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GISELE MIYAMURA MARTINS
AVALIAO DO EFEITO DO HORMNIO TIREOIDEANO NA ESTRUTURA
E FISIOLOGIA SSEA DE CAMUNDONGOS COM INATIVAO DO
GENE DO ADRENOCEPTOR 2A
So Paulo 2012
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Morfofuncionais do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias.
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GISELE MIYAMURA MARTINS
AVALIAO DO EFEITO DO HORMNIO TIREOIDEANO NA ESTRUTURA
E FISIOLOGIA SSEA DE CAMUNDONGOS COM INATIVAO DO
GENE DO ADRENOCEPTOR 2A
So Paulo 2012
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Morfofuncionais do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincias Morfofuncionais Orientadora: Prof. Dr. Ceclia Helena de Azevedo Gouveia Verso original
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Dedico este trabalho com todo amor ao meu pai, Ado Jos Carlos Martins, e a minha me, Elza Miyamura Martins por me possibilitarem a realizao de mais um sonho.
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AGRADECIMENTOS
Obrigada ao meu pai, Ado Jos Carlos Martins, que tem sido um grande e maravilhoso pai, dedicando-se inteiramente sua famlia, acreditando e possibilitando a realizao de todos os meus sonhos e por ser a pessoa na qual me espelho para tentar ser cada dia melhor. A minha me, Elza Yoshie Miyamura Martins, obrigada por todo carinho, amor e cuidado sempre a mim dedicados, pela sua grande amizade e companheirismo. Obrigada minha orientadora, Ceclia Helena de Azevedo Gouveia Ferreira, por me receber em seu laboratrio, pela amizade, confiana e ensinamentos a mim dedicados, sem os quais este trabalho no poderia ser realizado. Ao meu namorado, Eduardo Henrique Beber, obrigada por todo amor e carinho, por tanta ajuda e por todos os ensinamentos de Anatomia. Obrigada tambm pela pacincia nos momentos em que precisei. Te amo. Ao meu irmo, Leandro Miyamura Martins, pela coragem e companheirismo dedicados aos nossos pais no perodo em que passei a morar em So Paulo. Aos meu queridos amigos de laboratrio, Bruno Jos Silva de Melo e Manuela Miranda Rodrigues, obrigada pela ajuda que me proporcionaram em algum momento, pela amizade e situaes engraados por ns vividas. Marlia Bianca Teixeira por ter sido extremamente importante para que este trabalho pudesse ser realizado. minha querida amiga Cristiane Cabral Costa, pelos bons conselhos, amizade e ajuda pessoal nos momentos em que precisei. Agradeo especialmente ao Marcos Vinicius da Silva por tanta colaborao e pelo grande amigo com quem sempre pude contar. todos os meus colegas do departamento em especial Aline Rosa Marosti Bobna, Kelly Palombit, Ricardo Bandeira e Tabata Leal Nascimento os quais se tornaram meus grandes amigos. Agradeo aos professores Miriam Ribeiro, Marcelo Muscar e Newton Sabino Canteras por fazerem parte da minha banca de qualificao e pela importante contribuio na execuo deste trabalho. Agradeo s professoras Patricia Brum e Maria Luiza Barreto Chaves pela colaborao e disponibilizao de seu laboratrio para a realizao dos experimentos. Obrigada ao professor Rodrigo Cardoso de Oliveira, pela primeira oportunidade em seu laboratrio e pelos ensinamentos transmitidos na minha iniciao cientfica. Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro para a realizao deste projeto.
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RESUMO
MARTINS, G. M. Avaliao do efeito do hormnio tireoideano na estrutura e fisiologia ssea de camundongos com inativao do Gene do adrenoceptor 2a. 2012. 90 f. Dissertao (Mestrado em Cincias Morfofuncionais) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.
Um dos mais importantes achados dos ltimos anos foi o de que o remodelamento sseo est sujeito ao controle do sistema nervoso central (SNC), com o sistema nervoso simptico (SNS) agindo como efetor perifrico. Uma srie de estudos sugere que o SNS regula negativamente a massa ssea, agindo exclusivamente via receptor 2-adrenrgico (2-AR), que expresso no tecido sseo. Entretanto, um estudo recente do nosso grupo demonstrou que camundongos com dupla inativao dos genes dos receptores adrenrgicos 2A e o 2C (2A/2C-AR
-/-) apresentam um fentipo de alta massa ssea (AMO), apesar de apresentarem hiperatividade simptica crnica e 2-AR intacto. Alm disso, foi demonstrado que esses camundongos knockouts (KO = com inativao gnica) so resistentes osteopenia induzida pelo excesso de hormnio tiroideano (HT). Esses achados sugerem fortemente que: o 2-AR no o nico adrenoceptor envolvido no controle do metabolismo sseo; que o SNS interage com o HT para regular a massa ssea; que o 2A-AR e/ou 2C-AR tambm possam apresentar um papel importante na mediao das aes do SNS no esqueleto e que esses receptores esto envolvidos na interao do HT com o SNS para regular a massa e metabolismo sseos. Neste projeto, tivemos os seguintes objetivos: (i) avaliar se a inativao isolada do 2AAR interfere na estrutura e fisiologia sseas, caracterizando o fentipo sseo de camundongos 2AAR
-/-; e (ii) avaliar se a ao do HT no tecido sseo depende do 2AAR, avaliando o efeito do HT na estrutura e fisiologia sseas dos camundongos 2AAR
-/- tratados com 20 vezes a dose fisiolgica de T3 (7 g/100 g PC/dia). Pudemos observar que o comprimento longitudinal do fmur e tbia dos animais 2A-AR-/- so significativamente menores do que aqueles dos animais selvagens, em todos os perodos estudados. A anlise por microtomografia computadorizada do fmur mostrou que no h diferena entre os animais selvagens e 2AAR
-/- com relao estrutura de osso trabecular, j com relao ao osso cortical, foi observada uma diminuio da porosidade da cortical (67%, p
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ABSTRACT
MARTINS, G. M. Evaluation of the effect of thyroid hormone on bone structure and physiology of mice with inactivation of Gene 2A-adrenoceptor. 2012. 90 p. Masters thesis (Morphofunctional Sciences) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.
One of the most important finds of the recent years is that bone remodeling is subject to the control of the central nervous system (CNS), with the sympathetic nervous system (SNS) acting as the peripheral effector. A number of studies suggest that the SNS negatively regulates bone mass, acting exclusively via 2-adrenergic receptor (2-AR), which is expressed in osteoblasts. However, a recent study of our group showed that mice with double gene inactivation of the adrenergic receptor 2A and 2C (2A/2C-AR
-/-) have a high bone mass phenotype (HBM), even though they present a chronic SNS hyperactivity and intact 2-AR. Furthermore, we have demonstrated that these knockout (KO) mice are resistant to the thyroid hormone-induced osteopenia. These findings strongly suggest that: (i) 2-AR is not the only adrenoceptor involved in the control of bone metabolism; (ii) the CNS interacts with thyroid hormone (TH) to regulate bone mass; iii) 2A and/or 2C adrenoceptors may also have an important role in mediating the actions of the CNS in the skeleton; and that (iv) these receptors are involved in the interaction of TH with the SNS to regulate bone mass and metabolism. In this project, we had the following objectives: (i) to evaluate whether the isolated inactivation of 2AAR interferes with the bone structure and physiology, characterizing the bone phenotype of 2AAR
-/- mice and (ii) to evaluate whether the action of HT on bone tissue depends on 2AAR, assessing the effect of HT on bone structure and physiology of 2AAR
-/- mice treated with 20 times the physiological dose of T3 (7g/100g BW/day). We have observed that the longitudinal length of the femur and tibia of 2AAR
-/- animals are significantly lower than those of wild type animals in all periods. The analysis of the femur by computed microtomography showed no difference between wild animals and 2AAR
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/- regarding to the trabecular bone structure, but it was observed a lower cortical porosity (67%, p
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LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 - Esquema de seleo das reas de interesse do fmur e vrtebra...............................................................................................................
38
Figura 2 - Foto do osso no equipamento para a realizao do teste de flexo de trs pontos.....................................................................................................
39
Figura 3 - Massa corporal dos animais Selvagens e 2A-AR
-/-.......................... 41
Figura 4 - Parmetros cardacos dos animais Selvagens e 2A-AR
-/-................ 42
Figura 5 - Composio corporal dos animais Selvagens e 2A-AR
-/-. Contedo de gordura axilar e retroperitoneal.....................................................
43
Figura 6 - Comprimento corporal dos animais Selvagens e 2A-AR
-/-............... 44
Figura 7 - Comprimento do fmur dos animais Selvagens e 2A-AR
-/-.............. 45
Figura 8 - Comprimento da tbia dos animais Selvagens e 2A-AR
-/-.............. 45
Figura 9 - Anlise por CT da Metfise Distal do Fmur de Camundongos Selvagens e 2A-AR
-/-.........................................................................................
46
Figura 10 - Anlise por CT do osso cortical femoral por microtomografia computadorizada em animais Selvagens e 2A-AR
-/-.........................................
47
Figura 11 - Anlise do osso trabecular da vrtebra L5 por microtomografia computadorizada em animais Selvagens e 2A-AR
-/-.........................................
48
Figura 12 - Anlise do osso cortical da vrtebra L5 por microtomografia computadorizada em animais Selvagens e 2A-AR
-/-........................................
49
Figura 13 - Parmetros biomecnicos determinados no fmur de animais Selvagens e 2A-AR
-/-.........................................................................................
50
Figura 14 - Parmetros biomecnicos determinados na tbia de animais Selvagens (Selv) e 2A-AR
-/-...............................................................................
51
Figura 15 - Expresso gnica dos receptores adrenrgicos no fmur dos animais selvagens e 2A-AR
-/- ............................................................................
52
Figura 16 - Expresso gnica dos genes relacionados ao metabolismo sseo no fmur de animais selvagens e 2A-AR
-/- .......................................................
53
Figura 17 - Expresso gnica dos receptores de hormnio tireoideano no fmur de animais selvagens e 2A-AR
-/- .............................................................
53
Figura 18 - Efeito do T3 na Massa corporal dos animais Selvagens e 2A-AR
-/ 55
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10
Figura 19 - Efeito do T3 nos parmetros cardacos..........................................
56
Figura 20 - Efeito do T3 no contedo de gordura axilar (GA) e retroperitoneal (GR)....................................................................................................................
57
Figura 21 - Efeito do T3 no Comprimento corporal...........................................
60
Figura 22 - Efeito do T3 no comprimento do fmur e tbia................................
61
Figura 23 - Anlise por uCT do efeito de 30 e 90 dias de tratamento com T3 no osso trabecular femoral..................................................................................
