II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Kitin

Kitin merupakan polimer alam terbanyak di dunia setelah selulosa (Yanming, et

al. 2001). Struktur molekul kitin juga mirip selulosa. Persamaan antara selulosa

dengan kitin adalah ikatan antara monomernya yaitu ikatan glikosida pada posisi

β-(1,4). Perbedaan antara kitin dengan selulosa terletak pada atom C nomor 2

setiap monomernya. Pada selulosa terikat gugus hidroksil (–OH), sedangkan pada

kitin berupa gugus asetamida (–NHCOCH3). Kitin merupakan biopolimer alam

paling melimpah kedua setelah selulosa. Senyawa kitin atau ( (1-4)-N-asetil-D-

glukosamin) dapat dipertimbangkan sebagai suatu senyawa turunan selulosa,

dimana gugus hidroksil pada atom C-2 digantikan oleh gugus asetamido

(Pujiastuti, 2001). Struktur kitin dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur kitin (Murray et al., 2003)

6

Dalam hal kelarutan kitin berbeda dengan selulosa karena kitin merupakan

senyawa yang stabil terhadap pereaksi kimia. Kitin bersifat hidrofobik, tidak larut

dalam air, alkohol dan hampir semua pelarut organik. Kitin dapat larut dalam

asam klorida, asam sulfat dan asam fosfat pekat. Aplikasi kitin yang utama adalah

sebagai senyawa pengkelat logam dalam instalasi pengolahan air bersih atau

limbah, kosmetik sebagai fungisida dan fungistatik penyembuh luka. Kitin

bersifat biodegradable, biocompatible, citocompatible, dan mempunyai

bioaktivitas serta daya adsorpsi yang ditentukan oleh sifat biologi dan

fisikokimiawinya (Kumirska, et al., 2011).

Proses isolasi kitin biasanya terdiri dari demineralisasi, deproteinisasi dan

pemutihan (bleaching). Dua tahap pertama dapat dilakukan dengan urutan yang

sebaliknya atau saling dipertukarkan tergantung kepada pemisahan karotenida dan

protein dan penggunaan kitin yang dihasilkan. Kitin yang akan digunakan untuk

absorben atau penjerat enzim harus didahului oleh didemineralisasi, karena

pemisahan garam akan mengisi dan melindungi struktur materi kitin menjamin

deasetilasi polisakarida pada penembahan alkali selama depeoteinisasi. Akan

tetapi deprotenisasi harus dilakukan lebih dulu untuk memproses cangkang yang

sebelumnya telah diekstraksi dengan minyak untuk memisahkan karotenoidnya

(Synoweiecky and Al-Khateeb, 2003).

B. Kitosan

Kitosan disebut juga dengan β-1,4-2-amino-2-dioksi-D-glukosa. Senyawa ini

memiliki bentuk seperti lembaran tipis dan berserat, berwarna putih atau kuning,

7

tidak berbau, dan memiliki sifat tidak larut dalam air, sedikit larut dalam HCl,

HNO3, dan H3PO4 serta tidak larut dalam H2SO4. Kitosan memiliki struktur yang

mirip dengan kitin, hanya saja gugus asetilnya telah dihilangkan dengan

menggunakan basa kuat. Adanya gugus amina dan hidroksil pada kitosan

menjadikan sifatnya lebih aktif dan bersifat polikationik (Murray et al., 2003).

Di alam kitosan banyak terdapat pada dinding sel jamur, terutama pada ordo

Mucorales, dimana sebagian besar penyusun komponen dinding selnya adalah

kitosan dan pada Saccharomyces cerevisiae, kitosan merupakan penyusun utama

pada askospora. Struktur kitosan dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Struktur kitosan (Murray et al., 2003)

Dewasa ini, kitosan telah banyak digunakan dalam banyak bidang, dalam

kosmetik, farmasi, tambahan makanan, dan pertanian (Kannan et al., 2010).

Kitosan berfungsi menyerap zat racun, mencegah plak dan kerusakan gigi,

membantu mengontrol tekanan darah, memebantu menjaga pengayaan kalsium

(Ca) atau memperkuat tulang, dan bersifat anti tumor (Shahidi et al., 1999).

C. N-asetilglukosamin

N-asetilglukosamin merupakan komponen dari glikoprotein, proteoglikan,

glikosaminoglikan dan komponen penyusun jaringan penghubung lainnya.

