hematology analyzers final full - Ελληνική Εταιρία Κλινικής ... hematology...

Τεχνολογία Αιµατολογικών Αναλυτών και

Ανιχνευτών Πηκτικότητας Αίµατος

∆ρ. Βασίλης Σπυρόπουλος

Καθηγητής Τµήµατος Τεχνολογίας Ιατρικών Οργάνων

Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυµα Αθήνας

Email: [email protected] URL: www.bmtl.bme.teiath.gr

Τµήµα Τεχνολογίας Ιατρικών ΟργάνωνΕργαστήριο Βιοϊατρικής Τεχνολογίας

2

Τα κλάσµατα του αίµατος


3

Η διαστρωµάτωση της ενδιάµεσης στιβάδας


4

H σύνθεση του κλάσµατος των έµµορφωνσυστατικών τού αίµατος σε φυσιολογικά άτοµα

Τύπος κυττάρων Αριθµός ανά mm3 Μέσος όγκος σε µm3 Ποσοστό Λευκών

Ερυθροκύτταρα

4.8 - 5.5 x 106 90 -

Λευκοκύτταρα

5000-10000 100

α. Ουδετερόφιλα

2000-7500 450 40-75

β. Λεµφοκύτταρα

1500-4000 250 20-45

γ. Ηωζινόφιλα

40-400 450 1-6

δ. Βασεόφιλα

10-100 450 0-1

ε. Μονοκύτταρα

200-800 600 2-10

Θροµβοκύτταρα

1.5 - 4.0 x 105 8 -


5

Εγχάρακτοι θάλαµοι µέτρησης Αιµοσφαιρίων

σε αντικειµενοφόρους πλάκες

α) Neubauerβ) Buerkerγ) Tuerkδ) Schilling.


6

Τετραγωνίδια θαλάµων µέτρησης

Καταµετρούνται τα εντός του εµβαδού των τετραγωνιδίων και τα

εφαπτόµενα µε δύο τουλάχιστον εξωτερικές πλευρές τους κύτταρα.


7

Wallace H. Coulter (1913 – 1998)

� Κατά το πρώτο µισό του 20ου Αιώνα έλαβανχώρα σηµαντικές πρόοδοι στην Αιµατολογία.

� Ο Άγγλο - Αυστριακός Maxwell Myer Wintrobe (1901 – 1986)το 1929 περιέγραψετη µέθοδο προσδιορισµού του αιµατοκρίτη µετη φυγοκέντρηση του αίµατος σε γυάλινο

σωλήνα και εισήγαγε τους ερυθροκυτταρικούςδείκτες (MCV, MCH και MCHC).

� Ο Αµερικανός Wallace H.Coulter επινόησεκαι ανέπτυξε τη διάταξη για τηναυτοµατοποιηµένη µέτρηση των παραµέτρων

όλων των κυττάρων του αίµατος, δίνοντας µιαπολύ σηµαντική ώθηση στην εργαστηριακή

Αιµατολογία.


8


9

Το δίπλωµα Ευρεσιτεχνίας και το πρωτότυπο

του Αναλυτή Coulter


10

Αρχή λειτουργίας του απαριθµητή Coulter(Mέθοδος Αγωγιµότητας - Αρχή Coulter)

� Η µέθοδος βασίζεται στην µεταβολή της αγωγιµότητας ενός αγώγιµουδιαλύµατος, κατά την διέλευση ενός κυττάρου, διαµέσου ενός στοµίου[Coulter, 1956].

� Αραιωµένο αίµα διέρχεται µέσω ενός στοµίου διαµέτρου D:D/50 < d < D/2

όπου d η µέγιστη διάµετρος του υπό ανίχνευση κυττάρου. � Το στόµιο ευρίσκεται ανάµεσα σε δύο ηλεκτρόδια, διαµέσου των

οποίων ρέει ένα σταθερό ρεύµα. � Καθώς ένα κύτταρο διέρχεται µέσω του στοµίου, λόγω της

χαµηλότερης αγωγιµότητάς του, δηµιουργείται µία στιγµιαία αύξησητης αντίστασης, της στήλης του αγώγιµου υγρού, ανάµεσα σταηλεκτρόδια και παράγεται ένας παλµός (πτώση τάσης), ανάλογος τουόγκου του κυττάρου [Adams, 1967].

� H παλµοσειρά η οποία προκύπτει ενισχύεται, ταξινοµείται καιαποτελεί το µέτρο του αριθµού των διερχοµένων κυττάρων (ανάµονάδα όγκου).


