FORMULASI EKSTRAK SAMBILOTO (Andrographis paniculata) DAN BROTOWALI (Tinospora crispa)

SEBAGAI INHIBITOR α-GLUKOSIDASE DAN ANALISIS SIDIK JARI MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI

RONA JUTAMA YONANDA

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2011

ii

ABSTRAK

RONA JUTAMA YONANDA Formulasi Ekstrak Sambiloto (Andrographis paniculata) dan Brotowali (Tinospora crispa) sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan Analisis Sidik Jari Menggunakan Teknik Kromatografi. Dibimbing oleh LATIFAH K. DARUSMAN dan WULAN TRI WAHYUNI. Sumber bahan alam yang berpotensi sebagai penghambat aktivitas α-glukosidase di antaranya adalah sambiloto dan brotowali. Penelitian ini bertujuan memperoleh formula ekstrak sambiloto dan brotowali dengan penghambatan kerja enzim α-glukosidase tertinggi dan informasi sidik jari formula tersebut. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi dan ultrasonikasi dengan pelarut air, etanol 30%, dan 70%. Ekstrak sambiloto ultrasonikasi dan ekstrak brotowali maserasi menggunakan etanol 70% menunjukkan nilai IC50 terendah, berturut turut 55.36 dan 68.28 ppm. Formula ekstrak sambiloto dan brotowali dengan nisbah konsentrasi 2 IC50:1 IC50 merupakan formula paling baik dengan inhibisi 28.11%. Pada analisis kromatografi lapis tipis, fase gerak optimum pemisahan komponen sambiloto yaitu etil asetat sedangkan untuk ekstrak brotowali adalah campuran kloroform:etanol:etil asetat (0.487:0:0.513). Pemisahan komponen formula dilakukan menggunakan fase gerak tunggal etil asetat. Analisis formula menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi pemisahan ekstrak sambiloto tidak menunjukkan komponen yang berasal dari ekstrak brotowali, sehingga masih perlu dilakukan pengoptimuman kondisi pemisahan formula.

ABSTRACT

RONA JUTAMA YONANDA Formulation of Sambiloto (Andrographis paniculata) and Brotowali (Tinospora crispa) Extract as An α-Glucosidase Inhibitor and Fingerprints Analysis Using Chromatography Techniques Supervised by LATIFAH K. DARUSMAN and WULAN TRI WAHYUNI.

Two of many potential sources of natural materials as an α-glucosidase inhibitors are sambiloto and brotowali. The aims of the study were to obtain the best formula of sambiloto and brotowali extract with highest α-glucosidase enzyme inhibition including its fingerprint information. Extractions were carried out using maceration and ultrasonication methods with water, ethanol 30%, and 70% as the solvents. Sambiloto ultrasonication extract and brotowali maceration extract using ethanol 70% as solvent showed the lowest IC50 value, respectively 55.36 and 68.28 ppm. Both of extracts were then formulated. Formula of sambiloto and brotowali with the concentration ratio of 2 IC50:1 IC50 was the best formula with inhibition value 28.11%. In thin layer chromatography separation, ethyl acetate was the optimum mobile phase for sambiloto extract and chloroform: ethanol: ethyl acetate (0.487: 0: 0.513) is the optimum mobile phase composition for brotowali extract. Ethyl acetate used as mobile phase in formula separation. Formula analysis using high performance liquid chromatography technique with optimum separation condition of sambiloto extract did not show components from brotowali extract, so the separation condition of the formula still need to be optimized.

iii

FORMULASI EKSTRAK SAMBILOTO (Andrographis paniculata) DAN BROTOWALI (Tinospora crispa)

SEBAGAI INHIBITOR α-GLUKOSIDASE DAN ANALISIS SIDIK JARI MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI

RONA JUTAMA YONANDA

Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2011

iv

Judul Skripsi : Formulasi Ekstrak Sambiloto (Andrographis paniculata) dan Brotowali (Tinospora crispa) Sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan Analisis Sidik Jari Menggunakan Teknik Kromatografi

Nama : Rona Jutama Yonanda NIM : G440670092

Disetujui,

Pembimbing I

Prof.Dr.Ir Latifah K. Darusman, MS.

NIP. 19530824 197603 2 001

Pembimbing II

Wulan Tri Wahyuni S.Si, M.Si.

Diketahui, Ketua Departemen Kimia

Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal lulus:

v

PRAKATA

Segala puji dan syukur penulis ucapkan ke hadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah berjudul “Formulasi Ekstrak Sambiloto (Andrographis paniculata) Dan Brotowali (Tinospora crispa) Sebagai Inhibitor α-Glukosidase dan Analisis Sidik Jari Menggunakan Teknik Kromatografi”. Penelitian ini bertujuan mengetahui potensi gabungan ekstrak sambiloto dan brotowali sebagai inhibitor enzim α-Glukosidase serta penentuan sidik jari menggunakan teknik kromatografi. Penelitian dilakukan sejak Maret 2011 sampai Agustus 2011 di Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Laboratorium Uji Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS dan Wulan Tri Wahyuni, S.Si, M.Si selaku pembimbing yang selalu memberi bimbingan, motivasi dan saran selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada Pusat Studi Biofarmaka dan Bagian Kimia Analitik atas dilibatkannya penulis ke dalam penelitian ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Om Eman, Bu Nunung, Pak Dede, Pak Kosasih, dan Pak Ridwan di Laboratorium Kimia Analitik, juga kepada Mba Salina, Ibu Nunuk, Antonio, Pak Zaim dan segenap pegawai di Pusat Studi Biofarmaka yang telah banyak membantu dalam pengerjaan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih tak terhingga kepada Ayah dan ibu atas dukungan materi dan moril. Terima kasih kepada teman-teman terdekat, rekan-rekan di Laboratorium Kimia Analitik serta keluarga besar mahasiswa Kimia angkatan 44 atas segala dukungan dan bantuan dalam proses pengerjaan dan penyelesaian karya tulis ini.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2011

Rona Jutama Yonanda

vi

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 9 Juni 1989 dari pasangan Suyono HS dan Siti Djulaeha. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara.

Penulis lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBo) pada tahun 2007 dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis memilih Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama menjalani perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia Tingkat Persiapan Bersama (TPB) pada tahun ajaran 2008/2009, Kimia Analitik Layanan, serta Spektrofotometri dan Aplikasi Kemometrik pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis juga berkesempatan menjalani kegiatan Praktik Lapang di Laboratorium Research & Development (R&D) Balai Besar Penelitian Pascapanen, Bogor.

vii

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................................ viii 

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii 

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 

TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 1 

Sambiloto (Andrographis paniculata)................................................................ 1 Brotowali (Tinospora crispa) ............................................................................. 2 Diabetes mellitus (DM) ...................................................................................... 2 Enzim α-glukosidase .......................................................................................... 3 Ekstraksi ............................................................................................................. 3 Uji toksisitas larva udang (Brine Shrimp Lethality Test). .................................. 4 Analisis sidik jari dan kromatografi ................................................................... 5 

BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 6 

Alat dan Bahan ................................................................................................... 6 Metode ................................................................................................................ 6 

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 8 

SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 15 

Simpulan ........................................................................................................... 15 Saran ................................................................................................................. 15 

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 15 

LAMPIRAN .......................................................................................................... 18 

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

1  Sistem pereaksi pengujian aktivitas enzim α glukosidase .................................. 7 

2  Komposisi formula ekstrak kasar sambiloto dan brotowali ............................... 8 

3  Komposisi fase gerak menggunakan simplex centroid axial design .................. 8 

4 Nilai IC50 ekstrak etanol 70% sambiloto dan brotowali ................................... 10 

5  Inhibisi enzim α-glukosidase formula sambiloto-brotowali ............................. 10 

6 Jumlah bercak pada elusi fase gerak tunggal ekstrak sambiloto dan brotowali……………………………………………………………………. 11 

7  Jumlah pita pada elusi ekstrak sambiloto menggunakan fase gerak campuran........................………………………………………………… ....... 12 

8  Jumlah pita pada elusi ekstrak brotowali menggunakan fase gerak campuran...………………………………………………………................. ... 12 

9   Jumlah pita dan nilai Rf formula menggunakan fase gerak optimum sambiloto dan brotowali .................................................................................... 13 

10  Jumlah pita dan nilai Rf ekstrak sambiloto, brotowali serta formula sambiloto dan brotowali…………………………………………………….. .. 14 

vii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Herba Sambiloto ................................................................................................. 2 

2 Herba Brotowali .................................................................................................. 2 

3 Reaksi hidrolisis p-NPG oleh enzim α-Glukosidase menjadi p-nitrofenol dan glukosa. ................................................................................................................ 3 

4 Skema umum instrumen KCKT .......................................................................... 6 

5 Rendemen ekstrak sambiloto & brotowali metode maserasi. ............................ 9 

6 Rendemen ekstrak sambiloto & brotowali metode ultrasonikasi. ....................... 9 

7 Nilai LC50 ekstrak sambiloto dan brotowali...................................................... 10 

8 Profil KLT elusi ekstrak sambiloto menggunakan fase gerak campuran komposisi 1-10 di bawah sinar UV 366 nm. ..................................................... 11 

9  Profil KLT elusi ekstrak brotowali menggunakan fase gerak campuran komposisi 1-10 di bawah sinar UV 366 nm. ..................................................... 12 

10  Plot kontur jumlah pita campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak sambiloto. ................................................................ 12 

11  Plot kontur desirability campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak sambiloto. ................................................................ 12 

12 Plot jumlah pita campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak brotowali. .................................................................................. 13 

13 Plot kontur desirability campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak brotowali. ................................................................. 13 

14   Profil KLT Formula menggunakan fase gerak optimum pemisahan ekstrak sambiloto (1) dan brotowali (2). ........................................................................ 13 

15  Profil KLT formula (1), ekstrak sambiloto (2), ekstrak brotowali (3), dan standar andrografolida (4) menggunakan fase gerak etil asetat di bawah sinar UV 366 nm, serta profil KLT standar andrografolida di bawah sinar UV 254 nm (5) .................................................................................................. 14 

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Bagan Alir Lingkup Kerja Penelitian ................................................................ 19 

2 Kadar air sampel sambiloto dan brotowali........................................................ 20 

3 Indeks polaritas fase gerak menurut Snyder ..................................................... 21 

4 Uji Toksisitas Ekstrak Sambiloto dan Brotowali (metode larva udang) ........... 22 

5 Uji inhibisi enzim α-glukosidase (in vitro) ekstrak Sambiloto dan Brotowali . 23 

6 Uji inhibisi enzim α-glukosidase (in vitro) ekstrak sambiloto dan brotowali etanol 70% ......................................................................................................... 24 