62
Figura 24 - Anlise por CT do efeito de 30 e 90 dias de tratamento com T3 no osso cortical da difise do fmur de animais Selvagens e 2A-AR
-/-.............
63
Figura 25 - Anlise por CT do efeito de 30 e 90 dias de tratamento com T3 no osso trabecular do corpo vertebral de animais Selvagens e 2A-AR
-/-..........
65
Figura 26 - Anlise por CT do efeito de 30 e 90 dias de tratamento com T3 no osso cortical do corpo vertebral de animais Selvagens e 2A-AR
-/-...............
66
Figura 27 - Efeito de 30 e 90 dias de tratamento com T3 em parmetros biomecnicos do fmur de animais Selvagens e 2A-AR
-/-.................................
67
Figura 28 - Efeito de 30 e 90 dias de tratamento com T3 em parmetros biomecnicos da tbia de animais Selvagens e 2A-AR
-/....................................
68
Figura 29 - Expresso gnica dos receptores beta adrenrgicos no fmur de animais selvagens e 2A-AR
-/- tratados com T3..................................................
69
Figura 30 - Expresso gnica dos receptores alfa adrenrgicos no fmur de animais selvagens e 2A-AR
-/- tratados com T3..................................................
70
Figura 31 - Expresso de genes relacionados ao metabolismo sseo no fmur de animais selvagens e 2A-AR
-/- tratados com T3...................................
71
Figura 32 - Expresso gnica do TR e TR no fmur de animais selvagens e 2A-AR
-/- tratados com T3.................................................................................
72
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Grupos experimentais dos animais selvagens e geneticamente modificados.......................................................................................................
35
Tabela 2 - Massa Muscular do Extensor Longo dos Dedos, Gastrocnmio e Reto Femoral de Animais selvagens e 2A-AR
-/-..............................................
44
Tabela 3 - Concentraes sricas de T3 e T4 nos animais selvagens (Selv) e 2A-AR
-/- tratados ou no com dose suprafisiolgica de T3...........................
54
Tabela 4 - Efeito de 30 dias de tratamento com T3 em msculos esquelticos......................................................................................................
59
Tabela 5 - Efeito de 90 dias de tratamento com T3 em msculos esquelticos......................................................................................................
59
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2D - Duas dimenses
3D - Trs dimenses
2-AR - Receptor Adrenrgico 2
1-AR - Receptor Adrenrgico 1
2-AR - Receptor Adrenrgico 2
3-AR - Receptor Adrenrgico 3
CT - Microtomografia Computadorizada
AMO - Alta Massa ssea
B.Ar - rea da cortical
BMD - Densidade Mineral ssea
BV/TV - Volume sseo/Volume trabecular
CART - Trancrito regulado pela cocana e anfetamina
CO2 - Dixido de carbono
Ct.Th - Espessura cortical
DA - Grau de anisotropia
DNAc - DNA complementar
DXA - Dual energy X-ray Absorptiometry
ELD - Msculo Extensor Longo dos Dedos
EFTP - Ensaio de Flexo de Trs Pontos
EPM - Erro Padro da Mdia
Fig. - Figura
FGF23 -Fibroblast growth factor 23
GA - Gordura Axilar
GASTRO - Msculo Gastrocnmio
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GH - Hormnio do crescimento
GR - Gordura Retroperitoneal
HT - Hormnio tireoideano
IGF-I - Insulin Growth Factor - I
KO - Knockout
L2 - Segunda vrtebra lombar
L3 - Terceira vrtebra lombar
L4 - Quarta vrtebra lombar
L5 - Quinta vrtebra lombar
MEC - Matriz Extracelular
NE - Noradrenalina
NF-k - Fator Nuclear kappa B
OPG - Osteoprotegerina
PCR - Reao em Cadeia da Polimerase
Po - Porosidade da cortical
RANK - Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa B
RANK-L - Ligante do Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa B
RF - Msculo Reto Femoral
RNAm - RNA mensageiro
ROI - Regio de interesse
rT3 - T3 reverso
Selv - Selvagem
SMI - ndice do modelo estrutural
SNA - Sistema Nervoso Autnomo
SNC - Sistema Nervoso Central
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SNS - Sistema Nervoso Simptico
T2 - Diiodotironina
T3 - Triiodotironina
T4 - Tetraiodotironia ou tiroxina
TA - Temperatura Ambiente
T.Ar - rea peristica
Tb.N - Nmero de trabculas
Tb.Pf - Fator de padro de osso trabecular
T.Pm - Permetro do peristeo
Tb.Th - Espessura trabecular
Tb.Sp - Separao entre as trabculas
TR - Receptor de hormnio tiroideano
TR - Receptor de hormnio tireoideano
TR - Receptor de hormnio tireoideano
TRAP - Fosfatase cida tartrato-resistente
TRH - Hormnio liberador de tireotrofina
TSH - Hormnio tireotrfico
TSHR - Receptor de TSH
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SUMRIO
1 INTRODUO........................................................................................................... 17 1.1 O tecido sseo....................................................................................................... 17 1.2 O sistema nervoso autnomo e o sistema nervoso simptico......................... 19 1. 2.1 O sistema nervoso autnomo.............................................................................. 19 1. 2.2 O sistema nervoso simptico.............................................................................. 21 1.3 O sistema nervoso simptico e o tecido sseo .............................................. 22 1.4 Evidncias de que os receptores adrenrgicos 2 tambm participam da regulao da massa e metabolismo sseos...........................................................
24
1.5 O hormnio tireoideano (HT)................................................................................ 28 1.6 Evidncias de que o HT interage com o SNS via receptores adrenrgicos para regular a massa e metabolismo sseos............................................................
31
2 OBJETIVOS................................................................................................................. 33 2.1 Objetivos gerais.................................................................................................... 33 2.2 Objetivos especficos............................................................................................ 33 3 MATERIAL E MTODOS............................................................................................. 34 3.1 Animais e tratamento.......................................................................................... 34 3.1.1 Animais modificados geneticamente...................................................................... 34 3.1.2 Animais selvagens e 2A-AR
-/- tratados com HT.................................................. 34 3.2 Sacrifcio dos animais e coleta de amostras..................................................... 35 3.3 Dosagens sricas de T3 e T4................................................................................. 36 3.4 Comprimento corporal e comprimento do fmur e tbia...................................... 36 3.5 Medida da composio corporal........................................................................... 36 3.6 Microtomografia computadorizada (CT) em duas e trs dimenses (2D e 3D)....................................................................................................
37
3.7 Teste biomecnico do fmur e tbia...................................................................... 38 3.8 Preparao para PCR em tempo real (real-time PCR)......................................... 39 3.9 Anlise estatstica.................................................................................................. 40 4 RESULTADOS............................................................................................................. 41 4.1 Avaliao da inativao isolada do 2A-AR na estrutura e fisiologia sseas, caracterizando o fentipo sseo de camundongos ..................................
41
4.1.1 Massa corporal....................................................................................................... 41 4.1.2 Parmetros cardacos............................................................................................ 41 4.1.3 Massa das gorduras axilar e retroperitoneal........................................................ 42 4.1.4 Massa seca, massa mida e contedo de gua dos msculos
esquelticos................................................................................................................... 43
4.1.5 Comprimento corporal............................................................................................ 44 4.1.6 Comprimento do fmur e da tbia.......................................................................... 45 4.1.7 Microtomografia computadorizada em 3D: anlise do osso
trabecular da metfise distal do fmur............................................................................ 46
4.1.8 Microtomografia computadorizada em 2D: anlise do osso cortical
da difise do fmur.......................................................................................................
47
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16
4.1.9 Microtomografia computadorizada em 3D: anlise do osso
trabecular da quinta vrtebra lombar............................................................................ 48
4.1.10 Microtomografia computadorizada em 2D: anlise do osso cortical
da quinta vrtebra lombar.............................................................................................. 49
4.1.11 Teste biomecnico do fmur e tbia.................................................................... 50 4.1.12 Expresso gnica dos receptores adrenrgicos no fmur.................................. 51 4.1.13 Expresso de genes relacionados ao metabolismo sseo no fmur............... 52 4.1.14 Expresso gnica dos receptores de hormnio tireoideano no fmur.............. 53 4.2 Avaliao do efeito do HT na estrutura e fisiologia sseas dos
camundongos 2A-AR-/-.................................................................................................
54
4.2.1 Dosagens sricas de T3 e T4.............................................................................. 54 4.2.2 Massa corporal..................................................................................................... 55 4.2.3 Parmetros cardacos.......................................................................................... 56 4.2.4 Massa das gorduras axilar e retroperitoneal......................................................... 57 4.2.5 Massa seca, massa mida e contedo de gua dos msculos esquelticos........ 58 4.2.6 Comprimento corporal.......................................................................................... 60 4.2.7 Comprimento do fmur e da tbia......................................................................... 60 4.2.8 Microtomografia computadorizada em 3D: anlise do osso trabecular da
metfise distal do fmur............................................................................................... 62
4.2.9 Microtomografia computadorizada em 2D: anlise do osso cortical
da difise do fmur.......................................................................................................... 62
4.2.10 Microtomografia computadorizada em 3D: anlise do osso
trabecular da quinta vrtebra lombar.............................................................................. 64
4.2.11 Microtomografia computadorizada em 2D: anlise do osso cortical
da quinta vrtebra lombar............................................................................................ 65
4.2.12 Teste biomecnico do fmur e tbia.................................................................. 67 4.2.13 Expresso gnica dos receptores adrenrgicos no fmur dos
animais tratados com hormnio tireoideano.................................................................. 69
4.2.14 Expresso de genes relacionados ao metabolismo sseo no
fmur dos animais tratados com hormnio tireoideano.............................................. 70
4.2.15 Expresso gnica dos receptores de hormnio tireoideano do
fmur dos animais tratados........................................................................................ 72
5 DISCUSSO............................................................................................................ 73 5.1 Caracterizao do fentipo sseo de camundongos com inativao do receptor adrenrgico 2A...................................................................
73
5.2 Efeito do HT no esqueleto de animais 2A-AR-/- .................................................. 76
6 CONCLUSES........................................................................................................... 81 6.1 A comparao dos animais selvagens e 2A-AR
-/- no tratados sugere que..................................................................................................................
81
6.2 A comparao do efeito do tratamento com dose suprafisiolgica de T3 entre animais selvagens e 2A-AR
-/- sugere que....................................................... 81
REFERNCIAS............................................................................................................ 82
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1 INTRODUO
1.1 O tecido sseo
O tecido sseo um dos mais resistentes e rgidos tecidos do corpo humano
que tem como funes a proteo e sustentao de rgos, locomoo,
armazenamento de clcio, fsforo e outros ons (BARON, 2003; GRAAF, 2003).
