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Fabiana da Silva Lima

Modulao da glutamina sobre a via de sinalizao do fator nuclear kappa B (NF-B) em macrfagos peritoniais em um

modelo murnico de desnutrio protica

Dissertao para obteno do grau de

MESTRE

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock

So Paulo 2011

Fabiana da Silva Lima

Modulao da glutamina sobre a via de sinalizao do fator nuclear kappa B (NF-B) em macrfagos peritoniais em um modelo murnico de desnutrio protica

Comisso Julgadora da

Dissertao para obteno do grau de Mestre

Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock Orientador/Presidente

_____________________________________

1o Examinador

________________________________

2o Examinador

So Paulo,______ de 2011.

Ao meu Pai Cicero: trabalhador, inteligente e guerreiro. Ensinou-me a lutar e a viver com dignidade.

Ao meu marido Moises: meu anjo protetor, amigo e companheiro. Por acreditar em mim e estar

sempre ao meu lado: todo meu amor.

Ao Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock: Orientador a palavra que melhor lhe define: no s esteve sempre presente, mas caminhou junto, trabalhando com dedicao e entusiasmo. A voc toda minha gratido,

admirao e respeito.

AGRADECIMENTOS

A Daisy M.C. Santos, amiga e companheira, sempre ao meu lado. Aos amigos do

Hospital Universitrio e a todos aqueles que sempre torceram por mim, obrigada.

Aos amigos do laboratrio de Hematologia Clnica, em especial a Luciana Simo

Carmo, Mayara Caldas Ramos, Alexandra Siqueira Melo, Graziela Batista da Silva, e

Jackeline Soares.

A Profa. Dra. Primavera Borelli, exemplo de dedicao ao ensino e a pesquisa, a

voc toda minha admirao, respeito e carinho.

Ao Prof. Dr. Marcelo Macedo Rogero, do Departamento de Nutrio da Faculdade

de Sade Pblica, pela contribuio na realizao desse trabalho.

A tcnica de laboratrio Mariana Ferreira pelo auxlio prestado.

Aos estagirios de iniciao cientfica, em especial a Mayara Cortez, todo meu

carinho e amizade.

Ao Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas, e a todo o pessoal da

secretaria da ps-graduao, pelo trabalho realizado.

A Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo pelo apoio financeiro

para a realizao desta pesquisa.

A todos aqueles no citados aqui, mas que de alguma forma contriburam para

realizao desse trabalho. Muito obrigada.

De tudo ficaram trs coisas:

A certeza de que estamos sempre comeando,

A certeza de que precisamos continuar...

A certeza que seremos interrompidos antes de terminar.

Portanto devemos:

Fazer da interrupo, um caminho novo...

Da queda, um passo de dana,

Do medo uma escada,

Do sonho uma ponte...

Da procura, um encontro

Fernando Sabino

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS ................................................................................. ix

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... xi

RESUMO.................................................................................................................................. xii

ABSTRACT ............................................................................................................................ xiv

1. INTRODUO E JUSTIFICATIVA .................................................................................. 16

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 18

2.1 OBJETIVOS ESPECFICOS ......................................................................................... 18

3. REVISO DA LITERATURA ............................................................................................ 19

3.1 DESNUTRIO PROTICA E PROTICO ENERGTICA ................................. 19

3.2 MACRFAGOS ............................................................................................................ 23

3.3 ATIVAO CELULAR MEDIADA POR LPS ........................................................... 24

3.4 GLUTAMINA ................................................................................................................ 28

4. MATERIAL E MTODOS .................................................................................................. 30

4.1 ANIMAIS ....................................................................................................................... 30

4.2 RAES ........................................................................................................................ 31

4.3 INDUO DESNUTRIO .................................................................................... 31

4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................ 32

4.6 AVALIAO DA CONCENTRAO PROTICA DAS RAES ......................... 33

4.7 OBTENO DE SANGUE TOTAL E SORO .............................................................. 33

4.8 DETERMINAO DE PROTENAS TOTAIS, ALBUMINA, PR-ALBUMINA,

GLUTAMINA SRICA, CORTICOSTERONA E HEMOGRAMA. ................................. 33

4.9 OBTENO DE CLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS E

IMUNOFENOTIPAGEM .................................................................................................... 34

4.10 CULTURA DE CLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS............................ 35

4.11 DETERMINAO DA EXPRESSO DE TRAF-6, IKK, IB- E IB-

FOSFORILADO, NF-B E NF-B FOSFORILADO ....................................................... 36

4.11.1 SDS-PAGE e Western blotting ............................................................................ 36

4.12 ANLISE ESTATSTICA .......................................................................................... 38

5. RESULTADOS .................................................................................................................... 39

5.1 AVALIAO DO CONSUMO DE GUA, PROTENAS, RAO E VARIAO

DO PESO CORPREO ....................................................................................................... 39

5.2 ANLISE DAS CONCENTRAES SRICAS DE PROTENAS TOTAIS,

ALBUMINA E PR-ALBUMINA ...................................................................................... 40

5.3 AVALIAO DA CONCENTRAO DE GLUTAMINA PLASMTICA .............. 41

5.4 AVALIAO DA CONCENTRAO DE CORTICOSTERONA ............................ 41

5.5 HEMOGRAMA.............................................................................................................. 42

5.5.1. Eritrograma ............................................................................................................. 42

5.5.2. Leucograma ............................................................................................................ 43

5.6 AVALIAO MORFOLGICA DA MEDULA OSSEA........................................... 44

5.7 LAVADO PERITONIAL ............................................................................................... 45

5.8 ANLISE IMUNOFENOTPICA (ENSAIOS EX VIVO) .......................................... 46

5.9 AVALIAO DA CONCENTRAO DE TNF- E IL-1 ..................................... 49 5.10 AVALIAO DA CONCENTRAO DE IL-10 .................................................... 50

5.11 AVALIAO DA EXPRESSO TOTAL DE TRAF-6 ............................................. 51

5.12 AVALIAO DA EXPRESSO TOTAL DE IKK .................................................. 52

5.13 AVALIAO DA EXPRESSO DE IB- TOTAL E IB- FOSFORILADO ... 52 5.14 AVALIAO DA EXPRESSO DE NF-B TOTAL E NF-B FOSFORILADO 54

6. DISCUSSO ........................................................................................................................ 56

7. CONCLUSO......................................................................................................................61

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................................... 62

ANEXO A : CERTIFICADO DO COMIT DE TICA NO USO DE ANIMAIS ................ 72

ix

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

AP-1: Ativador da protena-1

BCG: Bacilo Calmette-Gurin

CARS: Sndrome da resposta antiinflamatria compensatria

CD14: Marcador mielomonoctico, receptor de lipopolissacardeo

CD71: Marcador monoctico. Receptor de transferrina

CD86: Marcador monoctico/co-ativador.

DPE: Desnutrio Protico - Energtica

DNA: cido Desoxirribonuclico

EDTA: cido Etilenodiaminotetractico

ELISA: Enzima Linked Immuno Sorbent Assay

FAO: Organizao das Naes Unidas para Agricultura e alimentao

GSH: Glutationa (forma reduzida)

GM-CSF: Fator estimulador de colnia grnulo-monoctica

GTP: Guanosina Trifosfato

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

IL-1: Interleucina 1

IL-6: Interleucina 6

IL-8: Interleucina 8

IL-10: Interleucina 10

IL-12: Interleucina 12

IRAK: Serina-treonina protena quinase

IB: Inibidor kappa B

IKK: I kappa B quinase

LBP: Lipoprotena ligadora do lipopolissacardeo

x