8

Glikosaminoglikan dan glikoprotein berperan sebagai substrat untuk perbaikan

jaringan dan reaksi anti-inflamasi (Chen et al., 2010). N-asetilglukosamin atau

nama lainnya adalah 2-asetamino-2-deoksi-β-D-glukosa atau 2-(asetilamino)-2-

deoksi-D-glukosa memiliki rumus molekul C8H15NO6 dan bobot molekulnya

221,21 g mol-1

. Secara umum, berbentuk serbuk berwarna putih dengan rasa

sedikit manis. Titik leleh nya 221 ˚C, larut dalam air dan membentuk larutan 1%

jernih (Chen et. al., 2010). N-asetilglukosamin atau GlcNac berisi campuran

murni 6,9% nitrogen dengan struktur kimia yang sama dengan selulosa yang

diganti oleh suatu unit asetil amino (CH3COONH2) (Pasaribu, 2004). Struktur N-

asetilglukosamin dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Struktur N-asetilglukosamin (Anonim, 2014)

Produksi GlcNAc dari kitin melalui dua tahap. Pada awalnya kitin dipecah secara

perlahan oleh endokitinase menjadi oligosakarida, selanjutnya oligosakarida

dipecah secara cepat oleh eksokitinase menjadi GlcNAc (Sashiwa et al., 2002).

Aplikasi N-asetilglukosamin tidak hanya pada terapi osteoartritis dan anti-

inflamasi saja, namun juga pada kosmetik untuk mencegah berpigmentasi,

penuaan, dan menjaga elastisitas kulit (Bisset et al., 2007). N-asetilglukosamin

berperan penting dalam struktural dan hidrasi pada matriks ekstraseluler beberapa

jaringan seperti persendiaan dan kulit baik dermis maupun epidermis. N-

9

asetilglukosamin juga digunakan sebagai agen pemutih wajah berdasarkan

mekanisme penghambatan aktivitas tirosinase, yaitu enzim utama dalam

pembentukan melanin di melanosit. Sifatnya yang stabil dibandingkan

glukosamin menjadikan N-asetilglukosamin berpotensi untuk dibuat dalam

sediaan topikal (Shatalebi et al., 2010).

D. Glukosamin

Glukosamin (C6H13NO5) atau gula amino merupakan prekursor penting dalam

sintesis biokimia dari protein glikosilasi dan lipid. Glukosamin sebagai komponen

utama dari rangka luar Crustaceae, Artropoda, dan cendawan juga merupakan

salah satu monosakarida yang banyak dijumpai, misalnya dalam industri,

glukosamin diproduksi dengan cara hidrolisis rangka luar crustaceae atau hirolisis

kitin (Shantosh et al., 2007).

Golongan Crustaceae yang memiliki kandungan glukosamin yaitu seperti

rajungan, kepiting, udang, dan cumi-cumi. Tidak hanya itu, terdapat juga pada

invertebrata, seperti Artopoda, Molusca, Coelenterata, dan Nematoda serta

beberapa kelas serangga dan jamur. Rangka luar golongan hewan dan jamur

tersebut tersusun atas kitin. Kitin merupakan dasar pembentuk kitosan, dimana

kitosan sendiri merupakan polimer dari glukosamin (D-glukosamin). Glukosamin

berfungsi sebagai pengemulsi, koagulasi, pengkhelat, dan penebal emulsi

(Anonim, 2007).

Glukosamin ditemukan secara luas pada tulang rawan dan memiliki peranan yang

sangat penting untuk kesehatan dan kelenturan sendi (EFSA, 2009). Glukosamin

10

merupakan senyawa alami yang terdapat dalam tubuh manusia yang terdiri dari

glukosa dan asam amino glutamin. Selain itu glukosamin adalah unsur pokok dari

GAG pada tulang rawan kartilago dan cairan sinovial. Fungsi glukosamin dalam

tubuh adalah untuk memproduksi cairan sinovial yang berfungsi sebagai pelumas

pada tulang rawan, sehingga pergerakan tulang menjadi baik. Kekurangan cairan

sinovial dalam tubuh akan menyebabkan terjadinya gangguan sendi, seperti

gerakan sendi yang kaku sehingga akan berakibat terkena penyakit osteoarthritis

(Williams, 2004). Struktur glukosamin dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Struktur D-glukosamin (Anonim, 2014)

E. Enzim Kitinase

Kitinase (EC 3.2.1.14) merupakan enzim yang mampu menghidrolisa polimer

kitin menjadi kitin oligosakarida atau monomer N-asetilglukosamin. Enzim ini

dihasilkan oleh bakteri, fungi, tanaman, dan hewan. Atas dasar cara kerjanya

dalam mendegradasi substrat, kitinase dibedakan ke dalam 2 kelompok utama,

yaitu endokitinase dan eksokitinase. Endokitinase memotong polimer kitin secara

acak ikatan β-1,4 bagian internal mikrofibril kitin dan menghasilkan dimer,

trimer, tetramer dan atau oligomer gula.

