Gehaltener Vortrag Grundlagen Der HPLC 06.Bis 08.04

JR/parameter der hplc

Gleich gehts loos!

Grundlagen der HPLCBerlin, 11. 13. Oktober 2010

JR/parameter der hplc

Band I, II

t0, tR

Parameter der HPLCH, N k RJR/ parameter

ChromatographieChromatographie ist ein physikalisches Trennverfahren, bei dem die Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer mobilen und einer stationren Phase geschieht.Rmpp Multimedia Viewer, Version 2.00

JR/basics

VerteilungsmodellDer chromatographische Vorgang lt sich mit der Verteilung bei der Flssig-Flssig-Extraktion vergleichen:

kblau =

6

kgelb = 4

Phasentrennung

Trennfaktor = k1 / k2> 100 Ausschtteln < 100 PerforationJR/basics

k

ExtraktionstechnikenK1 K2 K 100 Ausschtteln Schttel (Scheide -) trichter K < 100 Kontinuierlich mit Perforatoren muss stets so gewhlt werden, da 1 ist =

24 6

Chromatographische Interaktionen

K = cstat / c mob = 1,5 Injektion Interaktion Peak broadening getrennte Peaks

Parameter der HPLCTotzeit = t0 (Def.)

Retentionszeit = tR

Retentionsfaktor(Kapazittsfaktor k)

kk2 k1 t R 2 t0 t R1 t0

=

t R t0 t0 2

Trennfaktor

(Selektivittsfaktor)

=

=

Efficency

(Trennstufenzahl)

tR N =5,5 4 wo,5

Resolution(Auflsung)

1 R= 4

k 1+ k

( a 1)

NJR/basics

Optimised Application

JR/basics

Who is who?

mAU

Standard

Time [min]

Bei gleicher Retentionszeit im identischen chromatographischen System kann eine Identifizierung der Analyten erfolgen (auch durch Aufspiken) _ Gleiche Flchen = gleiche Konzentration!

JR/basics

Grundlagen der HPLC

RetentionJedem Elutionsvolumen einer Komponente entspricht bei gegebener Flurate eine Retentionszeit tR. Erhhung der Flurate kann also die spt eluierenden Analyten nach vorne holen Nachteil: Druckerhhung(kann Pumpenbereich berschreiten oder der Sule schaden)

Verlagerung in ungnstigere Bereiche der vanDeemter - Gleichung

JR/basics

RetentionsfaktorKapazittsfaktor

k ( A)

t R ( A) t R ( A) t0 = = t0 t0

Ma fr die Strke der Wechselwirkung einer Substanz mit der stationren Phase in einem gegebenen chromatographischen System K < 1 ergibt ungenaue Ergebnisse K = 2 6 ist erstrebenswert Erlaubt den direkten Vergleich zweier Analyten in einem gegebenen chromatographischen SystemJR/basics

TrennfaktorSelektivittsfaktor

t R ( B) k ( B) = = t R ( A) k ( A)Ma fr die Trennfhigkeit eines gegebenen chromatographischen Systems fr zwei Substanzen

> 1 ist erforderliche Trennbedingung

JR/basics

Grundlagen der HPLC

Das allgemeine Elutionsproblem

G.Aced, H. Mckel, Liquidchromatographi Liquidchromatograph

Grundlagen der HPLC

GAUSS - Funktion

WP1 - WP2 = 2 0,5 = (8 2) 0,5 2,354 y = y0 y0 exp [(xx- )20)/ ] / y = exp [(x - 0 x ] 2 2 2 = = 4 JR/basics

TRENN - STUFENZAHLEinsteinsche Diffusionsgesetz 2= 2 *D *t (mittleres Verschiebungsquadrat identisch mit der Varianz der Gaussverteilung) Wenn der austretende Peak im Detektor erkannt wird, hat er die Varianz 2 und die WP-Breite 2 Die Peakvarianz 2pro Einheitslnge wird als Bodenhhe H bezeichnet (engl. HETP) und ist ein Gtemass fr die Effizienz einer Sule. H = 2 / L Bezglich der Hhe einer Trennstufe und der Anzahl N / Sule gilt N * H = L bzw. N = L2/ 2 . Der Peak bentigt fr das Durchlaufen einer Sulenlnge L die Zeit tRund fr den Weg (1/2 WP) die Zeit t. N = (tR / t ) 2 bzw. N = 16 (tR / w0,5 )2 = 5,545 * (tR / b0,5 )2JR / Parameter der HPLC

Korrelation zwischen Sulenlnge, Trennstufenzahl und KorngreSulenlnge [mm] 10 m 250 125 60 30 18 000 9 000 4 500 Theoretische Trennstufenzahl [N / m] Partikelgre 5 m 36 000 9 000 4 500 3 m 72 000 18 000 9 000 sub 2 144 000 72 000 36 000 18 000

18 000

36 000

2 250

J. Reusch

Das Prinzip

Eddy Diffusion(Mehrwegeffekt)

AU

HM = 2 dpmin

40 m 1 km 10 cmJ. Reusch

PEAHM = 2dP2 dP HL = DM

Hmob

2 dP = DM

MehrwegeffJR / basics

Hstat

c d2 f = DS

Van Deemter-FunktionAlle Varianzen sind additiv und es resultiert dieVan Deemter-Funktion Gesamtbodenhhe:

H ges = H M + H L + H mob + H stat

B H ges = A + + C JR/parameter der hplc

Grundgleichung der HPLC

rot: grn: rosa: blau:

