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Fabiana da Silva Lima
Modulação da glutamina sobre a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) em macrófagos peritoniais em um
modelo murínico de desnutrição protéica
Dissertação para obtenção do grau de
MESTRE
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock
São Paulo 2011
Fabiana da Silva Lima
Modulação da glutamina sobre a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-ҡB) em macrófagos peritoniais em um modelo murínico de desnutrição protéica
Comissão Julgadora da
Dissertação para obtenção do grau de Mestre
Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock Orientador/Presidente
_____________________________________
1o Examinador
________________________________
2o Examinador
São Paulo,______ de 2011.
Ao meu Pai Cicero: trabalhador, inteligente e guerreiro. Ensinou-me a lutar e a viver com dignidade.
Ao meu marido Moises: meu anjo protetor, amigo e companheiro. Por acreditar em mim e estar
sempre ao meu lado: todo meu amor.
Ao Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock: Orientador é a palavra que melhor lhe define: não só esteve sempre presente, mas caminhou junto, trabalhando com dedicação e entusiasmo. A você toda minha gratidão,
admiração e respeito.
AGRADECIMENTOS
A Daisy M.C. Santos, amiga e companheira, sempre ao meu lado. Aos amigos do
Hospital Universitário e a todos aqueles que sempre torceram por mim, obrigada.
Aos amigos do laboratório de Hematologia Clínica, em especial a Luciana Simão
Carmo, Mayara Caldas Ramos, Alexandra Siqueira Melo, Graziela Batista da Silva, e
Jackeline Soares.
A Profa. Dra. Primavera Borelli, exemplo de dedicação ao ensino e a pesquisa, a
você toda minha admiração, respeito e carinho.
Ao Prof. Dr. Marcelo Macedo Rogero, do Departamento de Nutrição da Faculdade
de Saúde Pública, pela contribuição na realização desse trabalho.
A técnica de laboratório Mariana Ferreira pelo auxílio prestado.
Aos estagiários de iniciação científica, em especial a Mayara Cortez, todo meu
carinho e amizade.
Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, e a todo o pessoal da
secretaria da pós-graduação, pelo trabalho realizado.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro
para a realização desta pesquisa.
A todos aqueles não citados aqui, mas que de alguma forma contribuíram para
realização desse trabalho. Muito obrigada.
“De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando,
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza que seremos interrompidos antes de terminar.
Portanto devemos:
Fazer da interrupção, um caminho novo...
Da queda, um passo de dança,
Do medo uma escada,
Do sonho uma ponte...
Da procura, um encontro”
Fernando Sabino
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS ................................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... xi
RESUMO.................................................................................................................................. xii
ABSTRACT ............................................................................................................................ xiv
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .................................................................................. 16
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 18
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 18
3. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 19
3.1 DESNUTRIÇÃO PROTÉICA E PROTÉICO – ENERGÉTICA ................................. 19
3.2 MACRÓFAGOS ............................................................................................................ 23
3.3 ATIVAÇÃO CELULAR MEDIADA POR LPS ........................................................... 24
3.4 GLUTAMINA ................................................................................................................ 28
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 30
4.1 ANIMAIS ....................................................................................................................... 30
4.2 RAÇÕES ........................................................................................................................ 31
4.3 INDUÇÃO À DESNUTRIÇÃO .................................................................................... 31
4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................ 32
4.6 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA DAS RAÇÕES ......................... 33
4.7 OBTENÇÃO DE SANGUE TOTAL E SORO .............................................................. 33
4.8 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS, ALBUMINA, PRÉ-ALBUMINA,
GLUTAMINA SÉRICA, CORTICOSTERONA E HEMOGRAMA. ................................. 33
4.9 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS E
IMUNOFENOTIPAGEM .................................................................................................... 34
4.10 CULTURA DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS............................ 35
4.11 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE TRAF-6, IKK, IҠB-α E IҠB-α
FOSFORILADO, NF-ҠB E NF-ҠB FOSFORILADO ....................................................... 36
4.11.1 SDS-PAGE e “Western blotting ............................................................................ 36
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 38
5. RESULTADOS .................................................................................................................... 39
5.1 AVALIAÇÃO DO CONSUMO DE ÁGUA, PROTEÍNAS, RAÇÃO E VARIAÇÃO
DO PESO CORPÓREO ....................................................................................................... 39
5.2 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE PROTEÍNAS TOTAIS,
ALBUMINA E PRÉ-ALBUMINA ...................................................................................... 40
5.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLUTAMINA PLASMÁTICA .............. 41
5.4 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA ............................ 41
5.5 HEMOGRAMA.............................................................................................................. 42
5.5.1. Eritrograma ............................................................................................................. 42
5.5.2. Leucograma ............................................................................................................ 43
5.6 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DA MEDULA OSSEA........................................... 44
5.7 LAVADO PERITONIAL ............................................................................................... 45
5.8 ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (ENSAIOS EX VIVO) .......................................... 46
5.9 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE TNF- E IL-1α ..................................... 49
5.10 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE IL-10 .................................................... 50
5.11 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE TRAF-6 ............................................. 51
5.12 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE IKK .................................................. 52
5.13 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE IҠB- TOTAL E IҠB- FOSFORILADO ... 52 5.14 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NF-ҠB TOTAL E NF-ҠB FOSFORILADO 54
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 56
7. CONCLUSÃO......................................................................................................................61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 62
ANEXO A : CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ................ 72
ix
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
AP-1: Ativador da proteína-1
BCG: Bacilo Calmette-Guérin
CARS: Síndrome da resposta antiinflamatória compensatória
CD14: Marcador mielomonocítico, receptor de lipopolissacarídeo
CD71: Marcador monocítico. Receptor de transferrina
CD86: Marcador monocítico/co-ativador.
DPE: Desnutrição Protéico - Energética
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
EDTA: Ácido Etilenodiaminotetracético
ELISA: Enzima Linked Immuno Sorbent Assay
FAO: Organização das Nações Unidas para Agricultura e alimentação
GSH: Glutationa (forma reduzida)
GM-CSF: Fator estimulador de colônia grânulo-monocítica
GTP: Guanosina Trifosfato
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IL-1: Interleucina 1
IL-6: Interleucina 6
IL-8: Interleucina 8
IL-10: Interleucina 10
IL-12: Interleucina 12
IRAK: Serina-treonina proteína quinase
IҡB: Inibidor kappa B
IKK: I kappa B quinase
LBP: Lipoproteína ligadora do lipopolissacarídeo
x
LPS: Lipopolissacarídeo
LPS-LPB: Complexo lipoproteína ligadora do lipopolissacarídeo
LPS-CD14: Complexo lipopolissacarídeo /Marcador mielomonocítico
MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno
MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade
mCD14: CD14 ligado a membrana
MyD88: Fator diferenciador mieloide 88
NAD+ : Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NaCl: Cloreto de sódio
NF-ҡB: Fator de transcrição nuclear kappa B
PAMP: Padrão molecular associado ao patógeno
PBS: Phosphate buffered saline
PMSF: Phenylmethanesulfonyl fluoride
pIҡB-α: Inibidor kappa B alfa fosforilado
pNF-Ҡb: Fator de transcrição nuclear kappa B fosforilado
RNA: Ácido ribonucléico
SDS: Sodium dodecyl sulfate
sCD14: CD14 solúvel
SIRS: Síndrome da resposta inflamatória sistêmica
TBS: Tris buffered saline
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
TLR: Receptor toll-like
TLR-4: Receptor toll-like 4
TRAF-6: Fator 6 associado ao receptor de TNF
WHO: World Health Organization
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. REPRESENTAÇÃO DA ATIVAÇÃO DO FATOR NUCLEAR KAPPA B (NF-
ҠB) ATIVADO PELO LIPOPOLISSACARÍDEO ................................................ 26
FIGURA 2. METABOLISMO DA GLUTAMINA EM MACRÓFAGOS ............................ 29
FIGURA 3. COMPOSIÇÃO DAS RAÇÕES .......................................................................... 31
FIGURA 4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................... 32
FIGURA 5. CONSUMO DE ÁGUA, PROTEÍNAS, RAÇÃO E VARIAÇÃO DO PESO
CORPÓREO ..................................................................................................................... 39
FIGURA 6. PROTEÍNAS TOTAIS, ALBUMINA E PRÉ-ALBUMINA ............................... 40
FIGURA 7. CONCENTRAÇÃO DE GLUTAMINA PLASMÁTICA ................................... 41
FIGURA 8. CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA .................................................. 42
FIGURA 9. ERITROGRAMA ................................................................................................. 42
FIGURA 10. LEUCOGRAMA ................................................................................................ 43
FIGURA 11. MIELOGRAMA ................................................................................................. 44
FIGURA 12. LAVADO PERITONIAL ................................................................................... 45
FIGURA13. ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA DA POPULAÇÃO DE CÉLULAS
PERITONIAIS.................................................................................................................. 46
FIGURA 14. ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (CD14, F4/80)............................................47
FIGURA 15. ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (TLR-4/MD-2)............................................48
FIGURA 16. EXPRESSÃO DE TNF-ALFA E INTERLEUCINA - 1 .................................... 49
FIGURA 17. AVALIAÇÃO DA INTERLEUCINA-10 .......................................................... 50
FIGURA 18. EXPRESSÃO TOTAL DE TRAF-6 .................................................................. 51
FIGURA 19. EXPRESSÃO TOTAL DE IKK ......................................................................... 52
FIGURA 20. EXPRESSÃO DE IKB ALFA TOTAL E FOSFORILADO .............................. 53
FIGURA 21. EXPRESSÃO DE NFKB TOTAL E FOSFORILADO ..................................... 54
xii
RESUMO
LIMA, F.S. Modulação da glutamina sobre a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) em macrófagos peritoniais em um modelo murínico de desnutrição protéica. Dissertação [Mestrado] – Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.72p.
Os mecanismos exatos que comprometem o sistema imune em estados de
desnutrição ainda não estão totalmente esclarecidos, sendo que a desnutrição
modifica a funcionalidade das células efetoras da resposta inflamatória/infecciosa,
ocasionando menor síntese de citocinas pró-inflamatórias, além de ocasionar
alterações da hemopoese. Macrófagos apresentam papel chave tanto na resposta
imune inata quanto adaptativa, e apresentam alta taxa de utilização do aminoácido
glutamina, que é fundamental para o fornecimento de energia e nitrogênio. Nesse
contexto, verifica-se que o metabolismo da glutamina em macrófagos desempenha
um papel importante para a síntese de citocinas, sendo que a síntese de diversas
citocinas é dependente da concentração extracelular de glutamina. Dada a
importância desse aminoácido no organismo e que sob condições de estresse sua
manutenção encontra-se prejudicada e diante do fato de que macrófagos utilizam
altas taxas desse aminoácido para seu funcionamento propusemo-nos a estudar
alguns aspectos da influência desse aminácido sobre células macrofágicas em
situação de desnutrição protéica. Camundongos BALB/c, machos, submetidos à
desnutrição protéica, após perda de aproximadamente 20% do peso corpóreo, foram
eutanasiados. Hemograma, mielograma, e análise das concentrações séricas de
glutamina, proteínas totais, albumina e pré-albumina séricas foram realizadas.
Células macrofágicas coletadas da cavidade peritonial foram cultivadas, in vitro, com
glutamina, em diferentes concentrações, e a capacidade de produção de TNF-, IL-1
e IL-10, bem como a expressão de moléculas envolvidas na ativação da via do fator
de transcrição NF-ҡB, foram quantificadas. Animais desnutridos apresentaram
diminuição da concentração de glutamina plasmática e aumento do corticosterona
circulante. Anemia, leucopenia e severa redução na celularidade da medula óssea
com comprometimento do setor mielóide foram evidenciadas nos animais
desnutridos, bem como diminuição da celularidade da cavidade peritonial com
redução da população de células macrofágicas. Os resultados demonstram que a
glutamina apresenta um efeito dose dependente na ativação de macrófagos
peritoniais cultivados in vitro e estimulados com LPS por 30 minutos, mostrando-se
xiii
capaz de induzir a uma menor produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-
e IL-1, e ao mesmo tempo aumentar a produção de IL-10, modulando negativamente
a via de sinalização do fator de transcrição NF-ҡB, principal via para indução de
genes da resposta inflamatória e imune, sendo essa modulação mais evidente nos
animais desnutridos. Baseando-se nestes resultados, discutimos o papel do estado
nutricional modificando a resposta do organismo frente a um estímulo inflamatório e
o papel da glutamina, in vitro, em modular esse processo.
