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Expression und Mutagenese von VEP1-kodierten Progesteron-

5β-Reduktasen aus pharmazeutisch interessanten Angiospermen

Der Naturwissenschaftlichen Fakultätder Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zurErlangung des Doktorgrades Dr.rer.nat.

vorgelegt vonPeter Reinhard Bauer

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissen-schaftlichen Fakultäten der Friedrich -Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 18.10.2012

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Reiner Fink

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Kreis

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Yves Muller

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Für Christina, meine Familie und mich

Leb! Leb!Eh deine Sehnsucht stirbt,

Eh durch den Hauch des Zeitlosen Kraft und Fluss versiegen!

Gib! Gib!All deine Lebenskraft,

den Träumen deines Herzensdeines freien Geist Vision!

Schandmaul

Die Nacht schuf tausend Ungeheuerdoch frisch und fröhlich war mein Mut

in meinen Adern, welches Feuerin meinem Herzen, welche Glut

J.W. Von Goethe

Lasst uns realistisch bleiben,versuchen wir das Unmögliche

Ernesto „Che“ Guevara

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Danksagung

Ich bedanke mir bei meinem Doktorvater Prof. Dr. W. Kreis für die Möglichkeit, die vorliegende Arbeit unter seiner Betreuung zu Erstellen und das in mich gesetzte Vertrauen. Insbesondere für die stete Diskussionsbereitschaft, die kreative Freiheit, welche ich erfahren habe, und seine Anleitung zur Entwicklung einer wissenschaftlichen Arbeitsweise.

Prof. Dr. L. Heide vom Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie (Uni Tübingen), bei dem ich während meiner Diplomarbeit die praktischen Grundlagen der Molekularbiologie erlernen durfte, was wesentlich zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit beigetragen hat.

Ganz explizit bedanken möchte ich mich außerdem bei Herrn Dr. F. Müller-Uri, für sein enormes Interesse an meinen Experimenten und Ergebnissen, seine stete Anteilnahme, die Einführung in die Wissenschaftspolitik und die zahlreichen Gespräche, die ebenfalls sehr zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Ebenso gebührt mein Dank sowohl Frau Dr. V. Herl (durch deren Vorarbeit der Grundstein dieser Arbeit gelegt wurde), als auch Frau Dr. P. Schebitz, v.a. für Ihre fachliche Einarbeitung zu Beginn meiner Zeit am Lehrstuhl und die wunderbare persönliche Zusammenarbeit. Herrn Dr. C. Rieck danke ich für seine Hilfe bei der GC-MS-Analytik.

Herrn Dr. H. Lanig von CCC der Universität Erlangen danke ich für die Simulation der Moleküldynamiken meiner klonierten bzw. mutierten Proteine. Herrn Dr. B. Schmid vom Lehrstuhl für Biotechnologie für seine Einführung in Software zur Analyse von Proteinstrukturen.

Zu gleichen Teilen möchte ich mich bei ALLEN meinen Kollegen vom Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie bedanken, von denen ich in den letzten Jahre fachliche und persönliche Unterstützung erfahren durfte. Ganz besonders meiner Laborpartnerin Frau Kristin Rudolph, die ich zunächst als Bachelor-Studentin an unserem Lehrstuhl kennenlernen durfte, um sie später als Masterstudentin anzuleiten und mit der mich eine enge Freundschaft verbindet. Unser Laboralltag und unsere gemeinsame Zeit waren immer super (und kalorienreich). Außerdem dem Rest meiner direkten Laborkollegen im Labor von Herrn Dr. F. Müller-Uri für die sehr gute und freundschaftliche Zusammenarbeit: Frau M. Ernst, Frau J. Munkert, Frau G. Fischer und Herrn A. Löbers.

Frau H. Maiolino und Frau G. Friedrichs haben mit ihren „Grünen Daumen“ jede Pflanze zum Blühen gebracht. Frau V. Kummeth danke ich für ihre gekonnte Hilfe in allen Verwaltungsangelegenheiten.

Zuletzt möchte ich mich bei allen Pharmazie-Praktikanten bedanken, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben.

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InhaltsverzeichnisDanksagung..........................................................................................................................................4I. EINLEITUNG...................................................................................................................................8

I.1 Herzglykoside - eine wichtige Gruppe pflanzlicher Sekundärstoffe in der Gattung Digitalis...8I.1.1 Chemische Eigenschaften und Verbreitung .......................................................................8I.1.2 Medizinische Bedeutung von Digitalis sp und Herzglykosiden im Wandel....................10

I.2 Biosynthese der Herzglykoside ...............................................................................................11I.2.1 Allgemeine Untersuchungen zum Ablauf ........................................................................11I.2.2 Enzyme der Biosynthese: Progesteron-5β-Reduktase (P5βR).........................................15

I.3 Zielsetzung der Arbeit..............................................................................................................17II. MATERIAL UND METHODEN..................................................................................................18

II.1 Materialien..............................................................................................................................18II.1.1 Wasser..............................................................................................................................18II.1.2 Chemikalien.....................................................................................................................18II.1.3 Pflanzenmaterial..............................................................................................................19II.1.4 Lösungen.........................................................................................................................20

II.1.4.1 Lösungen für die Molekularbiologie.......................................................................20II.1.4.2 Lösungen für die Dünnschichtchromatographie......................................................21II.1.4.3 Lösungen für die Protein-Biochemie.......................................................................21

II.1.5 Puffer...............................................................................................................................21II.1.5.1 Puffer für die Molekularbiologie.............................................................................21II.1.5.2 Puffer für die native His-tag-Reinigung von rekombinanten Proteinen .................22

II.1.6 Nährmedien ....................................................................................................................23II.1.7 Bakterienstämme und Plasmide......................................................................................23II.1.8 Molekularbiologische Kits..............................................................................................25II.1.9 Enzyme............................................................................................................................26II.1.10 Oligonukleotid-Primer...................................................................................................26II.1.11 Verbrauchsmaterialien...................................................................................................29II.1.12 Geräte............................................................................................................................29II.1.13 DNA- und Proteinmarker..............................................................................................31

II.2. Methoden................................................................................................................................32II.2.1 Klonierung und Mutation von Genen..............................................................................32

II.2.1.1 Isolierung von genomischer DNA (gDNA).............................................................32II.2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA....................................................................................32II.2.1.3 Umschreiben von Poly(A)+-RNA in cDNA............................................................33II.2.1.4 Standard-/RT-PCR...................................................................................................33II.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese .....................................................................................34II.2.1.6 Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gelen („freeze'N squeeze“)..........................34II.2.1.7 Konzentrierung und Reinigung von PCR-Produkten..............................................35II.2.1.8 pQE30-UA- / TOPO-TA-Klonierung......................................................................35II.2.1.9 Herstellung von kompetenten E. coli Zellen ..........................................................36II.2.1.10 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli........................................................36II.2.1.11 Colony-PCR ..........................................................................................................36II.2.1.13 Mutagenese-PCR...................................................................................................37II.2.1.14 Plasmid-Isolierung.................................................................................................38II.2.1.15 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von RNA und DNA..........................38II.2.1.16 DNA-Sequenzierung..............................................................................................39II.2.1.17 Langzeit-Lagerung von Bakterienstämmen...........................................................39II.2.1.18 DpnI-Verdau..........................................................................................................39

II.2.2 Heterologe Protein-Expression in E. coli........................................................................40

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II.2.2.1 Kultivierung von E. coli M15[pREP4] und Induktion der Proteinexpression.........40II.2.2.2 Zell-Lyse und native His-tag-Affinitätschromatographie........................................40

II.2.3 Proteinbiochemische Methoden......................................................................................41II.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinen..............................................................41II.2.3.2 Umpuffern von Proteinproben.................................................................................41II.2.3.3 Konzentrierung von Proteinlösungen......................................................................41II.2.3.4 SDS-PAGE ..............................................................................................................41II.2.3.5 Proteinfärbung mit Coomassie brilliant blue...........................................................42II.2.3.6 Standard-Enzymassays für rP5βR ..........................................................................43

II.2.4 Spezielle analytische Methoden......................................................................................43II.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC).........................................................................43II.2.4.2 GC-MS Analytik......................................................................................................44II.2.4.3 Photometrische Analytik..........................................................................................44

II.2.5 Darstellung von Proteinstrukturen und in silico-Methoden ...........................................46III. ERGEBNISSE..............................................................................................................................47

III.1 Klonierung von orthologen P5βR..........................................................................................47III.1.1 Ableitung der Primer und Screening von RNA-Bibliotheken.......................................47III.1.2 Klonierung in den TOPO-Klonierungsvektor................................................................49III.1.3 Etablierung eines Klonierungssystems für pQE30-UA Vektoren..................................52III.2 Funktionelle Expression der orthologen P5βR in E. coli M15[pREP4] ..........................56III.2.1 Expressionsbedingungen und native His-tag-Reinigung...............................................56III.2.2 Nachweis der katalytischen Aktivität.............................................................................57III.2.3 Biochemische Untersuchung der rekombinanten P5βR.................................................59

III.2.3.1 Enantioselektivität..................................................................................................59III.2.3.2 Cosubstrat-Spezifität .............................................................................................59III.2.3.3 Temperatur-Optima................................................................................................61III.2.3.4 Enzymkinetiken für Progesteron und 2-Cyclohex-1-enon.....................................61

III.3 Modellierung und in silico Analyse der heterolog exprimierten Biosynthese-Gene........65III.3.1 Homologie-Modellierung der P5βR und deren Validierung..........................................65III.3.2 Exakte Analyse der Substrat-Bindetaschen....................................................................70

III.4 Ortsgerichtete Mutagenese (SDM) der rekombinanten D. lanata P5βR...............................72III.4.1 Mutagenese der konservierten Reste der Bindetasche der DlP5βR...............................72

III.4.1.1 Herstellung und Validierung der mutierten Plasmide.............................................72III.4.1.2 Überexpression und Bestimmung der katalytischen Aktivitäten der Muteine.......75III.4.1.3 Kinetische Untersuchung der Muteine...................................................................78III.4.1.4 In silico Betrachtung der Muteine DlP5βR G145A und F153A............................79

III.4.2 Rationale Mutagenese zur Steigerung der katalytischen Aktivität der rDlP5βR...........82III.4.2.1 Ableitung von essentiellen Aminosäuren für die katalytische Aktivität der rDlP5βR................................................................................................................................82III.4.2.2 Ortsgerichtete Mutagenese der D. lanata P5βR.....................................................84III.4.2.3 Relative Aktivitäten und kinetische Untersuchungen der gefundenen Muteine....86III.4.2.4 Alternative Strategien zur Verbesserung der katalytischen Aktivität ....................90

III.4.3 N-terminale Deletionsmutanten der DlP5βR.................................................................93III.4.3.1 Klonierung der full-length DlP5βR........................................................................93III.4.3.2 Subklonierung und funktionelle Expression der kompletten DlP5βR ..................94III.4.3.3 Einkürzungs-Mutagenese.......................................................................................97

III.4.4 Mutagenese zur Änderung der Cosubstrat-Spezifität....................................................99III.4.4.1 In silico Analyse NADPH und NADH-spezifischer SDRs....................................99III.4.4.2 Mutagenese-Experimente.....................................................................................101III.4.4.3 Versuche zur in-vitro-Biosynthese........................................................................104

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IV DISKUSSION.............................................................................................................................108IV.1 Klonierung, Sequenz-Analyse, Expression und Verbreitung der P5βR...............................108

IV.1.1 Klonierung von orthologen P5βR.................................................................................108IV.1.2 Analyse der Proteinsequenzen und Strukturen.............................................................109IV.1.3 Vorkommen und Vergleich von homologen, funktionellen P5βR in Herzglykosid-haltigen und Herzglykosid-freien Angiospermen .................................................................113

IV.2 Mutagenese-Experimente.....................................................................................................119IV.2.1 Steigerung der enzymatischen Aktivität der rDlP5βR..................................................119

IV.2.1.1 Ableitung von Mutagenese-Positionen durch „bioactivity guided“-Screening . .119IV.2.1.2 Gerichtete Mutagenese und Charakterisierung der Muteine................................123IV.2.1.3 Simulation der Molekül-Dynamik (MD)..............................................................125

IV.2.2 Konservierte Reste innerhalb der Bindetasche der P5βR.............................................128IV.2.3 Einkürzungs-Mutagenese der rDlP5βR .......................................................................131IV.2.4 Änderung der Cosubstrat-Spezifität.............................................................................137

V ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................................................143V SUMMARY..................................................................................................................................145VI LITERATURVERZEICHNIS*...................................................................................................147VII ANLAGEN................................................................................................................................163

VII.1 Abkürzungsverzeichnis......................................................................................................163VII.2 Publikationsliste.................................................................................................................165VII.3 Tagungsbeiträge und wissenschaftliche Preise...................................................................165

VII.3.1 Wissenschaftliche Kongresse mit Eigenbeitrag..........................................................165VII.3.2 Preise während der Promotionsphase.........................................................................166

VII.5 LEBENSLAUF..................................................................................................................167

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I. EINLEITUNG

I.1 Herzglykoside - eine wichtige Gruppe pflanzlicher Sekundärstoffe in der Gattung Digitalis

Die Gattung Digitalis akkumuliert eine große Anzahl von pflanzlichen Sekundärstoffen und

wurde phytochemisch bereits sehr gut untersucht. Beschrieben wurden u.a. über 40 verschiedene

Arten von Anthrachinonen (z.B. Digitolutein), Steroidsaponine mit meist nur schwachem

Saponincharakter (z.B. Digitonin und Titogenin), Flavonoide wie Digicitrin und als Digitanole

bezeichnete C5-C6 ungesättigte C21-Pregnane. Pharmazeutische und toxikologische Bedeutung

erlangte die Gattung aber ausschließlich auf Grund ihres Gehaltes an 5β-Cardenoliden, einer

Untergruppe der herzwirksamen Glykoside (Luckner und Wichtl, 2000; Clemente et al., 2011).

I.1.1 Chemische Eigenschaften und Verbreitung

Unter der Sammelbezeichnung Herzglykoside versteht man eine Gruppe von Naturstoffen

mit spezifischer Wirkung auf den Herzmuskel von Kalt- und Warmblütern. Es handelt sich um C23-

oder C24-Steroide mit einer charakteristischen cis-trans-cis Verknüpfung des Steroid-Ringsystems.

Dieses kann in unterschiedlichen Hydroxylierungsmustern vorliegen, wobei die beiden β-ständigen

Hydroxylgruppen an den Positionen 3 und 14 obligatorisch sind (Abb. 1).

Abb. 1: Exemplarische Struktur eines Herzglykosids. Durch Abspaltung der terminalen Glucose entsteht aus dem

Primär- das Sekundärglykosid (A = Cardenolid; B = Bufadienolid).

An der 3-Hydroxylgruppe findet man in der Regel 1 - 4 glykosidisch gebundene

Zuckerketten. Neben „typischen“ Zuckern wie D-Glucose, L-Rhamnose und D-Fucose treten hier

auch sehr seltene 2,6-Didesoxyzucker wie β-D-Digitoxose auf. Kommen beide Zuckerarten

gemeinsam vor, ist das Aglykon an diese seltenen Zucker gebunden, während das „normale“

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Zuckermolekül endständig angeknüpft ist (Primärglykosid). Die Abspaltung des terminalen

Zuckerrestes (z.B. durch pflanzeneigene Glucosidasen während der Aufarbeitung) führt zur Bildung

von Sekundärglykosiden. Die Art und Anzahl der Zuckermoleküle der glykosidischen Seitenkette

sind von therapeutischer Relevanz, da sie einen wesentlichen Einfluss auf die Pharmakokinetik der

Herzglykoside haben.

Ein anderes typisches Merkmal ist der β-ständige Lactonring an C-17. Anhand der

Beschaffenheit dieses Rings erfolgt eine weitere Einteilung der Herzglykoside: Handelt es sich um

einen fünfgliedrigen Butenolid-Ring werden die Verbindungen den Cardenoliden (Abb. 1, A), im

Falle des sechsgliedrigen Cumalinrings den Bufadienoliden zugeordnet (Abb. 1, B). Zur

Cardenolidgruppe gehören die Glykoside aus Digitalis-, Strophanthus-, Convallaria-, Nerium- und

Adonis-Arten, während es sich bei den Urginea- und Helleborus-Glykosiden um Bufadienolide

handelt (Teuscher und Lindequist, 2010).

Herzglykoside treten sporadisch sowohl in monokotylen, als auch in dikotylen Pflanzen auf

und wurden bisher in über 20 Pflanzenfamilien beschrieben (Teuscher und Lindequist, 2010; Kreis

und Müller-Uri, 2009). Offizinelle Arzneibuch-Drogen (Ph.Eur 7.0, DAB, DAC) finden sich in

verschiedenen Pflanzenfamilien: Plantaginaceae (Digitalis lanatae folium, Digitalis purpureae

folium), Ranunculaceae (Adonidis herba, Hellebori radix), Apocynaceae (Nerii folium, Strophanthi

semen), Convallariaceae (Convallariae herba), Hyacinthaceae (Scillae bulbus). Bufadienolide

findet man außerdem in den Hautdrüsen von bestimmten Kröten (Bufo bufo), Schlangen der

Gattung Rhabdophis und einigen Insekten, wie dem Monarchfalter. Dieser Schmetterling ist

allerdings nur sekundär giftig, d.h. er nimmt die Herzglykoside mit der Nahrung auf, modifiziert sie

und speichert sie in endogenen Geweben (als Übersichtsartikel hierzu s. auch Dobler et al., 2011).

Andere Insekten sind zur aktiven Bildung dieser Strukturen in der Lage (Passtells JM et Daloze D,

1977). Beobachtet wird außerdem das Vorkommen von endogenen Herzglykosiden im

menschlichen Organismus, die vermutlich eine bisher unbekannte Art von Steroidhormonen

darstellen. Obwohl ihre Bedeutung noch nicht eindeutig bekannt ist, sind bereits zahlreiche

physiologische Wirkungen beschrieben worden (Schoner, 2002; Bagrov und Shapiro, 2008; Ritz

und Schoner, 2008).

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I.1.2 Medizinische Bedeutung von Digitalis sp und Herzglykosiden im Wandel

Die aus Digitalis lanata und Digitalis purpurea isolierten Digitalis-Glykoside bewirken eine

Steigerung der Kontraktionskraft des Herzmuskels (positiv inotrope Wirkung) auf Grund derer

diese Verbindungen lange Zeit Mittel der ersten Wahl bei einer klinisch manifesten Herzinsuffizienz

darstellten. Neben dieser Steigerung der Kontraktionskraft des Herzens kommt es außerdem zu

einer Verringerung der Schlagfrequenz (negativ chronotrope Wirkung), einer Erschwerung der

Erregungsleitung (negativ dromotrope Wirkung) und zu einer Senkung der Reizschwelle des

Muskels (positiv bathmotrope Wirkung). In der Summe führen diese Effekte bei den Patienten so zu

einer Ökonomisierung der Herzarbeit (Mutschler et al., 2008). Andere Digitalis-Arten haben bzw.

hatten keine pharmazeutische Bedeutung (Clemente et al., 2011).

Auf molekularer Ebene kommt es durch die Gabe von Herzglykosiden zur dosisabhängigen

Hemmung der kardialen Mg-abhängigen Na+/K+-ATPase und folglich zu einer Störung des Na+- und

K+-Transports aus bzw. in die Zelle. Durch die erhöhte intrazelluläre Na+-Konzentration werden

membranständige Na+/Ca2+-Transporter in ihrer Funktionsweise beeinflusst. Die intrazelluläre Ca2+-

Konzentration steigt an, da weniger Ca2+--Ionen aus der Zelle transportiert werden. Dies bedingt

eine verbesserte Kontraktionskraft des Herzmuskels (Demiryurek und Demiryurek, 2005). Für die

Erhöhung der intrazellulären Na+-Konzentration von 1 auf 2 mM wurde in vitro eine Verdopplung

der Kontraktionskraft beschrieben (Fozzord und Sheets, 1985).

Als Arzneistoffe werden heute entweder die isolierten Reinstoffe, oder partialsynthetische

Derivate eingesetzt. Therapeutisch stehen Digoxin (z.B. Lanicor®), Digitoxin (z.B. Digimerck®),

Acetyldigoxin (z.B. Novodigal®) und Metildigoxin (z.B. Lanitop®) in einer Erhaltungsdosis von

0,05-0,3 mg/Tag zur Verfügung.

Neuere Untersuchungen stellen den therapeutischen Effekt der Therapie im Rahmen einer

Evidenz-basierten Medizin jedoch in Frage. In der placebokontrollierten DIG-Studie, an der 7788

Patienten teilnahmen, hatte die medikamentöse Therapie mit Digoxin keinen signifikanten Effekt

auf die Überlebenszeit der Patienten (Hobbs, 1997). Als Argument für eine Digitalis-Therapie

wurden jedoch eine erhöhte Belastbarkeit und eine geringe Hospitalisierungsrate in der Verum-

Gruppe aufgeführt (Jaehde et al., 2003). Hinzu kommt die sehr geringe therapeutische Breite der

Substanzen. Typische Nebenwirkungen wie Benommenheit, Übelkeit, Farbsehen, Arrhythmien und

Halluzinationen bei älteren Patienten treten häufig bereits vor Erreichen des vollen Wirkspiegels auf

und werden mit etwa 20 % angegeben. Als besonders schwierig stellt sich hierbei die Dosisfindung

bei älteren, multimorbiden Patienten dar. Vor allem auf Grund der klinischen Untersuchungen

veränderte sich der Stellenwert der Herzglykoside in der Therapie: Obwohl sie noch immer zu den

Standard-Arzneimitteln des Indikations-Bereichs Herzinsuffizienz zählen, handelt es sich nach den

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aktuellen Therapieleitlinien nicht mehr um Mittel der ersten Wahl. Diese sind jetzt Diuretika, β-

Blocker, ACE-Hemmer, Sartane und Spironolacton. Die Monotherapie mit Herzglykosiden gilt

ebenfalls als obsolet und wird in der Praxis in Deutschland nicht mehr praktiziert (Mutschler, 2008;

DEGAM Leitlinie von Muth et al., 2006).

Neue, vielversprechende Indikationsbereiche für Herzglykoside entstehen momentan

allerdings durch die Entdeckung der endogenen „Digitalis-artigen Faktoren“ (endogenous digitalis-

like factors / DLF; Ouabain, Marinobufagenin) und das wachsende Verständnis ihrer

physiologischen Funktionen bei der Blutdruckregulation, der Kontrolle des Zellzyklus und der

Apoptose (Jortani und Valdes, 1997; Bagrov und Shapiro, 2008). Hierdurch kann beispielsweise die

bereits 1967 durch Shiratori und Gan erstmals beschriebene Hemmung des Wachstums maligner

Zelllinien durch Herzglykoside im Ansatz erklärt werden. Neben solchen in-vitro-Effekten wurde

auch wiederholt die klinische Wirksamkeit der Herzglykoside als antitumorale Agenzien in vivo

demonstriert: So wurde eine Gruppe von Patientinnen, die an Brustkrebs erkrankten, über 22 Jahre

beobachtet, wobei die Mortalität bei den Frauen, die eine zusätzliche Therapie mit Digitalis

erhielten, bei 6 % lag, die der anderen bei 34 % (Stenkvist, 1999; Übersichtsarbeit s. Winnicka et

al., 2006). Ye et al. (2011) zeigten neben der Hemmung der Interferon-β-Genexpression einen

inhibierenden Effekt von Bufalin auf die Tumornekrosefaktor (TNF)-Signalkaskade und eine

Interferenz mit NfκB. Die Autoren geben Bufalin deshalb als möglichen Arzneistoff zur Therapie

von Entzündungen und bestimmten Autoimmunerkrankungen an. Digitoxin und andere Cardenolide

besitzen außerdem schon in geringster Konzentration antivirale Wirkung gegen Herpes simplex

Viren Typ 1 (HSV-1) (Su et al., 2008; Bertol et al., 2011).

I.2 Biosynthese der Herzglykoside

I.2.1 Allgemeine Untersuchungen zum Ablauf

Da es sich um therapeutisch interessante Naturstoffe handelt, war die Biosynthese der

Cardenolide (speziell in Digitalis) Gegenstand intensiver Forschung. Der putative Biosynthese-Weg

wurde unter anderem über Fütterungsexperimente mit radioaktiv markierten Vorstufen, die

Reinigung bzw. die Klonierung und heterologe Expression von vermeintlichen Biosynthese-

Enzymen aufgeklärt (Kreis und Müller-Uri, 2009; Clemente et al., 2011). Eine zusammenfassende

Darstellung wichtiger Schritte der Biosynthese ist im folgenden wiedergegeben (Abb. 2):

11

Abb. 2: Schematische Darstellung der frühen Herzglykosid-Biosynthese ausgehend von Cholesterol. A stellt den

putativen Hauptweg über Pregnan-Zwischenstufen dar. B zeigt einen möglichen Nebenweg über Norcholansäuren.

Wichtige Enzyme sind angegeben (SCCE = Side-chain cleaving enzyme; 3β-HSD = 3β-Hydroxysteroid-

Dehydrogenase, KSI = Ketosteroid-Isomerase; P5βR = Progesteron-5β-Reduktase).

Da es sich bei den Cardenoliden um Steroide handelt, geht man davon aus, dass der Aufbau

des Aglykons aus Mevalonsäure über Triterpen- bzw. Phytosterolintermediate verläuft.

12

A

B

Experimentell konnte bereits früh der Einbau von markierten Mevalonat-Vorstufen in den Steroid-

Körper gezeigt werden (Ramstad und Beal, 1960). Das Muster der Markierung an C-1, C-7 und C-

15 entsprach ebenfalls den Erwartungen, die sich aus einer Biosynthese über den Mevalonat-Weg

ergeben (Gros und Leete, 1965). Die Kohlenstoff-Atome C-22 und C-23 des charakteristischen

Butenolid-Rings stammen jedoch nicht aus einem anderen Biosynthese-Weg (Gregory und Leete,

1969).

Man geht davon aus, dass der erste Schritt der Biosynthese in der partiellen Abspaltung der

Seitenkette an C-17 zwischen den beiden Kohlenstoffatomen C-20 und C-22 durch das Side Chain

Cleaving Enzyme (SCCE) besteht, wobei Pregnenolon gebildet wird (Pilgrim, 1972). Da die

Fütterung von 25-Azacycloartanol bei D. lanata Sprosskulturen jedoch zu einer Steigerung des

endogenen Cholesterols bei gleichzeitiger Abnahme der Konzentration von 24-Alkyl-Sterolen bzw.

Cardenoliden führte, gelten auch klassische Phytosterole, wie Campesterol, als mögliche

Ausgangsverbindungen (Milek at al., 1997).

