, m, H-Phmeta) 13C-NMR: 38.4, 43.8, 56.4, 124.3, 128.2, 128.9


136

7.2 Biologische Methoden

7.2.1 Allgemeine Angaben

Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland:

Kaliumdihydrogenphosphat (reinst), Kaliumhydroxid (p.a.), DMSO p.a., 5,5‘-Dithiobis-2-

nitrobenzoesäure (DTNB), Natriumcarbonat wfr. (reinst), Acetylthiocholiniodid (ATC) (>99 %),

Acetylcholinesterase (E.C. 3.1.1.7, Typ VI-S, Electric Eel), Methanol (p.a.), Natrium-

dihydrogenphosphat (p.a.), Phosphorsäure, Thioflavin T, Natriumchlorid (p.a.), Natriumazid (p.a.),

Natriumhydroxid (p.a.), Hexafluoroisopropanol (>99 %), DMSO (p. a.)

Iris-Biotech, Marktredwitz, Deutschland:

Fmoc-Arg(Mts)-Wang Harz, Fmoc-Aminosäuren: Novabiochem, Merck, Darmstadt, Deutschland.

Dimethylformamid (peptide grade), Dichlormethan (peptide grade)

Acros Organics, Geel, Belgien:

Piperidin

Merck, Darmstadt, Deutschland:

Diisopropylcarbodiimid

Bachem Holding, Bubendorf, Schweiz:

Amyloid Protein (1-42)

7.2.2 Untersuchung der Inhibition der AChE (Ellman’s-Test)148

7.2.2.1 Reagenzien und Materialien

Die Reagenzien werden nach folgenden Vorschriften hergestellt:

Phosphatpuffer 0.1 M (pH = 8.0):

1.36 g KH2PO4 werden in 100 ml dem. Wasser gelöst und mit wässriger 3 M KOH auf pH = 8.0 ± 0.1

eingestellt. Der Puffer wird steril filtriert und bei 4°C gelagert. Der Puffer ist unter diesen

Bedingungen ca. 7 Tage haltbar.

Ellman’s Reagenz (DTNB) 0.01 M

396 mg DTNB und 150 mg Na2CO3 werden in 100 ml dem. Wasser gelöst und aliquotiert (à 1.5 ml)

bei -18 °C aufbewahrt.


137

ATC 0.075 M

217 mg ATC unter Lichtausschluss in 10 ml dem. Wasser gelöst und aliquotiert (à 0.5 ml) bei -18 °C

dunkel aufbewahrt.

AChE 2.5 u/ml

500 Einheiten der AChE werden in 1 ml einer steril filtrierten 1 %-igen Gelatine-Lösung gelöst und ad

100 ml mit dem. Wasser verdünnt. Das Enzym kann in dieser Form aliquotiert (0.8 ml) mehrere

Monate gelagert werden, ohne dass Aktivitätsverluste auftreten. Vor der Messung ist die aufgetaute

Probe nochmals 1:1 mit dem. Wasser zu verdünnen.

Inhibitorlösungen:

Von den zu testenden Substanzen wird eine Stammlösung in DMSO hergestellt. Ausgehend von dieser

Lösung wird eine Verdünnungsreihe so hergestellt, dass die komplette sigmoidale Dosis-

Wirkungskurve (siehe Kapitel 4.1.1) abgedeckt wird. Es werden jeweils Dreifachbestimmungen

durchgeführt.

7.2.2.2 Durchführung der Messungen

Die verwendeten Reagenzien werden bei 20 °C kurz vor dem Gebrauch aufgetaut und temperiert.

Gerät und Parametereinstellungen:

Gerät: UV-VIS Spektrophotometer Cary UV 50, Varian GmbH, Darmstadt, Deutschland

Programm: Kinetik

Wellenlänge: 412 nm

Messzeit: 300 s

Messintervall: 5 s

Messgröße: Absorption Units (AU)/s

Berechnung: Nullte Ordnung

Küvette: Quarzglas, 4.5 ml, Schichtdicke 10 mm


138

Messungen:

Es werden nacheinander die tabellierten Reagenzien (siehe Tabelle 77) zugegeben, mit einem

Plastikspatel vermischt und die Inkubationszeit von 5 min nach Zugabe des Enzyms eingehalten.

Direkt im Anschluss an die letzte Zugabe wird die Messung gestartet.

3.0 ml 100 µl 100 µl 100 µl 20 µl AU/s (ca.)

Blindwert (BW) Puffer dem. Wasser dem. Wasser Ellman’s Lsg. ATC-Lsg. 105 Leerwert (LW) Puffer dem. Wasser AChE-Lsg. Ellman’s Lsg. ATC-Lsg. 103 Inhibitor (Inh.) Puffer Inhibitorlsg. AChE-Lsg. Ellman’s Lsg. ATC-Lsg.

Tabelle 77: Reagenzienzugabe bei den verschiedenen Messungen.

Ein Aliquot Reagenzien ist ausreichend für folgenden Messverlauf:

BW => LW1 => 3x Inh (Konz.1) => LW2 => 3x Inh (Konz.2) => LW3

Dieses Vorgehen wird fortlaufend mit frischen Reagenzien wiederholt.

7.2.2.3 Auswertung der Messungen

Aus den Blind- und Leerwerten eines Messverlaufs wird das arithmetische Mittel berechnet. Aus der

Differenz des gemittelten Leerwertes bzw. dem Messwert und dem gemittelten Blindwert erhält man

den korrigierten Leerwert bzw. die korrigierten Messwerte. Die restliche Enzymaktivität berechnet

sich dann durch das Verhältnis von korrigiertem Messwert zu korrigiertem Leerwert.

Die prozentuale Inhibition der AChE wird gegen den dekadischen Logarithmus der entsprechenden

Inhibitorkonzentration aufgetragen. Die zugehörigen Dosis-Wirkungskurven mit IC50-Werten werden

mit Hilfe des Programms Origin® (non-linear regression; sigmoidal dose-response, variable slope)

berechnet.