Palavras-Chave: Desnutrição, Glutamina, Macrófagos, Citocinas, NF-ҡB.
xiv
ABSTRACT
Lima, F.S. Modulation of glutamine on the signaling pathway of nuclear factor kappa B (NF-ҡB) in peritoneal macrophages in a mouse model of protein malnutrition. 72.Dissertação [Mestrado] – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2011.
The exact mechanisms that commits the immune system in condition of malnutrition
are still not fully understood, being that malnutrition modifies the functionality of
effector cells in inflammatory/infectious response, leading a reduced synthesis of pro-
inflammatory cytokines besides causing changes in hematopoiesis. Macrophages
play an essential role on the innate and adaptive immune response, and have high
utilization rate of the amino acid glutamine, which is essential for the supply of energy
and nitrogen. In this context, it appears that the glutamine metabolism in
macrophages is essential for the synthesis of cytokines and synthesis of several
cytokines are dependent of the extracellular glutamine concentration. Given the
importance of this amino acid in the body and knowing that in stress conditions
situations its maintenance is impaired and besides that macrophages use high levels
of this amino acid to function, we proposed to investigate some aspects of the
influence of this amino acid on macrophages in a situation of protein malnutrition.
BALB/c male, subjected to protein malnutrition, after attained about 20% loss of their
original body weight were sacrificed. Hemogram, myelogram, and analysis of serum
concentrations of glutamine, protein, albumin and prealbumin were evaluated.
Macrophages collected from peritoneal cavity were cultivated, in vitro, with glutamine,
at different concentrations and the TNF-α, IL-1 and IL-10 capacity of production, as
well as the expression of molecules involved in the transcription factor NF-ҡB
activation were evaluated. Malnourished animals showed lower plasma glutamine
and increase of corticosterone levels. Anemia, leucopenia and severe reduction of
cellularity of bone marrow with myeloid impaired, as well as reduction of the
peritoneal cavity cellularity with reduced macrophages population were observed in
malnourished animals. Data showed that glutamine has a dose dependent effect on
peritoneal macrophages activation in vitro when stimulated with LPS for 30 minutes,
being able to induce a decrease of pro-inflammatory cytokines production as TNF-α
and IL-1, while at same time an increase of IL-10 production, modulating negatively
the signaling pathway transcription factor NF-ҡB activation which is the main pathway
xv
to induce genes of the inflammatory and immune response, and this modulation was
more pronounced in malnourished animals. Based on these results, we discuss the
role of nutritional status modifying immune response face to inflammatory stimulus
and the role of glutamine in vitro in modulating this process.
Keywords: Malnutrition, Glutamine, Macrophages, Cytokine, NF-ҡB.
16
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A desnutrição protéica e protéico-energética (DPE) é o tipo mais frequente de
desnutrição, estimando-se que mais de 30% da humanidade sofrem de algum grau
de desnutrição, sendo mais encontrada em crianças e idosos, pacientes portadores
de neoplasias, doenças crônicas ou sob quimioterapia (WAITZBERG et al., 1999;
MARCOS, 2000; WHO, 2000; GADDUCCI et al., 2001; AKNER;CEDERHOLM, 2001;
NOVA et al., 2002; KEUSCH, 2003).
O binômio desnutrição-infecção pode ser visto sob dois aspectos: a desnutrição
alterando os mecanismos de defesa do indivíduo e a infecção agravando o estado
carencial previamente instalado ou ainda, a doença desencadeando-o (BEISEL,
1984; KEUSCH et al., 1986; POWANDA;BEISEL, 2003; SCRIMSHAW, 2003).
Nessas condições a desnutrição pode facilitar a invasão do agente, favorecer sua
proliferação no organismo, facilitar infecções secundárias e modificar o curso e a
evolução da enfermidade (LAMUS, 1975; BRUNDTLAND, 2000).
Dados da literatura e do nosso grupo evidenciam que a desnutrição
compromete órgãos linfo-hemopoéticos e modifica a resposta imune. Nossos
trabalhos demonstram alterações estruturais e ultra-estruturais da medula óssea,
baço e timo; alterações funcionais como redução da migração celular, do
espraiamento, fagocitose, atividade bactericida e fungicida bem como alterações na
produção de espécies reativas do oxigênio (CHANDRA, 1991; KEUSCH, 1994;
BORELLI et al., 1995; NARDINELLI;BORELLI, 2001; BRIASSOULIS et al., 2001;
VITURI et al., 2001) e nitrogênio (FOCK et al., 2003). Nossos dados também
revelam que macrófagos de animais desnutridos apresentam menor capacidade em
sintetizar citocinas pró-inflamatórias como TNF-, IL-1, IL-1 e IL-6 quando
estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) (FOCK et al., 2007).
Macrófagos apresentam papel chave tanto na resposta imune específica
quanto adquirida, e apresentam alta taxa de utilização do aminoácido glutamina, que
é fundamental para o fornecimento de energia e nitrogênio (NEWSHOLME et al.,
2001). A ativação de macrófagos in vitro por LPS acarreta em aumento da síntese
de RNA mensageiro, a qual é mantida pelo aminoácido glutamina, que atua como
precursor de bases nitrogenadas. O aumento do processo de transcrição de
citocinas por macrófagos permite a modulação das respostas imune e inflamatória.
Nesse contexto, verifica-se que o metabolismo da glutamina em macrófagos é
17
essencial para a síntese do Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e de
interleucinas (ILs), como IL-1, IL-6 e IL-8, sendo a síntese dessas citocinas
dependente da concentração extracelular de glutamina (NISHIYAMA;CURI, 2000).
Todavia, os mecanismos moleculares de ação da glutamina em macrófagos
ativados, decorrente de processos infecciosos e inflamatórios, não estão
completamente elucidados.
Uma vez que, animais desnutridos apresentam alterações funcionais em
macrófagos, e que para essas células a concentração extracelular do aminoácido
glutamina é essencial para síntese de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α,
investigamos a participação da glutamina na via de sinalização do fator nuclear
Kappa-B (NF-ҡB) (principal via da resposta inflamatória e imune), e a concentração
do Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Inteleucina 1, in vitro, em macrófagos
peritoniais de camundongos desnutridos suplementados in vitro previamente com L-
glutamina em diferentes concentrações e estimulados posteriormente com LPS
(Lipopolissacarideo).
18
2. OBJETIVOS
Sabendo-se que animais desnutridos apresentam hipoplasia severa de órgãos
linfo-hemopoéticos e alterações funcionais das células efetoras da resposta
inflamatória/infecciosa, e que o metabolismo da glutamina em macrófagos é
essencial para a síntese de diversas citocinas, nos propusemos a avaliar, neste
trabalho, o efeito da glutamina sobre a via de sinalização do fator de transcrição
NFҡB em macrófagos peritoniais, estimulados com LPS, obtidos de camundongos
submetidos à desnutrição protéica.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Como objetivos específicos propusemos avaliar:
Parâmetros bioquímicos indicativos do estado nutricional: concentração
de proteínas totais, albumina e pré-albumina;
A concentração plasmática de glutamina e corticosterona;
Hemograma, mielograma e contagem da celularidade peritoneal;
Análise por citometria de fluxo da porcentagem de células
macrofágicas na cavidade peritoneal;
Os efeitos da suplementação com L-glutamina, in vitro, em diferentes
concentrações, sobre a capacidade de macrófagos peritoniais em sintetizar
TNF-, IL-1 e IL-10 quando estimulados com LPS;
A expressão da molécula TRAF-6 e IKK em macrófagos peritoniais
estimulados in vitro com LPS e suplementados em diferentes concentrações
de glutamina;
A expressão do IҡB total e da porção fosforilada em macrófagos
peritoniais estimulados in vitro com LPS e suplementados em diferentes
concentrações de glutamina;
A expressão total do fator de transcrição NFҡB e da porção fosforilada
em macrófagos peritoniais estimulados in vitro com LPS e suplementados em
diferentes concentrações de glutamina.
19
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 DESNUTRIÇÃO PROTÉICA E PROTÉICO – ENERGÉTICA
A desnutrição protéico-energética (DPE) é definida pela Organização Mundial
da Saúde como "condição (ões) patológica(s) que provém da menor ingestão, em
várias proporções, de proteínas e calorias‖ (de ONIS et al., 1993).
A desnutrição pode ter origem na deficiência ou ausência de qualquer nutriente,
sendo que sua instalação e gravidade dependem da causa, intensidade e duração
da carência (STINNETT, 1983).
Clinicamente, a desnutrição é caracterizada pela ingestão inadequada ou
mesmo pela ingestão de um excesso de nutrientes de forma desbalanceada. Os
indivíduos desnutridos apresentam-se incapazes de utilizar totalmente os alimentos
que consomem, ou ainda, indivíduos que consomem excesso de calorias, sendo que
a dieta desbalanceada não fornece nutrientes adequados para o crescimento e
manutenção do organismo (WHO, 2000).
Enquanto nos países em desenvolvimento a principal causa de DPE é primária
e atinge principalmente lactantes e crianças, nos países industrializados a DPE
geralmente é secundária, estando associada a outras doenças, acometendo tanto
crianças como adultos (BARON, 1997).
Quanto à etiologia, a desnutrição apresenta causas multifatoriais, podendo ser
classificada em:
Primária: ocorre pela ingestão de uma dieta inadequada devido à
indisponibilidade em várias proporções de alimentos. Abrange
principalmente países em desenvolvimento e em regiões como Pacífico,
Sudeste da Ásia e África Subsaariana. É também consequência direta
dos maiores índices de pobreza nesses países e de zonas de
guerras/conflitos em algumas regiões (SHETTY, 2006).
Secundária: atinge tanto países desenvolvidos como aqueles em
desenvolvimento. Acometem principalmente indivíduos hospitalizados
por períodos prolongados, aqueles que necessitam de dieta
enteral/parenteral, portadores de doenças crônicas e inflamatórias, que
sofrem de neoplasias e aqueles que realizam quimioterapia (STINNETT,
1983; SHETTY, 2006).
20
Em países como Alemanha, França, Reino Unido e Estados Unidos os índices
de prevalência da desnutrição aguda nos últimos dez anos em crianças
hospitalizadas variou de 6 para 14%, enquanto que na Turquia, um índice de até
40% têm sido descrito (JOOSTEN;HULST, 2010).
Por ano, 10,8 milhões de crianças com menos de cinco anos morrem de
causas que envolvem direta ou indiretamente a desnutrição. Associada a doenças
infecciosas, a desnutrição leva a uma indisposição grave por parte da comunidade,
diminuindo a qualidade de vida, fazendo com que se perpetue o ciclo desnutrição-
infecção-doença e pobreza (SCHAIBLE;KAUFMANN, 2007; KATONA;KATONA-
APTE, 2008).
De acordo com a FAO (2010), a maior parte da população desnutrida vive em
países em desenvolvimento. A principal causa da fome e consequente desnutrição
é a pobreza. Um total de aproximadamente 925 milhões de pessoas sofreu fome em
2010 comparados ao ano anterior que atingiu aproximadamente 1,020 bilhão. Na
Ásia e no Pacífico é estimado que 578 milhões de pessoas sofram de fome crônica,
239 milhões passam fome na África Subsaariana, 53 milhões na América Latina e
Caribe, 37 milhões no Oriente Médio e África do Norte e 19 milhões em países
desenvolvidos.
No Brasil, o índice de desnutrição é irregular. Em 2003, no Norte e Nordeste
urbano e rural os índices de desnutrição variaram entre 36,2 a 48,3%. No Sul,
Sudeste e Centro-Oeste esses índices foram menores (17%, 18,3% e 22,3%
respectivamente). Dados mostraram que 6,6% das crianças com até cinco anos de
idade que vivia no Semi-Árido, uma das áreas mais pobres do país, sofriam de
desnutrição crônica (déficit de altura) (MONTEIRO, 2003). Porém, o quadro nacional
está modificando gradualmente.