Recentemente, descobriu-se que o tecido sseo participa ativamento da regulao
do metabolismo mineral e da glicose, atravs da liberao do fator de crescimento
fibroblstico 23 (fibroblast growth factor 23 FGF-23) e da osteocalcina,
respectivamente. O FGF23 produzido por ostecitos, circula como um hormnio e
age no rim estimulando a excreo urinria de fsforo (FUKUMOTO; MARTIN,
2009). A osteocalcina, sintetizada pelos osteoblastos, aumenta a sntese, secreo e
sensibilidade insulina e aumenta utilizao da glicose e o gasto energtico (LEE
et al., 2007). Assim sendo, uma srie de evidncias sugerem que o tecido sseo
atua, tambm, como um rgo endcrino (FUKUMOTO; MARTIN, 2009).
Macroscopicamente, o tecido sseo pode ser classificado como cortical (ou
compacto) e trabecular (ou esponjoso). O osso cortical, que representa 80% da
massa esqueltica, predomina nos ossos longos e tem, principalmente, funo
mecnica e de proteo de rgos. Sua espessura e arquitetura variam dependendo
do stio esqueltico, o que reflete o desempenho funcional do osso. O osso
trabecular ou esponjoso, que corresponde a aproximadamente 20% da massa
esqueltica, encontrado predominantemente no esqueleto axial e no interior dos
ossos longos, dentro de suas extremidades expandidas (metfises e epfises). O
osso esponjoso d resistncia adicional aos ossos, alm de acomodar a medula
ssea por entre suas traves sseas. Tanto o osso trabecular quanto o cortical
formam um reservatrio de clcio e fosfato que podem ser prontamente removidos
ou acrescentados por ao celular, sob controle hormonal (BARON, 2003).
Microscopicamente, como todo tecido conjuntivo, o tecido sseo consiste de
uma poro celular e de uma matriz extracelular (MEC). A MEC possui um
componente orgnico (35%) e inorgnico (65%). O seu componente orgnico
formado por colgeno, protenas no colgenas (osteonectina, osteocalcina, entre
outras), mucopolissacardeos e lipdeos. A fase inorgnica , predominantemente,
constituda por clcio e fsforo, que so depositados como sais amorfos sobre a
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MEC e, durante o processo de mineralizao ssea, formam estruturas cristalinas
similares aos cristais de hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2]. As molculas de colgeno
formam uma estrutura tridimensional, criando espaos para acomodar esses cristais
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
As clulas sseas representam apenas 1 a 2% do tecido sseo. Entretanto,
so responsveis pelas funes metablicas do osso (como, por exemplo, o
remodelamento sseo e a manuteno dos nveis circulantes de clcio e fsforo).
Basicamente, h duas linhagens de clulas no tecido sseo, as clulas da linhagem
osteoblstica e osteoclstica. As clulas sseas da linhagem osteoblstica so: (a)
as clulas osteoprogenitoras, que do origem aos osteoblastos; (b) os osteoblastos,
responsveis pela formao ssea; (c) os ostecitos, encontrados embebidos na
MEC; e (d) as clulas de revestimento ou de superfcie, responsveis pela proteo
das superfcies sseas. A outra linhagem de clulas osteoclsticas, responsveis
pela reabsoro ssea (BARON, 2003).
O tecido sseo est em constante processo de remodelamento, atravs da
atividade finamente regulada e acoplada dos osteoclastos e osteoblastos, esse
acoplamento determinado por uma constante troca de sinais entre essas clulas.
O remodelamento sseo ocorre em pequenas unidades de clulas chamadas de
unidades de remodelamento sseo (BRUs, bone remodeling units), que so
observadas em vrios stios das superfcies sseas. A sequncia de eventos em um
stio de remodelamento, ou seja, em uma BRU, a ativao-reabsoro-formao.
As superfcies sseas quiescentes so recobertas por clulas de superfcie ou de
revestimento (flat bone-lining cells). Em resposta a um estmulo de reabsoro, as
clulas de superfcie se retraem e expem a superfcie celular; ao mesmo tempo,
ocorre a diferenciao, ativao e migrao dos osteoclastos aos stios de
reabsoro (superfcie exposta). Os osteoclastos reabsorvem o osso velho e formam
uma lacuna, chamada de lacuna de Howship. Finalmente, os osteoblastos ocupam
o stio de reabsoro e sintetizam a matriz extracelular (osteide) que, aps um
perodo de amadurecimento (aproximadamente 10 dias), ser mineralizada. Ao final
de cada ciclo de remodelamento, a quiescncia restaurada. O produto final do
remodelamento sseo a manuteno da integridade ssea (GOUVEIA, 2004;
MUNDY; OYAJOBI, 2003). Em adultos, a reabsoro e formao ssea geralmente
ocorrem de um modo balanceado, a fim de manter a massa ssea praticamente
constante (BARON, 2003; MUNDY; OYAJOBI, 2003). O remodelamento sseo
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19
importante para o reparo dos micro- e macro-danos e para permitir a renovao
contnua da matriz ssea, o que, por sua vez, garante a sua integridade (MUNDY;
OYAJOBI, 2003).
Uma srie de fatores sistmicos e locais so responsveis pela regulao do
processo de remodelamento. Sabe-se, atualmente, que a interao entre protenas
localizadas nas superfcies dos osteoblastos e osteoclastos extremamente
importante para a regulao local e sistmica do remodelamento sseo.
O ligante do receptor ativador do NF-k (RANK-L) um membro da
superfamlia dos ligantes aos fatores de necrose tumoral (TNF). O RANK-L est
presente na superfcie das clulas osteoblsticas e se liga a seu receptor o RANK
(Receptor activator of nuclear factor kappa B), que est presente na superfcie das
clulas precursoras dos osteoclastos e nos osteoclastos maduros. O RANK uma
protena de membrana do tipo I, que foi originalmente clonada a partir de clulas
dendrticas (ANDERSON et al., 1997). A ligao do RANK-L ao seu receptor
especfico, o RANK, promove a induo da osteoclastognese e atividade dos
osteoclastos. O RANK-L tambm um fator essencial para a sobrevivncia e
maturao dos osteoclastos (SCHNEEWEIS; WILLARD; MILLA, 2005; WADA et al.,
2006).
Segundo Liu et al. (1991), a osteoprotegerina (OPG) uma glicoprotena
solvel, sintetizada pelos osteoblastos, que se liga ao RANK-L e, desta forma,
bloqueia a ligao RANK/RANK-L. Assim sendo, a interao OPG/RANK-L limita a
sobrevivncia, diferenciao e atividade dos osteoclastos (SCHNEEWEIS;
WILLARD; MILLA, 2005; WADA et al., 2006).
A descoberta desta interao celular entre osteoblastos e osteoclastos via
sistema RANK/RANKL/OPG - permitiu um maior entendimento dos mecanismos de
regulao do remodelamento sseo, tanto em condies fisiolgicas como tambm
em condies patolgicas.
1.2 O Sistema nervoso autnomo e o sistema nervoso simptico
1.2.1 O sistema nervoso autnomo
Com base em critrios funcionais, o Sistema Nervoso pode ser dividido em
Sistema Nervoso Somtico e Sistema Nervoso Visceral. Como os prprios nomes
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sugerem, o Somtico responsvel pela vida de relao, enquanto que o Visceral
controla a vida vegetativa. Ambos possuem componentes aferentes e eferentes, no
entanto, diferentemente do Somtico, a eferncia Visceral no atinge o nvel de
conscincia, ocorrendo de forma autnoma. Desta maneira, convencionou-se
chamar essa diviso do Sistema Nervoso Visceral de Sistema Nervoso Autnomo
(SNA) (MACHADO, 2006).
Caracterstica marcante do SNA a existncia de dois neurnios para
conectar o Sistema Nervoso Central (SNC) ao rgo efetuador. Um deles apresenta
seu corpo dentro do SNC (tronco enceflico ou medula espinal), enquanto o outro
tem o corpo localizado no Sistema Nervoso Perifrico (SNP), em agrupamentos de
corpos neuronais chamados de gnglios. Sendo assim, o neurnio cujo corpo est
no SNC denominado pr-ganglionar, e o neurnio cujo corpo est em gnglios
denominado ps-ganglionar. Os impulsos nervosos que seguem pelo SNA terminam
em msculo estriado cardaco, msculo liso ou glndula. Assim, o SN autnomo
involuntrio (DANGELO; FATTINI, 2007)
Alm das diferenas com a diviso eferente do Sistema Nervoso Somtico, o
prprio SNA apresenta diferenas internas, baseadas em fatores anatmicos,
farmacolgicos e fisiolgicos de seus neurnios. Desta forma, o SNA subdividido
em partes Simptica e Parassimptica (MACHADO, 2006).
Entende-se por fatores anatmicos a localizao dos corpos dos neurnios
pr e ps-ganglionares, bem como o tamanho de suas fibras. A posio dos
neurnios pr-ganglionares no Sistema Nervoso Simptico (SNS) na medula
torcica e lombar (entre T1 e L2), diz-se, pois, que o SNS toraco-lombar. No
Sistema Nervoso Parassimptico (SNP), elas se localizam no tronco enceflico
(portanto, dentro do crnio) e na medula sacral (S2, S3 e S4). Diz-se que o SNP
parassimptico crnio-sacral. Com relao aos neurnios ps-ganglinares, no
SNS, se localizam longe das vsceras e prximo da coluna vertebral, formando os
gnglios paravertebrais e pr-vertebrais, j no SNP, os neurnios ps-ganglionares
se localizam prximo ou dentro das vsceras (DANGELO; FATTINI, 2007;
KOEPPEN; STANTON, 2009)
Os aspectos fisiolgicos levam em conta as aes geradas por cada parte
dessa diviso. J os aspectos farmacolgicos, dizem respeito aos tipos de
neurotransmissores que so principalmente usados pelas fibras ps-ganglionares
(acetilcolina ou noradrenalina). Sabemos, hoje, que a ao da fibra nervosa sobre o
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efetuador (msculo ou glndula) se faz por liberao de um neurotransmissor, dos
quais os mais importantes so a noradrenalina e acetilcolina. As fibras nervosas que
liberam a acetilcolina so chamadas colinrgicas e as que liberam noradrenalina,
adrenrgicas. Entretanto as fibras que secretam noradrenalina ativam receptores
adrenrgicos e as que secretam acetilcolina ativam receptores colinrgicos
(MACHADO, 2006).
Os sistemas simptico e parassimptico diferem no que se refere
disposio das fibras adrenrgicas e colinrgicas. Geralmente, as fibras pr-
ganglionares, tanto simpticas como parassimpticas, e as fibras ps-ganglionares
parassimpticas so colinrgicas. Contudo, a grande maioria das fibras ps-
ganglionares do SNS adrenrgica. Fazem exceo as fibras que inervam as
glndulas sudorparas e os vasos dos msculos estriados esquelticos, que apesar
de serem simpticas, so colinrgicas (DANGELO; FATTINI, 2007).