Das gebildete Pregnenolon wird im Anschluss sukzessive über Isoprogesteron zu

Progesteron umgesetzt. Hierzu sind zwei Reaktionen notwendig: die Oxidation der 3-

Hydroxylgruppe des Steroid-Körpers zum Keton und die Isomerisierung der Doppelbindung des

entstandenen Δ5-Pregnen-3,20-dions (Isoprogesteron) zum Δ4-Pregnen-3,20-dion (Progesteron). Im

tierischen System werden beide Reaktionen durch einen einzigen Enzymkomplex, der sowohl 3β-

Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD), als auch Ketosteroid-Isomerase-Aktivität (KSI) besitzt

katalysiert (Pollack, 2004). Frühere Theorien legten dieses Verhalten auch für die pflanzlichen 3β-

HSDs nahe (Finsterbusch et. al., 1999). Die Aminosäure-Sequenz des Enzyms zeigte jedoch eine

größere Übereinstimmung mit den 3β-HSDs mikrobiellen Ursprungs (Lindemann et al., 2000; Herl

et al., 2007), die keine KSI-Aktivität besitzen. Die Klonierung und funktionelle Expression der Δ5-

3β-HSD aus D. lanata erfolgte durch Herl et al. (2007). Neben Pregnenolon katalysierte das

rekombinante Enzym bei Anwesenheit von NAD+ die Umsetzung zahlreicher weiterer Substrate

(z.B. Testosteron). Wie bei den bakteriellen Enzymen konnte jedoch keine KSI-Aktivität

nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite besitzen Rohextrakte von D. lanata Blättern bzw.

Zellkulturen KSI-Aktivität. Aus den Blattextrakten konnte bereits ein 15 kDa Protein mit KSI-

Aktivität partiell gereinigt werden. Auch hier erfolgte keine Co-Reinigung mit der 3β-HSD

(Meitinger et al., 2010). Obwohl der Ablauf der Biosynthese über Progesteron bereits seit

Jahrzehnten etabliert ist, konnte erst kürzlich das Vorhandensein von Progesteron in Pflanzen

(Juglans regia) zweifelsfrei nachgewiesen werden (Pauli et al., 2010).

Die stereospezifische Reduktion der Δ4,5-C=C-Doppelbindung des Progesterons erfolgt

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durch die NADPH-abhängige Progesteron-5β-Reduktase (früher 5β-POR, jetzt P5βR), wobei die

charakteristische cis-Verknüpfung der Ringe A und B des Steroidkörpers entsteht, die typisch für

alle Cardenolide der Gattung Digitalis ist. Aus diesem Grund wurde dem Enzym lange Zeit eine

Schlüsselrolle in deren Biosynthese zugesprochen. Auch eine Progesteron-5α-Reduktase, welche

die Reduktion von Progesteron zu 5α-Pregnan-3,20-dion katalysiert, wurde aus D. lanata

Zellkulturen isoliert und charakterisiert (Wendroth und Seitz, 1990). Im Gegensatz zur P5βR ist

diese durch Finasterid bei einer Konzentration von 180 µM vollständig hemmbar (Grigat, 2005).

Das Enzym hat für die Biosynthese der 5β-Cardenolide vermutlich keine Bedeutung, da eine

Isomerisierung von 5α- zu 5β-Derivaten bisher nicht beschrieben wurde (Kreis et al., 1998).

Vermutlich sind die ubiquitär zu findenden Steroid-5α-Reduktasen primär in die Biosynthese der

Brassinosteroide involviert (Li et al., 1997).

Es folgt die enzymatische Reduktion der 3-Ketofunktion des 5β-Pregnan-3,20-dions zum

entsprechenden Alkohol (5-Pregnan-3β-ol-20-on). Obwohl 5β-Pregnan-3,20-dion in vitro durch

die rekombinante D. lanata 3β-HSD stereospezifisch umgesetzt wird (Herl et al., 2007), ist nicht

klar, ob diese Reaktion, wie von Finsterbusch et al. (1999) bereits angeregt, auch in vivo durch die

3β-HSD katalysiert wird, oder ob spezielle 3β-Hydroxysteroid-5α-Oxidoreduktasen, 3β-

Hydroxysteroid-5β-Oxidoreduktasen und 3α-Hydroxysteroid-5β-Oxidoreduktasen eine Rolle in der

Biosynthese der verschiedenen Herzglykoside spielen (Stuhlemmer et al., 1993; Clemente et al.,

2011).

Die beiden Enzyme, die an der 14β- und 21β-Hydroxylierung beteiligt sind, konnten bisher

weder gereinigt noch kloniert werden. Auch die Abfolge der Oxidationen ist nicht bekannt

(Clemente et al. 2011). Da 14β-Hydroxyprogesteron in Cardenolide aufgenommen werden, geht

man davon aus, dass die 14β-Hydroxylierung der Bildung des Butenolid-Rings vorangeht (z.B.

Haussmann et al., 1997). Dieser entsteht vermutlich durch den nukleophilen Angriff einer

aktivierten Acetat- oder Mevalonat-Einheit an der C-20-Ketofunktion mit anschießender

Lactonringbildung über C-21, wobei die beiden Kohlenstoff-Atome C-22 und C-23 ins Molekül

eingeführt werden. Eine andere Möglichkeit postuliert zunächst die Bildung eines 21-O-Malonyl-

Hemiesters mit nachfolgender Decarboxylierung und Dehydrierung (Stuhlemmer und Kreis, 1996;

Pádua et al., 2008). Unterstützt wird dieser Mechanismus durch die kürzlich veröffentlichte

Reinigung einer Malonyl-CoenzymA: 21-Hydroxypregnan 21-O-Malonyltransferase (Dp21MaT9)

aus den Blättern von D. purpurea (Kuate et al., 2008).

Variationen der Cardenolidstruktur ergeben sich v.a. aus der 12β- und 16β-Hydroxylierung

des Steroidkörpers (Änderung der „Herzglykosid-Reihe“) und durch die Anknüpfung verschiedener

14

Zucker. Es wurde gezeigt, dass die Hydroxylierungen prinzipiell auf Stufe des Pregnans, des

Cardenolid-Aglykons oder des Glykosids erfolgen kann (Furuya et al., 1970; Tschesche, 1971;

Reinhard et al., 1975). Durch die Kombination der unterschiedlichen Aglyka mit verschiedenen

Zuckerketten ergibt sich so eine große Anzahl verschiedener Herzglykoside (bei Digitalis sind über

70 unterschiedliche Verbindungen beschrieben worden; Luckner und Wichtel, 2000).

Neben diesem „klassischen“ Biosynthese-Weg über Pregnan-Zwischenstufen, gibt es die

Möglichkeit der Biosynthese über Norcholansäure-Intermediate (Haussmann et al., 1997).

Markierte Norcholansäuren wurden in Fütterungsversuchen, analog zu den Pregnanen, ebenfalls in

die Cardenolide eingebaut. Für D. lanata gibt es Hinweise darauf, dass in der Pflanze je nach

Cardenolid-Typ beide Wege parallel ablaufen (Maier et al., 1986; Übersicht auch bei Kreis und

Müller-Uri, 2009). Die rekombinanten P5βR und 3β-HSDs aus D. lanata waren in der Lage

Norcholansäure-Substrate effizient umzusetzen (Schebitz et al., 2010).

I.2.2 Enzyme der Biosynthese: Progesteron-5β-Reduktase (P5βR)

Auf Grund der beschriebenen Rolle für die Katalyse des lange Zeit proklamierten

Schlüsselschrittes der Cardenolid-Biosynthese (Herl et al., 2007), handelt es sich bei der

Progesteron-5β-Reduktase um das momentan am intensivsten erforschte Enzym (z.B. Kreis und

Müller-Uri, 2010; Clemente et al., 2011). Die erste Reinigung, Charakterisierung und teilweise

Mikrosequenzierung des strikt NADPH-abhängigen Enzyms mit einer Größe von etwa 43 kDa

gelang aus Blätter- bzw. Sprosskulturen von D. purpurea (Gärtner et al., 1990; Gärtner et al., 1994).

Roca-Pérez et al. (2004) identifizierten das erste Gen für eine P5βR in D. obscura (Dop5βR;

AJ555127). Später erfolgte die Klonierung und funktionelle Expression der orthologen P5βR über

RT-PCR aus cDNA von D. lanata. Der Vergleich mit der klonierten Sequenz aus der gDNA zeigte

ein kleines Intron im P5βR-Gen (Herl et al., 2007). Das Gen selbst ist in der Gattung Digitalis stark

konserviert und wurde als Marker für phylogenetische Analysen herangezogen (Herl et al., 2007).

Das rekombinante Protein (rDlP5βR) setzte neben Progesteron eine Reihe von weiteren Steroiden

mit Enon-Struktur, wie Cortisol und Cortison, um. Auch kleinere mono- und azyklische Substrate

mit aktivierter Doppelbindung werden stereoselektiv reduziert (Burda et al., 2009).

Die Kristallstruktur der rDlP5βR mit und ohne Cosubstrat wurde von Egerer-Sieber et al.

(2006) bzw. Thorn et al. (2008) veröffentlicht (PDB 2v6g bzw. 2v6f). Wie bereits aus der Sequenz

ersichtlich war, zeigte die Struktur die Zugehörigkeit des Enzyms zur Familie der kurzkettigen

Dehydrogenasen/Reduktasen (short-chain dehyrogenases/reductases; SDRs), einer großen Gruppe

von NAD(P)H bzw. NAD(P)+-abhängigen Oxidoreduktasen, die zwar einige Sequenzmotive

15

gemeinsam haben, jedoch nur eine geringe Sequenzidentität aufweisen. Man findet sie in

zahlreichen Organismen und Stoffwechselwegen (Lipid-, Aminosäure-, Hormonmetabolismus,

ect.). Die strukturelle Gemeinsamkeit stellt ein zentrales, paralleles β-Faltblatt-System dar, das von

mehreren α-Helices flankiert wird und in der Gesamtheit als Rossmann-Faltung bezeichnet wird

(Kavanagh et al., 2008). Es handelte sich jedoch um eine neue Unterklasse, in welcher von der

charakteristischen katalytischen SDR-Tetrade (bzw. Triade) nur die beiden konservierten

Aminosäure-Reste Lys-147 und Tyr-179 vorhanden sind. Thorn et al. (2008) definierten drei neue

Proteinmotive, die in dieser neuen SDR-Familie zu finden sind (Abb. 3, Motiv IV, V, VI).

Abb. 3: Experimentell bestimmte Struktur der P5βR aus D. lanata. Die Lage der charakteristischen Protein-Motive I-III

(rot; Persson et al., 2003) bzw. IV-VI (weinrot; Thorn et al., 2008) ist farblich markiert. Die Lage von Cosubstrat

(NADP+, grün) Substrat (Progesteron, blau) ist ebenfalls ersichtlich.

Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der P5βR besaßen große Ähnlichkeiten zu Genen

bzw. Proteinen mit unbekannter Funktion aus Pflanzen, die keine Herzglykoside akkumulieren (z.B.

Populus tremuloides, Vitis vinifer, Ricinus communis). Herl et al. (2009) berichteten von der

Klonierung und funktionellen Expression einer orthologen P5βR aus A. thaliana (VEP1; AtStR).

Das rekombinante Enzym war ebenfalls in der Lage, Progesteron stereoselektiv zu 5β-Pregnan-

3,20-dion zu reduzieren. Obwohl die Sequenzidentität der AtStR zur DlP5βR über 70% beträgt,

16

besaß es eine etwa 50-fach höhere katalytische Aktivität. Auch dieses Enzym zeigte einen

deutlichen promisken Charakter (Burda et al., 2009).

I.3 Zielsetzung der Arbeit

Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe von systematischer, ortsgerichteter

Mutagenese (site-directed mutagenesis) der DlP5βR das Verständnis für die Struktur und

Reaktivität der Progesteron-5β-Reduktasen zu erweitern. Einen Schwerpunkt dieser Versuchsreihen

sollten Experimente bilden, mit deren Hilfe die stark ausgeprägten quantitativen Unterschiede in der

katalytischen Umsetzung von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion, die zwischen der D. lanata und

der A. thaliana P5βR existieren, erklärt werden sollten. Eine bereits bestehende in-silico-Theorie

musste experimentell überprüft werden. Anhand der Ergebnisse sollte die Aktivität der rDlP5βR

rational gesteigert werden. Des Weiteren sollten putativ für die Katalyse bzw. Substrat-Bindung

wichtige Aminosäure-Reste identifiziert bzw. ersetzt und die Cosubstrat-Spezifität geändert werden.

Hierzu sollten u.a. folgende Methoden Verwendung finden:

– Klonierung weiterer orthologer P5βR-Gene aus verschiedenen Taxa mit und ohne

Cardenolid-Akkumulation

– Heterologe Überexpression dieser Gene in E. coli M15 und deren funktionelle Analyse

– Homologie-Modellierung und Strukturanalyse der neuen rP5βR

– Mutagenese der rDlP5βR (Substitution einzelner Aminosäuren, Alanin-Austausch-

Mutagenese, Deletionsmutagenese)

– Charakterisierung und Vergleich interessanter Muteine anhand ihrer Enzymkinetik (Km und

vmax)

Um eine große Anzahl von Protein-Proben effizient charakterisieren zu können, sollte eine

neue photometrische Methode für rP5βR etabliert werden.

17

II. MATERIAL UND METHODEN

II.1 Materialien

II.1.1 Wasser

Soweit nichts anderes angegeben, wird für alle molekularbiologischen und protein-

biochemischen Arbeiten bidestilliertes Wasser (Aquabidest) verwendet, das vor der Nutzung bei 121

°C und 1 bar Überdruck für 16 min autoklaviert wurde. Es wird verschlossen bei Raumtemperatur

gelagert.

II.1.2 Chemikalien

Bezeichnung Hersteller / Lieferant

30 % Bis-Acrylamidlösung Applichem GmbH, Darmstadt, D

Agar Merck KGaA, Darmstadt, D

Agarose NEEO Ultra-Qualität Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

Ampicillin-Na Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

Anisaldehyd Fluca AG, Buchs, D

Coomassie Brilliant Blue Serva Feinbiochemica GmbH &

Co. KG, Heidelberg, D

Dichlormethan Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

DMSO Applichem GmbH, Darmstadt, D

dNTPs Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, D

Ethidiumbromid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

Glucose-6-Phosphat Boehringer GmbH, Mannheim, D

Hefeextrakt Applichem GmbH, Darmstadt, D

HEPES Applichem GmbH, Darmstadt, D

Imidazol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

IPTG Applichem GmbH, Darmstadt, D

Isoprogesteron LS Pharmazeutische Biologie

Kanamycin-Sulfat Applichem GmbH, Darmstadt, D

Methanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

NaCl Applichem GmbH, Darmstadt, D

NAD+ Applichem GmbH, Darmstadt, D

NADH Applichem GmbH, Darmstadt, D

NADP+ Applichem GmbH, Darmstadt, D

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NADPH Applichem GmbH, Darmstadt, D

Natriumdihydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt, D

Natrium-EDTA Applichem GmbH, Darmstadt, D

NaOH Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

Oligonucleotide Eurogentec, Seraing, B

o-Phosphorsäure 85% Merck KGaA, Darmstadt, D

Progesteron Applichem GmbH, Darmstadt, D

Pregnanderivate Steraloids Inc., Newport RI, USA

Proteinmarker Precision (Plus) Protein-Standard BioRad GmbH, München, D

Salzsäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

SDS Ultrapure Applichem GmbH, Darmstadt, D

TEMED Merck KGaA, Darmstadt, D

Tris/HCl Sigma-Adrich, Taufkirchen, D

Trypton Applichem GmbH, Darmstadt, D

X-Gal Applichem GmbH, Darmstadt, D

β-Mercaptoethanol (β-ME) VWR Int. GmbH, Darmstadt, D

Alle nicht aufgeführten Chemikalien wurden in p.A.-Qualität bei VWR International GmbH

(Darmstadt, D) oder Sigma-Aldrich GmbH (Taufkirchen, D) bezogen.

II.1.3 Pflanzenmaterial

Zur Isolierung von RNA und gDNA wird stets frisches Pflanzenmaterial in Form von

jungen, frisch geernteten Blättern genutzt. Diese werden aus dem botanischen Garten der Friedrich

Alexander Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) entnommen und unmittelbar verarbeitet oder in

Form von kommerziell erhältlichen Samen bezogen und im Gewächshaus bis zur Ausbildung von

Blättern geeigneter Größe angezogen. Die Pflanzen werden nach vier bis sieben Tagen pikiert,

täglich bewässert und einmal wöchentlich gedüngt (WUXAL Universaldünger, Wilhelm Haug,

Ammerbuch, Deutschland).

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Pflanzenart Herkunft

Atropa belladonna Botanischer Garten FAU, Erlangen

Calotropis procera www.rareplants.de

Gomphocarpus fruticosus www.rareplants.de

Erysimum crepidifolium www.rareplants.de

Erysimum rhaeticum www.rareplants.de

Arabidopsis thaliana LS Pharmazeutische Biologie, FAU

Digitalis lanata LS Pharmazeutische Biologie, FAU

Mentha x piperita LS Pharmazeutische Biologie, FAU

Solanum lycopersicon LS Biochemie, FAU

Solanum tuberosum LS Biochemie, FAU

Nicotiana tabacum LS Biochemie, FAU

Withania somnifera LS Pharmazeutische Biologie, FAU

Lunaria annua LS Pharmazeutische Biologie, FAU

Die Pflanzen wurden durch Dr. Walter Welß (Botanischer Garten, FAU) identifiziert.

II.1.4 Lösungen

II.1.4.1 Lösungen für die Molekularbiologie

Lösung Zusammensetzung

Ampicillin-Stammlösung (100 mg/mL) 100 mg Ampicillin-Natriumsulfatad 1000 µL Aquabidest

Carbenicillin-Stammlösung (50mg/mL) 50 mg Carbenicillin-Natriumsulfatad 1000 µL Aquabidest

Kanamycin-Stammlösung (25 mg/mL) 25 mg Kanamycinad 1000 µL Aquabidest

Antibiotika-Lösungen werden nach Herstellung steril filtriertund bei - 20 °C aufbewahrt

CaCl2-RL 60 mM CaCl2

15 % Glycerin10 mM PIPES

pH = 7,0 einstellen und autoklavieren

20

http://www.rareplants.de/

IPTG-Stammlösung (1M) 238,3 mg Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG)ad 1000 µL Aquabidest

Die Lösung wird steril filtriert und bei -20 °C aufbewahrt

X-Gal-Stammlösung 20 mg X-Galad 1000 µL Aquabidest

II.1.4.2 Lösungen für die Dünnschichtchromatographie


Fließmittel 7 VT Dichlormethan3 VT Ethylacetat

Anisaldehyd-RL (Jork, 1990) 2,5 mL Anisaldehyd50 mL Eisessig425 mL Methanol25 mL konz. Schwefelsäure

II.1.4.3 Lösungen für die Protein-Biochemie


Bradford-RL (Bradford, 1976) 100 mg Coomassie Brilliant Blue G2550 mL Ethanol (96%)100 mL o-Phosphorsäure (85%)ad 1000 mL Aquabidest

Coomassie-Färberlösung-RL 800 mg Coomassie Brilliant Blue R-250160 mL Methanol40 mL Eisessigad 400 mL Aquabidest

Coomassie-Entfärberlösung-RL 160 mL Methanol40 mL Eisessigad 400 mL Aquabidest

II.1.5 Puffer

II.1.5.1 Puffer für die Molekularbiologie

Bezeichnung Zusammensetzung

50 x TAE Puffer 2,0 M Tris/HCL1,0 M Natriumacetat50 mM EDTA

pH einstellen auf 7,5

21

10 x DNA-Stopppuffer 50 % Glycerol 0,1 % Bromphenolblau

II.1.5.2 Puffer für die native His-tag-Reinigung von rekombinanten Proteinen

Alle Puffer werden nach der Herstellung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt.

Bezeichnung Zusammensetzung

Nativer Lysepuffer 50 mM NaHPO4300 mM NaCl10 mM Imidazol

Nativer Waschpuffer 50 mM NaHPO4300 mM NaCl20 mM Imidazol

Nativer Elutionspuffer 50 mM NaHPO4300 mM NaCl250 mM Imidazol

II.1.5.3 Puffer für die Protein-Analytik und Enzymassays

Bezeichnung des Puffers Zusammensetzung

P5βR-Assaypuffer (Gärtner et al., 1990) 100 mM HEPES-KOH, pH 8,0250 mM Saccharose2 mM EDTAβ-Mercaptoethanol

3β-HSD-Assaypuffer (Finsterbusch et al., 1999) 20 mM NaPi, pH 7,8250 mM Saccharose10 mM Natriumascorbat

5 x SDS-Probenpuffer 225 mM Tris/HCl, pH 6,850 % Glycerol5 % SDS0,05 % Bromphenolblau250 mM DTT

SDS-PAGE Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl, pH 8,820 mL SDS 20 %ad 1000 mL Aquabidest

SDS-PAGE Sammelgelpuffer 0,5 mM Tris/HCl, pH 8,810 mL SDS 20 %ad 1000 mL Aquabidest

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SDS Elektrophoresepuffer 3,0 g TRIS14,4 g Glycin10 mL SDS 10% ad 1000 mL Aquabidest

Vor jedem Gebrauch frisch zubereiten!

II.1.6 Nährmedien

Nach der Herstellung der Medien entsprechend den Vorgaben mit Aquabidest, wird der pH-

Wert auf 7,5 eingestellt und die Lösung unmittelbar danach autoklaviert. Die optionale Zugabe von

Antibiotika-Lösungen erfolgt bei den Flüssigmedien unmittelbar vor Gebrauch unter aseptischen

Bedingungen.

Medium Zusammensetzung

LB-Medium 0,5% Hefeextrakt1% NaCl1% Trypton

pH-Wert einstellen auf 7,5 und autoklavieren

LB-Agar LB-Medium + 1,5% Agar

SOC-Medium 20 mM Glucose0.5% Hefeextrakt2,5 mM KCl10 mM MgSO4

10 mM NaCl2% Trypton

II.1.7 Bakterienstämme und Plasmide

Die Bakterienstämme werden in LB-Medium mit 50 % DMSO bei -20 °C gelagert.

Bakterien-Stamm Beschreibung Lieferant

E. coli BL21 (DE) F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) (Lucigen)E. coli M15 [pREP4] NalS, StrS, RifS, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-,

RacA+, Uvr+,Lon+ (KanR) (Qiagen)E. coli One Shot®TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15

ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galKrpsL (StrR) endA1 nupG (Invitrogen)

E. coli NEB5α fhuA2Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 E. coli HI-Control 10G mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC),endA1 recA1 Ø80dlac

ZΔM15, lacX74 araD139 Δ (ara,leu),7697 galU galKrpsL nupG λ- tonA /Mini-F laclq1(GentR) (Lucigen)

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Vektorkonstrukt Selektionsmarker Beschreibung bzw. Herkunft des rekombinanten Proteins

pCR®2.1-TOPO® Ampicillin/ TA-Klonierungsvektor (Invitrogen) Kanamycin

pCR/NtP5βR Referenz: diese Arbeit pCR/AbP5βR Referenz: diese Arbeit pCR/SlP5βR Referenz: diese Arbeit pCR/StP5βR Referenz: diese Arbeit pCR/WsP5βR Referenz: diese Arbeit pCR/LaP5βR Referenz: diese Arbeit

pEtiTe C-His Kanamycin Überexpression von rekombinantem Proteinmit C-terminalem His-Tag

pEtiTe / rDlP5βR Referenz: diese Arbeit pEtiTe / rDlP5βR-10 Referenz: diese Arbeit pEtiTe / rDlP5βR-20 Referenz: diese Arbeit pEtiTe / rDlP5βR-30 Referenz: diese Arbeit pEtiTe / rDlP5βR-40 Referenz: diese Arbeit

pQE-30 Ampicillin Überexpression von rekombinantem Proteinmit N-terminalem His-Tag (Qiagen)

pQE-30 / rAtP5βR Referenz: Herl et al., 2009 pQE-30 / rDlP5βR Referenz: Herl et al., 2006 pQE-30 / rDlP5βR Referenz: diese Arbeit (Mutante) pQE-30 UA Ampicillin Überexpression von rekombinantem Protein

mit N-terminalem His-Tag (Qiagen) pQE-30 UA / rAbP5βR Referenz: diese Arbeit pQE-30 UA / rEcP5βR Referenz: diese Arbeit pQE-30 UA / rErhP5βR Referenz: diese Arbeit pQE-30 UA / rGfP5βR Referenz: diese Arbeit pQE-30 UA / rMpP5βR Referenz: diese Arbeit pQE-30 UA/ rMpIPTR Referenz: diese Arbeit

pREP4 Kanamycin Hilfsplasmid für die Proteinexpression mit pQE-30 Vektoren in E. coli M15

pRARE2 Chloramphenicol Hilfsplasmid zur Expression seltener tRNAs inE. coli

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Abb. 4: Vektorkarten aller im Rahmen dieser Arbeit genutzten Klonierungs- und Expressionsvektoren.

II.1.8 Molekularbiologische Kits

Handelsname des Kits Vertreiber

Expresso T7 Cloning and Expression System Lucigen Corp., Middleton, WI, USA

innuPREPRNA Mini Kit Analytik Jena AG, Jena, D

peqGOLD® Plasmid Minipräp Kit I Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Phusion Site-directed Mutagenesis Kit New England Biolabs Inc., Ipswich, USA

QIAquick® Gel Extraktion Kit Quiagen GmbH, Hilden, D

QIAquick® Gel Purification Kit Quiagen GmbH, Hilden, D

SuperScriptTM III First-Strand Synthesis Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D

System for RT-PCR

TOPO TA Cloning® Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D

Die Nutzung der Kits erfolgte nach Angaben des Herstellers. Nähere Angaben finden sich unter II.2.

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II.1.9 Enzyme

Bezeichnung des Enzyms Herkunft

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, D

Lysozym AppliChem GmbH, Darmstadt, D

Pfu DNA Polymerase Dr. Christoph Rieck, LS Pharmazeutische

Biologie Uni Erlangen

Phusion(R) High-fidelity DNA Polymerase New England Biolabs Inc., Ipswich, USA

PeqGOLD Taq DNA Polymerase PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Restriktionsendonucleasen (DpnI, SalI, SphI,) Promega GmbH, Fermentas GmbH

Alle Enzyme werden bei – 20 °C aufbewahrt

II.1.10 Oligonukleotid-Primer

Alle Primer, die man zur Mutagenese und zur Klonierung von Genen benutzt, werden nach

Möglichkeit so konzipiert, dass sie eine Schmelztemperatur von ca. 53 °C und einen GC-Gehalt von

40 % besitzen. Ersteres soll gewährleisten, dass für alle Mutagenese-Experimente nur ein einziges

PCR-Programm notwendig ist. Bei den Mutagenese-Primern wird die geplante Fehlpaarung auf

beiden Seiten von mindestens 10 – 12 Basen flankiert, die komplementär an der Zielgensequenz

bindenden (Abb. 5):

Abb. 5: Design der Mutagenese-Primer am Beispiel des P5βR-Gens. Die rote Fehlpaarung muss sich in der Mitte des

Primers befinden und auf beiden Seiten von ca. 10-12 Nt flankiert werden, die komplementär an der Zielsequenz

binden (grün). Der Antisense-Primer (Primer 2, nicht in Abbildung sichtbar) ist revers-komplementär zu Primer 1.