7.2.3 Fibrilleninhibition

7.2.3.1 Synthese des verkürzten Peptids165,166

Die Festphasenpeptidsynthese erfolgt an einem Milligen 9050 PepSynthesiser nach Standard-Fmoc-

Protokoll und DIC-HOBT-Aktivierung. Als Edukt wurde die C-terminale an Wang-Harz gebundene

Aminosäure verwendet. Aminosäuren und Kupplungsreagenz wurden in vierfachem Überschuss im

Verhältnis zur Beladung des Harzes eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde DMF/DCM (60/40, v/v)

verwendet. Die Schutzgruppenabspaltung erfolgte in Piperidinlösung (Vol.-20 % in DMF). Die

Kupplungszeit pro Aminosäure betrug 60 Minuten.


139

Abb. 66: Struktur der synthetisierten Peptids.

Festphasenpeptidsynthese ausgehend von 500 mg Fmoc-Asp(OtBu)-Wang-Harz (Beladung: 0.54

mmol/g ≅ 0.270 mmol).

Eingesetzte Aminosäuren: 460 mg (1.08 mmol) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 336 mg (1.08 mmol) Fmoc-

Ala-OH, 2 x 418 mg (1.08 mmol) Fmoc-Phe-OH, 367 mg (1.08 mmol) Fmoc-Val-OH, 382 mg (1.08

mmol) Fmoc-Leu-OH, 506 mg (1.08 mmol) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 660 mg (1.08 mmol) Fmoc-

Gln(Trt)-OH, 2 x 669 mg (1.08 mmol) Fmoc-His(Trt)-OH.

Die Synthese erfolgt nach Fmoc-Protokoll mit DIC/HOBT-Aktivierung (165 mg, 1.08 mmol

HOBT*H2O pro Aminosäure), Kupplungszeit pro Aminosäure: 60 Minuten + Fmoc-Entschützung

nach dem letzten Kupplungsschritt.

Vor der Abspaltung wird das Harz in einen Schüttelkolben überführt und wie folgt gewaschen:

DMF (2 x), CH2Cl2/Methanol im Wechsel (2 x), Eisessig (1 x), CH2Cl2/Methanol im Wechsel (2 x).

Anschließend wird das Harz im Exsikkator getrocknet.

Die Abspaltung erfolgt durch Behandlung mit TFA/DCM (1:1, + Zusatz von 2.5 % Triisopropylsilan)

für 2 h und anschließender Filtration. Nach Einengen des Filtrats wird das Peptid durch Zutropfen von

kaltem Diethylether als TFA-Salz ausgefällt, abfiltriert und der Feststoff mit Diethylether gewaschen.

Die Charakterisierung erfolgte mittels LC-MS: Säule: Agilent Zorbax SB-Aq, 5 μm, 4.6 x 150 mm,

Eluent A: H2O/0.1% TFA, Eluent B: Acetonitril/0.1% TFA, Gradient: 50 % B - 95 % B über 45 min.

Ausbeute: 308 mg (0.210 mmol, 77 %) hellgelber Feststoff

Molare Masse: 1356.49 g/mol (Peptid); 1469.66 g/mol (TFA-Salz)

Summenformel: C63H89N17O17 (*C2HF3O2)

LC-MS m/z: 1357.0 [M+H]+; Rt (min): 3.4

7.2.3.2 Thioflavin-T-Test (in Analogie zu Levine et al.175)

7.2.3.2.1 Reagenzien und Materialien

Die Reagenzien werden nach folgenden Vorschriften hergestellt:

Stammlösung Thioflavin T:

95.7 mg Thioflavin T werden in 100 ml dem. Wasser gelöst (3 mM). 10 ml dieser Lösung wird auf

100 ml mit dem. Wasser aufgefüllt (0.3 mM), welche dann à 1 ml aliquotiert wird und bei -18 °C

gelagert wird. Die Lösung ist bei dieser Lagerung ca. 1 Jahr haltbar.


140

Puffer:

299.9 mg NaH2PO4 wfr. (25 mM), 703.1 mg NaCl (120 mM), 20 mg NaN3 (0.02 %) sowie 1 ml

0.3 mM Thioflavin-Lösung (3µM) werden in 100 ml dem. Wasser gelöst und mit wässriger 3 M

NaOH auf pH 7.4 ± 0.1 eingestellt. Der Puffer wird steril filtriert und bei 4 °C gelagert. Er unter

diesen Bedingungen ca. 7 Tage haltbar

Puffer mit AChE169

5.6 mg AChE werden in 2 ml Puffer gelöst (1µM).

Amyloid (1-42) – Lösung:

1 mg Amyloid (1-42) wird in 50 µl Hexafluoroisopropanol (HFIP) gelöst, in dem man es 1-2

Stunden bei 4 °C ruhig stehen lässt. Schütteln ist unbedingt zu vermeiden. Im Anschluss wird HFIP

vorsichtig mit Stickstoff abgeblasen, so dass sich ein klarer Film bildet. Zu diesem Film werden

116 µl DMSO (2 mM) gegeben und kurz verwirbelt. Die Lösung wird direkt eingesetzt.

Peptid-Lösung:

2.86 mg Peptid werden in 1 ml DMSO (2 mM) gelöst und direkt eingesetzt.

Inhibitorlösungen:

Von den zu testenden Substanzen wird eine Stammlösung in DMSO hergestellt. Ausgehend von dieser

Lösung wird eine Verdünnungsreihe so hergestellt, dass die komplette sigmoidale Dosis-

Wirkungskurve (siehe Kapitel 4.1.1) abgedeckt wird. Es werden jeweils Zweifachbestimmungen

durchgeführt.

