FACULDADE INFORIUM DE TECNOLOGIA - Mestradoti · e 100 μg L-1 (linha verde) ... amostras brutas do...

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FACULDADE INFORIUM DE TECNOLOGIA

MESTRADO EM TECNOLOGIA DA INFORMAÇÃO APLICADA À BIOLOGIA

COMPUTACIONAL

Wesley Maia de Souza

Avaliação de resíduos do hormônio 17 β estradiol, utilizando o HPLC,

nas águas do Rio Vieira da cidade de Montes Claros, MG

Dissertação apresentada à Faculdade

Infórium de Tecnologia para a obtenção do

título de Mestre em Tecnologia da

Informação Aplicada à Biologia

Computacional.

Área de concentração: Biologia molecular

estrutural

Orientador: Prof. Dr. Tadeu Henrique de

Lima.

Belo Horizonte

2015

ii

Wesley Maia de Souza

Avaliação de resíduos do hormônio 17 β estradiol, utilizando o HPLC, nas águas

do Rio Vieira da cidade de Montes Claros, MG.

Belo Horizonte

2015

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Dedico esse trabalho à Dalva das Graças Maia de Souza,

José Carlos de Souza e a Arlen de Paulo Santiago Neto.

Pela força, inspiração e eterna amizade.

iv

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais José Carlos de Souza e Dalva das Graças Maia de Souza pelo

apoio, compressão e amor.

À Deus pela oportunidade e por tudo.

Aos meus amigos Arlen de Paulo Santiago Neto e Viviane Aparecida Queiroz

pelo companheirismo e amizade.

A Farmácia Minas Brasil, através da Pessoa de Luciano Frederico Paixão

Guedes por ter cedido o padrão utilizado na pesquisa.

Ao Professor Doutor Flaviano Oliveira Silveira, a Professora Gevany Paulino

de Pinho e a técnica Ane Patrícia Cacique, do Laboratório de Química Instrumental da

Universidade Federal de Minas Gerais / Instituto de Ciências Agrárias de Montes

Claros- MG, pelo auxílio, dedicação e amor à pesquisa.

Ao orientador Professor Doutor Tadeu Henrique de Lima, pelas correções e

dicas preciosas.

A todos aqueles que integralmente ou parcialmente colaboraram para a

realização destes trabalhos, meu muito obrigado.

v

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ............................................................................................................ 4

2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................... 4

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................. 4

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 5

3.1 Ocorrência de fármacos e desreguladores endócrinos no meio ambiente .............. 5

3.1.1 Problemas ambientais relacionados aos desreguladores endógenos ................ 6

3.1.2 Principais fármacos e desreguladores endócrinos abordados em estudos

ambientais................................................................................................................ 10

3.2 Remoção de fármacos e desreguladores endócrinos em estação de tratamento de

esgoto ETE. ................................................................................................................. 12

3.2.1 A eficiência do HPLC na identificação e quantificação dos desreguladores

endógenos na água. ................................................................................................. 13

3.2.2 Funcionamento do detector de arranjo de diodos........................................... 15

3.3 Características dos hormônios 17β-estradiol ........................................................ 16

3.3.1 A ineficiência da remoção do 17β-estradiol nas estações de tratamento de

esgoto ...................................................................................................................... 18

3.3.2 Fatores intervenientes na remoção de fármacos e desreguladores em estações

de tratamento de esgoto ........................................................................................... 20

3.3.3 Sorção ............................................................................................................. 20

3.3.4 Transformações biológicas ............................................................................. 21

3.3.5 Fotodegradação .............................................................................................. 23

3.3.6 Volatilização................................................................................................... 24

4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25

4.1 Caracterizações da área de estudo......................................................................... 25

4.1.1 Área da bacia do Rio Vieira ........................................................................... 25

4.2 Preparo da vidraria. ............................................................................................... 27

4.3 Matriz .................................................................................................................... 28

4.4 Reagentes e solventes ........................................................................................... 28

4.5 Equipamentos ........................................................................................................ 28

4.6 Preparo do padrão de 17 beta-estradiol e das amostras ........................................ 26

4.7 Análises cromatográficas ..................................................................................... 30

vi

4.8 Padrão analítico ..................................................................................................... 30

4.9 Coleta e armazenamento das amostras ................................................................. 30

4.10 Procedimento de extração das amostras de água ................................................ 32

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................... 34

5.1 Validade do método analítico ............................................................................... 34

5.1.1 Seletividade...................................................................................................34

5.1.2 Linearidade...................................................................................................34

5.1.3 Precisão........................................................................................................35

5.1.4 Exatidão .......................................................................................................36

5.2. Análises cromatográficas ..................................................................................... 36

5.3 Resultados das análises ......................................................................................... 37

6. CONCLUSÃO ........................................................................................................... 46

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .................................................. 47

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 48

vii

ABREVIATURAS

Estações de tratamento de esgoto (ETES)……………………………………………….1

Desreguladores endócrinos (DE)…………………………………………………...........2

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)………………………………………..4

17ß-estradiol (E2)………………………………………………...…………………….. 4

Compostos de desregulação endócrina (CDE)……………………………….……….…5

1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-cloro-feniletano)(DDT)………………………………………..6

Doses diárias aceitáveis (DDA)………………………….………………………………8

Estados Unidos da Améria (EUA)……………………………….………………………9

Ibuprofeno (IBP) ……………………………………………………….………………11

Diclofenaco(DCF)………………………………………………………………….…..11

Sulfametoxazol (SMX)…………………………………………………………………11

Trimetoprima (TRI) ……………………………………………………………………11

Tetraciclina (TET)…………………………………………………………………...…11

Bezafibrato (BZF) ……………………………………………………………………..11

Etinilestradiol (EE2)……………………………………………………………………11

Estrona (E1)……………………………………………………………………………11

Estriol (E3) ………………………………………………………………………….…11

Bisfenol A (BPA)………………………………………………………………………12

Nonilfenol (NP)………………………………………………………………………...12

Cromatografia em fase gasosa (CG)……………………………………………………15

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)………………………………………15

Espectrometria de massa (MS)…………………………………………………………15

Detector de massa (GC-MS)……………………………………………………………15

Detecção electroquímica (ED) …………………………………………………………15

viii

Detecção de fluorescência (FLD)……………………………………………………....15

Cromatógrafo gasoso com detector de massa (GC-MS)…………………………….…15

Extração líquido-líquido (LLE) ………………………………………………………15

Extração em fase sólida (SPE) …………………………………………………………15

Absorção de extração (SBSE) …………………………………………………………15

Espectrometria de massa (EM)…………………………………………………………15

Performance liquid chromatography (HPLC)………………………………………...16

Estação de tratamento de água (ETA) …………………………………………………20

Partição sólido-líquido (Kd) ………………………………………………………...…22

Sólido suspensos (SS)…………………………………………………………….…….22

Radiação ultravioleta (UV)……………………………………………………………..24

Laboratório de Química Instrumental – (LQI)…………………………………………26

Intituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE)……………………………..……26

Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG………………………………………26

Detector com arranjo de diodos (DAD)………………………………………………..29

Cromatografia Líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE-

DAD)…………………………………………………………………………………...31

Desvio padrão relativo (DPR)………………………………………………………….36

Coeficiente de variação (CV)…………………………………………………………..36

Estimativa do desvio padrão (s) ……………………………………………………..…36

Limites de detecção (LD) ………………………………………………………...……36

Limites de quantificação (LQ) …………………………………………………………36

Valor máximo permitido (VMP)…………………………………………………….…43

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 3.1.2: Estrutura básica dos estrogênios esteróides. ............................................. 11

Figura 3.2: Rotas de contaminação e exposição humana aos fármacos e desreguladores

endócrinos.. ..................................................................................................................... 13

Figura 3.2.2: Esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de arranjo de

diodos. ............................................................................................................................ 16

Figura 3.3.1: Fórmula estrutural do 17β-estradiol .......................................................... 18

Figura 4.1: Localização da Área de Estudo. ................................................................... 26

Figura 4.1.1: Mapa de abrangência da bacia hidrográfica do Rio Vieira. ...................... 27

Figura 4.6: Percurso do rio na cidade de Montes Claros e localização dos pontos de

coleta das três amostras. ................................................................................................. 31

Figura 4.9: Os três pontos de coleta de água do Rio Vieira. .......................................... 32

Figura 4.9.1: Garrafa de Van Dorn utilizada para recolher amostras de água do Rio

Vieira. ............................................................................................................................. 32

Figura 4.9.2: Sistema a vácuo Supelco Visiprep. ........................................................... 33

Figura 4.10: Figura 4.7 – Preparação do padrão e das amostras de 17 beta-estradiol...34

Figura 5 – Curva de calibração do 17β-estradiol obtida pela injeção de 5 pontos…….36

Figura 5.2: Cromatograma da solução padrão de 17β-estradiol a 50μg L-1

em metanol 36

Figura 5.2.1: Cromatogramas da solução padrão de 17β-estradiol a 50μg L-1

(linha azul)

e 100 μg L-1

(linha verde) em metanol. .......................................................................... 37

Figura 5.3: Cromatograma da amostra P1A em metanol (linha verde) solução padrão de

17β-estradiol a 50μg L-1

(linha azul) .............................................................................. 37

Figura 5.4: Cromatograma da amostra P1B em metanol (linha verde) solução padrão de


(linha azul) .............................................................................. 38

Figura 5.5: Cromatograma da amostra P1C em metanol (linha verde) solução padrão de


(linha azul) .............................................................................. 38

Figura 5.6: Cromatograma da amostra P1D em metanol (linha verde) solução padrão de


(linha azul) .............................................................................. 39



(linha azul). ............................................................................. 39



(linha azul) .............................................................................. 40



(linha azul) .............................................................................. 40

x

Figura 5.10: Cromatograma da amostra P2D em metanol (linha verde) solução padrão

de 17β-estradiol a 50μg L-1

(linha azul) ......................................................................... 40

Figura 5.11: Cromatograma da amostra P3A em metanol (linha verde) solução padrão


(linha azul) ......................................................................... 41

Figura 5.12: Cromatograma da amostra P3B em metanol (linha verde) solução padrão


(linha azul) ......................................................................... 41

Figura 5.13: Cromatograma da amostra P3C em metanol (linha verde) solução padrão


(linha azul) ......................................................................... 42