11

Gambar 5. Reaksi pemutusan ikatan β-1,4 pada bagian internal mikrofibril kitin oleh

endokitinase (Suryanto et al., 2005)

Eksokitinase disebut juga kitobiodase atau kitin β-1,4-kitobiodase yang

memotong kitin hanya dari ujung non reduksi dan tidak secara acak serta tanpa

adanya pembentukan unit-unit monosakarida atau polisakarida.

Gambar 6. Reaksi pembebasan unit-unit diasetilkitobiose oleh enzim eksokitinase

(Suryanto et al., 2005)

Bila hasil potongan berupa monomer maka enzim tersebut dinamakan β-1,4-N-

acetylheksosaminidase, namun bila potongan yang dihasilkan berupa dimer maka

enzim tersebut disebut sitobiosidase dan keduanya menghasilkan monomer-

monomer GlcNAc (Cohen-Kupiec and Chet, 1998).

12

Gambar 7. Reaksi pemutusan diasetilkitobiodase, kitotriose, dan kitotetraose oleh

β-1,4-N-acetylheksosaminidase menghasilkan N-asetil-D-glukosamin

(Suryanto et al., 2005)

Berdasarkan homologi sekuen asam aminonya, kitinase dibedakan atas famili 18

dan 19. Famili 18 meliputi kitinase dari bakteri, fungi, serangga, tanaman (kelas

III dan V), hewan (Gijzen et al., 2001) dan satu kitinase dari Streptomyces griseus

(Ohno et al., 1996). Kitinase tanaman kelas I tersusun atas sekuen yang conserved

pada struktur utamanya, serta domain kaya sistein pada ujung N. Kitinase kelas II

secara struktural homolog dengan kelas I, tetapi tidak memiliki domain kaya

sistein. Sementara, kitinase kelas III dan V tidak memiliki homologi dengan

kitinase kelas I, II dan IV (Fukamizo, 2000).

Selain oleh kitinase, polimer kitin juga bisa didegradasi oleh enzim kitin

deasetilase dan kitosanase. Kitin deasetilase (EC 3.5.1.41) menghilangkan gugus

asetil dari kitin menghasilkan kitosan. Kitosan akan dipotong-potong oleh

kitosanase (EC 3.2.1.1.32) menghasilkan kitosan oligomer kitosan. Oligomer

13

kitosan kemudian dipotong-potong lagi oleh β-D-glukosaminidase menghasilkan

monomer glukosamin (Patil et al., 2000).

Gambar 8. Jalur degradasi kitin secara enzimatik (Gooday, 1994)

Actinomycetes, bakteri, dan jamur merupakan organisme yang mampu

memanfaatkan kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen. Genus bakteri yang

sudah banyak dilaporkan memiliki kitinase antara lain Aeoromonas, Alteromonas,

Chromobacterium, Enterobacter, Ewingella, Pseudoalteromonas, Pseudomonas,

Serratia, Vibrio, Bacillus, Pyrococcus (Suryanto et al., 2005).

Koloidal kitin merupakan salah satu substrat yang dapat digunakan untuk

menginduksi kitinase pada bakteri, jamur, dan actinomycetes. Substrat ini

mampu menginduksi enzim hidrolitik seperti β-1,4-N-asetilglukosamidase,

endokitinase dan kitobiosidase pada Aeromonas caviae, Enterobacter

agglomeras, Bacillus cereus (Suryanto et al., 2005).

14

F. Enzim Kitindeasetilase

Enzim kitin deasetilase terdapat bakteri laut, beberapa jamur dan beberapa

serangga, yang mengkatalisis proses deasetilasi kitin, suatu biopolimer struktural

yang ditemukan mikroorganisme laut, sel jamur dan dinding spora serta kutikula

dan peritrofik matriks serangga (Zhao et al., 2010). Kitin deasetilase pertama kali

ditemukan dari ekstrak jamur Mucor rouxii (Araki et al., 1975) dan lebih lanjut

diketahui bahwa enzim tersebut dikaitkan dengan sintesis dinding sel dengan

mengubah kitin menjadi kitosan.

Sampai saat ini sudah banyak dilakukan penelitian mengenai enzim kitin

deasetilase. Penelitian ini pada umumnya bertujuan untuk mempelajari sifat-sifat

yang dimiliki oleh enzim kitin deasetilase (Zhao et al., 2010), antara lain yaitu:

1. Masa Molekular

Massa molekul untuk sebagian besar kitin deasetilase adalah dalam kisaran 25

sampai 80 kDa.