7.2.3.2.2 Durchführung der Messungen

Gerät und Parametereinstellungen:

Gerät: Fluoreszenz Spektrophotometer Cary Eclipse, Varian GmbH, Darmstadt, Deutschland

Programm: Kinetik

Anregungswellenlänge: 450 nm

Emissionswellenlänge: 482 nm

Messzeit: 300 min

Messintervall: 5 min

Messgröße: Fluoreszenzintensität

96-well-Mikrotiterplatte: weiß, Nunc GmbH, Wiesbaden, Deutschland


141

Messungen:

Die folgenden Reagenzien werden in der angegebenen Reihenfolge zugegeben:

90 µl Puffer (ohne bzw. mit AChE) (P)

5 µl Inhibitor in verschiedenen Konzentrationen (I),

5 µl DMSO (D)

5 µl Aβ bzw. Peptid (F)

Ein typischer Aufbau einer 96-well-Mikrotiterplatte mit Referenz- und Blindwerten, sowie mit drei

Inhibitoren in je sechs Konzentrationen sah folgendermaßen aus (siehe Tabelle 78):

A B C D E F G H 1 P/D/F P/I1c1/F P/I1c1/D P/I2c1/F P/I2c1/D P/I3c1/F P/I3c1/D - 2 P/D/F P/I1c1/F P/I1c1/D P/I2c1/F P/I2c1/D P/I3c1/F P/I3c1/D - 3 P/D/F P/I1c2/F P/I1c2/D P/I2c2/F P/I2c2/D P/I3c2/F P/I3c2/D - 4 - P/I1c2/F P/I1c2/D P/I2c2/F P/I2c2/D P/I3c2/F P/I3c2/D - 5 - P/I1c3/F P/I1c3/D P/I2c3/F P/I2c3/D P/I1c3/F P/I3c3/D - 6 P/D/D P/I1c3/F P/I1c3/D P/I2c3/F P/I2c3/D P/I3c3/F P/I3c3/D - 7 P/D/D P/I1c4/F P/I1c4/D P/I2c4/F P/I2c4/D P/I3c4/F P/I3c4/D - 8 P/D/D P/I1c4/F P/I1c4/D P/I2c4/F P/I2c4/D P/I3c4/F P/I3c4/D - 9 - P/I1c5/F P/I1c5/D P/I2c5/F P/I2c5/D P/I3c5/F P/I3c5/D -

10 - P/I1c5/F P/I1c5/D P/I2c5/F P/I2c5/D P/I3c5/F P/I3c5/D - 11 - P/I1c6/F P/I1c6/D P/I2c6/F P/I2c6/D P/I3c6/F P/I3c6/D - 12 - P/I1c6/F P/I1c6/D P/I2c6/F P/I2c6/D P/I3c6/F P/I3c6/D -

Tabelle 78: Aufbau einer 96-well-Mikrotiterplatte.

7.2.3.2.3 Auswertung der Messungen

Die Auswertung verläuft analog zu Kapitel 7.2.2.3.

7.2.4 Bestimmung des logP-Wertes


Phosphatpuffer pH 7.4 (DAB 9):

250 ml einer 0.02 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung werden mit 393.4 ml 0.1 M

Natriumhydroxidlösung auf pH 7.4 eingestellt.


142

7.2.4.2 Durchführung

Geräte und Parametereinstellungen:

Gerät: HPLC-Anlage Agilent

Säule: Waters Xterra ODS 250 x 4.6 mm

Injektionsvolumen: 100 µl

Temperatur: 30 °C

Mobile Phase: Puffer / Methanol 30/70 mit Zusatz von 0.02 % N,N-Dimethylhexylamin

Fluss: 1.5 ml/min

Detektion: UV; Messwellenlänge 254 nm

Messungen:

Die verwendeten Standards und Testsubstanzen werden in MeOH gelöst (40 µg/ml). Es werden

jeweils Dreifachbestimmungen durchgeführt, wobei die Abweichung von k‘ unterhalb von 1 % liegt.

7.2.4.3 Auswertung und Bestimmung der logP-Werte

Der Kapazitätsfaktor wird mit Hilfe der Gleichung 6 berechnet. Aus den gemessenen log k‘-Werten

und den aus der Literatur bekannten logP-Werten, die den notwendigen Lipophiliebereich abdecken,

wird durch lineare Regression eine Kalibriergerade erstellt, mit welcher die logP-Werte der

Testsubstanzen berechnet wurden.

Gleichung 6

Standardsubstanz log k‘ logP187

2-Phenylethanol 0.15 1.36

Benzol 0.34 2.13

N,N-Dimethylanilin 0.44 2.31

Toluol 0.52 2.73

Ethylbenzol 0.63 3.15

Biphenyl 0.88 4.01

Anthracen 1.06 4.45

Abb. 67: Korrelation zwischen den log k‘- und den logP-Werten der Standardsubstanzen.

y = 3.4688x + 0.8903R² = 0.9941

0

1

2

3

4

5

0 0.25 0.5 0.75 1 1.25

logP

log k'

k‘ = Kapazitätsfaktor

TR = Retentionszeit

T0 = Totzeit


143

7.2.5 Blut-Hirn-Schrankengängigkeit - Quantifizierung

Die biologischen Arbeiten hierfür wurden im Arbeitskreis von Prof. Carola Förster im

Universitätsklinikum Würzburg von Dr. Malgorzata Burek nach Förster et al.189 durchgeführt.


Puffer:

975 mg NaH2PO4 werden in 1 l Millipore-Wasser gelöst und mit Phosphorsäure auf pH 3.0 ± 0.1

eingestellt.

Probenlösung:

Die Proben aus dem Transwellversuch werden aliquotiert (à 1 ml) und anschließend wird in einer

beheizten Vakuumzentrifuge innerhalb von 12 h bei 60 °C das Wasser abgezogen. Der Rückstand

wird vollständig in 1 ml MeOH suspendiert. Die dadurch ausfallenden denaturierten Proteine und

Zellrückstände werden abzentrifugiert (5 min, 13 000 Umdrehung/s). Der Überstand wird zur

Quantifizierung verwendet.

7.2.5.2 Durchführung

Geräte und Parametereinstellungen:

Gerät: HPLC-Anlage Varian

Säule: Waters Xterra ODS 250 x 4.6 mm

Injektionsvolumen: 20 µl

Temperatur: 30 °C

Mobile Phase: Puffer / Methanol 35/65

Fluss: 0.75 ml/min

Detektion: UV; Messwellenlänge 360 nm

Messungen:

Es wurde mit Hilfe der externen Standardmethode eine Kalibriergerade über einen

Konzentrationsbereich von 0.05 – 0.8 mg/ml der einzelnen Substanzen erstellt (siehe Abb. 68). Im

Anschluss daran wurden die einzelnen Lösungen aus den verschiedenen Kammern und

Referenzsystemen vermessen. Es werden jeweils Dreifachbestimmungen durchgeführt.