(linha azul) ......................................................................... 42

xi

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 3.1: Estudos brasileiros acerca da ocorrência de desreguladores endócrinos em

diferentes matrizes ambientais……………………………………………………...….14

Tabela 3.2: Concentração do17β-estradiol durante o ciclo hormonal. ........................... 17

Tabela 3.3: Excreção diária de hormônios ..................................................................... 17

Tabela 5.1.3 - Repetitividade do método cromatográfico para a determinação do 17 β-

estradiol...........................................................................................................................35

xii

RESUMO

A ocorrência de fármacos e desreguladores endógenos (DE) no meio ambiente é uma

questão que desperta grande preocupação atualmente por serem substâncias tóxicas e

que causam mudanças nas características fenotípicas de alguns animais, além de serem

produzidas e consumidas pelo homem. Entre essas substâncias a presença dos DE nas

águas residuais é a que mais preocupa. O hormônio 17 β estradiol, que é um DE natural,

produzido endogenamente pelo homem e, principalmente, pelas mulheres durante o

ciclo menstrual. A estrona constitui um de seus metabólitos mais resistentes e existe em

grande concentração nos sistemas sanitários urbanos, mas pode ser degradada ou

removida nos ambientes naturais ou nas estações de tratamento de esgoto (ETE) por

fotodegradação, degradação biológica, volatilização ou sorção. Por esse motivo há a

necessidade de monitoramento de resíduos do hormônio 17 β estradiol nas águas do Rio

Vieira, rio que atravessa a cidade de Montes Claros – MG, constituindo a área de estudo

em questão. Essa pesquisa possui como objetivos: aperfeiçoar e validar as condições

cromatográficas e o método para a determinação do hormônio 17 β estradiol em

amostras de água utilizando a cromatografia em fase líquida de alta eficiência;

quantificar a concentração do hormônio 17 β estradiol existente nas águas em três

pontos do Rio Vieira; analisar se a interferência antrópica interfere no aumento da

quantidade do hormônio em questão no Rio Vieira e verificar se a estação de tratamento

de esgoto (ETE) de Montes Claros, em Minas Gerais, é eficiente na remoção do 17 β

estradiol. Para a avaliação da qualidade do corpo hídrico constituinte da bacia do Rio

Vieiras, em função do disruptor endócrino natural (17 beta – E2) foram coletadas

amostras brutas do rio em três pontos estratégicos: na nascente; na saída da cidade de

Montes Claros e depois da ETE. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de

Química Instrumental - LQI, da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, no

Instituto de Ciências Agrárias, em Montes Claros, Minas Gerais. O método foi adaptado

da metodologia desenvolvida por Alda e Barcelò (2001), para extração do hormônio

17β-E2 em amostras de água bruta. A validação do método proposto foi obtida por meio

da avaliação dos parâmetros de seletividade, linearidade, precisão, repetibilidade e

exatidão. Não foi detectada a presença deste analito nas amostras, mas há fatores

xiii

importantes e relevantes que indicam a remoção ou degradação do 17 beta-estradiol ao

longo do Rio Vieira como: cloração, fotodegradação, biodegradação e sorção.

Palavras-chave: Água do Rio Vieira; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE); 17 Beta-estradiol (E2); Extração em Fase Líquida (EFL).

xiv

ABSTRACT

The occurrence of endogenous drugs and disruptors (ED) in the environment is an issue

that arouses great concern nowadays because they are toxic substances that cause

changes in phenotypic characteristics of some animals, and are produced and consumed

by man. Among these substances the presence of underweight wastewater is of greatest

concern. The hormone 17 β estradiol, which is a natural of produced endogenously by

humans, and especially by the women during the menstrual cycle. Estrone is one of his

toughest metabolites and there is a large concentration in urban sanitation systems but

can be degraded or removed in natural environments or in sewage treatment plants

(STP) for photo-degradation, biological degradation, volatilization or sorption.

Therefore there is the need for monitoring residues of the hormone 17 β estradiol in the

waters of the Rio Vieira, river running through the city of Montes Claros - MG,

representing the study area in question. This research has the following objectives:

improve and validate the chromatographic conditions and the method for determining

the hormone 17 β estradiol in water samples using liquid chromatography of high

efficiency; quantify the concentration of the hormone 17 β estradiol existing in the

waters at three points of the Vieira River; examine whether anthropogenic interference

interferes with the increased amount of the hormone in question in Rio Vieira and verify

that the sewage treatment plant (STP) of Montes Claros, Minas Gerais, is effective in

removing the 17 β estradiol. For evaluating the quality of the constituent water body

River basin Scallops, depending on the natural endocrine disruptor (17 beta - E2) Gross

river samples were collected at three strategic points: at the source; out of the town of

Montes Claros and after the TEE. The research was conducted in Instrumental

Chemistry Laboratory - LQI of the Federal University of Minas Gerais - UFMG, the

Institute of Agricultural Sciences, in Montes Claros, Minas Gerais. The method was

adapted from the methodology developed by Alda and Barcelò (2001) for extraction of

17β-E2 hormone in the raw water samples. The validation of the proposed method was

obtained through the assessment of selectivity parameters, linearity, accuracy,

repeatability and accuracy. Not the presence of this analyte in the sample was detected,

but there are important and relevant factors that indicate the removal or degradation of

17-beta estradiol along the Rio Vieira as chlorination, photo degradation,

biodegradation and sorption.

xv

Keywords: Urban Rivers Water; High-performance liquid chromatography (HPLC); 17

Beta-estradiol (E2); Liquid Phase Extraction (EFL).

1

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, os riscos ambientais causados pelo consumo e produção de alguns

compostos químicos vêm aumentando com o avanço da tecnologia. Há uma crescente

preocupação com a presença de fármacos em ambientes aquáticos e seus possíveis

impactos ambientais. A literatura evidencia que vários pesquisadores, em todo o mundo,

detectaram muitos desses fármacos residuais em águas naturais e em efluentes de

estações de tratamento de esgoto (ETEs). A contaminação ambiental por fármacos está

relacionada à produção, o consumo, o gerenciamento do retorno desses compostos e

seus metabolismos no meio ambiente.

A ecotoxicologia, que é um ramo da toxicologia, vem estudando e monitorando há

algum tempo o comportamento de compostos tóxicos em meio aquático, assim como

seus efeitos em organismos vivos. Esse tipo de estudo faz-se necessário para o melhor

controle da qualidade dos produtos, bem como para práticas mais sustentáveis em

obediência aos órgãos competentes como o Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (Azevedo & Chasin, 2013).

Pouco se sabe sobre o efeito dessas substâncias no meio ambiente (Donn et al., 2008a,

2008b, 2008c) e na literatura científica (revisado por Ying et al., 2002), mas há alguns

anos, pesquisas realizadas na Europa mostraram a presença de fármacos nos corpos

d’água. Alguns fármacos são lançados constantemente no ambiente aquático e essa

sistêmica introdução é suficiente para causar efeitos prejudiciais aos organismos vivos

que estão em contato com esse coquetel de contaminantes.

Uma avaliação criteriosa dos efeitos desses fármacos no meio aquático se faz

necessário. Uma vez conhecido os efeitos, deve-se estabelecer os limites de

concentrações para o descarte seguro de efluentes domésticos tratados em corpos

receptores. O monitoramento da eficiência de remoção desses fármacos pelos processos

convencionais de tratamento de efluentes domésticos das estações de tratamento de

esgoto (ETEs) é de grande importância, pois no futuro, podem ser necessárias

2

adaptações, ou mesmo implantar outros processos de tratamento que complementem a

remoção adequada desses fármacos.

O 17 beta-estradiol é o estrogênio ovariano biologicamente mais resistente. Depois de

ser secretado pelo ovário, grande parte é desidrogenado e biotransformado em estrona,

que também é um estrogênio bastante potente em relação ao organismo humano.

O estrona pode causar alterações mesmo em baixas concentrações (ng L-1

), como o fato

de afetarem a capacidade de reprodução das espécies e interferirem no desenvolvimento

da prole, reduzindo a eclosão de ovos de pássaros, peixes e tartarugas, feminizando

peixes machos, provocando o hermafroditismo em peixes, répteis, pássaros e mamíferos

(SANTAMARTA, 2001; MCLACHLAN et al., 2006; REIS FILHO et al., 2006) e pode

estar presente em efluentes de estação de tratamento de esgoto (ETEs) e na água

afluente de estações de tratamento de esgoto (ETEs). Dessa forma, é importante avaliar

a concentração destes desreguladores endócrinos (DE) na água efluente das estações de

tratamento de esgoto (ETEs).

A presença desses fármacos residuais na água pode causar efeitos adversos na saúde,

seja humana ou de outros organismos presentes nas águas, como os peixes. Os efeitos

causados no sistema reprodutivo de organismos aquáticos são demonstrados em alguns

estudos. Atualmente, existe uma preocupação no desenvolvimento de métodos

analíticos suficientemente sensíveis na determinação dos fármacos residuais em

ambientes aquáticos, com limites de detecção na ordem de μg/L e ng/L.

A importância dos estrogênios reside no seu potencial de afetar adversamente o sistema

reprodutivo de organismos aquáticos como, por exemplo, a feminização de peixes

machos presentes em rios contaminados com descarte de efluentes e é relatada em

diversos trabalhos científicos no mundo.

Pesquisadores desenvolveram e vêm desenvolvendo métodos cromatográficos para a

identificação e quantificação de fármacos em efluentes de estação de tratamento de

3

esgoto (ETEs) e em águas naturais, em baixas concentrações (Verbinnen & Nunes,

2010).

Dessa forma, esse trabalho realizou o monitoramento, por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE), da presença do hormônio 17β-estradiol (E2) nas amostras de água

do afluente da estação de tratamento de esgoto da cidade de Montes Claros – MG, bem

como a validação de método. Para isso, teve como objetivos específicos: aperfeiçoar e

validar as condições cromatográficas e o método para a determinação do hormônio 17β-

-estradiol em amostras de água utilizando a cromatografia em fase líquida de alta

eficiência; quantificar a concentração 17β-estradiol que existe nas águas em três pontos

do Rio Vieira; analisar se a interferência antrópica influencia no aumento da quantidade

do17β-estradiol no Rio Vieira e verificar se a estação de tratamento de esgoto (ETE) de

Montes Claros, em Minas Gerais, é eficiente na remoção do17β-estradiol.

