GAMMOPATIE E MIELOMA MULTIPLO

GAMMOPATIA

CONDIZIONE CLINICO-LABORATORISTICA CARATTERIZZATA DA UN AUMENTO DELLA ZONA GAMMA AL TRACCIATO ELETTROFORETICO DELLE PROTEINE

Albumina α1 α2 βγ

CATENA L

CATENA H

SITO LEGANTE

L’ ANTIGENE

SITI DI LEGAME

RECETTORE Fc

E COMPLEMENTO

STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE

IgG IgA IgM IgD IgE

cat. H

cat. L K o K o K o K o K o

mg/dL 1000-1.400

200-300

40-150 3 <1

Emivita 21 g 6 g 5 g 3 g 2 g

Secrezioni esterne

+ +++ + ? ?

Passaggio placentare

+ - - - -

PROPRIETA’ DELLE IMMUNOGLOBULINE

IgG1IgE

IgA

IgM

STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE

GAMMOPATIA POLICLONALE

Stimolazione di più cloni di PC con incremento di una o diverseclassi di Ig che esprimono entrambe le catene leggere

Condizioni cliniche: - epatopatie

- mal collagene (LES, AR, Sjogren)- infezioni (TBC, EBV, toxoplasmosi, endocarditi)- sarcoidosi- fibrosi cistica

GAMMOPATIA MONOCLONALE

Stimolazione di un SINGOLO clone di PC con incremento di un SOLOtipo di catena pesante e di catena leggera

ASSOCIATA A:

MGUS (56%) Mieloma multiplo (18%) Amiloidosi (10%) Linfomi non HDG (5%) LLC (2%) Macrogl.Waldestrom (2%)

Collagenopatie e malattie autoimmuni: AR, Crohn,

polimialgia reumatica, LES, sclerodermia, Sjogren, artritepsoriasica, miastenia gravis

Malattie cutanee: pioderma gangrenosus, psoriasi,

orticaria, scleromixedema

Malattie endocrine: iperparatiroidismo

Malattie epatiche: epatite, cirrosi

Malattie infettive: micobatteri, CMV, endocarditebatterica, AIDS

Neoplasie: carcinomi colon, polmone, prostata,

GAMMOPATIA MONOCLONALE

CLASSI DI ETA’

CM

(%)

0-10 0

11-24 0.4 ISOTIPO %

25-34 0.8 IgG 70

35-44 2.3 IgA 6

45-54 5.6 IgM 11

55-64 6.6 Multiple 11

65-74 7.8 C. leggere 1

>75 7.6

PREVALENZA DELLE CM

MGUS

INCIDENZA: 1% popolazione >50 anni; 3% popolazione >70 anni

DIAGNOSI: CM sierica <3 gr/L

<5% PC midollariassenza di lesioni osteolitiche, anemia, ipercalcemiafunzione renale nella norma

EVOLUZIONE: 25% sviluppa patologia linfoproliferativa

55% presenta malattia stabile15% decesso per altre cause5% picco scompare

FOLLOW-UP: esami ematici periodici semestrali (proteine tot,

elettroforesi e dosaggio immunoglobuline)

TERAPIA: nessuna

CLINICA: assenza di sintomi

riscontro laboratoristico occasionale

• Il rischio attuale di trasformazione di MGUS in MM è del:

• 6.1% a 5 anni

• 15.4% a 10 anni

• 31.3% a 20 anni

EVOLUZIONE DELLE MGUS

FATTORI DI RISCHIO

Elevati livelli iniziali di CMForme IgA e IgMCatene leggere vs pesanti ( 70% vs 30%)

E’ POSSIBILE

PREVEDERE L’EVOLUZIONE DI UNA

MGUS A MM?

no

EVOLUZIONE IN MIELOMA MULTIPLO

MIELOMA MULTIPLO

PATOLOGIA CARATTERIZZATA DALLA PROLIFERAZIONE NEOPLASTICA DI UN SINGOLO CLONE DI PLASMACELLULE AD ELETTIVA LOCALIZZAZIONE MIDOLLARE

