Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο...

11
- 14 - Άσκηση 1: Μικροσκόπια & Μικροσκόπηση Σύνοψη Η αποκρυπτογράφηση της λειτουργικότητας του κυττάρου έγινε δυνατή χάρη στον συνδυασμό της παρατήρησης των κυτταρικών δομών και της βιοχημικής ανάλυσης. Η Άσκηση 1 του παρόντος εργαστηριακού οδηγού αφορά τη γνωριμία του φοιτητή με το σύγχρονο φωτονικό μικροσκόπιο, με σκοπό την εκμάθηση της λειτουργίας και του τρόπου χρήσης του. Στο εισαγωγικό τμήμα αναλύονται οι βασικές αρχές της μικροσκοπίας και παρουσιάζονται οι δύο κατηγορίες μικροσκοπίων (φωτονικό, ηλεκτρονιακό) και οι κύριες παραλλαγές τους (μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων, φθορισμού κ.λπ.). Ακολούθως περιγράφονται τα μέρη του σύγχρονου φωτονικού μικροσκοπίου (οπτικά και μηχανικά) και γίνεται αναλυτική περιγραφή των χειρισμών του οργάνου. Τέλος, δίνονται οδηγίες για τον τρόπο παρασκευής προσωρινών παρασκευασμάτων και τις μεθόδους χρώσης των βιολογικών υλικών, καθώς και συμβουλές για την καλύτερη δυνατή παρατήρηση. Ο φοιτητής προετοιμάζεται για να εξασκηθεί στο εργαστήριο στην παρατήρηση μικροοργανισμών, κυττάρων και ιστών. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece J. B. (2010), Βιολογία (τόμος Ι), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN:978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 6: Περιήγηση στο κύτταρο. 1. Εισαγωγικό μέρος Στην προσπάθειά μας να παρατηρήσουμε κύτταρα, ιστούς ή και ολόκληρους οργανισμούς, προκειμένου να τους μελετήσουμε, ερχόμαστε αντιμέτωποι με το φράγμα του μεγέθους. Τα κύτταρα δεν είναι ορατά με γυμνό μάτι, με εξαίρεση ορισμένα απαυτά, όπως τα αυγά των ψαριών. Στην πραγματικότητα αδυνατούμε να παρατηρήσουμε αντικείμενα μικρότερα των 0,1 mm (10 -4 m) (Εικ. 1.1). Ήταν λοιπόν απαραίτητο να αναπτυχθούν κατάλληλα οπτικά μέσα, ώστε να υποβοηθείται το μάτι μας να «βλέπει» την οργάνωση των κυττάρων. Είναι άλλωστε γνωστό ότι μόνο με συνδυασμό της παρατήρησης των κυτταρικών δομών και της βιοχημικής ανάλυσης είναι δυνατή η αποκρυπτογράφηση της λειτουργικότητας της βασικής μονάδας της ζωής. Μόλις τον 17 ο αιώνα κατασκευάστηκε το πρώτο φωτονικό μικροσκόπιο που επέτρεψε την παρατήρηση μικροοργανισμών. Από τότε βελτιώθηκε κατά πολύ η τεχνική κατασκευής μικροσκοπίων. Σήμερα μπορούμε να παρατηρήσουμε με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου αντικείμενα διαμέτρου μέχρι και 0,1 μm (10 -7 m), ενώ με το ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο το όριο παρατήρησης φθάνει το 1nm (10 -9 m) (Εικ. 1.1). Εικόνα 1.1 Το μέγεθος και το εύρος παρατήρησης των αντικειμένων.

Transcript of Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο...

Page 1: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 14 -

Άσκηση 1: Μικροσκόπια & Μικροσκόπηση

Σύνοψη Η αποκρυπτογράφηση της λειτουργικότητας του κυττάρου έγινε δυνατή χάρη στον συνδυασμό της παρατήρησης των κυτταρικών δομών και της βιοχημικής ανάλυσης. Η Άσκηση 1 του παρόντος εργαστηριακού οδηγού αφορά τη γνωριμία του φοιτητή με το σύγχρονο φωτονικό μικροσκόπιο, με σκοπό την εκμάθηση της λειτουργίας και του τρόπου χρήσης του. Στο εισαγωγικό τμήμα αναλύονται οι βασικές αρχές της μικροσκοπίας και παρουσιάζονται οι δύο κατηγορίες μικροσκοπίων (φωτονικό, ηλεκτρονιακό) και οι κύριες παραλλαγές τους (μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων, φθορισμού κ.λπ.). Ακολούθως περιγράφονται τα μέρη του σύγχρονου φωτονικού μικροσκοπίου (οπτικά και μηχανικά) και γίνεται αναλυτική περιγραφή των χειρισμών του οργάνου. Τέλος, δίνονται οδηγίες για τον τρόπο παρασκευής προσωρινών παρασκευασμάτων και τις μεθόδους χρώσης των βιολογικών υλικών, καθώς και συμβουλές για την καλύτερη δυνατή παρατήρηση. Ο φοιτητής προετοιμάζεται για να εξασκηθεί στο εργαστήριο στην παρατήρηση μικροοργανισμών, κυττάρων και ιστών.

Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece J. B. (2010), Βιολογία (τόμος Ι), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN:978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 6: Περιήγηση στο κύτταρο.