Primer werden bei der Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) bestellt und ihre Konzentration

vor der PCR mit Aquabidest auf 20 µM eingestellt. Die Lagerung erfolgt in Aliquots nach Vorgaben

des Herstellers bei -20 °C. Die nachfolgende Tabelle gibt die Nukleotidsequenzen aller verwendeten

Primer wieder.

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Bezeichung Sequenz (5'-3')

A. thaliana P5βR Mutagenese-PrimerAt_F153A_F CTT GGC CCT GCC ACC AAC GTT G At_F153A_B CAA CGT TGG TGG CAG GGC CAA GAt_F343A_F GTG TGT GGT GGG CTG CTG ATG TTA TACAt_F153A_B GTA TAA CAT CAG CAG CCC ACC ACA CAC

E. crepidifolium P5βR Mutagenese-PrimerEc_L156V_F CTT TCA GCA ACG TGG ACG GAC CEc_L156V_B GGT CCG TCC ACG TTG CTG AAA GEcL156V_F2 CAG CAA CGT GGA CGG ACCEcL156V_B2 GGT CCG TCC ACG TTG CTGEc_T205M_F GGC CAA ACA TGA TCT TTG GEc_T205M_B CCA AAG ATC ATG TTT GGC C

E. rhaeticum P5βR Mutagenese-PrimerEr_T248M_F GAA GGC TTC ATG ACG GCT TCEr_T248M_B GAA GCC GTC ATG AAG CCT TCEr_L156V_F TTT CAG CAA CGT CGG CGG CGEr_L156V_B CGC CGC CGA CGT TGC TGA AAEr_I140V_F TCC GGC ACG TCT GTC TCC AGEr_I140V_B CTG GAG ACA GAC GTG CCG GAEr_T205M_F GAA TCC AAA GAT CAT GTT TGG TCEr_T205M_B GAC CAA ACA TGA TCT TTG GAT TCEr_N84D_F GAT GTC TCC GAC GCT GAA GAT GEr_N84D_B CAT CTT CAG CGT CGG AGA CAT CEr_S154E_F GGC CCT TTC GAG AAC CTC GGC Er_S154E_B GCC GAG GTT CTC GAA AGG GCC

D. lanata P5βR Mutagenese-PrimerT35G_fwd GAT AGT TGG GGT AGG GGA ATC ATC GGC AACT35G_rev GTT GCC GAT GAT TCC ACC TAC CCC AAC TAT CT35D_F GAT AGT TGG GGT AGA CGG AAT CAT CGG CT35D_R GCC GAT GAT TCC GTC TAC CCC AAC TAT CA62D_F GGT ATA CGG CGT CGA CCG CCG CAC CAG ACA62D_R GTC TGG TGC GGC GGT CGA CGC CGT ATA CCR63M_F GTA TAC GGC GTC GCC ATG CGC ACC AGA CCC GCR63M_R GCG GGT CTG GTG CGC ATG GCG ACG CCG TAT ACR63D_F GTA TAC GGC GTC GCC GAC CGC ACC AGA CCC GR63D_B CGG GTC TGG TGC GGT CGG CGA CGC CGT ATA C R63M_R64N_F GTA TAC GGC GTC GCC ATG AAC ACC AGA CCC GCC TGG CR63M_R64N_B GCC AGG CGG GTC TGG TGT TCA TGG CGA CGC CGT ATA C R63D_R64D_F GTA TAC GGC GTC GCC GAC GAC ACC AGA CCC GCC TGR63D_R64D_B CAG GCG GGT CTG GTG TCG TCG GCG ACG CCG TAT ACR64D_F CGG CGT CGC CCG CGA CAC CAG ACC CGC CTG R64D_B CAG GCG GGT CTG GTG TCG CGG GCG ACG CCGT65P_F GTC GCC CGC CGC CCG AGA CCC GCC TGT65P_R CAG GCG GGT CTC GGG CGG CGG GCG ACP85A_F CGA CAT ATC CGA TGC AGA TGA CTC CCP85A_R GGG AGT CAT CTG CAT CGG ATA TGT CGW106A_F GTT CTA CGT TAC CGC GGC TAA TCG ATCW106A_B GAT CGA TTA GCC GCG GTA ACG TAG AACG145A_F CAT TGC AGA CTG CTA GGA AGC ATT ACG145A_R GTA ATG CTT CCT AGC AGT CTG CAA TG

27

R146T_F CAT TGC AGA CTG GGA CTA AGC ATT ACA TGG GR146T_R CCC ATG TAA TGC TTA GTC CCA GTC TGC AAT GK147A2_F GAC TGG GAG GGC GCA TTA CAT GGK147A2_R CCA TGT AAT CGC CCC TCC CAG TCM15[0]L_F GAG GAA GCA TTA CCT GGG ACC ATT TGM15[0]L_R CAA ATG GTC CCA GGT AAT GCT TCC TCF153A_F CAT GGG ACC AGC TGA ATC CTA CGGF153A_R CCG TAG GAT TCA GCT GGT CCC ATG Y156V_F CCA TTT GAA TCC GTC GGG AAA ATA GAY156V_R TCT ATT TTC CCG ACG GAT TCA AAT GGD181T_L182Q_F CAT GAA CTT TTA CTA TAC TCA AGA GGA TAT TAT GCT TGA GGD181T_L182Q_R CCT CAA GCA TAA TAT CCT CTT GAG TAT AGT AAA AGT TCA TGG204N_F GTT CAT CGC CCA AAC AAT ATA TTC GGGG204N_R CCC GAA TAT ATT GTT TGG GCG ATG AACN205A_F CAT CGC CCA GGG GCT ATA TTC GGGN205A_B CCC GAA TAT AGC CCC TGG GCG ATG N205L_F GCC CAG GGC TGA TAT TCG GN205L_B CCG AAT ATC AGC CCT GGG CN205M_F CAT CGC CCA GGG ATG ATA TTC GGG TTT TCN205M_R GAA AAC CCG AAT ATC ATC CCT GGG CGA TGM213L_F CTC CAT ATA GTC TGA TGA ATT TGG TGG GM213L_R CCC ACC AA TTC ATC AGA CTA TAT GGA GM214A_F CCA TAT AGT ATG GCG AAT TTG GTG GGM214A_R CCC ACC AAA TTC GCC ATA CTA TAT GGS248M_F GGG ATG GGT ACA TGG ATT GCT CTGS248M_R CAG AGC AAT CCA TGT ACC CAT CCCS248Y_F GGG ATG GGT ACT ATG ATT GCT CTG ATGS248Y_B CAT CAG AGC AAT CAT AGT ACC CAT CCCY302F_F GGT GTG GAG AGT TTG AAG AAG GGGY302F_R CCC CTT CTT CAA ACT CTC CAC ACCF343A_F CGG AAT TTG GTG GGC TGG TGA TGT TAT ACF343A_R GTA TAA CAT CAC CAG CCC ACC AAA TTC CGV346A_fwd GTG GTT TGG TGA TGC TAT ACT TGG GAA TGV346A_rev CAT TCC CAA GTA TAG CAT CAC CAA ACC ACI347A_fwd GGT TTG GTG ATG TTG TCC TTG GGA ATG AGI347A_rev CTC ATT CCC AAG GAC AAC ATC ACC AAA CCN350V_fwd GTT ATA CTT GGG GTC GAG TGT TTC CTG GN350V_rev CCA GGA AAC ACT CGA CCC CAA GTA TAA CE351P_fwd GTT ATA CTT GGG AAT CCG TGT TTC CTG GAT AGE351P_rev CTA TCC AGG AAA CAC GGA TTC CCA AGT ATA ACC352G_F CTT GGG AAT GAG GGT TTC CTG GAT AGC352G_R CTA TCC AGG AAA CCC TCA TTC CCA AGC352M_F CTT GGG AAT GAG ATG TTC CTG GAT AGT ATGC352M_B CAT ACT ATC CAG GAA CAT CTC ATT CCC AAGF353M_F GGG AAT GAG TGT ATG CTG GAT AGT ATG AACF353M_R GTT CAT ACT ATC CAG CAT ACA CTC ATT CCCF353P_fwd GGG AAT GAG TGT CCG CTG GAT AGT ATGF353P_rev CAT ACT ATC CAG CGG ACA CTC ATT CCCPB_CS_1fwd GTA TAC GGC GTC GAC ATG AAC ACC AGA CCC GCC PB_CS_1rev GGC GGG TCT GGT GTT CAT GTC GAC GCC GTA TAC

Primer für Deletionsmutagenese der rDlP5βRMbdirGATE CAC CAT GAG YTG GTG GTG GGC TVH1188brev AAC CAT GTC AAG GAA CAA TCKR_pETite_rev_C GTG ATG GTG GTG ATG ATG AGG AAC AAT CTT GTA AGC TTT TGKR_pETite_dir_C GAA GGA GAT ATA CAT ATG AGC TGG TGG TGG GKR_Mut30_Rev CAT ATG TAT ATC TCC TTC TTA TAG TTA AACKR_Mut30_For ATA GTT GGG GTA ACC GG

28

Primer zur Klonierung von P5βR PB_Mp_rev GGC ACC ATY CTG TAN GCY AANtdir1 ATG AGC TGG TGG GCTNtrev1 CTA AGG AAC AAC TTT GTA GGCNtdirSac1 TAT AGA GCT CAT GAG GTG GTG GGC TGG NtrevHind3 TAT AAA GCT TCT AAG GAA CAA CTT TGT AGG CZmPORdir ATG AGC TTG AGC TGG TGG TGGZmPORrev TCA AGG AAT AAT CTT GTAPB_Rc_dir ATG AGC TGG TGG TGG CPB_Rc_rev TCA AGG CAC AAT CTT ATA CGA CTPB_MP_IPTR_fwd ATG GCA GAA GTA CAG AGG TAT GCPB_MP_IPTR_rev TTA ATA GAG AGC CAA AGC TTT GTC TCGGen_Dir ATG AGY TGG TGG TGG GCTGen_Rev AGG AAC AAT CTT GTA AGC CTTEry_Dir ATG AGT TGG TGG GGGErysalrev TAT AGT CGA CTG GAA ATC AAG GCA CGA TCTPB_Can_fwd ATG AGC TGG TGG TGGPB_Can_bwd GCA TAC Å ATT GTG CCT TGA

II.1.11 Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Firma

Amicon Ultra 10000 MWCO (UltracellTM) Millipore, Carrigtwohill, I

DC-Aluminium Platten, Kieselgel 60 F254 Merck KGaA, Darmstadt, D

Reaktionsgefäße 0,1; 0,5; 1,5 und 2 mL Sarstedt AG, Nümbrecht, D

PD-10 Colums (SephadexTM G-25M) Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg, D

Pipettenspitzen 10 µL, 100 µL, 1000 µL Sarstedt AG, Nümbrecht, D

Petrischalen, steril, Ø 8,5 cm Greiner GmbH, Frickenhausen, D

Spritzenvorsatzfilter, steril, 0,45 µm Membran Merck Labor, Bruchsal, D

UV/Vis-Küvetten Sarstedt AG, Nümbrecht, D

II.1.12 Geräte

Bezeichnung Firma

Autoklaven

Systec 5075 ELVC Systec GmbH, Wettenberg, D

Systec DE-45 Systec GmbH, Wettenberg, D

Brutschrank

Heraeus B 5050 Heraeus Holding GmbH, Hanau, D

DC-Kammer Desaga GmbH, Heidelberg, D

DC-Tauchkammer Desaga GmbH, Heidelberg, D

DC Workstation CAB UVIS Desage GmbH, Heidelberg, D

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Gaschromatographie

GCMS-QP2010S Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D

AOC-20i Auto Injector Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D

Agarose Gelkammer 40-1214 Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Heizblöcke

Digitaler Blockheizer HX-2 Peqlab GmbH, Erlangen, D

HPLC 2487 Dual λ Absorbance Detector Waters Corporation, Milford MA, USA

1525 Binary WPLC Pump Waters Corporation, Milford MA, USA

717plus Autosampler Waters Corporation, Milford MA, USA

Symmetry C18 5µL, 1,6 x 150 mm Col. Waters Corporation, Milford MA, USA

Inkubator G24 environmental incubator shaker New Brunswick, NJ, USA

Magnetrührer

REC-G Janke & Kunkel GmbH, Staufen, D

VMS – C7 VWR International, Darmstadt, D

Microprocessor pH-Meter pH 537 Wiss. Technische Werkstätten, Weilheim, D

Milli-Q Gradient A10 Millipore Corparate, Billerica MA, USA

Mikrowelle (MW 9716) Severin 700 & Grill Severin Elektrogeräte GmbH, Sundern, D

Photometer

GeneQuant pro Amersham Biosciences Europe GmBH,

Freiburg, D

NanoDrop® ND-1000 Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Novaspec Plus Amersham Bioscience Europe GmbH, Freiburg

Pipetten

peqpette, div. Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Gilson pipetman

Agarose- / Protein-Elektrophorese

peqPOWER 250 Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Schüttler

Infors HT Multitron Infors GmbH, Einsbach, D

Gerhardt R05 C. Gerhardt GmbH Co. KG, D

Sterilbank Meissner & Wurst GmbH, Stuttgart, D

Thermocycler

Thermocycler T3 Biometra GmbH, Göttingen, D

peqSTAR 96 Universal Gradient Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Thermomixer

30

Thermomixer comfort Eppendorf AG, Hamburg, D

Thermomixer compact Eppendorf AG, Hamburg, D

Thriller Thermomixer Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Ultraschallbad Sonorex Bandelin Ultraschall GmbH, Berlin, D

Ultraschall-Homogenisator Sonoplus, HD 2070 Bandelin Ultraschall GmbH, Berlin, D

UV-Photometer

UV2450 Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D

Temperature Control Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D

Vortex-Mischer

Vortex Genie® 2 G560 E neoLab Migge GmbH, Heidelberg, D

Vortex Mixer neoLab 7-2020 neoLab Migge GmbH, Heidelberg, D

Waagen

Kern EMB 220-2M Kern & Sohn GmbH, Baligen, D

Ohaus Pioneer PA114 Ohaus Corp. Pine Brook, NJ, USA

Wasserbad Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach, D

Zentrifugen

PerfectSpin 24R Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Kühlzentrifuge Sorvall RC 5B Plus Kendro Laboratory GmbH, München, D

II.1.13 DNA- und Proteinmarker

DNA-Marker Protein-Marker

Quick-Load(R) 1 kb DNA Ladder Precision Plus ProteinTM Standards (New England Biolabs, Frankfurt am Main, D) (BioRad GmbH, München, D)

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II.2. Methoden

II.2.1 Klonierung und Mutation von Genen

II.2.1.1 Isolierung von genomischer DNA (gDNA)

Die Methode zur Isolierung genomischer DNA aus Pflanzenmaterial beruht auf einem

Hinweis von E. Souza-Canada vom LS für Pflanzenphysiologie der Universität Bayreuth. 100 mg

frisches Blatt-Material wird mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und mit Mörser und Pistill

möglichst fein zerkleinert. Das Pulver wird noch im gefrorenen Zustand mit 1330 µL

vorgewärmtem Extraktionspuffer versetzt und 15 min bei 65 °C inkubiert. Nach einer Abkühlphase

von 1 min werden 650 µL Chloroform/Isoamylalkohol zugegeben und 5 min bei RT und 300 Upm

geschüttelt. Die beiden Phasen werden durch Zentrifugation (13000 Upm /5 min) getrennt, die

organische Phase wird verworfen. Durch Zugabe von 700 µL Isopropanol wird die gDNA bei RT

gefällt (2 min). Man zentrifugiert erneut bei 13500 Upm für 5 min und wäscht das Zellpellet mit 1

mL eiskaltem 70 %-igem EtOH. Nach dem Trocknen wird das DNA-Pellet in 100 µL Aquabidest

gelöst und die Konzentration bestimmt. Die Lösung wird bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

Optional kann nach der Chloroform-Extraktion ein RNase-Verdau durchgeführt werden.

II.2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA

Neben der gDNA war v.a. die pflanzliche RNA Ausgangspunkt für die Klonierung neuer

P5βR. Alle Arbeiten mit RNA werden auf Grund einer potentiellen Kontaminationsgefahr durch

RNasen mit speziell vorbehandelten Gerätschaften durchgeführt. Mörser, Pistille, Spatel werden für

mindestens 4 h bei 200 °C sterilisiert, die Verbrauchsmaterialien werden RNase-frei bezogen und

die Handschuhe regelmäßig nach jedem Arbeitsschritt gewechselt.

Zur Isolierung der Gesamt-RNA wird das innuPREP Plant RNA Mini Kit (Analytik Jena)

verwendet. Als Ausgangsmaterial der Gewinnung der RNA wird analog der Hersteller-Vorschrift

frisch geerntetes Blatt-Material eingesetzt, welches in flüssigem Stickstoff schockgefroren zu einem

feinen Pulver zerrieben wird. Bis zu 200 µg dieses Pulvers werden mit einem der beiden

mitgelieferten Puffer versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Bei der Arbeit mit

neuen Pflanzen zu denen keine Erfahrungswerte vorliegen, werden bei der erstmaligen RNA-

Isolierung jeweils beide im Kit enthaltenen Puffer (RL und PL) getestet. Die Gesamt-RNA wird

nach der Reinigung mit 30 µL RNase-freiem Wasser von der Säule eluiert und die Konzentration

bzw. Reinheit photometrisch bestimmt. Bis zum weiteren Gebrauch erfolgt die Lagerung bei - 80

°C.

32

II.2.1.3 Umschreiben von Poly(A)+-RNA in cDNA

Die Synthese der P5βR cDNA wird mit dem SuperScriptTM III First-Strand Synthesis for

reverse transcription PCR (RT-PCR) Kit (Invitrogen GmbH, Darmstadt) nach dem folgenden

Pipettierschema in einem Thermocycler mit Oligo(dT)20-Primern durchgeführt:

1. Denaturierung RNA 5 µgPrimer 50 µMdNTPs-Mix je 250 µMDEPC-Wasser ad 10 µL

65 °C, 5 min

2. Inkubation 0 °C (auf Eis), 1 min

3. RT-Reaktion Zugabe von 10 µL cDNA-Synthese-Mix

RT-Puffer (10x) 1x1 MgCl2 5 mM1 DTT 10 mM1 RnaseOUTTM 40 USuperScriptTM III RT 200 U

1 Endkonzentration in 20 µL50 °C, 50 min

4. Termination 85 °C, 5 min

5. RNase-Verdau Zugabe von 2 U RNase H37 °C, 20 min

2 µL der synthetisierten cDNA werden als Template für eine PCR mit genspezifischen P5βR

Primern eingesetzt. Die restliche cDNA wird bei -20 °C gelagert.

II.2.1.4 Standard-/RT-PCR

Die Vermehrung von bestimmten gDNA- und cDNA-Fragmenten erfolgt mit Hilfe der

Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bei der Klonierung von unbekannten, orthologen Progesteron-5-

Reduktasen werden hierbei genspezifische Primer der am nächsten verwandten Art verwendet.

Folgender PCR-Ansatz wird auf Eis pipettiert:

Standard-PCR / RT-PCRAnsatz Template/cDNA 2 ng

Antisense-/Senseprimer je 1 µMdNTP-Mix 50 mM

Y- Puffer (10x) 5 µLTaq-DNA-Polymerase 2 UAquabidest ad 50 µL

33

PCR Programm Initiale Denaturierung 94 °C 3 min Denaturierung 94 °C 20 sek Annealing 50 °C 30 sek

Elongation 72 °C 2 min Finale Elongation 72 °C 10 min

II.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese

Das bei einer PCR erhaltene DNA-Amplifikat und Plasmide, die mit

Restriktionsendonukleasen geschnitten wurden, werden zur Kontrolle mittels Agarose-

Gelelektrophorese in einzelne DNA-Fragmente aufgetrennt und analysiert. Für alle Banden

zwischen 0,5 und 7 kb wird ein 1 %-iges Gel eingesetzt. 5 g Agarose werden abgewogen und in 500

mL 1 x TAE Puffer suspendiert. Die Suspension wird in der Mikrowelle erhitzt bis eine homogene,

klare Lösung entstanden ist. Man wartet bis diese auf etwa 50-60 °C abgekühlt ist und gießt dann

ein Gel.

Die zu untersuchende DNA-Lösung wird mit 0,1 VT 10 x DNA-Stopppuffer versetzt und

nach dem Auspolymerisieren des Gels mit einer Pipette in die Geltaschen transferiert. Als Referenz

werden parallel 5 µl SmartLadder (Eurogentec) DNA-Marker (1 kb oder 0,5 kb) aufgetragen.

Überschüssige Agarose-Lösung wird bis zu ihrer Verwendung im Trockenschrank bei 60°C

aufbewahrt. Die elektrophoretische Trennung der DNA erfolgt bei einer konstanten Spannung von

70 V. Das Gel wird anschließend für 20 min in einer 0,1%-igen Ethidiumbromidlösung inkubiert.

Die Auswertung und Dokumentation des Ergebnisses erfolgt bei einer Wellenlänge von

λ = 305 nm.

II.2.1.6 Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gelen („freeze'N squeeze“)

Durch Ethidiumbromid-Interkalation sichtbar gemachte DNA-Fragmente gewünschter

Größe werden von störenden Begleitbanden im Anschluss an eine Agarose-Gelelektrophorese unter

UV-Licht (λ = 365 nm; Intensität = 70 %) mittels Skalpell zügig aus dem Gel geschnitten. Das

extrahierte Gel-Fragment wird in Parafilm gewickelt und bei -80°C für 10 min bis zur völligen

Erhärtung eingefroren. Anschließend wird durch mechanischen Druck der Finger die Flüssigkeit

inklusive der darin enthaltenen DNA aus diesem gefrorenen Gelstück in ein 1,5 mL Eppendorf-

Gefäß gepresst.

Die wässrige DNA-Lösung wird mit 0,75 VT Isopropanol (bzw. 2 VT Ethanol) versetzt und

gut gemischt. Diese Mischung wird zur Präzipitation der Nucleinsäuren zunächst für 15 min bei -20

°C belassen und daraufhin für 30 min bei 4 °C und 13000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird

34

x 30 Zyklen

verworfen und das DNA-Pellet mit eiskaltem 70 %-igem Ethanol gewaschen. Nach einem weiteren

5-minütigen Zentrifugationsschritt wird der Überstand komplett entfernt. Das Pellet wird bei 40 °C

im Heizblock für 10 min getrocknet und je nach Anfangskonzentration der DNA vor der Gel-

Elektrophorese in der gewünschten Menge Aquabidest gelöst. Die DNA-Lösung wird bis zum

Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt.

II.2.1.7 Konzentrierung und Reinigung von PCR-Produkten

Die Reinigung und Konzentrierung von amplifizierter DNA aus PCR-Reaktionen erfolgt mit

dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Abhängig von der Konzentration der DNA werden

1-4 PCR Ansätze über dieselbe Säule gereinigt, um die Konzentration des gereinigten Produkts zu

erhöhen. Es wird nach der Vorschrift des Herstellers weitergearbeitet (QIAquick® Spine Handbook,

Version 2002) und mit 30 - 50 µL Aquabidest eluiert. Die Aufbewahrung erfolgt bei -20 °C.

II.2.1.8 pQE30-UA- / TOPO-TA-Klonierung

Das Vorgehen bei der direkten Klonierung von gereinigten PCR-Produkten in den pQE-30

UA-Expressionsvektor erfolgt nach dem Protokoll 1 (Ligation with pQE30 UA) des

QIAexpressionistTM (Stand Juni 2003). Die direkte Klonierung in den TOPO-TA-Vektor

(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) erfolgt nach Anleitung des Herstellers (Version U, Stand 2006).

Für beide Methoden sind weder Restriktionsverdau noch Ligase notwendig, allerdings muss in der

vorangehenden PCR taq-Polymerase genutzt werden, damit PCR-Produkte mit 5'-A-Überhängen

vorhanden sind.

Für die Ligation in den pQE30-UA Vektor wird ein molekulares Vektor:Insert-Verhältnis von 1:10

gewählt. Bei den P5βR-Genen entspricht dies etwa 200 ng gereinigtem PCR-Produkt. Die

Reaktionsansätze setzen sich wie folgt zusammen:

pQE30-UA-Klonierung pQE-30 UA Vektor (50 ng/µL) 1 µL

gereinigtes PCR Produkt 1-4 µL (200 ng)

2 x Ligation Master Mix 5 µL

Aquabidest ad 5 µL

Der Ligationsansatz wird für 2 h bei 16 °C im Thermoblock belassen und anschließend in

chemisch kompetente E. coli Zellen transformiert.

TOPO-TA Klonierung pCR 2.1-TOPO Vektor 1 µL

Gereinigtes PCR-Produkt 2 - 4 µL

Salzlösung 1 µL

Aquabidest ad 6 µL

35

II.2.1.9 Herstellung von kompetenten E. coli Zellen

Die Transformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen stellt einen notwendigen Schritt

für die Vermehrung von DNA oder die Expression von rekombinanten Proteinen dar. Voraussetzung

hierfür ist, dass die verschiedenen E. coli Laborstämme zunächst so behandelt werden, dass sie

chemisch kompetent werden. Es wird auf die Calciumchlorid-Methode nach Mülhardt (2008)

zurückgegriffen: 1 mL einer Übernachtkultur des Bakterienstamms wird in 400 mL LB-Medium

überführt und bis zu einer OD595 von 0,6 in einem Schikane-Kolben bei 37 °C und 200 Upm

inkubiert. Anschließend wird die Kultur auf Eis abgekühlt und bei 4 °C und 4000 Upm

abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 100 mL CaCl2 RL resuspendiert. Es

wird erneut zentrifugiert, resuspendiert und zentrifugiert. Das Pellet wird nach diesen

Waschschritten in 10 mL CaCl2 RL resuspendiert und unter der Impfbank steril zu je 100 µL

Portionen aliquotiert. Die Aufbewahrung erfolgt bei - 80 °C.

II.2.1.10 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli

Die Transformation von Plasmid-DNA in kompetente Zellen dient deren Vermehrung oder

Lagerung. Hierzu werden chemisch kompetente Zellen 5 min auf Eis aufgetaut, 1 ng eines Plasmids

(bzw. 5 µL eines durchschnittlichen Mutations- oder Ligationsansatzes) zugegeben und sehr

vorsichtig gemischt. Man lässt die Mischung für 30 min auf Eis stehen und platziert sie

anschließend für 30 s bei 42 °C in einen Thermoblock. Nach diesem Hitzeschock werden 100 µL

SOC-Medium zugegeben und der komplette Ansatz auf einer vortemperierten, antibiotikahaltigen

Agar-Platte mit einer sterilen Pipettenspitze ausplattiert. Die Wahl des Antibiotikums richtet sich

nach dem neu in die Bakterienzelle eingeführten Resistenz-Gen. Die Platte wird über Nacht bei 37

°C inkubiert. Sind am nächsten Tag Bakterien-Kolonien sichtbar, werden sie mit einem sterilen

Zahnstocher in eine 3 mL LB-Kultur überführt.