2. Suhu dan pH Optimum

Menurut hasil yang dilaporkan, pH optimum untuk kitin deasetilase

ekstraseluler adalah netral atau dalam kisaran basa 7-12, sementara sebagian

kitin deasetilase intraseluler yang nilai pH optimal berada dalam kisaran 4,5-

6. Suhu optimal adalah 50-60 °C.

3. Substrat Spesifik

Caufrier et al. (2003) menguji asetil xilan, peptidoglikan dan kitin sebagai

substrat untuk kitin deasetilase dari M. rouxii dan asetil xilan esterase dari

Streptomyces lividans. Semua enzim diuji untuk menentukan aktif tidaknya

15

pada asetil xilan, peptidoglikan, dan kitin. Hasil menunjukkan bahwa enzim

kitin deasetilase tidak aktif pada peptidoglikan tetapi aktif pada asetil xilan. Hal

ini menjelaskan bahwa baik kitin deasetilase dan asetil xilan esterase memiliki

domain katalitik yang sama.

G. Jamur Mucor miehei

Jamur adalah sekelompok organisme yang digabungkan dalam takson Kingdom

Fungi berdasarkan sistem Whitaker. Kingdom fungi mempunyai ciri khas yaitu

bersifat heterotrof yang mengabsorbsi nutrien dan memiliki kitin pada dinding

selnya. Jamur benang atau kapang adalah golongan fungi yang membentuk

lapisan jaringan miselium dan spora yang tampak. Miseliumnya terdiri dari

filamen tubular yang tumbuh yaitu hifa (Singleton dan Sainsbury, 2006).

Jamur dapat bersifat sapotrof yaitu dengan mendapatkan nutrisi dari organisme

lain yang telah mati, ada juga yang bersifat parasit dengan mengisap nutrisi dari

organisme lain yang hidup, atau dengan bersimbiosis mutualisme dengan satu

organisme (Sadava, 2003).

Fungi mempunyai penggunaan kitin yang berbeda dengan hewan. Hewan hanya

memproduksi kitin pada bagian tertentu, misalnya sebagai rangka luar, rambut,

atau kuku, sementara fungi memiliki kitin sebagai pembentuk dinding pada

seluruh selnya. Adanya kitin juga membantu membedakan antara fungi dan

eukariota lainnya, seperti protista (Sadava, 2003).

16

Mucor adalah genus fungi yang berasal dari ordo Mucorales yang merupakan

fungi tipikal saprotrop pada tanah dan serasah tumbuhan yang mampu

menghasilkan enzim kitindeasetilase pada substrat kitin atau kulit Crustaceae dan

media cair yang mengandung nutrien yang diperlukan (Ratledge, 1993). Mucor

berkembang biak secara aseksual dengan membentuk sporangium yang ditunjang

oleh batang yang disebut sporangiofor. Hifa vegetatifnya bercabang-cabang,

bersifat senositik dan tidak bersepta. Ciri khas pada Mucor adalah memiliki

sporangium yang berkolom-kolom atau kolumela (Singleton dan Sainsbury,

2006).

Mucor miehei sebagai salah satu anggota ordo Mucorales mempunyai talus yang

berupa miselium yang lebat. Pembiakkan aseksual dilakukan dengan spora tak

berflagel (Aplanospora). Aplanospora terbentuk dalam sporangium dan

sporangium terletak pada ujung sporangiofor atau pada ujung cabang-cabangnya.

Pembiakkan seksual pada Mucorales berlangsung dengan bersatunya dua

gametangium yang berinti banyak. Gametangium terbentuk pada ujung hifa atau

ujung cabang hifa (Dwidjoseputro, 1976). Berikut ini merupakan taksonomi

Mucor miehei (Singleton dan Sainsbury, 2006).

Kingdom : Fungi

Divisi : Zygomycota

Kelas : Zygomycetes

Ordo : Mucorales

Famili : Mucoraceae

Genus : Mucor

Spesies : Mucor miehei

17

H. Fermentasi Fasa Cair Sistem Tertutup (Batch)

Fermentasi merupakan suatu reaksi oksidasi reduksi yang memanfaatkan sumber

energi karbon, nitrogen, dan pospor untuk membentuk senyawa dengan nilai

ekonomi yang lebih tinggi serta terakumulasi dalam medium. Proses fermentasi

terjadi disebabkan oleh hasil metabolisme dari organisme (Rao, 2009). Medium

dalam suatu fermentasi harus mengandung substrat yang kaya akan nutrisi. Nutrisi

utama yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba adalah karbon, nitrogen,

hidrogen, oksigen, dan fosfor. Faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan

substrat untuk fermentasi (Pujaningsih, 2005) adalah:

a. Ketersediaan yang kontinyu, yaitu substrat tersedia sepanjang tahun sehingga

saat disimpan dalam beberapa bulan, mutu dan komposisi relatif tetap.

b. Sifat substrat harus dapat difermentasikan, contoh pada Trichoderma viridae

yang tumbuh baik hanya pada substrat selulosa (jerami padi), tetapi tidak dapat

tumbuh pada bungkil kelapa.

c. Harga substrat ekonomis atau terjangkau dan dapat digunakan sesuai

kebutuhan.

Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur terendam

(submerged). Medium kultur permukaan dapat berupa medium padat, semi padat,

atau cair. Sedangkan kultur terendam dilakukan dalam media cair menggunakan

bioreaktor yang dapat berupa labu yang diberi aerasi, labu yang digoyangkan

dengan shaker atau fermentor (Rahman, 1992). Dibandingkan dengan medium

padat, medium cair mempunyai beberapa kelebihan (Weites et al., 2001), yaitu

sebagai berikut.

18

1. Jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat diatur sesuai dengan

yang diinginkan.

2. Dapat memberikan kondisi yang optimum untuk pertumbuhan.

3. Pemakaian medium lebih efisien.

Kondisi yang optimum untuk suatu proses fermentasi tergantung pada jenis

organismenya. Pengendalian faktor-faktor fermentasi bertujuan untuk

menciptakan kondisi yang optimum bagi pertumbuhan dan produksi metabolit

yang diinginkan dari suatu organisme tertentu. Fermentasi medium cair lebih

memungkinkan untuk mengendalikan faktor-faktor fisik dan kimia yang

mempengaruhi proses fermentasi, seperti suhu, pH, dan kebutuhan oksigen

(Rahman, 1992).

Pada fermentasi skala laboratorium yang menggunakan labu goyang (shake flask),

pengendalian suhu dapat dilakukan melalui penggunaan inkubator yang

dilengkapi dengan thermostat pengatur suhu atau menggunakan penangas air

(waterbath). Penambahan asam atau basa untuk mengatur pH medium pada

fermentasi yang menggunakan labu goyang, dilakukan secara manual. Ke dalam

medium ditambahkan larutan indikator pH yang akan menunjukkan pada saat

diperlukannya penambahan asam atau basa ke dalam medium (Ton et al., 2010).

Fermentasi medium cair dapat dilakukan dengan cara fermentasi tertutup (batch

culture), fermentasi kontinyu, dan fermentasi “fed batch”. Pada fermentasi

tertutup, setelah inokulasi berjalan tidak dilakukan lagi penambahan medium ke

dalam fermentor, kecuali dalam pemberian oksigen (udara steril), antibuih, dan

asam atau basa yang mengatur pH. Oleh karena itu pada sistem tertutup ini

19

dengan sekian lamanya waktu fermentasi yang ditentukan maka laju pertumbuhan

spesifik mikroorganisme semakin menurun sampai akhirnya pertumbuhan

terhenti. Hal ini disebabkan karena dengan semakin bertambahnya waktu

fermentasi, nutrien-nutrien esensial dalam medium semakin berkurang dan terjadi

akumulasi autotoksin yang mempengaruhi laju pertumbuhan dan kombinasi dari

keduanya. Dengan demikian pada fermentasi tertutup jumlah sel maksimum

terletak pada saat fase stationer (Ton et al., 2010).

Menurut Mitchel et al. (2006), tahapan proses umum dalam fermentasi batch ini

antara lain sebagai berikut.

1. Persiapan substrat

Substrat dapat dibuat menjadi butiran kecil. Untuk menambah ketersediaan gizi

dilakukan penambahan air dan nutrisi yang disebut dengan pra-perawatan

substrat.

2. Persiapan inokulum

Persiapan inokulum tergantung pada jenis mikroorganisme yang digunakan.

Proses fermentasi batch ini dapat melibatkan bakteri dan jamur dengan spora

merupakan hasil inokulasi. Tujuannya untuk menciptakan inokulum dengan

tingkat kelangsungan hidup mikroorganisme yang tinggi.

3. Persiapan wadah

Wadah harus benar-benar bersih dan steril sebelum penambahan substrat

dilakukan.

4. Inokulasi

Pengerjaan tahap ini dilakukan dengan penyebaran substrat pada media yang

telah steril secara hati-hati.

20

5. Proses fermentasi batch

Sebelum memulai proses ini, hal yang harus diperhatikan adalah pH medium,

suhu, dan waktu inkubasi.

