IDENTIFICAZIONE:l’approccio tradizionale

Identificazione convenzionale

☣ Test biochimici☣ Test colturali

Test biochimici

☣ Accumulo di niacina☣ Riduzione dei nitrati☣ Catalasi

• a 68°C• semiquantitativa

☣ Idrolisi del Tween 80☣ Ureasi☣ Riduzione del tellurito☣ Arilsolfatasi☣ β-glucosidasi

Niacina

☣ Prodotto del metabolismo micobatterico accumulato nel terreno• requisiti della coltura• l’estrazione• la rivelazione• 24 ore

☣ Distingue il M. tuberculosis dalle altre specie

☣ Irregolarmente positiva nel M. simiae☣ Raramente positiva in altri micobatteri

Nitrati

☣ Svariate specie micobatteriche sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti• 4 ore

Catalasi a 68°C

☣ Praticamente tutti i micobatteri producono catalasi

☣ In quasi tutte le specie, ad eccezione di quelle del M. tuberculosis complex la catalasi è termoresistente• incubazione a 68°C per 20 min• rivelazione con H2O2

• 20 min

Catalasi semiquantitativa

☣ I diversi tipi di catalasi prodotti dalle varie specie micobatteriche differiscono anche quantitativamente

☣ Il test permette di differenziare i ceppi che, in seguito all’aggiunta di H2O2, producono una colonna di bollicine superiore, o inferiore, a 45 mm• 14 giorni

Idrolisi del Tween 80

☣ Alcuni micobatteri possiedono una esterasi, grazie ad essa sono in grado di idrolizzare il Tween 80

☣ Utilizzando Tween legato a rosso neutro, l’idrolisi è evidenziata dal viraggio al rosso• 10 giorni

Ureasi

☣ Alcuni micobatteri sono in grado di idrolizzare l’urea

☣ L’avvenuta idrolisi è indicata dal viraggio di un idoneo indicatore• 3 giorni

Riduzione del tellurito

☣ La capacità di ridurre il tellurito di potassio a tellurio metallico si evidenzia dalla formazione di un precipitato nero• 10 giorni

Arilsolfatasi

☣ I micobatteri provvisti di arilsolfatasi sono in grado di idrolizzare la fenolftaleina tripotassica a fenolftaleina

☣ La fenolftaleina, in ambiente alcalino, sviluppa un colore rosso• 3 giorni

β-glucosidasi

☣ I micobatteri che possiedono la β‑glucosidasi sono in grado di idrolizzare i β‑glucosidi liberando glucosio

☣ Usando come substrato il p‑nitrofenil‑D‑glucoside si ha liberazione di p‑nitrofenolo che è giallo• 3 ore

Test colturali

☣ Velocità di crescita☣ Temperature di crescita☣ Pigmento☣ Morfologia delle colonie☣ Test di inibizione selettiva

Velocità di crescita

☣ I micobatteri a crescita rapida formano colonie visibili ad occhio nudo in meno di una settimana

☣ I micobatteri a crescita lenta possono richiedere anche 6 settimane• Il tempo richiesto per la crescita nella coltura primaria

non è indicativo• Il tempo richiesto per la crescita in coltura liquida non

è indicativo• Il test deve essere eseguito utilizzando un inoculo

diluito

Temperature di crescita

☣ Il range di temperatura che permettono lo sviluppo delle varie specie batteriche è ampio

☣ Oltre all’incubazione a 37°C è necessario provare almeno altre due temperature, 25-30°C e 42‑45°C

Pigmento

☣ I micobatteri si distinguono in:• non cromogeni• scotocromogeni• fotocromogeni

Morfologia delle colonie

☣ Aspetto macroscopico☣ Aspetto microscopico (100x)

Test di inibizione selettiva

☣ L’aggiunta al terreno di particolari sostanze permette di distinguere le specie che ne tollerano la presenza, che crescono, da quelle che ne risultano inibite• TCH• NaCl• Tiacetazone• Idrossilamina• (MacConkey)• NAP

Identificazione

☣ Confronto dei risultati dei test con i dati presenti in letteratura (tabelle)

Identificazione

Crescita in presenza di:

Specie

Nia

cin

a

Rid

uzi

on

e d

ei n

itra

ti

Cat

alas

i a 6

8°C

Cat

alas

i >45

mm

Pig

men

to a

l bu

io

Pig

men

to a

lla lu

ce

-g

luco

sid

asi

Idro

lisi d

el T

wee

n 8

0

Cre

scit

a le

nta

Cre

scit

a a

25°C

Cre

scit

a a

45°C

Rid

uzi

on

e d

el t

ellu

rito

Ari

lso

lfat

asi

Co

lon

ie r

ug

ose

Ure

asi

Mac

Co

nke

y

NaC

l

TC

H

Tia

ceta

zon

e

Idro

ssila

min

a

Iso

nia

zid

e

M. africanum 10 10 0 0 0 0 50 10 100 0 0 0 0 100 90 0 0 10 0 0 0

M. asiaticum 0 0 100 100 0 100 10 100 90 100 0 0 0 10 0 50 0 100 100 82 91

M. avium/intracellululare 0 0 70 19 4 4 10 0 90 100 47 76 0 10 0 24 5 100 98 71 98

M. bovis/M. bovis BCG 0 8 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 0 0

M. chelonae 3 8 50 97 0 0 10 20 0 96 0 51 90 50 90 90 59 90 90 96 50

M. fallax 10 90 10 50 10 10 50 50 0 90 50 50 10 50 10 10 10 90 90 50 50

M. flavescens 0 100 100 100 100 100 10 100 50 100 17 32 0 50 100 0 100 100 100 0 0

M. fortuitum 7 100 100 98 0 0 85 33 0 90 0 43 100 50 100 100 100 100 100 96 50

M. gastri 0 0 0 0 0 0 90 100 90 100 0 0 0 50 100 16 0 100 9 0 8

M. gordonae 0 0 100 96 100 100 10 91 90 100 0 0 0 0 8 0 0 100 100 35 87

M. haemophilum 0 0 0 0 0 0 50 0 90 90 0 0 0 90 0 0 0 90 50 50 90

M. kansasii 0 97 100 100 0 97 30 100 100 100 0 0 0 50 100 0 0 100 9 11 15

M. malmoense 0 13 25 0 0 0 10 100 90 100 0 50 0 0 71 10 0 100 100 63 100

M. marinum 0 0 100 33 0 90 50 100 50 100 0 0 6 50 100 0 17 100 67 100 83

M. nonchromogenicum 0 11 100 100 0 0 50 100 90 100 0 0 10 50 0 0 0 100 100 100 100

Impiego attuale

☣ Identificazione del M. tuberculosis• Niacina + nitrati

☣ Identificazione dei MOTT• Ampio pannello di test

☣ Supporto ad altri approcci identificativi• Test mirati• Velocità di crescita• Pigmento• Temperature di crescita

Conclusioni

☣ Non esistono kit commerciali☣ I tempi sono estremamente lunghi☣ Non tutti i test sono perfettamente riproducibili☣ L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le

specie più comuni☣ Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o “nuovi” ☣ Alcuni test possono essere utilizzati per dirimere

ambiguità emergenti da altri sistemi di identificazione☣ Permettono di differenziare le specie all’interno del

M. tuberculosis complex