II.2.1.11 Colony-PCR

Bei der Colony-PCR handelt es sich um eine Modifikation der Standard-PCR-Methode (Van

Zeijl et al., 1998). Während diese allerdings zur Vermehrung von P5βR-Genen zum Zwecke der

Klonierung Anwendung findet, wird die Colony-PCR genutzt um Bakterienkolonien zu

identifizieren, bei denen die Aufnahme eines Klonierungs- oder Expressionsplasmides mit dem

gewünschten ORF erfolgreich stattgefunden hat. Je nach Anzahl der zu untersuchenden Kolonien

wird der folgende PCR-Mastermix vorbereitet und in einem PCR-Gefäß vorgelegt:

36

Ansatz Insertspezifische Primer je 1µMY-Buffer (10x) 2,5 µLTaq-DNA Polymerase 0.5 UdNTPs-Mix 50 mM H20bidest ad 25 µL

Statt einer Template-DNA wird eine Bakterienkolonie mit einem sterilen Zahnstocher

aufgenommen und im vorbereitetem PCR-Mix steril unter Laminar-Flow suspendiert. Der

Zahnstocher mit den Resten der Kolonie wird in 3 mL LB-Medium überführt (Inkubation über

Nacht bei 37 °C und 180 Upm). Die PCR-Programm für die Colony-PCR für alle P5βR ist:

Colony-PCR Programm Initiale Denaturierung 94 °C 10 min Denaturierung 94 °C 20 sek Annealing 50 °C 30 sek

Elongation 72 °C 2 min Finale Elongation 72 °C 10 min

Die Identifizierung der positiven Klone erfolgt nach Agarose-Gelelektrophorese der PCR-

Ansätze.

II.2.1.12 Blau-Weiß-Selektion

Um E. coli Klone, die ein TOPO-Plasmid mit erfolgreich in das lacZ'-Gen integriertem

PCR-Produkt besitzen, zu identifizieren, wird die Blau-Weiss-Selektion angewendet. Man verteilt

50 µL X-Gal-Lösung unter sterilen Bedingungen auf einer Agar-Platte und wartet bis diese völlig

getrocknet ist. Die frisch transformierte Bakterien-Suspension wird auf der so vorbereiteten Platte

ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bakterien-Kolonien, die Plasmide mit Insert

aufgenommen haben, zeichnen sich am nächsten Morgen durch eine weiße Färbung aus. Nur diese

werden weiter untersucht.

II.2.1.13 Mutagenese-PCR

Zum ortsgerichteten Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren wird eine modifizierte

Stratagene QuikchangeTM Methode (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) verwendet. Die Primer

werden so konzipiert, wie es unter II.1.10 beschrieben wurde. Der 25 µL PCR-Ansatz wird zunächst

halbiert, wobei jede Hälfte nur einen der beiden komplementären Primer enthält. Für die

Mutagenese ist eine high-fidelity DNA-Polymerase ohne 5'-3'-Exonuclease-Funktion (Phusion- oder

pfu-DNA-Polymerase) obligatorisch:

37

x 30 Zyklen

PCR-Ansatz Template DNA 2 ng / µLSense-/Antisense-Primer je 1 µMdNTP-Mix 50 µMPhusion-DNA-Polymerase 2,5 UH20bidest ad 25 µl

PCR-Programm 1 Denaturierung 98 °C 1 minDenaturierung 98 °C 20 sekAnnealing 50-55 °C 30 sekElongation 72 °C 1 min Pause

Nach 5 Zyklen werden beide Teile ad 25 µL vereint und für weitere 30 Zyklen in den

Thermozykler gegeben. Die Annealingtemperatur kann hierbei aus Gründen der Ausbeute unter

Umständen auf 50 °C gesenkt werden.

PCR-Programm 2 Denaturierung 98 °C 1 min Denaturierung 98 °C 20 sekAnnealing 50 °C 30 sekElongation 72 °C 1 minFinale Elongation 72 °C 5 min

Das Ergebnis der PCR-Reaktion wird über 1 %-ige Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.

Um die Template-DNA zu zerstören folgt ein DpnI-Restriktionsverdau.

II.2.1.14 Plasmid-Isolierung

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen erfolgt unter Verwendung des

peqGOLD Plasmid Minipräp Kit I (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) mit

leichten Modifikationen der Hersteller-Vorschriften (Protokoll A). Je nach erwarteter DNA-

Ausbeute, die sich aus den Erfahrungswerten für die Kombination von bestimmten Plasmiden mit

bestimmten Bakterienstämmen ergibt, werden 2 - 4 mL einer LB-Übernachtkultur eingesetzt. Nach

Zugabe der Lösung III wird das Präzipitat für 30-45 min bei 13500 Upm zentrifugiert, um eine

bessere Abtrennung von unerwünschten Nicht-Plasmidbestandteilen zu erreichen. Die

Konzentration und Reinheit der in 50 µL Aquabidest eluierten DNA wird photometrisch bestimmt. Die

DNA-Lösung wird bei -20 °C aufbewahrt.

II.2.1.15 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von RNA und DNA

Die Qualität und Quantität von wässrigen DNA- und RNA-Lösungen werden photometrisch

mit einem NANODROP ND-2000 Spektrophotometer ermittelt. Der Nullabgleich des Geräts wird

38

5 Zyklen

30 Zyklen

mit Aquabidest oder Elutionspuffer durchgeführt. 1 µL der Lösung wird auf das Messsystem

aufgebracht und die Konzentration über die Absorption der DNA-Bestandteile bei einer

Wellenlänge von λ=260 nm bestimmt. Die Reinheit der Analyse ergibt sich aus dem Quotienten R

und dem Vergleich mit den theoretischen Sollwerten (Lottspeich und Zorbas, 2006).

R = A260 / A280 (SollwertDNA = 1,8; SollwertRNA = 2,0)

II.2.1.16 DNA-Sequenzierung

Plasmide mit putativ mutiertem P5βR-Gen oder eingebautem PCR-Produkt werden zur

endgültigen Verifizierung der erfolgreichen Klonierung zur Sequenzierung nach Sanger an die

Firma GATC Biotech AG (Konstanz, Deutschland) oder Eurofins MWG Operon (Ebersberg,

Deutschland) geschickt. Die Plasmid-Konzentration muss hierzu im Bereich zwischen 20 – 100

ng/µL liegen und der Reinheitsquotient möglichst nahe bei 1,8 sein. Von den Firmen gelieferte

Ergebnisse werden bioinformatisch, u.a. mit Hilfe von Alignment- und BLASTn-Algorithmen,

analysiert.

II.2.1.17 Langzeit-Lagerung von Bakterienstämmen

Alle E. coli Stämme mit erfolgreich aufgenommenen Plasmiden werden in Form von

Glycerol- oder DMSO-Stocks in eine haltbare Dauerkultur überführt. Dazu wird 1 mL frische

Bakterienkultur mit 1 mL Glycerol oder 1 mL DMSO versetzt und intensiv gemischt. Diese

Glycerol-/DMSO-Stocks können bei – 80 °C über Jahre aufbewahrt werden (Mühlhardt, 2009). Mit

20 µL dieser Lösung werden bei einer erneuten Inkulturnahme 3 mL sterile LB-Kulturen

angeimpft.

II.2.1.18 DpnI-Verdau

Zur selektiven Entfernung von methylierter DNA (z.B. PCR-Templates) wurde ein 25 µL-PCR-

Ansatz mit 2 µL Enzym (= 20 U) über 2 h bei 37 °C verdaut.

39

II.2.2 Heterologe Protein-Expression in E. coli

II.2.2.1 Kultivierung von E. coli M15[pREP4] und Induktion der Proteinexpression

Eine 20 mL LB-Kultur wird mit 20 µL eines E. coli M15[pREP4] DMSO-Stocks, der das pQE-30

Vektorkonstrukt für die Produktion des gewünschten rekombinanten Proteins beinhaltet, unter

sterilen Bedingungen angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Um den Selektionsdruck

aufrecht zu erhalten, werden dieser LB-Vorkultur und der späteren LB-Hauptkultur Kanamycin (25

µg/mL) und Ampicillin (100 µg/mL) zugesetzt.

Die komplette Vorkultur wird am folgenden Tag in 1000 mL vorgewärmtes, autoklaviertes LB-

Medium (Schikane-Kolben) überführt und bei 37 °C / 180 Upm auf einem Schüttler bis zu einer

OD600 von 0,7 kultiviert. Anschließend erfolgt die Induktion der Proteinexpression mit 100 µL einer

1M IPTG-Lösung. Die Kulturen werden für 96 h bei 4 °C / 100 Upm geschüttelt.

Das Ernten der Kulturen erfolgt durch Zentrifugation bei 4 °C und 4500 Upm. Aus 1000 mL Kultur

werden zwei Zellpellets gewonnen, die bis zu ihrer Verwendung bei -20 °C aufbewahrt werden

können.

II.2.2.2 Zell-Lyse und native His-tag-Affinitätschromatographie

Alle Arbeitsschritte, vom Ernten der Bakterienkulturen bis zur Aufreinigung des

rekombinanten Proteins, werden bei 4 °C durchgeführt. Schockgefrorende Zellpellets werden vor

der Verarbeitung 30 min aufgetaut. Zwei aus je 500 mL derselben Bakterienkultur gewonnenen

Bakterienpellets werden jeweils in 5 - 10 mL einer Mischung aus Lysepuffer und Lysozym (1

mg/mL) redispergiert und die Suspension für 30 min inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeitspanne

werden die Zellen durch eine Ultraschall-Behandlung aufgeschlossen (Sonoplus; 6 10-s-Intervalle

mit einer Zwischenpause von jeweils 10 s). Mittels Zentrifugation wird das lösliche Protein von

unerwünschten Abfallprodukten abgetrennt (20.000 Upm; 15 min). Der Überstand wird

portionsweise auf eine Ni-NTA-Säule aufgebracht, für 60 min bei 300 Upm geschüttelt und die

Aufreinigung des nativen Proteins entsprechend dem Protokoll Nr. 12 des „The QIAexpressionist“-

Handbuchs (Auflage Juni 2003) durchgeführt. Das rekombinante Protein wird mit 1 x 1 mL und 3 x

0,5 mL von der Säule eluiert. Gegebenenfalls werden Proben für die SDS-Analytik bzw. die

Gehaltsbestimmung entnommen.

40

II.2.3 Proteinbiochemische Methoden

II.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinen

Zur Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration wird auf die von Bradford (1976)

beschriebene Methode zurückgegriffen. Unter Rühren wird 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250

in einer Mischung aus 50 mL Ethanol 96 % und 100 mL o-Phosphorsäure 85 % gelöst. Mit Aquabidest

wird daraufhin auf 1000 mL aufgefüllt und filtriert. Der Faktor der erhaltenen Bradford-RL wird

über eine Eichgrade mittels verschiedener Konzentrationen von Rinderserumalbumin abgeleitet.

20 µL der zu bestimmenden Lösung werden mit 2 mL der Bradford-RL versetzt und für 10

min bei RT inkubiert. In dieser Zeit wird mehrfach auf- und abpipettiert, um die Mischungen

vollständig zu homogenisieren. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird die Intensität des blauen

Farbstoff-Proteinkomplexes gegen eine parallel bearbeitete Negativkontrolle, bestehend aus

Pufferlösung ohne Protein und Bradford-RL, photometrisch bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm

bestimmt. Die Konzentration der Protein-Lösung berechnet sich wie folgt:

Proteinkonzentration [mg/mL] =

II.2.3.2 Umpuffern von Proteinproben

Zum Abtrennen von eventuellen niedermolekularen Verunreinigungen vor der

Durchführung von P5βR-Assays und für Kristallisationsversuche wird das Protein mittels PD-10

Säulen (SephadexTM G-25M) aus dem Elutionspuffer in den entsprechenden Zielpuffer überführt

(z.B. P5βR-Assaypuffer). Die Säule wird hierzu erst mit 3 x 3 mL des Zielpuffers äquilibriert, bevor

2,5 mL Proteinlösung aufgebracht werden können. Der Durchfluss wird verworfen und das

rekombinante Protein mit 3,5 mL Zielpuffer von der Säule eluiert. Die Proteinlösung wird entweder

bis zur zeitnahen Verwendung bei -4 °C gelagert oder nach Zugabe von 5 % Glycerol bei -20 °C

eingefroren.

II.2.3.3 Konzentrierung von Proteinlösungen

Zur Einkonzentrierung von Proteinlösungen mit niedrigem Proteingehalt werden Amicon

Ultra 10000 MWCO Säulen entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet.

II.2.3.4 SDS-PAGE

Die Überprüfung der Proteinexpression geschieht durch die Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Die Molekulargewichtsbestimmung der gereinigten Proteine

erfolgt über den Vergleich mit einem Molekulargewichtsmarker (II.1.13).

41

Durchschnittlich gemessene Extinktion595

x Faktor

Volumen der Probenlösung [ = 20 µL]

Sämtliche Utensilien werden vor Verwendung mit 70 %-igem Ethanol gereinigt. Der

Zusammenbau der Gießapparatur erfolgt nach Herstellerangaben. Als erstes werden Trenn- und

Sammelgel in separaten Gefäßen vorbereitet:

Bestandteil Trenngel Sammelgel

Acrylamid 30 % 1600 µL 330 µL4 x Trenngelpuffer 1000 µL -4 x Sammelgelpuffer - 500 µL Aquabidest 1400 µL 1170 µLTEMED 3 µL 3 µLAPS 25 µL 25 µL

Das Trenngel wird gegossen und mit 0,1%-iger SDS-Lösung überschichtet. Diese Lösung

wird, nachdem die Polymerisation vollständig abgelaufen ist, wieder entfernt. Daraufhin wird das

Sammelgel gegossen und der Kamm zur Aussparung der Geltaschen eingesetzt. Das fertige SDS-

Gel wird in die Elektrophorese-Apparatur eingesetzt, die zunächst im Innen- und darauf im

Außenraum mit Elektrophoresepuffer befüllt wird. Anschließend wird der Kamm gezogen und die

Geltaschen mehrfach mit Pufferlösung gespült, um eventuelle Gelreste zu entfernen.

16 µL Proteinprobe werden mit 4 µL 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 100

°C hitzedenaturiert. Nach dem Abkühlen wird kurz zentrifugiert und die Geltaschen werden mit

jeweils 20 µL der vorbereiteten Proben beladen. Pro Gel werden 5 µL Marker (Precision Plus

Protein Standards) eingesetzt.

Der Elektrophese-Lauf erfolgt zweiphasig: Bis zum Erreichen des Trenngels (ca. 20 min)

wird eine Spannung von 70 V angelegt, die dann für die restliche Zeit (ca. 90 min) auf 200 V erhöht

wird. Die Detektion der Proteinbanden erfolgt durch Anfärbung mit Coomassie brilliant blue (siehe

II.2.3.5).

II.2.3.5 Proteinfärbung mit Coomassie brilliant blue

SDS-Gele werden nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proben für 1 h unter

Schütteln in 100 mL Coomassie-Färber-RL inkubiert. Anschließend wird das vollständig gefärbte

Gel portionsweise mit jeweils 100 mL Coomassie-Entfärber-RL solange unter Schütteln entfärbt,

bis die Proteinbanden deutlich sichtbar werden. Die Gele werden dokumentiert. Soll ein Gel

aufbewahrt werden, wäscht man es 5 min mit Aquabidest und schweißt es dann wasserdicht in Folie

ein.

42

II.2.3.6 Standard-Enzymassays für rP5βR

Die Funktionalität der gereinigten rP5βR wird mittels Standard-Enzymassay bestimmt.

Dieser geht zurück auf Stuhllemmer und Kreis (1996) bzw. in abgewandelter Form auf Herl et al.

(2006 und 2009): Unmittelbar nach der nativen His-tag-Reinigung wird das Protein in P5βR-

Reduktase-Assaypuffer überführt und die Konzentration der Lösung bestimmt. Pro Enzym-Assay

werden i.d.R. 0,2 mg Protein eingesetzt. Nur bei stark aktiven Proteinen (rMpP5βR und rAtP5βR

bzw. bestimmt rDlP5βR-Muteine) wurde diese Enzym-Menge reduziert, um einen Substrat-

Überschuss zu gewährleisten. Jeder P5βR-Assay setzt sich wie folgt zusammen:

P5βR-Assay Rekombinantes Enzym 0,2 mgProgesteron-Lösung (50 mM in EtOH 96 %) 10 µLRegenerierendes System (in P5βR-Assaypuffer) 45 µL

NADP+ (6,4 mM EK)Glucose-6-phosphat (3,1 mM EK)Glucose-6-phosphat-Dehyrogenase (42 nkat)

P5βR-Assaypuffer ad 1000 µL

Das regenerierende System wird immer frisch hergestellt. Der fertige Ansatz wird vor der

Substrat-Zugabe (Progesteron) für 10 min bei 30 °C und 550 Upm vorinkubiert. Mit der Zugabe

beginnt der eigentliche Assay, der für 2 h bei 30 °C durchgeführt wird. Die Negativkontrolle erfolgt

mit hitzedenaturiertem Protein (Wasserbad 100 °C, 10 min bzw. Mikrowelle 700 Watt, 30 s) in

analoger Weise.

Nach Ablauf der Reaktionszeit werden die Proben auf Eis gestellt, jeweils 1 mL

Dichlormethan zugesetzt und für 30 s gevortext. Die Phasen werden durch Zentrifugation (5 min,

13500 Upm) getrennt. Die untere (organische) Phase mit den extrahierten Produkten und Edukten

wird abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Für eine nachfolgende GC-MS-Analytik wird der

Rückstand in 100 µL Dichlormethan gelöst. Für die Dünnschichtchromatographie erfolgt dies

analog in 50 µL Methanol.

II.2.4 Spezielle analytische Methoden

II.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC)

Die DC-Analytik wird zur qualitativen Kontrolle der Standard-Enyzmassays verwendet.

Hierzu werden auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 60 F254) geeigneter Größe jeweils 50 µL der

Proben und als Referenzen jeweils 10 µL der Edukte und Produkte der Reaktion (Konz. 50 mM)

mittels einer Kapillare strichförmig aufgetragen. Die DC-Kammer wird vor Verwendung mit der

mobilen Phase (vgl. Fließmittel) gesättigt. Die Laufhöhe beträgt ca. 12 cm. Die Detektion der

43

Substanzen erfolgt mittels Anisaldehyd-RL. Die DC-Platte wird nach Beendigung des Laufs

zwischengetrocknet und kurz in die RL getaucht. Im Anschluss wird sie bis zum Erscheinen der

Banden auf einer 100 °C heißen Heizplatte belassen. Die Auswertung und Dokumentation erfolgt

an der DC Workstation CAB UVIS (Desaga) bei Tageslicht.

II.2.4.2 GC-MS Analytik

Sowohl zur qualitativen Kontrolle der Standard-Enzymassays, als auch zur Quantifizierung

von relativen Enzymaktivitäten, findet die GC-MS Analytik Verwendung. 1-2 µL der Probe werden

mit einer GC HP 6890 MSD Type 5972A (Hewlett-Packard) unter den folgenden Bedingungen

untersucht:

Trägergas HeliumSäule / Stationäre Phase Kapillarsäule HP Optima 5Einlasstemperatur 300 °CSolvent Delay 4 minMessmodus full-scan (m/z = 50 – 600)Transferline-Temperatur 300 °CTemperaturprogramm Dauer Starttemperatur Endtemperatur Aufheizrate

[min] [°C] [°C] [°C/min] 4 200 200 - - 200 300 4 6 300 300 -

Die Produkte der Reaktion werden anhand des Vergleichs ihrer Rf-Werte mit denen der

Standards und über ihre individuellen Zerfallsspektren im Massenspektrometer eindeutig

identifiziert. Die Flächen unter den jeweiligen Kurven (AUC) werden mittels der Gerätesoftware

integriert. Relative Enzymaktivitäten berechnet man nach:

X = AUCProdukt / (AUCProdukt + AUCEdukt)

Relative Aktivität [%] = (XMutante / XWildtyp) x 100

II.2.4.3 Photometrische Analytik

Kinetische Untersuchungen der Enzymaktivität der rP5βR erfolgen photometrisch über die

Abnahme der Extinktion des Cobsubstrats NADPH (λ=340 nm), das während der Reaktion

verbraucht wird. Je nach Aktivität des Proteins werden pro Assay zwischen 0.025 und 0.2 mg

Protein eingesetzt:

44

Ansatz 1 Rekombinantes Protein 0.025 – 0.2 mg

NADPH 0,4 mM

DMSO 40 µL


Der Ansatz wird für 2 min bei der Reaktionstemperatur (30-40 °C) vorinkubiert. Die

Reaktion wird durch Zugabe von 10 µl Substratlösung (0,05 – 0,6 mM) gestartet. Die Messzeit

beträgt 200 s. Die Berechnung der kinetischen Konstanten (Km und vmax) erfolgt über die Steigung

der resultierenden Kurve mit der SHIMADZU UVProbe Software (Kinetik Modul) nach der Hanes-

Methode (Hanes, 1935).

Die resultierenden vmax-Werte werden in mkat/kg (= nkat/mg) angegeben:

vmax [mkat/kg] = 16,67 x vmax [U/mg]

Aus diesen werden die Kcat-Werte (s-1) berechnet:

kcat [s-1] = Enzym-Menge pro mg [nmol] / vmax [nkat/mg]

Hieraus ergibt sich katalytische Spezifität mit:

Katalytische Spezifität [M-1s-1] = kcat [s-1] / Km [M]

Die Bestimmung der kinetischen Konstanten für das Cosubstrat (NADH bzw. NADPH)

erfolgt abweichend hiervon in Gegenwart eines 2-Cyclohexen-1-on-Überschusses nach folgendem

Ansatz:

Ansatz 2 Rekombinantes Protein 0.0125 – 0.05 mg2-Cyclohexen-1-on 2 mM

DMSO 40 µL


Die Reaktion wird in diesem Fall durch die Zugabe von 10 µL Cosubstrat (0,05 - 0,5 mM

EK) gestartet. Die übrigen Reaktionsbedingungen bleiben erhalten.

45

II.2.5 Darstellung von Proteinstrukturen und in silico-Methoden

Für die Beantwortung von bioinformatischen Fragestellungen in der modernen

molekularbiologischen Forschung finden eine Vielzahl von Programmen Anwendung. Im Rahmen

dieser Arbeit kamen folgende Software zum Einsatz:

Anwendungsgebiet Programm(e)

Protein- und Nucleinsäure-Alignments ClustalW (www.bi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)Bioedit

Design und Analyse von PCR Primern ID Integrated DNA Technologie; Oligoanalyser(www.idtdna.com/analyzer/Applications/)

Planung von Plasmid-Restriktionen / PlasmaDNA-LigationenPCR Simulation FastPCR (primerdigital.com/fastpcr.html)

3d Liganden-Erstellung ACD Chemsketch

Visualisierung und Bearbeitung Pymolvon Proteinstrukturen Swiss PDB Viewer / DeepView

Wincoot 7.1

Suche nach verwandten Proteinstrukturen VAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/)

Docking ArgusLab, Autodock

Berechnung von Proteineigenschaften ExPasY ProtParam Tool (www.expasy.org)

Translation von Nucleotidsequenzen ExPasY Translate Tool (www.expasy.org)

Suche nach orthologen und paralogen BlastN, BlastP (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)Genen/Proteinen

Homologie-Modellierung SwissModel (www.swissmodel.expasy.org)

Validierung von Homologie-Modellen SwissModel (www.swissmodel.expasy.org/qmean/)

46

III. ERGEBNISSE

Im Gegensatz zu „Directed Evolution“-Experimenten, bei denen zu Beginn keine

detaillierten Informationen über das Zielprotein vorhanden sein müssen, ist der entscheidende

Faktor zur Planung eines rationalen Proteindesigns mittels ortsgerichteter Mutagenese die

Verfügbarkeit einer möglichst großen Basis an Struktur- bzw. Sequenzinformationen. Um die

Aktivitätsunterschiede, die sich bei der rDlP5βR und der AtP5βR finden, zu untersuchen, war das

erste Ziel dieser Arbeit deshalb eine Vielzahl von homologen P5βR-Genen aus verschiedenen

Pflanzen zu klonieren und funktionell in E. coli M15 zu exprimieren. Hierbei sollten

optimalerweise sowohl funktionelle Enzyme mit einer hohen, als auch Enzyme mit einer niedrigen

Aktivität gefunden werden. Aus den Sequenz- und Aktivitätsdaten sollten in der Folge

aussichtsreiche Positionen innerhalb der rDlP5βR für die anschließende ortsgerichtete Mutagenese

abgeleitet werden.

III.1 Klonierung von orthologen P5βR

Die Datenbank-Suche nach bekannten Homologen zur D. lanata P5βR (DlP5βR) mittels

BLAST Algorithmus (BLASTp bzw. BLASTn) ergab eine hohe Anzahl an entsprechenden

putativen P5βR-Genen, verteilt über viele Taxa innerhalb und außerhalb der Angiospermen, mit

einer Identität zur A. thaliana P5βR (AtP5βR) und D. lanata P5βR (DlP5βR) von etwa 50 - 99

Prozent. Ihre Annotierung erfolgte in nahezu allen Fällen ausschließlich auf Grund der

Sequenzähnlichkeit zu diesen Enzymen. Daten ihre Aktivitäten betreffend waren nicht verfügbar.

Die bekannten Sequenzen sollten genutzt werden, um Primer zur Klonierung weiterer P5βR-Gene

zu generieren.

III.1.1 Ableitung der Primer und Screening von RNA-Bibliotheken

Primer wurden abgeleitet aus den GenBank-Einträgen der funktionell bestätigten P5βR aus

Arabidopsis thaliana (EF579963), Digitalis lanata (AY585867) und Nicotiana tabacum

(AB488494.1/AB488495.1), sowie den putativen P5βR aus Zea mays (NM_001174269.1), Vitis

vinifera (AM448495.1) und Ricinus commumis (XM_002510077.1). Zum Teil wurden die Primer

mit degenerierten Positionen konzipiert (siehe II.1.10).