Van Deemter-Kurve Stoffaustauschphnomene Lngsdiffusion Eddy DiffusionJR / basics

Peaksymmetrie

fT < 1 fronting (leading) fT > 1 tailing USP Waters blich 5% 2,5 % 10 % Sulenqualitt berladung Totvolumen Chemisches (thermodynamisches) Tailing

Ursachen:

JR / /basics JR basics

Peaksymmetrie

T = b0,1 / a0,1

f

T = w 0,05 / 2

Definition nach USPJR / basics

Peak Asymmetry FactorA10 = Peak Asymmetry Factor at 10% peak height

A= b / ab = 0.1948 min a = 0.1552 min a b

A = 1.255

Trennstufen (Plate Count)JP ( Japanese Pharmacopoeia )tR = 3.405 min Pw50% = 0.0937 minPeakweite bei 50% Peakhhe

N = 5,545 * (tR / b0,5 )2

N = 7320.6 plates

JR / basics

Trennstufen (Plate Count)EP ( European Pharmacopoeia )tR = 3.405 min Pw50% = 0.0937 minPeakweite bei 50% Peakhhe

N = 5,545 * (tR / b0,5 )2

N = 7307.5 plates

JR / basics

Grundlagen der HPLC

Poor Peak Shape

Plugged Frit or Bad Injector?

Auflsung (Resolution)1 RS = 4

1 k N , k +1,

Theoretische Bodenzahl (Efficiency) N Trennfaktor (Selektivitt) Retentionsfaktor (Kapazitts-) k

Resolution (R)

Efficiency Retention Selectivity

Grundlagen der HPLC

Auflsung (Resolution)R = 1,19 [(tR2 - tR1 ) / (w1/2 1 + w1/2 2)] R = 1/4 ( 1) ( ) 1/2 ( / 1 + ) = 1,01 R = 1,0 N = 163000 R = 1,5 N = 367000 = 1,10 R = 1,0 N = 3700 R = 1,5 N = 8400

Grundlagen der HPLC

Peakabstand in

a) Peakabstand (tR) entspricht 8

, ) 1 0, )

. 5 , 2 % ,

)

. 4 ,

G. Aced, H. Mckel, Liquidchromatographie

Grundlagen der HPLC

Trennungsqualitta) b) c) Die Trennung ist zu gut Optimale Basislinien-Trennung berlappende Peaks

d) Entspricht a), jedoch bei 2,5facher Breite der Peaks ( = 40 % Hhe) e)Entspricht b), jedoch greres ) ), ) = !

G. Aced, H. Mckel, Liquidchromatographie

Welche Parameter sind zu bercksichtigen ?

1 RS = 4

1 k N , k +1,

Theoretische Bodenzahl N (Efficiency) Trennfaktor (Selektivitt) Retentionsfaktor (Kapazitts-) k

JR / basics

OptimierungsparameterRs = N (-1) [ k/(1+k)]N = Trennstufenzahl = Trennfaktor k = Retentionsfaktor Stationre Phase-var.

Solvent Solvent variable variableJR / basics

Column Column variable variable

Retentionsfaktor

Trennstufenzahl

0

5

10

Trennfaktor0

Ausgangssituation

5

10

Resolution (R)Initial Separation

Vary k

Vary N

Vary

timeL.R.Snyder, J.J. Kirkland, Modern Liquid Chromatography

Resolution1 RS = 4

1 k N , k +1,

Theoretische Bodenzahl (Effizienz) Nkleine Partikel, gute Packung, lange Sulen, geringes Totvolumen

Trennfaktor (Selektivitts-) Eigenschaft des Trgermaterials

Retentionsfaktor (Kapazitts-) knderung des Eluenten, des pH-Werts, der stationre Phase

Grundlagen der HPLC

Ermittlung der optimalen chromatographischen ParameterAuflsung*

Geschwindigkeit** ... Sulenlnge, Flow, Trennstufenzahl **...Sulenquerschnitt (---> ermittelt d. Beladungsstudien)

Beladung**

Die Trennsule

JR/column hardware

Grundlagen der HPLC

Konstruktion von Trennnsulen (1)

Grundlagen der HPLC

Konstruktion der Trennsule (2)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0

Sulenrohr Trgermaterial M6 x 0,35 Abschluschraube Sieb / Filter - Kombination PTFE-Dichtring Fitting Schneidring Kapillarrohr Verschraubung

1 0

2

3

4

5 6

7

8 9

Abschlsse von Trennsulen

Grundlagen der HPLC

1 9

2

3 4 5

6

8 7

Gewindeverbindung1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sulenrohr Trgermaterial Abschluschraube Sieb / Filter - Kombination PTFE-Dichtring Fitting Schneidring Kapillarrohr Verschraubung

Klemmringverschraubungen swagelock

Grundlagen der HPLC

Konstruktion der Trennsule (3)

Grundlagen der HPLC

Konstruktion der Trennsule

male und female Anschlsse fr 1/16 Kapillare und UNF 32 Verschraubungen

Grundlagen der HPLC

Konstruktion von Trennsulen (4)

Vorsulen- / Hauptsulen-Kopplung

Grundlagen der HPLC

1Kombination v. Kopplungs2u.Abschluschraube fr 3 Vorsule 10 mm 4 Vorsule 20 mm 5 Verbinder 6 Hauptsule

Vorsulen- / Hauptsulen-Kopplung

Grundlagen der HPLC

Direktkopplung Sulenkopplung

stand alone unit

Spacer fr 5 u. 10 mm Vors.