IN GRADO DI PRODURRE ELEVATEQUANTITA’ DI IMMUNOGLOBULINE

MONOCLONALI (CM)

DEFINIZIONE

EPIDEMIOLOGIA

EZIOLOGIA

MIELOMA MULTIPLO

1% DI TUTTE LE NEOPLASIE 10% DELLE NEOPLASIE EMATOLOGICHEINCIDENZA ANNUALE: 3-4 /100.000/annoPOPOLAZIONE NEGRA/BIANCA: 2:1

ETA’ MEDIA DIAGNOSI: 68 ANNI4% ETA’ INFERIORE AI 40 ANNIM:F=1:1

CAUSA ANCORA SCONOSCIUTAESPOSIZIONE A RADIAZIONIESPOSIZIONE A METALLI PESANTI, ASBESTO, BENZE, FITOFARMACI

• SUSCETTIBILITA’ GENETICA• FLOGOSI CRONICA (continua stimolazione Ag)• HHV8

• UN’INDAGINE PRELIMINARE INDICA 100 NUOVI CASI DI MM/ANNO NELLE PROVINCIE DI FIRENZE E PRATO

• LA SOPRAVVIVENZA MEDIA DEL MM DALLA DIAGNOSI È DI 3 ANNI, CON UN RANGE DA POCHI MESI A DIVERSI ANNI.

EPIDEMIOLOGIA E SOPRAVVIVENZA

MM:PATOGENESI

Il mieloma non è patologia neoplastica della PC, ma del sistema linfoide B, di una cellula B che è antecedente alla maturazione in plasmacellula.

Infatti: linfociti B circolanti del soggetto presentano Ig di superficie con le stesse caratteristiche isotipiche ed idiotipiche della CM

IPERMUTAZIONE SOMATICA

SELEZIONE ANTIGENICA

RICOMBINAZIONE IGH SWITCH

STROMA

IL-6

IL-6

IL-6

IL-6R

IL-1

TNF-

M-CSF

HGF

IL-6IL-6

Molecole

adesioneIL-1

TNF-

M-CSF

HGF

NEOANGIOGENESI

Fas

MM:PATOGENESI

CORRELATI ALLA

COMPONENTE M

CORRELATI ALLA

SINTESI DI CITOCHINE

S. IPERVISCOSITA’ AMILOIDOSI AL

INSUFFIC. RENALE SINT. NEUROLOGICI

LESIONI OSSE IPERCALCEMIA

INSUFFIC. MIDOLLARE SUSCETTIBILITA’ INFETTIVA

CORRELATI ALLA

MASSA TUMORALE

QUADRO CLINICO

MM E DOLORI OSSEI

SEDI: rachide, bacino, cranio, coste, ossa lunghe (omero-femore)

TIPO LESIONE: lisi a stampo, osteoporosi diffusa, fratture

EZIOPATOGENESI: citochine (OAF: Osteoclast Activing Factors) IL6, TNF, IL1 che creano aumento dell’attività degli osteoclasti

DIAGNOSI: Rx scheletro (RMN e scintigrafia)

MM E DOLORI OSSEI

LESIONI DELLE DIPLOE DELLA TECA

CRANICA IN REGIONE FRONTALE E

MASSE ESPANSIVE

Nair, S. R. et al. N Engl J Med 2004;351:1874

MM E SINTOM. NEUROLOGICA

Compress.midollari (fratture vertebrali): paraplegia, emiplegiaradicoliti

Polineuropatie sensitivo-motorie

MM E LOCALIZZAZIONI EXTRAMIDOLLARI

Multiple masse sottocutanee con diametro dai 3 ai 9 cmMasse addominali multiple coinvolgimento rene sx (7-13 cm)

MIELOMA MULTIPLO IgA Lambda

MM E LOCALIZZAZIONI SNC

LIQUOR

MM E ALTERAZ. LABORATORIO

• Anemia (normocromica-normocitica)

• Piastrinopenia e leucopenia (grado infiltrazione midollare)