De acordo com Monteiro et al., (2009), houve um declínio substancial da
desnutrição infantil no Brasil, sendo que os fatores responsáveis por esse declínio
seria a melhoria da distribuição de renda, redução da pobreza, consequência da
reativação do crescimento econômico e diminuição do desemprego, reajustes do
salário mínimo e expansão da cobertura dos programas de transferência de renda.
Essa evolução do declínio da desnutrição no Brasil entre 1996-2007 indica que a
meta do milênio das Nações Unidas relativa à desnutrição infantil de 6% (redução à
metade no período de 1990-2015) poderá ser alcançada pelo Brasil.
21
Segundo a Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) nacional 2008-2009, o
déficit de altura nos primeiros anos de vida (principal indicador da desnutrição
infantil) tem apresentado os menores índices da última década, mas ainda atinge
intensamente a região norte do Brasil (IBGE, 2010).
As manifestações clínicas da DPE dependem do grau e severidade da
deficiência protéico-calórica, da causa e duração da deficiência, bem como da idade
do indivíduo e da associação ou não com outras doenças. Desta forma, a
desnutrição compreende uma gama de síndromes clínicas. As formas clínicas
características com manifestações mais severas são o Kwashiorkor e o Marasmus
(De ANGELIS, 1986; SHETTY, 2006).
Em 1933, a médica Dra. Cicely Williams, na Costa do Ouro (Colônia da África
Ocidental), descreveu uma síndrome bem definida chamada Kwashiorkor. É uma
palavra do dialeto africano que significa ―doença do segundo filho‖ ou ―doença do
desmame‖, pois ocorre quando há de se desmamar o primeiro filho para amamentar
o segundo. Esses indivíduos apresentavam edema, principalmente das mãos e dos
pés, irritabilidade, diarréia, descamação das áreas da pele chegando a ulcerações.
Consiste numa desnutrição essencialmente protéica, desencadeada pela ingestão
protéica em quantidades insuficientes e também devido a uma alimentação
desbalanceada. Os acometidos por Kwashiorkor apresentam atraso no crescimento,
alterações psicomotoras e fraqueza muscular. Tende a ser limitado em algumas
partes do mundo como a África Subsaariana, Pacífico e Sudeste da Ásia (De
ANGELIS, 1986; SHETTY, 2006).
O Marasmus é uma forma clínica que consiste em severa alteração no
crescimento, com intensa atrofia muscular, raramente apresenta edema e
dermatoses, porém a perda de gordura subcutânea e da camada muscular é muito
aparente, dando aquele aspecto de ―pele enrrugada‖. É definido pela diminuição no
consumo tanto de proteínas como de calorias, ou seja, uma desnutrição protéico-
energética (De ANGELIS, 1986; AUGUSTO, 1995; SHETTY, 2006).
Tanto Kwashiorkor quanto Marasmus podem cursar com retardo no
crescimento, alterações psicomotoras e alterações morfológicas e funcionais
acentuadas em diversos órgãos como coração, pulmões, músculo esquelético, perda
da elasticidade da pele, sistema gastrintestinal, hepatobiliares, rins e sistemas
endócrino e imunológico como, por exemplo, supressão da medula óssea (De
ANGELIS, 1986; AUGUSTO, 1995; SHETTY, 2006;). Outros quadros intermediários
22
podem surgir pela combinação dos mais variados graus de privação protéica com
diversos graus de deficiência calórica total.
O comprometimento dos orgãos linfo-hematopoéticos na desnutrição está
diretamente associado com a modificação da resposta imune que se traduz por
maior suscetibilidade a infecções (GROSS;NEWBERNE, 1980; TOMKINS, 1986;
VICTORIA;HERNANDEZ, 1990; SCRIMSCHAW, 2003).
A atrofia linfóide é uma das características mais severas da desnutrição. O
tamanho e o peso do timo estão reduzidos. Instala-se uma deficiência intensa de
linfócitos T, aumentando a susceptibilidade a patógenos, infecções virais e
oportunistas (CHANDRA, 1997; CUNNINGHAM-RUNDLES et al., 2005;
SCHAIBLE;KAUFMANN, 2007). A associação desnutrição-infecção é responsável
pelos altos índices de morbidade e mortalidade principalmente entre crianças,
adolescentes e idosos (BEISEL, 1977; VICTORIA;HERNANDEZ, 1990).
A desnutrição também acarreta diversas alterações hematológicas
quantitativas, como anemia e leucopenia (MARTINS et al., 1971; De ANGELIS,
1986; LEE;HERBERT, 1999).
Trabalhos anteriores em nosso laboratório sobre desnutrição protéica e
protéico-energética demonstram que a anemia instalada em animais desnutridos, é
uma anemia decorrente da redução do número de precursores eritróides e que são
hiporesponsivas à eritropoetina (BORELLI et al., 2007). A desnutrição acarreta
alterações na medula óssea que levam a diminuição da população celular,
resultando em anemia, diminuição de reticulócitos e leucopenia (BORELLI et al.,
2009).
Outras alterações hematológicas quantitativas, também evidenciadas na
desnutrição, como leucopenia, linfocitopenia e neutropenia são um reflexo do
comprometimento dos órgãos linfo-hemopoéticos, particularmente do microambiente
hemopoético (GARCIA, 1992; BORELLI et al., 1995; AUGUSTO, 1995; BARON,
1997; XAVIER et al., 2007). Na desnutrição há uma aparente dificuldade da resposta
leucocitária em processos infecciosos, que pode ocorrer, em parte, devido a uma
redução no compartimento de reserva da medula óssea (BORELLI;BLATT, 2004),
com consequente alteração no processo de mobilização dos leucócitos do sangue
para os tecidos (BORELLI et al., 1995, LANDGRAF et al., 2007), além de alterações
dos mecanismos funcionais de resposta celular (BORELLI et al., 1995; NARDINELLI
;BORELLI, 2001; VITURI et al., 2001; FOCK et al., 2003).
23
1METCHNIKOFF, E.Lectures on the comparative pathology of inflammation. London, 1893.
3.2 MACRÓFAGOS
Em 1892 os estudos de Metchnikoff e colaboradores demonstraram a
importância das células fagocitárias, descrevendo o princípio da imunidade celular
gerada através do processo de fagocitose por macrófagos (METCHNIKOFF1, 1893
apud JENKIN;ROWLEY, 1963).
As células mononucleares originam-se na medula óssea e os monoblastos são
os precursores mais imaturos derivados da célula progenitora pluripotente que se
diferencia em promonócito e monócito. Os monócitos circulam pelo sangue periférico
e migram através dos vasos sanguíneos para os vários órgãos e sistemas teciduais,
onde se transformam em macrófagos, que constitui uma fase mais avançada na vida
da célula mononuclear fagocitária (VAN FURTH et al., 1972; 1979).
Macrófagos são caracterizados pela sua alta atividade endocítica e também
pela elevada capacidade de secretar grande número de compostos, incluindo
enzimas, proteínas plasmáticas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio,
prostaglandinas e citocinas, o que reforça o papel dessas células em iniciar e regular
as respostas imune e inflamatória (YASSAD et al., 1997; GREENBERG;
GRINSTEIN, 2002).
Os macrófagos desempenham um importante papel como célula apresentadora
de antígeno. Os antígenos insolúveis fagocitados e os antígenos solúveis
pinocitados são ingeridos e degradados enzimaticamente em pequenos fragmentos,
os quais são ligados com moléculas de classe II do MHC, sendo transportados para
a superfície externa da membrana plasmática, o que permite que estes fragmentos
sejam apresentados para linfócitos T (YASSAD et al., 1997; GREENBERG;
GRINSTEIN, 2002).
Os macrófagos são geralmente subclassificados de acordo com o seu estado
de ativação em residentes, inflamatórios ou células ativadas (COHN, 1978). Os
macrófagos residentes representam células teciduais que não foram expostas a
substâncias estranhas, apresentando baixa atividade funcional, como, por exemplo,
baixas taxas de secreção de proteinases ou síntese de espécies reativas de
oxigênio. Os macrófagos inflamatórios representam aqueles que receberam um
estímulo inflamatório não microbicida. Possui muita semelhança com o macrófago
ativado já que há um aumento do espraiamento, fagocitose, membrana plasmática
24
mais proeminente, mas não há um aumento acentuado na produção de espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio. Porém macrófagos que demonstram elevadas
taxas de síntese de espécies reativas de oxigênio (O2
- e H2O2) e nitrogênio,
aumento da atividade antimicrobiana e da capacidade tumoricida, difusão mais
rápida sobre a superfície de vidro, membrana plasmática mais proeminente,
aumento do tamanho celular e do conteúdo de lisossomos e maior taxa de
fagocitose, são denominados macrófagos ativados (COHN, 1978).
Estudos do nosso grupo têm demonstrado que a desnutrição parece modificar
a produção e a mobilização de células sanguíneas e o ―burst‖ respiratório (BORELLI
et al., 1995; NARDINELLI;BORELLI, 2001).
Além disso, a desnutrição parece acarretar alterações funcionais em
macrófagos, como redução da migração celular, do espraiamento, fagocitose,
atividade bactericida e fungicida bem como alterações na produção de espécies
reativas do oxigênio e nitrogênio (CHANDRA, 1991; KEUSCH, 1994; BORELLI et
al.,1995; NARDINELLI;BORELLI, 2001; BRIASSOULIS et al., 2001; VITURI et al.,
2001; FOCK et al., 2003). Dados do nosso grupo também revelam que macrófagos
oriundos de animais desnutridos apresentam menor capacidade em sintetizar
citocinas pró-inflamatórias como TNF-, IL-1, IL-1 e IL-6 quando estimulados com
lipopolissacarídeo (LPS) (FOCK et al., 2007).
3.3 ATIVAÇÃO CELULAR MEDIADA POR LPS
O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente da parede de bactérias gram-
negativa e está relacionada ao choque tóxico. Quando o LPS é liberado, por
exemplo, quando a bactéria sofre autólise da parede celular, o LPS é liberado
causando diversos efeitos fisiopatológicos, estimulando a produção de citocinas. As
principais células afetadas pelo LPS são monócitos e macrófagos, que produzem
citocinas pró-inflamatórias, entre elas IL-1, IL-6 e TNF-, que atuam como
mediadores da reposta inflamatória (OPAL;ESMON, 2003; BEUTLER; RIETSCHEL,
2003).
O sistema imune inato possui estratégias para o reconhecimento de
microorganismos. Uma estratégia é o reconhecimento do padrão molecular
filogeneticamente conservado associado ao patógeno (pathogen-associated
25
molecular patterns - PAMP). Receptores tipo Toll like (TLR) desempenham um
importante papel no reconhecimento de diversos padrões moleculares associados à
patógeno (MEDZHITOV, 2006; VANDEWALLE, 2008).
Células como macrófagos possuem receptores de superfície chamados de
CD14. O CD14 é uma molécula que está presente na maioria das células e pode
apresentar-se como CD14 solúvel (sCD14) ou ligado à membrana (mCD14)
(TOBIAS et al.,1999).
Para que ocorra a ativação celular é preciso que haja ligação do LPS a célula
pela ligação do complexo LPS-LBP (Proteína Ligante de LPS) ao CD14, onde o LBP
dissocia-se e o complexo LPS-CD14 associa-se com o receptor do tipo TLR4. O
sCD14 possui afinidade pelo LPS-LBP circulante (ZIEGLER-HEITBROCK;
ULEVITCH, 1993; LANDMANN et al., 2000; BEUTLER, 2003). Segundo Detmers et
al.,(1996), a internalização do LPS pode ser necessária, sendo considerado um fator
importante para a ativação celular.
O TLR4 necessita de uma molécula adicional conhecida como MD-2,
necessária para a ativação celular. Essa molécula forma um complexo com o
domínio extracelular do TLR4 (SHIMAZU et al., 1999; AKASHI et al., 2000;
TRIANTAFILOU;TRIANTAFILOU, 2002).
Quando o complexo TLR4 é ativado ocorre uma série de eventos.
Inicialmente há a associação de uma proteína chamada MyD88 que recruta
membros da família quinase associada ao receptor de IL-1: serina-treonina proteína
quinase do receptor de IL-1 (IRAK4 e IRAK1), que são fosforilados associando-se a
proteína TRAF-6 (fator de necrose tumoral associado ao fator 6).