1.2.2 O sistema nervoso simptico (SNS)
Como mencionado acima, o SNS uma subdiviso do SNA, o qual um
componente eferente do SN Visceral. A grande maioria das fibras ps-ganglionares
do SNS tem a noradrenalina como neurotransmissor, e por isso, dizemos que so
fibras adrenrgicas (MACHADO, 2006).
O sistema adrenrgico um regulador essencial de funes neuronais,
endcrinas, cardiovasculares, vegetativas e metablicas. As catecolaminas
endgenas, noradrenalina (produzida pelos neurnios adrenrgicos) e adrenalina
(produzida pela medula das glndulas supra-renais), transmitem seus sinais
biolgicos via receptores acoplados protena G para regular uma variedade de
funes celulares (HOFFMANN; LEFKOWITZ, 1996). Esses receptores so
denominados receptores adrenrgicos, e atravs deles que o SNS efetua suas
aes sob os rgos alvo. A maioria desses receptores est localizada na
membrana plasmtica de neurnios e em clulas alvo neuronais e no neuronais.
Os receptores adrenrgicos foram inicialmente classificados como e .
Atualmente, sabe-se que h pelo menos nove subtipos de receptores adrenrgicos:
trs isoformas 1 (1A, 1B e 1D), trs isoformas 2 (2A, 2B e 2C) e trs isoformas
(1, 2 e 3) (BYLUND et al., 1994; CIVANTOS; ALEIXANDRE, 2001).
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Todos os nove subtipos de receptores adrenrgicos so ativados pela
adrenalina e noradrenalina, entretanto, apenas os receptores 2 atuam como
autoreceptores inibitrios pr-sinapticos. Assim sendo, esses receptores modulam
(inibem) a liberao de noradrenalina pelas terminaes simpticas e por neurnios
adrenrgicos no SNC (BUCHELER; HADAMEK; HEIN, 2002).
Ainda no foi completamente elucidada a funo fisiolgica e o potencial
teraputico de cada subtipo de receptor adrenrgico, portanto mais estudos sobre a
especificidade das isoformas dos receptores adrenrgicos so necessrios para o
desenvolvimento de novas estratgias teraputicas na criao de drogas subtipo
seletivas.
1.3 O sistema nervoso simptico e o tecido sseo
Um dos mais importantes achados dos ltimos anos foi o de que o
remodelamento sseo tambm est sujeito ao controle do SNC, com o SNS agindo
como efetor perifrico (DUCY et al., 2000; TOGARI, 2002).
O papel do SNS no controle do remodelamento sseo foi evidenciado pelo
fentipo de alta massa ssea (AMO) em modelos de camundongos com baixa
atividade simptica, como em animais Ob/Ob, que so deficientes de leptina, e em
animais deficientes de dopamina -hidroxilase (DbH-/-), enzima responsvel pela
sntese de catecolaminas (THOMAS; MATSUMOTO; PALMITER, 1995; THOMAS;
PALMITER, 1998). Esses modelos animais, entretanto, apresentam disfunes
endcrinas, incluindo hipercorticismo, hiperinsulinemia e hipogonadismo, que podem
interferir nos efeitos do SNS no osso.
Uma quantidade substancial de evidncias demonstrou que o SNS regula
negativamente a formao ssea e positivamente a reabsoro ssea
(ELEFTERIOU et al., 2005; TAKEDA et al., 2002; TAKEUCHI et al., 2001). Assim,
espera-se que a diminuio e o aumento do tnus simptico resultem,
respectivamente, em alto e baixo fentipo de massa ssea.
Uma srie de estudos recentes mostra que o SNS regula o remodelamento
sseo via receptor 2-adrenrgico (2-AR). A presena de fibras nervosas
simpticas foi identificada no tecido sseo e na medula ssea; alm disso, 2-ARs
foram encontrados em clulas osteoblsticas e osteoclsticas (BJURHOLM et al.,
1988; TAKEDA et al., 2002). Foi mostrado que a administrao de propranolol, um
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bloqueador especfico e no seletivo, aumentou a massa ssea em roedores
(TAKEDA et al., 2002), alm de atenuar ou mesmo prevenir a perda de massa ssea
induzida pela deficincia de estrgeno (BONNET et al., 2007; BONNET; PIERROZ;
FERRARI, 2008). Inversamente, o isoproterenol, um agonista do 2-AR, prejudicou
a aquisio do pico de massa ssea e diminuiu a massa e a resistncia sseas em
animais adultos (BONNET et al., 2007; BONNET et al., 2005).
Um papel mais preciso do 2-AR na massa ssea foi substanciado por anlises
de animais com inativao gnica (knockout - KO) desses receptores, os
camundongos 2-AR-/-, que no apresentam anormalidades endcrinas ou
metablicas. Esses animais tm peso corporal normal, mas apresentam um fentipo
de AMO a partir dos 6 meses de idade, que ocorre devido a um aumento da
formao e diminuio da reabsoro sseas (ELEFTERIOU et al., 2005).
Adicionalmente, esses animais so resistentes perda de massa ssea induzida por
ovariectomia.
Apesar de um crescente corpo de evidncias de que a sinalizao do 2-AR
um elemento chave na regulao do remodelamento sseo, experimentos
farmacolgicos e genticos tm produzido resultados contrastantes e inconclusivos.
digno de nota que a administrao de alguns agonistas -adrenrgicos, como
salbutamol (BONNET et al., 2007; BONNET et al., 2007; PATAKI et al., 1996),
clenbuterol (BONNET et al., 2005; CAVALIE et al., 2002) e formoterol (PATAKI et al.,
2006) promoveram efeitos positivos na massa ssea de ratos. Alm disso, os efeitos
positivos dos bloqueadores no so sempre detectveis e parecem ser dose
dependentes, com diminuio dos benefcios em altas dosagens (BONNET et al.,
2007).
Em humanos, uma srie de estudos mostrou que a administrao desses
bloqueadores promove efeitos positivos (BONNET et al., 2007; SCHLIENGER et al.,
2004), negativos (REJNMARK et al., 2004) ou no promovem efeitos (LEVASSEUR
et al., 2005; REID et al., 2005) na densidade mineral ssea (bone mineral density-
BMD) e/ou em fraturas sseas. Assim, os efeitos dos agonistas no metabolismo
sseo permanecem controversos.
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1.4 Evidncias de que os receptores adrenrgicos 2 tambm participam da
regulao da massa e metabolismo sseos
Visando investigar o papel do SNS na massa ssea e no remodelamento, um
estudo recente do nosso grupo analisou o fentipo esqueltico de um modelo de
camundongo com hiperatividade simptica crnica (FONSECA et al., 2011). Esse
modelo animal baseado no duplo KO dos genes 2A e 2C dos receptores
adrenrgicos (2A/2C-AR-/-) (HEIN; ALTMAN; KOBILKA, 1999).
Trs subtipos de 2-ARs foram identificados: 2A-AR, 2B-AR e 2C-AR
(KNAUS et al., 2007; PHILIPP; HEIN, 2004). Os receptores adrenrgicos 2 (2-ARs)
foram inicialmente classificados como autorreceptores inibitrios pr-sinpticos
(modulam a liberao de neurotransmissores liberados pelo prprio neurnio) que
regulam negativamente a liberao de catecolaminas. Estudos farmacolgicos
indicam que o receptor adrenrgico 2A pode ser considerado o principal receptor
2 que atua na liberao de noradrenalina (PHILIPP; HEIN, 2004). A ativao dos
receptores 2 no tronco enceflico leva a uma reduo do tnus simptico, o que
resulta em diminuio da freqncia cardaca e da presso sangunea (RUFFOLO et
al., 1991; RUFFOLO; NICHOL; HIEBLE, 1991). Esses efeitos so potencializados
pela estimulao dos 2-ARs em terminaes nervosas simpticas. Hein, Altman e
Kobilka (1999) mostraram que o bloqueio simultneo do 2A- e do 2C-ARs em
camundongos leva a uma elevao crnica do tnus simptico. Esses camundongos
KOs apresentam alta mortalidade e diminuio da funo cardaca a partir dos 4
meses de idade (BRUM et al., 2002). De acordo com o esperado, observamos que
os camundongos 2A/2C-AR-/- apresentam nveis plasmticos elevados de
noradrenalina (NE) e hipertrofia cardaca, o que confirma a hiperatividade do SNS
(FONSECA et al., 2011).
Considerando-se as evidncias de que a ativao do SNS apresenta efeitos
negativos na massa ssea (DUCY et al., 2000), a nossa expectativa era a de que os
camundongos 2A/2CAR-/- apresentariam um esqueleto osteopnico.
Surpreendentemente, vimos que esses animais apresentam um fentipo
generalizado de AMO (FONSECA et al., 2011). A anlise da massa ssea por dual
energy X-ray absorptiometry (DXA), por um perodo de 12 semanas, mostrou que o
fentipo de AMO nos animais 2A/2C-AR-/- se torna mais evidente medida em que
os animais envelhecem. Anlises histomorfomtricas mostraram um aumento de
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osso trabecular no corpo vertebral da quinta vrtebra lombar (L5). Alm disso,
anlises por microtomografia computadorizada (CT) mostraram aumento de osso
trabecular, uma melhor conexo entre as trabculas e maior quantidade de
trabculas em forma de placas no fmur e na vrtebra dos animais KOs.
As melhorias na massa ssea e na microarquitetura trabecular apresentadas
por esses KOs foram acompanhadas por melhorias nos parmetros biomecnicos
do fmur e da tbia. Nesses dois stios esquelticos, a carga mxima (uma medida
de fora ssea) foi significativamente elevada nos animais KOs (8-18%). Alm disso,
a resilincia, que reflete a habilidade do osso de sofrer deformao elstica, tambm
apresentou-se aumentada na tbia desses animais com relao aos animais
selvagens (BRUM et al., 2002; FONSECA et al., 2011).
possvel que as melhorias na massa e funo sseas (biomecnica ssea),
apresentadas pelos camundongos 2A/2C-AR-/-, possam ser parcialmente explicadas
pelo aumento da carga mecnica, uma vez que esses animais apresentam maior
peso corporal do que os selvagens. Entretanto, alguns pontos indicam que uma
maior carga mecnica no pode ser a nica, ou a principal explicao do fentipo de
AMO dos KOs. Primeiro, o fentipo de AMO foi mais evidente na coluna lombar e
menos evidente na tbia, ossos que so, respectivamente, menos e mais sujeitos ao
stress mecnico dependente do peso corporal. Segundo, as diferenas de peso
corporal entre os KOs e os selvagens no mudaram durante as 12 semanas de
avaliao, enquanto que as diferenas da BMD aumentaram (FONSECA et al.,
2011).