• VES e PRC

• Ipercalcemia

• Iperuricemia

• Creatinina e azotemia

• Proteine totali

• Albumina

• Altre Ig (non CM)

• Elettroforesi: 80% picco monoclonale

10% ipogammaglobulinemia

TEST DIAGNOSTICI

• ESAMI EMATICI: Emocromo completo, formula leucocitaria, funz renale, calcemia, uricoemia, proteine totali e frazionate, VES, PCR, LDH

• IMMUNOELETTROFORESI

• IMMUNOFISSAZIONE

• DOSAGGIO QUANTITATIVO di CM e altre Ig

• DOSAGGIO QUANTITATIVO delle catene leggere libere nel siero (forme MM oligo-non secernente)

• DOSAGGIO QUANTITATIVO della proteinuria di Bence Jones (catene leggere)

• B2-MICROGLOBULINA

• RX SCHELETRO (RMN)

• STRISCIO PERIFERICO, emazie a rouleaux

• ASPIRATO MIDOLARE E BOM

• BIOPSIA GRASSO PERIOMBELICALE (amiloidosi)

MM: STRISCIO PERIFERICO

emazie a rouleaux

MM: ASPIRATO MIDOLLARE

MAGGIORI:

• Plasmocitoma alla biopsia del tessuto

• Plasmacellule midollari 30%

• CM:

– IgG >3.5 g/dL

– IgA >2 g/dL

– BJ 1g/24h

MINORI:

• Plasmacellule midollari 10-29%

• CM < ai livelli maggiori

• Lesioni osse litiche

• Diminuzione delle Ig normali

– IgG <600 mg/dL

– IgA <100 mg(dL

– IgM <50 mg/dL

DIAGNOSI: 1 criterio maggiore + 1 minore , oppure3 criteri minori

CRITERI DIAGNOSTICI

ULTERIORI TEST DIAGNOSTICI CON SIGNIFICATO PROGNOSTICO

INDICE DI MARCATURA PLASMACELLULARE (LI)

Correla con attività proliferativa plasmacellulare

STUDIO CARIOTIPO

Correla con sopravvivenza:malattia stabile 56 mesi se LI <3% vs 19 se LI >3%

30-50% citogenetica convenzionale

90% FISH

TRASLOCAZIONI COINVOLGENTI 14q32

• Descritta in 50-60% dei pazienti

• Presenti soprattutto nelle fasi avanzate della malattia, sono infatti particolarmente comuni nei pazienti con PC leukemia

• Comportano un’aumentata trascrizione di oncogeni (fattori di trascrizione)

• Sono traslocazioni mutualmente esclusive

14q32 IgH

Geni cicline D

FGFR3

Geni MAF t(14,16)

t(11,14) ciclina D1t(4;14) t(14,16) ciclina D2t(6;14) ciclina D3

TRASLOCAZIONI COINVOLGENTI 14q32

16q32 (5%)

4p16 (15%)

11q13 (20%)

assente (25%)

8q24 (5%)

6p21 (3%)

altri (27%)

FISH: MONOSOMIA 13q

FREQUENZA 30-50%FATTORE PROGNOSTICO SFAVOREVOLE

LEUCEMIA PLASMACELLULARE

PC MATUREPLASMOBLASTI:

pattern cromatina immaturanucleoli

FORME LINFOPROLIFERATIVE

CRONICHE

LLC: PRESENTAZIONE CLINICA

- Infiltrazione linfonodale, midollareo splenica- Assenza di linfocitosi nel periferico

- Assenza di linfocitosi nel periferico- Assenza di sintomatologia- Esami di routine identificano una clonalità per cellule B

DIAGNOSI Caratterizzata da leucocitosi con linfocitosi,Il numero di linfociti circolanti > 5000/mm3

Disordine linfoproliferativo cronico acquisito, di natura monoclonale, caratterizzato dall’espansione di piccoli linfociti apparentementematuri che si accumulano nel sangue periferico, midollare e negliorgani linfatici

Senza linfocitosi

LLC: MORFOLOGIA(FORMA TIPICA)