11

Τεχνικές λεπτοµέρειες (Ι)

� Το εναιώρηµα των κυττάρωναναρροφάται µέσω του στοµίου, ελεγχόµενο µέσω υδραργυρικούµανοµέτρου.

� Η επαναληψιµότητα του αναρ-ροφούµενου όγκου, εξασφαλίζεταιµέσω δύο ηλεκτροδίων επαφής µετον υδράργυρο, τα οποία καιδίδουν το σήµα έναρξης και λήξηςτης δειγµατοληψίας, καθορίζονταςτον όγκο του δείγµατος.

� Η διάκριση του µεγέθους τωνµετρουµένων κυττάρων επιτυγ-χάνεται µέσω τάσης κατωφλίου ήπαραθύρου, για το ύψος τωνπαλµών (π.χ. µέσω συγκριτώντάσης).


12

Τεχνικές λεπτοµέρειες (ΙΙ)

� Αν ο απαριθµητής Coulter εφoδιασθεί µε ένα µετατροπέα Α/D και καταχωρητές, είναι δυνατή η ταξινόµηση των υψών των παλµών και κατ' αναλογία, η κατά µεγέθηκατανοµή των υπό ανίχνευση κυττάρων [Mc Gann, 1982].

� Συνεπώς, οι σύγχρονοι απαριθµητές Coulter, είναι σε θέση να προσδιορίζουν και τιςδιαφορικές κατανοµές των Λευκοκυττάρων, των Ερυθροκυττάρων και τωνΘροµβοκυτάρων και να τις παρουσιάζουν (σε οθόνη ή/και σε εκτυπωτή) υπό τηνµορφή καµπυλών ή ιστογραµµάτων.

� Ο συντελεστής βαθµονόµησης του Απαριθµητού Coulter, είναι σταθερός γιαδεδοµένα:� Την διάµετρο του στοµίου (συνήθως 100 µm).� Το µήκος του (συνήθως 200 µm,).

µε αντίστοιχη αντίσταση της σχηµατιζόµενης στήλης ηλεκτρολύτη 25 kΩ καιχωρητικότητα 120 pF).

� Επίσης επηρεάζεται σηµαντικά από:� Την σύνθεση του ισότονου ηλεκτρολυτικού διαλύµατος (φυσιολογικός ορός

ρυθµιζόµενος µε φωσφορικά άλατα).� Το κέρδος του συστήµατος προενισχυτή / ενισχυτή, το οποίο θα πρέπει να έχειαπόκριση συχνοτήτων µεγαλύτερη από 70 kHz (χρόνος ανόδου παλµού τηςτάξης των 5 µs) και χαµηλό θόρυβο.


Το σύστηµα αναρρόφησης και

υδροδυναµικής εστίασης


14

Τεχνικές λεπτοµέρειες (ΙΙΙ)

� Ταυτόχρονα, απορρίπτεται και ο ηλεκτρονικός θόρυβος, ο οποίοςτυχόν εισάγεται στο σύστηµα.

� Οι απαριθµητές κατά Coulterσυνήθως διαθέτουν και µία οθόνη στηνοποία εµφανίζονται οι παλµοσειρές και γίνεται δυνατός ο έλεγχος τηςαξιοπιστίας του συστήµατος, άµεσα ή έµµεσα, µέσωµικροεπεξεργαστή.

� Χρησιµοποιούνται τρεις διαφορετικές αραιώσεις και δοχεία καθώς καιΛυσοζύµη, για τη λύση των µεµβρανών των Ερυθροκυττάρων.

� Οι σύγχρονοι αυτόµατοι αιµατολογικοί αναλυτέs κατά Coulter, εκτόςαπό τις παραµέτρους οι οποίες προσδιορίζονται άµεσα µέσωµέτρησης, δηλαδή αριθµός Λευκο -, Ερυθρο - και Θροµβοκυττάρωνκαι της συγκέντρωσης Αιµοσφαιρίνης (φωτοµετρικά), προσδιορίζουνέµµεσα µέσω υπολογισµών, µέχρι συνολικά 14 - 24 παραµέτρους, οιοποίες αφορούν µορφολογικά χαρακτηριστικά, τον αιµατοκρίτη κλπ.

� Όλες οι µετρήσεις γίνονται εις τριπλούν, για τον περιορισµό τυχαίων(στατιστικών) σφαλµάτων.