O TRAF-6 ativa quinases da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), as
quais podem promover a ativação do ativador da proteína-1 (AP-1) por meio da
MAPK (figura 1.) (BEUTLER;RIETSCHEL, 2003; BEUTLER, 2004; KAWAI;AKIRA,
2005).
No citoplasma de células não estimuladas, o fator de transcrição denominado
fator nuclear-ҡB (NF-ҡB) — que se apresenta na forma de dímero — encontra-se na
forma inativa devido a sua associação com proteínas denominadas inibidores κB
(IκB). A família de proteínas IҡB inclui IҡBα, IҡBβ, IҡBε, Bcl-3, e as regiões carboxi-
terminal do NF-ҡB1 (p105), NF-ҡB2 (p100). As proteínas IҡB ligam-se, com diferentes
afinidades e especificidades, para diferentes dímeros do NF-ҡB. Portanto, além da
existência de diferentes dímeros de NF-ҡB em um tipo celular específico, há também
26
grande número de combinações entre o IҡB e os dímeros do NF-ҡB
(CAAMAÑO;HUNTER, 2002; LI; VERMA, 2002).
O TRAF-6 promove a ativação por fosforilação do complexo IҡB quinases (IKK).
Esse complexo é composto de duas subunidades catalíticas IKKα e IKKβ e uma
subunidade regulatória IKKγ e induz a fosforilação do IҡB (BEUTLER, 2004; KAWAI;
AKIRA, 2005).
A fosforilação dos IҡB resulta na sua poliubiquitinação, a qual, por sua vez,
acarreta sua degradação mediada pelo proteossoma 26S, o que permite, desse
modo, que o fator de transcrição NF-ҡB transloque para o interior do núcleo celular e
ative a transcrição de diversos genes dependentes desse fator, como genes de
citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1 e IL-6 (figura 1) (BEUTLER, 2004;
KAWAI;AKIRA, 2005).
O NF-ҡB também promove a estimulação da síntese do IҡB, uma vez que a
região promotora do gene que codifica para o IҡB contém sítios funcionais para o
NF-ҡB. Desse modo, o IҡB recém-sintetizado liga-se ao NF-ҡB e suprime a sua
atividade (HATADA et al., 2000; MAGNANI et al., 2000; DOBROVOLSKAIA;VOGEL,
2002; FUJIHARA et al., 2003; KAWAI;AKIRA, 2005).
Figura 1. Representação da
ativação do fator nuclear B (NF-
B) ativado pelo lipopolissacarídeo (LPS). (Adaptado de MIYAKE, 2003).
27
Vários estímulos levam à fosforilação do IҡB, que é fundamental para sua
degradação. A proteína IҡB fosforilada recebe a adição de ubiquitina, pela ação da
ubiquitina ligase, sendo em seguida degradada pelo complexo proteossoma 26S.
Isso resulta na liberação do NF-ҡB. Tanto o IҡB como o IҡB ligam-se ao p50,
tornando a sequência localizadora do núcleo inacessível, impedindo sua
translocação (GHOSH et al.,1998).
O desmembramento do complexo IҡB/ NF-ҡB permite o transporte do NF-ҡB
para o núcleo, com consequente ligação desse nos genes que apresentam a
sequência regulatória GGGACTTTCC junto à região promotora, levando a um
aumento na expressão do gene alvo. A fosforilação do IҡB ocorre pela ação de
proteínas quinases específicas, como o complexo IҡB quinase (IKK), que contém
duas subunidades com propriedades de quinase: IKK e IKK (também
denominadas IKK1 e IKK2, respectivamente) (CAAMANO; HUNTER, 2002; LI;
VERMA, 2002).
O complexo IKK é capaz de discernir entre o IҡB complexado e o IҡB livre,
explicando o fato do IҡB poder acumular-se nas células onde o IKK permanece
ativado (ZANDI et al.,1997). Vale lembrar que muitas proteínas quinase estão
envolvidas nesse processo de fosforilação e que esse mecanismo não está
totalmente elucidado.
Dessa forma o LPS estimula a síntese de citocinas, induzindo a ativação de
vários fatores de transcrição como o NF-ҡB, entre outros como AP-1 e o STAT, os
quais ativam ou reprimem os genes alvo. Estes fatores podem também intensificar e
perpetuar a expressão de citocinas, visto que as regiões promotoras de muitas
citocinas e seus genes de receptores revelam numerosos sítios reguladores para
estes fatores de transcrição. Desde que as citocinas não atuam sozinhas, sendo
produzidas e liberadas em rede bem coordenada, os níveis relativos destes fatores
de transcrição podem ser responsáveis pela ação inflamatória e antiinflamatória
prolongada das citocinas e seus ativadores (CAAMANO;HUNTER, 2002; LI;
VERMA, 2002; BILLACK, 2006).
28
3.4 GLUTAMINA
Aminoácidos são requeridos para a síntese de uma variedade de proteínas e
possuem importante papel na resposta imune. Uma dieta adequada de todos os
aminoácidos é necessária para a manutenção do sistema imune e prevenção de
doenças e infecções. Quando a demanda de aminoácidos é insuficiente o impacto é
negativo sobre a imunidade (LI et al., 2007).
A glutamina é um aminoácido não essencial, sendo sintetizada principalmente
pelo músculo esquelético. Entretanto, segundo Newsholme et al.,(2001), em
determinadas condições a glutamina torna-se ―condicionalmente essencial‖ como em
traumas, cirurgias e septicemia. A glutamina é essencial para função de células
como neutrófilos, linfócitos e macrófagos, possui diversas funções no organismo na
biossíntese de nucleotídeos, detoxificação de amônia, síntese de glutationa,
manutenção do equilíbrio ácido-base e transferência de nitrogênio entre os órgãos
(NEWSHOLME et al., 2001).
Segundo Frisina et al.,(1994) e Rowbottom et al.,(1995), a taxa de utilização de
glutamina por macrófagos é similar ou superior à de glicose. Contudo, apenas
pequena parte dos carbonos da molécula de glicose (<10%) e do aminoácido
glutamina (5-25%) são completamente oxidados por macrófagos em meio de cultura.
Sendo assim, a maioria das moléculas de glicose é convertida em lactato (glicólise),
enquanto grande parte da glutamina é convertida em glutamato, aspartato e lactato
(glutaminólise) (figura 2) (NEWSHOLME et al.,1999).
Os processos de glicólise e glutaminólise fornecem intermediários
metabólicos para vias biossintéticas de macromoléculas. A glicólise fornece glicose-
6-fosfato para a formação de ribose-5-fosfato, a qual é precursora da síntese de
DNA e RNA e glicerol-3-fosfato para a síntese de fosfolipídios. Paralelamente, a
glutaminólise fornece amônia e aspartato para a síntese de purinas e pirimidinas,
que são necessárias para a formação de DNA e RNA. Glutamina também fornece
nitrogênio para a formação de glicosamina, GTP e NAD+ (NEWSHOLME et al., 1987;
NEWSHOLME et al., 2001).
29
Figura 2. Metabolismo da glutamina em macrófagos. Enzimas estão indicadas
como: 1. glutaminase; 2. aspartato aminotransferase; 3. enzimas da metade esquerda do ciclo de Krebs; 4. malato desidrogenase NAD-dependente; 5. enzima málica 6. fosfoenolpiruvato carboxiquinase; 7. piruvato quinase; 8. lactato desidrogenase; (modificado de CALDER, 1995).
Macrófagos são células caracterizadas por alta taxa de secreção de proteínas,
que depende do aumento da síntese de RNAm, a qual utiliza purinas, pirimidinas e
ribose-5-fosfato. Isto caracteriza papel relevante da glutamina na manutenção de
elevadas taxas de transcrição (NEWSHOLME et al., 1996). De acordo com essa
hipótese, alguns estudos têm investigado a relação entre secreção de TNF-, IL-1 e
IL-6 – que são citocinas quantitativamente relevantes sintetizadas por macrófagos –
e a concentração extracelular de glutamina, desde que macrófagos podem ser
totalmente dependentes da concentração extracelular de glutamina para atingirem
uma atividade secretória ótima (MURPHY;NEWSHOLME, 1999). Segundo
NEWSHOLME et al., (1999), macrófagos peritoniais de camundongos ativados com
BCG e incubados em meio de cultura na presença de 2 mM de glutamina
apresentam a capacidade de sintetizarem TNF- em altas taxas quando estimulados
por LPS. Além disso, WALLACE;KEAST (1992) e YASSAD et al., (1997)
demonstraram, respectivamente, que o aumento da secreção de IL-1 e IL-6 por
macrófagos estimulados por LPS foi dependente da concentração de glutamina
extracelular.
extracelular
glutamina
glutamato
1
oxaloacetato
aspartato
alfacetoglutarato
malato
piruvato
lactato
fosfoenolpiruvato
2
3
4
5
6
7
8
NH3
30
Rogero et al., (2008), também observaram que animais desmamados
prematuramente e suplementados com glutamina apresentaram aumento na função
de macrófagos e na hemopoese quando estimulados com BCG. Li et al., (2007),
também relata que a glutamina é o maior combustível para as células do sistema
imune, atuando na proliferação de linfócitos T, na síntese de proteína, produção de
citocinas e inibição da apoptose.
Entretanto, a literatura apresenta divergências em relação à capacidade da
glutamina em melhorar a resposta imune e aumentar a produção de citocinas pró-
inflamatórias. Segundo Engel et al., (2009), um estudo realizado com pacientes
submetidos à cirurgia cardíaca demonstrou que a produção de IL-6, IL-8 e TNF-,
não foi influenciada pela normalização dos níveis de glutamina após trauma
cirúrgico. Hubert-Buron et al., (2006), avaliaram os efeitos do pré-tratamento com
glutamina nas células epiteliais do intestino humano na ubiquitinação do IҡB-α e
verificaram que a glutamina diminui a produção de IL-1, IL-6, e IL-8, e aumenta a
produção de IL-10 na mucosa duodenal de humanos. Também demonstraram que a
ativação de NF-ҡB,está diminuída nas células epiteliais do intestino. De acordo com
Singleton;Wischmeyer (2008), a glutamina tem apresentado efeito antiinflamatório
em modelo experimental de sepse. Este efeito tem sido associado com a diminuição
da ativação do NF-ҡB.
Os mecanismos responsáveis pela habilidade da glutamina em regular a
resposta inflamatória e diminuir a ativação do NF-ҡB ainda não estão totalmente
esclarecidos. Assim, a divergência dos dados obtidos pode dever-se a diferenças
nos métodos utilizados (in vivo e in vitro), nas concentrações de glutamina, e nos
tipos celulares avaliados nesses estudos.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Para realização dos experimentos foram utilizados camundongos BALB/C, de
dois a três meses de idade, isogênicos, machos, provenientes do Biotério Central do
Conjunto das Químicas da Universidade de São Paulo.
Os animais foram submetidos, desde o nascimento, às mesmas condições
ambientais (temperatura ambiente entre 22-25C, ciclo de luz de 12 horas). Logo
31
após o desmame, os animais passaram a ser alimentados com ração Purina e
água ad libitum até o início do experimento.
Os animais foram pesados e distribuídos em gaiolas metabólicas (ZUCAS et
al., 1969), pesados a cada 48 horas durante o período de adaptação (BORELLI et
al., 1995), que foi definido pelo ganho e estabilidade do peso corpóreo.
4.2 RAÇÕES
A ração I controle, destinada aos animais nutridos contém 12% de proteína
(Tabela 1. Ração I controle), e a ração II hipoprotéica, destinada aos animais do
grupo desnutrido, contém 2% de proteína (Tabela 1. Ração II hipoprotéica). As
rações são isocalóricas, sendo diferente apenas o conteúdo protéico. A caseína foi
à fonte protéica das rações, sendo a concentração protéica da caseína e das rações
determinadas pelo método micro-Kjeldahl (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985). A
mistura salínica e vitamínica utilizadas foram às recomendadas por REEVES et al.,
(1993) (Tabela 1.). As rações foram produzidas em nosso laboratório na forma de
granulado e conservadas a -4C até o momento de uso.
Tabela 1: Composição das Rações
Constituintes Ração I Controle
Ração II Hipoprotéica
(g/kg ração)
Proteína 120 20 Mistura salínica
1 35 35
Mistura vitamínica1 10 10
Sacarose 100 100 Óleo Soja 40 40 Celulose 50 50 L-Cistina 1,8 0,257
Bitartarato de Colina 2,5 2,5 Tert-butilhidroquinona 0,008 0,008
Amido (q.s.p.) 100 100 Tabela 1.