144

Abb. 68: Kalibriergeraden für die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit.

7.2.5.3 Auswertung

Aus den Dreifachbestimmungen wird das arithmetische Mittel berechnet und die prozentuale

Durchgängigkeit mit Hilfe von Gleichung 5 berechnet.

y = 12862x - 109.79R² = 0.9999

y = 2744.5x - 11.628R² = 1

y = 6919.9x - 15.412R² = 0.9993

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Flä

che

Konzentration [mg/ml]

2A

2C

5C

145

8 LITERATURVERZEICHNIS

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160

9 ANHANG

ANHANG

161

9.1 Biologische Aktivitäten

Nr. IC50 [µM] IC50 [µM] Selektivität IC50 [mM] IC50 [mM]

AChE BuChE AChE/BuChEFibrillen- bildung

Fibrillen-auflösung

2A 12±0.15 n.d. - 10±1.22 12±0.43

2B 1.34±0.04 >10 >1 38±1.27 43±2.38

2C 3.85±0.08 >10 >1 6.6±0.52 7.8±0.64

2D 6.31±0.09 >10 >1 >100 n.d.

2E >10 >10 - >100 n.d.

2F >10 >10 - 23±0.78 27±1.35

2G >10 >10 - 23±0.83 24±1.73

2H 5.67±0.07 >10 - >100 n.d.

2I >10 >10 - >100 n.d.

2J 5.78±0.07 >10 >1 >100 n.d.

2K >10 >10 - 21±1.33 23±1.82

2L >10 >10 - >100 n.d.

2M >10 >10 - >100 n.d.

2N >10 >10 - >100 n.d.

2O 0.82±0.03 7.89±0.14 9.62 4.9±0.26 5.9±0.69

2P >10 4.12±0.06 <1 9.2±0.16 11.8±1.49

3A >10 >10 - 21±1.39 26±0.87

3C 4.12±0.08 >10 >1 9±0.64 12±1.57

4A 1.29±0.07 3.58±0.04 2.77 12.5±0.84 12.2±1.54

4C 0.24±0.05 9.66±0.08 40.25 8±0.92 11±1.28

4F 2.98±0.09 1.7±0.06 0.58 19±1.59 26±1.37

4H >10 >10 - >100 n.d.

4I >10 >10 - >100 n.d.

4J 8.74±0.17 >10 >1 >100 n.d.

5A 12.4±0.20 >10 - 5.5±0.32 4.9±0.79

5B 3.52±0.15 8.31±0.10 2.36 46±1.59 49±0.98

5C 7.84±0.19 8.38±0.06 1.07 2.6±0.62 4.2±0.32

5K 8.27±0.16 >10 >1 31±1.83 43±1.36

5O 2.32±0.08 9.82±0.16 4.23 3.0±0.49 4.5±0.56

5P >10 1.07±0.08 <1 47±1.49 56±2.76

6A 0.27±0.06 2.60±0.10 9.63 35±1.38 45±2.67

6B >10 >10 - 39±0.96 46±1.65

6C 1.25±0.07 >10 >1 1.9±0.59 3.3±0.74

6D 2.75±0.15 >10 >1 89±2.92 n.d.

6E 8.87±0.19 >10 >1 130±2.58 n.d.

6N 7.58±0.17 9.78±0.06 1.29 48±1.53 45±1.27

6O 4.17±0.13 >10 >1 4.4±0.52 6.8±0.97

6P 3.84±0.12 0.64±0.02 6.01 32±1.85 45±0.86

7A 0.86±0.04 2.40±0.03 2.79 10±0.94 9.8±0.56

7C 2.31±0.10 >10 >1 2.1±0.08 3.6±0.33

ANHANG

162




7H 0.99±0.16 1.64±0.06 1.66 6.7±0.43 7.4±0.92

8A 6.04±0.09 >10 >1 5.6±0.62 6,6±0.87

8C 1.58±0.09 >10 >1 15.5±0.25 17.8±1.87

9A 0.12±0.04 >10 >1 14±1.39 19±2.43

9C 0.51±0.03 >10 >1 1.7±0.72 4.2±0.86

9F 4.65±0.11 >10 >1 12±0.84 18±1.05

9G 5.76±0.18 >10 >1 >100 n.d.

9H 2.72±0.15 8.18±0.12 3.01 >100 n.d.

9I 8.29±014 6.01±0.07 0.72 >100 n.d.

9J 4.56±0.12 >10 >1 >100 n.d.

9O 1.49±0.06 >10 >1 2.3±0.06 2.8±0.69

10A 1.30±0.05 2.45±0.08 1.88 12±0.62 13±1.22

10B 3.45±0.08 7.43±0.09 2.64 25±0.93 28±1.27

10C 0.98±0.07 9.12±0.11 7.58 4.6±0.72 5.2±0.84

10D 5.32±0.15 >10 >1 27±1.28 30±1.54

10E >10 >10 - 78±2.03 86±1.65

10P 3.78±0.09 >10 >1 >100 n.d.

11A 2.25±0.12 1.42±0.07 0.63 14±1.13 15±0.12

11C 7.74±0.09 >10 >1 3.6±0.42 3.9±0.34

11M 2.98±0.12 >10 >1 45±1.28 48±1.45

12A 7.25±0.15 >10 >1 50±1.86 51±1.89

12B 6.95±0.19 >10 >1 44±1.47 47±1.65

12C 1.19±0.08 >10 >1 3.9±0.83 4.8±0.66

12D >10 >10 - >100 n.d.

12E >10 >10 - >100 n.d.

12K >10 7.31±0.04 <1 >100 n.d.

12L >10 >10 - 95±1.25 n.d.

12M 2.49±0.10 >10 >1 36±0.63 39±0.94

12O 1.08±0.04 2.82±0.16 2.61 7.5±0.97 8.3±0.87

12P >10 0.63±0.08 <1 >100 n.d.