Von verschiedenen Pflanzen wurde RNA isoliert (II.2.1.2) und in cDNA umgeschrieben

(II.2.1.3). Es wurden dazu zunächst die Primer-Kombination gewählt, die für die taxonomisch am

nächsten stehende Art mit bekannter Gensequenz geeignet war. In den Fällen, in denen es auf diese

47

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/255538115?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=43&RID=TTSTNDWK011



Art nicht möglich war, ein PCR-Produkt zu erhalten, wurden auch die anderen im Rahmen der

vorliegenden Arbeit abgeleiteten und synthetisierten Primer getestet. Da keine Festlegung auf

bestimmte Taxa erforderlich war, wurden Versuche mit Pflanzenmaterial, aus dem mit den

Standardmethoden keine RNA gewonnen werden (z.B. Dionaea muscipula oder Nepenthes alata)

oder bei denen mit keiner Primer-Kombination eine erfolgreiche PCR durchgeführt werden konnte

(z.B. Hedera helix), nicht weiter verfolgt. Ähnlich wie P5βR-cDNA aus D. lanata und A. thaliana

besaßen alle erhaltenen PCR-Amplifikate eine Größe von etwa 1,1 - 1,2 kb (II.2.1.5; Abb. 6):

1 cDNA Mentha piperita

2 cDNA 2 Mentha piperita

3 cDNA Gomphocarpus fruticosus

4 cDNA Erysimum rhaeticum

Abb. 6: Beispiele für PCR-Amplifikate aus der cDNA von M. piperita, G. fruticosus und E. rhaeticum mit

verschiedenen P5βR-Primern, deren Größe auf putative P5βR-ORFs schließen lässt. M = 1kb Marker.

Die nachfolgende Tabelle fasst alle Organismen zusammen, bei denen cDNAs synthetisiert

werden konnten, mit denen eine Amplifikation von putativen P5βR möglich war und gibt die

dazugehörige Primer-Kombination an (Tab 1):

Tab. 1: Primer-Kombinationen für die Amplifikation von putativen, orthologen P5βR-Genen verschiedener Pflanzen.

cDNA aus Organismus Primerkombination

Amoracia rusticana Ery_Dir + ErysalrevAtropa belladonna Ntdir1 + Ntrev1Coffea arabica Gen_Dir + Gen_RevNicotiana tabacum Ntdir1 + Ntrev1Solanum tuberosum Ntdir1 + Ntrev1Solanum lycopersicon Ntdir1 + Ntrev1Erysimum crepidifolium Ery_Dir + ErysalrevErysimum rhaeticum Ery_Dir + ErysalrevGomphocarpus fruticosus Gen_Dir + Gen_RevRicinus communis PB_Rc_dir + PB_Rc_revMentha piperita Gen_Dir + Gen_RevCalotropis procera Gen_Dir + Gen_RevWithania somnifera Ntdir1 + Ntrev1Lunaria annua Ery_Dir + Erysalrev

48

M 1 2 3 M 4

1,0 kb1,5 kb

ca. 1,1 kb

Bei nahe verwandten Arten war in allen Beispielen jeweils ein Primer-Paar ausreichend. Die

Kombination von Ntdir1/Ntrev1 (beide aus der putativen N. tabacum P5βR abgeleitet) funktionierte

für alle untersuchten Solanaceen, Ery_Dir/Erysalrev für alle untersuchten Brassicaceen und

Gen_Dir/Gen_Rev für die verschiedenen Vertreter von Familien innerhalb der Gentianales.

III.1.2 Klonierung in den TOPO-Klonierungsvektor

Zur Aufklärung der Sequenzen der putativen P5βR-Gene und zur Vermehrung der DNA

sollten die erhaltenen, ca. 1,1 kb großen, (RT-)PCR-Produkte im Anschluss in den pCR®2.1-

TOPO®-Vektor kloniert werden. Hierzu wurden die gewünschten Banden zur Reinigung und

Aufkonzentrierung mittels „freeze'N squeeze“-Verfahren (II.2.1.6) aus einem Agarose-Gel isoliert.

Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese wurde kontrolliert, ob die Reinigung erfolgreich war. Im

aufgeführten Beispiel (Abb. 7) konnte so eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von 165 ng/µL

und einem Reinheitsquotient (II.2.1.15) von 1,78 erhalten werden.

Abb. 7: Kontrolle der mit „freeze'N squeeze“ gereinigte PCR-Amplifikate putativer P5βR aus der cDNA von Solanum

tuberosum (Spur 1) und Atropa belladonna (Spur 2/3). Die Konzentration betrug in beiden Fällen 165 ng/µL bei einem

Reinheitsquotient von 1,78.

Die gereinigte DNA wurde in den Vektor kloniert und dieses Konstrukt in chemisch

kompetente E. coli One Shot TOP10 transformiert. Die Auswahl von Bakterien-Kolonien mit

inserthaltigem pCR®2.1-TOPO® Vektor erfolgte mittels Blau-Weiß-Selektion (II.2.1.12). Von positiv

selektionierten Kolonien wurden LB-Flüssigkulturen angelegt und die Plasmid-DNA isoliert

(II.2.1.14).

Die Sequenzierung erfolgte bei GATC Biotech AG zunächst immer mit dem firmeneigenen

TOPO-1 Primer. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Hilfe von ClustalW mit der als Referenz

dienenden DlP5βR-Nucleotidsequenz verglichen. Es wurden jeweils beide Orientierungen

(5'-3' und 3'-5') getestet, da die bei der TOPO-UA Klonierung aufgenommenen Inserts beide

49

M 1 2 3

1 kb

Integrationsmöglichkeiten vorweisen können. Zeigte sich eine signifikante Übereinstimmung,

wurde im Anschluss mit dem TOPO-2 Primer der Rest der Insert-Sequenz sequenziert. Beide

Teilsequenzen wurden händig zur Gesamtsequenz zusammengefügt. Abb. 8 zeigt beispielhaft die

Nukleotid-Sequenz der putativen A. belladonna P5βR, die aus den Sequenzierungen des pCR®2.1-

TOPO® Vektor-Konstrukts Nr. 3 abgeleitet wurde im direkten Vergleich zur intronfreien P5βR-

Sequenz aus D. lanata. Die Identität zwischen den beiden Sequenzen beträgt 75 %. Das Alignment

umfasst einen kompletten Leserahmen von Start- bis Stopp-Codon für eine putative P5βR. Aus

dieser Analyse lässt sich ableiten, dass die gewünschte P5βR-Sequenz vollständig in das Plasmid

eingebaut worden war.

AbP5βR ATGAGCTGGTG---GGCTGGAGCTATTGGTGCTGCCAAGAAAAAATTCGAAGAAGATGAT 57DlP5βR ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 60 *********** ********* **:** *****.*******..** ***********

AbP5βR GCACCACCCAAGTATCAAAGCGTTGCTCTAATCATCGGAGTTACCGGCATCGTCGGCAAC 117DlP5βR GCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAAC 120 ****..**.*** ** ..***** ** *.**..* **.**:*****.***.********

AbP5βR AGTCTCGCCGAGATCCTCCCTCTCGCCGACACCCCCGGCGGTCCTTGGAAAGTCTATGGC 177DlP5βR AGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGC 180 ** ** ** ******** **:** ******************** *****.**.** ***

AbP5βR GTTGCTCGCCGCCCTAGACCGTCGTGGAATGCCGACCACTCAATTGAGTACGTCCAATGT 237DlP5βR GTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGC 240 ** ** ******.* ***** * ***.***. ** .* *.** .* ********.**

AbP5βR GACATATCTAACCCGGAAGATACCCAATCCAATCTCTCCCTTCTCACTGATGTCACCCAC 297DlP5βR GACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCAC 300 ******** .* **.**:** :***** **** ** **.* *** ******** ******

AbP5βR GTGTTCTATGTTACTTGGGCTAATAGATCCACAGAGATTGAAAACTGTGAAATTAATGGG 357DlP5βR GTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGC 360

******** ***** *********.*******.**..::************. ***.*

AbP5βR AAAATGTTTAGAAATGTTCTTAATGTTATTATCCCTAATTGCCCCAATTTACGCCACATC 417DlP5βR AAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATC 420 ******** **.** ** ***.*** :.**********************... ******

AbP5βR TGTTTGCAAGCGGGTCGAAAACATTATTTGGGTCCGTTTGAATTGTATGGAAAAGTAG-- 475DlP5βR TCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGACCATTTGAATCCTACGGGAAAATAGAA 480 * :*****..* ** .*.**.***** :****:**.******* ** **.***.***

AbP5βR -CCCATGATTCTCCGTTTCACGAGGATTTACCGAGATTAAGTGGGCCTAATTTTTACTAC 534DlP5βR TCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCCAGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTAT 540 ******** *:** *: .. ********.** **.**.*. . . ** ********

AbP5βR ATTCTTGAGGATATTTTATTTAAGGAGATGGAGAAGAAGGAAGGATTGACATGGTCAGTT 594DlP5βR GATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAGAAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTT 600 .:* *:*********:*. **.*****.*************.**:*****:*****.***

AbP5βR CATAGGCCCGGGACGATATTTGGGTTTTCACCATATAGTTTGATGAACATTGTTGGAACG 654DlP5βR CATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACC 660 ***.* **.****. ***** ********:*********:******* :* ** **:**

AbP5βR CTTTGTGTTTACGCGGCTATATGTAAACACGAAGGGTTGCCGTTGAGGTTTCCAGGTGTT 714DlP5βR CTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAGGGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGT 720 *********** **.*****:** ********.**.::* *********.*:*** *

50

AbP5βR AAAGCGGCGTGGAATGGATACTCGGATTCCTCCGATGCGGACTTGATTGCTGAGCATCAG 774DlP5βR AAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCTGATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCAT 780 **.** ******.****.********** *** ******** *****:** ********

AbP5βR ATATGGGCTGCAGTGGATCCGTACGCTAAGAATGAGGAGTTTAATGTGAGCAATGGGGAT 834DlP5βR ATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAACGAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGAT 840 **:***************** ** **:**.** ****. *********** *****.***

AbP5βR GTCTTCAAGTGGAAGCATTTCTGGAAGGTTTTGGCTGAGCAATTTGGAGTGGAGGCCACG 894DlP5βR GTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTGGCGGAGCAGTTTGGAGTAGGGTGTGGA 900 ** ** **.*********** ******** ***** *****.********.*.* . .

AbP5βR GAGTTTGATGAAGGGAAGAGATGCACTTTGGGAGAGATGATGAAAGACAAAGGCGCTGTT 954DlP5βR GAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAGGATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTT 960 ****:***:******.:*..:* *.:*** ..** :*.*****.*. **.*. * ***

AbP5βR TGGGATGAGATTGTGAAGGAGAATGGATTGGAGTCTACTAAATTGGAGGAGGTTGGGGTT 1014DlP5βR TGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACACCTACGAAACTGAAGGATGTCGGAATT 1020 ***** **.** ****.*************... **** *** **.**** ** **..**

AbP5βR TGGTGGTTTGTTGATCTTATTCTTGGTGGAGATTGTCCTTTGGATACTATGAACAAGAGC 1074DlP5βR TGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAGTGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGC 1080 ********** **** ****:***** ..:** *** ****** *************

AbP5βR AAGGAGCACGGTTTCTTGGGATTCCGAAACTCACAAAAAGCATTCATTTCCTGGATTGAT 1134DlP5βR AAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCCAAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGAC 1140 ******** ** ** ******** .*.*****..*.**:**.******** ********

AbP5βR AAGGTGAAAGCCTACAAAGTTGTTCCTTAG 1164DlP5βR AAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1170 **** .***** *****..*********..

Abb. 8: Alignment der erhaltenen putativen P5βR-Sequenz aus Atropa belladonna (AbP5βR) aus dem pCR2.1-TOPO-

Vektor mit der DlP5βR (AY585867), sequenziert mit TOPO-1 und TOPO-2 Primern. Start- und Stopp-Codon sind grün

bzw. rot hinterlegt.

Die Nukleotid-Sequenzen wurden mit dem Programm ExPASy in die korrespondierenden

Aminosäure-Sequenzen übersetzt und in der Genbank NCBI Databases GenBank

(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) veröffentlicht. Eine Liste aller auf diese Weise klonierten

und sequenzierten homologen P5βR-Sequenzen wird in Tab. 2 wiedergegeben.

Tab. 2: Zusammenfassung aller in den pCR®2.1-TOPO®-Vektor klonierten DNA-Abschnitte.

Organismus ORF NT AS Genbankeintrag

A. belladonna P5βR (cDNA) 1164 387 GU451678

N. tabacum P5βR (cDNA) 1167 388 GU807434

W. somnifera P5βR (gDNA) 1235 - JN638574

S. lycopersicon P5βR (cDNA) 1164 387 JF504670

S. tuberosum P5βR (cDNA) 1164 387 JF504669

L. annua P5βR (gDNA) 1278 - JN638575

A. thaliana Promotorregion ca. 1 kb

51

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

Für die heterologe Expression sollten diese zunächst auf die von Herl et al. (2006) etablierte

Art mittels Restriktionsendonukleasen in den pQE-30 Expressionsvektor subkloniert werden. Es

konnte jedoch kein zufriedenstellendes Konstrukt hergestellt werden. Unter anderem wurde das

Insert trotz geeigneter Schnittstellen in falscher Orientierung in den Vektor ligiert.

III.1.3 Etablierung eines Klonierungssystems für pQE30-UA Vektoren

Zur Steigerung der Klonierungseffizienz wurde deshalb ein alternatives Klonierungssystem

mit dem pQE30 UA-Expressionsvektor entwickelt. Mit Hilfe dieses Systems konnten innerhalb von

sehr kurzer Zeit PCR-Produkte nach einer Reinigung (unter Umgehung des Klonierungsvektors und

der Subklonierung in den pQE30-Vektor) direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden

(Abb. 9).

Abb. 9: Entwickeltes System zur schnellen, direkten Klonierung orthologer P5βR mit dem pQE30-UA Vektor.

Durch dieses Vorgehen war es möglich, mehrere weitere homologe P5βR-Gene in frame zu

klonieren. Dies soll im Folgendem am Beispiel des P5βR-Gens aus Mentha piperita (MpP5βR;

Genbankeintrag GU451677) dargestellt werden.

Aus der cDNA, die durch Umschreiben von RNA aus frischem M. piperita Blattmaterial

gewonnen wurde, ließ sich durch eine PCR Reaktion mit den P5βR-spezifischen Primern Gen_Dir

und Gen_Rev im 1 %-igen Agarosegel eine deutlich sichtbare Bande bei der gewünschten Höhe von

ca. 1,1 kb nachweisen. Zur maximalen Ausbeute an DNA wurden jeweils 4-5 PCR-Ansätze gepoolt

und die gewünschten Banden aus einem Agarose-Gel isoliert, um störende Nebenprodukte

abzutrennen (Abb. 10).

52

Abb. 10: PCR-Produkte mit cDNAs aus jungen Blättern von M. x piperita (Spur 1-4) und den Gen_Dir- und Gen_Rev-

Primern. Schwach erkennbar sind Nebenbanden der Reaktion.

Die so gereinigten PCR-Amplifikate wurden direkt in den pQE-30 UA Vektor kloniert

(II.2.1.8) und das Konstrukt in (hoch)kompetente E. coli NEB-5α Zellen transformiert (II.2.1.10).

Das Screening der resultierenden Kolonien erfolgte mittels Colony-PCR (Abb. 11). Die

Erfolgsquote hierbei lag je nach PCR-Produkt zwischen 10 und 100 Prozent.

Abb. 11: Screening von zehn Bakterienkolonien (Spur 1-10) zur Kontrolle der erfolgreichen Aufnahme eines

Konstruktes aus putativer MpP5βR im pQE-30-UA Vektor mittels Colony-PCR (Gen_Dir/Gen_Rev-Primer). Spur 3-6,

8 und 10 zeigt positive Kolonien.

Die Bakterien-Kolonien, bei denen die Reaktion positiv verlief, wurden in Flüssigkultur

übernommen, um ihre Plasmid-DNA zu präparieren (II.2.1.14). Dies war wichtig, da bei der

gewählten Klonierungsstrategie PCR-Produkte (entsprechend der TOPO-UA Klonierung, II.2.1.8)

sowohl in sense- als auch in antisense-Orientierung in das Plasmid aufgenommen werden konnten.

53

Die Sequenzierung erfolgte jeweils mit den Primern pQE_FP und pQE_RP(-50). Die

erhaltenen Teilsequenzen (Daten nicht gezeigt) wurden kombiniert, um den durchgängigen

Leserahmen der Nucleotid-Sequenz zu erhalten. In der Sequenz des Klons Nr. 39 fanden sich auch

die beiden Primer wieder, die zur Klonierung Verwendung fanden. Dies spricht dafür, dass die

gesamte, intronfreie Gensequenz vollständig in den Vektor integriert wurde. Die vollständige Insert-

Sequenz umfasste 1170 Nt und einen durchgehenden Leserahmen ohne Stopp-Codons (Abb. 12).

Am 5'-Ende der Sequenz konnte die Codierung für den späteren N-terminalen His-tag identifiziert

werden. Diese war vom putativen P5βR-Insert durch die 30 Basen der „Multiple Cloning Site“

(MCS) getrennt. Die Sequenzidentität zum D. lanata bzw. A. thaliana P5βR-ORF auf

Nucleotidebene betrug 80 bzw. 71 %.

5'-ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCCACGTGATATCCTCAATCGCTTCTATG AGCTGGTGGTGGGCT GGGGCTATCGGCGCTGCAAAGAAAAAACTCGAAGAAGATGAGGCGCCGCCGAACTACCAGAGCGTAGCTCTGGTGGTGGGGGTGACCGGAATCGTCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCGCTCTCCGACACTCCCGGCGGCCCCTGGAAGGTCTACGGGGTGGCGCGCCGCCCCCGCCCCGCCTGGAACGACGATCACCCCATCACCTACATCCGCTGCGACGTGTCCGATTCCGGCGACGCGAAGGAGAAGCTGTCCCCTCTCACCGATCTAACCAACATCTTCTATGTAACATGGACTAACAAATCCACCGAGGCGGAGAATTGCGAAGCCAATGGGAAAATGCTGAAGAATGTGCTCGATGCATTGATCCCTAATTGCCCTAATTTGAAGCATGTCTGTTTGTTGACTGGTAGGAAGCATTACGTTGGTCCATTCGAGTCCGTTGGAAAGATTCGAGCACACGATCCTCCGTTTACTGAGGATTTGCCTCGATTGGACTGCCCGAATTTCTACTATACCTTGGAGGATATTCTGTTTGAGGAGGTTCAGAAGAAGGAGGGCTTGACATGGTCTGTGCATAGGCCTGGGGCTATATTCGGGTTCTCGCCATATAGCATGATGAATTTGGTTGGAACACTTTGTGTTTATGCAGCCATTTGTAAGCATGAAGGTGCAGTCTTGAGGTTTCCTGGTTGTAAAGGTGCTTGGGATGGATACTATGATTGCTCTGATGCAGATTTGATTGCGGAGCATCAAATCTGGGCAGCCGTGGATCCTTACGCGAAGAATGAGGCGCTCAATGTGAGCAATGGCGATGTTTTCAAGTGGAAGCATTTCTGGAAAGTGTTGGCAGAGCAGTTTGGGGTGGAGTGTGGGGAGTATGAGGAAGGGAATGAGGTGAAGTTGCAGGATTTGATGAAGGATAAAGGCCCAGTTTGGGATGAAATCGTGAGGGAGAATGGCTTGTCGCCTACGAAGCTGGAGGACGTGGGGATTTGGTGGTTTGCCGATTTTAGCCTTGGGTATGAATGTCCCTTGGATACGATGAACAAAAGCAAGGAGCATGGATTTCTGGGATTCAGAAATTCCAAGAACTCCTTCATTTCTTGGATTGATAAGGTGAAGGCTTACAAGATTGTTCCTTAG-3´

Abb. 12: Sequenz der klonierten, putativen M. piperita P5βR im pQE30-UA-Vektor. Der ORF liegt „in frame“ zur His-

tag Codierung (gelb) vor. Die Sequenz des (sense) Klonierungs-Primers (Gen_Dir) ist unterstrichen. Start- und Stopp-

Codon sind grün bzw. rot hinterlegt.

Diese DNA Sequenz wurde mittels ExPASy Translation-Tool (II.2.5) in die

korrespondierende Aminosäuresequenz übersetzt. Die putative MpP5βR umfasst 389 Reste. Die

charakteristischen Protein-Motive für SDR und P5βR sind im Protein zu finden. Die

Sequenzidentität zur rDlP5βR beträgt 82 % (Abb. 13).

MSWWWAGAIGAAKKKLEEDEAPPNYQSVALVVGVTGIVGNSLAEILPLSDTPGGPWKVYGVARRPRPAWNDDHPITYIRCDVSDSGDAKEKLSPLTDLTNIFYVTWTNKSTEAENCEANGKMLKNVLDALIPNCPNLKHVCLLTGRKHYVGPFESVGKIRAHDPPFTEDLPRLDCPNFYYTLEDILFEEVQKKEGLTWSVHRPGAIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGAVLRFPGCKGAWDGYYDCSDADLIAEHQIWAAVDPYAKNEALNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECGEYEEGNEVKLQDLMKDKGPVWDEIVRENGLSPTKLEDVGIWWFADFSLGYECPLDTMNKSKEHGFLGFRNSKNSFISWIDKVKAYKIVP

Abb. 13: Aminosäure-Sequenz der putativen MpP5βR. Charakteristische Protein-Motive der DlP5βR sind gelb markiert.

54

Das Vorgehen beim Klonieren von weiteren putativen P5βR-Genen aus anderen Organismen

erfolgte analog. Die neu beschriebenen Sequenzen wurden ebenfalls in der NCBI Databases

GenBank veröffentlicht. Alle Sequenzen sind in richtiger Orientierung und im richtigen

Leserahmen zum N-terminalen His-tag in den pQE30-UA Expressionsvektor kloniert worden. Die

einzige Ausnahme stellt die putative P5βR aus Calotropis procera (CpP5βR) dar. Bei dieser

konnten durch Colony-PCR 11 positive Bakterienkolonien identifiziert werden, deren Plasmid-

DNA isoliert und sequenziert wurde. Allerdings besaßen alle Inserts die falsche („antisense“)

Orientierung. In der folgenden Tabelle (Tab. 3) sind alle im Rahmen dieser Arbeit in

Expressionsvektoren klonierte Gene, inklusive der entsprechenden Genbank-Einträge, verzeichnet.

Tab. 3: Zusammenfassung aller Gene/Genbankeinträge, die erfolgreich in frame in Expressionsvektoren kloniert

werden konnten (P5βR = Progesteron-5β-Reduktase; 3β-HSD = 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase; IPTR =

Isopiperitenon-Reduktase). Die Klonierung der CpP5βR gelang nur in 3'-5' Orientierung.

Organismus ORF NT AS Expressions- Genbankeintrag

system

A. belladonna P5βR 1164 387 pQE30-UA GU451678

A. thaliana 3β-HSD - - pQE30-UA -

E. crepidifolium P5βR 1170 389 pQE30-UA GU354236

E. rhaeticum P5βR 1170 389 pQE30-UA GU354237

G. fruticosus P5βR 1167 388 pQE30-UA GU354238

M. piperita P5βR 1170 389 pQE30-UA GU451677

M. piperita IPTR 945 314 pQE30-UA -

C. procera P5βR 1164 387 (pQE30-UA) GU479996

H. carnosa P5βR 1164 387 Gateway GU354231

P. major P5βR 1170 389 Gateway GU354233

N. oleander P5βR 1164 387 Gateway GU354232

A. curassavica P5βR 1164 387 Gateway GU354230

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit erfolgte für die im Folgenden beschriebenen Versuche

(u.a. Expression, native His-tag Reinigung, katalytische Aktivität, Modellierung) eine

Konzentrierung auf die Plasmid-Konstrukte mit den klonierten P5βR aus Atropa belladonna,

Erysimum crepidifolium, Erysimum rhaeticum, Gomphocarpus fruticosus und Mentha piperita.

Trotzdem erfolgte auch der Nachweis der erfolgreichen funktionellen Expression der P5βR aus

Hoya carnosa, Plantago major, Nerium oleander und Asclepias curassavica (die Klonierung und

funktionelle Expression dieser vier cDNAs erfolgte im Rahmen der Diplomarbeit von Margareta

Brydziun; vgl. hierzu Bauer et al., 2010).

55

III.2 Funktionelle Expression der orthologen P5βR in E. coli M15[pREP4]

III.2.1 Expressionsbedingungen und native His-tag-Reinigung

Zur Aufklärung der optimalen Expressionsbedingungen der klonierten P5βR, wurden für alle

Proteine die beiden publizierten Möglichkeiten für rP5βR getestet (Standardbedingungen von 1mM

IPTG, 37 °C, 4 h bzw. Variation mit 0,1 mM IPTG, 4 °C, 96 h). Es wurde jeweils die Methode mit

den individuell besseren Ergebnissen weiterverwendet. Hauptkulturen zur Proteinexpression

wurden angelegt und auf eine Überexpression von rP5βR überprüft. Für die rMpP5βR konnte

rekombinantes Protein nur dann erhalten werden, wenn nach der Induktion mit 0,1 mM IPTG für 96

h bei 4 °C kultiviert wurde. Abb. 14 zeigt das Expressionsprofil des Proteins unter diesen

Gegebenheiten:

Abb. 14: Expressionsprofil der rMpP5βR mittels SDS-PAGE und Coomassie Brilliant Blue Analyse. Spur 1 = vor

Induktion; Spur 2 = 24 h; Spur 3 = 48 h; Spur 4 = 72 h; Spur 5 = 96 h; Spur 6/7 = Protein-Eluat der nativ gereinigten

rMpP5βR im Elutions- bzw. P5βR-Assaypuffer; Spur 8 = nativ gereinigte rGfP5βR.

Die nach 0 h (= vor IPTG-Induktion, Spur 1), 24 h (Spur 2), 48 h (Spur 3), 72 h (Spur 4) und

96 h (Spur 5) entnommenen Proben wurden nach ihrer Aufarbeitung mittels 12,5-%-igem SDS-Gel

aufgetrennt und nach Färben mit Coomassie Brilliant Blue analysiert. Es zeigte sich eine Bande,

deren Höhe von etwa 40 – 45 kDa der berechneten Proteingröße von ca. 43 kDa entspricht. Diese

Bande hat ihre stärkste Intensität nach 96 h Kultivierungsdauer.

Aus den so behandelten E. coli Kulturen konnte das rekombinante Enzym in einer guten

Ausbeute (nativ) überexprimiert werden. Die Abbildung 14 zeigt die gereinigte rMpP5βR im

Imidazol-Elutionspuffer bzw. im P5βR-Assaypuffer (Bahn 6 und 7). Im Vergleich hierzu ist

ebenfalls die nativ-gereinigte rGfP5βR zu sehen (Bahn 8). Die Reinigung erfolgte wie unter II.2.2.2

beschrieben.

56

ca. 43 kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8

Auf diese Weise war es möglich, die rekombinanten, homologen Enzyme in 2 Gruppen zu

separieren. Die rekombinanten Erysimum Enzyme (rEcP5βR, rErP5βR) konnten v.a. über die

Expressionsvariante mit 1 mM ITPG und einer Kultivierungsdauer von 4-5 h gewonnen werden, die

auch für die nahe verwandte P5βR aus A. thaliana (rAtP5βR) beschrieben worden ist. Die Enzyme

aus G. fruticosus (rGfP5βR) und M. piperita (rMpP5βR) wurden nach der oben dargelegten, langen

Inkubationszeit bei niedriger Temperatur überexprimiert. Mit keiner von beiden Methoden gelang

es, das A. belladonna Enzym (rAbP5βR) zu exprimieren.