Vorsulenkopplung

Grundlagen der HPLC

Vors.allein Vorsule 10 x 4,0 mm

Hauptsule ohne VS

Hauptsule mit VSJR/basics

110749 99 203 99 203

111776JR/basics

110749 99 203 99 203

111776JR/basics

Kompatibilittsprobleme

JR/basics

Kompatibilittsprobleme

JR/basics

Totvolumen bei KapillarverbindungenM6 x 1,0 10-32 UNF

Grundlagen der HPLC

10-32 UNF

Unterschiede in Ferrulekonus (lnge) Gewinde (Art, Lnge)10-32 UNF

NIE fertige Kapillarverbindungen benutzen! Stets auf Typenreinheit achten!

Shimadzu HP Beckmann Waters Hitachi Varian

J. Reusch

Anschlussschrauben Ferrules

Waters Swagelock

Uptight Valco

Parker

Rheodyne

J. Reusch

Grundlagen der HPLC

Vergleich unterschiedlicher TrennsulenDurchmesser

HP - Application of narrow bore columns

Eco Glass Columns lab scale i.d. 10 / 15 / 20 / 25 / 32 / 50 mm length 120/200 / 450 / 750 / 999 mm pressure rating 10 - 30 bar (350 psi, depending on diameter) competitive pricingRf.: Katalog YMC Europa GmbH

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Stationre Phasen

Die Struktur von KieselgelDie Hydrolyse von Silikaten fhrt primr zur Bildung von Orthokieselsure Si(OH)4, die intermolekular Wsser abspaltet:

Die Polykondensation fhrt ber Polykieselsuren H2n+2SinO3n zur Bildung von Metakieselsuren H2SiO3, die bei n = 3 - 6 als Ringe, bei > n als Ketten vorliegenHollemann-Wiberg, Lehrbuch d. anorg. Chemie

TechnologieLudox emulgiert mit Formaldehyd und Harnstoff in Harz eingebettet, Veraschung bei 500C H OH2 O

d Techn. 975)

Siloxanbildung bei > 200C erfordert Rehydroxylierung (H+) OH HO

Si(OEt)4 wird Si - O -saurer Hydronach Si - O as / Unger) lyse und erfolgter Gelbildung in NaOH digeriert ( ) sion in langk., aliph. Alkohol O durch H2O-Entzug ein Gel, das H2O nach Temp. behandlg. und NH4Si - O - Si - O Zusatz reiftJR/basics

Particle shape

JR/basics

Grundlagen der HPLC

Porenbildung

Schematische Darstellng der Gelbildung aus (I) nichtaggregierten (II) aus teilaggregierten Solen

Large Pore Silica: Silica 4000 dp = 10 m

Foto: Photo: K. Unger, Porous Silica

Vergleich unterschiedlicher Porenweiten

Trennung eines Peptides auf Butylphasen: bei gleichen chromatographischen Bedingungen werden mit 120 A erreicht: * schmalere Peaks * dadurch bessere AuflsungJR/basics

Vergleich unterschiedlicher PorenweitenAuswahl an angebotenen Porendurchmessern [] darunter zugehrige Oberflchenwerte [m2/g]60 120 300 200 200 300 150 1000 10 bis zu 4000 ~3 [m2/g]

Einflu auf die Retention:Wegen mit zunehmender Porenweite abnehmender Oberflchen sinkt die verfgbare Kontaktflche und damit die Intensitt der Wechselwirkung die Retentionszeiten werden krzer

Einflu auf die Bodenzahl:In den groen Poren sind die Diffusionswege fr eine Probenkomponente lnger, deshalb nimmt die Bandenverbreiterung zu und die Bodenzahl ab

JR/basics

KorngrssenverteilungKorngrssenanalysen: Sieben,Sedimentieren, Windsichten, Light scattering, Coulter Counter

Zertifikat fr Bulk - Materialien:10 % des Silicagels sind kleiner als 3,5 m 50 % dfes Silicagels sind kleiner als 5,0 m 90 % des Silicagels sind kleiner als 6,2 m dp90 / dp10 soll ca. 1,5 - 2,0 betragen : hier 1,77

dp - Werte sollen sich zwischen dem 0,5- un 1,5-fachen von dp50 bewegen! (2,5 bzw. 7,5 m)

JR/basics

Column pressure as a function of particle size distributionIncrease in pressure [%}

200 150 100 50 0 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 particle size [m]

Grundlagen der HPLC

Derivatisierung auf der KieselgeloberflcheI. Si - O - C Brush N Si-C polymer

II. Si - N - C Brush

III. Si - C monomer

JR

JR/basics

Wechselwirkungsmechanismen

JR/chrom. interaction

Size Exclusion Chromatography (SEC)Solvens

verfgbare Porengre 30 7 60 36 100 68 120 180 200 300 1000 3000 4000

Analyt Glucose Myoglobin Hmoglobin Ribosome

MG Molekldurchmesser 189 D 16 000 D 65 000 D 28 000 000 D


Size Exclusion Chromato (SCE)Standard - MixAusschluss vollstndige Penetration der Poren

Eichgeradelg M = A - BVE

Unbekannte Probe


Wechselwirkungen

polar . unpolar

hydrophil

Tensid hydrophob

Micelle

lsliches ltrpfchenin polarer UmgebungChrom.interact,. J.Reusch

Grundlagen der HPLC

Normal PhaseOberflche des KieselgelsH isolate H O H O O geminale H O H O vicinale H O s iloxane O H