7 Uji inhibisi enzim α-glukosidase (in vitro) Glucobay (Akarbosa) .................... 26 

8 Profil KLT fase gerak tunggal........................................................................... 27 

9 Profil kromatogram analisis sidik jari formula menggunakan KCKT .............. 28 

1

PENDAHULUAN Diabetes mellitus (DM) atau yang lebih dikenal dengan kencing manis merupakan penyakit yang disebabkan oleh gangguan metabolik yang ditandai dengan tingginya kandungan gula darah (hiperglikemia) (Poretsky 2009). DM merupakan penyakit dengan jumlah penderita yang cukup tinggi di dunia. Menurut World Health Organization (WHO) melalui riset yang dilakukan oleh Wild et al. (2004), jumlah penderita DM pada tahun 2000 mencapai 171 juta jiwa dan diperkirakan angka ini akan naik menjadi 366 juta jiwa pada 2030. Sedangkan penderita DM di Indonesia mencapai 8.426 juta jiwa pada 2000 dan diperkirakan akan naik menjadi 21.257 juta jiwa pada 2030. Sedangkan menurut penelitian yang dilakukan federasi diabetes internasional, pada 2010 penderita DM dalam rentang usia 20-79 tahun diperkirakan telah mencapai 284 juta jiwa, dan pada 2030 akan mencapai 438 juta jiwa. Pengobatan DM dapat dilakukan lewat terapi insulin atau pengobatan oral dengan obat antidiabetes sintetik. Namun, kedua cara pengobatan ini membutuhkan biaya yang cukup besar dan memiliki efek samping terhadap pasien. Oleh karena itu, pengobatan tradisional menggunakan produk alam semakin diminati masyarakat karena dipercaya lebih aman untuk dikonsumsi. Penelitian mengenai potensi antidiabetes dari produk alam kini semakin banyak dilakukan. Dari beragam jenis tumbuhan obat yang terdapat di Indonesia, terdapat beberapa tanaman yang dipercaya memiliki potensi aktivitas antidiabetes, di antaranya adalah sambiloto (Andrographis paniculata) (Ahmad et al. 2006) dan brotowali (Tinospora crispa) (Tinospora crispa) (Noor et al. 1989). Herba sambiloto dan brotowali telah dimanfaatkan sejak lama oleh penduduk Indonesia karena khasiatnya sebagai obat bagi berbagai penyakit. Herba sambiloto dikenal memiliki aktivitas antipiretik, diuretika, dan antidiabetik (Yulinah et al. 2001). Sedangkan herba brotowali dikenal memiliki aktivitas antidiabetik, antihepatitis, dan dipercaya dapat menyembuhkan gatal-gatal pada kulit (Kresnady 2003).

DM tipe II adalah DM yang tidak bergantung insulin yang awalnya disebabkan oleh peningkatan kadar gula darah pascamakan (Postprandial hyperglycemia). Postprandial hyperglycemia terjadi akibat penyerapan hasil pemecahan karbohidrat. Pemecahan ini dibantu oleh enzim, seperti

enzim α-glukosidase dan α-amilase. Jika enzim tersebut dihambat kerjanya oleh bahan tertentu, maka dapat mengurangi pemecahan karbohidrat dan disakarida sehingga penyerapan gula oleh tubuh menjadi terhambat (Sunil 2009). Sriyapai et al (2009) menemukan adanya aktivitas hipoglikemia serbuk batang brotowali terhadap pasien yang memiliki gangguan metabolisme. Di sisi lain, Ahmad et al. (2006) menemukan bahwa ekstrak etanol herba sambiloto memiliki aktivitas hipoglikemia yang cukup baik.

Kombinasi dari kedua ekstrak herba tersebut, dengan formula tertentu, diduga dapat menghasilkan aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase yang lebih baik. Potensi kombinasi ekstrak herba sambiloto dan brotowali sebagai antidiabetes melalui mekanisme inhibisi α-glukosidase akan diteliti dan menjadi fokus pada penelitian ini. Penelitian ini bertujuan memperoleh formula gabungan ekstrak sambiloto-brotowali dengan aktivitas inhibisi α-glukosidase terbaik dan mendapatkan sidik jari formula serta ekstrak tunggal sambiloto dan brotowali.

TINJAUAN PUSTAKA

Sambiloto (Andrographis paniculata)

Herba sambiloto (Andrographis paniculata) (Gambar 1) merupakan salah satu bahan obat tradisional yang banyak digunakan dan telah dikenal sejak abad ke-18. Sambiloto banyak dijumpai hampir di seluruh kepulauan nusantara. Secara taksonomi, sambiloto diklasifikasikan ke dalam divisi Spermathophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dycotyledonae, subkelas Gamopetalae, ordo Personales, famili Acanthaceae, subfamily Acanthoidae, genus Andrographis, dan spesies Andrographis paniculata (Dalimunthe 2009). Sambiloto tumbuh liar di tempat terbuka seperti kebun, tepi sungai tanah kosong yang agak lembab atau di pekarangan. Herba sambiloto merupakan tanaman tahunan bercabang, dapat mencapai tinggi 60-70 cm dengan daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang, pangkal dan ujung meruncing, tepi rata, permukaan atas hijau tua, bagian bawah hijau muda, panjang 2-8 cm, dan lebar 1-3 cm (Subramanian et al. 2008). Bunga berbibir bentuk tabung kecil, warnanya putih bernoda ungu. Sambiloto dikenal dengan beberapa nama lain, seperti ki

2

oray atau ki peurat (Jawa barat), bidara, takilo, sambiloto (Jawa Tengah), pepaitan, ampadu (Sumatera), Kirayat (India), dan the creat (inggris) (Dalimunthe 2009). Daun dan bagian lainnya dari herba sambiloto telah banyak digunakan sebagai bahan obat untuk berbagai penyakit. Sambiloto mengandung andrografolida, suatu diterpena lakton kristalin, tak berwarna, dan memiliki rasa pahit (Ahmad et al. 2006). Andrografolida merupakan bahan aktif utama di samping komponen lainnya seperti 14-deoksi-11,12-didehidroandrografolida, dan 14-deoksiandrogrofolida. Menurut penelitian yang telah dilakukan, dilaporkan bahwa sambiloto memiliki aktivitas hipotensif yang aktivitasnya berkorelasi kuat terhadap keberadaan senyawa andrografolida (14-deoksi-11,12-didehidroandrografolida dan 14-deoksiandrogrofolida). Aktivitas antitrombotik, antikanker, dan antioksidan dari sambiloto juga telah dilaporkan (Subramanian et al. 2008).

Gambar 1 Herba Sambiloto

(Sumber : (www.herbal.medicalonlinemedia.com)

Brotowali (Tinospora crispa)

Herba brotowali (Tinospora crispa) (Gambar 2) telah lama digunakan sebagai tumbuhan obat oleh warga Asean karena dipercaya memiliki khasiat dalam menyembuhkan berbagai macam penyakit, baik penyakit dalam maupun luar. Secara taksonomi, brotowali diklasifikasikan ke dalam divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Ranunculales, famili Menispermaceae, genus Tinospora, dan spesies Tinospora Crispa.

Tumbuhan ini menyukai tempat yang panas untuk tumbuh, dapat tumbuh mencapai ketinggian 2.5 m, ukuran batang sebesar jari kelingking, daun tunggal agak bundar, ujung meruncing dengan panjang 7-12 cm, lebar 5-10 cm dan memiliki rasa pahit. Bagian

tumbuhan ini yang banyak dimanfaatkan adalah bagian batangnya. Batang herba brotowali secara tradisional digunakan sebagai obat antidiabetes, tekanan darah tinggi, antimalaria, dan penambah nafsu makan (Amom et al. 2008).

Gambar 2 Herba Brotowali

(Sumber : www.herbstohealth.blogspot.com)

Brotowali mengandung zat pahit tinokriposid, damar lunak, pati, glikosida, pikroretosid, harsa, kolumbin, kaokulin atau pikrotoksin, dan beberapa alkaloid seperti aporfin, beberin, dan palmatin. Senyawa yang paling penting yang terdapat pada batang brotowali diduga merupakan senyawa tinokrisposid yang memiliki aktivitas sebagai antimalaria, antiinflamasi, dan antidiabetes (Marthianti 2006).

Diabetes Mellitus (DM)

Diabetes Mellitus (DM) merupakan penyakit metabolik kronis yang ditandai dengan kandungan gula darah di atas normal. DM Secara klasik dikelompokkan ke dalam dua tipe, yaitu DM tipe I dan tipe II berdasarkan sebab timbulnya penyakit. Namun, menurut Poretsky (2009), terdapat dua pengelompokan DM lain di samping tipe I dan II. Kedua tipe DM tersebut adalah Gestational DM (GDM) dan DM yang disebabkan oleh sebab spesifik seperti penyakit exocrine pancreas, kelainan genetik pada sel-β, dan keberadaan zat kimia & obat-obatan serta kelainan genetika. DM Tipe I bergantung terhadap hormon insulin. DM tipe I disebabkan oleh kurangnya produksi insulin oleh pankreas akibat rusaknya sel-β pankreas yang bertanggung jawab dalam produksi insulin sel, sehingga insulin yang dihasilkan tidak cukup untuk mengubah gula yang berada dalam darah

3

menjadi gula interseluler, akibatnya terjadi penumpukan gula di dalam darah. Sedangkan DM tipe II tidak bergantung terhadap hormon insulin. DM tipe II dapat disebabkan oleh abnormal atau rusaknya permukaan sel yang berfungsi sebagai reseptor, kerusakan di bagian dalam sel (post-receptor defects), atau kombinasi keduanya. DM dapat menyebabkan komplikasi penyakit lain bagi penderitanya, seperti aterosklerosis, tekanan darah tinggi, gagal ginjal, dan infeksi (Ahmad et al. 2006). Postprandial hyperglycemia atau peningkatan kadar gula kadar setelah makan merupakan salah satu gangguan awal sebelum berkembangnya penyakit DM tipe II lebih jauh di dalam tubuh. Menghambat kenaikan gula darah setelah makan merupakan pengobatan awal bagi penderita DM tipe II (Sunil 2009). Pencegahan terjadinya Peningkatan kadar gula darah pascamakan dapat dilakukan dengan menghambat laju hidrolisis karbohidrat melalui penghambatan enzim α-glukosidase. Hanya monosakarida, seperti glukosa dan fruktosa yang langsung dapat terserap masuk ke dalam aliran darah, sedangkan karbohidrat kompleks, oligosakarida, dan disakarida harus dipecah sebelum dapat masuk ke aliran darah (Sunil 2009).