1. Εισαγωγικό μέρος Στην προσπάθειά μας να παρατηρήσουμε κύτταρα, ιστούς ή και ολόκληρους οργανισμούς, προκειμένου να τους μελετήσουμε, ερχόμαστε αντιμέτωποι με το φράγμα του μεγέθους. Τα κύτταρα δεν είναι ορατά με γυμνό μάτι, με εξαίρεση ορισμένα απ’ αυτά, όπως τα αυγά των ψαριών. Στην πραγματικότητα αδυνατούμε να παρατηρήσουμε αντικείμενα μικρότερα των 0,1 mm (10-4 m) (Εικ. 1.1). Ήταν λοιπόν απαραίτητο να αναπτυχθούν κατάλληλα οπτικά μέσα, ώστε να υποβοηθείται το μάτι μας να «βλέπει» την οργάνωση των κυττάρων. Είναι άλλωστε γνωστό ότι μόνο με συνδυασμό της παρατήρησης των κυτταρικών δομών και της βιοχημικής ανάλυσης είναι δυνατή η αποκρυπτογράφηση της λειτουργικότητας της βασικής μονάδας της ζωής.

Μόλις τον 17ο αιώνα κατασκευάστηκε το πρώτο φωτονικό μικροσκόπιο που επέτρεψε την παρατήρηση μικροοργανισμών. Από τότε βελτιώθηκε κατά πολύ η τεχνική κατασκευής μικροσκοπίων. Σήμερα μπορούμε να παρατηρήσουμε με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου αντικείμενα διαμέτρου μέχρι και 0,1 μm (10-7 m), ενώ με το ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο το όριο παρατήρησης φθάνει το 1nm (10-9 m) (Εικ. 1.1).

Εικόνα 1.1 – Το μέγεθος και το εύρος παρατήρησης των αντικειμένων.

Page 2: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 15 -

Στα πρώτα απλά μικροσκόπια, ένας μόνο μεγεθυντικός φακός χρησίμευε για την απευθείας παρατήρηση του αντικειμένου. Στα σύγχρονα σύνθετα μικροσκόπια, ένας φακός (ο αντικειμενικός φακός) σχηματίζει ένα πραγματικό είδωλο μέσα στο σωλήνα του μικροσκοπίου, ενώ ένας δεύτερος φακός (ο προσοφθάλμιος φακός) χρησιμοποιείται ως απλό μικροσκόπιο για την παρατήρηση του ήδη μεγεθυσμένου ειδώλου. Με τον τρόπο αυτό οι δύο φακοί συνεισφέρουν στην ολική μεγεθυντική ισχύ του οργάνου και έτσι η μεγεθυντική ισχύς του σύνθετου φωτονικού μικροσκοπίου μπορεί να αυξηθεί κατά πολύ, σε σχέση με εκείνη του απλού μικροσκοπίου (Εικ. 1.2).

Εικόνα 1.2 – Το σύνθετο μικροσκόπιο του Robert Hooke (1635-1703). Ο Hooke δημοσίευσε το 1665 ένα βιβλίο με τον τίτλο «Μικρογραφία», στο οποίο περιέγραφε και απεικόνιζε διάφορα αντικείμενα που είχε παρατηρήσει με το μικροσκόπιό του. Σ’ αυτόν οφείλουμε την περιγραφή της κυτταρικής δομής του φελλού (βλ. λεπτομέρεια), καθώς και τον όρο «κύτταρο».

Ο λόγος του μεγέθους του ειδώλου προς το μέγεθος του αντικειμένου είναι αυτό που καλούμε μεγέθυνση. H ποιότητα πάντως ενός μικροσκοπίου εξαρτάται κυρίως από την ικανότητά του να διακρίνει παρά να μεγεθύνει αντικείμενα. Διακριτική ικανότητα (resolution) είναι η δυνατότητα να βλέπουμε τα είδωλα δύο παρακείμενων σημείων ως δύο ξεχωριστές οντότητες. Για να γίνει κατανοητή η διαφορά μεταξύ διακριτικής ικανότητας και μεγέθυνσης σκεφτείτε το παράδειγμα που ακολουθεί: κάθε φωτογραφία είναι ένα ψηφιδωτό από πολύ μικρούς κόκκους (εικονοστοιχεία ή pixels). Οι λεπτομέρειες που μπορείτε να παρατηρήσετε σε μια συγκεκριμένη φωτογραφία δεν μπορεί να είναι ποτέ μικρότερες από το μέγεθος του κόκκου από τον οποίο συντίθεται. Όσο λοιπόν και να μεγεθύνετε τη φωτογραφία ποτέ δεν θα αποκτήσει εικόνα με μεγαλύτερη ευκρίνεια από αυτή του μικρού μεγέθους. Επομένως, η μεγέθυνση αναφέρεται στο μέγεθος ενώ η διακριτική ικανότητα στην ελάχιστη απόσταση δύο σημείων ώστε να μη συγχέονται.

Τα σύγχρονα φωτονικά μικροσκόπια μεγεθύνουν μέχρι 1.000 έως 2.000 φορές και η διακριτική τους ικανότητα (όριο) φτάνει τα 0,1 μm. Η μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα για ένα φωτονικό μικροσκόπιο που χρησιμοποιεί ορατή ακτινοβολία είναι περίπου 0,3 μm με ξηρό αντικειμενικό φακό όπου παρεμβάλλεται ο αέρας μεταξύ παρασκευάσματος και φακού, και 0,2 μm με καταδυτικό φακό, όπου παρεμβάλλεται ειδικό λάδι με δείκτη διάθλασης περίπου ίδιο με το φακό. Με υπεριώδη ακτινοβολία, η διακριτική ικανότητα αυξάνεται (0,1 μm) εξαιτίας του μικρότερου μήκους κύματος. Το όριο της διακριτικής ικανότητας καθορίζει και το ανώτατο όριο της αποδοτικής μεγέθυνσης που είναι δυνατή μ’ αυτούς τους φακούς.