15

∆ευτερογενείς υπολογισµοί άλλων

διαγνωστικά σηµαντικών παραµέτρων


16

Βασικά σφάλµατα τα οποία εµφανίζονται

στους Απαριθµητές Coulter

� Απόφραξη της οπής του στοµίου.� Αβεβαιότητα του κατωφλίου του διαχωριστή (discriminator), µε

συνέπεια µη µέτρηση ισοµεγεθών κυττάρων.� Σφάλµα σύµπτωσης (coincidence), λόγω ταυτόχρονης εισόδου

περισσοτέρων κυττάρων στην οπή.� Σφάλµα καθίζησης των κυττάρων στο αραιωµένο δείγµα.� Στατιστικό σφάλµα (επαναληψιµότητα).� Σφάλµα διακύµανσης της θερµοκρασίας.� Βιολογικές παραµορφώσεις κυττάρων λόγω επίδρασης του

διαλύµατος.� Σφάλµα προσδιορισµού όγκου µέτρησης.� Σφάλµα αραίωσης.� Σφάλµα εξωτερικών ηλεκτροµαγνητικών επιδράσεων.


17

Παραλλαγές των απαριθµητών Coulter

� Στην αγορά εµφανίσθηκαν κατά καιρούς πολλές παραλλαγές συσκευώναπαρίθµησης αιµοσφαιρίων, οι οποίες βασίζονται στην µεταβολήαγωγιµότητας, αλλά διαφοροποιούνται:� στο σύστηµα αναρρόφησης, στην σχετική θέση ηλεκτροδίων - στοµίου

αναρρόφησης, � στην µέθοδο προσδιορισµού του µετρουµένου σταθερού όγκου

αραιωµένου δείγµατος, � στο αν εισάγεται προς µέτρηση αραιωµένο δείγµα ή πλήρες αίµα, µε

εσωτερική διαδικασία αραίωσης κλπ.� Επίσης, έχει χρησιµοποιηθεί ως παραλλαγµένη αρχή µέτρησης:

� Η ανίχνευση της διαφοράς της διηλεκτρικής σταθεράς, ανάµεσα στοηλεκτρολυτικό διάλυµα και τα κύτταρα.

� Η ανίχνευση της µεταβολής της χωρητικότητας, ανάµεσα σταηλεκτρόδια - οπλισµούς ενός πυκνωτή.

� Η µεταβολή της χωρητικότητας, ανιχνεύεται µέσω της µεταβολής τηςσυχνότητας ενός συντονιζόµενου κυκλώµατος [Helleman & Benjamin, 1969].


18

Η εξέλιξη των Απαριθµητών Coulter


19

Φασµατοµετρία Αιµοκυττάρων µε βάση

την αρχή Coulter


20

Ιστόγραµµα συχνότητας όγκου κυττάρων


21

Ιστόγραµµα συχνότητας όγκου Αιµοπεταλίων

και Ερυθροκυττάρων σκύλου (normal)

MCV


22

Ιστόγραµµα συχνότητας όγκου Αιµοπεταλίων

και Ερυθροκυττάρων γάτας (normal)


Αιµατολογικοί αναλυτές σκεδαζόµενου

ασύγχρονου ή συγχρόνου (LASER) φωτός


24

Οπτική µέθοδος απαρίθµησης κυττάρων

� Η µέθοδος βασίζεται στην συλλογή και µέτρηση, του σκεδαζόµενουπάνω στα κύτταρα φωτός, ασύγχρονου ή συγχρόνου (LASER) φωτός.

� Ένα αραιωµένο δείγµα αίµατος (1:500 για τα λευκά και 1:50000 γιατα ερυθρά αιµοσφαίρια) αναρροφάται, µε µεγάλη ταχύτητα, µέσωστενής κυλινδρικής κυψελίδας µέτρησης.

� Ένα οπτικό σύστηµα, παρέχει µία φωτεινή ζώνη εντός σκοτεινούπεδίου και το σκεδαζόµενο κατά την πρόσθια διεύθυνση φως, συλλέγεται στη κάθοδο ενός φωτοπολλαπλασιαστή.

� Οι παραγόµενοι ηλεκτρικοί παλµοί, αντιστοιχούν στα ανιχνευόµενακύτταρα.

� Τα σήµατα ενισχύονται µέσω ενισχυτή υψηλής σύνθετης αντίστασηςεισόδου και διαχωρίζονται µέσω διαχωριστή µεταβλητού παραθύρου.

� Οι παρεχόµενοι παλµοί σταθερού πλάτους, οδηγούν ψηφιακά displays. � Η µέτρηση διαρκεί 30 s, απαιτείται δείγµα 1 ml και η ακρίβεια είναι

της τάξης του 2 %.