Ombre di Gumprecht

• > 95% casi: clone B

• < 5% casi: clone T

LLC: MORFOLOGIA(FORME ATIPICHE)

Forma atipicaCromatina condensataCitoplasma basofilo (diff plasmocitoide)

Forma prolinfociticaPiccoli linfociti, prolinfociti con nucleoli

HAIRY CELL LEUK: MORFOLOGIA

Tipiche proiezione del citoplasma

Nucleo eccentrico ovalare, generalmente è visibile un nucleolo

Citoplasma ampio, basofilo, agranulato

TRAP+

La reazione citochimica alla

Fosfatasi acida permane dopo

trattamento con Ac. L(+) Tartarico

per la presenza dell’isoenzima V

della fosfatasi acida nelle HC

Reattività con antisieri per le catene leggere k(60%) o (40%), IgG(50%), IgM (25%)

CD20+, CD22+(marcatori B linfocitari)

CD25 ( IL-2R)

CD11c ( monocitario)

HC2, CD103

HAIRY CELL LEUK: cito-immunologia

LLC: BIOPSIA MIDOLLARE

immunoistochimica

LLC: ORGANI LINFOIDI

Diffuso infiltrato linfocitario che sovverte

struttura LN, possono essere presenti follicoli

linfoidi residui. La capsula è in genere

risparmiata

Coinvolgimento della polpa bianca con diversi

Gradi di infiltrazione anche della polpa rossa

MILZA

LINFONODO

• Debole espressione delle SIg ( k 60%; 40% , più frequenti IgM)

• Espressione di CD19, CD20, CD5, CD23*, CD24

• Debole espressione di CD79b, CD22, FMC7

• Aumento CD8+; CD16CD56(NK)

• Riduzione CD4+

• Per le forme T: Ridotta espressione CD45RA, studio del TCR.

LLC: IMMUNOFENOTIPO

LLC: IMMUNOFENOTIPO

CD19+/CD5+

FMC 7 neg

CD79b neg

CD22+ dim

CD23+

CD20+ dim

Clon Kappa

weak

LLC: marker sierici

Correlate with tumor mass and the proliferative activity of CLL cells and predict disease progression, even among patients with early-stage disease.

TK sierica

CD23

High levels of the sCD23 have also been linked to adverse prognostic features such as diffuse bone marrow infiltration, rapid doubling time, and disease progression in early-stage CLL

ß 2M shows a positive correlation with clinical stages and has been found to be a strong prognostic marker

Beta2-microglobulina

LLC: riarrangiamento geni Ig

LLC: riarrangiamento geni Ig

About 50% of patients present in their leukemic cells somatic hypermutations in the rearranged variable regions of the immunoglobulin heavy chains (IgVH).

In 1999, differents groups independently reported on the prognostic importance of IgVH genes in CLL, showing that IgVH mutational status separates CLL into two different forms of the disease.

UNMUTATED-CLL have a more malignant condition, including evidence of advanced, progressive disease, atypical peripheral blood cell morphology, adverse cytogenetic features, clonal evolution, and resistance to therapy than those with mutatedIgVH genes MUTATED-CLL

There is, however, an exception to this rule and that is the expression of the immunoglobulin variable region gene V3-21,which is associated with an inferior outcome independent of mutational status

LLC: riarrangiamento geni Ig

Since determining IgVH mutations requires specific equipmentfor DNA sequencing and is time consuming as well as expensive, it is not possible to study IgVH mutations on a routine basis, particularly in nonspecialized laboratories. Accordingly, many attempts have been made to identify a marker that could be as useful as IgVH mutational status in the prognostic assessment of patients with CLL

ZAP 70 CD38

LLC: riarrangiamento geni Ig

LLC: RUOLO CD38

Espressione regolata nell’ontogenesi del linfocita B

Bone Marrow PC

Up-regolazione prima che la cellule B entri nel centro germinativo e vada incontro al riarrangiamento dei geni delle IgV, decresce nellafase centrocitica ed è assente nella cellule memoria