α-Glukosidase

α-Glukosidase merupakan enzim yang bekerja pada usus halus manusia dan berperan dalam produksi glukosa. Enzim ini menghidrolisis karbohidrat dari makanan menjadi glukosa dan monosakarida lain (Sugiwati et al.2006). Cara kerja enzim ini adalah dengan mengkatalisis hidrolisis ikatan α-Glikosidik α-1,4 pada oligosakarida dan α- D-Glikosida (Sou et al. 2000). Sejak awal tahun 1990, kelas baru dalam golongan obat antidiabetik, yaitu inhibitor α-Glukosidase, dianggap merupakan pendekatan yang baik dalam pengobatan DM.

Produk awal inhibitor α-Glukosidase yang dijual bebas adalah Akarbosa yang diproduksi oleh Bayer Jerman AG dengan nama dagang Glucobay®. Inhibitor α-Glukosidase menunda pemecahan oligosakarida dan disakarida menjadi monosakarida dengan menginhibisi α-Glukosidase pada small intestinal brush border (Ye et al. 2002).

Aktivitas inhibisi α-Glukosidase dapat diuji baik secara in vitro maupun in vivo. Uji in vivo biasanya menggunakan mencit sebagai hewan uji. Uji in vitro menurut Li et al. (2010), dapat dilakukan dengan menggunakan

pseudo substrate (substrat semu) p-nitrofenil glukopiranosida (p-NPG) di dalam buffer fosfat yang ditambahkan ekstrak uji. Reaksi tersebut akan menghasilkan glukosa dan p-nitrofenol yang berwarna kuning dan dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 400 nm (Gambar 3) yang diukur intensitasnya dengan metode spektrofotometri (Sugiwati et al. 2009). Kontrol positif dapat menggunakan akarbosa.

N+

O

-O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

N+

O

O-

OH

OH

OH

HO

O

OH

-

Gambar 3 Reaksi hidrolisis p-NPG oleh enzim α-Glukosidase menjadi p-nitrofenol dan glukosa (Sugiwati et al. 2009).

Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses transfer selektif suatu komponen dari suatu fase pelarut (biasanya air) ke pelarut lain yang berbeda nilai kepolarannya (biasanya pelarut organik) (Meloan 1999). Proses ekstraksi terjadi akibat nilai konstanta distribusi solut yang berbeda di kedua fase. Proses transfer ini menggunakan prinsip like dissolve like. Pelarut polar akan melarutkan komponen polar, sedangkan pelarut non-polar akan melarutkan komponen non-polar (Skoog et al. 2004). Terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi proses ekstraksi, di antaranya jenis dan volume pelarut, jumlah sampel, suhu dan waktu ekstraksi. Faktor-faktor tersebut harus dioptimasi sedemikian rupa untuk menghasilkan nilai recovery yang baik. Separasi selektif dari komponen target dengan rendemen maksimum dan atau penghilangan interferen merupakan tujuan utama proses ekstraksi (Dobiàš et al. 2010).

Dalam konteks analisis tanaman obat, proses ekstraksi akan memisahkan senyawa metabolit yang larut dari sel yang tak larut dalam pelarut. Produk yang diperoleh dari tanaman dalam bentuk cairan, semi-padat, maupun serbuk merupakan campuran metabolit yang kompleks, seperti flavonoid,

4

alkaloid, lignin, terpenoid, dan lain sebagainya (Henda et al. 2008). Proses industri tanaman obat dimulai dengan tahap ekstraksi dengan berbagai macam teknik dan teknologi. Teknik umum yang biasa digunakan untuk ekstraksi komponen fitokimia tanaman obat adalah maserasi, infusi, perkolasi, digesti, dekoksi, soxhletasi, ekstraksi arus-terbalik, microwave assisted extraction (MAE), ekstraksi ultrasonik, supercritical fluid extraction, pressurized liquid extraction, dan subcritical water extraction merupakan beberapa teknik yang dapat digunakan untuk ekstraksi komponen fitokimia dari tanaman obat (Kumar et al 2006).

Subramanian et al (2008) memperoleh ekstrak sambiloto dengan teknik maserasi dingin menggunakan etanol 20% sebagai pelarut selama 7 hari, sedangkan Ahmad et al. (2006) menggunakan teknik ekstraksi refluks dengan air , etanol 95%, 50%, dan 20% sebagai pelarut. Noor et al. (1989) menggunakan air sebagai pelarut dengan teknik ekstraksi refluks untuk memperoleh ekstrak herba brotowali.

Maserasi. Maserasi merupakan salah satu teknik ekstraksi klasik dengan merendam sampel dalam pelarut yang sesuai selama beberapa waktu (biasanya selama 24 jam). Metode ini digunakan untuk sampel yang tidak tahan panas. Proses ekstraksi yang terjadi pada teknik maserasi merupakan difusi molekular yang berjalan sangat lambat, pengadukan perlahan membantu terjadinya difusi dan memastikan pengumpulan larutan berkonsentrasi tinggi pada permukaan partikel. (Kumar et al. 2006). Pelarut akan menembus dinding sel tanaman dan masuk ke dalam rongga sel simplisia yang mengandung zat aktif dan melarutkannya (Indraswari 2008). Kelebihan metode ini adalah murah, sederhana, dan menghindari kerusakan komponen yang tidak tahan panas. Sedangkan kekurangannya antara lain tidak efisien karena tidak ada gaya lain yang membantu proses ekstraksi (hanya direndam), membutuhkan pelarut yang banyak, dan waktu ekstraksi yang dibutuhkan cukup lama.

Ultrasonikasi. Ekstraksi ultrasonik merupakan metode ekstraksi dengan menggunakan gelombang ultrasonik. Metode ini tidak membutuhkan waktu yang lama dibandingkan dengan metode maserasi ataupun soxhletasi. Prinsip ekstraksi ultrasonik adalah peningkatan transfer massa yang disebabkan oleh meningkatnya penetrasi pelarut ke dalam jaringan tumbuhan lewat

efek kapiler. Gelembung kavitasi akan terbentuk pada dinding sel tanaman akibat adanya gelombang ultrasonik. Efek dari pecahnya gelembung kavitasi ini dapat mengakibatkan peningkatan pori-pori dinding sel. Pecahnya gelembung kavitasi disebabkan oleh tipisnya bagian kelenjar dalam sel tumbuhan yang mudah dirusak dengan sonikasi. Hal tersebut memudahkan pelepasan komponen esensial ke dalam pelarut (Melecchi et al. 2006)

Dengan kata lain, gelombang ultrasonik dapat memfasilitasi terjadinya pembengkakan sel dan pelarutan komponen dalam tanaman yang disebabkan pembesaran pori-pori dinding sel. Pembengkakan pori yang lebih besar akan meningkatkan transfer massa sehingga dapat meningkatkan efisiensi dan mengurangi waktu ekstraksi (Melecchi et al. 2006). Kelebihan lain dari ekstraksi ultrasonik adalah keterulangan ekstraksi baik, waktu ekstraksi yang jauh lebih singkat, lebih efisien, dan dapat digunakan untuk ukuran sampel yang beragam. Ekstraksi ultrasonik sangat baik digunakan untuk ekstraksi komponen organik polar (Said 2009).

Uji Toksisitas Larva Udang (Brine Shrimp Lethality Test).

Komponen bioaktif hampir selalu memiliki efek racun pada konsentrasi tinggi. Farmakologi dapat dikatakan sebagai toksikologi pada dosis rendah, begitu pula sebaliknya, toksikologi dapat dikatakan sebagai farmakologi pada dosis tinggi (McLaughlin et al. 1998). Letalitas in vivo organisme sederhana dapat digunakan untuk memprediksi aktivitas sitotoksik dari ekstrak bahan alam (Mann et al. 2011). Pengujian sitotoksisitas menggunakan larva udang air laut (Artemia salina) merupakan metode yang aman, praktis, dan murah. Telur udang (Artemia salina) dapat dengan mudah diperoleh dan disimpan bertahun-tahun dalam keadaan kering. (McLaughlin et al. 1998).

Udang air laut termasuk ke dalam divisi Arthropoda, kelas Crustacea. Siklus hidupnya dimulai saat penetasan telur. Telur yang awalnya inaktif, ketika terkena air laut akan mengalami rehidrasi dan pertumbuhan berlanjut hingga menetas menjadi larva. Larva tersebut sangat sensitif terhadap zat racun. Nisbah antara larva mati dan hidup yang dikoreksi terhadap kontrol digunakan sebagai perkiraan toksisitas bahan (Milhem et al. 2008), biasanya dinyatakan sebagai nilai LC50, yaitu konsentrasi bahan atau zat yang

5

mengakibatkan kematian pada 50% binatang uji.

Analisis Sidik Jari dan Kromatografi

Secara umum, satu atau dua komponen aktif farmakologis digunakan sebagai penciri untuk mengevaluasi kualitas dan autentisitas tanaman obat. Namun, penentuan seperti ini tidak memberikan gambaran utuh susunan komponen suatu produk herbal karena efek terapi yang dihasilkan biasanya merupakan hasil dari beragam komponen yang terdapat di dalam produk tersebut (Liang et al. 2004). Oleh karena itu diperlukan suatu gambaran utuh komponen-komponen yang terdapat di dalam suatu tumbuhan dan merupakan suatu sidik jari sehingga dapat digunakan sebagai kontrol kualitas dan autentisitas suatu produk obat (Cui et al. 2009).

Analisis sidik jari merupakan teknik analisis yang dikembangkan dengan tujuan kontrol kualitas (autentisitas, identitas, mutu, dan reliabilitas) obat herbal yang berasal dari tumbuhan. Metode kromatografi dapat digunakan sebagai penduga konsistensi kualitas dan stabilitas ekstrak atau produk herbal lewat observasi visual (kromatogram) dan dilakukan dengan pembandingan pola sidik jari dengan sidik jari standar (Rajkumar & Sinha 2010).

Cui et al. (2009) melakukan analisis sidik jari komponen aktif sambiloto menggunakan metode KCKT pada beberapa tanaman sambiloto dengan tempat tumbuh berbeda.

Kromatografi. Kromatografi merupakan teknik pemisahan berdasarkan perbedaan daya adsorpsi suatu komponen di antara dua fase (fase gerak dan diam). Teknik pemisahan ini dilakukan dengan melewatkan fase gerak yang mengandung sampel melalui fase diam di dalam suatu sistem tertentu sehingga terjadi partisi komponen dalam sampel di antara fase gerak dan fase diam. Komponen yang memiliki rasio distribusi lebih besar terhadap fase diam akan membutuhkan waktu lebih lama untuk melewati sistem tersebut, begitu juga sebaliknya (Harvey 2000).