1As misturas salínica e vitamínica foram preparadas
sob encomenda de acordo com as recomendações de 1993 do Instituto Americano de Nutrição para camundongos adultos (REEVES, 1993).
4.3 INDUÇÃO À DESNUTRIÇÃO
No período de adaptação de aproximadamente 3 semanas, os animais foram
32
colocados individualmente em gaiolas metabólicas e mantidos nas mesmas
condições de ciclo de luz de 12h (claro/escuro), onde foram alimentados com ração
Purina e água ad libitum até adaptação ao gaioleiro, estabilidade do peso corporal
e início do experimento.
Após o período de adaptação, os animais foram separados em dois grupos:
controle e desnutrido. Ao grupo controle (nutrido) foi administrado ração contendo
12% de proteína e ao grupo experimental (desnutrido) foi administrada uma dieta
com 2% de proteína. Em ambos os grupos, foi determinado a cada 48 horas o
consumo de ração, água e o peso corpóreo de cada animal. Quando houve perda de
aproximadamente 20 a 25 % do peso corporal do grupo desnutrido, os animais
foram sacrificados para obtenção das amostras biológicas.
4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Figura 3. Delineamento experimental.
1 Avaliação do consumo de água, peso e ração a cada 48
horas. 2 Coleta de material biológico para determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos.
Período de adaptação
BALB/c machos de 3 meses de idade
adaptação
Ração 12%
Proteína (Controle)
Período
Experimental
Ração 2% Proteína
(Desnutrido)
Eutanásia
Coleta de amostra
biológica2
5 semanas
1
Ciclo de luz 12 hs (claro/escuro)
22 – 25ºC
Coleta de Macrófagos
Peritoniais
33
4.5 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL DOS ANIMAIS
A avaliação do estado nutricional dos animais foi baseada no peso corpóreo, no
consumo diário das rações e no consumo total de proteína, hemograma, dosagem
de proteínas totais, albumina e pré-albumina sérica.
4.6 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA DAS RAÇÕES
A determinação da concentração protéica das rações foi realizada pelo método
de micro-Kjedahl (WARD, 1963) e realizada no laboratório de Nutrição Experimental
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP, sob responsabilidade do Profº Dr.
Júlio Tirapegui.
4.7 OBTENÇÃO DE SANGUE TOTAL E SORO
As amostras sanguíneas foram obtidas, a partir do plexo axilar com auxílio de
uma pipeta de transferência, em camundongos previamente anestesiados com
cloridrato de quetamina (50 mg/Kg de massa corporal) associado ao cloridrato de
xilazina (50 mg/Kg de massa corporal), por via intramuscular.
Amostras, sem anticoagulante, foram utilizadas para obtenção do soro, e
amostras utilizando-se EDTA 10%, como anticoagulante, para obtenção do sangue
total, o qual foi utilizado para a realização do hemograma. Amostras contendo
heparina como anticoagulante, na proporção de 40 µL de heparina (25000UI/5 mL)
para 1,0 mL de sangue foram utilizadas para dosagem de glutamina plasmática.
O soro foi separado por centrifugação (2000 x g por 10 minutos) a 4C e
utilizado para a dosagem das proteínas totais, albumina e pré-albumina séricas.
4.8 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS, ALBUMINA, PRÉ-
ALBUMINA, GLUTAMINA SÉRICA, CORTICOSTERONA E HEMOGRAMA.
A determinação de proteínas totais foi realizada pelo método do Biureto
(GORNALL et al.,1949) e a determinação de albumina realizada pelo método do
Verde de Bromo Cresol (DOUMAS, et al. 1971). As amostras foram processadas em
duplicata e a leitura realizada em espectrofotômetro automatizado COBAS MIRA
PLUS (ROCHE).
34
A pré-albumina foi avaliada pela determinação quantitativa em soro por técnica
automatizada de nefelometria utilizando-se reagentes comerciais N-ANTISORO pré-
albumina (Dade Behring®, Marburg, USA), seguindo-se a metodologia indicada pelo
fabricante.
A determinação de glutamina foi realizada segundo a metodologia descrita por
LUND (1985), que se baseia na conversão de NAD+ para NADH (cuja concentração
é medida pelo espectrofotômetro). Esta conversão é proporcional à quantidade de L-
glutamina inicial.
O Corticosterona foi avaliado pelo método de ELISA (Enzyme Linked
ImmnunoSorbent Assay ), kit Enzo Life Sciences.
Para a realização do hemograma as amostras foram coletadas como descrito
no item 4.7 (DACIE;LEWIS, 1995). O número de eritrócitos e de leucócitos foi
determinado pelo analisador automático de células sanguíneas ABC Vet (ABX
DIAGNOSTICS). Os valores relativos do número de leucócitos foram determinados
em extensões sanguíneas realizadas após a coleta do sangue e coradas pela
coloração de May Grunwald-Giensa, modificada (ROSENFELD, 1947).
4.9 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS E
IMUNOFENOTIPAGEM
Após exsanguinação dos animais, a cavidade peritonial foi lavada com 5 mL de
meio RPMI 1640 (Cultilab, Campinas, Brasil), pH 7,4, estéril, contendo 10% de
soro bovino fetal (Cultilab Campinas, Brasil). O líquido peritonial aspirado contém
as células, as quais foram contadas em hemocitômetros e cuja viabilidade celular foi
avaliada pelo teste de exclusão com o azul de tripan 0,1%.
Alíquotas de 106 células/mL de suspensão contendo as células do lavado
peritonial dos camundongos, controles e desnutridos, foram suspensas em meio
RPMI 1640 (Cultilab, Campinas, Brasil), pH 7,4, incubadas com 1g de anticorpos
monoclonais, durante 20 minutos sob agitação em temperatura ambiente. Após
este período os tubos foram centrifugados a 450 X g por 10 minutos, o
sobrenadante descartado e o sedimento celular lavado duas vezes com PBS azida
a 0,1%, sendo que após a última lavagem o sedimento foi ressuspenso com 500L
de paraformaldeído a 1% e submetido à analise por citometria de fluxo. Um total de
35
10.000 eventos foram adquiridos em citômetro de fluxo contendo laser de argônio
de 488nm e 15mW modelo FACS CALIBUR (Becton Dickinson) e as análises
realizadas empregando-se o programa Cell Quest Pro.
As células foram caracterizadas imunofenotipicamente pelos anticorpos F4/80,
CD14 e TLR-4/MD-2. Em todos os casos utilizaram-se os controles negativo de
cadeia conjugado ao respectivo fluorcromo.
4.10 CULTURA DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS
As células foram coletadas como descrito no item 4.9 e cultivadas em meio
RPMI 1640 com 10% de soro bovino fetal, suplementado ou não com 0,6, 2 e 10
mmol/L de glutamina. As células foram incubadas por 24 horas.
A escolha pela concentração de glutamina de 0,6 mmol/L durante o período de
cultura celular se deve ao fato dessa concentração corresponder àquela observada
no plasma de animais adultos saudáveis. A concentração 2 mmol/L é uma
concentração padrão em cultura de células e apesar desse valor estar acima das
concentrações de glutamina in vivo (0,6 mmol/L), experimentalmente 2 mmol/L
propiciaram melhores resultados em condições de incubação de células por
períodos prolongados (24–72 horas) (EAGLE et al.,1955). A concentração de 10
mmol/L — apesar de significativamente superior àquela utilizada em ensaios in vitro
com macrófagos — é devido ao fato de estudos, que utilizaram outros tipos
celulares, tais como enterócitos e células mononucleares do sangue periférico,
terem verificado efeitos opostos da glutamina sobre a expressão de genes que
codificam para citocinas quando a concentração desse aminoácido foi igual ou
superior a 2 mmol/L (WISCHMEYER et al., 2003; HUBERT-BURON et al., 2006).
As células foram inicialmente plaqueadas na concentração de 1x106
células/mL/poço em placas de cultura durante 2 horas a 37°C em atmosfera
contendo 5% de CO2. Após este período, o sobrenadante foi retirado a fim de
remover as células não aderentes e em seguida foi adicionado meio de cultura. As
amostras foram cultivadas por 24 horas com diferentes concentrações de glutamina
(0; 0,6; 2 e 10 mmol/L) em meio RPMI 1640, pH 7,4, estéril, apirogênico,
suplementado com soro fetal bovino (10%). Após 24 hs, as células foram incubadas
com 1,25 µg/mL de LPS de Eschericia coli, sorotipo 055:B5 (Sigma Chemical
Company, USA®), durante 30 minutos. Após esse período, o sobrenadante foi
36
retirado e armazenado em freezer a -40ºC, para determinação da concentração de
TNF- e IL-1α presente no sobrenadante das culturas celulares realizado pelo
método de ELISA (Enzyme Linked ImmnunoSorbent Assay) – kits R&D Systems.
As células aderentes foram lisadas por meio da adição em cada poço de
tampão RIPA (0,1 % SDS, 1 % Igepal CA-630, 1 % deoxicolato de sódio, 10 mM
Tris.HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 µg/mL aprotinina, 1 µg/mL leupeptina, 100 µg/mL
PMSF, 0,5 mM EDTA). A partir desse lisado celular foram realizados os ensaios de
determinação das proteínas TRAF-6, IҡB-α, IҡB-α fosforilado, IKK, NF-ҡB e NF-ҡB
fosforilado por Western Blot .
4.11 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE TRAF-6, IKK, IҠB-α E IҠB-α
FOSFORILADO, NF-ҠB E NF-ҠB FOSFORILADO
A expressão do TRAF-6, IKK, IKB-α total, IKB-α fosforilado, NF-B total e NF-B
fosforilado em células mononucleares peritoniais, mantidos sob cultura como descrito
no item 4.10, foi determinado pela técnica de Western Blotting.
4.11.1 SDS-PAGE e “Western blotting”
4.11.1.2 Preparo do gel de poliacrilamida
O procedimento foi realizado conforme protocolo de SAMBROOK et al., (1989),
e HARLOW;LANE (1988), descrito sucintamente a seguir.
Foram preparados géis em bicamada, sendo a camada superior (gel de
empacotamento) constituída de acrilamida a 5%, 125 mM Tris pH 6,8, 0,1% SDS,
0,1% persulfato de amônio e 0,1 % TEMED. O gel inferior (resolutivo) foi preparado
com 6 a 10 % de poliacrilamida, 380 mM Tris.HCl, pH 8,8, 0,1 % persulfato de
amônio e 0,077 % TEMED.
4.11.1.3 Preparo de lisado de proteínas para SDS-PAGE e “Western blotting”
Os lisados foram preparados a partir de 1x106 células em tampão RIPA (0,1 %
SDS, 1 % Igepal CA-630, 1 % deoxicolato de sódio, 10 mM Tris.HCL, pH 7,5, 150
mM NaCl, 2 µg/mL aprotinina, 1 µg/mL leupeptina, 100 µg/mL PMSF, 0,5 mM
37
EDTA). O material foi sonicado (30 segundos), centrifugado por 10 minutos, a
2000xg, e 4 °C. O sobrenadante foi quantificado e um volume correspondente a 200
µg foi misturado ao tampão de amostra (3 x concentrado, 100 mM Tris.HCL, pH 6,8,
5 % 2-mercaptoetanol (v/v), 2 % SDS, 20 % glicerol, 0,01 % azul de bromofenol),
fervido por 10 minutos e submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida. Foi
utilizado a mistura pré-corada BenchMark (GIBCO BRL, MD, EUA) (5-10 µg de
proteína).
4.11.1.4 Transferência de proteínas do gel para a membrana (nitrocelulose)
O gel contendo as proteínas fracionadas por eletroforese foi incubado por 10
minutos em tampão de transferência (3 mM glicina, 48 mM Tris base, 0,037
% SDS , 20 % metanol, pH 8,3). Paralelamente, a membrana de nitrocelulose foi
hidratada e então também incubada em tampão de transferência. Um "sanduíche"
foi então montado na seguinte ordem: 3 folhas de papel filtro, membrana, gel, 3
folhas de papel filtro. A transferência foi realizada em cuba de eletroforese, na
presença de tampão de transferência, sob corrente de 200-400 mA, por 30-90
min.