6. Kultivasi

Tahap ini merupakan tahap pemisahan substrat padat dari medium yang dapat

dilakukan dengan menggunakan kertas saring dan sentrifugasi.

Pemanfaatan fermentasi batch secara tradisional (Holker et al., 2004 dan Pandey,

2000) antara lain sebagai berikut.

1. Pembuatan minuman beralkohol seperti bir dengan cara sari buah yang diberi

Saccaromyces cereviciae kemudian diinkubasikan.

2. Pembuatan Yoghurt dengan cara menfermentasikan air susu dengan bakteri

bukan khamir. Biasanya menggunakan Lactobacillus bulgaricus dan

Streptococcus thermopillus. Bakteri ini akan mengubah laktosa (gula susu)

menjadi asam laktat pada kondisi anaerob yang bersifat menggumpalkan

kasein.

3. Keju, biasanya menggunakan bakteri dengan spesies Lactobacillus bulgaricus

dan Streptococcus thermopillus. Enzim yang diperlukan untuk menghasilkan

keju adalah rennet yang mengandung cymosin yang bersifat menggumpalkan

kasein.

Selain aplikasi di atas, masih banyak aplikasi yang menghasilkan produk-produk,

seperti enzim, pigmem, senyawa aromatik, senyawa kimia, antibiotik, agen

pengontrol biologis, dan banyak aplikasi penggunaan mikroorganisme dalam

21

fermentasi batch sebagai bagian dari proses perantara, yaitu pewarnaan zat warna,

biobleaching, biopulping, dan bioremediation.

I. Phenylisothiocyanate (PITC)

Rumus Kimia : C7H5NS

Formulasi Kimia : C6H5NCS

Massa molar : 135,18 g/mol

Kelarutan dalam air : 20 ˚C (tidak larut, penguraian)

Titik leleh : -21 ˚C

Densitas : 1,13 g/cm3 (20 ˚C)

Titik didih : 221 ˚C

Tekanan uap : 10 hPa (20 ˚C)

Titik nyala : 87 ˚C

Indeks refraktif : 1,6497 (20 ˚C, 589 nm) (Anonim, 2014)

Gambar 9. Struktur fenil isotiosianat (Anonim, 2014)

J. Fourier Transform Infrared (FTIR)

Fourier Transform Infra Red (FTIR) merupakan suatu teknik spektroskopi

inframerah yang dapat mengidentifikasi kandungan gugus fungsi suatu senyawa

termasuk senyawa kalsium fosfat, namun tidak dapat mengidentifikasi unsur-

22

unsur penyusunnya. Prinsip kerja dari metode ini adalah sinar yang diserap

menyebabkan molekul dari senyawa tervibrasi dan energi vibrasi diukur oleh

detektor serta energi vibrasi dari gugus fungsi tertentu akan menghasilkan

frekuensi secara spesifik. Ada dua jenis energi vibrasi yaitu vibrasi bending dan

vibrasi stretching. Vibrasi bending yaitu pergerakan atom yang menyebabkan

perubahan sudut ikatan antara dua ikatan atom atau pergerakan dari seluruh atom

terhadap atom lainnya. Sedangkan vibrasi stretching adalah pergerakan atom yang

teratur sepanjang sumbu ikatan antara dua atom sehingga jarak antara dua atom

dapat bertambah atau berkurang (Samsiah, 2009).

Spektrofotometer FTIR memiliki kesamaan dengan spektrofotometer Infrared

dispersi hanya saja pengembangan pada sistem optiknya sebelum berkas sinar

inframerah melewati contoh. Spektrofotometer FTIR memiliki dasar pemikiran

dari persamaan gelombang yang dirumuskan oleh seorang ahli matematika dari

Perancis, Jean Baptiste Joseph Fourier (1768-1830). Dari deret Fourier tersebut

intensitas gelombang digambarkan sebagai daerah frekuensi atau daerah waktu.

Perubahan gambaran intensitas gelombang radiasi elektromagnetik dari derah

frekuensi ke daerah waktu atau sebaliknya disebut Transformasi Fourier (Fourier

Transform). Pada sistem optik peralatan instrumen Fourier Transform Infrared

memiliki dasar daerah waktu yang non dispersif. Secara keseluruhan, analisis

menggunakan spektrofotometer ini lebih unggul dibandingkan spektrofotometer

infrared dispersi (Hsu, 1994), yaitu:

1. dapat digunakan untuk semua frekuensi dari sumber cahaya secara simultan

sehingga dapat dilakukan analisis lebih cepat, dan

23

2. metode spektrometri FTIR memiliki sensitifitas lebih besar dibandingkan cara

dispersi, karena radiasi yang masuk ke sistem detektor lebih banyak tanpa

harus melalui celah.