13A 0.89±0.02 >10 >1 3.6±0.72 3.7±0.76

13B 1.71±0.04 >10 >1 23±1.57 24±1.56

13C 0.09±0.01 >10 >1 1.6±0.88 2.2±0.43

13D 2.34±0.12 >10 >1 18±1.24 19±2.14

13E 7.67±0.13 >10 >1 71±0.87 74±1.98

13O 1.65±0.08 >10 >1 1.4±0.56 2.3±0.44

13P 7.89±0.18 5.94±0.17 0.75 23±0.99 28±0.89

14A 1.95±0.08 2.99±0.07 1.53 10±0.34 16±1.43

14C 1.98±0.02 >10 >1 2.9±0.46 3.4±0.56

14M 8.12±0.23 >10 >1 85±1.39 91±1.88

15A 4.56±0.19 >10 >1 24±1.38 30±2.23

15B 3.26±0.16 >10 >1 15±1.48 21±1.12

ANHANG

163




15C >10 >10 - 65±2.13 63±0.85

15D >10 >10 >1 96±2.39 n.d.

15E >10 >10 - >100 n.d.

15P >10 3.64±0.18 <1 35±1.38 41±2.67

16A 1.63±0.15 3.35±0.12 2.06 39±1.57 42±2.34

16B 1.98±0.08 8.63±0.16 4.34 130±2.59 n.d.

16C 0.83±0.09 8.75±0.06 10.54 >100 n.d.

16H 4.66±0.15 >10 >1 116±2.12 n.d.

16P 7.32±0.87 3.51±0.05 0.48 >100 n.d.

17A 1.87±0.07 8.34±0.09 4.46 27±0.86 32±0.97

17B 6.39±0.08 >10 >1 18±0.34 21±0.85

17C 5.60±0.09 >10 >1 12±1.94 16±0.86

17D 8.31±0.18 >10 >1 34±1.13 56±1.98

17E >10 >10 - 48±1.59 52±2.67

17P 4.56±0.05 9.34±0.09 2.05 20±0.36 21±0.98

18A 3.11±0.08 4.22±0.04 1.36 16±0.97 23±1.54

18B 2.56±0.12 >10 >1 58±1.59 56±2.18

18C 1.21±0.08 8.76±0.12 7.24 6.2±0.82 5.4±0.75

18P 8.43±0.19 1.49±0.14 0.18 >100 n.d.

19A 6.78±0.15 >10 >1 15±0.87 18±1.46

19B >10 >10 - 90±2.53 n.d.

19C 4.98±0.18 >10 >1 65±1.19 72±1.95

19D >10 >10 - >100 n.d.

20A >10 5.71±0.08 <1 99±2.86 n.d.

20B >10 >10 - 50±1.23 57±1.66

20C >10 5.55±0.13 <1 65±2.45 69±2.37

20E >10 >10 - >100 n.d.

20P >10 2.67±0.06 <1 26±1.12 29±1.27

20P >10 3.90±0.10 <1 >100 n.d.

21A 2.04±0.02 >10 >1 8.9±0.78 9.5±0.76

21B 2.76±0.04 >10 >1 26±0.67 29±1.36

21C 1.87±0.18 >10 >1 13±0.34 16±0.89

21D 3.21±0.17 >10 >1 >100 n.d.

21E 5.67±0.08 >10 >1 >100 n.d.

21K 1.12±0.06 2.32±0.05 2.07 2.5±0.34 4.5±1.32

21P 8.95±0.16 >10 >1 30±0.21 32±2.20

ANHANG

164

9.2 ROS Daten

Nr. % Inhibition

der LP [1 µM]

% Inhibition

der LP [0.1 µM]

%ROS inhibition

[1 µM]

%ROS inhibition

[0.1 µM]

2A 30.906±6.063 N.S. ±0,034 N.S. ±0,469 27,018±0,339

2B 26.932±0.010 1,69±0,010 N.S. ±0,501 16,458±0,105

2C 15.674±0.482 3,60±0,046 N.S. ±0,316 15,266±0,466

2J 23.400±1.245 N.S. ±0,018 3,927±0,662 10,852±0,313

4A 24.504±0.671 4,24±0,042 5,591±0,761 25,047±0,481

4C 17.661±0.325 0,63±0,019 N.S. ±0,576 27,310±0,984

5L N.S. ±0.138 6,35±0,065 7,400±0,617 8,724±0,839

5P N.S. ±0.098 5,08±0,017 N.S. ±0,800 8,986±0,592

6A 26.932±0.315 3,39±0,033 N.S. ±0,784 17,335±0,556

6B 48.250±0.044 10,66±0,016 11,703±0,208 N.S. ±0,256

6C 25.166±0.842 2,96±0,047 N.S. ±0,801 29,079±0,556

6J 17.219±0.157 N.S. ±0,160 13,099±0,544 27,115±0,543

15A 30.685±0.199 N.S. ±0,111 N.S. ±0,526 28,292±0,940

15C N.S. ±0.011 1,91±0,036 N.S. ±0,541 24,477±0,731

11A 38.411±1.265 0,63±0,012 2,832±0,656 17,680±0,238

11N 35.983±0.274 7,63±0,295 N.S. ±0,805 22,574±0,228

12A 42.605±1.211 3,18±0,264 5,130±0,638 27,468±0,408

12B 38.411±2.529 2,54±0,393 14,619±0,454 31,687±0,300

12C 32.451±0.666 7,63±0,348 4,035±0,656 44,480±0,636

12J 17.440±1.358 N.S. ±0,006 23,409±0,771 N.S. ±0,974

13A 52.760±2.214 2,33±0,044 N.S. ±0,742 28,989±0,564

13B 37.307±0.296 6,78±0,023 N.S. ±0,138 33,486±0,521

13C 33.113±0.462 N.S. ±0,153 2,140±0,367 17,792±0,405

13J 26.711±1.708 N.S. ±0,008 N.S. ±0,731 21,689±0,172

14A 35.541±1.869 1,27±0,027 N.S. ±0,717 24,934±0,865

14C 33.555±0.000 N.S. ±0,031 N.S. ±0,199 24,252±0,615

ANHANG

165

9.3 pKS-, logP-Werte und Reinheit

Die pKS-Werte wurden im Arbeitskreis von Prof. Sotriffer; Uni Würzburg mit der Software MoKa

berechnet.