A eficiência da transferência foi verificada corando-se a membrana por 5-
10 minutos com corante Ponceau (1% Ponceau, 1 % ácido acético), seguida de
lavagem com água destilada ou TBS (Tris, pH 7,5, 20 mM, NaCI 0,9 %).
4.11.1.5 Reatividade dos anticorpos frente as proteínas
Os sítios sem proteínas das membranas foram bloqueados com proteínas de
leite desnatado Molico, a 5 %, em tampão TBS, por 12 horas, sob agitação. O
anticorpo específico (anti TRAF-6, anti IKK, anti IҡB- total, anti IҡB-
fosforilado, anti NF-ҠB total e anti NF-ҠB fosforilado) foi diluído em TBS com
0,05% Tween 20 (TBST) e utilizado para a incubação com as membranas, por
12 horas, sob agitação, à temperatura ambiente. A membrana foi lavada 3
vezes, por 10 minutos, com TBST. As proteínas foram então sondadas com
anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de raiz forte, diluído
1:5.000 em TBST, por 2 horas, sob agitação. A membrana foi lavada 3 vezes, por
10 minutos, sob agitação.
38
4.11.6 Revelação com sistema Quimioluminescente
A revelação foi realizada utilizando-se o Kit ECL Plus (luminol, fenol e peróxido
de hidrogênio), com exposição das membranas em filmes de raio X. Para análise foi
utilizado o digitalizador de Imagem ImageQuant 400 (GE Helthcare).
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram analisados utilizando-se o programa
GraphPadInstat Tm for Windows. Os dados foram primeiramente submetidos ao teste
de homocedasticidade da amostra e classificados em paramétricos ou não
paramétricos pela aderência à curva Normal (curva Gaussiana). Dados obtidos em
nossos experimentos foram submetidos à análise estatística do teste U e ANOVA e
considerados significativos quando o p 0,05.
39
5. RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO DO CONSUMO DE ÁGUA, PROTEÍNAS, RAÇÃO E
VARIAÇÃO DO PESO CORPÓREO
Verificamos que animais que receberam dieta hipoprotéica consumiram
quantidades semelhantes de ração em relação aos animais do grupo controle, mas
houve uma significativa redução na ingestão de proteínas, já que a dieta
hipoprotéica contém apenas 2% de proteína. Não houve diferença significativa no
consumo de água. Os animais do grupo desnutrido apresentaram uma perda de
peso significativa em relação ao peso inicial, quando comparados com o grupo
controle.
Consumo de água
Controle Desnutrido0
2
4
6
8
Grupos
(mL
/dia
/an
imal)
Consumo de proteínas
Controle Desnutrido0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
***
Grupos
(g/d
ia/a
nim
al)
Consumo de ração
Controle Desnutrido0
1
2
3
4
5
6
Grupos
(g/d
ia/a
nim
al)
Variação Peso Corpóreo
-30
-20
-10
0
10
*
Grupos
Controle Desnutrido
(%)
Gráfico 1. Resultado, em valores médios o desvio padrão do consumo de água,
proteínas, ração e variação do peso corpóreo. Os animais do grupo controle (n=27
animais) e desnutrido (n=27 animais) receberam, respectivamente, a ração I e a
ração II. * Valores significativos para p 0,05. *** Valores significativos para p
0,001. n representa o número de animais avaliados.
40
5.2 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE PROTEÍNAS TOTAIS,
ALBUMINA E PRÉ-ALBUMINA
Verificamos uma redução significativa nas concentrações de proteínas totais,
albumina e pré-albumina séricas nos animais desnutridos em relação ao grupo
controle, caracterizando o quadro de desnutrição.
Proteínas totais
Controle Desnutrido0
1
2
3
4
5
6
7
Grupos
*
(g/d
L)
Albumina
Controle Desnutrido0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
Grupos
(g/d
L)
Pré- albumina
Controle Desnutrido0
5
10
15
**
Grupos
(mg
/dL
)
Gráfico 2. Resultado, em valores médios o desvio padrão de proteínas totais,
albumina e pré-albumina dos animais do grupo controle e desnutrido. Os animais do
grupo controle (n=12 animais) e desnutrido (n=12 animais) receberam,
respectivamente, a ração I e a ração II. * Valores significativos para p 0,05. **
Valores significativos para p 0,01. n representa o número de animais avaliados.
41
5.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLUTAMINA PLASMÁTICA
Podemos observar que os animais do grupo desnutrido apresentaram uma
diminuição significativa dos níveis plasmáticos de glutamina (p 0,05) quando
comparado com animais do grupo controle.
Controle Desnutrido0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0*
Grupos
Glutamina
(mm
ol/
L)
Gráfico 3. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de
glutamina plasmática dos animais dos grupos controle (n=6) e desnutrido (n=6). *
p 0,05, quando comparamos ambos os grupos de animais. n representa o número
de animais avaliados.
5.4 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA
Podemos observar que os animais do grupo desnutrido apresentaram um
aumento significativo dos níveis plasmáticos de corticosterona (p 0,05) quando
comparado com animais do grupo controle.
42
Controle Desnutrido0
5
10
15
20
25 *
Corticosterona
Grupos
(ng
/mL
)
Gráfico 4. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de
glutamina plasmática dos animais dos grupos controle (n=10) e desnutrido (n=10).
* p 0,05, quando comparamos ambos os grupos de animais. n representa o número
de animais avaliados.
5.5 HEMOGRAMA
5.5.1. Eritrograma
Os animais do grupo desnutrido apresentaram valores significativamente
menores (p 0,05) do número de eritrócitos, volume hematócrito e concentração de
hemoglobina , em relação aos respectivos controles.
Controle Desnutrido0
5
10
15
*
Grupos
Nú
mero
de E
ritr
ócit
os
(x 1
06/m
m3)
Controle Desnutrido0
5
10
15*
Grupos
He
mo
glo
bin
a(g
/dL
)
Controle Desnutrido0
10
20
30
40
50
*
Grupos
He
ma
tóc
rito
(%)
Gráfico 5. Resultado, em valores médios o desvio padrão do número eritrócitos,
dosagem de hemoglobina, volume hematócrito dos animais dos grupos controle
(n=10) e desnutrido (n=10). * p 0,05, quando comparamos ambos os grupos de
animais. n representa o número de animais avaliados.
43
5.5.2. Leucograma
Os animais do grupo desnutrido, quanto ao número de leucócitos apresentaram
diferença estatísticamente significativa, em relação ao grupo controle. Podemos
observar que os animais do grupo desnutrido apresentaram leucopenia com
acentuada neutropenia em relação aos respectivos controles (Gráfico5).
Controle Desnutrido0
1000
2000
3000
4000
**
Grupos
Le
uc
óc
ito
s
(/m
m3)
Controle Desnutrido0
5
10
15
20
25
*
Grupos
Ne
utr
ófi
los
(%)
Controle Desnutrido0
200
400
600
800
***
Grupos
Ne
utr
ófi
los
(/m
m3)
Controle Desnutrido0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Grupos
Eo
sin
ófi
lo
(%)
Controle Desnutrido0
10
20
30
Grupos
Eo
sin
ófi
lo
(/m
m3)
Controle Desnutrido0.0
0.2
0.4
0.6
Grupos
Ba
só
filo
(%)
Controle Desnutrido0
5
10
15
20
Grupos
Ba
só
filo
(/m
m3)
Controle Desnutrido0
20
40
60
80
100 *
Grupos
Lin
fóc
ito
(%)
Controle Desnutrido0
500
1000
1500
2000
2500
**
Grupos
Lin
fóc
ito
(/m
m3)
Controle Desnutrido0
50
100
150
*
Grupos
Mo
nó
cit
o
(/m
m3)
Controle Desnutrido0
1
2
3
4
5
Grupos
Mo
nó
cit
o
(%
)
Controle Desnutrido0
200
400
600
800
Grupos
Pla
qu
eta
s
(x
10
3/m
m3)
Gráfico 6 . Resultado, em valores médios o desvio padrão do número de
leucócitos, do número de bastonetes, segmentados, linfócitos, monócitos e
eosinófilos presentes no sangue dos animais dos grupos controle (n=10) e
desnutrido (n=10). * p 0,05 quando comparamos ambos os grupos de animais, **
p 0,01 quando comparamos ambos os grupos de animais, *** p 0,001 quando
comparamos ambos os grupos de animais. n representa o número de animais
avaliados.
44
5.6 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DA MEDULA OSSEA
A análise do quadro hematológico medular dos animais desnutridos evidenciou
hipoplasia com significativa redução no número de células nucleadas blásticas e na
série granulocítica, além de significativa redução na série eritrocitária plasmocitária e
monocítica, porém não observamos diferenças significativas nas contagens de
linfócitos (Gráfico 7).
Controle Desnutrido0
2
4
6
8
10
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
06/m
L)
Número de células totais
**
Grupos
Controle Desnutrido0
2
4
6
8N
úm
ero
de
cé
lula
s
(x10
5/m
L)
Blastos
*
Grupos
Controle Desnutrido0
2
4
6
8
10
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x10
5/m
L)
Formas Jovens
*
Grupos
Controle Desnutrido0
5
10
15
20
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
Forma Anel
*
Grupos
Controle Desnutrido0
5
10
15
20
25
Segmentado
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
*
Grupos
Controle Desnutrido0
1
2
3
Eosinófilo
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L) *
Grupos
Controle Desnutrido0
10
20
30
Série Linfocitária
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
Grupos
Controle Desnutrido0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Plasmócitos
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
*
Grupos
Controle Desnutrido0
1
2
3
Linhagem Mono-Macrofágica
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
*
Grupos
Controle Desnutrido0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Eritroblastos Jovens
*
Grupos
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
Controle Desnutrido0
2
4
6
8
Eritroblastos Policromáticos
*
Grupos
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x1
05/m
L)
Controle Desnutrido0
2
4
6
8
Nú
me
ro d
e c
élu
las
(x10
5/m
L)
Eritroblastos Ortocromáticos
*
Grupos
Gráfico 7. Resultado, em valores médios o desvio padrão do número total de
células nucleadas e dos diferentes tipos celulares presentes na medula óssea de
camundongos do grupo controle (n=10) e desnutrido (n=10). * p 0,05, quando
45
comparamos ambos os grupos de animais. ** p 0,01 quando comparamos ambos
os grupos de animais, n representa o número de animais avaliados.
5.7 LAVADO PERITONIAL
O número total de células no lavado peritonial de animais desnutrido foi
estatisticamente menor quando comparado ao grupo controle. Os animais do grupo
desnutrido apresentaram também diminuição das células mononucleares e
polimorfonucleadas, em relação ao grupo controle (Gráfico 8).
Controle Desnutrido0
1
2
3
*
Grupos
Célu
las T
ota
is
(x 1
06/m
L)
Controle Desnutrido0
50
100
150
Grupos
Mo
no
nu
cle
are
s
(%)
Controle Desnutrido0
1
2
3
*
Grupos
Mo
no
nu
cle
are
s
(x 1
06/m
L)
Controle Desnutrido0.0
0.2
0.4
0.6
Grupos
Ma
stó
cit
os
(%)
Controle Desnutrido0.000
0.005
0.010
0.015
Grupos
Ma
stó
cit
os
(x 1
06/m
L)
Controle Desnutrido0
2
4
6
8
Grupos
Se
gm
en
tad
os
(%)
Controle Desnutrido0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
*
Grupos
Se
gm
en
tad
os
(x 1
06/m
L)
Gráfico 8 . Resultado, em valores médios o desvio padrão do número de células
totais, mononucleadas e polimorfonucleadas no lavado peritonial de camundongos
do grupo controle (n=10) e desnutrido (n=10). * p 0,05, quando comparamos
ambos os grupos de animais. n representa o número de animais avaliados.
46
5.8 ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (ENSAIOS EX VIVO)
O perfil das diferentes populações celulares não marcadas no lavado peritonial
de camundongos dos grupos desnutrido e controle, obtidos por citometria de fluxo,
encontram-se no gráfico 9. As letras (A) e (B) representam os respectivos controles
de cadeias isotípicas.