Στο ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο πάλι, η διακριτική ικανότητα είναι πολύ καλύτερη επειδή το μήκος κύματος ενός ηλεκτρονίου είναι πολύ μικρότερο από το μήκος κύματος ενός φωτονίου. Γενικά, η διακριτική ικανότητα στο ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο είναι περίπου 100 φορές μεγαλύτερη από αυτή του φωτονικού μικροσκοπίου. 1.1. Κατηγορίες μικροσκοπίων Όπως ήδη διαπιστώσατε, σήμερα υπάρχουν δύο διακριτές κατηγορίες μικροσκοπίων: τα φωτονικά μικροσκόπια και τα ηλεκτρονιακά μικροσκόπια. Και οι δύο κατηγορίες μικροσκοπίων βασίζονται στις ίδιες αρχές για τον σχηματισμό του ειδώλου, μόνο που στο φωτονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιούνται φακοί

Page 3: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 16 -

(γυάλινοι) για να κατευθύνουν τη δέσμη των φωτονίων, ενώ στο ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιείται ένα σύστημα ηλεκτρομαγνητικών φακών για να εστιάσει τη δέσμη των ηλεκτρονίων (Εικ. 1.3).

Εικόνα 1.3 – Το φωτονικό (α) και το ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο (β). 1.1.1. Φωτονική μικροσκοπία Από τότε που ο Robert Hooke κατασκεύασε το πρώτο σύνθετο μικροσκόπιο (Εικ.1.2) μέχρι σήμερα έχουν γίνει πολλές βελτιώσεις στο φωτονικό μικροσκόπιο. Ορισμένες από τις κύριες παραλλαγές του φωτονικού μικροσκοπίου είναι:

Το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (bright-field microscope). Πρόκειται για την εξελιγμένη μορφή του μικροσκοπίου του Hooke. Είναι το κλασικό φωτονικό μικροσκόπιο που θα χρησιμοποιήσετε στις ασκήσεις και περιγράφεται παρακάτω.

Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων (phase-contrast microscope). Οι περιορισμένες δυνατότητες του κλασικού φωτονικού μικροσκοπίου οφείλονται και σε μερικές ενδογενείς ιδιότητες της ζωντανής ύλης. Τέτοιο μειονέκτημα είναι η διαφάνεια των περισσότερων κυτταρικών συστατικών στην ορατή φασματική περιοχή, με εξαίρεση μερικών χρωστικών, ιδιαίτερα φυτικών, που απορροφούν το φως ορισμένου μήκους κύματος. Αυτήν ακριβώς την αδυναμία καλύπτει το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων. Στηρίζεται στην αρχή ότι καθώς οι ακτίνες του φωτός περνούν διαμέσου του βιολογικού υλικού επηρεάζονται από τις φυσικές του ιδιότητες και διαθλώνται, οπότε αλλάζει η φάση τους ανάλογα με τη σύσταση των περιοχών. Με το μικροσκόπιο αυτό οι διαφορές του δείκτη διάθλασης που έχουν οι περιοχές του παρασκευάσματος με διαφορετική σύσταση μετατρέπονται σε διαφορές έντασης του φωτός, που γίνονται αντιληπτές από το ανθρώπινο μάτι. Χρησιμοποιείται για την παρατήρηση ενδοκυτταρικών δομών σε ζωντανά κύτταρα.

Το μικροσκόπιο φθορισμού (fluorescence microscope). Βασίζεται στην αρχή ότι ορισμένες ενώσεις απορροφούν την υπεριώδη ακτινοβολία και την αποδίδουν ξανά ως ορατή ακτινοβολία (φθορισμός). Είναι παρόμοιο με το συμβατικό μικροσκόπιο εκτός από το ότι το προσπίπτον φως περνά από δύο ομάδες φίλτρων. Η πρώτη αφήνει να περάσουν μόνο τα μήκη κύματος που διεγείρουν τη φθορίζουσα ουσία, ενώ η δεύτερη ομάδα φίλτρων αφήνει να περάσει μόνο ο ειδικός φθορισμός που εκπέμπεται από τη φθορίζουσα ουσία.

Το μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (dark-field microscope). Στο μικροσκόπιο αυτό, η φωτεινή δέσμη διέρχεται από ειδικό συμπυκνωτή ώστε το αντικείμενο να φωτίζεται πλάγια και να περιθλάται το φως στις οριακές φάσεις. Έτσι, το αντικείμενο φαίνεται λαμπρό ενώ το περιβάλλον μέσο παραμένει σκοτεινό.

Page 4: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 17 -

Άλλες παραλλαγές του φωτονικού μικροσκοπίου είναι: το μικροσκόπιο συμβολής, το πολωτικό μικροσκόπιο και το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης. 1.1.2. Ηλεκτρονιακή μικροσκοπία Δύο είναι οι βασικοί τύποι ηλεκτρονιακών μικροσκοπίων: το ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο διέλευσης και το ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη ηλεκτρονίων για το σχηματισμό του ειδώλου, αλλά διαφορετικούς μηχανισμούς για να σχηματίσουν το τελικό είδωλο.

Ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο διέλευσης (transmission electron microscope). Το μεγάλο πλεονέκτημα του ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου διέλευσης είναι η εξαιρετική διακριτική του ικανότητα (2 nm). Με το μικροσκόπιο αυτό είναι δυνατόν να επιτευχθούν μεγεθύνσεις έως και 106Χ, ενώ με τις ηλεκτρονιογραφίες επαυξάνεται η μεγέθυνση κατά 10 περίπου φορές. Ο σχηματισμός του ειδώλου εξαρτάται από την τοπική απορρόφηση ή σκέδαση της δέσμης των ηλεκτρονίων στο παρασκεύασμα, που έχει υποστεί μια εξειδικευμένη επεξεργασία ώστε ορισμένες περιοχές του έχουν μεγαλύτερη πυκνότητα ηλεκτρονίων ενώ άλλες όχι. Οι περιοχές με μεγάλη πυκνότητα ηλεκτρονίων εμφανίζονται σκοτεινές γιατί λίγα ηλεκτρόνια τις διαπερνούν. Αντίθετα, άλλες περιοχές του παρασκευάσματος είναι ανοικτόχρωμες γιατί τις διαπερνούν περισσότερα ηλεκτρόνια.

Ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (scanning electron microscope). Η διακριτική ικανότητα του ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου σάρωσης είναι 3-20 nm. Το σύστημα των ηλεκτρομαγνητικών φακών εστιάζει τη δέσμη των ηλεκτρονίων σε μία συγκεκριμένη θέση στην επιφάνεια του δείγματος. Η εστιασμένη δέσμη με ένα κατάλληλο σύστημα σαρώνει όλη την επιφάνεια του δείγματος που είναι καλυμμένη με ένα βαρύ μέταλλο. Καθώς η δέσμη των ηλεκτρονίων σαρώνει γρήγορα την επιφάνεια του δείγματος ορισμένα μόριά του διεγείρονται προς υψηλότερα ενεργειακά επίπεδα και απελευθερώνουν δευτερογενή ηλεκτρόνια, που σχηματίζουν το είδωλο του δείγματος στην οθόνη.

Εικόνα 1.4 – Φωτογραφίες τραβηγμένες από ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο διέλευσης (α, b και c) όπου διακρίνονται νανοσωματίδια διαμέτρου 20nm (a), 45nm (b) και 80 nm (c). Ανάλογο παρασκεύασμα σε φωτογραφία από ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (d). Παρατηρήστε την τρισδιάστατη απεικόνιση των σωματιδίων. .

2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων

Page 5: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 18 -

2.1.1. Συσκευές φωτονικό μικροσκόπιο.

2.1.2. Υλικά αντικειμενοφόροι, καλυπτρίδες, σταγονόμετρα, διηθητικό χαρτί, βελόνες ανατομίας, λαβίδες, ψαλίδι, κομμάτια εφημερίδας, μόνιμα παρασκευάσματα, χαρτί καθαρισμού φακών, κεδρέλαιο.

2.1.3. Διαλύματα

αλκοόλη 70%. 2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1. Γνωριμία με το φωτονικό μικροσκόπιο Το μικροσκόπιο είναι όργανο εξαιρετικά ευαίσθητο γι’ αυτό χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή κατά τη χρήση του. Εάν χρησιμοποιείται για πρώτη φορά μικροσκόπιο πρέπει αρχικά να αναγνωρίσετε τα βασικά μέρη του, όπως π.χ. τους προσοφθάλμιους και τους αντικειμενικούς φακούς, την τράπεζα, τον πυκνωτή, τον κοχλία αδρής εστίασης, το μικρομετρικό κοχλία, κ.λπ. Συμβουλευτείτε την Εικόνα 1.5 και διαβάστε προσεχτικά τα χαρακτηριστικά του φωτονικού μικροσκοπίου που έχετε στον πάγκο σας.

Εικόνα 1.5 – Σύγχρονο φωτονικό μικροσκόπιο ασκήσεων.

Page 6: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 19 -

Το ουσιαστικό τμήμα του σύνθετου φωτονικού μικροσκοπίου είναι το οπτικό σύστημα που

αποτελείται από δύο συγκλίνοντες ομοαξονικούς φακούς (ή σύστημα φακών), τον προσοφθάλμιο και τον αντικειμενικό.

Ο προσοφθάλμιος φακός βρίσκεται στην άκρη του οπτικού σωλήνα και μ’ αυτόν ο παρατηρητής βλέπει το αντικείμενο. Το μικροσκόπιο που έχετε στη διάθεσή σας είναι διοφθάλμιο, έχει δηλαδή δύο προσοφθάλμιους φακούς ώστε να παρατηρείτε και με τα δύο μάτια. Παρατηρήστε ότι ή απόσταση μεταξύ των δύο προσοφθάλμιων φακών είναι δυνατόν να αυξομειωθεί, προκειμένου να ανταποκρίνεται στην απόσταση των ματιών του καθενός. Παρατηρήστε, επίσης, ότι ο αριστερός προσοφθάλμιος φακός έχει τη δυνατότητα να ανεβοκατεβαίνει περιστροφικά. Βεβαιωθείτε ότι οι δύο φακοί βρίσκονται στο ίδιο ύψος προκειμένου να βλέπεται το ίδιο από τα δύο μάτια. Όσοι έχετε μυωπία ή υπερμετρωπία, μπορείτε να μικροσκοπείτε με ή χωρίς γυαλιά. Αν επιλέξετε τη δεύτερη περίπτωση ρυθμίστε απλά τη διαφορά βαθμών των ματιών σας αυξάνοντας ή μειώνοντας το ύψος στον αριστερό προσοφθάλμιο φακό. Όσοι όμως έχετε και (ή μόνο) αστιγματισμό μικροσκοπείτε φορώντας τα γυαλιά σας. Ο προσοφθάλμιος φακός μεγεθύνει την πραγματική εικόνα που δίνει ο αντικειμενικός φακός.