III.2.2 Nachweis der katalytischen Aktivität

Zur Planung der Mutagenese-Versuche war neben der Aufklärung der Sequenz besonders

der Nachweis der katalytischen Aktivität (v.a. mittels Standard-P5βR-Enzymassays; II.2.3.6)

essentiell. Hierzu wurde das nativ gereinigte Enzym in P5βR-Assaypuffer umgepuffert (II.2.3.2)

und von dieser Mischung jeweils 0,2 mg in einem Volumen von 1000 µL eingesetzt. Die

Auswertung der Enzymtests erfolgte mittels DC nach Tauchen in Anisaldehyd-RL.

Abb. 15: DC Analyse des Standard-P5βR-Enzymassays der rMpP5βR bei 30 °C und 0,5 mM Progesteron (Spur 1 = 0,2

mg Protein; Spur 2 = 0,4 mg Protein; M = Referenzen; Spur 3 = Negativkontrolle)

Die Dünnschichtchromatographie zeigte, dass das Enzym in der Lage ist, Progesteron zu

5β-Pregnan-3,20-dion, dem putativen Folgeprodukt innerhalb der Herzglykosid-Biosynthese,

umzusetzen. Ebenfalls zu sehen war, dass diese Reduktion konzentrationsabhängig verläuft (Abb.

15). So war bei einer Konzentration von 0,2 mg/mL Protein nach 2 h bei 30 °C noch Substrat zu

sehen (Spur 1), während bei der doppelten Enzym-Konzentration nur noch das Produkt detektiert

werden konnte (Spur 2). Wurde das Enzym vor Substrat-Zugabe denaturiert, fand keine Katalyse

statt (Spur 3).

57

Auf diese Art konnten die katalytischen Aktivitäten der klonierten, funktionell exprimierten

Enzyme (EcP5βR, ErP5βR, GfP5βR und MpP5βR) verschiedener Taxa demonstriert werden. Dies

stellt nach den aus Digitalis sp. und A. thaliana rekombinant verfügbaren Proteinen den ersten

Nachweis der Funktionalität dieser neuen Enzym-Klasse dar. Abbildung 16 zeigt einen direkten

Vergleich der Aktivitäten aller Enzyme bei 30 °C nach 2 h.

Abb. 16: DC der P5βR-Standard-Assays der verschiedenen klonierten und funktionell exprimierten rP5βR zur

vergleichenden Darstellung ihrer jeweiligen katalytischen Aktivitäten (T = 30 °C; PRO-Konzentration = 0.5 mM; Spur

1 = rEcP5βR; Spur 2 = rGfP5βR; Spur 3 = rDlP5βR; Spur 4 = rMpP5βR; Spur 6 = rAtP5βR).

Wie für die rMpP5βR bereits gezeigt besitzen alle Enzyme die Fähigkeit, Progesteron

katalytisch zu 5β-Pregnan-3,20-dion zu reduzieren. Allerdings unterscheiden sich die Proteine

hinsichtlich ihres Aktivitätslevels untereinander stark (Abb. 16). Die rMpP5βR (Bahn 5) und die

rAtP5βR (Bahn 6) zeichnen sich durch eine hohe Aktivität aus, während Enzyme aus E.

crepidifolium (Bahn 3) und E. rhaeticum (nicht in Abbildung) in ihrer Aktivität eher der rDlP5βR

entsprechen. Die rGfP5βR ist sogar noch weniger aktiv (Bahn 2). Es stellte sich so dar, dass sich die

beiden taxonomisch näher verwandten Protein-Gruppen, mit jeweils ähnlicherer

Aminosäuresequenz (rP5βR aus Erysimum sp./A. thaliana bzw. D. lanata/M. piperita), jeweils

deutlich in ihrer Aktivität unterschieden. Des weiteren besaßen die beiden Enzyme, die sich aus

Organismen ableiten, welche keine Herzglykoside akkumulieren (AtP5βR und MpP5βR), die höhere

enzymatische Aktivität. Diese simple Einteilung der rekombinanten Enzyme hinsichtlich

verschiedener Aktivitätsgrade, bestimmt mittels P5βR-Enzymassay und DC (bzw. GC-MS, s.

III.2.3.2), wurde in späteren Versuchen zur Ableitung von Aminosäuren der DlP5βR genutzt, die

besonders gute Ziele der ortsgerichteten Mutagenese darstellen („bioactivity-guided screening“,

II.4.2.1).

58

5β-Pregnan-3,20-dion

Progesteron

β-Mercaptoethanol

1 2 3 4 5 M

III.2.3 Biochemische Untersuchung der rekombinanten P5βR

Neben den einfachen Funktionsdaten (III.2.2) wurden auch einige wichtige biochemische

Parameter bestimmt. Da der Zweck der vorhergehenden Klonierung und funktionellen Expression

der rekombinanten Proteine jedoch immer die Verwendung der gewonnenen Informationen für

spätere Mutagenese-Experimente der rDlP5βR war, erfolgte diese Charakterisierung selektiv für

bestimmte Merkmale.

III.2.3.1 Enantioselektivität

Die Untersuchung der Enantioselektivität (=stereospezifische Reduktion der Δ4,5-C=C-

Doppelbindung) erfolgte durch Auswertung der Standard-P5βR-Enzymassays mit Progesteron als

Substrat nach einer zweistündigen Inkubationsdauer mittels DC und GC-MS-Analytik (II.2.4.2). In

der Kontrolle konnten mittels des entwickelten GC-Programmes bzw. der bereits etablierten DC die

beiden möglichen Produkte der Reduktion (5β-Pregnan-3,20-dion [1] bzw. 5α-Pregnan-3,20-dion

[3]) von Progesteron mit beiden analytischen Methoden getrennt werden. In allen analysierten

Assays wurde jeweils nur ein Produkt gefunden. Dieses wurde über die Retentionszeit (Rt=23,7)

und das dazugehörige Massenspektrum eindeutig als 5β-Pregnan-3,20-dion identifiziert (Abb. 17).

Abb. 17: Gaschromatographische Trennung möglicher Produkte der Reduktion von Progesteron zur Analyse der P5βR-

Assays. A Kontrolle B Enzym-Assay mit rekombinanter P5βR aus M. piperita (1 = 5β-Pregnan-3,20-dion, Rt=23,7; 2 =

Isoprogesteron, Rt=24,19; 3=5α-Pregnan-3,20-dion, Rt=24,55; 4 = Progesteron, Rt=25,93).

III.2.3.2 Cosubstrat-Spezifität

Es wurde getestet, ob die rekombinanten P5βR eine strikte NADPH-Spezifität besitzen oder,

ob NADPH durch NADH ersetzt werden kann. Hierzu wurden Standard-P5βR-Assays mit nativ

59

gereinigtem Enzym durchgeführt, wobei anstatt eines regenerierenden Systems mit 6,4 mM NADP+

nur NADH im Überschuss (6,4 mM) eingesetzt wurde. Parallel hierzu erfolgte zur Kontrolle ein

Standard-Assay mit NADPH (Abb. 18).

Abb. 18: GC-Analyse der rP5βR-Aktivitätstests mit NADPH (links) und NADH (rechts) als Reduktionsäquivalente

unter identischen Bedingungen (Temperatur = 30 °C; Reaktionsdauer 2 h).

Weder mittels DC (Daten nicht gezeigt), noch mit GC-MS (Abb. 18) konnte eine

enzymatische Umsetzung des Substrats in Anwesenheit von NADH beobachtet werden. Dies war

essentiell, da in späteren Mutagenese-Experimenten die Cosubstrat-Spezifität der rDlP5βR rational

geändert werden sollte. Die Ansätze mit NADPH, die als Kontrollen dienten, führte mit allen

Enzymen, wie bereits gezeigt, zur stereospezifischen Bildung von 5β-Pregnan-3,20-dion.

60

III.2.3.3 Temperatur-Optima

Die Temperatur-Optima der rekombinanten P5βR aus M. piperita, G. fruticosus und E.

crepidifolium wurden mittels Standard-P5βR-Assay bei verschiedenen Temperaturen (T = 25 °C –

60 °C) und Progesteron als Substrat bestimmt. Alle rekombinanten Proteine wiesen ein ähnliches

Temperatur-Profil auf, wobei das Optimum jeweils bei 45-50 °C zu finden war (Abb. 19). Dies

entspricht in den Werten, die für die rDlP5βR und die rAtP5βR vorliegen.

Abb. 19: Einzelmessungen der Temperatur-Optima bestimmt mittel GC-MS-Analytik über die relative Aktivitäten

(II.2.4.2) bei unterschiedlichen Temperaturen (A = rGfP5βR; B = rMpP5βR; C = rEcP5βR; gemessen wurde die relative

Aktivität – II.2.4.2- bei unterschiedlichen Temperaturen).

Alternativ wurden die Temperatur-Optima der rMpP5βR und der rDlP5βR auch

photometrisch mit 2-Cyclohexen-1-on als Substrat bestimmt. Diese Messungen lieferten sehr

ähnliche Aktivitätsverläufe (Daten nicht gezeigt).

III.2.3.4 Enzymkinetiken für Progesteron und 2-Cyclohex-1-enon

Zur Bestimmung der Km- und vmax-Werte der rekombinanten P5βR wurde eine neue

photometrische Messmethode adaptiert, die auf der Abnahme des Cosubstrats NADPH während der

Katalyse beruht (II.2.4.3). Hierzu wurden die nativ-gereinigten Enzyme in P5βR-Assaypuffer

61

umgepuffert (II.2.3.2). Zunächst wurde für jedes Protein je nach Aktivitätsstufe der optimale Assay-

Konzentration bestimmt.. Als Standardsubstrate wurden sowohl das putativ-native Substrat

Progesteron, als auch das kleine Substratanalogon 2-Cyclohexen-1-on eingesetzt. Zur Berechnung

der Km-Werte diente der Hanes-Plot (II.2.4.3).

In der folgenden Abbildung (Abb. 20) sind exemplarisch einige photometrische Messkurven

des Enzym-Assays mit Progesteron bzw. 2-Cyclohexen-1-on als Substrat und die Hanes-Plots zur

Bestimmung der Km/vmax-Werte für beide genannten Substrate und das Cosubstrat am Beispiel der

rMpP5βR aufgeführt (für die anderen Enzyme werden die Werte direkt in Tabellen-Form

angegeben; s. Tab. 4).

Abb. 20: Hanes-Plots zur Ermittlung der Km- und vmax-Werte der rMpP5βR bei 40 °C. A Substrat = Progesteron;

Proteinkonzentration = 0,05 mg/mL. B Substrat = 2-Cyclohexen-1-on; Proteinkonzentration = 0.025 mg mL.

Für Progesteron konnte ein Km-Wert von 200,2 +/- 31,9 µM und ein vmax-Wert von 2,10 +/-

0,32 mkat/kg Protein ermittelt werden. Die kinetischen Daten der rGfP5βR und der rEcP5βR

wurden analog dazu bestimmt, wobei die rEcP5βR zur weiteren Charakterisierung im Rahmen der

Dissertation von Frau J. Munkert bearbeitet wurde (Munkert et al., 2011). Auf Grund der

geänderten Messmethode wurden die von Herl et al. (2006/2009) publizierten kinetischen Daten der

rDlP5βR bzw. rAtP5βR photometrisch neu bestimmt. Zusätzlich wurde erstmals auch 2-

62

Km = 200,1 µM

Vmax

=1,95 mkat/kg

Km = 109,5 µM

Vmax

= 8,05 mkat/kg

Cyclohexen-1-on als alternatives Substrat getestet und kinetische Konstanten hierfür bestimmt

(Zusammenfassung s. Tab. 4).

Tab. 4: Kinetische Daten einiger klonierter, rekombinanter P5βR für unterschiedliche Substrate (CH = 2-Cyclohexen-1-

on; PRO = Progesteron), (n = min. 3) (n.b. = nicht bestimmt).

Substrat Km vmax kcat Km/kcat

[µM] [mkat/kg] [min-1] [M-1/s-1]

rAtP5βR PRO 268,3 +/- 23 3.69 +/- 1.09 10,11 628,0

CH 115.7 +/- 1.6 20.40 +/- 1.38 66,85 9630,1

rDlP5βR PRO 362,3 +/- 57,5 0.42 +/- 0.05 1,13 52,2

CH 333,3 +/- 28,5 10.83 +/- 1.10 29,24 1462,3

rEcP5βR PRO n.b.

CH 912,4 +/- 92,9 59,43 +/- 4,83 164,55 3005,7

rGfP5βR PRO 267,0 +/- 55,2 0,18 +/- 0,01 0,48 30,0

CH 141,4 +/- 45,3 6,16 +/- 1,11 16,89 1990,8

rMpP5βR PRO 200,2 +/- 31,9 2,10 +/- 0,32 5,77 480,6

CH 110,2 +/- 54,8 7,36 +/- 0,71 20,27 3064,5

Diese bestimmten Aktivitätsdaten für die rekombinanten Enzyme decken sich gut mit der

qualitativen, dünnschichtchromatographischen Analyse. Dieses einfache DC-Screening-Verfahren

stellte jedoch eine ausreichende Basis für das später zu erläuternde „bioactivity-guided screening“-

Verfahren dar (s. II.4.2).

Für die rAtP5βR und die rMpP5βR wurden zusätzlich Experimente zur Bestimmung von

kinetische Daten für 12-Oxophytodien-Säure (OPDA), einem (Enon-)Substrat aus dem

Jasmonsäure-Stoffwechsel, durchgeführt. Allerdings konnte für beide Enzyme keine Umsetzung

unter den Bedingungen des Photometer-Assays nachgewiesen werden.

III.2.3.5 Enzymkinetiken des Cosubstrats NADPH

Um die kinetischen Daten für das Cosubstrat NADPH zu ermitteln, wurde 2-Cyclohexen-1-

on im Überschuss (Endkonzentration 2 mM) zugesetzt. Für die rMpP5βR betrug der Km-Wert (bei

einer Enzymkonzentration von 0,0125 oder 0,025 mg pro Assay) 28,1 +/- 8,6 µM. In Abbildung 21

sind jeweils die Hanes-Plots dargestellt, die aus den photometrischen Daten der Aktivitäten der

Enzyme abgeleitet wurden. Die Enzymmengen, die pro Ansatz eingesetzt wurden, mussten jeweils

empirisch herausgefunden werden.

63

Abb. 21: Photometrische Bestimmung (repräsentative Einzelmessungen) der enzymkinetischen Daten für rMpP5βR,

rAtP5βR, rDlP5βR, rGfP5βR und rEcP5βR in der Hanes-Darstellung. Proteinkonzentrationen 0.0125 mg (n = mind. 3).

Die statistische Auswertung aller gemessenen Km- und vmax-Werte gibt die folgende Tabelle

wieder (Tab. 5):

Tab. 5: Kinetische Daten einiger rekombinanter P5βR für die Umsetzung des Cosubstrats.

Substrat Km vmax kcat Km/kcat

[µM] [mkat/kg] [min-1] [M-1/s-1] rAtP5βR NADPH 17,8 +/- 1,4 18,78 +/- 1,46 51,46 48179,8

rDlP5βR NADPH 40,6 +/- 12,9 17,99 +/- 4,14 48,59 19965,5

rEcP5βR NADPH 54,1 +/- 13,7 49,18 +/- 7,68 136,16 46147,4

rGfP5βR NADPH 29,2 +/- 7,2 4,46 +/- 1,23 12,25 7037,9

rMpP5βR NADPH 28,1 +/- 8,6 9,88 +/- 2,71 27,19 16110,9

Die Affinitäten der verschiedenen orthologen P5βR lagen alle im selben Größenbereich. Die

Bestimmung der Werte wurde auch deshalb durchgeführt, um zu untersuchen, ob spätere

Mutationen innerhalb der Bindetasche einen zusätzlichen Effekt auf die Cosubstrat-Bindung

besitzen.

64

Km = 19,8 µM

Vmax

= 6,8 mkat/kg

Km = 18,8 µM

Vmax

= 19,8 mkat/kg

Km = 25,7 µM

Vmax

= 17.8 mkat/kg

Km = 31,7 µM

Vmax

= 1,7 mkat/kg

Km = 58,7 µM

Vmax

= 41,2 mkat/kg

III.3 Modellierung und in silico Analyse der heterolog exprimierten Biosynthese-Gene

III.3.1 Homologie-Modellierung der P5βR und deren Validierung

Um einen Einblick in die räumliche Struktur der funktionellen rP5βR zu erhalten, wurden

diese mit SWISS-Model modelliert. Mit Hilfe des „Template Identification Tools“ wurde nach

möglichen Templates mit experimentell bestimmter Proteinstruktur gesucht. Hierbei fanden sich in

allen Fällen ausschließlich die beiden DlP5βR-Strukturen (PDB 2v6g mit co-kristallisiertem

NADPH bzw. PDB 2v6f ohne NADPH). Als Grundlage für die Modellierung wurde 2v6g gewählt,

da die Auflösung des Kristalls und der E-value des Kristalls geringfügig besser waren als für PDB

2v6f. Modelliert wurde neben den Proteinen, für die enzymkinetische Daten erhoben worden sind

(P5βR aus A. belladonna, A. thaliana, E. crepidifolium, E. rhaeticum, M. piperita), auch die

(funktionell) klonierten P5βR aus A. curassavica, A. rusticana, H. carnosa, L. annua, N. oleander,

Nierembergia aristata, P. major und W. somnifera. Auf Grund der hohen Sequenzidentität der

neuen entdeckten Enzyme von mindestens 69 % zur DlP5βR, wurde für die Modellierung mit

Swiss-Model der automatische Modus gewählt. Die Modelle unterschieden sich im Bezug auf ihre

Gesamtfaltung nur geringfügig hinsichtlich bestimmter „Loops“ an der Oberfläche der Proteine,

waren ansonsten jedoch praktisch identisch (Abb. 22; Pfeile):

65

Abb. 22: Cartoon-Darstellung der Homologie-Modelle der klonierten und funktionell exprimierten P5βR aus A.

thaliana (rAtP5βR, A), D. lanata (rDlP5βR, B; Template für Modellierung; PDB 2v6g), E. crepidifolium (rEcP5βR, C),

G. fruticosus (rGfP5βR, D), M. piperita (rMpP5βR, E). In gelb gezeigt sind Substrat (Progesteron) und Cosubstrat

(NADP+).

Unterschiede zeigten sich in der Mikroarchitektur, z.B. der Aminosäure-Zusammensetzung

der putativen Substratbindetaschen. Gezeigt werden im folgenden die Reste, die sich im Abstand

von bis zu 4 Å um ein in das Model integrierte Substrat (Progesteron) befanden (Abb. 23).

66

Abb. 23: Darstellung der Substratbindetaschen (= Reste im Abstand von 4 Å um das Substrat) der Homologie-Modelle

der klonierten und funktionell exprimierten P5βR aus A. thaliana (rAtP5βR, A), D. lanata (rDlP5βR, B; Template für

Modellierung; PDB 2v6g), E. crepidifolium (rEcP5βR, C), G. fruticosus (rGfP5βR, D), M. piperita (rMpP5βR, E). In

gelb gezeigt sind Substrat (Progesteron) und Cosubstrat (NADP+).

Die Qualität der Modelle wurde via QMEAN Server analysiert (Abb. 24). Für die MpP5βR

lag der globale „QMEAN-Score“ bei 0.73, der „z-Score“ bei -0.25 und somit jeweils in einem

Bereich, der sich mit den durchschnittlichen Werten für experimentell bestimmte Proteinstrukturen

ähnlicher Größe (Anzahl der Aminosäurereste +/- 10 %) vergleichen lässt. Auch bei näherer

Betrachtung der einzelnen Aminosäure-Reste im Protein konnten keine größeren, unstimmigen

Bereiche detektiert werden (Abb. 24.D, Darstellung in rot).

67

Abb. 24: Analyse der Qualität der erzeugten Homologie-Modelle am Beispiel der MpP5βR. A/B Darstellung der

globalen QMEAN-Scores im Vergleich zu nicht-redundanten, experimentell bestimmten Strukturen ähnlicher Größe

(rot = Lage des MpP5βR-Modells); C Aufgliederung des QMEAN-Scores in die Unterpunkte (blau = verlässliche

Bereiche; rot = unsichere Bereiche); D Plot zur detaillierten Beurteilung der Modellqualität (blau = verlässliche

Bereiche; rot = unsichere Bereiche).

Die folgende Tabelle gibt die QMEAN-Score- und z-Score-Werte für alle Homologie-

Modelle wieder, mit denen weiter gearbeitet wurde (III.4.2). Diese Werte wurden zum Vergleich

auch für die experimentell bestimmte Struktur der rDlP5βR (PDB=2v6g) bestimmt (Tab. 6):

68

Tab. 6: Validierungsdaten wichtiger P5βR-Homologie-Modelle mittels QMEAN-Server. Grau unterlegt sind die Werte

für die experimentell bestimmte Kristallstruktur der rDlP5βR.

Protein QMEAN-Score z-Score

rAtP5βR 0.77 0,01

rDlP5βR 0.76 -0,12

rEcP5βR 0,76 -0,17

rErP5βR 0,73 -0,20

rGfP5βR 0,76 0,09

rMpP5βR 0,73 -0,25

rNaP5βR 0,79 0,23

Alle Modelle zeigten somit eine ausreichend gute Qualität für die Planung von Mutagenese-

Experimenten.

69

III.3.2 Exakte Analyse der Substrat-Bindetaschen

Um die quantitativen Unterschiede in der Katalyse der funktionellen P5βR besser zu

verstehen, wurden die Substrat-Bindetaschen der modellierten P5βR näher untersucht. Hierbei

wurden die Reste, die sich in einem Abstand von bis zu 4 Å um das Substrat Progesteron befanden,

als Bindetasche definiert (Abb. 23). Dies umfasste für die DlP5βR die Reste W106, G145, R146,

K147, M150, F153, Y156, Y179, G204, N205, M215, F343, V346, I347, N350, E352 und F353.

Die Besetzung dieser Positionen mit Aminosäureresten in den erstellten Homologie-Modellen ist in

der folgenden Tabelle dargelegt (Tab. 7):

Tab. 7: Analyse der Belegung einzelner Positionen innerhalb der putativen Substratbindetasche unterschiedlicher P5βR.

106 145 146 147 150 153 156 179 204 205 215 343 346 347 350 351 353

D. lanata W G R K M F Y Y G N M F V I N E F

E. crepidifolium W G T K L F L Y N T M F V I V E M

E. rhaeticum W G T K V F L Y N T M F V I V E M

A. belladonna W G R K L F Y Y G T M F L I G D P

G. fruticosus W G G K C F Y Y G N M F I C Y E A

M. piperita W G R K V F V Y G A M F F S Y E P

A. thaliana W G T K L F V Y N M M F V I V E M

A. curassavica W G G K C F Y Y G N M F I C Y E A

H. carnosa W G G K A F W Y G N M F L C Y E A

N. oleander W G L K L F F Y G N M F I V F E Q

P. major W G R K V F I Y G N M F A V I P P

I. canariensis W G R K M F Y Y G N M F V I N E F

N. tabacum W G R K L F Y Y G V M F L M G D R

Durch diesen Vergleich der Bindetaschen fanden sich sieben Positionen, die in allen

Proteinen strikt konserviert vorliegen: Es handelt sich um W106, G145, K147, F153, Y179, M215

und F343 (Nummerierung entsprechend der DlP5βR). Aus den Homologie-Modellen wurde

ersichtlich, dass diese Reste, trotz ihrer teils weiten Entfernung innerhalb der Primärsequenz der

Proteine, geclustert an einer Seite der Bindetasche vorlagen. Die relative Lage dieser Reste in der

Bindetasche wird in Abb. 25 dargestellt:

70

Abb. 25: A Nummerierung der Bindetasche der P5βR am Beispiel der DlP5βR und Darstellung der strukturell-

konservierten Reste W106, G145, K147, F153, Y179, M215, F343. B Häufigkeit von bestimmten Aminosäuren

innerhalb der Bindetaschen der funktionell bestätigten P5βR. Die Schriftgröße des Einbuchstaben-Codes entspricht der

Häufigkeit des Auftretens in den untersuchten P5βR.

Die erstmalige Beschreibung der Reste bereits von uns publiziert (Bauer et al., 2010). Ihre

Rolle für die Katalyse/Struktur der P5βR wurde im Anschluss durch Alanin-Austausch-Mutagenese,

am Beispiel des D. lanata Proteins näher untersucht (III.4.1).

71

III.4 Ortsgerichtete Mutagenese (SDM) der rekombinanten D. lanata P5βR

Aufbauend auf die aus III.1-III.3 gewonnenen Erkenntnisse sollte im folgenden mittels

ortsgerichteter Mutagenese ein verbesserter Einblick in die Struktur und die Funktionalität der

P5βR erhalten werden. Dies ist von besonderem Interesse, da es sich bei diesen Enzymen um eine

neue Untergruppe der „short-chain dehydrogenases/reductases“ (SDRs) handelt, zu der neben einer

einzigen Kristallstruktur kaum strukturelle Daten vorhanden sind (Thorn et al., 2008). Den

Schwerpunkt der Experimente bildeten Versuche, die sich mit den quantitativen Unterschieden der

rDlP5βR und der rAtP5βR befassten und ein rationales Enzym-Engineerings der rDlP5βR zum Ziel.

hatten. Obwohl im Rahmen dieser Arbeit weitere rekombinante P5βR verfügbar wurden, war die

P5βR im folgenden auf Grund der experimentell bestimmten Kristallstruktur der hauptsächliche

Ausgangspunkt aller Mutagenese-Experimente.

III.4.1 Mutagenese der konservierten Reste der Bindetasche der DlP5βR

Um Hinweise auf die Bedeutung der in III.3.2 identifizierten, strukturell-konservierten

Aminosäurereste innerhalb der Bindetasche (W106, G145, K147, F153, Y179, M215, F343) zu

erhalten, sollten Muteine der DlP5βR erzeugt werden, bei denen diese jeweils einzeln mittels

ortsgerichteter Mutagenese durch Alanin ersetzt worden sind. In den folgenden Ausführungen wird

die DlP5βR stets als „Wildtyp“ (WT) bezeichnet (Herl et al., 2006; rDlP5βRnn-13).

III.4.1.1 Herstellung und Validierung der mutierten Plasmide

Das Mutagenese-Protokoll für P5βR wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert und optimiert.

Es beruht auf einer PCR-Reaktion (II.2.1.4), die mit Primern durchgeführt wurde, die jeweils ein

dem Codon-Usage von E. coli angepasstes Alanin-Codon (GCC/GCT) an Stelle des Tripletts der

Aminosäure, die im Wildtyp (WT) substituiert werden sollte, enthielt. Als Template diente jeweils

das von Herl et al. (2006) generierte pQE30/DlP5βR-Konstrukt zur Expression der WT-DlP5βR.