HO O Si O O Si O O Si O Si O O Si O Si

H

Si O Si

O

Si O

O

Si O

O

Si O

O

Si

O

Si

O

Si

JR


Grundlagen der HPLC

Normal PhaseVerschiedene Silanol-Gruppen an KieselgeloberflcheH O O H O H O

HO

H

isolatet, free silanol-groups

vicinale silanol-groups

H O H O Sigeminale silanol-groups

H

O

H O

HO

H

hydrogenbonding (silanol - water)JR/chrom. interaction

JR

H O Si O Si O O

Normal Phase ChromatographyH middle HChlor - heptane

Wechselwirkungen an der Kieselgeloberflche

O very strong

Brom - heptane Jod - heptane

FeO Si O O H

Chlor - hexane

CH3

- -+ H + O

Chlor - heptane Chlor - octane

XH H H H H / / / / / O O O O O l O l l l l Si Si Si Si Si H / Si

l


Normal PhaseSeparation von Isomeren

NH2 NH2NH

NH2

2

OH Si

O Si

OH

ortho - meta - para - DAB


Normal Phase

Normal Phase bietet berragende Mglichkeiten zur Isomerentrennung o - Dibrombenzol / p -Dibrombenzol 3,3`- Dichlordiphenyl / 4,4`- Dichlordiphenyl Pyridazin / Pyrazin = 2,0 = 6,7 = 74,0

N N t Pyridazin = 74 x t Pyrazin

N

N

JR/basics

Wassergehalt im Eluenten

45 ppm 35 ppm

1 Inertpeak 2 Benzol 3 Naphthalin 4 Diohenyl 5 Anthracen 6 Pyren 7 Fluoranthracen 8 1,2 - Benzanthracen 15 ppm

Nach H. Engelhardt, Hochdruck-Flssigkeits-Chromatographie, 2.Auflage, S.120

Trennverhalten unterschiedlicher polarer Materialien

Grundlagen der HPLC

Column: Eluent: Flow rate: rate:

250 x 4 mm ID THF / n-Heptane (15 / 85) 2 ml / min

1. Toluene 2 Acetophenone 3 Phthalic acid dimethyleester 4 Benzanilide 5 Benzylalkene 6 Cinnamylalkene

a) Aminopropyl-

b) Cyanopropyl-

c) Silica

Reversed PhaseDerivatisierung - mgliche Reaktionen an Silika

H H Si O Cl CH3 Si CH3 C18 H37 Si O

CH3 Si CH3 +H Cl C18 H37


Reversed Phase ChromatographieOberflche von Kieselgelderivaten

CH3 CH3- Si- CH3 O Si O Si O Ca2+ O H O Si O Si O O CH3- S i-CH3 O Si O Si O O ** Al O Si O CH3- Si-CH3 O O Si O Si O O CH3- Si- CH3 O Si O Si

unpolare (z.B. C18) Regionen

Kieselgelmatrix polare Zentren (Restsilanolgruppen oder Metallatome)


Wechselwirkung im RP - Mode

Aus ICT-Handbuch Probenvorbereitung Rf.: Katalog YMC Europa GmbH

Wechselwirkung mit silanolen Restgruppen

Aus ICT-Handbuch Probenvorbereitung

Rf.: ICT, Festphasenextraktion

Selektivittsvergleich C18-Phasen

YMC Jsphere ODS YMC JsphereH80 Symmetry C18Inertsil ODS

YMC ProC18 Zorbax ODS Inertsil ODS2 YMC ODS-A YMC ODS-AM YMC ODS-AQ Nucleosil 120 C18 Luna C18 (2) Waters Spherisorb ODS 2 Zorbax Extended C18 Zorbax Rx C18 Hypersil BDS C18 YMC Jsphere ODS M80 XTerra MS C18 Hypersil ODS

Eluent:

Methanol H2O (90:10) Probe: Dimethylphthalat Toluol Biphenyl Phenanthren

Mit freundlicher Genehmigung von Hichrom Limited

Wechselwirkungenpolar . unpolar

hydrophil

Tensid hydrophob

Micelle

lsliches ltrpfchenin polarer UmgebungJR/chrom. interact,.

Struktur und Polaritt

H

Si OA pH ~ 2,0 4,5 pH ~ 5,0 - 7,4 pH ~ 8,0 10

Si OB

+

H

+

A A B BJR/chrom. interaction

Struktur und PolarittH+ O +

Si H (CH2)n

NH

+

H

H

Si (CH2)n NH

+

H H


Wechselwirkungen(Mesomerie)


Mesomerie

H C H C C H H C C

H H


Wechselwirkungen und Trennungmobile Phase C18 - Kette stationre Phase SiO2 - Basis

Solvophobe LC ( HILIC , HIC)


Polar Endcapped / Embedded Phases

Phenomenex, Technical Data Sheet, April 2003

Hydrophobe Phasefr wssrige Eluenten

Wegen geringer sterischer Hinderung der C12-Liganden wird eine hohe Belegungsdichte erreicht => hohe Hydrophobizitt

Phenomenex, Technical Data Sheet, April 2003

Polar / Hydrophilic Endcapping

Fr extrem polare Proben in 100 % wssrigen mobilen PhasenPhenomenex, Technical Data Sheet, April 2003

Beeinflussung der Retention an Kieselgel / Dichlormethan (oben) und am System RP / Methanol/Wasser - Gemischen (unten)

CH2Cl2+ AcCN

CH2Cl2

CH2Cl2 + n-Heptan

Polaritt unterschiedlicher TrgermaterialienNormal Phases (NP) Aluminiumoxid, Kieselgel funktionelle gruppen: Hydroxyl-, Lewissure und -basezentren