4

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Monitorar e validar, por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a presença do

hormônio 17β-estradiol (E2) nas amostras de água do Rio Vieira, da cidade de Montes

Claros – MG.

2.2 Objetivos Específicos

Aperfeiçoar e validar as condições cromatográficas e o método para a

determinação do hormônio 17β-estradiol em amostras de água utilizando a

cromatografia em fase líquida de alta eficiência;

Quantificar a concentração do hormônio 17β-estradiol existente nas águas em

três pontos do Rio Vieira.

Analisar se a interferência antrópica influencia no aumento da quantidade do

17β-estradiol no Rio Vieira.

Verificar se a estação de tratamento de esgoto (ETE) da cidade de Montes

Claros, em Minas Gerais, é eficiente na remoção do17β-estradiol.

5

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Ocorrência de fármacos e desreguladores endócrinos no meio ambiente

As pesquisas acerca dos desreguladores endócrinos (DE) aconteceram em consequência

de acontecimentos importantes que, a princípio, tiveram relação com efeitos da

exposição de seres humanos e animais a esses compostos como, por exemplo, a

incidência de câncer no sistema reprodutivo de filhas de mulheres que usaram entre os

anos de 1940 e 1970 o dietilestilbestrol, um agente terapêutico aplicado na gravidez

para reduzir o risco de aborto e, atualmente, considerado um DE (BIRKETT &

LESTER, 2003 apud BILA & DEZOTTI, 2007). Segundo Carlsen et al., (1992), na

Dinamarca, se constatou a diminuição da qualidade do sêmen de homens entre os anos

de 1938 e 1990, e que as supostas causas estariam relacionadas à exposição progressiva

dos homens aos estrogênios ou compostos com atividade semelhante aos estrogênios.

Atualmente, a presença de compostos químicos que podem alterar o sistema hormonal

dos organismos vivos, conhecidos como compostos de desregulação endócrina (CDE)

estão despertando grande interesse entre a comunidade científica devido às suas

diversas aplicações nas indústrias e no ambiente (DEBLONDE et al., 2011). No

entanto, comparativamente, pouco se sabe sobre os possíveis riscos ecológicos da

maioria desses produtos químicos. Esta falta de conhecimento resultou num substancial

esforço para desenvolver abordagens e gerar dados que possam ser úteis para avaliar o

impacto dos produtos farmacêuticos no ambiente (ANKLEY, 2006).

A poluição dos recursos hídricos por contaminantes que são originados por atividades

industriais, agrícolas ou são lançados no meio ambiente de forma inadequada causam

grandes preocupações para saúde humana e de animais. Entre os compostos que causam

riscos à saúde destacam-se os desreguladores endócrinos (DE), que são compostos

químicos exógenos que interferem na atividade hormonal pela ação de receptores de

hormônios (MAIA & DEZOTTI, 2007). Tais substâncias podem ser sintetizadas pelo

homem ou de origem natural, tais como os fitoestrogênios.

6

Atualmente, existe um consenso de que estes compostos são introduzidos no ambiente

principalmente através de águas residuais efluentes de estações de tratamento

municipal, efluentes hospitalares e atividades pecuárias (HEREBER, 2002; FENT et al.,

2006; BESSE et al., 2008; BESSE & GARRIC, 2009; VULLIET & CREN-OLIVÉ,

2011; BRAUSCH & RAND, 2011;BESSE et al., 2012).

A exposição a esses tipos de substâncias pode causar efeitos relacionados aos fenótipos

e às características físicas dos organismos de forma geral, tanto para os seres humanos

quanto para os animais. Alguns dos prováveis efeitos atribuídos à exposição a esses

compostos são: diminuição na quantidade de esperma; aumento de câncer de mama em

mulheres e o aumento de certas anormalidades no sistema reprodutivo humano

(LAGANÁ et al., 2004). Já em animais, como os peixes, foram identificados efeitos

como: feminização e reversão sexual, diminuição do desenvolvimento testicular,

inibição da espermatogênese, aumento da fertilização dos ovos pela redução da

produção dos hormônios sexuais masculinos e desequilíbrio no comportamento

reprodutivo (MILLS & CHICHESTER, 2005; SUMPTER, 2005).

As substâncias resultantes de decomposições, fármacos e outros produtos lançados nos

recursos hídricos podem interagir com os receptores de estrogênio, mas as evidências,

até o momento, indicam que as substâncias mais provavelmente responsáveis para uma

quantidade substancial da atividade estrogênica de efluentes municipais são esteroides

naturais e sintéticos (SUMPTER et al., 2006).

3.1.1 Problemas ambientais relacionados aos desreguladores endógenos

Paul Muller, em 1948, anunciou a síntese química do 1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-cloro-

feniletano) (DDT) e ganhou o Prêmio Nobel pela fantástica descoberta de um

―pesticida milagroso‖ (COLBORN et al.,2002). Os efeitos colaterais relativos à nova

descoberta não foram pesquisados a fundo e tão pouco levados em consideração.

7

A bióloga marinha Rachel Carson publicou o livro ―Primavera Silenciosa”, em 1962 e,

naquela época, poucas pessoas tinham ideia dos riscos oferecidos por pesticidas

organoclorados. Essas substâncias eram vistas como facilitadoras de uma alta produção

das safras de alimentos, livres das pragas que atormentavam os agricultores (CARSON,

1962). A partir desta obra, Carson esclarece de forma científica, mas simples, os

impactos causados pelo uso de tal pesticida. Depois de alguns anos, em meados da

década de 70, descobriu-se que: os pesticidas não garantiam a eliminação das pragas,

pois criavam resistência em algumas, as quais voltavam todos os anos em maior

quantidade. Por esse motivo houve o aumento da contaminação ambiental do solo e das

águas de abastecimento das cidades assustadoramente (BAIRD, 2002).

A partir da obra de Carlson surgiram várias questões relacionadas à disposição desses

produtos no meio ambiente e, com isso, vários países adotaram medidas restritivas ao

uso de pesticidas organoclorados, proibindo o uso e fabricação, face aos riscos de

contaminação do ambiente (BAIRD, 2002).

Os animais silvestres também podem sofrer impactos com os DE no meio ambiente.

Um acontecimento significativo e curioso foi observado no Lago Apopka, na Flórida

(EUA), em 1995, onde ocorreram anomalias no sistema reprodutivo de jacarés devido à

contaminação com o pesticida DDT (2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-triclo-roetano) e seu

metabólito DDE (2,2 bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno) (GUILLETTE et al., 1996).

No Reino Unido, ainda na década de 1990, foram observados alguns casos de

feminização de peixes devido à presença de compostos estrogênicos (hormônios

naturais femininos ou substâncias que os mimetizavam), a exemplo do17β-estradiol e

dos alquilfenóis, presentes nos efluentes das estações de tratamento de esgoto

(PURDOM et al., 1994; JOBLING et al., 1998; SUMPTER, 1998).

Outros problemas vinculados aos DE têm sido citados na literatura, tais como se

destacam (BILA & DEZOTTI, 2007): diminuição na eclosão de ovos de pássaros,

peixes e tartarugas; problemas no sistema reprodutivo de répteis, pássaros e mamíferos;

8

alterações no sistema imunológico de mamíferos marinhos. Já em seres humanos foram

relatados alguns casos, como os citados (BILA & DEZOTTI, 2007), tais como: aumento

da incidência de câncer de mama, de testículo e de próstata e a endometriose (doença

caracterizada pela presença do tecido uterino fora do útero).

Os efeitos dos estrogênios sobre peixes e outros organismos aquáticos têm sido

amplamente estudados (CALDWELL et al., 2008). No entanto, poucos estudos

avaliaram os efeitos potenciais de estrógenos nas águas de superfície em relação aos

seres humanos. Além disso, os estudos disponíveis sobre a utilização de DE em seres

humanos chegaram a conclusões divergentes em relação aos seus efeitos (AHERNE &

BRIGGS 1989; CHRISTENSEN, 1998; ANDERSSON & SKAKKEBAEK 1999;

WEBB et al., 2003). Ao fazer uma relação entre a exposição humana e os piores casos

independentes identificados de intoxicação com estes hormônios (HARTMANN et al.,

1998; FRITSCHE & STEINHART, 1999) concluíram que a ingestão dos estrogênios

endógenos através da água ou de qualquer outra forma externa é mínima em

comparação com as quantidades que os seres humanos produzem.

Os artigos que trata da detecção de estrógenos nas águas para o abastecimento humano,

tanto de superfície como das águas tratadas em empresas públicas (DONN et al., 2008a,

2008b, 2008c) e na literatura científica (YING et al., 2002) fornece poucas informações

para predizer se exposições potenciais de água potável são grandes ou pequenas em

comparação com outras fontes de exposição (por exemplo, a ingestão dietética de

referência) ou em comparação com doses diárias aceitáveis (DDA). Este fato torna

difícil determinar se as exposições às águas derivadas da superfície são uma fonte

significativa de estrogênio e se possuem potencial para exceder DDA e, assim, se os

mesmos merecem avaliação adicional.

Em ambientes aquáticos, as pesquisas sobre os efeitos causados pelos DE apontam

resultados preocupantes (BRANDT, 2012). Não há registros evidentes que indiquem

que as concentrações típicas dos DE existentes nos ambientes aquáticos possam causar

efeitos agudos nos organismos aquáticos, mas há estudos suficientes na Europa, Estados

Unidos e no Brasil que mostram efeitos crônicos em organismos mais sensíveis

9

expostos a concentrações relevantes dos compostos em ambientes aquáticos.

Alguns temas de pesquisas têm abordado situações preocupantes, como os efeitos

interativos causados pela mistura de diversos fármacos e DE no meio ambiente, que

podem resultar em consequências inesperadas quando combinados, ainda que em

concentrações baixas no meio ambiente (POMATI et al., 2008; QUINN et al., 2009).

Os últimos estudos apontaram os antibióticos como um dos principais contaminantes do

ambiente aquático pela possibilidade do desenvolvimento de bactérias patogênicas

resistentes no meio ambiente. Ash & Iverson (2004) identificaram bactérias resistentes

às sulfonamidas (um grupo de antibióticos) e à trimetropina em rios dos Estados Unidos

da América (EUA), fenômeno que parece ter ocorrido devido à presença desses

compostos nos ambientes aquáticos, mesmo em baixas concentrações.