A respeito do maior peso corporal, importante ser dito que os camundongos
2A/2C-AR-/- no so obesos. A massa gorda, determinada por DXA e pela medida
dos coxins adiposos mostrou ser menor nos animais KOs. importante considerar
que a massa magra identificada por DXA determinada pelo contedo de protena,
gua, glicognio e minerais que no so oriundos dos ossos (VILLICEV et al., 2007).
De fato, foi detectado um aumento na massa seca de dois dos cinco msculos
esquelticos avaliados (14% no plantar e 7% no gastrocnmio), mas foi observada
diminuio da massa seca no msculo sleo (58%) dos KOs vs. selvagens.
importante citar que o aumento da massa muscular era esperada, uma vez que
estudos mostraram que agonistas dos receptores 2- adrenrgicos aumentam a
massa muscular em humanos (MARTINEAU et al., 1992; MALTIN et al., 1993) e em
roedores (BONNET et al., 2005).
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digno de nota, entretanto, que esse efeito positivo dos agonistas no foi
capaz de contrabalancear os seus efeitos negativos na massa ssea em humanos
(DE VRIES et al., 2007) e em ratos (BONNET et al., 2007; BONNET et al., 2005).
Assim, improvvel que o aumento na massa muscular seja o principal
determinante do fentipo de AMO dos animais 2A/2C-AR-/-, baseado na teoria da
interao msculo-osso que determina que uma maior massa muscular est
associada a uma maior massa ssea (FROST., 2000).
Para investigar a base do aumento na massa ssea nos animais 2A/2C-AR-/-,
nosso grupo realizou histomorfometria ssea e foi avaliada a expresso de genes
relacionados com a reabsoro ssea. Vimos que a taxa de formao ssea maior
e que a reabsoro ssea menor nos 2A/2C-AR-/- em comparao com os
selvagens. Alm disso, vimos que a reduo na reabsoro ssea foi
acompanhada por uma diminuio no nmero de osteoclastos e por uma diminuio
na expresso do RNA mensageiro (RNAm) da fosfatase cida tartrato-resistente
(TRAP), que um marcador de atividade osteoclstica (ANGEL et al., 2000). Foi
detectado, ainda, que os animais 2A/2C-AR-/- apresentam diminuio da expresso
do RNAm do RANK. bem sabido que o RANK-L, o ligante do RANK, o principal
indutor da osteoclastognese e um importante indutor da atividade osteoclstica
(HOFBAUER; HEUFELDER, 2001; SCHNEEWEIS; WILLARD; MILLA, 2005), uma
vez que ele se liga com o RANK, o qual expresso em precursores de osteoclastos
e em osteoclastos maduros (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001; WADA et al., 2006).
Assim, esses dados sugerem que a elevao do tnus simptico em animais
2A/2C-AR-/- reduz a reabsoro ssea via RANK/RANK-L. Esses achados so
consistentes com o fentipo de AMO dos 2A/2C-AR-/-, mas contrasta estudos
anteriores que mostram que a ativao do SNS diminui a formao ssea e aumenta
a reabsoro (DUCY et al., 2000; ELEFTERIOU et al., 2005; TAKEDA et al., 2002;
TAKEDA, 2005; TAKEDA; KARSENTY, 2001).
Nosso grupo tambm investigou se possveis alteraes na leptina srica e/ou
na expresso do RNAm do transcrito regulado pela cocana e anfetamina (CART) no
crebro poderiam explicar o fentipo de AMO dos animais 2A/2C-AR-/-. Essa
suposio foi levantada j que h fortes evidncias de que a leptina controla a
reabsoro ssea indiretamente, atravs de, no mnimo, dois mecanismos distintos
e antagnicos (ELEFTERIOU et al., 2005). Por um lado, a leptina aumenta a
reabsoro ssea e inibe a formao atravs da ativao hipotalmica do SNS
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(DUCY et al., 2000.; ELEFTERIOU et al., 2005; SHI et al., 2008). Por outro, a leptina
inibe a reabsoro ssea, induzindo a expresso cerebral de CART, um
neuropeptdeo que inibe a reabsoro ssea modulando negativamente a expresso
de RANK-L (ELEFTERIOU et al., 2005). digno de nota, entretanto, que o nvel
srico de leptina e a expresso cerebral de RNAm do CART foram normais nos
animais 2A/2C-AR-/-. Alm disso, foi medido os nveis sricos de IGF-I (insulin
growth factor-I), j que h evidncias de que eixo GH/IGF-I medeia a sinalizao
adrenrgica no osso (BONNET; PIERROZ; FERRARI, 2008; PIERROZ et al., 2004).
Mais uma vez, no foram encontradas diferenas entre os animais KOs e os
selvagens.
Considerando o inesperado fentipo de AMO dos animais 2A/2C-AR-/- e as
evidncias de que os 2-ARs medeiam as aes osteopnicas do SNS
(ELEFTERIOU et al., 2005; TAKEDA et al., 2002), foi suspeitado que a expresso do
RNAm desse receptor pudesse estar regulada negativamente no osso dos animais
KOs. Entretanto, vimos que o 2-AR igualmente expresso em tbias de KOs e
selvagens. importante salientar que um estudo prvio no encontrou evidncia
funcional de de downregulation dos 2-AR nos animais 2A/2C-AR-/-, como um
resultado da elevao do tnus simptico (BRUM et al., 2002).
Vale pena mencionar que o fentipo de AMO ainda mais notvel em
animais 2A/2C-AR-/- do que em animais com inativao do receptor 2 adrenrgico.
Enquanto o fentipo de AMO observado apenas quando os animais 2-AR-/-
apresentam 6 meses de idade (ELEFTERIOU et al., 2005), esse fentipo j notado
quando animais 2A/2C-AR-/- apresentam um ms e dez dias de idade. Alm disso, o
volume trabecular por volume sseo na vrtebra lombar 80% maior em 2A/2C-AR-
/- vs. selvagens com quatro meses de idade, enquanto que em animais 2-AR-/-,
essa diferena de 50% vs. selvagens com seis meses de idade.
O fato de que animais 2A/2C-AR-/- apresentam fentipo de AMO, mesmo
apresentando elevao do tnus simptico e sinalizao normal do 2-AR, levanta a
hiptese de que os receptores 2A- e/ou 2C-AR tambm apresentam um papel na
mediao, direta ou indireta, das aes do SNS no esqueleto. De fato, nosso grupo
mostrou que os dois receptores so expressos no osso dos animais selvagens e nas
clulas osteoblasto-like MC3T3-E1 (derivadas da calvria de camundongos), sendo
que o RNAm do 2A-AR se mostrou mais expresso do que do 2C-AR.
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Os receptores 2-adrenrgicos foram inicialmente caracterizados como
receptores pr-sinpticos que regulam a liberao de NE (STARKE; ENDO; TAUBE,
1975). Depois, foi mostrado que esses receptores no inibem s a liberao de
catecolaminas, mas que tambm podem regular a exocitose de um nmero de
outros neurotransmissores no SNC e perifrico (PHILIPP; BREDE; HEIN, 2002).
Alm disso, foi mostrado que 2-ARs no esto restritos a localidades pr-sinpticas,
mas tambm possuem funes ps-sinpticas, que incluem regulao da
temperatura corporal, presso intraocular, liplise e percepo da dor (HEIN, 2006;
PHILIPP; BREDE; HEIN, 2002). Estudos adicionais sero necessrios para a
caracterizao do papel dos subtipos de 2-ARs no metabolismo sseo.
Coletivamente, os recentes achados do nosso grupo trazem novas evidncias
de que a regulao do metabolismo sseo pelo SNS extremamente complexa. O
fato de que os animais 2A/2C-AR-/- apresentam fentipo de AMO mesmo
apresentando uma elevao no tnus simptico e 2-AR intacto, sugere que o 2-
AR no o nico adrenoreceptor envolvido no controle do metaboismo sseo. Alm
disso, achados do nosso grupo tambm levantam a hiptese de que os
adrenoreceptores 2A- e/ou 2C tambm apresentam um papel importante na
mediao das aes do SNS no esqueleto.
As investigaes das funes especficas dos subtipos dos 2-ARs e suas
interaes no metabolismo sseo, incluindo interaes com o 2-AR, so
importantes para a elucidao do papel do papel do SNS no esqueleto, o que
poder contribuir para o desenvolvimento de novas estratgicas teraputicas para o
tratamento da osteoporose.
1.5 O hormnio tireoideano (HT)
A glndula tireoide, localizada imediatamente abaixo da laringe e ocupando
as regies laterais e anterior da traqueia, uma das maiores glndulas endcrinas e
secreta dois hormnios principais, a tiroxina e a triiodotironina, habitualmente
chamados de T4 e T3, respectivamente. Menos de 1% da produo tireoideana
representado por outras iodotironinas, o T3 reverso (rT3) e a diiodotironina (T2)
(GUYTON; HALL, 2006; KRONENBERG, 2008).
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As clulas da tireoide so tpicas clulas glandulares secretoras de protenas.
O retculo endoplasmtico e o aparelho de Golgi sintetizam e secretam para os
folculos uma grande glicoprotena chamada de tireoglobulina, sendo que cada
molcula de tireoglobulina contm cerca de 70 aminocidos tirosina, que so os
principais substratos que se combinam com o iodo para formar os hormnios
tireoidenos (GUYTON; HALL, 2006).
O primeiro estgio na formao dos hormnios tireoideanos o transporte de
iodeto do sangue para as clulas e folculos glandulares da tireoide. Primeiramente,
necessrio que ocorra a converso dos ons iodeto para uma forma oxidada de
iodo que se liga diretamente ao aminocido tirosina. O principal produto hormonal da
reao de acoplamento a molcula tiroxina, que permanece como parte da
molcula de tireoglobulina e outra possibilidade o acoplamento de uma molcula
de monoiodotirosina com uma de diiodotirosina, formando a triiodotironina.
(GUYTON; HALL, 2006).
Nos mamferos, 60-90% da produo tireoideana corresponde a
tetraiodotironina (T4) e 10-40% corresponde a triiodotironina (T3). Embora a tireide
produza preferencialmente T4, h um consenso de que a maioria dos efeitos dos
hormnios tireoideanos seja fruto da ligao do T3 com os seus receptores
nucleares (TRs) (KRONENBERG, 2008; YEN, 2001).