Beberapa teknik kromatografi seperti kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), kromatografi gas (KG), dan elektroforesis kapiler telah secara luas digunakan dalam analisis sidik jari. Sidik jari kromatografi merupakan pola kromatorgrafik dari ekstrak yang mengandung komponen kimia yang aktif secara farmakologi. Profil kromatografik dapat menyatakan ekstrak yang dianalisis memiliki

persamaan atau perbedaan sehingga dapat digunakan sebagai alat kontrol kualitas suatu ekstrak atau produk herbal (Liang et al. 2004). Kromatografi Lapis Tipis. Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu teknik kromatografi partisi. KLT menggunakan lapisan tipis silika gel, alumunium oksida, atau selulosa sebagai fase diam yang dilapiskan pada gelas, kaca, atau logam. Fase geraknya adalah pelarut atau campuran pelarut yang ditempatkan pada bejana pengembang. Sampel diaplikasikan pada bagian bawah pelat KLT, pelat ini kemudian ditempatkan pada bejana pengembang yang telah jenuh oleh fase gerak pengembang. Perbedaan nisbah distribusi komponen pada dua fase akan menghasilkan pemisahan komponen-komponen penyusunnya. KLT dapat digunakan untuk pemisahan senyawa yang berbeda seperti senyawa organik dan senyawa organik sintetik, serta kompleks anorganik-organik (Gritter et al. 1991). KLT dapat memberikan informasi mengenai banyaknya komponen yang terdapat di dalam suatu sampel dan dapat pula digunakan untuk tujuan identifikasi dengan membandingkan nilai retention factor (Rf) komponen uji dengan Rf standar dalam kondisi sistem yang sama. Rf adalah perbandingan jarak tempuh komponen dengan garis depan pelarut. KLT merupakan teknik yang cepat, meyakinkan, dan murah sehingga secara luas digunakan dalam analisis produk herbal. KLT memiliki kelebihan dalam menguji banyak contoh pada satu pelat di saat yang sama (Gu et al. 2006). Saat dilakukan analisis campuran kompleks seperti sampel herba menggunakan KLT, konsentrasi dari solut seringkali tidak diketahui, trial and error perlu dilakukan pada pelat KLT dengan tujuan mengetahui konsentrasi yang tepat untuk penotolan sampel, konsentrasi yang digunakan untuk penotolan sampel biasanya disesuaikan dengan metode deteksi yang digunakan (Fernand 2003).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan salah satu teknik kromatografi cair. KCKT memiliki kelebihan dibanding kromatografi gas yang hanya terbatas pada sampel tahan panas dan volatile, sampel yang tidak tahan panas dan nonvolatile dapat dianalisis menggunakan metode ini. Pada KCKT, sampel cair atau sampel padat dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, kemudian dilewatkan melalui kolom oleh fase gerak cair. Pemisahan komponen di dalamnya

6

ditentukan oleh interaksi komponen dengan fase diam (Harvey 2000).

KCKT dapat digunakan untuk analisis kuantitatif maupun kualitatif bagi sampel industri kosmetik, farmasi, dan lain sebagainya. Beberapa keuntungan yang diperoleh dari analisis menggunakan KCKT antara lain waktu pemisahan yang cepat, dapat menganalisis sampel yang beragam, dan presisi pengukuran yang lebih baik (Harvey 2000).

Gambar 4 Skema umum instrumen KCKT

(Harvey 2000)

KCKT merupakan metode yang umum digunakan dalam analisis obat herbal karena mudah digunakan dan tidak terbatas oleh sifat volatilitas dan stabilitas dari komponen sampel. Secara umum KCKT dapat menganalisis hampir seluruh komponen dalam obat herbal. Kolom fase terbalik pada KCKT merupakan kolom yang paling banyak digunakan dalam pemisahan analitis komponen obat herbal. Kondisi pemisahan optimum menggunakan KCKT dipengaruhi banyak faktor, seperti komposisi fase gerak, pengaturan pH, tekanan pompa, dan lain sebagainya (Liang et al. 2004).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain daun dan batang sambiloto, batang brotowali, etanol 30% dan 70%, air suling, telur udang laut (Artemia salina Leach), enzim α-glukosidase (Sigma-Aldrich), K2HPO4, KH2PO4, serum bovin albumin, p-nitrofenil glukopiranosida (p-NPG) (Sigma-Aldrich), dimetil sulfoksida (DMSO), Na2CO3, HCl, Glucobay®(Bayer) akarbosa, aseton, metanol, kloroform, etil asetat, dan diklorometana p.a. Alat yang digunakan antara lain peralatan kaca sederhana, neraca analitik, pelat KLT,

oven, microplate reader, bejana pengembang, ultrasonic bath dengan frekuensi 38 kHz, sentrifus, Camag Linomat 5, penguap putar, dan alat kromatografi cair kinerja tinggi Hitachi 20-AD.

Metode

Penelitian ini dibagi ke dalam 3 tahap (Lampiran 1). Tahap pertama adalah ekstraksi herba sambiloto (daun dan batang) dan brotowali (batang) menggunakan pelarut etanol dan air, kemudian dilakukan pengujian aktivitas inhibisi α-glukosidase pada beberapa konsentrasi dari masing-masing ekstrak tersebut hingga diperoleh nilai IC50. Tahap kedua adalah memformulasikan ekstrak dengan IC50 terendah dari kedua ekstrak, kemudian diuji kembali aktivitas inhibisi α-glukosidase dari masing-masing formula tersebut. Tahap ketiga adalah melakukan analisis sidik jari formula terbaik dan masing-masing ekstrak tunggal dengan menggunakan KLT lalu dilanjutkan dengan KCKT.

Preparasi Contoh Daun dan batang sambiloto serta batang brotowali yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Tawangmangu, Jawa Tengah, Indonesia. Sampel dikeringkan hingga kadar air kurang dari 10% di dalam oven bersuhu tidak lebih dari 50 oC. Setelah itu, digiling hingga menjadi serbuk. Serbuk ini selanjutnya disebut simplisia.

Penentuan Kadar Air (AOAC 1999) Masing-masing simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah dipanaskan sebelumnya di dalam oven bersuhu 105 oC selama 30 menit dan telah diketahui bobotnya. Cawan porselin berisi sampel tersebut kemudian dipanaskan di dalam oven bersuhu 105 oC selama 3 jam lalu didinginkan di dalam eksikator dan ditimbang. Pemanasan kembali dilakukan di dalam oven hingga diperoleh bobot konstan.

Kadar air (%) = %100×−A

BA

Keterangan: A = bobot simplisia sebelum dikeringkan (g) B = bobot simplisia setelah dikeringkan (g)

Maserasi Masing-masing simplisia ditimbang sebanyak 25 g, lalu ditambahkan pelarut (air

7

suling, etanol 30%, dan etanol 70%) sebanyak 125 mL, didiamkan selama 3 × 24 jam, disaring setiap 24 jam dan dilakukan penambahan kembali pelarut. Ekstrak disaring dan pelarutnya diuapkan menggunakan penguap putar sebelum dilakukan pengeringan beku hingga diperoleh ekstrak kering. Ultrasonikasi Masing-masing simplisia ditimbang sebanyak 25 gram, lalu masing-masing ditambahkan pelarut (air suling, etanol 30% , dan 70%) sebanyak 125 mL, kemudian ditempatkan di dalam ultrasonic bath selama 30 menit dengan frekuensi gelombang 38 kHz. Ekstrak disaring dan pelarutnya diuapkan menggunakan penguap putar lalu dilakukan pengeringan beku hingga diperoleh ekstrak kering.

Uji Toksisitas Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

Penetasan telur udang dilakukan dengan memasukkan sebanyak ± 100 mg telur udang ke dalam wadah berisi air laut yang diberi suplai udara menggunakan aerator selama 48 jam. Larutan uji yang digunakan memiliki konsentrasi 2500, 1000, 750, 500, dan 250 ppm.

Dipipet sebanyak 10 ekor larva udang dalam maksimum 1000 µL air laut ke dalam wadah uji, kemudian ditambahkan 1000 µL masing-masing ekstrak dengan konsentrasi dua kali lebih besar dari konsentrasi yang diinginkan. Setiap konsentrasi uji dilakukan empat kali pengulangan. Perlakuan untuk kontrol sama seperti di atas, hanya saja tanpa penambahan sampel. Larutan didiamkan selama 24 jam, lalu dihitung jumlah kematian larva udang pada masing-masing wadah dan dilakukan koreksi terhadap kontrol.

Nilai LC50 diperoleh dari hubungan antara konsentrasi (x) dengan% mortalitas menggunakan metode regresi.

Uji Inhibisi Enzim α-glukosidase (Sugiwati et al. 2009).

Masing-masing ekstrak yang akan diuji dilarutkan di dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 2000 ppm. Larutan enzim dibuat dengan melarutkan sebanyak 1 mg enzim α-glukosidase dalam 10 mL buffer fosfat 100 mM (pH 7.0) yang mengandung 200 mg serum bovin albumin. Sebanyak 0.5 mL larutan enzim tersebut diencerkan 100 kali dengan buffer fosfat pH 7.0 sebelum digunakan. (Subramanian et al.

2008). Campuran pereaksi diinkubasi pada suhu 37 oC selama lima menit. Setelah lima menit, ditambahkan larutan enzim α-glukosidase sebanyak 25 µL, kemudian diinkubasi kembali selama 15 menit. Dilakukan penambahan Na2CO3 200 mM sebanyak 100 µL untuk menghentikan reaksi enzim. Akarbosa digunakan sebagai kontrol positif dengan melarutkan tablet akarbosa dalam buffer fosfat pH 7.0 dan HCl 2N (1:1) dengan konsentrasi 1%. Kemudian larutan disentrifusa dan supernatannya diambil sebanyak 1 µL dan dimasukkan ke dalam sistem pereaksi seperti sampel. Sistem pereaksi dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Sistem pereaksi pengujian aktivitas enzim α glukosidase

Volume (µL)

Larutan Blanko Kontrol (+)

Kontrol (-) (So)

Sampel (S1)

Ekstrak - - 25 25

Buffer 50 50 25 25

Substrat 25 25 25 25

Inkubasi 37 oC, 5 menit

Buffer 25 - 25 -

Enzim - 25 - 25

Inkubasi 37 oC, 15 menit

Na2CO3 100 100 100 100

Larutan tersebut kemudian diukur absorbansnya menggunakan microplate reader pada 400 nm. Sampel dan kontrol positif dilakukan tiga kali ulangan (triplo). Persentase Inhibisi dapat dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut : Persentase Inhibisi

%100)( 01 ×

−−=

KSSK

K : absorbans kontrol - blanko S1 : absorbans sampel dengan penambahan

enzim S0: absorbans sampel tanpa penambahan

enzim

Nilai IC50 diperoleh dengan memplot konsentrasi ekstrak dengan log persen inhibisi ekstrak menggunakan analisis regresi. Nilai IC50 adalah nilai konsentrasi yang menghambat 50% kerja enzim.