Das Ergebnis dieser PCRs wurde mittels Agarose-Elektrophorese kontrolliert. Dies ist in folgender

Abbildung exemplarisch am Beispiel der angestrebten Substitution von G145, K147, F343 und

M215 gegen Alanin zu sehen (Abb. 26). Die Primer hierzu finden sich unter II.1.10.

72

Abb. 26: PCR mit Mutagenese-Primern zum Austausch der konservierten Reste gegen Alanin und dem

pQE30/DlP5βR(WT)-Konstrukt (1 = G145A_F/G145A_R-Primer, 2 = K147A_F/K147A_R-Primer, 3 =

F343A_F/F343A_R-Primer, 4 = M215A_F/M215A_R-Primer).

Erfolgreiche PCR-Ansätze kennzeichneten sich durch eine (schwach) sichtbare Bande bei

einer Größe von etwa. 4,0 kb (pQ30-Vektor, inkl. D. lanata P5βR-Insert). Bevor mit diesen PCR-

Ansätzen weiter gearbeitet werden konnte, wurde anschließend die Wildtyp-DNA (Template) durch

2-stündigen, selektiven Restriktionsverdau mit DpnI zerstört (II.2.1.18). Dies verringerte die spätere

Zahl an falsch-positiven Bakterien-Kolonien drastisch. Unabhängig von der Ausbeute der PCR

wurden 5 µL des ungereinigten PCR-Ansatzes zur in vivo Ligation und Vermehrung der DNA in

hochkompetente E. coli NEB-5α Zellen transformiert (II.2.1.10). Parallel wurden zur Kontrolle des

DpnI-Verdaus 5 µL des unbehandelten PCR-Ansatzes transformiert.

Zur Verifizierung der erfolgreichen Mutagenese des DlP5βR-Gens wurde die Plasmid-DNA

aus mehreren Bakterienkolonien re-isoliert (II.2.1.14) und sequenziert. Als Primer wurden pQE_FP

und pQE_RP(-50) genutzt. Die Auswertung der erhaltenen Sequenz erfolgte durch ein Alignment

gegen die WT-Sequenz. Ein repräsentativer Ausschnitt eines Nucleotid-Alignments zwischen dem

der WT- und der putativen DlP5βR_W106A-Sequenz zeigt Abb. 27:

73

DlP5βR CGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA 299W106A CGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA 298

************************************************************

DlP5βR CGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAG 359W106A CGTGTTCTACGTTACCGCGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAG 358

**************** ******************************************

DlP5βR CAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACAT 419W106A CAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACAT 418

************************************************************

Abb. 27: Ausschnitt aus dem Alignment der putativen DlP5βR_W106A-Sequenz gegen den D. lanata WT (rot = Trp-

Codon; grün = Ala-Codon).

In der WT-Sequenz befindet sich an den Position 316-318 mit TGG ein Tryptophan-Codon

(rot). Im Falle der mutierten Sequenz war der korrespondierende Sequenz-Abschnitt durch das

Alanin-Codon GCG (grün) ersetzt. Die Ergebnisse der Codon-Substitutionen bei allen anderen

Mutagenese-Experimente sind in Tab. 8 aufgelistet.

Tab. 8: Codons der konservierten Aminosäurereste im WT und nach erfolgreicher Mutagenese.

Position Altes Codon (WT) AS Neues Codon AS

106 TGG W GCG A

145 GGG G GCT A

147 AAG K GCG A

153 TTT F GCT A

215 ATG M GCG A

343 TTT F GCT A

Die Daten zeigten, dass mittels der Mutagenese-PCR (Expressions-)Plasmid-Konstrukte mit allen

gewünschten Mutationen der Dl5βR (W106A, G145A, K147A, F153A, M215A, F343A) erzeugt

werden konnten. Diese Konstrukte wurden zur Protein-Expression in chemisch kompetente E. coli

M15 [pREP4] Zellen transformiert (II.2.1.10). Der Austausch des katalytischen Tyrosins (Tyr-179)

gegen Alanin wurde bereits von Thorn et al. (2008) beschrieben. Das rDlP5βR Y179A-Mutein war

komplett inaktiv.

74

III.4.1.2 Überexpression und Bestimmung der katalytischen Aktivitäten der Muteine

Die Überexpression aller Muteine und die native His-tag Reinigung (II.2.2.1-II.2.2.2)

erfolgte nach den Standardbedingungen für den DlP5βR WT, da - wie beschrieben - lediglich

einzelne Reste im Inneren des Proteins ausgetauscht wurden. Auf diese Art konnten alle Muteine

erfolgreich gereinigt werden. Jeweils 0,2 mg des rekombinanten Proteins wurden in einem

Standard-P5βR-Enzymassay eingesetzt (II.2.3.6). Die Auswertung der katalytischen Effizienz

erfolgte zunächst mit Hilfe der DC um eine Einschätzung des Aktivitätsgrads der Muteine treffen zu

können. Als Standard-Substrat diente hierbei Progesteron. Zur Bestimmung der relativen

Aktivitäten wurden die Verhältnisse von gebildetem Produkt zu Substrat nach einer Assay-Dauer

von genau 2 h zusätzlich auch gaschromatographisch quantifiziert. Abbildung 28 zeigt die

Ergebnisse dieser Versuchsreihen.

75

Abb. 28: GC-MS- und DC-Analyse der Standard-P5βR-Assays aller Muteine (0,2 mg/Assay) mit 0,5 mM Progesteron

bei 30 °C nach 2 h (Mut = Assay mit Mutein; WT = Referenz-Assay mit WT).

Die Ergebnisse der Versuche zeigten, dass der Austausch der strukturell-konservierten

Aminosäure-Reste gegen Alanin in allen Fällen jeweils zu einem drastischen Rückgang der

katalytische Aktivität führte. Dieser Rückgang lag im Bereich zwischen 51 und 100 Prozent. Die

Substitution von Gly-145 und Phe-153 hatten einen vollständigen Verlust der Aktivität zur Folge.

Andererseits führte die Mutagenese des als katalytisch essentiell geltende Lysin-Restes (Lys-147)

76

erstaunlicherweise nicht zum kompletten Funktionsverlust. Für das Mutein wurde eine Restaktivität

von ca. 13 Prozent gemessen. Die berechneten relativen Aktivitätswerte sind in Tab. 9

zusammengefasst:

Tab. 9: Berechnete relative Enzym-Aktivitäten für alle Muteine nach Alanin-Austauschmutagenese der konservierten

Aminosäure-Reste (n = 5 - 12; n.d. = nicht detektierbar; MW +/- STABW).

Mutein AUC(Produkt)/AUC(Produkt+Substrat) Relative Aktivität

rDlP5βR WT 0.25 +/- 0.04 100

rDlP5βR W106A 0.12 +/- 0.01 48

rDlP5βR G145A n.d.1 0

rDlP5βR K147A 0.03 +/- 0.01 12

rDlP5βR F153A n.d.1 0

rDlP5βR M215A 0.13 +/- 0.01 52

rDlP5βR F343A 0.04 +/- 0.01 16

Die beiden Muteine, die im Standard-P5βR-Assay mit Progesteron keine nachweisbare

Enzym-Aktivität mehr zeigten (DlP5βR G145A bzw. F153A), wurden zusätzlich photometrisch auf

die Umsetzung von 2-Cyclohexen-1-on hin untersucht. Dadurch sollte geklärt werden, ob der

Funktionsverlust der Proteine auf Progesteron als Substrat beschränkt war. Pro Assay wurden 0,2

mg Protein und 0,4 mM Substrat eingesetzt. Bei 40 °C wurde eine mögliche Reaktion indirekt über

den Verbrauch an Cosubstrat bestimmt. Es konnte in keinem der beiden Fälle eine signifikante

Umsetzung gemessen werden (Abb. 29).

Abb. 29: Photometrische Messung der Abnahme der Extinktion des Cosubstrats (λ = 340 nm) am Beispiel der

Umsetzug von 2-Cyclohexen-1-on (0,4 mM) durch das inaktive rDlP5βR F153A-Muteins (0,2 mg).

77

Aus den Steigungen konnten die spezifischen und relativen Aktivitäten aller Muteine für die

Umsetzung von 2-Cyclohexen-1-on (Konzentration 0,4 mM) errechnet werden (II.2.4.3). Bei alle

mutierten Proteinen zeigte sich einen deutlich Rückgang der Enzymaktivität (Tab. 10).

Tab. 10: Spezifische und relative Aktivitäten der Alanin-Austausch-Muteine mit CH als Substrat (EK = 0,4 mM; Temp.

= 40 °C) photometrisch bestimmt (n.d. = nicht detektierbar.; n > 3; MW +/- STABW).

Mutein Spezifische Aktivität [U/mg] Relative Aktivität

rDlP5βR WT 0,3279 +/- 0,0322 100,0

rDlP5βR W106A 0,0093 +/- 0,013 2,8

rDlP5βR G145A n.d. n.d

rDlP5βR K147A 0,0031 +/- 0,001 0,9

rDlP5βR F153A n.d. n.d.

rDlP5βR M215A 0,0043 +/- 0,001 1,3

rDlP5βR F343A 0,0032 +/- 0,001 0,9

Der Verlust an Enzymaktivität verglichen mit dem WT der rDlP5βR war insgesamt

betrachtet noch ausgeprägter, als bei den Messungen mit Progesteron als Substrat. Die Aktivität der

Muteine lagen alle unter 3 % verglichen zum Wildtyp. Auch in diesen Versuchen konnte weder für

die Substitution G145A, noch für F153A, Aktivität mehr gemessen werden, was deren potentielle

Wichtigkeit für die Struktur des Proteins nahelegt.

Zusätzlich wurden erste Muteine der rAtP5βR hergestellt um die Auswirkungen der

Substitution der beiden Phenylalanine (analog zu Phe-153 und Phe-343 in der DlP5βR) auch in

diesem Enzym zu messen. Die Herstellung der AtP5βR F153A- und AtP5βR F3423A-Muteine

erfolgte mittel ortsgerichteter Mutagenese via Mutagenese-PCR (II.2.1.13). Über DNA-

Sequenzierung wurde die Mutagenese auf Nukleotid-Ebene bestätigt (II.2.1.16). Die Mutagenese

aller weiteren hier identifizierten, konservierten Aminosäuren der rAtP5βR wird von Herrn Jan

Petersen im Rahmen seiner Masterarbeit fortgeführt.

III.4.1.3 Kinetische Untersuchung der Muteine

Zusätzlich zu den relativen Aktivitäten wurden auch kinetische Enzym-Daten einiger

Muteine experimentell bestimmt. Da die Aktivitäten mit Progesteron für die Messmethode zu

gering waren, wurde statt dessen auf das bereits beschriebene Substrat-Mimetikum Cyclohexenon

zurückgegriffen. Messungen gelangen nur bei einer Erhöhung der Protein-Konzentration im

78

Photometer-Assay auf 0,2 mg/mL für die rDlP5βR K147A, F343A und M215A.

Tab. 11: Kinetische Daten einiger Alanin-Austausch-Mutanten der rAtP5βR bzw. der rDlP5βR (MW +/- STABW; n = 1

-4; n.d. = nicht detektierbar).

Substrat Km vmax kcat [µM] [mkat/kg] [min-1]

rAtP5βR F153A CH 1011,2 22,71 62,1

rAtP5βR F343A CH 329,2 2,3 6,29

rDlP5βR G145A CH n. d.

rDlP5βR K147A CH 46,9 +/- 21,6 0,065+/-0,010 0,18

rDlP5βR F153A CH n. d.

rDlP5βR M215A CH 107,6 +/- 69,0 0,1278 +/- 0,034 0,35

rDlP5βR F343A CH 206,1 +/- 133,5 1,067 +/- 0,203 2,89

Bei den Messungen der rAtP5βR-Muteine handelt es sich nur um Doppelbestimmungen (n =

2), die nur zur ersten Orientierung durchgeführt wurden. Man erkennt allerdings, dass der vmax-Wert

des F343-Muteins im Vergleich zum A. thaliana WT durch den Austausch auf etwa 1/10 gesunken

ist (s. Tab. 4). Das identische Phänomen eines Rückgangs des vmax-Werts auf 1/10 wurde auch für

das rDlP5βR F343A-Mutein gemessen. Beim A. thaliana-Protein führte der Austausche der Phe-153

nicht zu einem vollständigen Funktionsverlust, allerdings verkleinerte sich die Affinität des Proteins

für CH stark (Km des WT = 115,7 +/- 1,6; Vgl. Tab. 4).

III.4.1.4 In silico Betrachtung der Muteine DlP5βR G145A und F153A

Um eine Erklärung zu finden, weshalb die Substitutionen von Gly-145 und Phe-153 jeweils

zu einem vollständigen Funktionsverlust der beiden Muteine führten, erfolgte eine genauere in

silico Analyse der Kristallstrukturen der DlP5βR (PDB 2v6g und 2v6f). Hierzu wurde Progesteron,

das nicht im Kristall enthalten war, in das Enzym modelliert.

Für Gly-145 findet sich eine große räumliche Nähe sowohl zum Substrat (Progesteron), als

auch zur wichtigsten katalytischen Aminosäure Tyr-179 (Abb. 30, A). Das Cα-Atom des Glycins

befindet sich in einem Abstand von 3,8 Å zum O-Atom der Seitenkette des Tyrosins und 5,9 Å

entfernt von nächstgelegenen C-Atom des Progesterons. Die in silico Mutagenese dieses

Aminosäure mit Pymol (II.2.5) zeigt, dass durch die größere Seitenkette der C-O-Abstand auf 2,8 Å

und der C-C-Abstand auf 3,6 Å sinken (Abb. 30, B). Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe,

79

dass es zu einer sterischen Hinderung innerhalb der Substratbindetasche kommt und die Katalyse

deshalb gestört wird. Gleichzeitig sinkt mit dem Austausch eines Glycins die Flexibilität der

Bindetasche.

Abb. 30: In silico Mutagenese von Gly-145 (A = DlP5βR WT, PDB 2v6g; B = DlP5βR G145A). In Rot dargestellt sind

Substrat und Cosubstrat der Reaktion.

Analoge in silico Mutagenese-Experimente für das F135A-Mutein lieferten keine

eindeutigen Ergebnisse. Allerdings wurde im Weiteren die Lage aller identifizierten, konservierten

Reste in den beiden verfügbaren Kristallstrukturen am PC überlagert (Abb. 31). Hierbei wurde

ersichtlich, dass die relative Position aller 7 Aminosäure-Seitenketten sich unabhängig von der

Anwesenheit oder Abwesenheit von NADP+ nicht entscheidend verändert. Nur der Indol-Ring von

Trp-106 ändert geringfügig seine Lage. Die Ausnahme hierzu stellte Phe-153 dar. Die Aminosäure

ist Teil eines flexiblem „loops“, der einen Teil der Bindetasche bildet, beginnend bei Met-150.

Dieses Ergebnis wurde zusätzlich gestützt durch die niedrigen B-Faktoren, die für diesen Teil des

Protein-Kristalls angegeben werden.

80

Abb. 31: Vergleich der Positionen der konservierten Aminosäure-Reste in den beiden Kristallstrukturen der DlP5βR (A

= Kristall mit Cosubstrat; B = Kristall ohne Cosubstrat). Zu sehen sind das Substrat (Progesteron; blau) und das

Cosubstrat (NADP+; grün).

Die Ergebnisse geben einen Hinweis auf eine Art „Substrat-Klammer“ an der Phe-153

beteiligt ist. Zusammenfassend konnte in diesem Teil der Arbeit die Bedeutung der neu

identifizierten Aminosäure-Reste sowohl experimentell, als auch in silico gezeigt werden.

Gleichzeitig wurde experimentell die absolute Notwendigkeit des zweiten katalytischen

Aminosäure-Restes Lys-147 relativiert.

81

A

B

III.4.2 Rationale Mutagenese zur Steigerung der katalytischen Aktivität der rDlP5βR

Das wesentliche Ziel der Mutagenese-Experimente der DlP5βR war es die publizierten

Aktivitätsunterschiede für die Reduktion von Progesteron zwischen den beiden homologen P5βR

aus D. lanata und A. thaliana zu erklären (siehe I.2.2). Diese quantitativen Unterschiede wurden im

Rahmen dieser Arbeit reproduziert und neben Progesteron auch für das zweite gewählte Standard-

Substrat 2-Cyclohexen-1-on demonstriert (II.2.3.4). Ein rationales Mutagenese-Konzept wurde

entwickelt, in welchem neben den beiden genannten Proteinen auf die Sequenz-, Struktur- und

Aktivitätsinformationen der im Rahmen dieser Arbeit klonierten, funktionell exprimierten,

homologen P5βR (rEcP5βR, rErP5βR, rGfP5βR, rMpP5βR) zurückgegriffen wurde. Daneben

wurden bereits bestehende in silico Erklärungen experimentell überprüft (Herl et al., 2009).

III.4.2.1 Ableitung von essentiellen Aminosäuren für die katalytische Aktivität der rDlP5βR

Ein Vergleich der hoch aktiven rAtP5βR und schwach aktive rDlP5βR zeigte im direkten

Alignment (II.2.5) eine Identität von ca. 70 Prozent auf Aminosäure-Ebene. Dies entsprach 118

Unterschieden in den Primärstrukturen der beiden Proteine, wobei keine Wertung der einzelnen

Substitutionen hinsichtlich ihrer Lage im Protein bzw. ihrer Qualität (konservative Substitutionen,

etc.) vorgenommen wurde. Zur weiteren Einschränkung von putativ wichtigen Aminosäure-Resten

wurde mit CLUSTALw ein „Multiple Sequence Alignment“ erstellt, das neben der DlP5βR und der

AtP5βR die in dieser Arbeit aus diesem Grund neu klonierten, funktionell exprimierten EcP5βR,

ErP5βR, GfP5βR und MpP5βR beinhaltete. Wie bereits dargelegt, fanden sich, wie bei der

Klonierung angestrebt, P5βR von 2-3 Aktivitätsstufen, wobei die phylogenetisch näher verwandten

Gruppen DlP5βR/MpP5βR bzw. AtP5βR/ErP5βR/EcP5βR jeweils überraschenderweise sehr

unterschiedliche Aktivitätswerte zeigten. Die GfP5βR besaß kaum noch katalytische Aktivität. Für

das Aktivitäts-Screening reichte ein einfacher Aktivitätsvergleich mit DC und GC unter

Standardbedingungen (Abb. 16). Die Kenntnis der genauen kinetischen Konstanten der Enzyme

war nicht notwendig, obwohl diese zu einem späteren Zeitpunkt ebenfalls bestimmt wurden

(II.2.3.4). Im Alignment wurden die phylogenetisch näher verwandten Gruppen von P5βR mit

verschiedener Aktivität jeweils zum direkten Vergleich untereinander angeordnet (Abb. 32).

DlP5βR MSWWWAGAIG AAKKRLEED- DAQPKHSSVA LIVGVTGIIG NSLAEILPLA 49MpP5βR .......... ....K....- E.P.NYQ... .V......V. .........S 49AtStR .......... ....K.D..- EPSQSFE... ..I.....V. .........S 49EcP5βR ....G..... ....K.DD.- EPSQSYE... ..I.....V. .........S 49ErP5βR ....G..... ....K.DD.- EPTQSYE... ..I.....V. .........S 49GfP5βR .......... ..RQKKTD.Y T.LT.FQ..G ..I.....V. .........S 50

82

I

DlP5βR DTPGGPWKVY GVARRTRPAW HEDNPINYVQ CDISDPDDSQ A...PLTDVT 99MpP5βR .......... .....P.... ND.H..T.IR ..V..SG.AK E.......L. 99AtStR .......... .....P..T. NA.H..D.I. ..V..AE.TR S......... 99EcP5βR .......... .....P..S. NA.H..D.I. ..V.NAE.AR S......... 99ErP5βR .......... .....P..S. NA.H..D.I. ..V.NAE.AR S......... 99GfP5βR .......... .....P.... NA.H..E... ...ANRE.TE E...K..... 100

DlP5βR HVFYVTWANR STEQENCEAN SKMFRNVLDA VIPNCPNLKH ISLQTGRKHY 149MpP5βR NI.....T.K ...A...... G..LK..... L......... VC.L...... 149AtStR .V.....T.. ES.S...... GS.L....Q. I..YA...R. VC....T... 149EcP5βR .V.....TK. ES.S...... GS.L....Q. IV.HA...R. .C....T... 149ErP5βR .V.....T.. ES.S...... GS.I....Q. IV.HA...R. .C....T... 149GfP5βR .V.......K .N.I....V. G..LK....V LV....K.Q. VC....G... 150

DlP5βR MGPFESYGKI ESHDPPYTED LPRLKYMNFY YDLEDIMLEE VEKKE-GLTW 198MpP5βR V.....V... RA....F... ....DCP... .T....LF.. .Q...-.... 198AtStR L...TNVDG- PR....F... M...QIQ... .TQ...LF.. IK.I.-TV.. 197EcP5βR L...SNLDG- PR....F... M...QIQ... .TQ...LF.. IK...ISV.. 198ErP5βR V...SNL.GG PR....F... M...QIQ... .TQ..TLF.. IK...-SV.. 198GfP5βR C....L...V -G.E..F... ....DVP... .T...VLF.A .G...-.... 198

DlP5βR SVHRPGNIFG FSPYSMMNLV GTLCVYAAIC KHEGKVLRFT GCKAAWDGYS 248MpP5βR ......A... .......... .......... ....A....P ...G.....Y 248AtStR .I...NM... .....L..I. .......... ....SP.L.P .S.K..E.FM 247EcP5βR .I...NT... .....L..I. .......... ....SP.L.P .S.K..E.FT 248ErP5βR .I...NT... .....L..I. .......... ....SP.L.P .S.K..E.FT 248GfP5βR .......... .....L.... .......... ..D.VP.K.P ...E..E... 248

DlP5βR DCSDADLIAE HHIWAAVDPY AKNEAFNVSN GDVFKWKHFW KVLAEQFGVG 298MpP5βR .......... .Q........ .....L.... .......... .........E 298AtStR TA........ QQ........ .......CN. A.I.....L. .I......IE 297EcP5βR TA........ QQ........ .......CN. A.I.....L. .I......IE 298ErP5βR TA........ QQ........ .......CN. A.I.....L. .I......IE 298GfP5βR V......... .Q.......F .......... .......... .......D.E 298

DlP5βR CGEYEEGVDL KLQDLMKGKE PVWEEIVREN GLTPTKLKDV GIWWFGDVIL 348MpP5βR .......NEV .......D.G ...D...... ..S....E.. .....A.FS. 348AtStR EYGF...KN. G.VEM..... R....M.K.. Q.QEK..EE. .V...A.... 347EcP5βR EYGF...KN. G.VEM..... R....M.K.. Q.QEK..EE. .V...A.... 348ErP5βR QYGF...KN. G.VEM..... R....M.K.. Q.QEK..DE. .V...A.... 348GfP5βR ....-..EK. S.E.M..D.G G..D...A.. ..A....EE. .L.....IC. 347

DlP5βR GNECFLDSMN KSKEHGFLGF RNSKNAFISW IDKAKAYKIVP 389 MpP5βR .Y..P..T.. .......... .....S.... ...V....... 389AtStR .V.GMI.... ....Y..... ...N.S.... ...Y..F.... 388 EcP5βR .V.GMI.... .......... ...N.S.... ...Y..F.... 389ErP5βR .V.GMI.... .......... ...N.S.... ...Y..F.... 389 = 71 GfP5βR .Y..A.M... .......... .......... .E.M....... 388 = 26

Abb. 32: Multiple Sequenz-Alignment der P5βR zur Ableitung von essentiellen Aminosäure-Resten für die katalytische

Aktivität. Grün = Unterschiede zwischen der DlP5βR/MpP5βR ; Rot = Unterschiede zwischen der AtP5βR/EcP5βR/

ErP5βR; Graue Kästen = Überschneidungen der beiden Gruppen; Grüne Kästen = putativ essentielle Aminosäure-Reste.

83

205 248

156

II III

IV

V

VI

In einem ersten Schritt wurden mit Hilfe des Alignments die Primärstruktur-Unterschiede

innerhalb des rDlP5βR (geringe bis mittlere Aktivität) / rMpP5βR (hohe Aktivität) herausgearbeitet

(grün). Da die beiden Pflanzen nähere Verwandtschaft aufweisen, als das ursprüngliche

rDlP5βR/rAtP5βR-Paar, konnte die Anzahl der putativ wichtigen Positionen von 181 auf 71

reduziert werden. In gleicher Weise wurde mit der zweiten Gruppe rAtP5βR (hohe Aktivität) /

ErP5βR bzw. EcP5βR (jeweils geringe Aktivität) verfahren (rot). Hierbei fanden sich nur 26

Aminosäuren, die in der A. thaliana Variante anders waren, als in den beiden Erysimum sp.

Enzymen.

Unter der Annahme, dass die höheren Aktivitäten jeweils auf Mutationen an identischen

Bereichen der Enzyme zurückzuführen sind, wurde nun nach Überschneidungen aus den beiden

Ableitungen gesucht, also Positionen, die sowohl in der ersten als auch in der zweiten Gruppe

unterschiedlich besetzt sind (graue Kästen). Dies grenzte die zu untersuchenden Enzymbereiche

nunmehr auf 10 Positionen ein. Diese waren (bezogen auf die DlP5βR) Q22, H25, S88, F123, I140,

M150, Y156, N205, S248 und K336. Aminosäuren, die in den hoch aktiven Enzymen und der sehr

schwachen GfP5βR identisch waren - wie der Valin-Rest in Position 140 - wurden ebenfalls als

unbedeutend eingestuft.

Bei den übrigen identifizierten Positionen wurde untersucht, ob man bei den stark bzw.

schwach aktiven P5βR an den korrespondierenden Stellen identische bzw. Aminosäuren mit

ähnlichen chemischen Eigenschaften finden kann. Dies resultierte letzten Endes im Ausschluss aller

Positionen mit der Ausnahme von Y156, N205 und S248 (grüne Kästen): Anstatt des Restes

Tyrosin-156 fand man in beiden hoch-aktiven Enzymen ein Valin. Die Stelle 205 ist bei schwächer

aktiven P5βR durch einen hydrophilen Asparagin- bzw. Threonin-Rest gekennzeichnet, während

sonst mit Alanin (MpP5βR) bzw. Methionin (AtP5βR) hydrophobe Aminosäuren vorlagen.

Ähnliches gilt für Position 248, für die bei den schwach-aktiven Proteinen ein Threonin oder Serin

auftraten, ansonsten aber ein Methionin (AtP5βR) bzw. ein Tyrosin (MpP5βR). Aus diesem Grund

sollten im weiteren Verlauf, bei den Versuchen zum rationalen „Engineering“ der katalytischen

Aktivität der rDlP5βR, die Y156V-, N205(M/A)- und S248(M/Y)-Muteine mittels SDM hergestellt

werden.