25

Αιµατολογικός αναλυτής σκεδαζόµενου

σύµφωνου φωτός (LASER)


Οπτική κα υδροδυναµική εστίαση


Basophile Analysis System and MethodUS 20120282600 A1 (Νov 8, 2012)


28

Υβριδικός Αναλυτής (Coulter - LASER)


29

Ο έλεγχος ποιότητας Αιµατολογικών Αναλυτών

� Εξετάσθηκαν τρεις Αιµατολογικοί Αναλυτές:

� 2 βασισµένοι στην αρχή LASER scattering(Abbott CellDyne Sapphire and Bayer Advia 2120).

� 1 βασισµένος στην αρχή Coulter(Coulter LH 750).

� Ο έλεγχος των επιδόσεων τους για ως 29 παραµέτρουςέγινε µε τη χρήση:

� 3 διαφορετικών controls

� 6 διαφορετικών δειγµάτων αίµατος.


30

� Hematology AnalyzersABBOTT Cell-Dyn SapphireSIEMENS Advia 2120

� Control materialsCell-Dyn 29 Plus ControlAdvia TESTpoint™ (3 in 1)

Οι Αιµατολογικοί Αναλυτές


31

Οι µετρήσεις που πραγµατοποιούνται

Testing procedures Indicative Parameters

Daily monitoring of the CV of controls’ reference values

NEU, MONO, MPV, RBC etc.

Background monitoring and electronic noise (RBC count)

Blanks (residual cells/fragments) Blank Hemoglobin

Reproducibility/Precision LYM, MCH etc.

Accuracy CD-A vs. (CD+A)/2

Carry - over RBC, WBC, HGB, PLT, MCV

Stability (XB-moving average) MCV, MCH, MCHC etc.


32

Καθηµερνός έλεγχος του CV των τιµών προτύπωνεναιωρηµάτων (NEU, MONO, MPV RBC)

NEU

0

0,5

1

1,5

2

2,5

12-N

ov-2

008

13-N

ov-2

008

17-N

ov-2

008

19-N

ov-2

008

21-N

ov-2

008

25-N

ov-2

008

27-N

ov-2

008

1-D

ec-2

008

3-D

ec-2

008

5-D

ec-2

008

9-D

ec-2

008

10-D

ec-2

008

10-D

ec-2

008

15-D

ec-2

008

16-D

ec-2

008

17-D

ec-2

008

18-D

ec-2

008

23-D

ec-2

008

DATE

NE

U (

10e3

/µl) neu

target

lower

upper

MONO

0

0,5

1

1,5

2

2,5

5-Ma

r-200

910

-Mar

-200

916

-Mar

-200

917

-Mar

-200

918

-Mar

-200

919

-Mar

-200

919

-Mar

-200

920

-Mar

-200

920

-Mar

-200

920

-Mar

-200

923

-Mar

-200

926

-Mar

-200

930

-Mar

-200

931

-Mar

-200

97-

Apr-2

009

DATE

MO

NO

(10

e3/µ

l)

mono

target

lower

upper

MPV

0123456789

10

12-N

ov-2

008

14-N

ov-2

008

18-N

ov-2

008

20-N

ov-2

008

24-N

ov-2

008

25-N

ov-2

008

27-N

ov-2

008

1-De

c-20

081-

Dec-

2008

3-De

c-20

085-

Dec-

2008

5-De

c-20

089-

Dec-

2008

10-D

ec-2

008

15-D

ec-2

008

17-D

ec-2

008

19-D

ec-2

008

DATE

MP

V (f

L) mpv

targetlowerupper

Levey-Jennings graphs of the reference values for Cell-Dyn Sapphire (NEU Low & MONO High)

Levey-Jennings graphs of the reference values for Advia 2120 (MPV Abnormal & RBC Normal)

RBC

3,73,83,9

44,14,24,34,44,54,6

6-Fe

b-20

09

18-F

eb-2

009

5-M

ar-2

009

5-M

ar-2

009

9-M

ar-2

009

10-M

ar-2

009

10-M

ar-2

009

17-M

ar-2

009

17-M

ar-2

009

19-M

ar-2

009

20-M

ar-2

009

23-M

ar-2

009

27-M

ar-2

009

1-Ap

r-200

96-

Apr-2

009

7-Ap

r-200

9

13-A

pr-2

009

28-A

pr-2

009

29-A

pr-2

009

4-M

ay-2

009

7-M

ay-2

009

12-M

ay-2

009

13-M

ay-2

009

13-M

ay-2

009

DATE

RB

C (1

0e6/µ

l)

rbc

target

lower

upper


33

Επιτήρηση υποβάθρου υπολειποµένων κυττάρων

θραυσµάτων και ηλεκτρονικού θορύβου (HGB)