Die Reinheit der Substanzen wurde mit Hilfe von HPLC unter folgenden Bedingungen bestimmt:

Säule: waters XTerra RP18 (250 mm, 5 µm), Fließmittel: Phosphatpuffer (8.13 mM, pH

3.0)/Methanol 30/70, Wellenlänge 250 und 360 nm. Die bestimmte Reinheit war >95 % für alle

Substanzen bei einer Wellenlänge von 360 nm und für alle Substanzen außer 4A (>94.5 %), 2L (>94

%) und 12L (>94 %) bei einer Wellenlänge von 254 nm.

Nr. pKS logP

2A 8.8 3.8

2B 8.8 3.9

2C 8.8 3.9

2D 8.9 3.9

2E 8.9 4.0

2F 8.8 3.8

2G 8.8 3.9

2H 8.8 3.9

2I 8.8 3.9

2J 8.8 3.9

2K 8.8 3.9

2L 8.8 3.7

2M 8.8 3.5

2N 8.8 3.5

2O 8.8 3.9

2P 8.8 3.9

3A 8.8 3.9

3C 8.8 3.9

4A 8.8 4.0

4C 8.8 4.0

4F 8.8 3.9

4H 8.8 3.9

4I 8.8 3.9

4J 8.9 3.9

5A 8.8 3.3

5B 8.8 3.4

5C 8.8 3.4

5K 8.8 3.4

Nr. pKS logP

5O 8.8 3.5

5P 8.8 3.9

6A 8.8 3.9

6B 8.8 3.4

6C 8.8 3.4

6D 8.8 3.4

6E 8.8 3.5

6N 8.8 3.4

6O 8.8 3.4

6P 8.8 3.9

7A 8.8 3.7

7C 8.8 3.8

7H 8.8 3.8

8A 8.8 3.7

8C 8.8 3.8

9A 8.8 3.8

9C 8.8 3.9

9F 8.8 3.8

9G 8.8 3.9

9H 8.8 3.9

9I 8.8 4.0

9J 8.8 4.0

9O 8.8 3.9

10A 8.8 3.9

10B 8.8 4.0

10C 8.8 4.0

10D 8.8 4.0

10E 8.8 4.1

Nr. pKS logP

10P 8.8 4.0

11A 8.8 3.9

11C 8.8 4.0

11M 8.8 3.8

12A 8.8 3.9

12B 8.8 4.0

12C 8.8 4.0

12D 8.8 4.0

12E 8.8 4.1

12K 8.8 4.0

12L 8.8 3.8

12M 8.8 3.6

12O 8.8 4.0

12P 8.8 3.9

13A 9.0 3.8

13B 8.8 3.9

13C 8.8 3.8

13D 8.8 4.0

13E 9.0 4.0

13O 8.9 3.8

13P 9.0 4.0

14A 8.9 4.2

14C 8.9 4.3

14M 8.8 4.1

ANHANG

166

9.4 Abkürzungen

Aβ Amyloid β HOBt Hydroxybenzotriazol ACh Acetylcholin HPLC High performance liquid AChE Acetylcholinesterase chromatography AChEI AChE-Inhibitor HT Serotonin AD Alzheimer Krankheit IC50 Konz. Bei 50 % Hemmung ADAM a disintegrin and metalloproteinase LDA Lithiumdiisopropylamid domain-containing protein logP Octanol/Wasser ADMET Absorption/Verteilung/Metabolismus Verteilungskoeffizient /Exkretion/Toxikologie LP Lipidperoxidation APH anterior pharynx defective M1/M2 Muskarinrezeptor 1/2 APLP Amyloid-Vorläufer-ähnliche Proteine mAChR Muskarinerger ACh-Rezeptor APOE Apolipoprotein MAP Mikrotubuli assoziierte Proteine APP Amyloid-Precursor-Protein MDA Malonsäuredialdehyd ATC Acetylthiocholin mRNA Boten-RNA BACE Aspartylprotease mTORC mammalian target of Rapamycin- BBB Blut-Hirn-Schranke Komplex BuChE Butyrylcholinesterase nAChR Nikotinischer ACh-Rezeptor cEND Capillary endothelial cells NMDA N-Methyl-D-Aspartat ChAT Cholin-Acetyl-Transferase NMR Nuclear magenetic resonance ChE Cholinesterase NOESY Nuclear Overhauser effect CoA Coenzym A spectroscopy COSY Correlated spectroscopy NSAID Nicht-steroidiale Antiphlogistika COX Cyclooxygenase PACAP Pituitary adenylate cyclase- DCF Dichlorofluorescein activating polypeptide DCFH Dichlorodihydrofluorescein PAS Periphere anionische Seite DIC N,N-Diisopropylcarbodiimid PET Polyethylenterephthalat DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium PHF Paired helical filaments DMF Dimethylformamid pKS Säurekonstante DMSO Dimethylsulfoxid PP Phosphatase DTNB Dithionitrobenzoesäure PRiMA Prolin-reicher Membrananker EE Essigsäureethylester PS Polystyrol FCS Fötales Kälberserum PSEN Präsenilin FAD Familiäre Alzheimer Krankheit RF Rückfluss Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl ROESY Rotating-frame Overhauser effect GDP Guanosindiphosphat spectroscopy GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor ROS Reaktive Sauerstoffspezies gSAP γ-Sekretase-Aktivierungs-Protein RT Raumtemperatur GSK Glycogen-Synthase-Kinase SAR Struktur-Wirkungs-Beziehung GTP Guanosintriphosphat SOCS Suppressor of cytokine signaling HFIP Hexafluoroisopropanol SPPS Festphasenpeptidsynthese HMBC heteronuclear multiple bond TBA Thiobarbitursäure correlation TFA Trifluoressigsäure HMQC Heteronuclear Multiple Quantum THF Tetrahydrofuran Coherence ThT Thioflavin T TOCSY total correlated spectroscopy

ANHANG

167

9.5 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abb. 1: Erkrankungshäufigkeit der Alzheimer-Krankheit 2010 in Deutschland.6 Abb. 2: Alzheimer-Neuron mit intrazellulären Neurofibrillen und extrazellulären amyloiden Plaques. Abb. 3: Cholinerge Synapse. Abb. 4: Katalytische Triade der AChE mit ACh als Substrat. Abb. 5: Strukturen von AChE-Inhibitoren gegen die Alzheimer-Krankheit. Abb. 6: Struktur von Memantin. Abb. 7: Hyperphosphoryliertes -Protein bildet Neurofibrillen. Abb. 8: Entstehung der amyloiden Plaques aus dem Amyloid-Vorläufer-Protein (APP). Abb. 9: Schematische Darstellung der Aβ-Fibrillen.87 Links ist die Seitenansicht abgebildet, rechts die

Frontansicht. Mit freundlicher Genehmigung der PNAS (Copyright (2005) National Academy of Sciences, U.S.A.).

Abb. 10: Schematische Darstellung der Entstehung der Fibrillen über verschiedene Intermediate, modifiziert nach91 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier Limited.

Abb. 11: Schematisches Zusammenspiel von Aβ und Leptin und deren Abb. 12: Neue Therapeutika für die Alzheimer-Krankheit in klinischen Studien II-IV. Abb. 13: Verlauf der Leitstrukturfindung. Abb. 14: Leitstruktur mit zu variierenden Resten. Abb. 15: Syntheseschema der Zielverbindungen. Abb. 16: Derivate der Zielverbindungen. Abb. 17: Versuche zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid: Abb. 18: Schematische Darstellung des Mechanismus der Polymerisierung von 4-Chlorpyridin. Abb. 19: Zincke-analoge Ringöffnung des Dimers von 4-Chlorpyridins. Abb. 20: verhinderte Diazotierung durch mesomere Grenzstrukturen. Abb. 21: Nucleophile Substitution von 4-Chlorpyridin mit Hydrazin. Abb. 22: 1H-NMR von 4-Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid in DMSO bei verschiedenen Temperaturen. Abb. 23: Zusammenhang zwischen Temperatur und Abstand der Signale in Verbindung 2. Abb. 24: Syntheseschema zur Darstellung der einfach substituierten Pyridylhydrazon-Hydrochloride. Abb. 25: Bildung der Schiffschen Base aus einem Aldehyd und einem primären Amin. Abb. 26: Übersicht über die Variationen an der Hydrazinylseite der Pyridylhydrazone. Abb. 27: 1H-NMR-Spektrum der Verbindung 2 als freie Base. Abb. 28: Theoretisch mögliche Tautomere und cis-/trans-Isomere der Verbindung 2. Abb. 29: Vergleich der freien Base von Verbindung 2 und dem Hydrochlorid. Abb. 30: Verteilung der Ladung in der protonierten Verbindung 2. Abb. 31: Intensitätsunterschied im ROESY-Experiment zwischen der Kopplung vom NH zu den zwei

H-Pymeta (rot gekennzeichnet im Spektrum). Abb. 32: Syntheseschema zur Darstellung der disubstituierten Pyridylhydrazon Hydrobromide. Abb. 33: Endstufen 2A-14M. Abb. 34: Vergleich der freien Base von Verbindung 2A und dem Hydrobromid. Abb. 35: „H-H-Clash“ bei einer Drehung um die N-N-Bindung. Abb. 36: Verteilung der Ladung in der protonierten Verbindung 2A. Abb. 37: Struktur der Ketoderivate. Abb. 38: Syntheseschema zur Ketogruppe in Benzylposition. Abb. 39: Syntheseschema 1 für eine Ketogruppe mit jeweils einer Methylengruppe als Spacer. Abb. 40: Syntheseschema 2 für eine Ketogruppe mit jeweils einer Methylengruppe als Spacer. Abb. 41: Hydrolytische Spaltung von Acetylcholin zu Essigsäure und Cholin. Abb. 42: Farbreaktion des Ellman’s Test. Abb. 43: Steigung der Absorption beim Ellman’s Test mit Verbindung 2A Abb. 44: Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve der Verbindung 2A im Ellman’s Test. Abb. 45: Übersicht über die Strukturen von Dr. Vildan Alptüzün und Sülünay Parlar. Abb. 46: Einfluss des Substituenten an der Hydrazinyl-Seite auf die Cholinesteraseaktivität in

Vergleich zu Verbindung 2A: gefüllter Pfeil AChE, ungefüllter Pfeil BuChE. Pfeil nach oben: Aktivität steigt; Pfeil nach unten: Aktivität sinkt; Pfeil nach rechts: Aktivität unverändert.

ANHANG

168

Abb. 47: Einfluss des Substituenten an der Pyridyl-Seite auf die Cholinesteraseaktivität bzgl. Verbindung 2A: gefüllter Pfeil AChE, ungefüllter Pfeil BuChE. Pfeil nach oben: Aktivität steigt; Pfeil nach unten: Aktivität sinkt; Pfeil nach rechts: Aktivität unverändert.

Abb. 48: Korrelation der IC50-Werte für AChE/BuChE und Spacerlänge der Verbindungen 9A-E modifiziert nach Prinz et al.155 (mit vorläufiger Genehmigung von ACS, Copyright 2012).

Abb. 49: Schematische Darstellung des Bindemodus einer Beispielsubstanz in der AChE-Bindetasche. PAS = Periphere anionische Seite; AS = anionische Substratbindestelle; ACS =Acylbindestelle; OH = Oxyaniontasche; ES = esteratisches Zentrum.118,160,161.

Abb. 50: Stereoansicht der Überlagerung der aktiven Zentren von nativer BuChE (türkis), TcAChE (blau) und DmAChE (grün).159 Mit freundlicher Genehmigung der American Society for Biochemistry and Molecular Biology.

Abb. 51: Synthese des verkürzten Peptids mit Hilfe von SPPS. Abb. 52: Schematische Darstellung der möglichen Bindungsmodi von Kongorot mit Amyloid -

Fibrillen. Abb. 53: Struktur von Thioflavin T. Abb. 54: Verlauf der Fluoreszenzintensität beim ThT-Test mit Verbindung 2A Abb. 55: Einfluss des Substituenten an der Hydrazinyl-Seite auf die Hemmung der Fibrillenbildung:

Pfeil nach oben: Aktivität steigt; Pfeil nach unten: Aktivität sinkt; Pfeil nach rechts: Aktivität unverändert.

Abb. 56: Einfluss des Substituenten an der Pyridyl-Seite auf die Hemmung der Fibrillenbildung: Pfeil nach oben: Aktivität steigt; Pfeil nach unten: Aktivität sinkt; Pfeil nach rechts: Aktivität unverändert.

Abb. 57: Protonierbarkeit der Verbindungen 2A – 22O. Abb. 58: Schematische Darstellung des Aufbaus einer „Transwell-Kammer“. Abb. 59: Veranschaulichung der Adhäsion an den Filter / Transwell-Wand: Bereits der Filter allein

stellt laut dieser Darstellung den größten Widerstand für die Zellen dar, weswegen von Adhäsion ausgegangen werden muss.

Abb. 60: Schematische Darstellung des DCF-Assays. Abb. 61: Synthetisierte Verbindungen. Abb. 62: Syntheseschema zu den Verbindungen 2A-14O. Abb. 63: Struktur von 4-Pyrdidyl-hydrazin-Hydrochlorid 1. Abb. 64: Struktur der Verbindungen 2-14. Abb. 65: Struktur der Verbindungen 2A-14O. Abb. 66: Struktur der synthetisierten Peptids. Abb. 67: Korrelation zwischen den log k‘- und den logP-Werten der Standardsubstanzen. Abb. 68: Kalibriergeraden für die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit.

ANHANG

169

Tabelle 1: Variation der Reaktionsbedingungen zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin aus 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid (Edukt 1) und Hydrazinhydrat (Edukt 2).

Tabelle 2: In situ – Erzeugung der freien Base von 4-Chlorpyridin Hydrochlorid mit Tabelle 3: Variationen zur Extraktion von 4-Chlorpyridin. Tabelle 4: Variationen an der Mikrowelle zur Synthese von 4-Hydrazinylpyridin Tabelle 5: IC50-Werte [µM] für die Hemmung der AChE und BuChE, sowie die Selektivität

AChE/BuChE. Tabelle 6: Vergleich der IC50-Werte zwischen Aß, verkürztem Peptid und Zusatz von AChE [µM]. Tabelle 7: IC50-Werte [µM] für die Hemmung der Peptidfibrillenbildung. Tabelle 8: Übersicht über die bestimmten logP-Werte. Tabelle 9: prozentualer Durchgang der Verbindungen durch die Zellen. Tabelle 10: % Hemmung der ROS-Produktion bei einer Inhibitorkonzentration von 0.1 mM. Tabelle 11: Analytische Daten der Verbindungen 2-14. Tabelle 12: IR-Daten der Verbindungen 2-14. Tabelle 13:1H-NMR-Daten der Verbindungen 2-14. Tabelle 14: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2-14. Tabelle 15: Analytische Daten der Verbindungen 2A-14A. Tabelle 16: IR-Daten der Verbindungen 2A-14A. Tabelle 17: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2A-14A. Tabelle 18: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2A-14A. Tabelle 19: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2B-13B. Tabelle 20: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2B-14B. Tabelle 21: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2B–14B. Tabelle 22: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2B-14B. Tabelle 23: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2C-14C. Tabelle 24: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2C-14C. Tabelle 25: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2C–10C. Tabelle 26: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 10C–14C. Tabelle 27: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2C-14C. Tabelle 28: Analytische Daten der Verbindungen 2D-13D. Tabelle 29: IR-Daten der Verbindungen 2D-13D. Tabelle 30: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2D–13D. Tabelle 31: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2D-13D. Tabelle 32: Analytische Daten der Verbindungen 2E-13E. Tabelle 33: IR-Daten der Verbindungen 2E-13E. Tabelle 34: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2E – 13E. Tabelle 35: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2E-13E. Tabelle 36: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2F-9F. Tabelle 37: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2F-9F. Tabelle 38: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2F-9F. Tabelle 39: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2F–9F. Tabelle 40: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2G-9G. Tabelle 41:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2G-9G. Tabelle 42: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2G-9G. Tabelle 43: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2G–9G. Tabelle 44: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2H-9H. Tabelle 45:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2H-9H. Tabelle 46: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2H–9H. Tabelle 47: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2H-9H. Tabelle 48: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2I-9I. Tabelle 49:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2I-9I. Tabelle 50: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2I–9I. Tabelle 51: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2I-9I. Tabelle 52: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2J-9J. Tabelle 53:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2J-9J. Tabelle 54: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2I–9I.

ANHANG

170

Tabelle 55: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2J-9J. Tabelle 56: Analytische Daten der Verbindungen 2K-12K. Tabelle 57: IR-Daten der Verbindungen 2K-14K. Tabelle 58: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2A–12K. Tabelle 59: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2K-12K. Tabelle 60: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2L-12L. Tabelle 61:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2L-12L. Tabelle 62: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2L-12L. Tabelle 63: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2L–12L. Tabelle 64: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2M-14M. Tabelle 65:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2M-14M. Tabelle 66: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2M–14M. Tabelle 67: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2M-14M. Tabelle 68: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2N-6N. Tabelle 69:Analytische Daten 2 der Verbindungen 2N-6N. Tabelle 70: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2N–6N. Tabelle 71: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2N–6N. Tabelle 72: Analytische Daten 1 der Verbindungen 2O-13O. Tabelle 73: Analytische Daten 2 der Verbindungen 2O-14O. Tabelle 74: 1H-NMR-Daten der Verbindungen 2O-13O. Tabelle 75: 13C-NMR-Daten der Verbindungen 2O-13O. Tabelle 76: Analytische Daten der Verbindungen 15a und 15b. Tabelle 77: Reagenzienzugabe bei den verschiedenen Messungen. Tabelle 78: Aufbau einer 96-well-Mikrotiterplatte.

ANHANG

171

9.6 Übersicht über die Produkte

F

I Br

F

Br

N

O

O

N

O

O

NN

NPy

HBr

m

R'

Ph2

A B C

D E

F G H

I J K

L M

N O

Ph1

R n

O

F

F Cl

O

2 3

4 5

7

11

8 9

12

6

O2N13

Cl

Cl10

14

Westlich

Westlich

Östlich

Östlich

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