A descoberta de novas tecnologias analíticas, principalmente a cromatografia de fase

líquida acoplada à espectrometria de massas, permitiu a análise dessas substâncias

mesmo em baixas concentrações, como as que ocorrem no meio ambiente (IWA, 2010).

As pesquisas que avaliaram a ocorrência desses compostos no meio ambiente

começaram a ser intensificadas, notadamente nos países europeus e nos EUA, a partir

da década de 1970 (HIGNITE & AZARNOFF, 1977).

Alguns registros na literatura evidenciam grande variabilidade na ocorrência dos

fármacos e DE no esgoto sanitário bruto e tratado, o que pode ser explicado pelo padrão

de consumo diferenciado dessas substâncias. Diferentes países e regiões apresentam

características bem distintas em termos de prevalência de doenças, de processos de

tratamento de esgoto, de hábitos culturais ou até de restrições relacionadas ao mercado

farmacêutico (ZUCCATO et al., 2006).

Os fármacos encontrados no meio aquático no Brasil (esgoto bruto, tratado e águas

superficiais) ocorrem de forma semelhante, mas com uma ordem de grandeza inferior às

concentrações normalmente relatadas na literatura internacional. Anti-inflamatórios

10

como o diclofenaco ou o ibuprofeno foram encontrados em concentrações maiores nos

estudos de Ghiselli (2006) e Souza (2011), quando comparadas às concentrações

normalmente relatadas na literatura internacional. No caso dos hormônios naturais e

sintéticos e dos xenoestrogênios, as concentrações encontradas nas matrizes ambientais

brasileiras mostram-se semelhantes ou até três ordens de grandeza superiores às

concentrações comumente relatadas na literatura internacional.

3.1.2 Principais fármacos e desreguladores endócrinos abordados em estudos

ambientais.

Os fármacos são desenvolvidos para serem resistentes a diversas situações encontradas

dentro do organismo. São compostos ativos complexos desenvolvidos e usados com o

objetivo de promover efeitos biológicos específicos. Após administradas, essas

substâncias são absorvidas e distribuídas pelo corpo, onde são transportadas pelos

fluxos gástricos e entra em contato com diversos ambientes intracorpóreos. Nesse

percurso, elas são parcialmente metabolizadas e, finalmente, excretadas (via fezes e

urina) em suas formas originais, conjugadas ou como metabólitos (TAMBOSI, 2008).

O metabolismo dos fármacos em um organismo inicia-se por diversas reações

bioquímicas de hidroxilação, epoxidação, redução, hidrólise e adição de grupos

funcionais. Em seguida, moléculas endógenas altamente polares ligam-se aos

metabólitos formados nas reações anteriores ou aos próprios fármacos originais não

metabolizados, de forma a torná-los mais solúveis em água, facilitando, assim, a sua

excreção. Entre as diversas moléculas endógenas responsáveis pelo processo de

formação de conjugados, destacam-se os glicuronídeos, sulfatos e aminoácidos

(TAMBOSI et al., 2010).

O consumo de fármacos tende a aumentar com o tempo em consequência dos seus

efeitos benéficos à saúde e, consequentemente, aumentará também a sua concentração

no meio ambiente. Em contrapartida, outros microcontaminantes, como pesticidas e

poluentes industriais, tendem a diminuir nos próximos anos pelos avanços das restrições

legais (TAMBOSI et al., 2010).

11

Dos anti-inflamatórios, o ibuprofeno (IBP) e o diclofenaco (DCF) são os mais

comercializados e prevalentes no ambiente. Já entre os antibióticos, os mais citados são

o sulfametoxazol (SMX), trimetoprima (TRI) e a tetraciclina (TET). Os dois primeiros

antibióticos são normalmente estudados em conjunto por constituírem o princípio ativo

do medicamento Bactrim®, de grande utilização no nosso país. Entre os reguladores

lipídicos, o bezafibrato (BZF) é o medicamento mais relatado na literatura. O principal

hormônio sintético referenciado é o 17α-etinilestradiol ou etinilestradiol (EE2),

amplamente utilizado em pílulas anticoncepcionais (AQUINO et al., 2013).

Em se tratando de DE, destacam-se na literatura os estrogênios, hormônios responsáveis

pelo desenvolvimento das características femininas em um organismo. As principais

funções do estrogênio (Figura 3.1.2) são: regular o ciclo menstrual, estimular o

desenvolvimento do endométrio e das mamas e influenciar o desenvolvimento e

comportamento do organismo como um todo (NASSIF et al., 2005).

Os estrogênios possuem como estrutura padrão: 18 carbonos que contêm um anel

fenólico (um anel aromático com grupo hidroxila no carbono 3 e um grupo hidroxílico

ou cetona na posição 17 do anel D). O anel fenólico é o principal componente estrutural

responsável pela alta afinidade com os receptores estrogênicos (LOOSE et al., 2005).

Figura 3.1.2: Estrutura básica dos estrogênios esteroides.

Fonte: (LOOSE et al., 2005).

12

Estrogênios naturais que são excretados pelas mulheres e fêmeas de animais vertebrados

são: estrona (E1), 17β-estradiol ou estradiol (E2) e estriol (E3) (RIBEIRO et al., 2010).

O estrogênio sintético (EE2) também é um estrogênio, porém sintético, que apresenta

maior atividade de desregulação endócrina do que os hormônios naturais (SVENSON et

al., 2003).

Os pesticidas (ex. ftalatos, alquilfenóis, bifenilas policloradas e hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos) são substâncias que têm a capacidade estrogênica e são

constantemente encontradas em amostras de águas naturais e esgoto (bruto e tratado).

São caracterizados como xenoestrogênios e competem com o E2 pelos receptores de

estrogênio, além de exercer efeito sobre os organismos (GHISELLI & JARDIM, 2007),

os principais xenoestrogênios encontrados no meio ambiente são: bisfenol A (BPA) e

nonilfenol (NP).

3.2 Remoção de fármacos e desreguladores endócrinos em estação de tratamento de

esgoto ETE.

A remoção de fármacos e microcontaminantes presentes em esgotos sanitários requer

altos custos de investimento, pois se torna necessário tecnologias sofisticadas em

comparação aos sistemas biológicos de tratamento. Para tal remoção, as ETEs devem

possuir tecnologias importantes, como: processos oxidativos avançados, ozonização,

reatores com lâmpadas ultravioleta, processos de adsorção em carvão ativado (IWA,

2010) .

Na maioria das ETEs não existe tais tecnologias, dessa forma há a necessidade de

validar a remoção de fármacos e DE em sistemas de tratamento de esgoto que utilizam

reatores biológicos. Quando se analisa a remoção de fármacos e DE em lodos ativados

existem diversos estudos que comprovam tal eficiência (CLARA et al., 2005a; MIÈGE

et al., 2008; SIPMA et al., 2009).

13

Santos et al., (2010) afirmam que as principais substâncias encontradas em ambientes

aquáticos são: anti-inflamatórios não esteroides (16%), antibióticos (15%), reguladores

lipídicos (12%) e hormônios sintéticos (9%), que somados perfazem 52% dos 134

artigos publicados entre 1997 e 2009 sobre a ocorrência de fármacos em ambientes

aquáticos. As rotas de contaminação e exposição humana aos fármacos e desreguladores

endócrinos estão na Figura 3.2.

Figura 3.2: Rotas de contaminação e exposição humana aos fármacos e desreguladores

endócrinos.

Fonte: (AQUINO, 2013).

3.2.1 A eficiência do HPLC na identificação e quantificação dos desreguladores

endógenos na água.

Métodos para identificação e quantificação dos DE têm sido relatados, incluindo

cromatografia em fase gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e

espectrometria de massa (MS). A espectrometria de massa (EM) tornou-se a técnica

analítica mais amplamente utilizada no passado, devido à sua alta sensibilidade e

seletividade (VÍLCHEZ et al., 2001; LEE et al., 2005).

No entanto, a maioria destes métodos analíticos propostos na literatura necessita da

aplicação de derivatização trabalhosa e demorados procedimentos que antecipam a

análise do Cromatógrafo gasoso com detector de massa (GC-MS). Porém,

recentemente, a técnica de HPLC tem chamado mais atenção, quando é acoplada à

14

detecção electroquímica (ED) (PENALVER et al., 2002.; WATABE et al., 2004a.;

WATABE et al., 2004), detecção de fluorescência (FLD) (YING et al., 2002.;

GARCIA-PRIETO et al., 2006) e MS (BECK et al., 2005.; MITANI et al., 2005) e

atinge elevadas seletividade, sensibilidade e precisão. Os limites de detecção do método

de compostos estrogênicos são relatados de g/L para ng/L, níveis em diferentes

amostras ambientais.

Além disso, para conseguir um método rápido, eficiente e confiável para a análise

cromatográfica de compostos estrogênicos em amostras ambientais, a preparação da

amostra é muito importante. Vários métodos de pré-tratamento, tais como a extração

líquido-líquido (LLE) (VÌLCHEZ et al., 2001.; WATABE et al., 2004), a extração em

fase sólida (SPE) (LEE et al., 2005.; WANG et al., 2005.; CAI et al., 2003.;

VANDERFORD et al., 2003) e absorção de extração (SBSE) (KAWAGUCHI et al.,

2004a.; KAWAGUCHI et al., 2004), têm sido amplamente aplicados à extração dos DE

a partir de águas ambientais. No entanto, o método exige LLE, extração complexa, e os

procedimentos de limpeza, bem como grandes volumes de amostra e extratantes

orgânicos.

O método SPE supera a desvantagem da utilização de extratos orgânicos, mas ainda

possui demorados processos em múltiplos passos que, geralmente, incluem extração,

eluição, evaporação e a amostra de reconstituição. Para superar esses problemas, alguns

métodos de preparação de amostras on-line têm sido desenvolvidos. Ying, 2002

desenvolveu um sistema on-line SPE automático acoplado com HPLC-FLD o qual foi

aplicado com sucesso para a simultânea determinação de oito desreguladores endócrinos

in water (YING et al., 2002).