HGB

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1-O

ct-2

008

10-O

ct-2

008

22-O

ct-2

008

27-O

ct-2

008

7-N

ov-2

008

18-N

ov-2

008

25-N

ov-2

008

2-D

ec-2

008

9-D

ec-2

008

19-D

ec-2

008

7-Ja

n-2

009

19-J

an-2

009

23-J

an-2

009

2-F

eb-2

009

11-F

eb-

2009

20-F

eb-

2009

3-M

ar-

200

9

10-M

ar-

200

9

20-M

ar-

200

9

1-A

pr-2

009

8-A

pr-2

009

28-A

pr-2

009

6-M

ay-2

009

15-M

ay-2

009

27-M

ay-2

009

5-Ju

n-2

009

18-J

un-2

009

23-J

un-2

009

29-J

un-2

009

DATE

HG

B (

g/d

l)

hgb

limit

Levey - Jennings graph HGB blank Cell-Dyn Sapphire (RBC limit ≤ 0,1 g/dL)


34

Επαναληψιµότητα µετρήσεων (LYM & MCH)

LYM

353637383940414243444546

fnb01 fnb02 fnb03 fnb04 fnb05 fnb06 fnb07 fnb08

ASPIRATIONS

LYM (%) LYM

AVERAGE

LOW

UP

MCH

28,5

29

29,5

30

30,5

31

31,5

32

fnb01 fnb02 fnb03 fnb04 fnb05 fnb06 fnb07 fnb08

ASPIRATIONS

MCH (pg) MCH

AVERAGE

LOW

UP

Bland-Altman graph for Cell-Dyn Sapphire (LYM)

Bland-Altman graph for Advia 2120 (MCH)


35

Επιτήρηση ακριβείας Αναλυτή

WBC

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

5,65 8,175 21,705 6,395 15,08 13,205 41,765 7,305

(CD+A)/2

CD

-A

(CD+A)/2,CD-A

AVERAGE

LOW

UP

Bland-Altman graph for measurements of the same samples in both analyzers (WBS measurements).


36

Η δηµιουργία ενός συστήµατος συνδυασµένης

ανάκτησης εργαστηριακών δεδοµένων

Είναι απαραίτητη η δηµιουργία ενός συστήµατοςσυνδυασµένης ανάκτησης των εργαστηριακώνδεδοµένων από Αυτόµατους ΑιµατολογικούςΑναλυτές, Ψηφιακά Μικροσκόπια κλπ. και ηδηµιουργία µιας Βάσης ∆εδοµένων, η οποία θαεπιτρέπει:�Την αποθήκευση των δεδοµένων των ασθενών.�Την άµεση και γρήγορη αναζήτησή τους.�Την δυνατότητα επικοινωνίας µε άλλες βάσειςδεδοµένων του Νοσοκοµείου.

� Την δυνατότητα στατιστικής επεξεργασίας τους.


37

«Χειροκίνητη» τεκµηρίωση & ανάκτησηεργαστηριακών δεδοµένων


38

Ο Αναλυτές HeCo (Α) και Cell-Dyn 1800 (∆)


39

Η εικόνα της Γενικής Αίµατος από τουςΑναλυτές HeCo (Α) και Cell-Dyn 1800 (∆)


40

Η θέση εργασίας του Ψηφιακού

Μικροσκοπίου Nikon Eclipse 50i µε Η/Υ


41

Σύνδεση Περιφερειακού Εξοπλισµού του

Ψηφιακού Μικροσκοπίου µε Η/Υ


42

Λειτουργίες του συστήµατος

� Το σύστηµα χρησιµοποιείται για την αρχειοθέτηση τωνασθενών του Αιµατολογικού ιατρείου µε βάση:� Τα στοιχεία των ασθενών και τον αριθµό µητρώου τους.� Την ηµεροµηνία εξέτασης, την Κλινική και την Νόσο.

� Αποθηκεύονται στο σύστηµα:�Η Γενική Αίµατος από τον Αιµατολογικό Αναλυτή (Cell

Dynή HeCo).� Τρεις εικόνες από το µικροσκόπιο Nikon 50i, µία από τοεπίχρισµα αίµατος και δύο από το επίχρισµα µυελού.

� Τέλος καταχωρούνται γενικές παρατηρήσεις πουαφορούν στη ∆ιάγνωση του ασθενούς, τις Εξετάσεις του, την Αγωγή του κλπ.