Gráfico 9. Representação gráfica do resultado da imunofenotipagem da população
total de células do lavado peritonial de camundongos do grupo controle e desnutrido,
sendo a aquisição de 104 células realizada em citômetro de fluxo contendo laser de
argônio 488nm, FACS Calibur – Becton Disckinson. A imunofenotipagem mostra as
regiões selecionadas – gate R1 e gate R2 - das populações celulares não marcadas
com fluorcromos. SSC na ordenada vs. FCS na abscissa. Dispersão lateral (side
scatter channel – SSC – ângulo reto de 90) e Dispersão frontal (foward scatter
channel – FSC – ângulos pequenos 0,5 a 1,0). O controle do isotipo corresponde (A)
FL2= IgG 1 rat PE vs.FL1= IgG 2b rat FITC e (B) FL2= IgG2a rat PE vs. FL1=
IgG 2b rat FITC. Resultado de um experimento representativo de três experimentos
independentes.
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
A
B
R1
R2
R1
R2
Controle DesnutridoF
L2
-He
igh
t
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
FL
2-H
eig
ht
100 101 102 103 104
FL1-Height
A
B
R1
R2
R1
R2
Controle Desnutrido
47
A imunofenotipagem demonstra no gráfico 10, que a população no gate R1 é
negativa para a dupla marcação CD14, F4/80 em ambos os grupos, porém
observamos a presença de populações marcadas para o CD14 e F4/80 (Gate R2),
nos ensaios ex vivo de células do lavado peritonial de camundongos do grupo
desnutrido e controle, sendo que os animais do grupo desnutrido apresentaram menor
intensidades de fluorescência (R2= 50,1 da região selecionada, gate 2) em relação
aos animais do grupo controle (R2= 61,1% da região selecionada, gate 2).
Gráfico 10. Representação gráfica da imunofenotipagem das populações celulares do
lavado peritonial de camundongos do grupo desnutrido e controle, sendo a aquisição
de 104 células realizada em citômetro de fluxo contendo laser de argônio 488nm,
FACS Calibur – Becton Disckinson. A partir da região selecionada os resultados do
CD14 e F4/80 foram expressos em ―dot plot‖: ordenada (SSC e abscissa (FSC)
mostrando a janela eletrônica (―gate‖ R1 e R2) referente a expressão de CD14 e
F4/80. * p 0,01, quando comparamos o grupo controle com o grupo desnutrido .
CD
14
Controle
F4/80
71,21%
6,33%3,70%
58,08%58,08%
R1
R2
0,8 ± 0,2 % 0,3 ± 0,1 %
61,1 ± 4,7 % * 50,1 ± 2,9 %
Desnutrido
CD
14
Controle
F4/80
71,21%
6,33%3,70%3,70%
58,08%58,08%
R1
R2
0,8 ± 0,2 % 0,3 ± 0,1 %
61,1 ± 4,7 % * 50,1 ± 2,9 %
Desnutrido
48
No gráfico 11 observamos que a intensidades de fluorescência para o TLR-
4/MD-2 e F4/80, foi menor nos animais do grupo desnutrido em relação aos animais
do grupo controle, sendo que a população do ―gate‖ R1 a marcação foi muito baixa
em ambos os grupos.
Gráfico 11. Representação gráfica da imunofenotipagem das populações celulares do
lavado peritonial de camundongos do grupo desnutrido e controle, sendo a aquisição
de 104 células realizada em citômetro de fluxo contendo laser de argônio 488nm,
FACS Calibur – Becton Disckinson. A partir da região selecionada os resultados do
TLR-4/MD-2 e F4/80 foram expressos em ―dot plot‖: ordenada (SSC e abscissa (FSC)
mostrando a janela eletrônica (―gate‖ R1 e R2) referente a expressão de TLR-4/MD-2
e F4/80. * p 0,01, quando comparamos o grupo controle com o grupo desnutrido.
3,70%0,5 ± 0,2 %0,8 ± 0,2 %
TL
R-4
/MD
-2
Controle Desnutrido
R1
R2
F4/80
9,3 ± 0,9%14,2 ± 0,5% *
3,70%0,5 ± 0,2 %0,8 ± 0,2 %
TL
R-4
/MD
-2
Controle Desnutrido
R1
R2
F4/80
9,3 ± 0,9%14,2 ± 0,5% *
49
5.9 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE TNF- E IL-1α
Nos resultados apresentados no gráfico 12 podemos observar que animais de
ambos os grupos apresentaram diminuição da capacidade de produção de TNF- e
IL-1 quanto maior a concentração de glutamina. Após 30 minutos de estímulo com
LPS, in vitro, nas culturas com células mononucleares peritoniais suplementadas
com 2 mmol/L e 10 mmol/L observamos menor capacidade de animais desnutridos
produzirem TNF-.
Gráfico 12. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de
TNF- e IL-1 α produzido por células macrofágicas de camundongos do grupo
controle (n=10) e desnutrido (n=10) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com
1,25 g de LPS e cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina.
* p 0,05 quando comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido. a
p 0,05 quando comparado o grupo controle 0 mmol/L glutamina com outros grupos
controle. b p 0,05 quando comparado o grupo desnutrido 0 mmol/L glutamina com
os demais grupos desnutridos.
TNF-
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0
200
400
600
800
1000
*a
*
a
(Glutamine mmo/L)
(pg
/mL
)
IL-1
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0
200
400
600 a
a a
b
bb b
(Glutamine mmo/L)
pg
/mL
TNF-
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0
200
400
600
800
1000
*a
*
a
(Glutamine mmo/L)
(pg
/mL
)
IL-1
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0
200
400
600 a
a a
b
bb b
(Glutamine mmo/L)
pg
/mL
50
5.10 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE IL-10
Os perfis de produção de IL-10 após 30 minutos de estímulo com LPS, in vitro,
nas culturas com células mononucleares peritoniais foram bastante similares.
Entretanto células peritoniais de animais do grupo desnutrido independente da
concentração de glutamina que foram cultivadas apresentaram maior produção de
IL-10 quando comprado com os respectivos grupos controles.
Gráfico 13. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de IL-
10 produzido por células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=10) e
desnutrido (n=10) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e
cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando
comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido.
IL-10
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0
20
40
60
80
100
**
* *
(Glutamine mmo/L)
(pg
/mL
)
IL-10
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0
20
40
60
80
100
**
* *
(Glutamine mmo/L)
(pg
/mL
)
51
5.11 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE TRAF-6
A avaliação da expressão de TRAF-6 evidenciou que células peritoniais de
animais desnutridos quando cultivadas com 2 mmol/L ou 10 mmol/L de glutamina
por 24 horas e estimuladas com 1,25 g de LPS por 30 minutos apresentam menor
expressão de TRAF-6 quando comparado com os respectivos controles.
Gráfico 14. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de
TRAF-6 em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e
desnutrido (n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e
cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando
comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido.
TRAF-6
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*
*
Glutamina mmol/L
(U/A
)
TRAF-6
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*
*
Glutamina mmol/L
(U/A
)
52
5.12 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE IKK
A expressão de IKK não apresentou diferenças estatisticamente significativas
quando comparado os diferentes grupos entre si.
Gráfico 15. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de
IKK em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e desnutrido
(n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e cultivadas na
presença de diferentes concentrações de glutamina.
5.13 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE IҠB- TOTAL E IҠB-
FOSFORILADO
A avaliação da expressão de IҡB- total de células peritoniais de animais
desnutridos apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparada
IKK
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Glutamina mmol/L
(U/A
)
IKK
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Glutamina mmol/L
(U/A
)
53
com os respectivos controles quando cultivada com 2mmol/L de glutamina por 24
horas e estimulada com 1,25 g de LPS por 30 minutos. A expressão do IҡB-
fosforilado apresentou diferenças estatisticamente significativas quando comparado
os grupos desnutridos 0, 2 e 10 mmol/l de glutamina como respectivos controles.
Células de animais controles cultivadas na ausência de glutamina apresentaram
maior expressão de IҡB- fosforilado quando comparado com células de animais
controles cultivadas na presença de 2 ou 10 mmol/L de glutamina. Células de
animais desnutridos apresentaram maior expressão IҡB- fosforilado na
concentração 0,6 mmol/L sendo esta diferente estatisticamente dos grupos
desnutridos 2 e 10mmol/L de glutamina.
Gráfico 16. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de
IҡB-α e p-IҡB-α em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e
desnutrido (n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e
cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando
comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido. a p 0,05 quando
comparado o grupo controle 0 mmol/L glutamina com os demais grupos controle, b p
0,05 quando comparado o grupo desnutrido 0,6 mmol/L glutamina com os demais
grupos desnutrido.
p IkB-
C0 D0 C0,6 D0,6 C2 D2 C10 D100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0a
*
a
*,b
b
*,b
a
Glutamina mmol/L
(U/A
)
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Glutamina mmol/L
*
IkB-
(U/A
)
p IkB-
C0 D0 C0,6 D0,6 C2 D2 C10 D100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0a
*
a
*,b
b
*,b
a
Glutamina mmol/L
(U/A
)
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Glutamina mmol/L
*
IkB-
(U/A
)
54
5.14 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NF-ҠB TOTAL E NF-ҠB
FOSFORILADO
A avaliação da expressão de NF-ҡB total de células peritoniais de animais
desnutridos e animais controle apresentaram maior expressão quando as células
foram cultivadas na presença de 10mmol/L de glutamina por 24 horas e estimulada
com 1,25 g de LPS por 30 minutos.
A expressão do NF-ҡB fosforilado apresentou gradativa redução de sua
expressão de acordo com a concentração de glutamina nas quais as células foram
cultivadas. Quanto maior a concentração de glutamina menor foram os resultados
referentes à expressão do NF-ҡB fosforilado. Células de animais desnutridos
apresentaram menor expressão de NF-ҡB fosforilado quando comparado com os
respectivos grupos controle.
Gráfico 17. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de
NF-ҡB e pNF-ҡB em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e
desnutrido (n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e
cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando
comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido. a p 0,05 quando
comparado o grupo controle 0 mmol/L glutamina com os demais grupos controle, b p
0,05 quando comparado o grupo desnutrido 0 mmol/L glutamina com os demais
NFB
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*,d
e
e
d d
Glutamina mmol/L
U/A
p NF-B
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*,b
**,b
a
a,c
b c
Glutamina mmol/L
U/A
NFB
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*,d
e
e
d d
Glutamina mmol/L
U/A
p NF-B
0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*,b
**,b
a
a,c
b c
Glutamina mmol/L
U/A
55
grupos desnutrido. c p 0,05 quando comparado o grupo controle 0,6 mmol/L
glutamina com os demais grupos controle, d p 0,05 quando comparado o grupo
desnutrido 10 mmol/L glutamina com os demais grupos desnutrido, e p 0,05
quando comparado o grupo controle 10 mmol/L glutamina com os demais grupos
controle.
56
6. DISCUSSÃO
A desnutrição, nos mais variados graus, ainda constitui sério problema de
saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento, porém não estando
restrita a estes (MONTEIRO, 2003). A desnutrição protéica e protéico-energética
acarreta diversas alterações fisiológicas sendo a causa mais comum de deficiência
imune secundária em todo o mundo, levando a atrofia de órgãos linfóides, do timo,
deficiência de células T, aumento da susceptibilidade a infecções, reativação de
infecções virais e desenvolvimento de infecções oportunistas (CUNNINGHAM-
RUNDLES et al., 2005).
Até a década de 50, havia pouca ligação entre a interação nutrição-infecção. Já
em meados da década de 60, pesquisas realizadas no Sul da África, Chile e América
Central, demonstraram uma interação entre nutrição, imunidade e infecção, os quais
demonstraram as interações cíclicas do binômio desnutrição-infecção (KEUSH,
2003; KATONA;KATONA-APTE, 2008). Atualmente, é bem definido na literatura
que uma dieta deficiente em proteínas compromete o sistema imune alterando os
mecanismos de defesa do indivíduo, que são dependentes de uma dieta equilibrada
em proteínas, vitaminas e minerais. A nutrição desempenha um papel central no
sistema imune inato (não-específico) e adaptativo (adquirido-específico) consistindo
na manutenção da resposta imune, sendo que a deficiência desses compostos
acarreta a predisposição do organismo frente a agentes infecciosos (FIELD et al.,
2002; LI et al., 2007).