A sntese e secreo dos hormnios tireoideanos regulada pelo eixo
hipotlamo-hipfise-tireide. Resumidamente, o hipotlamo produz e secreta o
hormnio liberador da tireotrofina (thyrotropin releasing hormone-TRH) que atinge a
regio anterior da hipfise e estimula a produo do hormnio tireotrfico (thyroid
stimulating hormone-TSH). O TSH age nas clulas foliculares tireoideanas para
estimular a sntese e secreo de T4 e T3. O hormnio tireoideano age via receptor
TR no hipotlamo e na hipfise para inibir a produo e secreo de TRH e TSH,
esse feedback negativo mantm a circulao de hormnios tireoideanos e TSH
regulados (ABEL et al., 2001; FORREST et al., 1996; WAUNG; BASSET;
WILLIAMS, 2012; WILLIAMS, 2009). Quando um indivduo apresenta nveis
aumentados de TSH e nveis diminudos de T3 e T4, tm-se uma situao
patolgica denominada hipotireodismo. Contrariamente, o hipertireoidismo se
caracteriza sorologicamente por nveis aumentados de T3 e T4 e reduzidos de TSH
(KRONENBERG, 2008).
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A afinidade dos TRs aproximadamente 10 vezes maior pelo T3 em relao
ao T4. Por conta disso, considerando-se os efeitos genmicos dos hormnios
tireoideanos, o T4 atua como um pr-hormnio, e o T3 como hormnio ativo,
ligando-se aos receptores nucleares (BIANCO et al., 2002; BRENT; MOORE;
LARSEN, 1991). O T4, produto secretado em maior abundncia pela glndula
tireide, convertido a T3 por ao de enzimas conhecidas como selenodesiodases
das iodotironinas. A converso do T4 a T3 ocorre na prpria tireoide ou nas clulas
de outros tecidos.
Ao contrrio do que se pensava anteriormente, h evidncia de que o TSH
tambm atua diretamente em tecidos no tireoideanos, dentre esses, o tecido sseo.
O receptor de TSH (TSHR) primariamente expresso nas clulas foliculares da
glndula tireoide, mas tambm foi identificado no crebro, rins, testculos, corao,
osso, tecido adiposo, fibroblastos e em clulas do sistema imune, hematopoiticas e
sseas (BELL et al., 2002; PRUMMEL et al., 2000)
O HT tem efeito no osso adulto, sendo importante para a manuteno do
metabolismo sseo, uma vez que estimula tanto a formao quanto a reabsoro
ssea, regulando a atividade dos osteoblastos e osteoclastos. Uma srie de estudos
mostram que, em condies de excesso do HT, a atividade dessas duas populaes
celulares est aumentada com predomnio da atividade osteoclstica. Como
resultado, o metabolismo sseo acelerado favorecendo a reabsoro ssea,
balano negativo do clcio e perda de massa ssea (MELSEN; MOSEKILDE, 1977).
importante dizer que os efeitos osteopnicos do excesso de HT foram
primeiramente descritas h mais de um sculo atrs (VON RECKLINGHAUNSEN,
1891) e que, a tireotoxicose evidente considerada uma das causas da osteoporose
secundria (FALLON et al., 1983; FRASER et al., 1971). Assim sendo, o
entendimento dos mecanismos atravs dos quais os HTs levam perda de massa
ssea devem contribuir para o entendimento da fisiopatologia da osteoporose.
Embora a importncia dos HTs no desenvolvimento e metabolismo sseos
seja clara, pouco se sabe a respeito dos mecanismos que medeiam os seus efeitos
no tecido sseo, sendo necessrios estudos para um melhor entendimento destes
processos.
-
31
1.6 Evidncias de que o HT interage com o SNS via receptores adrenrgicos 2
para regular a massa e metabolismo sseos
O hormnio tireoideano essencial para o desenvolvimento, crescimento e
metabolismo sseos. O T3 estimula tanto a formao quanto a reabsoro ssea
atravs da regulao da atividade de osteoblastos e osteoclastos (KRAGSTRUP;
MELSEN; MOSEKILDEM, 1981; MOSEKILDE; MELSEN, 1978). O excesso de HT
estimula mais a atividade osteoclstica do que a osteoblstica, o que resulta em
aumento da calcemia e reduo da massa ssea.
Uma caracterstica importante do HT, mas ainda pouco entendida, a sua
interao com o SNS. bem sabido que o sinergismo entre as catecolaminas e o
HT necessrio para que ocorra a mxima termognese, liplise, gligogenlise e
gluconeognese (OPPENHEIMER et al., 1991). Estudos anteriores mostraram que
pacientes com hipertireoidismo apresentam tnus simptico elevado (PIJL et al.,
2001). Considerando que o excesso de HT causa perda de massa ssea e que a
ativao do SNS tambm apresenta efeito negativo na massa ssea, nosso grupo
levantou a hiptese de que o HT tambm interage com o SNS para regular o
metabolismo sseo e, conseqentemente, a massa ssea.
Uma evidncia dessa possvel interao o fato de que o tratamento de
pacientes hipertireoideos com propranolol (um antagonista -adrenrgico) corrige
secundariamente a hipercalcemia (RUDE et al., 1976). Alm disso, pacientes com
hipotireoidismo tratados com propranolol apresentam reduo da excreo de
hidroxiprolina pela urina, um marcador bioqumico de reabsoro ssea (BEYLOT et
al., 1982).
Para investigar essa hiptese, camundongos fmeas selvagens e 2A/2C-AR-
/- de 40 dias de idade foram tratados com aproximadamente 10 vezes a dose
fisiolgica de T3 (10xT3=3,5 g/100 g PC/dia) durante 80 dias ou permaneceram
sem tratamento (WT e KO controles) (FONSECA, 2009). Como esperado, os
animais selvagens tratados com T3 apresentaram diminuio na BMD do fmur
(13%, p
-
32
Foi observado, ainda, que os adrenoceptores 2A e 2C (2A-AR e 2C-AR) so
expressos na tbia de camundongos selvagens e em clulas MC3T3-E1. Mais
importante ainda foi o fato observar que o T3 inibe a expresso do 2C-AR no osso
de camundongos. Tambm observamos que o T3 reduziu significativamente a
expresso da OPG, uma protena que limita a atividade osteoclstica, nos animais
selvagens, mas no nos animais KOs.
Assim sendo, os nossos estudos sugerem que os receptores adrenrgicos 2A
e ou 2C apresentam um papel importante na fisiologia ssea e que o SNS interage
com o HT atravs desses receptores para regular a massa ssea. Entretanto, para
confirmar essas hipteses, se faz necessrio caracterizar o fentipo sseo e estudar
o efeito do HT em camundongos com inativao individual do 2A-AR e 2CAR.
-
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
1- Avaliar se a inativao isolada do 2A-AR interfere na estrutura e fisiologia
sseas;
2- Avaliar se o 2A-AR medeia aes do hormnio tireoideano na estrutura e
fisiologia sseas.
2.2 Objetivos especficos
1- Caracterizar o fentipo sseo de camundongos 2AAR-/-, avaliando:
a estrutura do osso trabecular e cortical, por microtomografia
computadorizada;
parmetros biomecnicos, pelo teste de flexo de trs pontos;
o metabolismo sseo, atravs da anlise da expresso de genes
relacionados fisiologia ssea.
2- Analisar o efeito do tratamento com dose suprafisiolgica de hormnio
tireoideano no esqueleto de camundongos selvagens (C57BL/6J) e com
inativao isolada do 2A-AR (2AAR-/-), nos seguintes parmetros:
na estrutura do osso trabecular e cortical, por microtomografia
computadorizada;
em parmetros biomecnicos, pelo teste de flexo de trs pontos;
no metabolismo sseo, atravs da anlise da expresso de genes
relacionados fisiologia ssea.
-
34
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Animais e tratamento
Todos os protocolos aplicados ao uso e manuseio de animais esto de acordo
com os termos estabelecidos pelo Comit de tica do Instituto de Cincias
Biomdicas (autorizao n 35, fls. 85, livro 02).
3.1.1 Animais modificados geneticamente
Foram estudados camundongos fmeas selvagens (C57BL/6J) e animais 2A-
AR-/-, com 30 dias de idade. Os animais foram mantidos no Biotrio do
Departamento de Anatomia do Instituto de Cincias Biomdicas sob o ciclo/escuro
de 12h/12h, com acesso gua e a rao ad libitum.
Os animais 2A-AR-/-, com background C57BL/6J, foram produzidos por Hein,
Altman e Kobilka. (1999) e trazidos ao Brasil pela Prof Dr Patrcia C. Brum, da
Escola de Educao Fsica e Esporte da USP, com quem estabelecemos
colaborao para a realizao deste estudo.
3.1.2 Animais selvagens e 2A-AR-/- tratados com HT
Os animais receberam dose suprafisiolgica de T3 (Sigma-Aldrich, Germany),
equivalente a 20 vezes a dose fisiolgica (20xT3=7 g/100 g peso corporal/dia). O
T3 foi administrada uma vez ao dia, intraperitonealmente, a partir dos 30 dias de
idade, por 30 ou 90 dias. Todos os animais foram pesados uma vez por semana
para acompanhamento da variao da massa corporal ao longo do perodo
experimental e para o ajuste das doses de T3 a serem administradas. Os animais
foram divididos em 4 grupos, os quais esto apresentados na tabela 1.
-
35
Tabela 1 Grupos experimentais dos animais selvagens e geneticamente modificados.
Idade ao sacrifcio
(dias) Grupos
30
60
120
Selv n=6
n=6 n=6
Selv+T3 n=6
tt=30 dias
n=6
tt=90 dias
2A-AR-/- n=6 n=6 n=6
2A-AR-/-+T3 n=6
tt=30 dias
n=6
tt=90 dias
Os animais foram tratados com dose suprafisiolgica de T3 (~20 x a dose fisiolgica de T3 = 20 x 0,7 ug/100 g PC/dia). Selv=selvagem. n refere-se ao nmero de animais a ser sacrificado e tt, ao tempo de tratamento com T3 no momento do sacrifcio.
3.2 Sacrifcio dos animais e coleta de amostras
Os camundongos foram sacrificados por exposio a dixido de carbono
(CO2) e, em seguida, o sangue foi coletado por puno cardaca com seringa e
agulha heparinizadas com 10 l de heparina (liquemine 25.000 l/5ml). Parte do
volume do sangue coletado foi imediatamente centrifugada a 3000 rpm 4 C, por
10 minutos, para obteno do plasma, que, em seguida, foi congelado em nitrognio
lquido e armazenado em freezer -80 C, para posterior dosagem de noradrenalina
(NE). Para obteno de soro, a outra parte do volume do sangue coletado foi
incubada a 37 C, por 10 minutos, e centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos em
temperatura ambiente (TA). O soro foi isolado e imediatamente congelado para
posterior anlise de T3 e T4.
Os fmures foram coletados e dissecados rapidamente sobre uma superfcie
resfriada (0-4 C). Em seguida foram congelados em nitrognio lquido, e
armazenados em freezer -80 C. O corao, as gorduras axilar (GA), retroperitoneal
(GR), os msculos extensor longo dos dedos (ELD), gastrocnmio (GASTRO) e o
reto femoral (RF) foram coletados e congelados para posterior anlise. A quarta
vrtebra lombar (L4) e a tbia esquerda foram coletadas, dissecadas, armazenadas
em lcool 70%, e posteriormente armazenadas em temperatura entre 0-4 C. O
-
36
fmur direito, tbia direita e a quinta vrtebra lombar (L5) foram coletados,
dissecados e armazenados em soluo salina 0,9% , e em seguida, congelados.
As carcaas foram congeladas para posterior anlise.
3.3 Dosagens sricas de T3 e T4
As dosagens sricas de T3 e T4 foram realizadas por radioimunoensaio no
laboratrio RDO Diagnsticos Mdicos. Os resultados foram expressos em
microgramas de T3 e T4 por decilitro de soro (mcg/Dl).
3.4 Comprimento corporal e comprimento do fmur e tbia
Aps o sacrifcio, o comprimento corporal foi aferido em centmetros (cm),
pela medida da distncia entre a ponta do focinho at a base da cauda. Mediu-se,
tambm, o comprimento do fmur e tbia direitos com um paqumetro eletrnico
digital (Vonder).
3.5 Medida da composio corporal
A medida da composio corporal foi realizada atravs da aferio da massa
mida dos contedos de GR e GA e da aferio da massa mida e seca dos
seguintes msculos esquelticos: RF, GASTRO e ELD. Foi, tambm, realizada a
medida da massa mida e seca do corao, para avaliao de hipertrofia cardaca.
Para tanto, aps o sacrifcio dos animais, a GR, GA, os msculos esquelticos e o
corao foram retirados dos animais e, logo em seguida, pesados em balana
analtica de preciso (Denver Instrument M-220D), para aferio de massa mida.
As amostras foram, em seguida, colocadas em estufa a 60 C, por 48 horas. Aps
esse perodo, os msculos foram pesados novamente para a aferio de massa
seca. O contedo de gua foi calculado a partir da diferena entre a massa mida e
a massa seca. As massas do RF foram divididas pelo comprimento, em centmetros,
do fmur (CF) e as massas do GASTRO e ELD foram divididas pelo comprimento da
tbia (CT) e, portanto, expressas como g/mmCFx100 e g/mmCTx100,
respectivamente. As massas das gorduras axilar e retroperitoneal e do corao
-
37
foram divididas pela massa em gramas do animal, sendo expressas como
g/gPCx100.
3.6 Microtomografia computadorizada (CT) em duas e trs dimenses (2D e
3D)
O fmur direito e a L5 foram dissecados e mantidos em salina -20 C at o
momento das anlises. Parmetros em 2D e 3D dos ossos foram obtidos atravs de
um Microtomgrafo Skyscan 1172 (Desktop X-ray microtomograph), e analisados
com o auxlio do programa CT-Analyser (verso 1.10, Skyscan, Artselaar, Blgica). A
regio de interesse (region of interest-ROI) dos fmures foi padronizada com base
no comprimento do osso. Para a anlise de osso trabecular, inicialmente, o
comprimento total de cada fmur foi dividido em quatro partes iguais. Em seguida, o
comprimento do quarto distal foi dividido por 1.5, onde a parte proximal desta diviso
foi selecionada para anlise (ROI). Este procedimento foi adotado a fim de excluir a
lmina epifisial das anlises (Fig. 1A)
Os parmetros trabeculares analisados foram: volume trabecular (BV/TV),
espessura trabecular (TbTh), separao trabecular (Tb.Sp), nmero de trabculas
(Tb.N), fator do padro trabecular sseo (Tb.Pf), um ndice de conectividade
trabecular; ndice do modelo estrutural (SMI), que indica a prevalncia de trabculas
sseas em forma de rods (cilndricas) e plates (achatadas), o grau de anisotropia
(DA) e a densidade mineral ssea (BMD).
O Tb.Pf reflete a conectividade trabecular, sendo que baixos ndices, indicam
melhor conectividade da estrutura trabecular (HAHN et al., 1992).
O SMI indica a prevalncia de trabculas sseas em forma de rods
(cilndricas) e plates (achatadas, em forma de placas). Este parmetro de suma
importncia na anlise da estrutura trabecular, uma vez que a deteriorao do osso
trabecular, em funo do envelhecimento ou doena, caracterizada pela converso
de trabculas achatadas para cilndricas. Assim sendo, o predomnio de trabculas
cilndricas resulta em um maior valor de SMI e em trabculas menos resistentes ao
stress mecnico (HILDEBRAND; RUEGSEGGER, 1997).
O DA a medida da simetria em 3 dimenses e reflete a orientao das
trabculas sseas. No caso do osso, que um material no contnuo, repleto de
estruturas (trabculas) orientadas em diferentes direes, a mensurao do DA
-
38
reflete a capacidade de reagir diferentemente a cargas vindas de sentidos
diferentes. Quanto menos simtrico o objeto, maior o DA. Com relao ao osso,
quanto maior o DA, maior ser o nmero de trabculas orientadas em diferentes
direes e, portanto, melhor ser a sua resposta a diferentes vetores de foras
mecnicas.
Para a anlise do osso cortical, parmetros em 2D do fmur foram obtidos e
analisados conforme descrito anteriormente. Primeiramente o osso foi dividido em
metades proximal e distal, em seguida, a metade distal foi subdividida em quatro
partes iguais. Por fim, o segundo quarto proximal foi selecionado para anlise (ROI)
(Fig 1B).
Os parmetros corticais analisados foram: rea peristica - rea total
delimitada pelo peristeo, inclui a rea medular e cortical (T.Ar), permetro do
peristeo (T.Pm), rea da cortical (B.Ar), rea medular (T.Ar-B.Ar), permetro do
endsteo (B.Pm-T.Pm), espessura cortical (Ct.Th) e porosidade da cortical (Po).
Figura 1 - Esquema de seleo das reas de interesse do fmur (quadriculado) e vrtebra.
A. Osso trabecular. B. Osso cortical. C. Osso trabecular e cortical. 3.7 Teste biomecnico do fmur e tbia
Os fmures e as tbias direitos foram dissecados e mantidos em salina a 20C
at o momento das anlises. Parmetros biomecnicos do fmur e da tbia dos
animais controles e tratados com T3 foram obtidos pelo Ensaio de Flexo de Trs
Pontos (EFTP), realizado em um sistema para teste de materiais Instron, modelo
3344 (Instron Corporation, MA, USA). Durante o ensaio, as extremidades dos
C
-
39
fmures e tbias eram apoiadas em dois roletes, posicionados sobre um suporte,
sendo a distncia entre os apoios variadas, conforme o tamanho dos ossos
(conseqncia das diferentes idades). Uma fora foi aplicada perpendicularmente ao
eixo longitudinal do osso no ponto mdio entre os dois apoios, no sentido ntero-
posterior no fmur e no sentido ltero-medial na tbia, por uma haste cilndrica a uma
velocidade constante de 05 cm/min at o momento de ruptura do osso (Fig. 2).
Figura 2 Foto do osso no equipamento para a realizao do teste de flexo de trs pontos.
A fora aplicada e o deslocamento da haste cilndrica foram monitorados e
registrados atravs de um software prprio do equipamento (Bluehill lite, verso
2.25). Foram avaliados os seguintes parmetros biomecnicos: Carga mxima (em
N), que corresponde maior fora aplicada durante o ensaio (fora mxima qual o
osso capaz de resistir); mdulo elstico (N/mm), que corresponde rigidez ssea
e a tenacidade (J), que a capacidade do osso de resistir a uma fratura.
3.8 Preparao para PCR em tempo real (Real-Time PCR)
O fmur esquerdo dos animais selvagens e 2A-AR-/- controles e tratados com
T3 foram dissecados rapidamente sobre uma superfcie resfriada (0-4 C),
congelados em nitrognio lquido e armazenados em freezer -80 C. Os ossos foram
pulverizados, na presena de nitrognio lquido, em um mortar e pistilo de ao
(Fisher Scientific International, Inc, Hampton, NH, USA) previamente resfriado em
gelo seco. Ao p de osso, foi adicionado Trizol. A mistura de p de osso mais
-
40
Trizol foi homogeneizada com um polytron PT10-35 (Brinkmann Intruments, Inc, NY,
USA).
O RNA total do fmur foi extrado de acordo com o protocolo fornecido pelo
fabricante do Trizol e tratado com DNAse I (Fermentas, Hanover, MD, USA),
segundo indicao do fabricante. A concentrao e pureza do RNA foram
determinadas por espectrofotometria, medindo-se a absorbncia em tampo TE (10
mM Tris-HCL, ph 8.0 e 1 mM EDTA) a 260 e 280 nm. O DNA complementar (DNAc)
foi sintetizado a partir do RNA total extrado (1,0 g), utilizando-se oligo(dt) e
transcriptase reversa (Fermentas, Hanover, MD, USA), conforme o seguinte
protocolo: incubao com o oligo(dt) a 25 C por 10 min, transcrio reversa a 37 C
por 1 hora e inativao por calor da transcriptase reversa a 95 C por 5 min no
termociclador Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany). Os valores relativos
amplificao do RNAm referente a cada gene estudado foram avaliados atravs da
mensurao da fluorescncia, quantificada por um termociclador e detector ABI
Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), comparando todas as
amostras e o controle em duplicatas. Aps padronizao da quantidade de DNAc e
da concentrao dos primers, as reaes foram realizadas em um volume total de
20 l, com 450 nM de primers e SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).
A beta actina foi selecionada como controle interno para corrigir a variabilidade nas
amplificaes. O DNAc foi amplificado em duplicatas nas seguintes condies: 1
ciclo a 50 C por 2 minutos e 95 C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos a 95 C por
15 segundos (desnaturao) e 60 C por 1 minuto (anelamento). Os valores de Ct
(threshold cycle) obtidos foram normalizados com o controle interno e a
quantificao relativa da expresso gnica foi expressa como induo em vezes e
determinada pelo mtodo do Ct como previamente descrito por Livak (1997).
3.9 Anlise estatstica
A significncia estatstica da diferena entre os valores mdios dos grupos para
qualquer parmetro foi testada pela anlise de varincia (ANOVA), seguida pelo ps
teste de Tukey ou Bonferroni. Os resultados foram expressos como mdia erro
padro da mdia (EPM). Para a realizao dos testes estatsticos, foi utilizado o
software Instat Instant Biostatistics e para a construo de grficos foi utilizado o
software Prism (ambos provenientes da GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
-
41
4 RESULTADOS
4.1 Avaliao da inativao isolada do 2A-ar na estrutura e fisiologia sseas,
caracterizando o fentipo sseo de camundongos 2AAR-/-
4.1.1 Massa corporal
A Fig. 3 mostra que os animais 2A-AR-/- apresentam massa corporal
significativamente menor (entre 9% a 14%) do que os animais selvagens, a partir
dos 65 at os 121 dias de idade.
Figura 3 - Massa corporal dos animais Selvagens (Selv) e 2A-AR-/-
30 37 44 51 58 65 72 79 86 93 100 107 114 12109
2A-AR-/-
Selv.
Idade em dias
12
14
16
18
20
22
24
26
Pes
o c
orp
ora
l (g
)12
0 d
ias
A medida da massa corporal foi iniciada quando os animais tinham 30 dias de idade, sendo pesados semanalmente. Todos os valores so expressos como mdia EPM (n=5-7 por grupo). p>0,05, xxp
-
42
Figura 4 - Parmetros cardacos dos animais Selvagens (Selv) e 2A-AR-/-.
0.00
0.25
0.50
0.75
Selv.
120 dias30 dias
(A)
2A AR-/-
60 dias
Idade
Mas
sa
mid
a d
oco
ra
o(g
/g.P
Cx1
00)
0.0
0.1
0.2
120 dias30 dias
(B)
60 dias
Mas
sa s
eca
do
cora
o
(g/g
.PC
x100
)
Idade
0.00
0.25
0.50
120 dias30 dias
(C)
60 dias
Co
nte
d
o d
e g
ua
do
co
ra
o(u
l/g
.PC
x100
)
Idade (A) Massa mida, (B) massa seca e (C) contedo de gua do corao em animais Selvagens (Selv) e 2A-AR
-/- de 30, 60 e 120 dias de idade. Os parmetros so expressos em g de corao/g de peso corporal x 100. O contedo de gua expresso em ul/g de peso corporal. Todos os valores so expressos como mdia EPM (n=4- 7 por grupo). p>0,05 e xp
-
43
Figura 5 - Composio corporal dos animais Selvagens (Selv) e 2A-AR-/-. Contedo
de gordura axilar e retroperitoneal.
30 DIAS 60 DIAS 120 DIAS0.00
0.05
0.10
0.15 2A-AR-/-
Selv.
Idade
Pes
o d
a G
ord
ura
Axi
lar
(g/g
.PC
x100
0)
30 DIAS 60 DIAS 120 DIAS0.0
0.1
0.2
(B)
Idade
Pes
o d
a G
ord
ura
Ret
rop
erit
oni
al(g
/g.P
Cx1
000)
Todos os valores so expressos como mdia EPM (n=4-7 por grupo). Os pesos da gordura retroperitoneal e axilar referem-se ao peso mido e so expressos em g de gordura/g de peso corporal x 100. p>0,05 e xp
-
44
Tabela 2 - Massa Muscular do Extensor Longo dos Dedos, Gastrocnmio e Reto. Femoral de Animais selvagens e 2A-AR
-/-. Idade 30 dias 60 Dias 120 Dias
Selv 2A-AR-/- Selv 2A-AR
-/- Selv 2A-AR-/-
ELD MS 0,010,0008 0,010,001 0,010,0008 0,010,0003 0,010,001 0,010,0008
MU 0,020,04 0,010,001 0,0290,002 0,0280,002 0,030,003 0,020,001
cH2O 0,0090,001 0,0090,001 0,020,001 0,010,003 0,010,001 0,0090,001
Gastro MS 0,110,01 0,080,009 0,160,003 0,160,01 0,160,003 0,150,004
MU 0,340,008 0,290,03 0,560,02 0,540,03 0,560,02 0,530,02
cH2O 0,240,01 0,240,02 0,340,01 0,340,01 0,30,007 0,30,012
Reto MS 0,070,008 0,070,01 0,090,002 0,080,002* 0,100,003 0,100,002
UM 0,240,02 0,250,03 0,330,008 0,290,01** 0,380,02 0,360,005
cH2O 0,110,007 0,140,01 0,170,003 0,150,004** 0,180,013 0,170,003
ELD = extensor longo dos dedos, Gastro = gastrocnmio, Reto = reto femoral, MS = massa seca, MU= massa mida. A MS e MU do Gastro e ELD foi expressa em g/comprimento da tbia em mm x 100. A MS e MU do Reto foi expressa em g/comprimento do fmur em mm x 100, cH2O = contedo de gua (ul/g.PC). p>0,05, *p
-
45
4.1.6 Comprimento do fmur e da tbia
A Fig. 7 mostra que o comprimento do fmur dos animais 2A-AR-/- menor do
que o dos animais selvagens durante todo o perodo estudado. Aos 30, 60 e 120
dias de idade, o comprimento do fmur dos animais 2A-AR-/- se mostrou 14%
(p
-
46
4.1.7 Microtomografia computadorizada em 3D: anlise do osso trabecular da
metfise distal do fmur
Atravs da microtomografia computadorizada em 3 dimenses da metfise
distal do fmur, observamos que no houve diferena significativa entre os animais
selvagens e 2A-AR-/-, em todas as idades avaliadas (30, 60 e 120 dias), em nenhum
dos parmetros sseos analisados.
Figura 9 Anlise por CT da Metfise Distal do Fmur de Camundongos Selvagens e 2A-AR
-/-.
0
5
10
15Selv.2A AR
-/-
(A)
BV
/TV
(Fm
ur)
0
25
50
75
Tb
.Th
(Fm
ur)
(B)
0
25
50
75
Tb
.Sp
(Fm
ur)
(C)
0.000
0.001
0.002
0.003
(D)
Tb
.N(F
mu
r)
0.000
0.025
0.050
(E)
TB
/PF
(Fm
ur)
0
1
2
3S
MI
(Fm
ur)
(F)
0
1
2
3
120 dias30 dias 60 diasIdade
DA
(Fm
ur)
(G)
0
50
100
120 dias30 dias 60 dias
Idade
(H)
Po
rosi
dad
e(F
mu
r)
0.00
0.05
0.10
120 dias30 dias 60 diasIdade
(I)
BM
D(F
mu
r)
A anlise foi feita da metfise distal do fmur de camundongos fmeas de 30, 60 e 120 dias de idade..(A) BV/TV = volume sseo/volume trabecular. (B) Tb.Th= espessura trabecular. (C) Tb.Sp= separao entre as trabculas. (D) Tb.N= nmero de trabculas (E) TB/PF= Fator de padro do osso trabecular. (F) SMI= ndice de modelo estrutural. (G) DA= Grau de Anisotropia. (H) Porosidade. (I) BMD= Densidade Mineral ssea). Todos os valores so expressos como mdia EPM (n=4-7 por grupo). As comparaes estatsticas foram feitas entre animais Selvagens (Selv) vs. 2A-AR
controles. p>0,05.
-
47
4.1.8 Microtomografia computadorizada em 2D: anlise do osso cortical da difise do
fmur
Atravs da microtomografia em 2 dimenses da difise do fmur, observamos
diferenas significativas apenas aos 30 dias de idade, sendo a rea medular, o
permetro do endsteo e a porosidade da cortical nos animais 2A-AR-/- foram 43%
(p
-
48
4.1.9 Microtomografia computadorizada em 3D: anlise do osso trabecular da quinta
vrtebra lombar
Atravs da microtomografia em 3 dimenses, observamos maior nmero de
trabculas (41%, p
-
49
4.1.10 Microtomografia computadorizada em 2D: anlise do osso cortical da quinta
vrtebra lombar
Atravs da microtomografia computadorizada em 2D do osso cortical da
quinta vrtebra lombar, observamos que no houve diferena significativa entre os
animais KOs e selvagens em nenhuma das idades estudadas (Fig. 12)
Figura 12 Anlise do osso cortical da vrtebra L5 por microtomografia
computadorizada em animais Selvagens (Selv) e 2A-AR-/-.
0
250
500
750
Selv.2A AR
-/-
re
a p
eri
stic
a(T
.Ar)
Vt
ebra
(A)
0
5
10
15
Per
met
ro d
op
eri
steo
(T
.Pm
)V
rte
bra
(B)
0
250
500
re
a d
a co
rtic
al(B
.Ar)
Vr
teb
ra
(C)
0
10
20
30
40
re
a m
edu
lar
(T.A
r-B
.Ar)
Vr
teb
ra
(D)
0
1000
2000
3000
(E)
Per
met
ro d
oen
d
steo
(B.P
m-T
.Pm
)V
rte
bra
0
25
50
75
Esp
essu
ra d
aco
rtic
al (
Ct.
Th)
Vr
teb
ra
(F)
0.0
0.1
0.2
0.3
60 dias 120 dias30 dias
Po
rosi
dad
e d
aco
rtic
al (
Po)
Vr
teb
ra
Idade
(G)
0
1
2
60 dias 120 dias30 dias
BM
DV
rte
bra
Idade
(H)
A anlise foi feita no corpo vertebral de L5 de camundongos fmeas de 30, 60 e 120 dias de idade. (A) rea Peristica. (B) Permetro do Peristeo. (C) rea da Cortical. (D) rea Medular. (E) Permetro do Peristeo. (F) Espessura da Cortical. (G) Porosidade da Cortical. (H) Densidade Mineral ssea. Todos os valores so expressos como mdia EPM (n=4-7 por grupo). p>0,05
-
50
4.1.11 Teste biomecnico do fmur e tbia
No observamos diferenas significativas nos parmetros biomecnicos do
fmur dos animais KOs quando comparados aos animais selvagens em nenhuma das
idades avaliadas (Fig. 13).
Figura 13 Parmetros biomecnicos determinados no fmur de animais Selvagens (Selv) e 2A-AR
-/-.
0
10
20
Selv.2A AR
-/-
(A)
30 dias 60 dias 120 diasIdade
Car
ga
mx
ima
(N)
Fm
ur
0
5
10
(B)
Mo
do
el
stic
o(N
/mm
)F
mu
r
30 dias 60 dias 120 dias
Idade
0.0000
0.0025
0.0050
120 dias30 dias
(C)
60 diasIdade
Ten
acid
ade
(J)
Fm
ur
Parmetros obtidos atravs do teste de flexo de trs pontos. A anlise foi feita em camundongos fmeas de 30, 60 e 120 dias de idade (A) Carga mxima. (B) Modo elstico. (C) Tenacidade ssea. Os valores so expressos como mdia EPM (n=4-7 por grupo). p>0,05.
A avaliao dos mesmos parmetros biomecnicos na tbia evidenciou
diferenas significativas entre os animais KOs e selvagens controles, sendo
observada uma menor carga mxima (19%, p
-
51
Figura 14 Parmetros biomecnicos determinados na tbia de animais Selvagens (Selv) e 2A-AR
-/-.
0
10
20
Selv.2A AR
-/-
(A)
30 dias 60 dias 120 diasIdade
Car
ga
mx
ima
(N)
Tb
ia
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
(B)