Rodriguez-Mozaz, 2004 também apresentou um sistema totalmente automático do

método SPE-HPLC-MS para a determinação de um ambiente mais relevante dos

estrógenos naturais em águas tratadas (RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2004). Já Watabe,

desenvolvido um sistema de HPLC de comutação de coluna com microanálise

automática, conseguido o bisfenol A, a uma ultrabaixo concentrações (abaixo de 1 ng /

L), utilizando electroquímica detecção (WATABE et al., 2004).

15

Com base no sistema de HPLC de comutação de coluna, Watabe também apresentou

um método HPLC-ED (WATABE et al., 2004a) e um Método de HPLC-MS

(WATABE et al., 2005) para a análise de bisfenol A em águas ambientais,

respectivamente, utilizando a imagem molecular do polímero, tal como um dispositivo

de pré-tratamento em linha.

3.2.2 Funcionamento do detector de arranjo de diodos

A Figura 3.2.2 ilustra um esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de

arranjo de diodos. Neste esquema há duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e

tungstênio, cujas emissões são focalizadas através de uma lente sobre a amostra.

Portanto, todo o espectro de emissão da lâmpada incide sobre a mesma, sendo que a luz

incidente será, em parte, absorvida. Esta luz que atravessou a amostra (transmitida ou

emergente) irá incidir sobre uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta

sobre uma grade de difração. Esta grade irá difratar a luz, separando os seus diferentes

comprimentos de onda, sendo que cada um deles irá incidir sobre um diodo do arranjo.

16

Figura 3.2.2: Esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de arranjo de

diodos.

Fonte: Adaptado (AZEKA, 2009)

Este diodo, ao receber o feixe de luz, produz uma corrente elétrica cuja magnitude

depende da intensidade da emissão (novamente aqui se aplica o efeito fotoelétrico).

Através de um circuito de calibração adequado, esta corrente será transformada em

absorbância nos diferentes comprimentos de onda, resultando no que se convenciona

chamar de espectro de absorção (OWEN, 1996).

O procedimento experimental convencional de obtenção de espectros de absorção em

um instrumento deste tipo envolve inicialmente o registro de um espectro do ruído de

fundo ou do solvente ou do ar (a serem utilizados como branco). Arquiva-se o mesmo e,

em sequência, se obtém o espectro da amostra e se efetua a subtração dos dois. O

resultado é o espectro da amostra, o qual tem o solvente (ou ar) como branco (OWEN,

1996).

3.3 Características dos hormônios 17β-estradiol

O 17β-estradiol é um hormônio feminino importante para a reprodução das células das

mamas, da pele e do cérebro, além de ser responsável pelo desenvolvimento das

características secundárias sexuais femininas e reprodução. Apesar de ser um hormônio

natural, é produzido em grande escala para ser usado em contraceptivos orais e para a

reprodução humana. O 17β-estradiol possui como um dos seus metabólitos naturais a

estrona, que é um ingrediente ativo de um estrogênio usado no tratamento de reposição

hormonal (IKEHATA et al., 2006).

O DE em questão é produzido naturalmente pelos organismos. A produção de hormônio

na mulher varia de acordo com o ciclo menstrual no qual ela se encontra, exceto quando

ela está grávida. O ciclo menstrual se divide em três fases (LOOSE et al., 2015).

17

Fase folicular – é a fase em que ocorre o desenvolvimento dos folículos dos

ovários. No início desta fase os baixos níveis de 17β-estradiol e de progesterona

fazem com que o revestimento uterino (endométrio) se desprenda na

menstruação.

Fase ovulatória - inicia-se ao aumentar o hormônio luteinizante e é

caracterizada pela liberação do óvulo. O nível de 17β-estradiol atinge o seu

ponto máximo e o nível de progesterona começa a subir.

Fase Luteínica - começa depois da ovulação e dura cerca de 14 dias. Se o

óvulo não for fertilizado, o corpo lúteo degenera e deixa de produzir

progesterona, o nível de 17β-estradiol decresce e inicia novo ciclo menstrual.

Na Tabela 3.2 está representada a concentração do17β-estradiol no organismo em cada

ciclo menstrual, já na Tabela 3.3 encontram-se os valores de excreção diária de

hormônios de homens e mulheres em diferentes fases da vida, podendo chegar a valores

altos como 600 microgramas por dia (JOHNSON et al., 2000). Dessa forma, esses

hormônios são liberados na urina constantemente em quantidades que poderiam afetar a

vida aquática e estão presentes nos esgotos domésticos.

Tabela 3.2: Concentração do17β-estradiol durante o ciclo hormonal.

Fonte: (LINHARES, 1993; LOOSE et al., 2015).

Tabela 3.3: Excreção diária de hormônios

Fonte: (JOHNSON et al., 2000)

18

3.3.1 A ineficiência da remoção do 17β-estradiol nas estações de tratamento de

esgoto

O 17β-estradiol (Figura 3.3.1) tem influência na formação das características

secundárias sexuais femininas e na reprodução, além de ser o estrogênio ovariano

biologicamente mais potente. Constitui-se em estrogênio manipulado para ser usado em

contraceptivos para a reposição hormonal, apesar de ser natural (IKEHATA et al.,

2006). O E2 pode causar alterações nos sistemas endócrinos de organismos vivos

mesmo em baixas concentrações na água, da ordem de ng.L-1

(SUMPTER, 2005).

Figura 3.3.1: Fórmula estrutural do 17β-estradiol.

Fonte: (WANG et al., 2008).

Os estrogênios naturais são transformados biologicamente no sistema hepático,

músculos, rins e gônadas, sendo degradados em compostos estrogênicos mais estáveis

conjugados a ácido sulfúrico e glicurônico (GILMAN et al., 2003). Em contrapartida, a

ocorrência de estrogênios ―livres‖ em Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) indica

que os metabólitos de estrogênios são transformados de volta a sua forma ativa durante

o tratamento do esgoto. Essa desconjugação ocorre durante o processo do tratamento do

esgoto (CHEN & HU, 2009; TERNES et al., 1999) e os hormônios permanecem na sua

forma ativa o que causa a contaminação dos corpos receptores.

Quanto mais eficiente a remoção de DE durante o tratamento de esgoto, menor a

presença desses no efluente final (BIRKETT & LESTER, 2002). A degradação do E2

ocorre de forma mais rápida nos sistemas aeróbios, onde em um dia de detenção hídrica

a taxa de remoção é de 88%, já nos sistemas anaeróbios, é de até 50% após 5 dias de

19

detenção hídrica (LEE & LIU, 2002). Ao serem lançados nos corpos receptores, os DE

podem ser removidos por fotodegradação, mas ocorre remoção lenta, com meia-vida de

10 dias (JURGENS et al., 2002). Dessa forma, esta água pode estar contaminada e pode

se tornar uma fonte adicional de DE para os consumidores da água tratada (LEINSTER

et al., 1981).

A presença de E2 em rios e na água para abastecimento humano é cada vez mais

frequente. O E2 foi detectado em uma fonte de água nos EUA na concentração de 17

ng.L-1

, em Taiwan, na ordem de 1,4 a 33,9 ng.L-1

em águas superficiais, no Brasil, no

afluente de uma estação de tratamento de água (ETA) convencional, na ordem de 3,0 a

9,1ng.L-1

, e na água de abastecimento humano, com concentração de 0,78 a 1,48 ng.L-1

e em mananciais de Belo Horizonte e São Paulo com concentrações de 1,5 a 36,8 ng.L-1

e 0,72 a 17,1ng.L-1

respectivamente (CHEN et al., 2007).

Todos os tratamentos que ocorrem nas estações de esgoto, principalmente na etapa da

clarificação, não são efetivos na remoção ou transformação de compostos estrogênicos

(SVENSON et al., 2003). Alguns estudos retratam essa realidade, como: o de

Westerhoff et al., (2005), a remoção de E2 foi de 2% após coagulação com sulfato de

alumínio e o de Chen et al., (2007), após coagulação/floculação com sulfato de alumínio

(5mg.L-1

), obtiveram remoção de 30 a 50%, mas no mesmo estudo, após a filtração

rápida, a remoção foi de 31 a 42% (filtro apenas com areia). O carvão ativado tem

eficiência de 97% de remoção para o 17β-estradiol após 4 horas de detenção hídrica

com 5mg. L-1

do carvão (WESTERHOFF et al., 2005). Mesmo assim, constitui-se em

um tratamento de alto custo e com um tempo de detenção hídrica grande para uma ETA.

A oxidação é um método comprovadamente eficiente para ser utilizado nas ETA na

remoção dos compostos estrogênicos. (PEREIRA et al., 2011), ao comparar o uso de

diferentes oxidantes para a transformação de compostos estrogênicos, identificaram que

os tratamentos com maior resultado para a remoção de estrogênios foram: a remoção

através do ozônio; o íon ferrato e dióxido de cloro.

20

No trabalho de (WESTERHOFF et al., 2005), alcançou-se uma eficiência de remoção

próxima a 100% com tempo de contato de 24 horas, dose de cloro de 3,5 a 3,8 mg.L-1

e

concentração inicial de E2 de 10 a 250 ng.L-1

. No estudo de Alum et al., (2004),

chegou-se a uma remoção de 99% de E2 com 1mg.L-1

de cloro e tempo de contato de 15

minutos, com uma concentração inicial elevada e limite de detecção do equipamento de

313ng.L-1

. Nakamura et al., (2007), após a oxidação com cloro de 1mg.L-1

e tempo de

contato de 15 minutos, chegaram a uma remoção de 70% para o estrona (E1). Doses de

cloro entre 1 e 4mg.L-1

mostraram-se mais eficazes para a remoção de compostos

estrogênicos. Mas a remoção de compostos estrogênicos possui relação direta com o

tempo de detenção hídrica para que ocorra um contato maior entre o cloro e os

hormônios para que assim ocorra a degradação mais efetiva (ALUM et al., 2004;

WESTERHOFF et al., 2005; NAKAMURA et al., 2007; PEREIRA et al., 2012).