8

Formulasi Ekstrak Sambiloto dan Brotowali

Formula ekstrak yang dibuat terdiri atas beberapa komposisi (Tabel 2) yang merupakan gabungan dari masing-masing ekstrak sambiloto dan brotowali dengan nilai IC50 terendah. Kemudian dilakukan pengujian aktivitas inhibisi α-glukosidase dari formula-formula tersebut hingga diperoleh nilai IC50. Pada formula terbaik (nilai IC50 paling rendah) dilakukan analisis sidik jari menggunakan KLT lalu dilanjutkan dengan KCKT sebagai pembanding.

Tabel 2 Komposisi formula ekstrak kasar sambiloto dan brotowali

Formula Perbandingan komposisi ekstrak

(IC50)

Sambiloto Brotowali A 1 IC50 1 IC50 B 2 IC50 1 IC50 C 1 IC50 2 IC50 D 11/2 IC50 1/2 IC50 E 1/2 IC50 11/2 IC50

Pemilihan Fase Gerak Terbaik Enam jenis pelarut yang memiliki tingkat polaritas berbeda diujikan sebagai fase gerak, yaitu etanol, metanol, aseton, diklorometana, etil asetat, dan kloroform pada pelat KLT yang telah ditotolkan masing-masing ekstrak sambiloto, brotowali, serta formula sambiloto dan brotowali. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam bejana berisi fase gerak tersebut. Pengembangan dihentikan ketika fase gerak telah mencapai ± 1 cm dari tepi atas pelat KLT. Kemudian pelat diangkat, dikeringkan dan dideteksi dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm. Tiga fase gerak yang menghasilkan pita terbanyak dan terpisah dipilih untuk digunakan sebagai fase gerak (A, B, C) pada analisis sidik jari. Ketiga fase gerak tersebut dikombinasikan menggunakan rancangan simplex centroid axial design dengan komposisi seperti pada Tabel 3. Pengembangan komponen kemudian dilakukan di dalam bejana pengembang. Deteksi komponen dilakukan di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Dihitung nilai Rf dari masing-masing pita yang terbentuk. Data yang diperoleh kemudian diolah menggunakan peranti lunak Stat ease Design Expert 8.0.6 trial version, sehingga dapat ditentukan komposisi fase gerak terbaik untuk pemisahan komponen dalam ekstrak.

Tabel 3 Komposisi fase gerak menggunakan simplex centroid axial design

Fase gerak

Perbandingan komposisi fase gerak (v/v/v)

A B C 1 1 0 0 2 0 0 1 3 0 1 0 4 ½ 0 ½ 5 0 ½ ½ 6 ½ ½ 0 7 1/3 1/3 1/3 8 1/6 2/3 1/6 9 1/6 1/6 2/3

10 2/3 1/6 1/6

Analisis Sidik Jari Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ekstrak sambiloto, formula, dan standar andrografolida (senyawa penciri pada sambiloto) diinjeksikan ke dalam alat KCKT dengan pemisahan menggunakan kolom fase terbalik. Fase gerak yang digunakan adalah metanol:air (52.5:47.5) dengan laju alir 1 mL/menit, volume injeksi sampel 10 µL pada panjang gelombang 220 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Kadar Air Simplisia

Simplisia disiapkan dari tanaman sambiloto dan brotowali yang telah dikeringkan di bawah suhu 50 oC hingga kandungan airnya kurang dari 10%, kemudian digiling dan ditentukan kadar airnya menggunakan metode gravimetri tak langsung pada suhu 105 oC. Penentuan kadar air pada penelitian ini bertujuan mengetahui kandungan zat pada sampel yang dinyatakan dalam persen bahan kering (Harjadi 1986). Menurut Harjadi (1986), jumlah air yang terkandung dalam bahan bergantung pada perlakuan yang telah dialami bahan tersebut, kelembaban udara dan faktor lainnya. Dalam ruang lingkup analisis tanaman obat, kadar air menjadi sangat penting. Selain karena dapat digunakan sebagai parameter ketahanan bahan dalam penyimpanan (Winarno 1992), kadar air juga berperan sebagai faktor koreksi terhadap rendemen hasil ekstraksi bahan. Kadar air simplisia sambiloto yang diperoleh adalah 5.47% dan brotowali 4.67% (Lampiran 2). Hasil tersebut masih berada di bawah persyaratan maksimum kadar air untuk bahan baku obat

tradisional, 661/IMENKsimplisia sadengan btumbuhan sberasal darilebih banyasimplisia bryang lebih karena itu, analisis yankadar air sisangat mung

Ekstra

Jenis ekmaserasi dajenis pelarut70%. Ekstbrotowali de3 ulangan sdan etanol ssenyawa polobat.

Polaritasdalam indekpolaritas, sbegitu pula(Lampiran 3sedangkan iPolaritas etaditentukan dengan indhasil kali polaritasnyaberdasarkansedangkan e Maserasdiperoleh menggunakaetanol 70%25.60%, danbrotowali 11.28% (Gterendah, baadalah ekstetanol 70%rendemen t30%, denganrendemen ebanyaknya sambiloto ypolaritas ebrotowali, ekstrak dendengan ek

yaitu 10% (KES/SK/VII/1mbiloto lebih

brotowali dambiloto yani daun dan baak mengandurotowali beras

sedikit mendengan perla

ng sama kemimplisia sambgkin terjadi.

aksi SimplisiaBrotow

kstraksi yangan ultrasonikt, yaitu air, etatraksi sampengan metodesetiap perlakusebagai pelarular yang mem

s suatu pelarks polaritas. Ssemakin polaa sebaliknya3) indeks polaindeks polaritanol 30% da dari hasil

deks polaritasproporsi a

a. Polarn perhitungetanol 70% adsi.. Rendemen

untuk san pelarut ai

% berturut-turn 26.39%, sedadalah 11.0

Gambar 5). aik untuk samtrak air. Pada% merupakatertinggi, diin perbedaan y

ekstrak etanol komponen

yang memilikietanol 70%.ekstrak etan

ngan rendemkstrak etanol

(SK Menkes 994). Kada

h tinggi dibanddikarenakan g dijadikan siatang lunak sung air, sedsal dari batanngandung airakuan prepar

mungkinan pebiloto dan br

a Sambiloto dwali

g digunakan kasi menggunanol 30%, dan

pel sambilote maserasi diuan. Penggunut bertujuan m

miliki aktivitas

rut lazim dinSemakin besarar pelarut ta. Menurut aritas air adalatas etanol adaan etanol 70%kali proporsisnya lalu diair dengan itas etanol

gan adalah dalah 6.07. n ekstrak kerinsampel sair, etanol 30rut adalah 1

dangkan untuk00%, 12.86%

Rendemen mbiloto dan bra sambiloto, an ekstrak ikuti ekstrak yang kecil. Tin

70% terkait n pada ti polaritas me Sedangkanol 30% meren tertinggi, l 70%. Tin

RI No ar air dingkan

bagian implisia ehingga dangkan ng kaku r. Oleh rasi dan rbedaan rotowali

dan

adalah nakan 3 n etanol to dan lakukan

naan air menarik sebagai

nyatakan r indeks tersebut,

Snyder ah 10.2,

alah 4.3. % dapat i etanol itambah

indeks 30% 8.43

ng yang ambiloto %, dan 19.19%,

k sampel %, dan

ekstrak rotowali ekstrak dengan etanol

ngginya dengan

tanaman endekati n pada rupakan

diikuti ngginya

rendemen pamemiliki polabanyaknya kpada tanaman

Gambar 5 Rb

Ultrasoniyang diperomenggunakanetanol 70% 14.89%, dan brotowali ada(Gambar 6).tertinggi mermenggunakanbrotowali eksyang paling ekstraksi menlebih rendah dmenggunakan

Gambar 6 Rb

Penggunasimplisia samatas polaritmemiliki ketersebut. andrografolidutama pembsambiloto ya

ada ekstrak daritas cukup tkomponen pon brotowali.

Rendemen ekbrotowali meto

ikasi. Rendemoleh untuk n pelarut air

berturut-turu17.13%, sedanalah 11.39%, . Rendemen rupakan ekstn etanol 70%strak air mengtinggi. Secarnggunakan mdibandingkann metode mas

Rendemen eksbrotowali meto

aan pelarut pmbiloto dan brtas komponeaktifan padaPada sam

da yang merberi efek obang mudah l

engan pelaruttinggi menunjolar yang te

kstrak sambilode maserasi.

men ekstrak sampel sam

, etanol 30%ut adalah 15ngkan untuk s11.19%, dan ekstrak sam

trak hasil ek%, sedangkanghasilkan renra umum ren

metode ultrason rendemen ekerasi.

strak sambilotode ultrasonik

olar pada ekrotowali dida

nen yang da kedua tan

mbiloto, terupakan kombat pada tanlarut dalam e

9

t yang jukkan erdapat

oto &

kering mbiloto %, dan 5.88%, sampel 8.16%

mbiloto kstraksi n pada demen demen onikasi kstraksi

to & kasi.

kstraksi asarkan diduga naman

erdapat mponen

naman etanol,

metanol, as(Wongkittipbrotowali, y(1989), ekshipoglikemipasti kombertanggungbrotowali se

Uji Tok

Pada pedigunakan emetode ekmaserasi. Duntuk setiapsambiloto detanol 70%adalah 674.ppm, sedanLC50 sebesa588.77 ppmdikatakan to< 1000 ppmekstrak sampelarut air,memiliki aksebagai obat

Nilai mengetahui juga bergukonsentrasi menyebabkasehingga pdijadikan konsentrasi α-glukosida

Gambar 7

Uji In

Ekstrak tunPengujia

glukosidase

sam asetat, ppong et al. 20yang dinyataktrak air brotoia, namun bel

mponen apa g jawab terhaebagai obat.

ksisitas Larva

enentuan tokekstrak yang bkstraksi, ya

Dilakukan empp perlakuan. engan pelarut

% yang dipe01 ppm, 659.

ngkan ekstrakar 680.80 ppmm (Lampiranoksik atau aktm (Juniarti etmbiloto dan etanol 30%ktivitas biolot. LC50 selain

aktivitas biuna sebaga

bahan yangan toksisitaspada peneliti

acuan uuji pada penese.