Ο αντικειμενικός φακός έχει μικρή εστιακή απόσταση και λίγο μακρύτερα από την εστία του τοποθετείται το προς παρατήρηση αντικείμενο. Το είδωλο που δίνει ο αντικειμενικός φακός είναι πραγματικό και ανεστραμμένο. Η απόσταση μεταξύ προσοφθάλμιου και αντικειμενικού φακού είναι μεγαλύτερη από το άθροισμα των εστιακών τους αποστάσεων, έτσι ώστε το είδωλο που τελικά βλέπει ο παρατηρητής είναι φανταστικό, μεγεθυσμένο είδωλο του πραγματικού αντεστραμμένου ειδώλου του αντικειμενικού φακού. Στο μικροσκόπιό σας υπάρχουν τέσσερις αντικειμενικοί φακοί που ο καθένας έχει διαφορετική μεγεθυντική ισχύ. Αυτοί βρίσκονται επάνω σε μία κεφαλή που περιστρέφεται. Η μεγεθυντική ισχύς είναι γραμμένη στους αντικειμενικούς (4Χ, 10Χ, 40Χ και 100Χ) και τους προσοφθάλμιους φακούς (10Χ). Η ολική μεγέθυνση του μικροσκοπίου είναι ίση με τη μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού πολλαπλασιαζόμενη επί τη μεγέθυνση του προσοφθάλμιου. Δηλαδή, αν παρατηρούμε ένα παρασκεύασμα μέσω ενός αντικειμενικού φακού 40Χ και ενός προσοφθάλμιου 10Χ, τότε η ολική μεγέθυνση του παρατηρούμενου αντικειμένου είναι 40Χ10=400.

Το οπτικό σύστημα του μικροσκοπίου είναι προσαρμοσμένο και ενσωματώνεται λειτουργικά σε ένα μηχανικό σύστημα-φορέα. Αυτό συγκροτείται από τα ακόλουθα μέρη:

τη βάση, που στηρίζει το όλο όργανο, τον οπτικό σωλήνα, που έχει προσαρμοσμένους τους φακούς, την τράπεζα, που είναι κινητή και στην οποία τοποθετείται το αντικείμενο, και τον βραχίονα, που φέρει δύο κοχλίες: τον μεγάλο, που λέγεται αδρός και μέσα σ’ αυτόν τον μικρό, που

λέγεται μικρομετρικός.

Ο αδρός κοχλίας χρησιμοποιείται για να ανεβοκατεβάζει την τράπεζα (μεγάλη μετατόπιση) όταν εστιάζουμε κάτω από μικρή μεγέθυνση (4Χ ή 10Χ), ενώ η περιστροφή του μικρομετρικού κοχλία οδηγεί σε μικρή μόνο μετατόπιση της τράπεζας και χρησιμοποιείται σε όλες τις μεγεθύνσεις προκειμένου να γίνει ευκρινέστερο το είδωλο.

Η τράπεζα έχει ένα κυκλικό άνοιγμα που επιτρέπει να περνούν οι φωτεινές ακτίνες ώστε να φωτίζεται το αντικείμενο. Το διερχόμενο φως προέρχεται από λαμπτήρα που βρίσκεται ενσωματωμένος στη βάση του οργάνου και η έντασή του ρυθμίζεται με ροοστάτη. Το αντικείμενο σταθεροποιείται στην τράπεζα με ένα ειδικό πίεστρο εφοδιασμένο με κλίμακα. Η μετακίνηση του αντικειμένου επάνω στην τράπεζα είναι δυνατή προς δύο κατευθύνσεις κάθετες μεταξύ τους (δεξιά/αριστερά - πάνω/κάτω) και πραγματοποιείται μέσω ενός συστήματος κοχλιών.

Κάτω από το κυκλικό άνοιγμα της τράπεζας βρίσκεται ένα εξάρτημα που σε μερικά μικροσκόπια κινείται κατακόρυφα με τη βοήθεια κοχλία, ενώ σε άλλα είναι σταθερό. Πρόκειται για το φωτιστικό σύστημα Abbe, ένα σύνθετο σύστημα που συγκροτείται ουσιαστικά από τον συμπυκνωτή φωτός (condenser) και το διάφραγμα-ίριδα, συχνά δε συνοδεύεται και από ένα φορέα φίλτρων. Ο συμπυκνωτής αποτελείται από σύστημα βοηθητικών φακών με διάφορο αριθμητικό άνοιγμα και σχετική ανεξαρτησία κινήσεων, ώστε να συνδυάζονται κατά περίπτωση και να εξασφαλίζουν συνολικά τη ροή περισσότερων φωτεινών ακτινών μέσα από το αντικείμενο. Το διάφραγμα, με μεταβαλλόμενη διάμετρο, επιτρέπει την αυξομείωση του φωτισμού ανάλογα με τον χρησιμοποιούμενο αντικειμενικό, το πάχος του αντικειμένου κ.λπ.