3.3.2 Fatores intervenientes na remoção de fármacos e desreguladores em estações

de tratamento de esgoto

Para um melhor entendimento sobre a degradação de fármacos e desreguladores que

ocorrem em ETE é necessário conhecer o percurso que os mesmos fazem e avaliar os

principais mecanismos de remoção atuantes nesses compostos, que por sua vez são

definidos pelas propriedades físico-químicas dos microcontaminantes, pela

configuração dos sistemas de tratamento, pelas condições ambientais e pelos parâmetros

operacionais das unidades de tratamento (IWA, 2010). As formas de remoção de

fármacos e desreguladores em ETE são:

3.3.3 Sorção

A tranferência de massa das moléculas de uma fase fluída para uma fase sólida ou

líquida é chamado de sorção. Essa transferência pode ser estimada pelo coeficiente de

dsitribuição ou partição sólido-líquido (Kd) que é a relação entre as concentrações de

uma substância nas fases líquida e sólida, quando há o equilíbrio (SUÁREZ et al.,

2008). Na sorção ocorre tanto a adsorção como a absorção: na adsorção é um processo

pelo qual átomos, moléculas ou íons são retirados na superfície de sólidos através de

21

interações de natureza química ou física, já na absorção é um efeito de fazer degradar ou

transformar alguma coisa, incorporando-a ou assimilando-a a outra.

Segundo Ternes ,2004, geralmente não se considera a liberação de sítios de absorção

nos sólidos pelo processo de biodegradação, tanto na fase sólida como no meio líquido,

em sistemas de tratamento de esgoto, quando se trata de Lodos ativados. No balanço de

massa de fármacos e DE somente os sólidos ou biomassas recém geradas estão

vulneráveis para a sorção dos compostos que entram nos reatores biológicos. Porem,

essa questão é uma síntese do balanço de massa, e como o tempo de retenção do sólidos

na unidade de tratamento é superior ao tempo de detenção hídrica do líquido e,

consequentimente, da geração de sólidos ou biomassa no sistema, a renovação dos sítios

de sorção são menores do que a geração desses sólidos. Portanto, o termo SS é

relacionado a quantidade de lodo ou biomassa gerada por unidade de esgoto tratado.

Em sistemas de tratamento de esgoto, a sorção de muitos fármacos e DE, podem ser

representada como: para um composto i em condições de equilíbrio entre as fases

líquida e sólida, a concentração na fase sólida (Ci,S) ou a massa de i por kg de sólidos

suspensos (Ci,S.SS-1

) é proporcional à concentração do composto i na fase líquida (Ci,L),

conforme mostra a Equação 1 (TERNES et al., 2004):

(1)

na qual: Ci,S é a concentração do composto i na fase sólida (ng.L

-1 a µg.L

-1);

Kd é o coeficiente de distribuição sólido-líquido (L.kg-1

); SS é a concentração de sólidos suspensos no esgoto, podendo ser ainda a produção de

lodo por litro de esgoto tratado (kg.L-1

);

Ci,L é a concentração do composto i dissolvido na fase líquida (ng.L-1

a µg.L-1

).

A adsorção está relacionada às interações eletrostáticas entre os compostos (carregado

positivamente) e a biomassa (carregada negativamente). Ou, de forma menos

significativa, as forças de Van der Waals entre grupos alifáticos dos fármacos e DE e as

superfícies hidrofóbicas da biomassa e da matéria orgânica em suspensão (AQUINO et

al., 2013).

22

3.3.4 Transformações biológicas

A baixa concentração dos fármacos e DE no esgoto bruto limita transformações

biológicas por dificultar as interações cinéticas entre os compostos. Por a maioria dessas

substâncias apresentarem cinética de degradação de primeira ordem, a taxa de

transformação biológica é diretamente proporcional à concentração dos compostos

existentes na fase líquida e da concentração da biomassa, que é expressa como sólido

suspensos (SS).

Os compostos com pouca tendência para a sorção na biomassa aeróbia (log Kd≤2,0), a

divisão do volume reacional do reator em vários compartimentos como, reator em

regime hidráulico de fluxo em pistão melhorou significativamente a remoção dos

compostos biodegradáveis, quando comparado a um reator em regime hidráulico de

mistura completa. O impacto positivo da aproximação do reator ao regime hidráulico de

fluxo em pistão foi menos significativo para compostos com grande tendência para a

sorção (AQUINO, et al., 2013).

Joss, (2006) propos a seguinte classificação dos fármacos e DE quanto ao grau de

biodegradabilidade:

Substâncias com Kbio<0,1 L.gSS-1

.d-1

não apresentam remoção satisfatória pelo

mecanismo de biodegradação, sendo a eficiência máxima de remoção do

composto na ETE inferior a 20% para compostos com grande tendência para a

sorção (log Kd>3);

Substâncias com 0,1≤Kbio≤10 L.gSS-1

.d-1

devem ser parcialmente biodegradadas

com eficiência de remoção de 20 a 90%;

Para compostos com Kbio>10, espera-se uma boa remoção biológica (acima de

90%), sendo a eficiência dependente do regime hidráulico do reator; são

observadas maiores eficiências de remoções em reatores com fluxo hidráulico do

tipo pistão.

23

Os fármacos e DE são melhores degradados em condições aeróbias, consequentemente

a concentração de oxigênio dissolvido no ambiente é muito importante para facilitar a

remoção biológica de alguns estrogênios, causando uma dependência de remoção da

atividade da biomassa e do potencial redox da ETE (AQUINO et al., 2013).

A assimilação que os microrganismos têm pelos fármacos e DE é um fato importante na

biodegradação desses compostos na ETE. Essa disponibilidade acontece através da

combinação dos aspectos físicos e químicos envolvendo a distribuição e a transferência

de massa dos compostos entre as fases líquidas e sólidas, além dos aspectos fisiológicos

dos microrganismos envolvidos (AQUINO; BRANDT; CHERNICHARO, 2013) Uma

alta biodisponibilidade depende principalmente: da solubilidade do fármaco ou do DE

em meio aquoso, sendo que compostos com log Kow<2,5 têm elevada hidrofilicidade e,

portanto, elevada biodisponibilidade e da temperatura, uma vez que o crescimento

microbiano é determinado por faixas de temperaturas (IWA, 2010).

O TDH e o tempo de retenção dos sólidos no sistema (idade do lodo) são outros

importantes fatores que influenciam na remoção biológica dos fármacos e DE em ETE.

Na realidade, esses fatores também influenciam os mecanismos de sorção. Elevado

TDH, assim como elevada idade do lodo permitem maior tempo para a biodegradação e

para a sorção dos compostos dissolvidos (AQUINO; BRANDT; CHERNICHARO,

2013).

3.3.5 Fotodegradação

A fotodegradação pode ocorrer quando os microconteminantes são expostos ou

excitados pela radiação UV, causando a clivagem de uma ligação química dessas

substâncias, esse processo é chamado de fotodegradação direta. Já na indireta os as

moléculas presentes no meio podem ser excitadas pela radiação ultravioleta (UV),

produzindo radicais livres que podem reagir com os microcontaminantes e os degradar

(GURR & REINHARD, 2006).

24

Nas ETEs a radiação solar é desprezível para a remoção de fármacos e DE, pois a

elevada presença de sólidos suspensos no esgoto bruto ou tratado, a pequena fração de

radiação UV do espectro solar e pequena área superficial disponível para a incidência

solar, sendo restrita apenas às primeiras camadas da coluna de água em unidades

abertas, a exemplo de decantadores e tanques de aeração (ZHANG et al., 2008). Mas a

fotodegradação pode ocorrer em maior monta em sistemas naturais (ex.: lagoas de

estabilização), nos quais são empregadas grandes áreas superficiais para a incidência

solar. E processo, nesse caso, pode ser limitado pelos períodos noturnos e pelos dias

nublados, bem como pela presença de sólidos (ex.: algas) na fase líquida (AQUINO et

al., 2013)

3.3.6 Volatilização

A remoção de compostos voláteis nas ETEs por volatilização é praticamente nula em

quase todas as pequisas. Como a maioria dos fármacos e DE tem estruturas de grande

massa molar e pouca volatilidade é desprezível a taxa de remoção através desse

mecanismo. Ainda que em sistemas de tratamento aerados mecanicamente, onde pode

ocorrer o desprendimento de substâncias para a fase gasosa, a remoção desses

compostos é desprezível. Segundo Suárez et al., (2008), não há possibilidade de

desprendimento dos fármacos e dos DE em sistema de lodos ativados, quando se leva

em conta as taxas de aeração comumente aplicadas.

25

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Caracterizações da área de estudo

Para que fosse avaliada a qualidade do corpo hídrico da bacia do Rio Vieira, em função

do disruptor endócrino natural (17 beta – E2) foram coletadas amostras brutas do rio em

três pontos estratégicos: na nascente; na saída da cidade de Montes Claros e depois da

ETE. A pesquisa foi desenvolvida no laboratório de Química Instrumental (LQI) da

Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, no Instituto de Ciências Agrárias, em

Montes Claros, estado de Minas Gerais.

4.1.1 Área da bacia do Rio Vieira

Montes Claros é uma cidade localizada no norte do estado de Minas Gerais, distante

418 km da capital Belo Horizonte. Possui aproximadamente 361.915 habitantes

distribuídos de forma heterogênea em um território de 3.568.941Km2 (IBGE, 2010).

Possui clima tropical semiúmido, Aw na classificação Köppen, temperatura média anual

de 24°C e índice médio pluviométrico anual de 1.074mm. Predomina como formas de

vegetação, o cerrado caducifólio com manchas de mata seca, e trechos de transição com

a caatinga (FRANÇA, 2007; NERY et al., 2014).

O Rio Vieira nasce na ―Serra do Vieira‖, antiga fazendo Vieira, há 8 km de Montes

Claros, seguindo para a Serra do Ibituruna, na Longitude ―43º44’04‖ W, e na Latitude

16º47’22‖ S. Sua foz, no Rio Verde Grande, localizada próxima a uma região chamada

Estação Ferroviária Canací, Longitude ―43º44’26‖ W, Latitude 16º36’10‖ S, a Nordeste

de Montes Claros. O seu afluente é o Rio Verde Grande, que é uma bacia federal, e se

situa na margem direita do rio São Francisco (BORGES, 2007; VELOSO & NERY,

2011; FONSECA & FONSECA, 2012; NERY et al., 2014).