CD38

LLC: RUOLO CD38

CD31

ProliferazioneBlocco apoptosi

CD31 CD38stro

ma

Lin

fociti

Plexin B1 CD100

DNA

LLC: RUOLO CD38

MARKER SURROGATO DELLO STATO MUTAZIONALE

CD38+NON MUTATI

CD38-MUTATI

30% casiPrognosi intermedia

Valore soglia di positività pari al 30%Espressione CD38 si modifica durante il corso della malattiaEspressione CD38 è aumentata su cellule di derivazione midollare

LLC: ZAP 70

MARKER SURROGATO DELLO STATO MUTAZIONALE

Valutazione in citofluorimetria, correla nel 93% dei casi di LLC con lo stato mutazionale

Micro-array: small number of genes allow the separation of mutated and unmutated CLL, the most specific of them being a gene that encodes for a 70-kD zeta-associated protein (ZAP-70). The majority of mutated cases are ZAP-70 negative, whereas unmutated forms are ZAP-70 positive.

METODOLOGIE DI STUDIO• Western blotting

• Quantitative RT-PCR

• Immunohistochemistry

• Flow cytometry Livello soglia 20%

The expression of ZAP-70 in peripheral blood lymphocytes depends on the cell lineage, the highest levels of ZAP-70 being observed - in NK cells - in T cells

The expression on B cells is low or absent

Consequently, the assessment of ZAP-70 in CLL cells by flowcytometry implies a multiparametric staining to independently identify CLL cells from T and NK cells

LLC: ZAP 70

LLC: ZAP 70

Syk family, attività tirosin-chinasica

Una volta attivato dal legame recettore-ligando è coinvolto nella Trasmissione del segnale a valle nel nucleo

Oltre ad essere coinvolto come secondo messaggero nelle cellule Tè stato identificato anche in nelle cellule B normali

Maturazione e differenziazione linfocitaria dalla fase PRO-B alla PRE-B (riarrangiamento geni IgVh) nel topo, nell’uomo è presentein una selezionata sottopopolazione di linfociti B maturi CD38+ nella milza e nelle tonsille

Recenti Studi

LLC: ALTERAZIONI CITOGENETICHE

80% dei pazienti presentano alterazioni citogenetiche

FISH

Delezione 13qTrisomia cromosoma 12

Delezione 11qDelezione 17pDelezione 6q

LLC: ALTERAZIONI CITOGENETICHE

LLC: ALTERAZIONI CITOGENETICHE

Alcune alterazioni citogenetiche hanno dimostrato ruolo patogenetico

•Delezione 17p13: localizzato gene p53

•Delezione 11q22: localizzato gene ATM (segnali di apoptosi in risposta al danneggiamento del DNA

Alcune alterazioni citogenetiche sono associate a caratteristiche tipiche di alcune forme di malattia

Delezione 11q: malattia caratterizzata da marcata linfoadenopatiama anche da refrattarietà a chemioterapici che

danneggiano DNA

Delezione 17p: malattia caratterizzata da refrattarietà a terapia con analoghi purinici

•Trisomia 12: iperespressione gene MDM2 in grado di legare e inattivare la p53 normale

LLC: ALTERAZIONI CITOGENETICHE

Correlazione tra stato mutazionale e alterazioni citogenetiche

Ig Vh mutati Ig Vh non mutati p

Del 13q 65% 48% 0.004

Trisomia 12 15% 19% 0.44

Del 11q 4% 27% <0.001

Del 17p 3% 10% 0.03

Differente background biologico di LLCGene expression profiling dimostra che è un’unica patologia

Alterazioni citogenetiche sfavorevoli…….stato non mutato Ig

LLC: ALTERAZIONI CITOGENETICHE

• Stato mutazionale Ig Vh

• Delezione 17p

• Delezione 11q

• Età

• Conta leucocitaria

• LDH

Fattori prognosticiIndipendenti per OS

• Stato mutazionale Ig Vh

• Delezione 17p

• Delezione 11q

Superano lo stadio clinico

LLC: ALTERAZIONI CITOGENETICHE

CROMOSOMA 12 (green)

DELEZIONE CHR 13q14 (red)