Page 7: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 20 -

2.2.2. Τρόπος χρήσης μικροσκοπίου Στο μικροσκόπιο μπορούμε να παρατηρήσουμε μόνο αντικείμενα διαπερατά από το φως και όσο το δυνατόν πιο επίπεδα. Για το λόγο αυτό φτιάχνουμε μικροσκοπικά παρασκευάσματα, δηλαδή τοποθετούμε σε μια γυάλινη πλάκα (αντικειμενοφόρο) το προς παρατήρηση αντικείμενο και το καλύπτουμε με ένα πολύ λεπτό γυάλινο πλακίδιο (καλυπτρίδα) (Εικ. 1.6). Τα παρασκευάσματα μπορεί να είναι προσωρινά, ημιμόνιμα ή μόνιμα, ανάλογα με το χρονικό διάστημα για το οποίο διατηρούνται χωρίς να αλλοιωθούν. Ο τρόπος παρασκευής προσωρινών μικροσκοπικών παρασκευασμάτων περιγράφεται παρακάτω. Προκειμένου να εξοικειωθείτε με τη χρήση του μικροσκοπίου θα χρησιμοποιήσετε αρχικά ένα μόνιμο παρασκεύασμα που θα σας δοθεί από τον υπεύθυνο της άσκησης.

Εικόνα 1.6 – Ορισμένα βασικά υλικά μικροσκοπίας 2.2.3. Παρατήρηση με συνήθεις αντικειμενικούς φακούς (4Χ, 10Χ, 40Χ)

Ξεκινήστε ελέγχοντας τους φακούς και το φωτιστικό σύστημα εάν είναι καθαρά και καθαρίστε τα με το ειδικό χαρτί εάν χρειάζεται. Στη συνέχεια ανοίξτε το φωτισμό ρυθμίζοντας την ένταση στο μισό περίπου του μέγιστου δυνατού.

Τοποθετήστε το παρασκεύασμα επάνω στην τράπεζα του μικροσκοπίου (με την καλυπτρίδα πάντοτε προς τα επάνω), σταθεροποιώντας το με το πίεστρο. Η τράπεζα του μικροσκοπίου θα πρέπει να βρίσκεται στη χαμηλότερη δυνατή θέση.

Βεβαιωθείτε ότι οι φωτεινές ακτίνες διέρχονται μέσα από την περιοχή που βρίσκεται το αντικείμενο που θα παρατηρήσετε, αλλιώς μετακινήστε το παρασκεύασμα επάνω στην τράπεζα με τη βοήθεια του συστήματος των κοχλιών μετακίνησης.

Βάλτε στη θέση παρατήρησης τον αντικειμενικό φακό με τη μικρότερη μεγέθυνση (4Χ). Στρέφοντας με μικρές κινήσεις τον μεγάλο (αδρό) κοχλία εστίασης πλησιάστε την τράπεζα προς τον

αντικειμενικό φακό, ενώ ταυτόχρονα παρατηρείτε από τους προσοφθάλμιους φακούς. Στην αρχή δεν θα βλέπετε τίποτα. Συνεχίστε υπομονετικά να ανεβάζετε την τράπεζα μέχρις ότου διακρίνετε το αντικείμενο. Με την περιστροφή του μικρομετρικού κοχλία το οπτικό πεδίο γίνεται καθαρότερο.

Προκειμένου να έχετε την καλύτερη δυνατή παρατήρηση πρέπει να ρυθμίσετε το ποσό του φωτός που δέχεται το παρασκεύασμα. Αυτό πετυχαίνεται μεταβάλλοντας τη διάμετρο του διαφράγματος και πρέπει να ρυθμίζεται σε κάθε αλλαγή παρασκευάσματος. Εάν το φως είναι λίγο ή ενοχλητικά δυνατό ελέγξτε την ένταση του φωτισμού.

Μάθετε να σαρώνετε όλη την επιφάνεια του παρασκευάσματος και να επιλέγετε τις περιοχές που θα παρατηρήσετε με ισχυρότερους φακούς. Προτού αλλάξετε αντικειμενικό φακό προσέξτε ώστε το

Page 8: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 21 -

αντικείμενο να βρίσκεται στο κέντρο του οπτικού πεδίου, έτσι ώστε με την αμέσως μεγαλύτερη μεγέθυνση να βρίσκεται και πάλι μέσα στο οπτικό πεδίο.

Χωρίς να μετακινήσετε την τράπεζα, αλλάξτε τον αντικειμενικό φακό με τον αμέσως μεγαλύτερης ισχύος. Κανονικά θα πρέπει να διακρίνετε ακόμη το αντικείμενο, παρότι αυτό θα φαίνεται θολό. Εστιάστε καλύτερα χρησιμοποιώντας μόνο τον μικρομετρικό κοχλία. Παρατηρήστε πως «παίζοντας» με τον μικρομετρικό κοχλία μπορείτε να διακρίνετε αντικείμενα που βρίσκονται σε διαφορετικό επίπεδο (Εικ. 1.7).

Κάθε φορά που θέλετε να μεγεθυνθεί περισσότερο το αντικείμενο αλλάζετε τον αντικειμενικό φακό με έναν μεγαλύτερης ισχύος, αλλά με φορά πάντοτε από τον μικρότερο προς τον μεγαλύτερο φακό, διορθώνοντας την εστίαση με τον μικρομετρικό κοχλία.

