Hemoglobinopatias: contributo da Genética Molecular · 3 Prevalência de portadores de...

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Dia do INSAA Referência: Função essencial do INSA

Hemoglobinopatias:

contributo da Genética Molecular

João GonçalvesUnidade de Genética Molecular – Lisboa

Departamento de Gené[email protected]

UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

Unidade de

Citogenética

Unidade de Genética Médica

Unidade de Genética Molecular

Unidade de Rastreio Neonatal

Unidade de Investigação e

Desenvolvimento

Núcleo de Apoio

Unidade de Bioquímica

Genética

Unidade de Tecnologia e

Inovação


Lab.Lisboa

João Gonçalves

Lab. Porto

Rosário Santos

H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular

2


Departamento de Promoção da Saúde e Doenças Crónicas

> HemoglobinopatiasUnid. Lab. de Referência

Departamento de Genética

� UnidUnid de Gende Genéética Molecular tica Molecular LisbLisb..� …� Hemoglobinopatias

(Genética Molecular)� …

> Médico Solicita Análise <Hospital – Serviço Hematologia

Serviço Genética

Centro DPNLab. Análises Clínicas

Cons. Privado

? Identif. Molecular HB variante? Identif. Molecular Talassémia

> Portador <> Doente <

> Casal em Risco, DPN <>>> Avaliação Hematol. e Bioq.<<<

Cooperaç

ão/

partilh

a de r

esulta

dos e

de co

nhecim

ento

s

Cooperação/

partilha de resultados e

de conhecimentos

Cooperação/partilha de resultados e

de conhecimentos

Cooperação/

partilha de resultados e

de conhecimentos

Cooperaç

ão/

partil

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esulta

dos e

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s

Departamento de Genética

Unidade de Investigação e Desenvolv.

> Grupo de Investigação em hemoglobinopatias e metab.

Ferro

Contributo da Genética Molecular integra-se no

Programa Nacional de Controlo das hemoglobinopatias


Prevalência de portadores de beta-talassémia na pop. Portuguesa

Prevalência de portadores de hemoglobina S na pop. Portuguesa

Martins MC et al (1993) Hereditary anaemias inPortugal: epidemiology, public health

significance, and control. J Med Genet 30:235-239.

(15208 indivíduos ♂: ββββtal:0,45%; HbS: 0,32%)

Base Científica

para o Programa Nacional de Controlo

das Hemoglobinopatias, 1986 (PNCH)⇒ Cooperação com a OMS⇒ Coordenação do INSA

DGS: Circ Norm Nº 18/DSMIA de 07/09/2004

Objectivos:- Prevenção

> Diagnóstico > Idef. Casais em risco> Aconselhamento Genético

> DPN molecular

- Tratamento

- Investigação



3

Prevalência de portadores de hemoglobinopatia β em Portugal

HbS

β-Talassémia

Inez et al, Arq INSA 1993, 19:27

“Bolsas” de alta prevalência:

5-10%

População (2006): 10,9 x 106

Nascimentos (2007): 102 x 103

Prevalência (global)

de portadores: 1-2%

Incidência:

5-10 casos/ano

SS,

Sβ-Tal,

β-Talβ-Tal



183388956Total

30(16.4%)

9147Talassémia

15(8.2%)

177Tal-Drepanocitose

138 (75,4%)

286842Drepanocitose

TotalAfectadoPortadorNormalDoença

DPN de Hemoglobinopatias de 1990 a Set2009



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εεεε Gγγγγ Aγγγγ ϕϕϕϕβ β3’

δ5’

Agrupamento génico da β β β β globina (11p15.5)

Gene: HBB5’ 1

pb 93 222 126

3’2 3130 850

Cd 1 30 31 104 105 146

CD 6: GAG>GTG

(c.20A>T)

p.Glu6Val ⇒⇒⇒⇒ Hb S



Diagnóstico molecular de Drepanocitose - Metodologias

2. BI-PASA (PCR bidireccional específica de alelo)

M

N

Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)

AA AA SS AS AA

800 pb

N

C

500 pb300 pb

C

M

1. PCR e Restrição Enzimática(Bsu 36 I)

controlos

AS SS AS SS AS AA


390 pbDig. Bsu 36 I:

Mutação : 390 pbAlelo Normal: 213 e 177 pb

M

N

f m f

Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)- Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio



5

Sequenciação automática

de fragmentos de DNA obtidos por PCR

(c.20A>T)

p.Glu6Val ⇒⇒⇒⇒ Hb S

GAG>GTG



DPN de Drepanocitose

pai mãe feto feto C. Neg MPM

Pesquisa de contaminação materna no DNA fetal: VNTR (DXS52)

Portador de Hb S Portadora de Hb SMutação: c. [20A>NT] + [=]

(p.Glu6Val)


c.[20A>T] + [20A>T]


Feto não possui alelo c materno

abc

Mutação: c. [20A>NT] + [=]

(p.Glu6Val)



6

Natural de S. Tomé e PríncipeC/ Anemia (Hb A2:3,6%; Hb S: 35%)Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatiaSangue materno (enviado para Lab Hematologia (PNCH))

Não foi possível fazer o estudo do marido desconhecendo-se se tem anemia.

Pai inacessível.

LA; Gestação de 16 semanas

?