CH3OH / H2O 80 : 20

CH3OH / H2O 50 : 50

CH3OH / H2O 30 : 70

Polar Bonded Phases (PBP) funktionelle Gruppen: NH2, Dio, CN, NO2 Reversed Phases (RP) funktionelle Gruppen: n-Alkylund Aryl - Liganden abnehmende Polaritt

t0

tR

tJR/chrom. interaction

Sorbens- / Isolat Wechselwirkungen1. Unpolare Wechselwirkungen Retention:Lsungsmittel

2.Polare Wechselwirkungen(H-Brckenbindungen, Dipol - Ww., Pi-Pi-Bindungen (O, N - haltige Ana-lyten)

(V.d.Waals-, Dispersionskrfte)unpolarer Analyt auf unpolarem Sorbens (C18) polare

Lsungsmitteln

Retention: Elution:

aus unpolaren

Reinigung:

unpolarer

Elution:

zunehmend

mit LM mit zuneh-mend polarem Charakter, ggf. Erhhung der Ionenstrke Zucker, Afla-toxine, Vitamine (wasserlsliche), Aminosuren, Lipide, Alkohole

Charakter

Anwendung:

Umweltapplikationen-unselektiv (Gruppenanalytik), Pestizide, Herbizide, PCBs, PAHs, Drogen

Anwendung:


Ionische Wechselwirkung

Retention aus a)LM geringer Ionenstrke b)pH - Einstellung

Elution aus a)durch LM hoher Ionenstrke b)durch Neutralisation des Sorbens

Ref: ICT GmbH, Handbuch, 1993

IonenaustauschChromatographie

primre u. sekundre Wechselwirkungen

Anionen-Austausch

Kationenaustausch

NR3+ OH-

JBrr Cl-

Na+

SO3-H+ SO3-H+ SO3-H+ SO3- H+

NR3+ OHNR3+ OH-

Li+ K+

NR3+ OH-

NO3-

Cs+


Ionenausschluss-ChromatographieCH3COO Cl -

negativ geladene GrenzschichtRef.: Mckel, Liquid-Chromatographie

Sorbens- / Isolat Wechselwirkungen3. Ionogene Wechselwirkungen(Ionische Zentren, elektrostat. Krfte) Kationenaustausch: Sorbens - / Analyt + Anionenaustausch: Sorbens + / Analyt Retention: aus Lsungsmitteln geringer Ionenstrke bei pH Werten, die Analyt oder Sorbens ionisch vorliegen lassen (verd. NaOH resp. HCl) (=> NICHTionisches Vorliegen Analyt / Sorbens!) 0,1 M Pufferlsungen (Acetat, Carbonat, Phosphat) zunehmende Ionenstrke (organ. Ionen resp. Suren) nderung von pH - Wert und Ionen-Typ Aminosuren, (Catechol-)Amine, Hormone, Purine

Reinigung: Elution: Anwendung:


Grundlagen der HPLC

WechselwirkungenBindungsenergien der WechselwirkungenBonding Energy [kcal / mol) c o v a le n t 10 0

i o n ic

50

10

d is p e r s io n

d i p ol e - in d uc e d d ip ol e

d i p ol e - d i p ol e h y d ro g e n b o n d Type of Interaction


Beeinflussung der Retention an Kieselgel / Dichlormethan (oben) und am System RP / Methanol/Wasser - Gemischen (unten)

CH2Cl2+ AcCN

CH2Cl2

CH2Cl2 + n-Heptan

Polaritt unterschiedlicher TrgermaterialienNormal Phases (NP) Aluminiumoxid, Kieselgel funktionelle gruppen: Hydroxyl-, Lewissure und -basezentren

CH3OH / H2O 80 : 20

CH3OH / H2O 50 : 50

CH3OH / H2O 30 : 70

Polar Bonded Phases (PBP) funktionelle Gruppen: NH2, Dio, CN, NO2 Reversed Phases (RP) funktionelle Gruppen: n-Alkylund Aryl - Liganden abnehmende Polaritt

t0

tR

t

Polare Wechselwirkung

Retention aus unpolarer Umgebung

Retention aus polarer Umgebung

Ref: ICT GmbH, Handbuch, 1993

Die Retention polarer AnalytenProbleme bei der RP-HPLC: polare Analyten werden kaum retardiert und daher auch nicht separiert der hohe Wassergehalt im Eluenten erschwert die Verdampfung fr die MS-Detektion Probleme bei der NP-HPLC: polare Analyten sind in typischen unpolaren Lsungsmitteln nur schlecht lslich Benzol und Toluol sind nicht kompatibel mit der MS - Detektion

Reversed Phase TrennsystemEine stationre Phase mit C18-Liganden wirkt nur dann als C18 - Medium, wenn der Wasseranteil im Eluens gering ist Die entfalteten, beweglichen Liganden bieten eine groe Kontaktflche fr eine Wechselwirkung Hohe Wassergehalte fhren zum Kollaps der C18-Liganden, sie wirken wie ein dnner Alkanfilm die Hydrophobie sinkt drastisch, die Kontaktflche wird in dieser Situation sehr klein Der polare Durchgriff bewirkt verstrkt zustzliche Interaktionen

Konditionierung

C18 Ketten in polarer Umgebung

C18 Ketten in mittelpolarer Solvathlle (MeOH)

Benetzung der Oberflche des Sorbens mit mittelpolarem Lsungsmittel schafft die Voraussetzung fr eine Retention des AnalytenRef: ICT GmbH, Handbuch, 1993

Affinity Chromatography

Immobilisierte Liganden u.a. Proteine A oder G, Heparin, IgM, AKs Elution mit z.B. steigender Ionenstrke, Lsung des immobilisierten Liganden oder via pH - nderung