Μετά το τέλος της παρατήρησης και προκειμένου να αλλάξετε παρασκεύασμα, επαναφέρετε τον αντικειμενικό φακό μικρότερης ισχύος, αφού προηγουμένως χαμηλώσετε την τράπεζα, και επαναλαμβάνετε τη διαδικασία.

Όταν θα έχετε οριστικά τελειώσει, κατεβάζετε την τράπεζα στο χαμηλότερο σημείο, στρέφετε τον αντικειμενικό φακό της μικρότερης ισχύος σε θέση εργασίας, απομακρύνετε το παρασκεύασμα, κλείνετε το φωτιστικό σύστημα και καλύπτετε το μικροσκόπιο με τη θήκη του.

Εικόνα 1.7 – Το βάθος των αντικειμένων. Οι εικόνες αριστερά και δεξιά προέρχονται από το ίδιο παρασκεύασμα που μικροσκοπείται με αντικειμενικό φακό 10Χ. Παρατηρήστε πως με τηπεριστροφή του μικρομετρικού κοχλία μπορείτε να εστιάσετε και να διακρίνετε αντικείμενα που βρίσκονται σε διαφορετικό βάθος. 2.2.4. Παρατήρηση με καταδυτικό φακό (100Χ) Όταν θέλουμε να πετύχουμε μεγάλες μεγεθύνσεις με παράλληλα αυξημένη διακριτική ικανότητα, χρησιμοποιούμε ειδικούς αντικειμενικούς φακούς που ονομάζονται καταδυτικοί. Οι φακοί αυτοί ονομάζονται έτσι γιατί μεταξύ φακού και παρασκευάσματος παρεμβάλλεται ειδικό λάδι (κεδρέλαιο) στο οποίο «βυθίζεται» ο φακός. Για τέτοιου είδους παρατήρηση ακολουθούμε την παρακάτω διαδικασία:

Τοποθετήστε το παρασκεύασμα και χρησιμοποιώντας μικρής ισχύος αντικειμενικούς φακούς εστιάστε και φέρτε στο κέντρο του οπτικού πεδίου την περιοχή που θέλετε να παρατηρήσετε με μεγάλη μεγέθυνση.

Απομακρύνετε το φακό και τοποθετήστε μια μικρή σταγόνα κεδρέλαιο επάνω στην καλυπτρίδα του παρασκευάσματος προσέχοντας να μην κουνηθεί το παρασκεύασμα. Στη συνέχεια τοποθετήστε τον καταδυτικό φακό (100Χ) στη θέση του.

Με προσοχή ανεβάστε την τράπεζα μέχρις ότου ο καταδυτικός φακός ακουμπήσει στο κεδρέλαιο. Παρατηρήστε τότε από τους προσοφθάλμιους φακούς και με τη χρήση αποκλειστικά του μικρομετρικού κοχλία εστιάστε στο αντικείμενο.

Προκειμένου να έχετε την καλύτερη δυνατή παρατήρηση με τον καταδυτικό φακό θα πρέπει το διερχόμενο φως να συγκεντρώνεται στην περιοχή του οπτικού πεδίου. Ρυθμίστε το πάχος της δέσμης

Page 9: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 22 -

του φωτός που διέρχεται από το παρασκεύασμα με τη βοήθεια του συμπυκνωτή, και αυξομειώστε ανάλογα την ένταση του φωτισμού μεταβάλλοντας τη διάμετρο του διαφράγματος.

Μετά το τέλος της παρατήρησης κατεβάστε την τράπεζα και απομακρύνεται το παρασκεύασμα. Σκουπίστε με προσοχή και με τη χρήση ειδικού χαρτιού διαποτισμένου με αλκοόλη πρώτα τον καταδυτικό φακό και στη συνέχεια το παρασκεύασμα (εάν αυτό είναι μόνιμο).

2.2.5. Γενικές οδηγίες και σημεία προσοχής Έχοντας ολοκληρώσει την περιγραφή των χειρισμών του μικροσκοπίου δώστε προσοχή στα παρακάτω βασικά σημεία (Εικ.1.8):

Το μικροσκόπιο είναι όργανο εξαιρετικά ευαίσθητο. Περιφέρετε το μικροσκόπιο πάντοτε με τα δύο χέρια αποφεύγοντας κατά το δυνατόν τις περιττές κινήσεις.

Τοποθετείτε το μικροσκόπιο με τους προσοφθάλμιους φακούς προς το μέρος σας. Τοποθετείτε το παρασκεύασμα στην τράπεζα με την καλυπτρίδα πάντοτε προς τα πάνω. Κινείτε προσεχτικά τους κοχλίες, ειδικά τον κοχλία αδρής εστίασης, προσέχοντας να μην ακουμπήσει

ο αντικειμενικός φακός το παρασκεύασμα. Ξεκινάτε την παρατήρησή σας χρησιμοποιώντας πάντοτε τον μικρότερης ισχύος αντικειμενικό φακό.

Ποτέ μην προσπαθείτε να βρείτε ένα σημείο του παρασκευάσματος με ισχυρούς αντικειμενικούς φακούς. Επιλέξτε πρώτα την περιοχή παρατήρησης με το μικρότερο φακό και μελετήστε την χρησιμοποιώντας ισχυρότερους φακούς στη συνέχεια.