43

Τυπικό menu του συστήµατος


44

Κατάλογος ασθενών


45

Συνδυασµένη ανάκτησης εργαστηριακών

δεδοµένων


46

Μέτρηση της πηκτικότητας του Αίµατος


Coagulation factors and related substances

Number and/or name Function Associated genetic disorders

I (fibrinogen) Forms clot (fibrin)Congenital afibrinogenemia, Familial renal amyloidosis

II (prothrombin)Its active form (IIa) activates I, V, VII, VIII, XI, XIII, protein C, platelets

Prothrombin G20210A, Thrombophilia

III Tissue factor Co-factor of VIIa (formerly known as factor III)

IV CalciumRequired for coagulation factors to bind to phospholipids (formerly known as factor IV)

V (proaccelerin, labile factor) Co-factor of X with which it forms the prothrombinase complex Activated protein C resistance

VI Unassigned– old name of Factor Va

VII (stable factor, proconvertin)

Activates IX, X congenital proconvertin/factor VII deficiency

VIII (Antihemophilic factor A) Co-factor of IX with which it forms the tenase complex Haemophilia A

IX (Antihemophilic factor B or Christmas factor)

Activates X: forms tenase complex with factor VIII Haemophilia B

X (Stuart-Prower factor) Activates II: forms prothrombinase complex with factor V Congenital Factor X deficiency

XI (plasma thromboplastinantecedent)

Activates IX Haemophilia C

XII (Hageman factor) Activates factor XI, VII and prekallikrein Hereditary angioedema type III

XIII (fibrin-stabilizing factor) Crosslink fibrin Congenital Factor XIIIa/b deficiency

von Willebrand factor Binds to VIII, mediates platelet adhesion von Willebrand disease

prekallikrein (Fletcher factor) Activates XII and prekallikrein; cleaves HMWK Prekallikrein/Fletcher Factor deficiency

high-molecular-weight kininogen (HMWK) (Fitzgerald factor)

Supports reciprocal activation of XII, XI, and prekallikrein Kininogen deficiency


Ο Μηχανισµός της Πήξης του Αίµατος

� Ο µηχανισµός της πήξης του αίµατος, είναι εξαιρετικάπερίπλοκος και βασίζεται σε πολλούς ενεργοποιητικούς

και ανασταλτικούς παράγοντες, οι οποίοι συνεργούν γιατον πολυµερισµό µονοµερών µορίων Ινικής.

� Αυτά απελευθερώνονται από τα µόρια Ινωδογόνου, µέσωτης πρωτεολυτικής δράσης της Θροµβίνης.

� Οι 13 κύριοι παράγοντες πήξης, χαρακτηριζόµενοισυνήθως µε λατινικούς αριθµούς, είναι οι ακόλουθοι:


ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΗΞΗΣ

Παράγων Ι :Ινωδογόνο

Παράγων ΙΙ : Προθροµβίνη

Παράγων ΙΙΙ : Θροµβοπλαστίνη

Παράγων ΙV : Ιόντα Ασβεστίου (Ca ++ )

Παράγων V : Προαξελερίνη (Ac - globulin)

Παράγων VI : Ενεργοποιηµένος Παράγων V

Παράγων VII : Προκονβερτίνη, SPCA, Σταθερός Παράγων

Παράγων VIII : Αντιαιµοφιλική Σφαιρίνη, Θροµβοπλαστινογόνο

Παράγων ΙΧ : Παράγων Christmas

Παράγων Χ : Παράγων Stuart Prower

Παράγων ΧΙ : ΡΤΑ

Παράγων ΧΙΙ : Παράγων Hageman

Παράγων ΧΙΙΙ : Σταθεροποιητικός Παράγων του Ινώδους (FSF).


Ο βασικές παράµετροι εργαστηριακού

προσδιορισµού της πηκτικότητας του Αίµατος

� Για σχεδόν κάθε ένα από αυτούς τους παράγοντες, υπάρχουν προ-παράγοντες και αναστολείς, µερικοί παράγοντες των αιµοπεταλίων κλπ.

� Για την εξέταση πιθανών διαταραχών του µηχανισµού πήξης του αίµατος, χρησιµοποιούνται µια σειρά εργαστηριακών δοκιµασιών, όπως:� Η µέτρηση του αριθµού των αιµοπεταλίων.� Η µέτρηση του χρόνου ροής, δηλαδή του χρόνου επίσχεσης µικρο-

αιµορραγίας, προκαλούµενης στον πήχη, µέσω µικρής τοµής.� Η µέτρηση του µερικού χρόνου θροµβοπλαστίνης (ΡΤΤ).� Η µέτρηση του χρόνου προθροµβίνης (ΡΤ).� Η µέτρηση του χρόνου θροµβίνης (ΤΤ) κλπ.