Nilai LC50 ekbrotowali

nhibisi Enzim

nggal an awal in

dilakukan

piridina, dan 04). Sedangkkan oleh Nooowali memililum diketahui

yang sajaadap aktivitas

a Udang ekst

ksisitas larva berasal dari saaitu ekstrak pat kali peng

Nilai LC50t air, etanol 30eroleh bertur.60 ppm, dan

k brotowali mm, 659.60 pp

n 4). Suatu if jika memilit al. 2009), s

brotowali %, dan etanoogis yang ber

n berguna ologis suatu i acuan tg aman dans jika dikoan ini, nila

untuk menentuan inhibis

kstrak sambilo

m α-glukosida

nhibisi enzn pada

aseton kan pada or et al iki efek i secara

a yang ekstrak

rak

udang atu jenis

hasil ulangan ekstrak

0%, dan rut-turut

n 522.37 memiliki pm, dan

ekstrak iki LC50 ehingga dengan

ol 70% rpotensi

untuk bahan,

terhadap n tidak onsumsi, ai LC50 entukan

si enzim

oto dan

se

im α-rentang

konsentrasi tersebut, eksmenunjukkantinggi diband30% sehinglanjut dengan(Lampiran 5 masing-masindan brotowalidengan IC50maserasi broditunjukkan p

Tabel 4 Nisam

Ekstrak

Sambiloto

Brotowali

Nilai IC50maserasi samcukup tinggi LC50 masing-berpotensi mdikonsumsi pekstrak sonikekstrak masdiformulasika

Formula Eks Formula Tabel 2 (fodilakukan pglukosidase ktersebut. Haterhadap fodengan tingformula B, ykali IC50 ekst1 kali IC50 ekdapat dilihat p

Tabel 5 Inhfor

Formula

Pe

S

A B C D E

250-1000 pstrak etanol 7n aktivitas indingkan ekstrga dilakukann rentang kondan 6). Nilai

ng ekstrak etai yaitu ekstraksebesar 55.3

otowali dengapada Tabel 4.

ilai IC50 ekmbiloto dan br

Metode ekst

Maseras

Ultrasonik

Maseras

Ultrasonik

0 ekstrak sonimbiloto memi

( > 800 ppm)-masing ekstramemberikan pada konsentrkasi etanol 7serasi etanolan dengan per

strak Sambildengan komp

ormula A-E) pengujian inkembali terhaasil pengujiaormula menugkat inhibisiyang komposirak sambilotokstrak brotowpada Tabel 5)

hibisi enzimrmula sambilo

erbandingan kekstrak (IC

ambiloto B

1 2 1

11/2 1/2

ppm.. Dari 70% secara nhibisi yang rak air dan n pengujian nsentrasi lebihi IC50 terendaanol 70% samk sonikasi sam6 ppm dan ean IC50 68.29

kstrak etanol rotowali

traksi IC50(

si 91

kasi 55

si 68

kasi 88

ikasi brotowaliki nilai IC5), yaitu di ataak tersebut seh

efek racunrasi tersebut.

70% sambilotl 70% kemrbandingan ter

oto dan Brotposisi seperti

dibuat, kemnhibisi enzimdap kelima foan inhibisi unjukkan foi terbesar isinya terdiri o berbanding dwali (hasil pen).

m α-glukooto-brotowali

komposisi C50)

inBrotowali

1 1 2

1/2 11/2

10

hasil umum

lebih etanol lebih

h lebar ah dari mbiloto mbiloto ekstrak 9 ppm

70%

(ppm)

6.54

5.36

8.29

9.23

ali dan 0 yang

as nilai hingga

n jika Maka

to dan mudian rtentu.

owali i pada mudian m α-ormula enzim

ormula adalah atas 2

dengan ngujian

osidase

% nhibisi

6.77 28.11 26.37 8.08 1.79

11

Inhibisi formula B menunjukkan hasil paling baik, yaitu 28%. Namun, jika dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak masiing-masing sambiloto dan brotowali yang dicampurkan ( ½ - 2 kali nilai IC50), maka terlihat aktivitas inhibisi yang lebih rendah. Hal ini mungkin terjadi diakibatkan tidak sinergisnya perpaduan antara ekstrak sambiloto dan brotowali dalam menginhibisi kerja enzim α-glukosidase. Mekanisme kerja komponen dalam kedua ekstrak yang berbeda mungkin menjadi salah satu alasan lebih tingginya aktivitas inhibisi ekstrak tunggal dibandingkan dengan aktivitas inhibisi formula. Sebagai pembanding aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase, digunakan Glucobay® akarbosa. IC50 akarbosa yang diperoleh sangat rendah, yaitu < 0.390625 ppm (Lampiran 7).

Analisis Sidik Jari

Penentuan Fase Gerak Terbaik Enam jenis pelarut digunakan sebagai fase gerak, yaitu kloroform, etil asetat, etanol, metanol, diklorometana dan aseton. Hasil pemisahan KLT keenam fase gerak tunggal dapat dilihat pada Lampiran 8 dan jumlah spot dapat dilihat pada Tabel 6. Tampak terlihat perbedaan kemampuan keenam fase gerak tersebut dalam memisahkan komponen melalui bercak yang dihasilkan. Elusi ekstrak sambiloto dengan fase gerak diklorometana, metanol, dan etil asetat menunjukkan jumlah bercak yang lebih banyak dan atau keterpisahan bercak yang lebih baik dibanding elusi menggunakan etanol, kloroform, dan aseton, sehingga ketiga fase gerak ini kemudian dipilih untuk dimasukkan ke dalam model simplex centroid axial design yang bertujuan untuk mengetahui komposisi fase gerak terbaik bagi pemisahan komponen dalam ekstrak sambiloto menggunakan KLT. Pada elusi ekstrak brotowali, fase gerak etanol, kloroform, dan etil asetat menghasilkan jumlah bercak yang lebih banyak dan atau keterpisahan bercak yang lebih baik dibandingkan ketiga fase gerak lainnya, sehingga ketiga fase gerak ini digunakan dalam penentuan fase gerak terbaik menggunakan model simplex centroid axial design.

Tabel 6 Jumlah bercak pada elusi fase gerak tunggal ekstrak sambiloto dan brotowali di bawah sinar UV 366 nm

Fase gerak Jumlah bercak Sambiloto Brotowali

Etanol 1 3 Kloroform 2 3

Diklorometana 2 2 Aseton 1 2 Metanol 1 1

Etil asetat 4 5

Ketiga fase gerak terbaik kemudian dikomposisikan sesuai Tabel 3 (simplex centroid axial design). Hasil elusi dari komposisi fase gerak ini dapat dilihat pada Gambar 8 (sambiloto) dan 9 (brotowali) sementara jumlah pita yang dihasilkan dapat dilihat pada Tabel 7 (sambiloto) dan Tabel 8 (brotowali)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 8 Profil KLT elusi ekstrak sambiloto menggunakan fase gerak campuran komposisi 1-10 di bawah sinar UV 366 nm.

Dilihat dari jumlah pita yang dihasilkan dan keterpisahan pita, maka fase gerak komposisi 2 untuk ekstrak sambiloto yang merupakan fase gerak etil asetat tunggal dan komposisi 4 untuk ekstrak brotowali yang terdiri atas kloroform:etanol:etil asetat (½:0:½) merupakan fase gerak yang menghasilkan jumlah pita terbanyak dengan pemisahan yang baik sehingga dapat digunakan dalam pemisahan komponen ekstrak sambiloto dan brotowali. Selanjutnya dilakukan pengolahan data menggunakan piranti lunak untuk mengetahui komposisi optimum dari pemisahan.

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 9 Profil KLT elusi ekstrak brotowali menggunakan fase gerak campuran komposisi 1-10 di bawah sinar UV 366 nm.

Tabel 7 Jumlah pita pada elusi ekstrak sambiloto menggunakan fase gerak campuran di bawah sinar UV 366 nm

Komposisi

Fase gerak (diklorometana:metanol:

etil asetat )

Jumla

h pita

1 1 :0: 0 1 2 0 :0: 1 5 3 0 :1: 0 1 4 ½ :0: ½ 3 5 0 : ½: ½ 1 6 ½ :½: 0 1 7 1/3 :0: 1/3 2 8 1/6 :2/3: 1/6 1 9 1/6 :1/6: 2/3 3

10 2/3 :1/6: 1/6 3

Tabel 8 Jumlah pita pada elusi ekstrak brotowali menggunakan fase gerak campuran

Komposisi Fase gerak (kloroform:

etanol:etil asetat )

Jumlah pita

1 1 :0: 0 6 2 0 :0: 1 6 3 0 :1: 0 3 4 ½ :0: ½ 9 5 0 : ½: ½ 3 6 ½ :½: 0 3 7 1/3 :0: 1/3 4 8 1/6 :2/3: 1/6 3 9 1/6 :1/6: 2/3 6

10 2/3 :1/6: 1/6 5

Pengoptimuman fase gerak terbaik Jumlah pita dalam elusi menggunakan

fase gerak campuran dijadikan parameter respon dan diolah menggunakan peranti lunak

Stat-Ease Design Expert 8.0.6 trial version untuk memperoleh komposisi optimum yang memberikan hasil elusi terbaik. Hasil pengolahan data menunjukkan komposisi optimum untuk elusi ekstrak sambiloto adalah komposisi fase gerak diklorometana:metanol:etil asetat (0:0:1) dengan perkiraan jumlah pita sebanyak 4.32222 (Gambar 10) dan nilai desirability sebesar 0.831 (Gambar 11.). Sedangkan untuk ekstrak brotowali, komposisi fase gerak optimun terjadi pada komposisi kloroform:etanol:etil asetat (0.487:0:0.513) dengan perkiraan jumlah pita sebanyak 8.61459 (Gambar 12) dan nilai desirability sebesar 0.936 (Gambar 13).

Gambar 10 Plot kontur jumlah pita

campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak sambiloto.

Gambar 11 Plot kontur desirability campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak sambiloto.

13

Gambar 12 Plot kontur jumlah pita

campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak brotowali.

Gambar 13 Plot kontur desirability campuran simplex centroid axial design optimasi fase gerak terbaik ekstrak brotowali.

Hasil pengolahan data menggunakan piranti lunak menghasilkan kondisi optimum fase gerak untuk elusi ekstrak sambiloto yang sama jika dibandingkan dengan hasil elusi yang telah dilakukan, yaitu fase gerak etil asetat tunggal. Sedangkan untuk brotowali, kondisi optimum fase gerak sedikit berbeda antara hasil elusi awal dibanding setelah dilakukan optimasi menggunakan piranti lunak.

Sidik jari formula kemudian dianalisis menggunakan KLT dengan fase gerak optimum dari masing-masing pemisahan ekstrak tunggal sambiloto dan brotowali. Fase gerak optimum pemisahan komponen ekstrak sambiloto merupakan fase gerak tunggal etil asetat, sedangkan fase gerak optimum

pemisahan komponen ekstrak brotowali merupakan campuran kloroform:etanol:etil asetat (0.487:0:0.513). Profil KLT dari elusi formula dengan kedua komposisi fase gerak tersebut dapat dilihat pada Gambar 14 dan jumlah pita serta nilai Rf dapat dilihat pada Tabel 9.

(1) (2) Gambar 14 Profil KLT dan kromatogram

Formula hasil pengolahan piranti lunak menggunakan fase gerak optimum pemisahan ekstrak sambiloto (1) dan brotowali (2) di bawah sinar UV 366 nm.

Tabel 9 Jumlah pita dan nilai Rf formula

menggunakan fase gerak optimum sambiloto dan brotowali

Pita Fase gerak terbaik

Sambiloto Brotowali

1 - 0.05

2 0.11 0.12

3 0.18 0.17

4 0.27 0.24

5 0.35 -

6 0.43 0.43

7 0.51 0.48

8 0.60 -

9 - 0.65

10 0.75 0.77

Profil KLT pada Gambar 14, menunjukkan fase gerak optimum ekstrak sambiloto (etil asetat) menghasilkan jumlah pita dan pemisahan yang sedikit lebih baik

dibanding brotowali (0.487:0:0.5dilakukan anImage J verberupa punchasil represKLT yang warna pita p

Hasilintensitas piAnalisis olehatas pelat lapelat, kemkromatogrambagian kaintensitas dpada bagkromatogramfase gerak menghasilkapuncak-puncitu, fase gersambiloto dipemisahan k

Perbandisambiloto, menggunakadapat dilihat

1

Gambar 15

fase gerak ((kloroform

513)). Untuk nalisis menggrsi 1.40g, kelucak-puncak laysentasi pita-pluasnya berb

pada pelat KLTl pengolahita-pita yang h piranti lunakalu menurun

mudian dikom dimulai daranan kromadan jumlah pugian tengahm di mana t

optimum pan intensitas pcak yang lebi

rak optimum pigunakan sebakomponen foringan profil K

brotowali,an fase gerakt pada Gamba

2 3

Profil KLTsambiloto ((3), dan st(4) mengguasetat di bnm, serta andrografolUV 254 nm

optimum m:etanol:etil

lebih meyagunakan piranuaran yang dihyaknya kroma

pita pada pemanding lurus T. han menunterdapat padk dimulai darihingga bagia

onversi ke ri sebelah kiri atogram. Peuncak cukup h hingga terlihat pengpemisahan sapita dan keterih baik. Olehpemisahan komagai fase gerarmula. KLT ekstrak , dan k tunggal etiar 15.

3 4 5

T formula (1), (2), ekstrak brandar androg

unakan fase gebawah sinar U

profil KLT lida di bawa

m (5)

ekstrak asetat

akinkan, nti lunak hasilkan atogram misahan dengan

njukkan da pelat. i bagian

an dasar dalam

hingga rbedaan terlihat kanan

ggunaan ambiloto rpisahan h karena mponen

ak untuk

tunggal formula il asetat

ekstrak rotowali

grafolida erak etil UV 366

standar ah sinar

Pi

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

1

Terdapat (Tabel 10) dibandingkanmenggunakanpada pita denpada formulmasing-masinmungkin disemasing-masinsenyawa denkemudian muSenyawa hasimerupakan jawab terhada

Tabel 10 Jsfd

ita Formula

1 0.06

2 0.13

3 0.26

4 0.31

5 0.39

6 0.42

7 0.46

8 -

9 0.65

0 0.73

1 0.80

Pada profpita pada Rfprofil kromatsaja disebabbrotowali pembuatan fopada profil Kandrografolidsambiloto dan

Pemisahan MenggunakaTinggi Dilakukanandrografolidformula. Hamengandung ditandai deng

perbedaan jupada prof

n ekstrak tun pelarut yangngan nilai Rfla namun ting ekstrak peebabkan oleh ng ekstrak

ngan kepolaranuncul pada pil interaksi inkomponen

ap aktivitas fo

Jumlah pita dsambiloto, formula sambdi bawah sinar

Rf

Sambiloto

0.07

0.13

-

0.33

0.39

-

0.48

-

0.65

0.73

0.81

fil KLT brotowf 0.60 yang togram formu

bkan oleh keyang dica

ormula, sehingKLT formula. da sebagai pen formula.

Komponan Kromatog

n analisis KCKda, ekstrak asil yang di

komponen agan puncak y

umlah pita dfil KLT founggal pada g sama, ditunjf 0.42 yang midak muncul enyusunnya, hinteraksi komyang memb

n berbeda sehrofil KLT foi kemungkinayang bertan

ormula sebaga

dan nilai Rf ebrotowali

iloto dan bror UV 366 nm

Broto-wali

-

0.14

0.29

0.35

0.40

-

0.49

0.60

0.69

0.75

0.83

wali, terlihat atidak muncul

ula, hal ini muecilnya konsampurkan gga tidak terdDigunakan s

enciri untuk e

nen Fografi Cair K

KT terhadap ssambiloto,

iperoleh, samandrografolidayang identik d

14

dan Rf ormula

elusi jukkan

muncul pada

hal ini mponen bentuk hingga

ormula. an juga nggung ai obat. ekstrak

serta otowali

Andro-grafolida

-

-

-

-

-

-

0.49

-

0.67

-

-

adanya l pada ungkin entrasi dalam

deteksi standar ekstrak

ormula Kinerja

standar dan

mbiloto a yang dengan

15

standar pada waktu retensi yang hampir sama (Lampiran 9). Pemisahan formula dilakukan menggunakan kondisi pemisahan yang sama dengan metode pemisahan komponen sambiloto. Hasil pemisahan formula yang dilakukan ternyata tidak menghasilkan puncak baru yang memiliki intensitas tinggi jika dibandingkan dengan puncak-puncak pada profil kromatogram ekstrak sambiloto. Artinya, pemisahan komponen formula sambiloto dan brotowali menggunakan kondisi pemisahan ekstrak sambiloto tidak dapat memisahkan komponen brotowali dengan baik sehingga perlu dilakukan optimasi kondisi pemisahan formula untuk memperoleh sidik jarinya.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Ekstrak sambiloto dengan aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase terbaik adalah ekstrak ultrasonikasi etanol 70% dengan IC50 sebesar 55.36 ppm. Sedangkan, ekstrak brotowali terbaik adalah ekstrak maserasi etanol 70% dengan IC50 68.29 ppm.

Formula dengan komposisi ekstrak sambiloto:ekstrak brotowali (2 IC50:1 IC50) merupakan formula dengan aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase paling baik, dengan persen inhibisi 28.11%. Aktivitas inhibisi formula ekstrak sambiloto dan brotowali etanol 70% lebih rendah dibandingkan aktivitas inhibisi masing-masing ekstrak tunggalnya. Komposisi fase gerak terbaik untuk pemisahan ekstrak sambiloto menggunakan model simplex centroid axial design adalah komposisi diklorometana:metanol:etil asetat (0:0:1), sedangkan untuk brotowali, kondisi fase gerak optimum terjadi pada komposisi komposisi kloroform:etanol:etil asetat (0.487:0:0.513). Kondisi pemisahan KCKT untuk sambiloto yang digunakan untuk analisis sidik jari formula tidak memberikan informasi mengenai komponen-komponen penyusun yang berasal dari brotowali.

Saran

Perlu diteliti mekanisme kerja komponen-komponen dalam ekstrak sambiloto dan brotowali dalam kaitan pengobatan DM tipe II dan perlu pula dilakukan optimasi formulasi serta kondisi KCKT untuk memperoleh sidik jari formula campuran sambiloto dan brotowali.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad M, Razak A, Akowuah GA, Asmawi Z, Zhari I. 2007. HPLC profile and antihyperglycemic effect of ethanol extracts of Andrographis paniculata in normal and streptozotocin-induced diabetic rats. J Nat Med 61:422-429.

Amom Z, et al. 2009. Nutritional

composition, antioxidant ability and flavonoid content of Tinospora crispa stem. Adv in Nat and Appl Sci3(1): 88-94.

Dalimunthe A. 2009. Interaksi Sambiloto

(Andrographis paniculata). Medan:Fakultas Farmasi, Universitas Sumatra Utara.

Dobiáš P et al. 2010. Comparison of

pressurised fluid and ultrasonic extraction methods for analysis of plant antioxidants and their antioxidant capacity. Central Eur J of Chem 8(1):87-95.

Fernand VE. 2003. Initial characterization of

crude extracts from phyllanthus amarus schum. and thonn. and quassia amara l. using normal phase thin layer chromatography [Tesis]. Fakultas pascasarjana, Lousiana State University.

Gu M, Su Z, Ouyang F. 2006. Fingerprinting

of salvia miltiorrhiza bunge by thin-layer chromatography scan compared with high speed countercurrent chromatography. J Liquid Chromatography and Related Tech29:1503-1514.

Gritter R, Bobbitt JM, Schwarting AE. 1991.

Pengantar Kromatografi. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB Press. Terjemahan dari : Introduction to Chromatography.

Handa SS, Khanuja SPS, Longo G, Rakesh

DD. 2008. Extraction Technologies For Medicinal And Aromatic Plants. Trieste : International Centre For Science And High Technology.

Harvey D. 2000. Modern Analytical

Chemistry. USA : McGraw-Hill Companies, Inc.

16

Indraswari A. 2008. Optimasi pembuatan ekstrak daun dewandaru (Eugenia uniflora l.) menggunakan metode maserasi dengan parameter kadar total senyawa fenolik dan flavonoid[Skripsi]. Surakarta : Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Juniarti, Osmeli D, Yuhernita. 2009.

Kandungan senyawa kimia, uji toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) dari ekstrak daun saga (Abrus precatorius L.). Makara, Sains, 13(1):50-54.

Kresnady B. 2003. Khasiat & Manfaat

Brotowali : Si Pahit Yang Menyembuhkan. Depok : PT Agromedia Pustaka.

Kumar P, Chu C, Krishnaiah D, Bono A.2006.

High hydrostatic pressure extraction of antioxidants from morinda citrifolia fruit-process parameters optimization. J Engineering Sci& Tech 1(1):41-49.

Li CM, et al. 2010. Comparison of Crataegus

pinnatifida bunge var. typica Schneider and C. pinnatifida bunge fruits for antioxidant, anti-α-glucosidase, and anti-inflammatory activities. Food Sci.Biotech19(3):769-775.

Liang YZ, Xie P, Chan K. 2004. Quality

control of herbal medicine. J Chromatography B 812:53-70.

Mann A, Ibrahim K, Oyewale AO, Amupitan

JO, Fatope MO, Okogun JI. 2011. Brine shrimp toxicity evaluation of the root bark extract of Terminalia avicennioides. African J Sci Research 4(1):221-228.

Marthianti A. 2006. Pengaruh pemberian

ekstrak batang Tinospora crispa dibandingkan dengan kloroquin terhadap jumlah eritrosit mencit Swiss yang diinfeksi Plasmodium berghei [Skripsi]. Semarang : Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro.

McLaughlin JL, Rogers LL, Anderson JE.

1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Information J 22:513-524.

Melecchi et al. 2006. Optimization of the sonication extraction method of Hibiscus tiliaceus L. flowers. Ultrasonics sonochemistry 13:242-250.

Meloan CE. 1999. Chemical Separation. New

York : J Wiley. Milhem MM, Al-Hiyasat AS, Darmani H.

2008.Toxicity testing of restorative dental materials using brine shrimp larvae (Artemia salina). J Applied Oral Sci 16(4):297-301.

Noor H, Hammonds P, Sutton R, Ashcroft

SJH. 1989. The hypoglycaemic and insulinotropic activity of Tinospora crispa: studies with human and rat islets and HIT-T15 B cells. Diabetologia 32:354-359.

Poretsky L. 2009. Principle of Diabetes

Mellitus. New York : Springer. Rajkumar T, Sinha BN. 2010.

Chromatographic finger print analysis of budmunchiamines in Albizia amara by HPTLC technique. Int J Res Pharm Sci 1(3):313-316.

Said KABM. 2009. Ultrasonic extraction of

antioxidant compound in Guava [Tesis]. Pahang : Faculty of Chemical & Natural Resources Engineering, Universiti Malaysia Pahang.

[SK MenKes] Surat Keputusan Menteri

Kesehatan Republik Indonesia. 1994. Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 661/Menkes/Sk/VII/1994 Tentang Persyaratan Obat Tradisional. Jakarta.

Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR.

2004. Fundamental of Analysis Chemistry. Edisi ke-8. Canada : Brooks/Cole-Thomson Learning.

Snyder LR, Kirkland JJ. 1979. Introduction to

Modern Liquid Chromatography. New York: Wiley.

Sou S, et al. 2000. Novel α-glucosidase

inhibitors with tetrachloropthlamide skeleton. Bioorganic & MedChem Letters 10:1081-1084.

17

Subramanian R, Asmawi MZ, Sadikun A. 2008. In vitro α-glucosidase and α-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and andrographolide. Acta Biochimica Polonica 55(2):391-398.

Sugiwati S, Kardono LBS, Bintang M. 2006.

α-Glucosidase inhibitory activity and hypoglycemic effect of Phaleria macrocarpa fruit pericarp extract by oral administration to rats. J Appl Sci 6(10):2312-2316.

Sugiwati S, Setiasih S, Afifah E. 2009.

Antihyperglycemic activity of mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] leaf extracts as an alpha-glucosidase inhibitor. Makara Kesehatan 13(2):74-78.

Sunil C, et al. 2009. α-Glucosidase inhibitory

and antidiabetic activities of ethanolic extract of Pisonia alba span. Leaf. Int J Integrative Biology 6(1):41-45.

Verbitski SM, Gourdin GT, Ikenouye LM,

McChesney JD. 2008. Detection of Actaea racemosa adulteration by Thin-Layer Chromatography and combined Thin-Layer Chromatography-bioluminescence. J AOAC Int 91:268-275.

\

Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. 2004. Global prevalence of diabetes estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27(5):1047-1055.

Wongkittipong R, Plat L, Damlonglerd S,

Gourdon C. 2004. Solid–liquid extraction of andrographolide from plants—experimental study, kinetic reaction and model. Separation and Purification Tech 40:147-154.

Ye F, Shen Z, Xie M. 2002. Alpha-

glucosidase inhibition from a Chinese medical herb (Ramulus mori) in normal and diabetic rats and mice. Phytomedicine 9:161-166.

Yulinah E, Sukrasno, Fitri MA. 2001.

Aktivitas antidiabetika ekstrak etanol Herba sambiloto (Andrographis paniculata Nees (Acanthaceae)). JMS 6(1):13-20.

LAMPIRAN

19

Lampiran 1 Bagan Alir Lingkup Kerja Penelitian

Batang tanaman brotowali

Ekstraksi (maserasi dan ultrasonikasi

dengan air suling, etanol 30 dan 70%)

Uji aktivitas inhibisi α-glukosidase

Nilai IC50

Konsentrasi ekstrak dengan aktivitas

inhibisi terbaik

Daun dan batang tanaman sambiloto

Ekstraksi (maserasi dan ultrasonikasi

dengan air suling, etanol 30 dan 70%)

Uji aktivitas inhibisi α-glukosidase

Nilai IC50

Konsentrasi ekstrak dengan aktivitas

inhibisi terbaik

Forrmulasi

Uji aktivitas Uji aktivitas inhibisi α-glukosidase formula

Formula dengan aktivitas inhibisi α-glukosidase terbaik

Analisis sidik jari formula terbaik

Menggunakan KLT dan KCKT

20

Lampiran 2 Kadar air sampel sambiloto dan brotowali

Sambiloto

Ulangan Bobot

simplisia awal

Bobot simplisia setelah

dikeringkan

Kadar air (% b/b)

1 3.0050 2.8422 5.42 2 3.0029 2.8406 5.40 3 3.0023 2.8344 5.59

rerata 5.47

Brotowali

Ulangan Bobot

simplisia awal

Bobot simplisia setelah

dikeringkan

Kadar air (% b/b)

1 3.0014 2.8620 4.64 2 3.0056 2.8665 4.63 3 3.0020 2.8601 4.73

rerata 4.67

Kadar air (KA) (%) = %100A

BA×

−

= %1000050.3

8422.20050.3×

−

= 5.42% Keterangan:

A : Bobot simplisia sebelum dikeringkan (g) B : Bobot simplisia setelah dikeringkan (g)

21

Lampiran 3 Indeks polaritas fase gerak menurut Snyder

Fase gerak Indeks polaritas Air 10.2

Aseton 5.1 Kloroform 4.1

Etanol 4.3 Metanol 5.1

Etil Asetat 4.4 Diklorometana 3.1

22

Lampiran 4 Uji Toksisitas Ekstrak Sambiloto dan Brotowali (metode larva udang)

Sambiloto

Pelarut Persamaan garis R2 LC50 (ppm)

Air y = 58.88 ln(x) - 333.5 0.897 674.01

Etanol 30% y = 56.75 ln(x) - 318.4 0.956 659.60

Etanol 70% y = 55.19 ln(x) - 295.4 0.995 522.37

Regresi Linier : Plot Log konsentrasi sebagai X dan % mortalitas sebagai Y

y = a + bx

50 = 58.88 ln(x) - 333.5

x = 674.01 ppm

Brotowali

Pelarut Persamaan garis R2 LC50 (ppm)

Air y = 51.37 ln(x) - 285.1 0.876 680.80

Etanol 30% y = 56.75 ln(x) - 318.4 0.956 659.60

Etanol 70% y = 59.36 ln(x) - 328.6 0.919 659.60

Regresi Linier : Plot Log konsentrasi sebagai X dan % mortalitas sebagai Y

y = a + bx

50 = 51.37 ln(x) – 285.1

x = 680.80 ppm

23

Lampiran 5 Uji inhibisi enzim α-glukosidase (in vitro) ekstrak Sambiloto dan Brotowali

Sambiloto

Maserasi

Etanol 70%

Konsentrasi (ppm)

inhibisi rerata (%)

250 56.87659 500 61.62448 750 57.46518 1000 51.22621

Sonikasi

Etanol 70%

Konsentrasi (ppm) inhibisi rerata (%)

100 53.76403 250 62.97119 500 57.93394 750 54.56465 1000 52.82997 1250 52.29622 1500 64.40564

Brotowali

Maserasi

Etanol 70%

Konsentrasi (ppm)

inhibisi rerata (%)

100 40.19 250 36.92 500 32.91 750 20.94 1000 23.77 1250 41.45 1500 54.96

Sonikasi

Etanol 70%

Konsentrasi (ppm) inhibisi rerata (%)

250 29.86294 500 29.86294 750 -10.5859 1000 25.61388

Lampiran

  sambiloto

Konse(pp1507537

18793.

46.823.4

sambiloto

Konsentr

(ppm)

1507537

18793.

46.823.4

6 Uji inhbrotow

sonikasi et

entrasi m) 00

50 75 7.5 75

875 375

maserasi et

rasi I

(

00 50 75 7.5 75

875 375

hibisi enzimwali etanol 7

anol 70%

Inhibisi rer(%)

86.8137.6946.7155.2658.2950.0232.45

tanol 70%

Inhibisi r

(%)

79.9523.3627.1841.1234.1525.0916.94

m α-glukosid70%

rata

rerata

dase (in vitr

ro) ekstrak ssambiloto d

24

dan

Brotowali

Konse(pp1507537

18793.

46.823.4

Brotowali

Konse(pp1507537

18793.

46.823.4

sonikasi et

entrasi m) 00

50 75 7.5 75

875 375

maserasi et

entrasi m) 00

50 75 7.5 75

875 375

tanol 70%

Inhibisi rer(%)

83.8917.1319.0635.1744.2737.2230.80

tanol 70%

Inhibisi rer(%)

87.8733.2429.7048.6457.7838.4436.27

rata

rata

25

26

Lampiran 7 Uji inhibisi enzim α-glukosidase (in vitro) Glucobay (Akarbosa)

Konsentrasi (ppm) Inhibisi rerata (%)

25 96.30 12.5 95.87 6.25 96.05 3.125 90.80 1.5625 83.24 0.78125 72.93 0.390625 57.54

27

Lampiran 8 Profil KLT fase gerak tunggal

Sambiloto

Di bawah sinar UV 254 nm

1 2 3 4 5 6

Di bawah sinar UV 366 nm

1 2 3 4 5 6

Brotowali

Di bawah sinar UV 254 nm

1 2 3 4 5 6

Di bawah sinar UV 366 nm

1 2 3 4 5 6

Keterangan : 1. Etanol, 2. Kloroform, 3. Diklorometana, 4. Aseton, 5. Metanol, 6. Etil asetat

28

Lampiran 9 Profil kromatogram analisis sidik jari formula menggunakan KCKT

Kromatogram standar andrografolida 30 ppm

Kromatogram ekstrak sambiloto

Kromatogram formula sambiloto dan brotowali