Εχθρός των μικροσκοπίων είναι η σκόνη και τα δακτυλικά αποτυπώματα στους φακούς. Φροντίστε ώστε να αφήνετε τους προσοφθάλμιους και τους αντικειμενικούς φακούς πάντοτε καθαρούς και το μικροσκόπιο καλυμμένο. Εάν οι φακοί δεν είναι καθαροί σκουπίστε τους προσεχτικά με ειδικό χαρτί ή μαλακό ύφασμα.

Εικόνα 1.8 – Σημεία προσοχής για την ορθή χρήση του μικροσκοπίου. 2.2.6. Παρασκευή και παρατήρηση προσωρινών παρασκευασμάτων Παρασκεύασμα καλούμε το υλικό που χρησιμεύει σαν αντικείμενο μικροσκοπικής παρατήρησης. Τέτοιο υλικό μπορεί να είναι για παράδειγμα απομονωμένα υποκυτταρικά οργανίδια ή κύτταρα, ιστοί, όργανα έως και ολόκληροι οργανισμοί.

Page 10: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 23 -

Πολλά παρασκευάσματα υπόκεινται σε ειδική επεξεργασία και χρώση προκειμένου να γίνει δυνατή η παρατήρησή τους ή για να βελτιωθεί η ικανότητα παρατήρησης. Συνήθως το παρασκεύασμα μονιμοποιείται αρχικά με εμβάπτισή του σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει κάποια αλκοόλη, αλδεΰδη ή οξικό. Με τη μονιμοποίηση σταθεροποιούνται τα συστατικά του κυττάρου. Στη συνέχεια το παρασκεύασμα αφυδατώνεται με αλκοόλη και για να σκληρύνει εγκλείεται σε υγρή παραφίνη, η οποία μετά τη στερεοποίησή της μπορεί να κοπεί σε λεπτές τομές σε ένα μικροτόμο. Τέλος, αφού το παρασκεύασμα αποπαραφινωθεί, γίνεται χρώση του με ειδικές χρωστικές που εκλεκτικά βάφουν υποκυτταρικές δομές και οργανίδια, ή ακόμα και συγκεκριμένες πρωτεΐνες ή άλλα μακρομόρια. Το αντιδραστήριο Feulgen, για παράδειγμα, χρωματίζει ειδικά το DNA. Η ηωσίνη και η αιματοξυλίνη χρωματίζουν καλά τους ζωικούς ιστούς, ενώ η σαφρανίνη τους φυτικούς ιστούς. Η μελέτη και εφαρμογή χρωστικών μεθόδων είναι πεδίο της Βιολογίας που ονομάζεται Ιστοχημεία.

Στην άσκηση αυτή θα μάθετε πώς να παρασκευάζετε απλά προσωρινά παρασκευάσματα (Εικ. 1.9). Ακολουθήστε τις οδηγίες που δίνονται παρακάτω:

Εικόνα 1.9 – Τρόπος παρασκευής ενός προσωρινού μικροσκοπικού παρασκευάσματος.

Τοποθετήστε μία σταγόνα νερό επάνω σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα. Τοποθετήστε μία καλυπτρίδα και παρατηρήστε. Αναγνωρίστε την κίνηση Brown της σκόνης, όπως και τις φυσαλίδες.

Επαναλάβετε τη διαδικασία προσέχοντας τη φορά αυτή να μην παγιδευτούν φυσαλίδες μεταξύ αντικειμενοφόρου πλάκας και καλυπτρίδας. Για να το επιτύχετε αυτό τοποθετήστε την καλυπτρίδα κατά τον τρόπο που υποδεικνύεται στις Εικόνες 1.9 και 1.10.

Σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα τοποθετήστε μία σταγόνα νερό. Κόψτε με το ψαλίδι σας δύο-τρία γράμματα από εφημερίδα. Τοποθετήστε τα γράμματα στην αντικειμενοφόρο διαβρέχοντάς τα με τη σταγόνα νερού. Τοποθετήστε μία καλυπτρίδα και παρατηρήστε το παρασκεύασμα.

Εξοικειωθείτε με την παρατήρηση όλου του εμβαδού του παρασκευάσματος, όπως και με την αίσθηση της αντιστροφής του ειδώλου.

Τοποθετήστε χιαστί δύο τρίχες επάνω σε μία αντικειμενοφόρο και προσθέστε μία σταγόνα νερό. Καλύψτε με καλυπτρίδα και παρατηρήστε.

Διαπιστώστε πως το εύρος του βάθους που είναι εστιασμένο εξαρτάται από τη μεγέθυνση και πως μικραίνει όσο αυξάνει η ισχύς του αντικειμενικού φακού.

Page 11: Άσκηση 1: Μικροσκόπια ... · ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Εικ. 1.4). Και τα δύο χρησιμοποιούν δέσμη

- 24 -

Εικόνα 1.10 – Διαδραστική απεικόνιση του τρόπου παρασκευής ενός προσωρινού μικροσκοπικού παρασκευάσματος.

2.3. Παρατηρήσεις

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

Συνιστώμενη βιβλιογραφία

1. Campbell, N. A., & Reece, J .B. (2010). Βιολογία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης.

ISBN: 978-960-524-305-0.

2. Καλιάφας, Α., & Κατσώρης, Π. (1991). Γενική Βιολογία: Από τη θεωρία στο πείραμα. Τμήμα Βιολογίας,

Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα.

3. Μαρμάρας, Β., & Λαμπροπούλου-Μαρμάρα, Μ. (2000). Βιολογία κυττάρου – Μοριακή προσέγγιση.

Εκδόσεις Τυπόραμα, Πάτρα. ΙSBN: 960-7620-13-5.