� Προφανώς, οι µέθοδοι αυτές, είναι εργασιοβόρες και περιέχουν στοιχείαυποκειµενισµού.

� Για τον λόγο αυτόν, έχουν αναπτυχθεί ορισµένες αυτοµατοποιηµένες ήηµιαυτοµατοποιηµένες µέθοδοι, τις οποίες θα παρουσιάσουµε στηνσυνέχεια.


Η µέτρηση του χρόνου που απαιτείται για την

πήξη µείγµατος πλάσµατος

� Πυρήνας της µεθόδου είναι η µέτρηση του χρόνου, ο οποίοςαπαιτείται για την πήξη µείγµατος πλάσµατος, ληφθέντος µε κιτρικόΝάτριο, κατάλληλου αντιδραστηρίου (εναιώρηµα φωσφολιπιδίων, ιστική θροµβοπλαστίνη, θροµβίνη κλπ.) και διαλύµατος CaCl2 .

� Υπάρχουν απλές µέθοδοι µέτρησης του χρόνου αυτού, ο οποίος είναιαπό 12 - 14 sec (TT, PT) µέχρι 30 - 45 sec (PTT), όπως: � Η συνεχής (µε το χέρι) ελαφρά απόκλιση του δοκιµαστικού σωλήνα,

στον οποίο γίνεται η αντίδραση, από την θέση ισορροπίας, και οέλεγχος αλλαγής της στάθµης του µείγµατος.

� Όταν η στάθµη πλέον δεν µετακινείται, έχει επέλθει η πήξη και οαπαιτούµενος χρόνος µετράται µε κοινό χρονόµετρο χειρός.

� Ο συνεχής έλεγχος του µείγµατος, µε ένα άγκιστρο Λευκοχρύσου, µέχρι την δηµιουργία των πρώτων νηµάτων ινικής.


Συνήθεις µέθοδοι ανίχνευσης

52


Μέθοδος απόκλισης από το σηµείο

ισορροπίας

a) Καµµία αλλαγή της στάθµης του µείγµατος και συνεπώς έχει επέλθειπλήρως η πήξη, b) Η αντίδραση δεν έχει ολοκληρωθεί ακόµη


Αυτοµατοποιηµένες Μέθοδοι Προσδιορισµού

Παραµέτρων Πήξης

� H ακριβέστερη µέθοδος προσδιορισµού του απαιτούµενου για τηνδηµιουργία πήγµατος χρόνου (PTT, PT, TT κλπ.) είναι η ακόλουθη:� Το υπό εξέταση πλάσµα, τοποθετείται σε µία διαφανή κυψελίδα, η

οποία παρεµβάλλεται ανάµεσα σε µία φωτεινή πηγή, συνήθως µίαφωτοδίοδο υπερύθρων, και ένα φωτοανιχνευτή, συνήθως µίαφωτοκρυσταλλοτριοδο.

� Μέσα στην κυψελίδα, τοποθετείται και ένα τεµάχιο ατσαλονήµατος(µήκους 5 mm και διαµέτρου 1 mm), το οποίο υπό την επίδραση τουµαγνητικού πεδίου ενός περιστρεφόµενου ηλεκτροµαγνήτη, περιστρέφεται και παίζει τον ρόλο αναδευτήρα.

� Το εκπεµπόµενο από την φωτοδίοδο φως, διέρχεται από τηνκυψελίδα και φθάνει στον ανιχνευτή (phototransistor).

� Μόλις προστεθεί το αντιδραστήριο, αρχίζει η αντίδραση πήξης καιταυτόχρονα αλλάζει η οπτική πυκνότητα του περιεχοµένου τηςκυψελλίδας.


Η µεταβολή της οπτικής πυκνότητας λόγω

πήξης καθορίζει τον χρόνο πήξης

� Η αλλαγή της οπτικής πυκνότητας του µείγµατος, προκαλείµεταβολή του ρεύµατος του phototransistor, δίδοντας µήνυµα σεέναν µικροεπεξεργαστή, ο οποίος ελέγχει το σύστηµα και ο οποίοςθέτει σε λειτουργία ένα ηλεκτρονικό χρονόµετρο.