O Rio Vieira, em decorrência de diversas pressões exercidas pelas atividades antrópicas

ao longo do tempo, sofreu uma ampla descaracterização da sua paisagem, cercado de

edificações e aglomerações, substituindo a vegetação e constituintes da paisagem

natural (FONSECA & FONSECA, 2012; NERY et al., 2014).

26

A poluição e a falta de tratamento adequado dos efluentes e resíduos provenientes da

cidade de Montes Claros vêm causando contaminação nas águas do Rio Vieira há

muitos anos (BORGES, 2007). A Figura 4.1 ilustra a trajetória do rio demonstrando que

o mesmo atravessa a cidade de ponta a ponta.

Figura 4.1: Localização da Área de Estudo.

Fonte: Adaptado (LIMA et al,. 2012).

Na bacia do rio vieira se encontra um manicial subterrâneo de grande significado, além

de rios e coregos intermintentes. O relevo é endocástico, principalmente na região da

Lapa Grande/Cedro que fica localizado a Oeste/Noroeste da bacia. Existe nesse local

várias grutas, vales cegos, nascentes e surgências (Figura 4.1.1) desde a sua nascente, no

município de Montes Claros, até sua foz no Rio Verde Grande, o Rio Vieira percorre

51,37 km, dentre os quais, aproximadamente, 42,7 km com contribuição de efluentes

domésticos e industriais provenientes da malha urbana de Montes Claros (EMATER,

2003).

27

Figura 4.1.1 Mapa de abrangência da bacia hidrográfica do Rio Vieira.

Fonte: (EMATER, 2006).

O Rio Vieira recebe as águas dos rios: Vieira, do Cedro e Canoas. Além destes, ocorre o

deságue de quinze córregos, a saber: da Gameleira; dos Porcos, Palmital (Nascentes);

São Geraldo, Vargem Grande, São Marcos, dos Bois, Lapa Grande; Morcego, Cintra,

Pau Preto, Barrocão, do Mocambo Firme, Cabeceiras, Mumbuca (EMATER, 2003).

O Rio Vieiras possui uma nescente perene, cujo a localilzação e protegida pela mata e

pelo relevo, que favorece a preservação da área. E outra intermintente, que se encontra

entre vales e protegido por cercas e pela vegetação fechada.

4.2 Preparo da vidraria.

As vidrarias utilizadas no processo de coleta, armazenamento e para a extração foram

descontaminadas da seguinte forma:

As vidrarias foram imersas em sabão alcalino Derquim® LM 01 (diluição 1:1000),

durante 24 horas;

28

Sob água corrente lavou-se a vidraria até completa remoção do sabão; Enxaguou-se três

vezes, utilizando água deionizada;

As vidrarias ficaram de molho em ácido nítrico 10% durante 24 horas;

Após completa secagem, toda vidraria foi vedada com papel filme e armazenada em

local apropriado.

4.3 Matriz

As matrizes utilizadas foram águas brutas, advindas de três pontos do Rio Vieira: da

nascente, com menor interferência antrópica; na cidade de Montes Claros, antes da ETE

e na região posterior ao tratamento que ocorre na ETE.

4.4 Reagentes e solventes

Os solventes utilizados no processo de extração foram: metanol (grau HPLC) e água

ultrapura. Para descontaminação e limpeza da vidraria foram utilizados ácido nítrico

(10%).

4.5 Equipamentos

Os equipamentos utilizados para realização da análise do 17β-estradiol foi um

cromatógrafo líquido, modelo 1200 (Agilent Technologies®), com bomba quaternária,

injetor automático, degaseificador e detertor com arranjo de diodos (DAD). Além

desses equipamentos, foram utilizados:

Coluna Kromasil 100-5C18,5µm x 4,6 mm x 250 mm;

Coluna de guardar Karomasil® 100-5C 18;

Workstation (Agilent ChemStation versão B.03.02, 17 de janeiro de 2008);

Balança analítica HA – 202 M, AND Company;

Bomba de vácuo Primar;

Câmara de vácuo, Visiprep DNTM

, Supelco;

29

Cartucho C18 OHASIS HLB, 6cc, Waters Corporation com capacidade de 4

mL;

Banho de Ultra som Bandelin Sonorex RK510S;

Frasco de vidro âmbar de diferentes volumes;

Micropipeta de 200, 1000 e 10000 µL;

Balões volumétricos de 10 mL;

Béquer;

Proveta;

Pipeta volumétrica;

Balão volumétrico;

Tubo de ensaio.

4.6 Preparo do padrão de 17 beta-estradiol e das amostras

A solução padrão estoque de 17β-estradiol (97%, m/m) foi preparada em metanol grau

CLAE na concentração de 100μg L-1

e estocada em frasco âmbar a uma temperatura de

-18°C. A partir desta, foi preparada uma nova solução na concentração de 50μg L-1.

Para preparo das amostras de água foi utilizado o método de extração em fase sólida

com parâmetros ajustados de acordo com a metodologia solicitada.

30

Figura 4.6 – Preparação do padrão e das amostras de 17 beta-estradiol

Fonte: (Próprio autor).

4.7 Análises cromatográficas

As análises cromatográficas, adaptada por Verbinnen (2010), foram realizadas em

cromatógrafo a líquido da Agilent Technologies (HPLC 1290) equipado com detector de

arranjo diodos (CLAE-DAD) operando no comprimento de onda de 230nm e

autoinjetor com alça de amostragem de 20μL. A coluna analítica de C18 (Kinetex) com

15cm comprimento x 0,32mm diâmetro interno x 5μm tamanho da partícula foi mantida

a 40ºC e fase móvel constituída por metanol grau CLAE em modo isocrático com fluxo

de 1mL min-1

, e não por gradiente, uma vez que neste bombeamento a composição da

fase móvel é mantida constante durante toda a análise cromatográfica, com a utilização

de apenas uma bomba.

4.8 Padrão analítico

O padrão analítico utilizado foi o 17β–E2. As soluções estoque deste padrão foram

obtidas a partir da diluição de 10mg do padrão em 10mL de metanol, para obtenção da

concentração de 100μg L-1

. O grau de pureza do padrão foi de 97% m/m, o hormônio

possui origem química natural e fórmula molecular C18H24O2.

4.9 Coleta e armazenamento das amostras

As coletas foram realizadas durante o mês de agosto de 2015, totalizando 12 amostras.

Foram coletadas amostras de água da nascente do Rio Vieira (Ponto 1; no perímetro

urbano em um local anterior a ETE, onde já sofreu todas as interferências antrópicas

possíveis (Ponto 2) e na região posterior à área da ETE da cidade de Montes Claros,

MG (Ponto 3), como mostra a Figura 4.9.

31

Figura 4.9 Percurso do rio na cidade de Montes Claros e localização dos pontos de

coleta das três amostras.

Fonte: Adaptado (LIMA et al,. 2012)

Quatro frascos de 500 mililitros foram coletados para cada amostra, foram utilizados

frascos âmbar previamente descontaminados, identificados, acondicionados em isopor

com gelo para serem transportados até o laboratório e armazenados em geladeira a 4ºC,

para posterior extração e análise. A Figura 4.9.1 ilustra a situação dos pontos no dia da

coleta das amostras no Rio Vieira.

P3 P2 P1

32

Figura 4.9.1 Os três pontos de coleta de água do Rio Vieira.


As amostras foram coletadas em três pontos do Rio Vieria (P1; P2 e P3), em cada ponto

foram retiradas quatro amostras (A; B; C e D) em diferentes alturas com a ajuda da

garrafa de Van Dorn como na Figura 4.6.

Figura 4.9.2 Garrafa de Van Dorn utilizada para recolher amostras de água do Rio

Vieira.


4.10 Procedimento de extração das amostras de água

O método foi adaptado da metodologia desenvolvida por Alda e Barcelò (2001), para

extração do hormônio 17β-E2 em amostras de água bruta. A concentração e a

purificação das amostras de água foram realizadas por extração em fase sólida (SPE). O

procedimento de extração foi realizado conforme etapas que se seguem:

Condicionou-se os cartuchos HLB C18 500mg (OASIS, Waters Corporation®) com 4

ml de metanol com fluxo de 1,5mL min-1

, na sequência passou-se 4mL de água

ultrapura. Para isto foi utilizada uma câmara de vácuo conforme Figura 4.7;

Para extração, as amostras foram homogeneizadas em ultrassom por 5 segundos e 200

ml foram filtrados em filtro de fibra de vidro 0,45μm. Em seguida, as amostras foram

transferidas para um recipiente limpo de vidro envolto em papel alumínio e, na

sequência, as mesmas foram adicionadas em cartucho C18, com fluxo de 1,5mL min-1

;

Os cartuchos foram lavados duas vezes com 4 ml de água ultrapura, posteriormente,

descartou-se a água de lavagem e os mesmos foram secos sob vácuo, por 30 min;

33

Procedeu-se a eluição dos analitos, utilizando 8 ml de metanol grau HPLC;

Transferiu-se o eluato para frasco âmbar, secou-se totalmente em banho maria (40ºC),

com fluxo de gás N2. Ressuspendeu-se em 4 mL de solução preparada com 49% de

metanol e 51% água ultrapura;

Injetou-se 20μL do extrato por injeção manual, em injetor com loop de 20μL.

Figura 4.10 Sistema a vácuo Supelco Visiprep.


34

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Validade do método analítico

A validação do método proposto foi obtida por meio da avaliação dos parâmetros de

seletividade, linearidade, precisão, repetibilidade e exatidão.

5.1.1 Seletividade

A seletividade do método cromatográfico foi avaliada pela observação da ausência de

picos na região do tempo de retenção do analito de interesse, que é de 1,75 min. Para

tanto, injetou-se amostras do branco com água ultrapura , sem fortificação e do branco

fortificado, com o hormônio, obtido com água ultrapura.

Para a comparação do espectro do pico obtido na separação com o de um padrão, como

uma indicação da presença do composto puro, utilizou-se um detector com arranjo de

diodos.

O nível de contaminação e interferência presente na amostra no branco foi interior a

30% do limite de quantificação (GARP, 1999), portanto, o método cromatográfico

empregado foi considerado seletivo.