?


DPN de Drepanocitose



Feto: Heterozigótico composto para as mutações

HBB:c.19G>A (HbC); p.Glu6Lys e HBB:c.20A>T (HbS); p.Glu6Val

HbC

HbS

Natural de S. Tomé e Príncipe(Hemog: 11,3 g/dL; VGM: 86,0 fL; HGM: 28,9 pg)Hb F: 2,0%; Hb C:38,0%)Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia

Não foi possível fazer o estudo do marido desconhecendo-se se tem anemia.

Inacessível

LA; Gestação de 16 semanas: Afectado – Hb SC

?



7

Confirmação hematológica e bioquímicaPortador de Hb S

Confirmação hematológica e bioquímicaPortadora de Hb S

Despiste de contaminação materna do DNA fetal

(VNTR)

f P M f CN MP

DPN Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais. - DNA fetal em duplicado.- Dois métodos de análise molecular (independentes).- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio



?

p1

p2

m


feto

Pai

mãe

Feto: 6/9 alelos não se encontram no (pai)

STR

D3S13

58AMG

X

AMG

Y

D5S81

8

vWA12

p12

D21S11

D13S317

FGA 4

q28

D7S82

0

D18S51

D8S11

79


8

Confirmação hematológica e bioquímicaPortador de Hb S

Confirmação hematológica e bioquímicaPortadora de Hb S

Despiste de contaminação materna do DNA fetal

(VNTR)

f P M f CN MP

DPN

Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais. - DNA fetal em duplicado.- Dois métodos de análise molecular (independentes).- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)



?

p1

p2

m


??

Sequenciação completa

do gene HBB

Portador de Hb S Portadora de Hb S


?

9

Diagnóstico e prevenção de hemoglobinopatia

Portador População Caso-índice

História familiarRastreio

(doentes e portadores)

STOPRastrear parceiro

Portador?

NS

STOP N AconselhamentoS

DPN? STOPNSAmniocentese ou

biópsia do córion

Afectado?STOP N SIVG?

S

STOP

N

IVG

DPN-LAB

LAB

LAB

LABLAB

Doente?

Portador?


Lab./Unidade Genética Molecular - Qualidade/ReferênciaDPN de Hemoglobinopatia

- Recepção de produtos Biológico (colheitas)

> Registos

- Extracção de DNA (diferentes métodos)

> Dif. produtos biológ. (SP; LA; Vil.)

- Diferentes métodos de análise

> PCR - Dig. enzimática

> BI-PASA

> ARMS

> Sequenciação

- Leitura e Interpretação dos resultados por TDT e TSS

- Registo de resultados

- Validação final/global dos resultados

- Elaboração de relatórios directivas internacionais

- Participa em ensaios de avaliação externa da qualidade

Validação

interna dos

resultados


Lab.

Referência

?

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- Experiência e o conhecimento acumulado ao longo dos anos necessário à função referência

- Frequência regular de cursos/acções de formação específicas patologia no âmbito da AEQ

- AcreditaAcreditaçção do Laboratão do Laboratóório/ensaios especrio/ensaios especííficos de determinado teste genficos de determinado teste genéética moleculartica molecular

- Utilização de métodos/ensaios validados; Validação interna de resultados

- Participação em reuniões internacionais de AEQ onde se estabelecem as directivas/recomendações UE

- Participação em exercícios de avaliação externa da qualidade (UK NEQAS; 2002)

- Formação no âmbito das actividades de prestação de serviços a profissionais de saúde e ensino Sec. Sup.

- Colaboração próxima com laboratório de nível 2 que permite resolver casos complexos

- Actuação como consultor/licenciamento Lab. para a validação de testes genéticos > Lab nível 2

- Colabora em investigação no âmbito do diagnóstico molecular em causa > Lab nível 2

- Organiza cursos/congressos AEQ/acções de formação de boas práticas laboratoriais a nível nacional >Ln2

H em oglobinopatiasH em oglobinopatiasH em oglobinopatiasH em oglobinopatias :Contributo da G en:Contributo da G en:Contributo da G en:Contributo da G en éééética M oleculartica M oleculartica M oleculartica M olecular - Função Referência

AcreditaAcreditaçção do Laboratão do Laboratóório/ensaios especrio/ensaios especííficos de determinado teste genficos de determinado teste genéética moleculartica molecular

> Estabiliza> Estabilizaçção das equipas; solucionar necessidades de pessoalão das equipas; solucionar necessidades de pessoal

> Reorganiza> Reorganizaçção de espaão de espaçços/obras (cumprir directivas internacionais)os/obras (cumprir directivas internacionais)

> Repara> Reparaçção de equipamento/substituião de equipamento/substituiçção equipamento obsoletoão equipamento obsoleto

> Actualiza> Actualizaçção dos procedimentos; Impressos e Instruão dos procedimentos; Impressos e Instruçções trabalho ões trabalho

> Operacionalidade do Programa Inform> Operacionalidade do Programa Informáático tico

> Aquisi> Aquisiçções de consumões de consumííveisveis

Prioridade

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AGRADECIMENTOS

> Susana Gomes

> Todos os elementos do Departamento de Genética

> Todos os elementos do Dep. Prom. Saúde e Doenças Crónicas

> Médicos

> Utentes

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