Sebagai contoh, senyawa kitin memberikan data serapan IR pada v = 3448,5 cm-1

yang menunjukan vibrasi ulur NH amida (NH amina) dan OH; v = 2920-2873,7

cm-1

yang menunjukan vibrasi ulur CH, CH2, dan CH3; v = 1450,4 cm-1

yang

menunjukan vibrasi tekuk NH; v = 1153,4 cm-1

yang menunjukan vibrasi ulur C-

N; v = 1033,8 cm-1

yang menunjukan vibrasi ulur C-O; dan v = 871,8 cm-1

yang

menunjukan vibrasi tekuk keluar bidang N-H (Syahmani and Sholahuddin, 2009).

K. Spektrofotometri Ultraviolet-Visible

Spektrofotometer terdiri atas spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer

menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan

fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditranmisikan atau yang

diabsorpsi. Spektrofotometer tersusun atas sumber spektrum yang kontinyu,

monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat

untuk mengukur pebedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun

pembanding (Khopkar, 2002).

Spektroskopi UV-Vis melibatkan absorpsi radiasi elektromagnetik dari kisaran

200-800 nm dan kemudian eksitasi elektron ke tingkat energi lebih tinggi.

Absorpsi cahaya ultraviolet/tampak oleh molekul organik terbatas hanya untuk

beberapa gugus fungsi (kromofor) yang mengandung elektron valensi dari energi

eksitasi yang rendah. Spektrum UV-Vis merupakan spektrum yang kompleks dan

24

nampak seperti pita absorpsi berlanjut, hal ini dikarenakan gangguan yang besar

dari transisi rotasi dan vibrasi pada transisi elektronik memberikan kombinasi

garis yang tumpang tindih (overlapping) (Hunger and Weitkamp, 2001).

Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk

mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi.

Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi

tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini. Tetapi spektrum ini

sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di

dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang

gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Dachriyanus,

2004).

Untuk mendapatkan hasil pengukuran yang optimum, setiap komponen dari

instrumen yang dipakai harus berfungsi dengan baik. Komponen-komponen

spektrofotometri UV-Vis meliputi sumber sinar, monokromator, dan sistem optik

(Rohman, 2007).

a. Sebagai sumber sinar; lampu deuterium atau lampu hidrogen untuk pengukuran

UV dan lampu tungsten digunakan untuk daerah cahaya tampak (visible).

b. Monokromator; digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponen-

komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah

(slit). Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga kisaran panjang

gelombang dilewatkan pada sampel sebagai scan instrumen melewati

spektrum.

25

c. Optik-optik; dapat didesain untuk memecah sumber sinar sehingga sumber

sinar melewati dua kompartemen, dan sebagai mana dalam spektrometer

berkas ganda (double beam), suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu

kompartemen untuk mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel. Yang

paling sering digunakan sebagai blanko dalam spektrofotometri adalah semua

pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi.

Gambar 10. Skema kerja spektrofotometri UV-Vis (Anonim, 2014)

Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri

ultraviolet (Rohman, 2007), yaitu:

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Panjang gelombang yang digunakn untuk analisis kuantitatif adalah panjang

gelombang dimana terjadi absorbansi maksimum. Untuk memperoleh

panjang gelombang serapan maksimum dapat diperoleh dengan membuat

kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu

larutan baku dengan konsentrasi tertentu.

2. Pembuatan kurva kalibrasi

Dilakukan dengan membuat seri larutan baku dalam berbagai konsentrasi

kemudian asorbansi tiap konsentrasi di ukur lalu dibuat kurva yang

merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Kurva kalibrasi

yang lurus menandakan bahwa hukum Lambert-Beer terpenuhi.

26

3. Pembacaan absorbansi sampel

Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai

0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitan. Hal ini disebabkan

karena pada kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang

terjadi adalah paling minimal.

Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel

tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Serapan ultraviolet dan visibel

dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat transisi-transisi diantara tingkatan-

tingkatan tenaga elektronik. Disebabkan karena hal ini, maka serapan radiasi

ultraviolet atau terlihat sering dikenal sebagai spektroskopi elektronik. Transisi-

transisi tersebut biasanya antara orbital ikatan antara orbital ikatan atau orbital

pasangan bebas dan orbital non ikatan tak jenuh atau orbital anti ikatan. Panjang

gelombang serapan merupakan ukuran dari pemisahan tingkatan-tingkatan tenaga

dari orbital yang bersangkutan. Spektrum ultraviolet adalah gambar antara

panjang gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan (transmitasi

atau absorbansi). Sering juga data ditunjukkan sebagai gambar grafik atau tabel

yang menyatakan panjang gelombang lawan serapan molar atau log dari serapan

molar, Emax atau log Emax (Sastrohamidjojo, 2001).

Spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang

berupa larutan, gas, atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu

diperhatikan pelarut yang dipakai (Mulja dan Suharman, 1995), antara lain:

1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sisvtem ikatan rangkap terkonjugasi

pada struktur molekulnya dan tidak berwarna.

27

2. Tidak berinteraksi dengan molekul senyawa yang dianalisis.

3. Kemurniannya harus tinggi untuk analisis.

L. High Pergormance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi dapat didefinisikan sebagai pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan distribusi antara dua atau lebih fase terlarut. Contoh beberapa fase

terlarut diantaranya adalah gas-cair, gas-padat, cair-cair, cair-padat, gas-cair-

padat, dan cair-cair-padat. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka

dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase

diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition

chromatography). Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi

dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu kromatografi gas (gas

chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) (Harmita, 2006).

HPLC merupakan suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair.

HPLC dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis senyawa

berdasarkan kekuatan atau kepolaran fasa geraknya. Berdasarkan polaritas relatif

fasa gerak dan fasa diamnya, HPLC dibagi menjadi dua, yaitu fasa normal yang

umum digunakan untuk identifikasi senyawa nonpolar dan fasa terbalik yang

umum digunakan untuk identifikasi senyawa polar. Pada fasa normal, fasa gerak

yang digunakan kurang polar dibandingkan dengan fasa diam. Sedangkan pada

fasa terbalik, fasa gerak lebih polar dibandingkan dengan fasa diam (Gritter et al.,

1991).

28

Prinsip pemisahan senyawa menggunakan HPLC adalah perbedaan distribusi

komponen diantara fasa diam dan fasa geraknya. Semakin lama terdistribusi

dalam fasa diam, maka semakin lama waktu retensinya (Clark, 2007).

Cara yang praktis dan efisien untuk menganalisis glukosamin adalah dengan

HPLC yang dilenkapi dengan ELSD (Evaportive Light Scattering Detection).

Metode HPLC dengan menggunakan evaporasi detektor hamburan cahaya

(ELSD) dapat meningkatkan sensitifitas, serta digunakan kolom HPLC yang

sangat stabil, mudah, dan cepat (Jacyno and Dean, 2004). Detektor evaporasi

hamburan cahaya ideal untuk mendeteksi analit tanpa gugus kromofor UV, karena

analisis tidak bergantung pada sifat optik dari suatu senyawa. Prinsip kerja dari

detektor evaporasi hamburan cahaya adalah sampel yang berasal dari HPLC

dalam bentuk cair mengalami nebulisasi menjadi bentuk aerosolnya. Kemudian

pelarut yang digunakan akan mengalami evaporasi (penguapan) sehingga terpisah

dari sampel. Sampel yang telah terpisah ditembaki dengan sinar pada semua

panjang gelombang (LS) kemudian jumlah cahaya yang dipantulkan kembali akan

memberikan sinyal untuk detektor. Sinyal yang terdeteksi akan memberikan data

output berupa kromatogram (Gritter et al., 1991). Adapun keunggulan dari ELSD,

yaitu:

1. Sensitivitas tinggi yang memberikan respon luar biasa untuk semua senyawa,

sampai ke tingkat nanogram rendah.

2. Operasi sub-ambien menggunakan tabung penguapan berpendingin peltier

memberikan suhu rendah sampai 10 °C, mencegah degradasi dari senyawa

labil panas yang tidak terdeteksi oleh ELSD lain.

29

3. Real-time kontrol selama injeksi melalui software dimensi yang diprogram

untuk mempertahankan sensitivitas maksimum pada pengoperasian alat.

4. Real-time pemograman gas yang menghilangkan efek peningkatan pelarut

selama elusi gradien, sangat baik untuk analisis kation.

5. Dispersi rendah dan kecepatan data output-tingkat tinggi adalah pasangan yang

cocok untuk aplikasi LC cepat.

6. Reprodusibilitas super di bawah 2% memberikan hasil yang dapat diandalkan

dan akurat.

7. Pemanasan dan pendinginan tabung evaporator cepat, meminimalkan waktu

keseimbangan dan sampel yang lewat.

Kondisi HPLC untuk identifikasi glukosamin menggunakan detektor ELSD,

kolom karbohidrat ES, 5m, 150 x 4,6 mm, fasa gerak adalah asetonitril:air (65:35)

yang merupakan campuran pelarut polar, dan laju alir 1,0 mL/menit (Jacyno and

Dean, 2004).