5.1.2 Linearidade

A linearidade foi avaliada pela resposta obtida em função da concentração do analito, a

qual foi estudada em um intervalo de concentração que variou de 0,5 a 4,0μg L-1

. A

linearidade foi determinada pelo coeficiente de correlação (r2), na qual se denotou o

valor de 0,9979, obtido pelo gráfico relacionando a resposta do equipamento em função

de 5 concentrações do analito que está apresentado na Figura 4, assim como Wang

et.al.(2008). Para estimar os coeficientes das curvas analíticas, utilizou-se o método da

regressão linear.

35

Figura 5 – Curva de calibração do 17β-estradiol obtida pela injeção de 5 pontos.

A determinação da linearidade das curvas analíticas foi feita a partir de padrões

analíticos preparados em solvente, nas concentrações de 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 e 4,0 μgL-1

,

injetadas em triplicata. Após as injeções foram calculados a média das áreas, a

estimativa do desvio padrão relativo (DPR), ou coeficiente de variação (CV), a

estimativa do desvio padrão (s) e a equação da regressão linear da curva analítica para o

hormônio.

5.1.3 Precisão

A avaliação da repetitividade do método cromatográfico, uma mesma amostra do

padrão 1,0 μg L-1

foi injetada sete vezes pelo mesmo operador no mesmo dia. A média,

o desvio padrão e o desvio padrão relativo das medidas do tempo de retenção e da altura

dos picos obtidos do hormônio 17β-estradiol, e são apresentados na Tabela 5.1.3.

Tabela 5.1.3 - Repetitividade do método cromatográfico para a determinação do 17 β-estradiol.

Parâmetro Tempo de retenção (min) Altura (mAu)

Média 52,9 1,93 Desvio Padrão 8,44 0,21 Desvio Padrão

Relativo 1,81 10,88

A precisão do método foi avaliada repetindo-se três vezes a extração seguindo o método

apropriado e as amostras foram fortificadas em três níveis de concentração (1,0, 2,0 e

36

3,0 μgL-1

) e injetadas em triplicata. E assim, calculou-se o desvio padrão (s) e o

coeficiente de variação (CV) ou desvio padrão relativo (RSD) dos hormônios (Tabela

___).

Tabela__- Porcentagem de recuperação média (%), valores de (s) e coeficiente de variação (CV%), aos

níveis de 1,0, 2,0 e 3,0 μgL-1

para o 17β-estradiol analisados por HPLC-DAD.

Fármaco

Concentração

(μgL-1)

Recuperação

média (%)*

Desvio

Padrão (s)

Coeficiente de

variação médio

(CV%)*

17β-

estradiol 2,0 97,87 17,06 6,14

A recuperação média obtida é de 97,87%, o qual está dentro do intervalo aceitável

admitido pelo GARP (1999), de 70 a 120%, com precisão de até ± 20%.

5.1.4 Exatidão

A exatidão do método foi avaliada por meio de ensaios de recuperação e pela

comparação de métodos.

5.2. Análises cromatográficas

Na Figura 5.2 é apresentado o cromatograma da solução padrão de 17β-estradiol a 50μg

L-1

em metanol, apresentando tempo de retenção de 1,75min.

Figura 5.2: Cromatograma da solução padrão de 17β-estradiol a 50μg L-1

em metanol.

37

Na Figura 5.2.1 é apresentado um cromatograma de comparação entre a injeção do

padrão de 50 e 100μg L-1

confirmando o tempo de retenção do 17β-estradiol.

Figura 5.2.1: Cromatogramas da solução padrão de 17β-estradiol a 50μg L-1

(linha azul)

e 100 μg L-1

(linha verde) em metanol.

5.3 Resultados das análises

Nas Figuras 5.3, 5.4, 5.5 e 5.6 são apresentados os cromatogramas de cada amostra

correspondendo aos pontos de coleta de amostra de água.



(linha azul).

38



(linha azul).



(linha azul).

39

Figura 5.6: Cromatograma da amostra P1D em metanol (linha verde) solução padrão de


(linha azul).

As amostras identificadas como P1 foram recolhidas em diferentes alturas na principal

nascente do Rio Vieira, localizada a 11 km da cidade de Montes Claros. É uma região

com pouca atividade antrópica e nenhuma característica de interferência de animais de

médio e grande porte. O local é preservado, sem poluição e fica entre dois paredões de

pedras, o que dificulta o acesso de animais e automóveis. A água é de bom aspecto,

translúcida e inodora.

A seguir estão representados os cromatogramas (Figuras (5.7, 5.8, 5.9 e 5.10)) das

amostras identificadas como P2 (ponto imediatamente anterior a ETE).



(linha azul).

40



(linha azul).



(linha azul).



(linha azul).

As amostras identificadas como P2 foram retiradas em diferentes alturas de um ponto

imediatamente anterior a ETE de Montes Claros, onde a cor é escura, com odor

41

desagradável, e com aspecto poluído e degradado. O local é de difícil acesso contendo

água residuária de toda a cidade, uma vez que o rio corta a cidade de ponta a ponta e o

local de captação de água para o tratamento na ETE se encontra do final da cidade.

A seguir encontram-se os cromatogramas (Figuras: 5.11, 5.12, 5.13 e 5.14) das amostras

indentificadas como P3 (retiradas de ponto posterior a ETE).

Figura 5.11: Cromatograma da amostra P3A em metanol (linha verde) solução padrão


(linha azul).

Figura 5.12: Cromatograma da amostra P3B em metanol (linha verde) solução padrão


(linha azul).

42

Figura 5.13: Cromatograma da amostra P3C em metanol (linha verde) solução padrão


(linha azul).



(linha azul).

As amostras identificadas como P3 foram retiradas de diferentes alturas de um ponto

imediatamente posterior a ETE da cidade de Montes Claros. Nesse ponto, a água é de

aspecto poluído, escura, sem odor ruim, mas com muita espuma branca, resultado do

detergente que não é degradado e da alta velocidade com que a água sai da ETE. No

entorno do P3 não há a presença de casas ou de alguma atividade humana, mas existem

algumas aves e animais macroscópicos no seu entorno. Além disso, as coletas foram

realizadas em um período de seca e de racionamento de água na região, o que causou

menor vazão do Rio Vieira e, consequentemente, um maior tempo de detenção das

águas poluídas desse rio.

43

Em todos os pontos onde ocorreram a captação das amostras não foram encontrados o

hormônio 17β-estradiol. No momento em que o padrão do hormônio foi submetido a

detecção pelo aparelho de cromatografia (HPLC) os picos foram identificados e

representados nos gráficos das páginas anteriores, mas durante a análise das amostras

por esse mesmo aparelho nenhum píco do hormônio foi encontrado.

Os dejetos e secreções de homens e mulheres em ambientes urbanos se fazem com a

utilização de águas tratadas pelas empresas responsáveis e são adicionados, entre outros

compostos, o cloro que segundo Pereira et al., (2011) é amplamente utilizado como

desinfetante e, por sua característica oxidante, pode remover compostos orgânicos ou

converter compostos tóxicos em não tóxicos.

No trabalho de Westerhoff et al., (2005), alcançou-se uma eficiência de remoção

próxima a 100% com tempo de contato de 24 h, dose de cloro de 3,5 a 3,8 mg.L-1

e

concentração inicial de E2 de 10 – 250ng.L-1

. No estudo de Alum et al., (2004), chegou-

se a uma remoção de 99% de E2 com 1mg.L-1

de cloro e tempo de contato de 15

minutos, com uma concentração inicial elevada e limite de detecção do equipamento de

313ng.L-1

. Nakamura et al., (2007), após a oxidação com cloro de 1mg.L-1

e tempo de

contato de 15 minutos, chegaram a uma remoção de 70% para o estrona (E1). Portanto,

doses de cloro entre 1 e 4mg.L-1

têm se mostrado eficiente para a remoção de compostos

estrogênicos. Contudo, a cloração de compostos estrogênicos se mostra dependente do

tempo de contato, alcançando eficiências elevadas de remoção depois de elevados

tempos de contato (ALUM et al., 2004; WESTERHOFF et al., 2005; NAKAMURA et

al., 2007; PEREIRA et al., 2012).

Dessa forma, o aperfeiçoamento e validação das condições cromatográficas e do método

para a determinação do hormônio 17β-estradiol em amostras de água utilizando a

cromatografia em fase líquida de alta eficiência ocorreu efetivamente, mas não foi

possível: a quantificação da concentração do hormônio 17β-estradiol existente nas

águas do Rio Vieira; a analise da interferência antrópica influencia no aumento da

quantidade do 17β-estradiol no Rio Vieira e nem a verificação da eficiência da estação

44

de tratamento de esgoto (ETE) da cidade de Montes Claros, em Minas Gerais, na

remoção do17β-estradiol.

46

6. CONCLUSÃO

Por comparação do tempo de retenção entre o cromatograma do padrão de 17β-estradiol

e das 12 amostras de água analisadas não foi detectada a presença deste analito nas

amostras.

A portaria número 2.914, de dezembro de 2011, do Ministério da Saúde estabelece que

o valor máximo permitido (VMP) de cloro livre em águas urbanas para abastecimento é

de 5mg/L em cada ponto de escoamento urbano. Em Montes Claros a Copasa, que é a

empresa responsável pelo tratamento e abastecimento de esgoto obedece a essa portaria.

A fotodegradação do hormônio 17β-estradiol é um fator importante e que deve ocorrer

ao logo do Rio Vieira, pois esse rio é quase todo aberto e exposto aos raios solares, com

pouca cobertura vegetal em seu arredor, o que acarreta uma grande incidência solar.

Outro fator preponderante que pode ter causado a não detecção desse hormônio foi a

biodegradação ou a sorção, por que se trata de um rio urbano poluído, que sofre as ações

antrópicas e sanitárias de toda a população da cidade de Montes Claros.

Dessa forma, pode-se perceber que há fatores importantes e relevantes que indicam a

remoção ou degradação o 17beta-estradiol ao longo do Rio Vieira, como: cloração;

fotodegradação; biodegradação e sorção.

As análises foram feitas seguindo a metodologia proposta e o padrão foi detectado com

eficiência através do HPLC, o que comprova a eficácia da pesquisa na detecção desse

composto.

47

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Realizar avaliação mais aprofundada das causas dos efeitos deletérios sobre o hormônio

17beta-estradiol e quais interações podem existir.

Utilizar a metodologia desenvolvida para recursos hídricos poluídos em áreas rurais

onde não há a presença de cloro.

48

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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