Die Elution

JR/elu

Grundlagen der HPLC

Isokratische Elution

Einfach und reproduzierbar Geringere Dokumentation (Datenumfang) Preiswertes Equipment Keine Equilibrierung zwischen den Lufen Mglichkeit der berlappung von Lufen Weiter k - Bereich, langsame Trennung Grere Peakbreite, ProduktverdnnungJR/elution

Grundlagen der HPLC

EluensgradientenNiederdruckgradienten: Preiswertes Equipment Keine Probleme mit Volumenkontraktion Langsame nderung der Zusammensetzung bei steilen Gradienten Hochdruckgradienten: Teueres Equipment ( n LC - Pumpen) Volumenkontraktion wirkt sich aus Entgasung der EluentenJR/elution

Gradientenverlauf (RP Mode)

120

Anteil B [%]

100 80 60 40 20 0 0 2 4 0 5 [min] 16 [min] 18 18,1 30 4012 50 14 60 8 10 12 t 6 8 10 t

Zeit 0 4 8 10 12 16

%B 15 15 100 100 25 25

JR/elution

Grundlagen der HPLC

GradientenelutionVorteile: Trennung von Verbindungen mit groen Polarittsunterschieden schmale Peaks, hhere Nachweisempfindlichkeit spt eluierende Peaks werden erfat On column Anreicherung bietet Mglichkeit der Probenanreicherung (=> semiprparative Trennung)

JR/elution

Grundlagen der HPLC

Kontinuierlicher Gradient

Vorteil: Bessere Peakform, geringerers Tailing Bessere Auflsung in krzerer Zeit Einfacheres Entfernen von Verunreinigungen Nachteil: Equilibierung zwischen Lufen notwendig Eluentenkomponenten knnen entgasen

JR/elution

Beeinflussung der Retentionszeit

Trennung von Benzoesure estern 1-5, Isokratisch 50/50 Gradient 50 100 AcN / WasserJR/elution

Grundlagen der HPLC

Temperaturgradienten

Weniger bedeutsam im Vergleich zur Gaschromatographie, da die Zahlenwerte fr die Freie Enthalpie erheblich kleiner sind. Wichtiger in der LC ist die Konstanz der Temperatur: Will man Retentionszeiten besser als 1 % reproduzieren, mu auf besser als 0,5 C thermostatisiert werden!

JR/elution

Flugradienten

Grundlagen der HPLC

Jedem Elutionsvolumen einer Komponente entspricht bei gegebener Flurate eine Retentionszeit tR. Erhhung der Flurate kann also die spt eluierenden Analyten nach vorne holen Nachteil: Druckerhhung(kann Pumpenbereich berschreiten oder der Sule schaden)

Verlagerung in ungnstigere Bereiche der vanDeemter - GleichungJR/elution

Grundlagen der HPLC

Sulen- und PuffererwrmungHhere Temperaturen ermglichen

Verbesserte Effizienz Hheren Durchsatz Hhere Lslichkeit Regionale Selektivittsunterschiede Bessere Reproduzierbarkeit

JR/elution

Die mobile Phase

JR/solvents

Grundlagen der HPLC

Wahl der mobilen Phase

Relative Retention:

Methanol < Ethanol < Acetonitril < 1-Propanol < 2-Propanol

Anzahl theor. Bden: Acetonitril > Methanol > Ethanol > 1-/2-Propanol Verhalten gegenber der Alkylkettenlnge: Acetonitril > Methanol > Ethanol > 1-/2-PropanolJR/solvents

Grundlagen der HPLC

Lsungsmittel fr die RP Chromatographie (I)Methanol hohe Viskositt nicht so toxisch wie MeCN preiswert MeOH / Wasser -Mischungen zeigen Druckmaxima gute Salzlslichkeit befhigt zur H-Brckenbildung => fr einfache Trennungen => hohe Salzkonzentrationen => Erreichen bestimmter SelektivittenJR/solvents

Grundlagen der HPLC

Lsungsmittel fr die RP - Chromatographie (II)Acetonitril geringe Viskositt => gute Diffusion ( => hohe Bodenzahl), => geringer Druckabfall (hoher Flu kleine Partikel mglich) sehr gute UV-Durchlssigkeit => Gradienten mglich => sehr niedrige Nachweisgrenzen fr Analyten teuer und toxisch => Wahl fr analyt. Methodenentwicklung und schwierige TrennungenJR/solvents

Grundlagen der HPLC

Lsungsmittel fr die RP Chromatographie (IV)Tetrahydrofuranhohe Viskositt Peroxidbildner gutes Lseverhalten (z.B Polymere) mischt sich mit jedem anderen Lsungsmittel => fr schwerlsliche Proben => zum Umsplen der Anlage von Alkanen/Chloroform auf wrige Lsungsmittel => fr das Erreichen bestimmter Selektivitten

JR/solvents

Grundlagen der HPLC

Lsungsmittel fr die RP - Chromatographie (III)Wasserhohe Reinheit notwendig => HPLC-reines Wasser => Reinigung ber eine RP-Phase Reinheitstest: Anreicherung auf RP-18-Sulen und nach folgend linearer Gradient

JR/solvents

Grundlagen der HPLC

MURPHYS AxiomSince Water Covers 75 % of the Earths Surface

Water Creates 75 % of HPLC Problems

JR/solvents

Grundlagen der HPLC

Auswahl der mobilen Phase Trenneigenschaften (Selektivitt) Viskositt und Gegendruck Kosten fr die Aufreinigung Frei von Verunreinigungen Wiederverwendbarkeit & Recycling Toxizitt & Brennbarkeit Kosten der Entsorgung Kosten der LagerhaltungJR/solvents