Neste trabalho, optamos pela indução de uma desnutrição protéica devido a
sua elevada endemicidade em países em desenvolvimento, e que não
coincidentemente, são as áreas em que predominam doenças infecciosas e altos
índices de mortalidade. A desnutrição protéica e protéico-energética são as formas
mais frequentes de desnutrição em pacientes hospitalizados, pacientes portadores
de neoplasias ou doenças crônicas, pacientes sob quimioterapia ou ainda indivíduos
que fazem dietas radicais (WAITZBERG et al., 1999; MARCOS, 2000;
BRUNDTLAND, 2000; GADDUCCI et al., 2001; AKNER et al., 2001; NOVA et al.,
2002; KEUSCH, 2003).
Neste modelo de desnutrição as rações foram elaboradas considerando os
teores de vitaminas, ácidos graxos e sais minerais necessários para fornecer uma
dieta adequada, restringindo-se apenas a quantidade de proteína da ração ofertada
57
(ração hipoprotéica) (REEVES et al.,1993). Na elaboração das rações utilizamos
caseína que é uma proteína de alto valor biológico. Em nosso estudo os
camundongos que receberam a dieta, ad libitum, deficiente em proteínas (ração
hipoprotéica, contendo 2% de proteínas), consumiram quantidade semelhante de
ração em relação aos animais controles, porém apresentaram uma significativa
perda de peso corpóreo de aproximadamente 20% do peso corpóreo inicial.
Ao desenvolvermos a desnutrição experimental optamos por trabalhar com
camundongos BALB/c, isogênicos, machos, visando maior uniformidade dos grupos,
evitando-se as flutuações hormonais que ocorrem durante o ciclo estral nas fêmeas.
Utilizamos ainda, animais adultos cuja estabilização do sistema hemopoético já foi
atingida, uma vez que, tanto em animais quanto em humanos ocorrem importantes
modificações fisiológicas na hemopoese em função da idade (BANNERMAN, 1993).
A perda de aproximadamente 20% do peso corpóreo inicial, associados aos valores
do hemograma, da concentração de proteínas totais, albumina e pré-albumina
séricas, mostraram-se como bons indicadores na avaliação da desnutrição protéica.
Nossos resultados também demonstram menores níveis plasmáticos de
glutamina nos animais do grupo desnutrido, o que em parte pode ser explicado pelo
estresse fisiológico causado pela desnutrição, onde a demanda é maior que a
produção, estabelecendo um quadro de deficiência de glutamina. Uma dieta
hipoprotéica acarreta diversas alterações fisiológicas, entre elas a liberação de
hormônios como a corticosterona que estimula a perda muscular. Isso pode explicar
a diminuição de glutamina plasmática nos animais do grupo desnutrido, uma vez que
o músculo esquelético é o principal sítio de síntese de glutamina e nossos resultados
demonstram que animais desnutridos apresentam maior nível de corticosterona
circulante.
Outro ponto chave no aumento da demanda de glutamina pelo organismo na
desnutrição seria justificado pelo fato que, na desnutrição o organismo comporta-se
como no jejum prolongado, onde os processos degradativos estão acentuados,
sendo a glutamina um aminoácido utilizado durante a gliconeogênese. Há, portanto,
um aumento da captação hepática desse aminoácido, o que poderia levar a uma
diminuição dos níveis no plasma (COLLEONE et al., 2000).
Em estudos anteriores (BORELLI et al., 2007; FOCK et al., 2007; 2010), nosso
grupo demonstrou que a leucopenia e a anemia estão associadas a uma hipoplasia
medular e esplênica especialmente importante no setor mielóide. Nesse trabalho
58
também encontramos anemia, com diminuição do número de eritrócitos, da
concentração de hemoglobina e volume do hematócrito. Dados do nosso grupo têm
demonstrado que a anemia vista nesses animais não é ferropriva e sim devido à
diminuição nos progenitores eritróides na medula óssea e que os mesmos são
hiporresponsivos ao estímulo com eritropoetina (BORELLI et al., 2007).
Também observamos leucopenia no sangue periférico dos animais do grupo
desnutrido e dados do nosso laboratório têm demonstrado que em situações onde a
desnutrição não está associada a outras doenças, a leucopenia é a regra (BORELLI
et al., 2007; FOCK et al., 2007; 2010).
Macrófagos ativados desempenham papel relevante na respostas imune e
inflamatória, por meio da liberação de uma variedade de mediadores que incluem
lipídios, espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, quimiocinas e citocinas
(BEUTLER, 1990; LEE et al., 2003). Nesse contexto, nosso grupo já havia
demonstrado diminuição da capacidade de síntese de citocinas pró-inflamatórias em
um modelo de desnutrição, no entanto esses resultados foram obtidos em animais
não isogênicos (FOCK et al., 2007). No atual trabalho, também, demonstramos que
células obtidas do lavado peritoneal de animais isogênicos desnutridos apresentam
menor capacidade de síntese de TNF-, bem como IL-1 e aumento da produção de
IL-10.
A síntese de TNF-α e IL-1 in vitro em macrófagos ativados por LPS está
relacionada ao fato dessa endotoxina ativar essas células, inicialmente, por meio da
sua ligação às proteínas CD14 e TLR4, que estão presentes na membrana
plasmática (MIYAKE, 2003). Esse fato acarreta na ativação de moléculas envolvidas
na transdução do sinal até culminar com a fosforilação do inibidor do NF-ҡB (IҡB-α).
Isto resulta na degradação do IҡB-α e, subsequente liberação e translocação do NF-
ҡB para o núcleo, onde o NF-ҡB promove a ativação de genes, entre eles os que
codificam a produção de TNF-α e IL-1 (BEUTLER;RIETSCHEL, 2003; BEUTLER et
al., 2006).
Nesse trabalho, avaliamos a capacidade da glutamina, in vitro, em modular
células obtidas do lavado peritoneal quando estimuladas com LPS. Especificamente
avaliamos o efeito da glutamina sobre a via de sinalização do fator de transcrição
NF-ҡB e a ação sobre a síntese de citocinas como TNF-α, IL-1 e IL-10.
Nossos resultados demonstram que células cultivadas na presença de
glutamina apresentam menor capacidade de produzir TNF-, bem como IL-1. Esses
59
resultados foram obtidos em ambos os grupos, onde observamos um efeito dose
dependente e paralelamente um aumento da concentração de IL-10. Todavia células
de animais desnutridos, mesmo suplementadas com glutamina, apresentaram menor
capacidade de produção de TNF-, bem como IL-1 e aumento de IL-10.
No presente estudo foi verificado que a ativação de macrófagos com LPS
acarretou em redução da expressão da proteína IҡB-α fosforilado, sendo que quanto
maior a dose de glutamina maior a redução da expressão de IҡB-α fosforilado e
paralelamente menor expressão de NF-ҡB fosforilado. Esses resultados corroboram
com os resultados encontrados para a produção de citocinas pró-inflamatórias, onde
observamos diminuição de TNF- e IL-1.
Esse fato pode ser explicado, em parte, pela capacidade da glutamina de
aumentar intracelularmente a quantidade de GSH (glutationa reduzida) reduzindo a
atividade de kinases sensíveis ao estado redox. Sendo assim, não há liberação do
NF-ҡB para o núcleo. O NF-ҡB encontra-se no citoplasma celular na forma inativa
devido a sua associação com o IҡB e sendo sensível ao estado redox celular, onde
pode ser fosforilado, ubiquitinado e posteriormente degradado pelo proteossoma
26S, liberando o NF-ҡB e sua translocação para o núcleo, onde irá se ligar a
sequências específicas no DNA regulando a transcrição de diversos genes (ROTH
et al., 2002; CAAMAÑO;HUNTER, 2002; LI;VERMA, 2002). A literatura demonstra
que células cultivadas com glutamina apresentam um aumento na concentração de
GSH e que a suplementação in vitro com glutamina é capaz de inibir a produção de
TNF-α por células do epitélio alveolar quando estimuladas com LPS (ROTH et al.,
2002; ZHANG et al., 2009).
Wischmeyer et al., (2003), também relatam que a suplementação in vitro com
glutamina acima de 4 mmol/L possui capacidade de diminuir a produção de TNF-α
em células mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro com LPS,
enquanto Cruzat et al., (2009) demonstrou in vivo que a suplementação com L-
glutamina na forma livre ou como dipeptídio diminui a liberação de TNF-α
imediatamente após o exercício intenso e que a razão GSH/GSSH no músculo sóleo
e no fígado apresenta-se maior.
Estudos revelam que a glutamina diminui a produção de IL-1, IL-6, e IL-8, e
aumenta a produção de IL-10 na mucosa duodenal de humanos (COEFFIER et al.,
2001; 2003). Hubert-Buron et al., (2006), avaliaram os efeitos do pré-tratamento com
glutamina nas células epiteliais do intestino humano na ubiquitinação do IҡB-α.
60
2 BONE, R.C.;BALK, R.A.; CERRA, F.B. Definitions for sepsis and organ failure guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The
ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest. v.101,p.1644-1655, 1992.
Entretanto os efeitos da suplementação com glutamina na degradação do IkB-α
não estão bem esclarecidos. Hubert-Buron et al., (2006), também, demonstraram
que a ativação de NF-ҡB está diminuída nas células epiteliais do intestino e que a
glutamina reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias, e que na presença de 10
mM de glutamina leva a uma menor expressão de IkB-α ubiquitinado e a um
aumento do IҡB-α livre, mostrando que a glutamina pode influenciar na ubiquitinação
de IҡB-α regulando enzimas especificas do processo de ubiquitinação.
De acordo com Singleton;Wischmeyer (2008), a glutamina tem apresentado
efeito antiinflamatório em modelo experimental de sepse. Este efeito tem sido
associado com a diminuição da ativação do NF-ҡB.
Outra hipótese para a diminuição da produção de citocinas pró-inflamatória e o
aumento da síntese de IL-10 está relacionado à síndrome da resposta anti-
inflamatória compensatória (CARS). Na desnutrição, existe um mecanismo de
adaptação ao estado metabólico. Um descontrole do estado de inflamação poderia
levar a falência total da defesa do organismo contra agentes infecciosos. O conceito
de CARS foi proposto em 1997 por Roger Bone (BONE2 et al., 1992 apud ADIB-
CONQUY;CAVAILLON, 2008).
A síndrome da reposta inflamatória sistêmica (SIRS), foi caracterizado em
meados da década de 90, conceituado pela excessiva produção de mediadores pró-
inflamatórios. Estudos têm demonstrado que existe uma relação SIRS/CARS, e que
na CARS ocorre à desativação parcial do sistema imune, restaurando a homeostase
devido ao estado inflamatório (WARD et al., 2008). Nas infecções, as células da rede
do sistema imune inato apresentam receptores de superfície para reconhecer e
reagir a microorganismos, como apresentação de antígenos, expansão e ativação
de linhagens de células tal como polimorfonucleares e linfócitos B, aumento da
produção de IL-1 e TNF-α. A presença dessas citocinas pode levar a outras
manifestações clínicas, tal como febre e vasodilatação (WARD et al., 2008; ADIB-
CONQUY;CAVAILLON, 2008; OSUCHOWSKI et al., 2006). A CARS reverte muitos
desses processos de profundo impacto no paciente, podendo causar a redução da
proliferação de linfócitos e a diminuição da produção de citocinas. Em monócitos
leva a redução da expressão de CD14, CD71, CD86, GM-CSF, redução da produção
de IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-α em resposta ao estímulo com LPS, e a redução da
fagocitose (WARD et al., 2008; ADIB-CONQUY;CAVAILLON, 2008).
61
7. CONCLUSÃO
Nosso trabalho demonstra que macrófagos peritoniais de animais desnutridos
quando suplementados com glutamina e estimulados com LPS, apresentam uma
diminuição da síntese de TNF-α e IL-1, decorrente da alteração na modulação na via
de sinalização do fator de transcrição NF-ҡB, sendo essa resposta dose-dependente
da concentração de glutamina.
62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADIB-CONQUYI, M.; CAVAILLON, J.M. Compensatory anti-inflammatory response syndrome. Journal of Thrombosis and Homeostasis, v.101, p.36-47, 2009.
AUGUSTO, A. P. Terapia Nutricional. São Paulo: Atheneu. p. 28-35, 1995.
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ANEXO A : CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS