Induksi Beta Galaktosa-Albert Hendriawan Agus Angga

download Induksi Beta Galaktosa-Albert Hendriawan Agus Angga

of 13

Transcript of Induksi Beta Galaktosa-Albert Hendriawan Agus Angga

Laporan Praktikum Biokimia Percobaan - 08 INDUKSI GALAKTOSIDASE

Disusun Oleh : Nama NIM Tgl. Percobaan Tgl. Pengumpulan Kelompok Asisten : Albert Hendriawan Agus Angga : 10509082 : 12 April 2012 :13 April 2012 : VI : Nurul

LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2012

I.

Tujuan Percobaan

Menentukan aktifitas galaktosidase dengan metode kolormetri pada berbagai medium penumbuhan E.coli. II. Teori Dasar

galaktosidase adalah enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi galaktosa danglukosa. Enzim ini akan disekresi jika suatu gen diaktifkan yang biasanya dinamakan sistim lac-operon dimana lac merupakan kepanjangan dari laktosa. Sistim operon ini cukup kompleks karena terdiri dari bagian promotor, operator dan operon itu sendiri. III. Prosedur percobaan Sebanyak 1,5 mL dari setiap media kultur bakteri (NB, NB+laktosa, NB+ glukosa, NB+glukosa+laktosa) dipipet pada tabung mikro, kemudian ditambahkan buffer Z sebanyak 0,5 mL dan dilakukan sentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 6000 rpm, kemudian dibuang supernatatnya dan suspensi kembali dilarutan dengan 1 mL buffer Z, dan dilakukan lagi sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm dan selama 3 detik, kemudian dibuang lagi supernatatnya dan dilarutkan kembali suspensinya dengan buffer Z sebanyak 1 mL, ditambahkan 50 L kloroform dan 20 50 L SDS dan di vortex, campuran kemudian di inkubasi pada 37oC selama 1 menit dan ditambahkan 0,2 mL ONPG dan ditambahkan Na2CO3 sebanyak 0,5 mL dan langsung dimasukan pada penanggas es untuk larutan blanko. Untuk tabung lainnya didiamkan selama 10,20,30,40 menit dalam water bath sebelum ditambahkan natrium karbonat dan kemudian dimasukkan kembali ke penanggas es. larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm untuk memisahkan bagian SDS dan kloroform, supernatat dipindahkan di kuvet (bagian atasnya saja) dan diukur absorbansi pada panjang gelombang 420 nm.

IV.

Data Pengamatan OD600 = 0,6 volume total = 1,77 mL Data kelompok 6 Tabung/menit NB NB+glukosa NB+laktosa NB+glukosa+lakto sa 0 0 0 0 0 10 -0,34 0,200 0,031 -0,05 20 0,245 0,309 1,233 -0,09 30 0,210 0,355 0,608 -0,047 40 1,09 0,02 1,314 -0,005

Data kelompok 5 Tabung/menit NB NB+glukosa NB+laktosa+gluko sa NB+laktosa Pengolahan Data Hasil pengolahan data kelompok 6 0 0 0 0 1,8931 10 0,333 0,068 0,036 1,925 20 0,729 0,070 0,022 1,934 30 0,927 0,088 0,039 1,940 40 0,987 0,141 0,067 1,946

Perhitungan aktivitas enzim: Tabung/menit NB NB+glukosa NB+laktosa NB+glukosa+lakto sa 0 0 0 0 0 10 -0,03202 0,0188 0,002919 -0,00471 20 0,011535 0,014548 0,058051 -0,00424 30 0,006591 0,011142 0,019083 0,030932 40 -0,00471 -0,00424 -0,00148 -0,00012

Hasil Pengolahan data kelompok V

Perhitungan aktivitas enzim: Tabung/menit NB NB+glukosa NB+laktosa NB+glukosa+lakto sa 0 0 0 0 0 10 0,031356 0,192283 0,498504 0,015604 20 0,034322 0,090416 0,295938 0,019913 30 0,029096 0,089388 0,417309 0,022764 40 0,023234 0,134517 0,447436 0,025597

V.

Pembahasan Pada silklus DNA/RNA terdapat 3 macam tahap yang paling penting untuk fungsi DNA yakni: replikasi yaitu dimana DNA/RNA memperbanyak diri mereka biasanya terjadi pada saat pembelahan sel, kemudian transkripsi dimana ada sebagian rantai pada DNA diduplikat rantai komplementernya untuk kebutuhan berbagai kepentingan sel biasanya berupa informasi untuk sintesis enzim, protein, hormon dan ekspresi gen yang biasanya rantai komplementer yang membawa informasi tersebut disebut sebagai m-RNA (messenger RNA) untuk keluar dari inti sel, kemudian informasi yang dibawa m-RNA akan diterjemahkan pada ribosom dimana pada proses ini disebut translasi m-RNA yang masuk pada ribosom biasanya akan di sebut sebagai r-RNA (ribosomal-RNA) dan kemudian ada bagian dari kompleks ribosom yang akan membawa asam amino sesuai dengan kode dari r-RNA, kompleks tersebut disebut sebagai t-RNA (transfer-RNA), dan produk akhirnya berupa gabungan-gabungan asam amino yang membentuk enzim, protein dan hormon.

Pada percobaan ini digunakan enzim galaktosidase dimana enzim ini dikode oleh suatu sistim yang bernama lac operon, pada sistim lac operon terdiri atas beberapa bagian yakni: induser, terminator, promotor, operator, dan sisitim operon itu sendiri. Skema lac operon itu sendiri sebagai berikut:

Setiap bagian pada sistim lac operon memiliki fungsinya tersendiri yakni, bagian promotor adalah bagian yang terdiri dari beberapa nukleotida yang mana bagian promotor merupakan tempat dimana dimulainya transkripsi, sedangkan induser berfungsi sebagai tempat penerimaan signal dimana gen tersebut harus diekspresikan, pada sistim lac operon, signal yang bertanggung jawab atas dimulainya replikasi adalah cAMP (siklik adeniosin mono fosfat) dimana senyawa ini merupakan senyawa turunan dari ATP dan jika konsentrasi senyawa ini tinggi maka sistim lac operon akan diaktifkan karena konsentrasi senyawa ini berbangding terbalik dengan konsentrasi glukosa, dengan kata lain semakin banyak cAMP yang ada pada lingkungan bakteri semakin sedikit kadar glukosa yang ada. Ada juga bagian yang disebut repressor yakni suatu protein yang terikat pada DNA yang akan menginhibisi ekspresi gen tersebut, jika kadar laktosa sangat rendah, maka protein pada repressor akan

menangkap signal dan akibatnya transkripsi gen terhentikan, pada sistim lac operon bagian repressor adalah bagian lacI.. Operator berfungsi sebagai daerah pengatur, jika di bagian lacI mengirim signal, maka yang ditangkap adalah daerah operator yang mana akan memutuskan berjalan atau tidaknya gen ditranskripsikan. Sedangkan pada sistim lac operon itu sendiri tersusun atas lacZ yang mana bagian ini yang akan menginformasikan untuk terbentuknya

galaktosidase untuk metabolisme laktosa sedangkan bagian lacY adalah bagian yangmengkode terbentuknya enzim galaktosidase permease yang mana enzim yang berikat pada protein pemompa yang mengatur sistim transport galaktosidase untuk masuk dan keluar sel, sedangkan lacA akan mengkode untuk menghasilkan enzim galaktosidase transasetilase yang mana berfungsi untuk transfer gugus asetil dari asetil-CoA ke

galaktosidase.Pada percobaan ini juga dilakukan sentrifugasi, yakni untuk memisahkan suspensi bakteri tersebut dengan mediumnya, yang kemudan dibilas dengan buffer Z, pembilasan buffer Z bertujuan agar tabung mikro memang sudah benar-benar bersih dan pHnya berupa pH 7, penambahan kloroform berfungsi untuk melarutkan bagian-bagian nonpolar bakteri, dan SDS berguna untuk melarutkan organel-organel bakteri atau melakukan lisis pada membran dan dinding sel bakteri.struktur SDS dan kloroform adalah sebagai berikut:

kloroform sebagai pelarut non-polar karena kloroform memiliki struktur yang tidak dapat terionsisasi dimana perbedaan keelektronegatifan pada Cl-C-Cl adalah nol, sedangkan perbedaan keelektronegatifan pada bagian H-C-Cl tidak nol, namun hidrogen pada kloroform terikat sangat kuat pada karbonnya karena ikatanya berupa ikatan sigma sehingga kloroform bersifat non-polar. Sedangkan struktur SDS sebagai berikut:

karena SDS memiliki ekor non polar dan kepala polar, maka SDS sangat cocok untuk sebagai emulglator agar bagian non-polar dan polar pada bakteri terlarut, selain itu SDS dapat melarutkan membran sel karena membran sel tersusun dari fosfolipid dimana fosfolipid juga memiliki struktur seperti SDS yakni ekor nonpolar (ekor karbon) dan kepala fosfat yang bersifat polar. Tujuan dari pemecahan sel bakteri adalah karena pengamatan aktifitas enzim diamati dengan cara kolormetri jika bakteri tidak di lisis terlebih dahulu, maka pengamatan warna kuning tidak akan terambati karena reaksi berlangsung dalam sel bakteri sehingga bakteri harus dipecahkan terlebih dahulu agar reaksi berlangsung secara ekstraseluler (di luar sel), kemudian ditambahkan ONPG sebagai substrat pengganti laktosa karena ONPG dimana ONPG merupakan senyawa turunan galaktosa yang memiliki gugus galaktosa yang kemudian galaktosa akan mengikat pada sisi aktif enzim dan pada akhir pemotongan ONPG akan menghasilkan galaktosa dan orto-nitrofenil yang berwarna kuning, dari warna kuning inilah kita akan mengamati konsentrasi warna kuning dengan metode spektofotometer dengan waktu inkubasi tertentu. Reaksi yang terjadi antara galaktosidase dengan ONPG adalah sebagai berikut:

Inkubasi dilakukan pada 37oC bertujuan untuk menjaga agar kerja enzim galaktosidase optimum, karena umunya enzim-enzim akan bekerja dengan baik pada suhu tersebut. untuk menghentikan reaksi pada waktu tertentu agar aktifitas enzim galaktosidase dapat diamati secara presisi pada waktu inkubasi yang diinginkan perlu ditambahkan reagen penghenti reaksi pada percobaan ini dilakukan dengan penambahan Na2CO3, cara kerja Na2CO3 untuk menghentikan reaksi adalah dengan cara mendenaturasi enzim tersebut karena garam Na2CO3 merupakan garam yang bersifat basa jika dilarutkan dalam air, karena garam tersebut akan mengalami hidrolisis dengan persamaan reaksi sebagai berikut:

Na2CO3 + H2O 2Na+ + HCO3- + OHKarena dihasilkan OH- maka suasana akan menjadi basa, yang memiliki kisaran pH antara 10-12, sehingga enzim galaktosidase terdenaturasi, sehingga reaksi akan berhenti, alhasil hasil yang diamati akan menjadi lebih presisi. kemudian Setelah ditambahkan Na2CO3, tabung mikro kemudian disimpan pada penanggas es dimana bertujuan untuk menjaga agar substrat dan sistim tidak rusak/berubah selain itu menjaga suhu rendah bertujuan agar orto-nitrofenil tidak bereaksi dengan spesi lain, karena jika orto-nitrofenil bereaksi dengan spesi lain maka warna kuning akan hilang. setelah itu dilakukan sentrifugasi kembali untuk memisahkan bagian kloroform dengan SDS, karena kloroform dapat merusak kuvet plastik dengan cara melarutkan plastik tersebut, sehingga pengamatan menjadi jelek karena terjadi hamburan cahaya pada plastik yang rusak. Grafik pada percobaan ini yang dilakukan oleh kelompok VI tidak seperti yang diharapkan karena terjadi kelalaian praktikan yakni semua spesi langsung ditambahkan Na2CO3 pada menit ke nol sehingga semua reaksi terhenti seketika, dan aktifitas enzim tidak terlihat secara signifikan meskipun telah dilakukan inkubasi selama jangka waktu tertentu, selain itu juga kelalaian karena lupa akan mensentrifugasi sistim tersebut, akibatnya kloroform merusaki kuvet, dan hasilnya kuvet menjadi buram dan pengamatan menjadi jelek (terdapat hasil minus pada pengukuran absorbansi) karena banyak cahaya yang dihamburkan, sehingga diambil data dari kelompok V untuk dijadikan sebagai pembanding. Dari data kelompok V didapatkan absorbansi tertinggi terdapat pada bakteri yang ditumbuhkan pada media laktosa, kedua dari glukosa+laktosa, dan yang terkecil adalah NB dan yang terakhir adalah glukosa sehingga pada medium NB atau glukosa NB tidak terbentuk warna kuning karenaa memang tidak dihasilkan galaktosidase. pada medium glukosa saja terdapat galaktosidase dalam jumlah yang sangat sedikit karena glukosa akan menginhibisi sekresi galaktosidase, karena semakin besar kadar glukosa yang ada maka cAMP yang terikat pada reseptor signal DNA semakin sedikit sehingga galaktosidase yang dihasilkan semakin sedikit atau bahkan tidak ada. VI. Kesimpulan Urutan aktifitas enzim galaktosidase dari tertinggi ke rendah adalah pada medium

laktosa>glukosa+laktosa>NB>glukosa VII. Daftar Pustaka J.H.Miller, 1972, Experimental in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Laboratorium halaman 352-355. D.L.Nelson, M.M.Cox, 2008,Lehninger: Principle of Biochemistry, 4th edition, Whfreeman Corporation, halaman 948-1081.