Grundlagen der HPLC

Einflu des pH WertesZusatz von Suren bzw. Pufferlsungren: (Trifluoressigsure, Phosphorsure, PO -Puffer) 4

Unterdrckung strender Gleichgewichte (Carboxylgruppenionisation, protonierte Aminogruppen) aber auch der Silanolgruppendissoziation

geringes Tailing, reproduzierbare Retentionszeiten schmale Peaks (definierter Zustand des Analyten) Robustheit wird verbessert Optimierung: k ber pH auftragenJR/solvents

Grundlagen der HPLC

Zugabe von Ionen

Bewirkt eine nderung der Selektivitt

Groe oberflchenaktive Ionen: (Alkylsulphate, quarternre Ammoniumionen)

Kleine polare Ionen: (geringere Adsorption an der stationren Phase): Phosphate, Perfluoracetate, Tetrabutylammoniumionen

JR/solvents

Optimierung einer TrennungWas sind die Ziele der Trennung? Sammeln von Informationen ber die Probe Werden spezielle HPLC-Methoden/Probenvorbereitung bentigt? Wahl des Detektors Wahl der HPLC-MethodeBestimmung der optimalen Sulenlnge Vernderung der Selektivitt durch nderung der Lsungsmittelzusammensetzung bei gleichem Solvens Vernderung der Sule bzw. der Temperatur

Validierung der Methode

JR/method development

Grundlagen der HPLC

Grundregeln der RP - Chromatographie

Prfen Sie Polaritt und Lslichkeit des Analyten Prfen Sie auf saure oder basische funktionelle Gruppen Alles, was dissoziieren kann, bentigt gepufferte Eluenten

Whlen Sie den geeigneten Phasentyp C18 bei unpolaren bis mittelpolaren Verbindungen, C8 oder C4 bei mehr polaren Komponenten

hren Sie bei unbekannten Gemischen einen Gradientenauf durch von 0 bis 100 % B mit 2 % Steigung / Minute


Grundlagen der HPLC

Grundregeln der RP - Chromatographie5 6 Definieren Sie im Elutionsprofil die Zielverbindung Erhhen Sie das Gradientenvolumen, wenn keine ausreichende Auflsung erreicht wurde (d.h., flachere Steigung bei gleichem Flu oder hheren Flu bei gleicher Dauer Vgrad = tgrad x Flowgrad ) Soll fr eine Isolierung der Zielsubstanz isokratisch gearbeitet werden : Ermitteln Sie, bei welchem %-Gehalt B die Komponente eluiert wurde. Ziehen Sie davon 20 % ab und arbeiten Sie unter diesen Bedingungen isokratisch

7


Druckprofile

Arbeitsweise der Pumpe

Ventilkonstruktion(1)

c

Rubinkugel

c

Saphirsitz, auch Keramik

C

Rheodyne - InjectorPumpe Pumpe

Sule

Sule

Waste Injektion

Waste Injektion

Load

Inject

145

Rheodyne Injektionssystem

Abhngigkeit von

Sulendimension, Flow, Particle size, Eluens, Temperature pH-Wert

TroubleshootingSule: C 8 15 cm Druck :1448 psi = 99.8 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 33.78 min Pw : 2.06 min Peak 2 : tR 41.87 min Pw : 2.74 min R 1-2 : 3.37

t0 = 0.50 10 20 30 40 50

TroubleshootingSule: C 8 15 cm Druck :1448 psi = 99.8 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 33.78 min Peak 2 : tR 41.87 min R 1-2 : 3.37

Pw : 2.06 min Pw : 2.74 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 25cm Druck : 2414 psi = 166 bar ID :4,60,mm dp : 5m Flussrate : 3 ml/min Peak 1 : tR 56.32 min Peak 2 : tR 69.78 min R 1-2 : 4.35

Variation der SulendimensionPw : 2.66 min Pw : 3.54 min

t = 0.9 t0 0 = 0.90 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0

Akademie fr Chromatographie

TroubleshootingSule: C 8 15 cm Druck :1448 psi = 99.8 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 33.78 min Peak 2 : tR 41.87 min R 1-2 : 3.37 Pw : 2.06 min Pw : 2.74 min

t0 = 0.50 10 20 30 40 50

Sule: C 8 6 cm Druck : 579 psi = 40 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3 ml/min Peak 1 : tR 13.49 min Peak 2 : tR 16.75 min R 1-2 : 2.15

Variation der SulendimensionPw : 1.30 min Pw : 1.73 min

t0 = 0.20 5 1 0 1 5 2 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 15 cm Druck :966 psi = 67 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 2ml/min Peak 1 : tR 50.89 min Peak 2 : tR 62.80 min R 1-2 : 2.91

Pw : 3.49 min Pw : 4.69 min

t0= 0,80 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 15cm Druck : 1931 psi = 133 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 4 ml/min Peak 1 : tR25.23 min Pw : 1.45 min Peak 2 : tR31.40 min Pw : 1.90 min R 1-2 : 3.69

Variation der Flussgeschwindigkeit

t0 = 0.40 1 0 2 0 3 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Variation der KorngrePw : 1.87 min Pw : 2.52 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Variation der KorngrePw : 2.26 min Pw : 2.97 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Variation der InnendurchmesserPw : 1.46 min Pw : 1.92 min

t0 = 0.40 1 0 2 0 3 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 15 cm Druck : 625 psi = 43 bar ID : 7.0mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 78.27 min Peak 2 : tR 96.96 min R 1-2 : 2.51

Variation der InnendurchmesserPw : 6.33 min Pw : 8.59 min

t0 = 1.20 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0 10 1 10 2



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 6 cm Druck :3861 psi = 266 bar ID : 2.1mm dp : 3m Flussrate : 1.5ml/min Peak 1 : tR 6.00 min Pw : 0.39 min Peak 2 : tR 6.98 min Pw : 0.51 min R 1-2 : 2.18

Optimierungsversuch 1 Hardware

t0 = 0,110 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 . 70 . 80 .