� Μόλις ολοκληρωθεί η αντίδραση πήξης, ανιχνεύεται από τοphototransistor µία ακόµη αλλαγή στην οπτική πυκνότητα τουδείγµατος, και µε το αντίστοιχο σήµα, σταµατά το χρονόµετρο, προσδιορίζοντας µε ακρίβεια, την υπό ανίχνευση χρονική διάρκεια, της αντίδρασης πήξης.

� Τέλος, ο µικροεπεξεργαστής, µπορεί να σχηµατίσει τους τυχόναπαιτούµενους λόγους ή/και ποσοστά ενεργότητας, µε βάσηκάποιο πλάσµα αναφοράς, τα οποία εκτυπώνονται από έναθερµοεκτυπωτή.


Ανίχνευσης της µεταβολής του ιξώδους του

αντιδρώντος µείγµατος, µέσω αναδευτήρα

� Εναλλακτικά, στη θέση του συστήµατος ανίχνευσης οπτικήςπυκνότητας, είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθεί ένα σύστηµαανίχνευσης της µεταβολής του ιξώδους του αντιδρώντος µείγµατος, µέσω ενός αναδευτήρα και της παρατήρησης της µεταβολής τουρεύµατος του κινητήρα του αναδευτήρα, λόγω της µεταβολής τηςαντίστασης του υπό ανάδευση µείγµατος, µε την ολοκλήρωση τηςαντίδρασης πήξης.

� Εφόσον η αιµοληψία και επεξεργασία/προετοιµασία των δειγµάτωνγίνει σωστά και εφόσον το pool πλασµάτων αναφοράς ελέγχεται γιατην επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων τα οποία δίδει, η µέθοδοςείναι εξαιρετικά αξιόπιστη και υψηλής επαναληψιµότητας.

� Τα όρια της καθορίζονται από την ποιότητα των αντιδραστηρίων καιόχι από τις τυχόν ηλεκτρικές αστάθειες του hardware.

� Ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων στο πλάσµα επί µέρουςπαραγόντων πήξης π.χ. της προθροµβίνης, γίνεται φωτοµετρικά, µέσωτης ακόλουθης αντίδρασης:


Μεταβολή της απορρόφησης λόγω παραγωγής

p - Νιτροανιλίνης στα 405 nm (400 - 420 nm)

V, cephalinprothrombin -----------------> thrombin

X a , Ca+ +

thrombinTos-Gly-Pro-Arg-pNA + H2O -------------------> Tos-Gly-Arg-OH +

pNA

Ο ρυθµός µεταβολής της απορρόφησης, λόγω τηςπαραγωγής της p - Νιτροανιλίνης, µετράται στα 405 nm(400 - 420 nm) [Boehringer Mannheim, 1983].


Σχηµατικό διάγραµµα

συσκευής προσδιορισµού

των PTT, PT, TT κλπ. (Coagulometer), µε βάσητην αλλαγή της οπτικής

πυκνότητας του αντι-δρώντος µείγµατος

(Πηγή: SEAC, Italy).


Working principles of viscoelastic point-of-care coagulation devices

� Thrombelastograph (TEG ): rotating cup with blood sample (1), coagulation activator (2), pin and torsion wire (3), electromechanical transducer (4), data processing (5).

� Rotation Thrombelastography (ROTEM): Cuvette with blood (1), activator added by pipetting (2), pin and rotating axis (3), electromechanical signal detection via light source and mirror mounted on axis (4), data processing (5).

� Sonoclot: Blood sample in cuvette (1) containing activator (2), disposable plastic probe (3) oscillating in blood sample mounted on electromechanical transducer head (4), data processing (5)


DC Fully Automated 2 Channel Analyzer


TEG® 5000 Thrombelastograph®Hemostasis System


International Normalised Ratio (INR)

INR = (prothrombintest / prothrombincontrol)ISI

63

ISI is a numerical value representing the responsiveness of any given commercial system relative to the international standard.

It takes into account the variability in results obtained using different commercial systems in calculating the result. In this way, results from different laboratories and countries can be compared more readily.

People who require long-term anticoagulant therapy are usually given Warfarin, an anticoagulant that can be taken in the form of a tablet instead of injection. This is often referred to as oral anti-coagulant therapy.

INR values over 4.5 increase the risk of major haemorrhage (bleeding), and an INR less than 2 increases the risk of thromboembolism (formation of blood clots within the blood vessels) and associated conditions such as heart attack and stroke.


Κατ’ οίκον µετεγχειρητική επιτήρηση του INR

hematology analyzers final full - Ελληνική Εταιρία Κλινικής ... hematology...

Documents

Transcript of hematology analyzers final full - Ελληνική Εταιρία Κλινικής ... hematology...