Temperatur 35C

Pw : 2.06 min Pw : 2.74 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Temperaturerhhung auf 60CPw : 2.45 min Pw : 3.30 min

?

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0



Eluent 50% ACNPw : 2.06 min Pw : 2.74 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Einfluss Eluent 60% ACNPw : 1.16 min Pw : 1.55 min

0

t0 = 0.5

1 0

2 0

3 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0



t0 = 0.50 5 1 0 1 5



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 15 cm Druck :938 psi = 65 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 8.55 min Peak 2 : tR 10.38 min Peak 3 : tR 10.85min R 1-2 : 4.10 R 2-3 : 0.91


t0 = 0.510 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 . 70 . 80 . 90 . 1 .0 0 1 .0 1 1 .0 2



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 15 cm Druck :709 psi = 49 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 4.45 min Peak 2 : tR 5.30 min Peak 3 : tR 5.68min R 1-2 : 4.05 R 2-3 : 1.58

Einfluss Eluent 95% ACNPw : 0.19 min Pw : 0.23 min Pw : 0.25 min

t0 = 0.510 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 .



Eluent 50% ACNPw : 2.06 min Pw : 2.74 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Einfluss Eluent 50% MeOHPw : 1.83 min Pw : 2.37 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0



Eluent 50% ACN

Pw : 2.06 min Pw : 2.74 min

t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0


Einfluss Eluent 50% IPAPw : 1.83 min Pw : 2.37 min

0

t0 = 0.5

1 0

2 0

3 0

4 0



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 15 cm Druck :647 psi = 49 bar ID : 4.6mm dp : 5m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 3.67 min Peak 2 : tR 4.30 min Peak 3 : tR 4.64 min R 1-2 : 3.77 R 2-3 : 1.79

Optimierung 2 GradientPw : 0.15 min Pw : 0.18 min Pw : 0.20 min

Zeit 0.00 min 0.19 min

%B 99.00 100.00

1 .0

20 .

30 .



t0 = 0.50 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

Sule: C 8 2 cm Druck :6632 psi = 457 bar ID : 2.1mm dp : 1.8m Flussrate : 3ml/min Peak 1 : tR 0.53 min Peak 2 : tR 0.55 min Peak 3 : tR 0.60 min R 1-2 : 1.54 R 2-3 : 2.93

Optimierung 3 Gradient UPLCPw : 0.02 min Pw : 0.02 min Pw : 0.02 min

Zeit 0.00 min 0.14 min

%B 56.00 100.00

t0 = 0.0150 0 .1 02 .0 03 .0 04 .0 05 .0 06 .0 07 .0 08 .0 09 .0


Troubleshooting

Einfluss der Temperatur

Troubleshooting3Sule RP18 15 cm x 4,6mm 3m

Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

3 Temperatur 40C 1 2 41 .0 2 .0 3 .0 4 .0



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

3+4 Temperatur 30C 1 2

1 .0

2 .0

3 .0

4 .0

5 .0

6 .0



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

3 Temperatur 20C 1

2 4

1 .0

2 .0

3 .0

4 .0

5 .0

6 .0

7 .0

8 .0

9 .0



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

3

Temperatur 10C 1

2 4

0

5

1 0



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

3 Temperatur 5C 1 2+4

0

5

1 0

1 5



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

2+3

Temperatur 50C

1 4

1 .0

2 .0

3 .0



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

2+3

Temperatur 60C

1 4

0 .5

1 .0

1 .5

20 .

2 .5



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0

2+3

Temperatur 70C 1 40 .5 1 .0 1 .5 20 . 2 .5



Temperatur 45C

1

2 4

1 .0

2 .0

30 .

4 .0


TroubleshootingpH - Wert


pH: 2.6

1

31 0

4

51 5 2 0

6

7

0

5

2 pH: 3.6 3 40 5 10

1

6+7 515 20



pH: 2.6

1

31 0

4

51 5 2 0

6

7

0

5

2 pH: 4.0

10 5

3

4+51 0 1 5

6+7



pH: 2.6

10 5 1 0

3

4

51 5 2 0

6

7

2 pH: 5.0

10 5

3+5 41 0

7

61 5



pH: 2.6

1

3

4

51 5 2 0

6

7

0

5

1 0

2 pH: 6.0

11 .0 2 .0 3 .0 4 .0 5 .0

3+5 46 .0 7 .0 8 .0 9 .0

71 .0 0

61 .0 1 1 .0 2



pH: 2.6

1

31 0

4

51 5 2 0

6

7

0

5

2+3 pH: 7.3

51 .0 2 .0 3 .0

1+44 .0

75 .0 6 .0 7 .0

68.0


TroubleshootingR e t e n t i o n s f a k t o r20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Suren (HA)

TheorieB( pKa = 4.8 ) ( pKa = 9.0 )

Neutralstoffe

ABasen (BH+)

pH - Wert


pH: 2.6

10 5 1 0

3

4

51 5 2 0

6

7

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

Phthalic acid Impurity 2-fluoro benzoic acid 3-cyano benzoic acid 2-chloro benzoic acid 3-fluoro benzoic acid 2,6- dimethyl benzoic acid


Gehaltener Vortrag Grundlagen Der HPLC 06.Bis 08.04

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