III.4.2.2 Ortsgerichtete Mutagenese der D. lanata P5βR

Die Mutagenese erfolgte, wie bereits unter III.4.1 beschrieben, für den Austausch der

strukturell konservierten Aminosäure-Reste W106, G145, K147, F153, M215 und F343 gegen

Alanin. Abb. 33 zeigt beispielhaft das Agarose-Gel der PCR des pQE30/DlP5βR-Vektorkonstruktes

(Herl et al., 2006) mit der N205M_F / N205M_B- Primerkombination vor und nach dem Verdau der

84

WT-Template-DNA mit DpnI. Das Vorgehen bei der Erzeugung, Überprüfung und Überexpression

der anderen unter III.4.2.2 definierten Muteine erfolgte in Analogie.

Abb. 33: PCR mit der WT DlP5βR-DNA (pQE30/DlP5βR-Vektorkonstrukt) und N205M_F/N205M_B-Primern (1 =

Vor DpnI-Verdau; 2 = Nach DpnI-Verdau; M = 1kb Marker).

Die mutierten Plasmid-DNAs für N205M, N205A, Y156V, S248M und S248Y wurden zur

Vermehrung in chemisch-hochkompetente E. coli NEB-5α Zellen transformiert (II.2.1.10). Die

Bestätigung der erfolgreichen Mutagenese der Plasmid-DNA wurde wie bei III.4.1.1 durchgeführt

(Abb. 34).

DlP5βR WT TCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGG 655

DlP5βR N205M TCATCGCCCAGGGATGATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGG 647 ************** *****************************************

Abb. 34: Alignment der Sequenz der putativen DlP5βR N205M Mutante gegen die WT DNA (rot = Asn-Codon; grün =

Met-Codon).

Die Überexpression der mutierten Enzyme (DlP5βR Y156V, N205M, N205A, S248M,

S248Y) erfolgte in E. coli M15[pREP4] unter den Bedingungen des rDlP5βR-WTs bzw. wie bereits

für die Alanin-Austausch-Muteine dargelegt (III.4.1). Alle angestrebten Muteine konnten so nativ in

guter Ausbeute gewonnen werden.

85

M 1 2 M

III.4.2.3 Relative Aktivitäten und kinetische Untersuchungen der gefundenen Muteine

Zur Bestimmung der katalytischen Aktivitäten der Muteine wurden Standard-P5βR-

Enzymassays bei einer Temperatur von 30 °C und 0,5 mM Progesteron über 2 h, mit 0,02 - 0,2 mg

Enzym, durchgeführt (II.2.3.6; Abb. 35).

Abb. 35: GC-MS-Messungen der DlP5βR (WT) und der Muteine Y156V, N205A und N205A.

Die DlP5βR-Muteine Y156V, N205A und N205M zeigten sowohl in der DC-, als auch in

GC-MS-Analyse eine deutlich stärkere Umsetzung des Progesterons zu 5β-Pregnan-2,30-dion. Die

Substitution des Serin-248 Restes gegen Alanin oder Tyrosin hatte zur Folge, dass keine Umsetzung

mehr nachweisbar war (Daten nicht gezeigt).

Für die Bestimmung der relativen Aktivitäten mittels GC-MS wurden die Konzentrationen

der Proteine im P5βR-Enzymassay auf 0,02 mg/mL reduziert, um einen Produktüberschuss über die

komplette Dauer des Assays zu gewährleisten. Als Referenz wurde der DlP5βR WT genutzt. Es

wurden minimal sechs verschiedene Protein-Chargen in Doppelbestimmung untersucht. Bei den

ermittelten Werten (Tab. 11) handelt es sich jeweils um relative (apparente) Aktivitäten, d.h. einen

86

Vergleich der Umsatzraten von Progesteron durch die Muteine im Vergleich zum WT unter den

Bedingungen des P5βR-Standardassays (30 °C, 2 h). Die Bedingungen wurden nicht für jede

Mutante optimiert (s. Diskussion IV.2).

Tab. 11: GC-MS-Messwerte und berechnete relative Aktivitäten der Y156-, N205- und S248-Muteine (n = mind. 12 ;

n.d. = nicht detektierbar – Methode validiert von Herl et al., 2006; MW +/- STABW).

Mutein AUC Relative, apparente Aktivität

[Produkt-/Gesamtfläche]

DlP5βR WT 0,25 +/- 0,04 100 %

DlP5βR Y156V 0,66 +/- 0,13 264 %

DlP5βR N205A 1,43 +/- 0,17 572 %

DlP5βR N205M 1,16 +/- 0,09 464 %

DlP5βR S248M n.d. n.d.

DlP5βR S248Y n.d. n.d.

DlP5βR Y156V_N205M 1,11 +/- 0,17 444 %

Die relativen Aktivitäten zeigten einen deutlichen Anstieg der Aktivität durch den Austausch

von Y156 bzw. N205. Die Y156V Mutante besaß eine ca. doppelt so hohe apparente Aktivität wie

der WT. Für die beiden Muteine N205A (Substitution in Analogie zu MpP5βR) und N205M

(Substitution in Analogie zu AtP5βR) konnte jeweils durch die Mutation einer einzigen Aminosäure

eine sehr deutliche Steigerung der apparenten relativen Aktivität auf das ca. 5-fache erreicht

werden. Die Mutagenese des Serin-Restes in Position 248 hatte für beide Muteine (S248M und

S248Y) eine deutliche Verminderung der Aktivität zur Folge. Nach 2 h Assayzeit mit 0,2 mg

Protein konnte jeweils kein 5β-Pregnan-3,20-dion nachgewiesen werden.

Um eine Erklärung für die gemessenen Effekte zu erhalten, wurden die Km – und kcat-Werte,

sowie die katalytische Effizienz (kcat/Km) für die Muteine Y156V, N205A und N205M

photometrisch bestimmt (II.2.4.3; Abb. 36). Als Substrate wurden Progesteron und 2-Cyclohexen-1-

on verwendet. Die Enzymkinetiken der beiden WT-Proteine (rAtP5βR, rDlP5βR) wurden ebenfalls

bestimmt.

87

Abb. 36: Hanes-Plots zur Bestimmung der DlP5βR Y156V-, N205A- und N205M-Muteine nach photometrischer

Messung der Enzym-Aktivitäten mit PRO und CH als Substrat.

Tabelle 12 gibt einen Überblick über die Km und kcat-Werte aller WT-Proteine und der

Muteine. Da es sich um fast homogen gereinigte Enzyme handelte, wurden aus den vmax-Werten die

Wechselzahlen (kcat) berechnet.

88

Tab 12: Kinetische Daten der Aktivitäts-Muteine und rDlP5βR / rAtP5βR (n = mind. 3).

Enzym/ Substrat Km kcat kcat/Km CH (kcat/Km)/ Mutein [µM] [s-1] [M-1s-1] Pro (kcat/Km)

rDlP5βR Pro 362.3 +/- 57.5 0.0189 +/- 0.0022 52.2

CH 333.3 +/- 28.5 0.4874 +/- 0.0495 1462.3 28.0

rAtP5βR. Pro 268.3 +/- 23 0.1685 +/- 0.0498 628.0

CH 115.7 +/- 1.6 1.1142 +/- 0.0630 9630.1 15.3

DlP5βR N205A Pro 84.6 +/- 42.7 0.0366 +/- 0.0088 432.6

CH 174.9 +/- 31.2 1.0965 +/- 0.0969 6269.3 14.4

DlP5βR N205M Pro 63.3 +/- 17.6 0.0299 +/- 0.0049 472.4

CH 195.5 +/- 10.1 0.4751 +/- 0.0781 2430.2 5.1

DlP5βR Y156V Pro 71.5 +/- 48.3 0.0075 +/- 0.0035 104.9

CH 1150 +/- 130 0.6772 +/- 0.0625 588.9 5.6

DlP5βR Y156V_ Pro 90.1 +/- 10,5 0,0411 +/- 0.01 456,2

N205M CH 334,4 +/- 33,7 1,0877 +/- 0,24 3252,7 7.1

Nach diesen Ergebnissen war 2-Cyclohexen-1-on sowohl für die WT-P5βR, als auch für die

N205- und Y156-Muteine das bevorzugte Substrat. Die rAtP5βR setzte das Substrat z.B. etwa 15-

fach besser um als Progesteron. Die Steigerung der Aktivitäten der N205A – und N205M-Muteine

trat nicht nur bei Progesteron, sondern auch bei 2-Cyclohexen-1-on auf. Hierbei wurde aber auch

ein selektiver Effekt auf die Substratspezifität sichtbar. Bei N205A erhöhte sich die Aktivität für

beide Substrate etwa in der gleichen Größenordnung, während bei N205M die

Aktivitätsverbesserung für Progesteron deutlich größer ausfällt als für 2-Cyclohexen-1-on. Auffällig

war bei allen Mutanten die erhöhte Affinität für beide Substrate. Bei Progesteron sank er von 362

µM (WT) auf 63.3 µM (N205M) bzw. 84.6 µM (N205A). Die Aktivitätsunterschiede zwischen der

rAtP5βR und rDlP5βR für die Reduktion von Progesteron betrug den Faktor 12. Die Werte für die

DlP5βR-Doppelmutante Y156V_N205M wurden ebenfalls unter diesen Bedingungen bestimmt,

obwohl im Screening mit dem Standard-P5βR-Assay keine synergistischen Effekte vermutet

werden konnten.

Auch die Km-Werte der Einfach-Mutanten mit gesteigerter Aktivität wurden bestimmt

(II.2.4.3). Alle lagen etwa im Bereich des WTs: Y156V (21,5 +/- 2,5 µM; n = 2), N205A (18,8 +/-

5,2; n = 3) und N205M (18,3 +/- 1; n = 2).

Die in silico Betrachtung der DlP5βR-Strukturen (PDB 2v6g, 2v6f) und der modellierten

Enzyme (II.2.5, III.3) zeigte, dass es sich bei den Aminosäuren an Positionen 156 und 205 (bezogen

auf D. lanata) jeweils um Teile der Bindetaschen handelte (Abb. 37).

89

Abb. 37: Die identifizierten „hot spots“ Y156, N205 und S248 für die Aktivitätsmutagenese bilden einen Teil der

Bindetasche der DlP5βR.

Zusammenfassend zeigten die Versuche, dass mit Hilfe des „bioactivity-guided screening“-

Ansatzes zum rationalen Protein-Design, mutierte Varianten der DlP5βR mit einer deutlich

gesteigerten katalytischen Effizienz hergestellt werden konnten. Für zwei von drei Aminosäure-

Substitutionen, die als putativ bedeutend für die Aktivität identifiziert werden konnten, gelang der

experimentelle Beweis.

Die Positionen 156 und 205 wurden zur Kontrolle zusätzlich bei der rEcP5βR und der

rErP5βR mutiert, wobei die Aktivität ebenfalls stark gesteigert werden konnte (DC- und GC-

Kontrolle; Daten nicht gezeigt). Eine weitere Charakterisierung dieser Erysimum-P5βR-Muteine

erfolgte nicht.

III.4.2.4 Alternative Strategien zur Verbesserung der katalytischen Aktivität

Alternativ zur beschriebenen Methode (und zu deren Überprüfung) wurde auch die

bestehende, aus in silico-Daten abgeleitete Theorie von Herl et al. (2009) experimentell überprüft.

Die Autoren diskutierten den Leu-182 Rest im rDlP5βR als wesentliche Ursache für die geringere

Aktivität dieses Enzyms, da sich in der entsprechenden Position bei klassischen SDRs ein Gln-Rest

befindet. Dieser Aminosäure-Rest wurde im „bioactivity-guided Screening“ allerdings nicht als

Schlüsselposition identifiziert.

90

Als Template für die Mutagenese diente erneut das von Herl et al. (2006) erstellte

pQE30/P5βR-Konstrukt (Klon Nr. 16). Die Mutagenese erfolgte mit den Primern aus II.1.10 bei 50

°C Annealing-Temperatur. Abbildung 38 zeigt die Kontrolle des Ergebnisses der PCR-Reaktion

mittels Gelelektrophorese.

Abb. 38: PCR zum Austausch von Leu-182 gegen Gln mit dem pQE30/DlP5βR(WT)-Konstrukt (M = Marker; 1 =

PCR-Reaktion).

Das weitere Vorgehen erfolgte in Analogie zu den bereits beschriebenen Mutagenese-

Experimenten.

Zur Überprüfung der katalytischen Aktivität wurden 0,2 mg des nativ gereinigten rDlP5βR

L182Q-Muteins in einem Standard-P5βR-Assay (II.2.3.6) eingesetzt. Unabhängig von der

verwendeten analytischen Methode zeigte sich eine Aktivität, die mit einer relativen Aktivität von

120 Prozent in etwa der des rekombinanten WT Proteins entsprach. In einem weiteren Experiment

sollte die benachbarte Aminosäure Asp-181 zusätzlich mutiert werden, um eventuelle

Nachbargruppen-Effekte zu klären. Das D181T_L182Q Mutein zeigte jedoch eine leicht verringerte

Aktivität von ca. 80 Prozent. Die beschriebene in silico Hypothese konnte somit experimentell

widerlegt werden.

Neben diesen Versuchen wurden Aminosäure-Reste, die sich aus Unterschieden in den

Sequenzen der D. lanata und A. thaliana P5βR ergaben, mutiert, um die Auswirkungen auf die

Enzymaktivität zu untersuchen. Es wurden Aminosäuren gewählt, die entweder Teil der P5βR-

Motive oder Teil der putativen Substrat-Bindetasche waren. Die Mutagenese wurde wie oben

dargelegt durchgeführt, die Muteine überexprimiert und jeweils 0,2 mg in einem Standard-P5βR-

Assay bei 30 °C über 2 h eingesetzt. Die Auswertung erfolgte über GC-MS-Bestimmung der

Peakflächen von Substrat und Produkt (II.2.4.2). Als Referenz dienten parallel durchgeführte

91

M 1

Assays mit rDlP5βR WT Protein. Folgende Tabelle gibt einen Überblick über die so bestimmten

relativen Aktivitäten (Tab. 13).

Tab. 13: Relative Aktivitäten der weiteren Muteine und Lage der substituierten Reste. Relative, apparente Aktivität und

Tendenz der Aktivitätsveränderung im Vergleich zum rDlP5βR Wildtyp (WT) angegeben mit – (verringert) / 0

(identisch) / + (erhöht); (n =mind. 3).

Mutein AUC Relative, apparente Aktivität / Lokalisierung des substituierten [Produkt-/Gesamtfläche] Tendenz der Aktivitätsänderung Aminosäurerests

DlP5βR WT 0.25 +/- 0.04 100 % 0 -

T65P 0,20 +/- 0.001 80 % 0 Nahe Motiv II

R146T 0,25 +/- 0.02 100 % 0 Motiv IV

M150L 0.31 +/- 0.02 124 % 0 Motiv IV

L182Q 0.30 +/- 0.04 120 % 0 Motiv V

D181T_L182Q 0.20 +/- 0,01 80 % 0 Motiv V

G204N 0.02 +/- 0.01 8 % - Motiv VI

Y156V 0.69 +/- 0.13 276 % + Bindetasche

N205M 1.16 +/- 0.09 464 % + Bindetasche

N205A 1.43 +/- 0.17 572 % + Bindetasche

S248M - 0.0 % - Nahe Bindetasche

Y302F 0,22 +/- 0,01 88 % Bei Peripherie

C352G 0.17 67 % 0 Bindetasche

F353M 0.33 131 % 0 Bindetasche

F353P 0.21 +/- 0.01 84 % 0 Bindetasche

N205M_Y156V 1.10 +/- 0.17 440 % + Bindetasche

Unabhängig von der Lage des Aminosäure-Restes konnte mit keiner dieser weiteren Muta-

tionen, die nicht mit unserem Screening identifiziert wurde, eine nennenswerte Steigerung der Akti-

vität beobachtet werden. Die Aktivitäten der R146T, M150l, Y392F, C352G, F353M und F353P

Muteine entsprachen tendenziell der des WTs (67,1 bis 131 Prozent). Obwohl z.B. Phe-353 zur Bin-

detasche gehört, führt dessen Austausch im Gegensatz zu Asn-205 und Tyr-156 zu keiner großen

Veränderung der Aktivität. Der Austausch des flexiblen Gly-204-Restes hatte eine starke Reduzie-

rung der Enzymaktivität zur Folge.

Mit Hilfe der Klonierung, der funktionellen Expression, einem einfachen Aktivitätsscreening

und dem Vergleich der Proteinsequenzen ist es in dieser Arbeit gelungen, essentielle Positionen für

die enzymatische Aktivität der P5βR zu identifizieren.

92

III.4.3 N-terminale Deletionsmutanten der DlP5βR

Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit klonierten und funktionell exprimierten P5βR-ORFs,

besteht das von Herl et al. (2006) klonierte Konstrukt aus einer 5'- verkürzten cDNA, die in den

pQE30-Vektor ligiert wurde. Das korrespondierende Genprodukt ist somit N-terminal um 13

Aminosäuren verkürzt, verglichen mit dem Genprodukt des full-length ORFs. Andere P5βR, wie die

hoch-aktive rAtP5βR (siehe III.2.3.4), liegen ebenfalls als ungekürzte cDNA im Vektor vor (Herl et

al., 2009), was die Vergleichbarkeit der rekombinanten Proteine möglicherweise einschränkt. Ein

Ziel war es deshalb mit Hilfe von systematischer Deletionsmutagenese zu erkunden, wie sich die N-

terminalen Deletionen von Aminosäuren auf die Aktivität der rDlP5βR auswirkt. Hierzu wurde in

Kooperation mit Kristin Rudolph (im Vertiefungsmodul ihrer Masterarbeit) der full-length ORF

kloniert, sowie erste Mutagenese-Experimente durchgeführt.

III.4.3.1 Klonierung der full-length DlP5βR

Um diese Mutagenese-Experimente durchführen zu können, musste zunächst die ungekürzte

cDNA der DlP5βR gewonnen und in einen Expressionsvektor kloniert werden. Aus 200 mg frischen

Blättern von D. lanata wurde die Gesamt-RNA isoliert (II.2.1.2) und mit unspezifischen Primern in

cDNA umgeschrieben. Zur Amplifikation der gewünschten cDNA wurden verschiedene

Kombinationen am Lehrstuhl vorhandener P5βR-Primer in einer Standard-PCR (II.2.1.4) bei einer

Annealing-Temperatur von 50 °C getestet. Nur mit den beiden Primern MbdirGATE/VH1188brev

konnte ein PCR-Produkt mit der erwarteten Größe von ca. 1,2 kb nachwiesen werden (Abb. 39).

Abb. 39: PCR mit frischer cDNA von D. lanata und verschiedenen Primer-Kombinationen ( M = Marker, 1-3 =

untaugliche Primer; 4 = MbdirGATE/VH1188brev) (aus Rudolph, 2011).

Die 1,2 kb-Bande wurde aus dem Gel isoliert und die gereinigte DNA redispergiert(II.2.1.6).

Die Konzentration betrug 24,5 ng/µL bei einem Reinheitsquotienten von 1,75 (II.2.1.15). Die

gereinigte DNA wurde in den pCR(R)2.1-TOPO-Vektor kloniert und in chemisch kompetente

93

E. coli One Shot Top10 Zellen transformiert (II.2.1.10). Eine Unterscheidung von positiven und

negativen Klonen erfolgte mittels Blau-Weiß-Selektion (II.2.1.12). Die DNA wurde isoliert

(II.2.1.14) und sequenziert (II.2.1.16).

Beide bei der PCR eingesetzten Primer wurden in den erhaltenen Sequenzen

wiedergefunden. Die beiden Teilsequenzen wurden von Hand zusammengesetzt und über ClustalW

mit der bereits bekannten DlP5βR-Sequenz verglichen (II.2.5). Dies ergab, dass die komplette P5βR

cDNA-Sequenz erfolgreich in 3'-5'-Orientierung in den pCR(R)2.1-TOPO-Vektor eingebaut worden

war. Die Identität im Alignment betrug 99.0 % (Abb. 40).

TOPO ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 60WT ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 60 ************************************************************

TOPO GCACAGCCNNAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAAC 120WT GCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAAC 120 ******** **************************************************

TOPO AGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGC 180WT AGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGC 180 ************************************************************

TOPO GTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGC 240WT GTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGC 240 ************************************************************

TOPO GACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCAC 300WT GACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCAC 300 ************************************************************

TOPO GTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGC 360WT GTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGC 360 ************************************************************

TOPO AAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATC 420WT AAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATC 420 ************************************************************

Abb. 40: Ausschnitt aus dem Alignment der in den pCR(R)2.1-TOPO-Vektor klonierten Sequenz(„TOPO“) der putativen

full-length P5βR aus D. lanata („WT“).

III.4.3.2 Subklonierung und funktionelle Expression der kompletten DlP5βR

Für die funktionelle Expression der kompletten rDlP5βR wurde die klonierte cDNA in einen

Expressionsvektor subkloniert. Gewählt wurde der pETite-Vektor mit C-terminalem His-tag (II.1.7),

u.a. da bei der direkten Klonierung keine artifiziellen Aminosäuren am C- oder N-Terminus des

rekombinanten Proteins eingeführt werden. Die Vermehrung der klonierten cDNA erfolgte mit

Primern, die zur Vektorsequenz komplementäre Überhänge von 15-18 Nt besaßen (II.1.10), in einer

94

Standard-PCR (II.2.1.4) bei 58 °C. Die Template-DNA wurde mit DpnI selektiv zerstört (II.2.1.18)

und das PCR-Produkt durch homologe Rekombination in den linearisierten pETite C-His-Vektor

ligiert (nach Anleitung des Herstellers: ExpressoTM T7 Cloning and Expression System, Lucigen,

Version 1.0). Das Konstrukt wurde in chemisch kompetente E. coli HI-Control-Zellen transformiert

(II.2.1.10), positive Kolonien mittels Colony-PCR identifiziert (II.2.1.11), deren Plasmid-DNA re-

isoliert (II.2.1.14) und zur Sequenzierung (mit T7-Primern) an die GATC Biotech AG geschickt

(II.2.1.16).

In der erhaltenen Sequenz konnten sowohl Vektor-, als auch Insertabschnitte identifiziert

werden. Die Sequenz des eingesetzten Forward-Primers war vollständig erhalten. Ein Alignment

dieser Sequenz gegen die der DlP5βR bestätigte zusätzlich die erfolgreiche Klonierung (Daten nicht

gezeigt).

Der Nachweis der Expression der rDlP5βr mit C-terminalem His-tag (rDlP5βRc), unter den

beschriebenen Standard-Bedingungen bei 4 °C über 96 h (II.2.2.1), erfolgte zunächst mittels SDS-

Page-Analyse. Nach der His-tag-Reinigung (II.2.2.2) wurden der Protein-Gehalt des Eluats

bestimmt (II.2.3.1) und mit Puffer auf 2,8 µg eingestellt. Parallel hierzu wurde als Kontrolle die von

Herl et al. (2006) klonierte, verkürzte rDlP5βR (=WT; auch rDlP5βRnn-13), mit der alle bisher

beschriebenen Versuche durchgeführt wurden, aufgearbeitet. Beide Proben wurden auf einem 12 %-

igem SDS-PAGE-Gel analysiert (II.2.3.4). Die Detektion erfolgte mittels Coomassie-Färbung

(II.2.3.5). Das gewünschte Produkt konnte auf einer Höhe von etwa 43 kDa nachgewiesen werden

(Abb. 41).

Abb. 41: SDS-Page der rDlP5βRnn-13 (1) und der rDlP5βRc (2) (M1 = Marker; aus Rudolph, 2011).

95

Der Nachweis der enzymatischen Aktivität des rekombinanten Proteins erfolgte, nach

Umpuffern in den P5βR-Assaypuffer (II.2.3.2), über den Standard-P5βR-Assay (II.2.3.6). Die

Auswertung des Assays erfolgte mittels Dünnschicht-Chromatographie (II.2.4.1; Abb. 42).

Abb. 42: DC-Analyse des Standard-P5βR-Assays der nativ gereinigten P5βR aus D. lanata mit C-terminalem His-tag

(rDlP5βRc) (1 = Referenzen; 2 = Aktiver Assay; aus Rudolph, 2011).

Analog der verkürzten rDlP5βRnn-13 konnte die stereo-selektive Umsetzung von

Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion eindeutig nachgewiesen werden. Die Enzym-Assays wurden

zusätzlich über GC-MS ausgewertet (II.2.4.2). Hierbei wurde die Umsetzung des kompletten

Enzyms (rDlP5βRc) mit der der verkürzten Variante (rDlP5βRnn-13) direkt verglichen. Abbildung

43 ist zu entnehmen, dass die verkürzte rDlP5βRnn-13 unter den Bedingungen des Standard-P5βR-

Assays etwa doppelte Aktivität zeigte.

Abb. 43: GC Analyse der rDlP5βRc (A) und der rDlP5βRnn-13 (B) mit Progesteron als Substrat (roter Pfeil, Rt =

10.69) und 5β-Pregnan-3,20-dion als Produkt (blauer Stern; Rt = 9.97) nach Rudolph, 2011.

96

In Tab. 14 sind die ermittelten, relativen Aktivitäten dargestellt.

Tab. 14: Relative Aktivitäten der rDlP5βRnn-13 und der rDlP5βRc (MW +/- STABW; n = 7-9).

Protein AUC Relative, apparente Aktivität

[Produkt-/Gesamtfläche] [%]

rDlP5βRnn-13 0,16 +/- 0,02 228,6

rDlP5βRc 0,07 +/- 0,02 100,0

III.4.3.3 Einkürzungs-Mutagenese

Mit dem Phusion Site-directed Mutagenesis Kit und 5'-phosphorylierten Primern (II.1.8,

II.1.10) wurden im Anschluss erste Deletionsmutanten der rDlP5βRc hergestellt. Vom 5'-Ende

ausgehend sollte die klonierte cDNA in jeweils 90 Nukleotide eingekürzt werden. Dies entspricht

einer N-terminalen Kürzung des Proteins um jeweils 10 Aminosäuren. Hierzu wurden Primer so

abgeleitet, dass einer in antisense-Orientierung an den pETite-Vektor bindet und genau bis zum

Startcodon der DlP5βR cDNA heranreicht, während der andere erst 90 Nukleotide downstream des

Startcodons binden sollte, wodurch bei der PCR die gewünschte Lücke an Nukleotiden entstehen

sollte (KR_Mut30_Rev; KR_30_For; II.1.10; Abb. 44).

Abb. 44: Schematisches Vorgehen bei der Erzeugung der Deletionsmutanten der rDlP5βRc mit 5'-phosphorylierten

Primern im pETite C-His/DlP5βR-Vektorkonstrukt (nach Rudolph, 2011).

Als Template der PCR diente das pETite C-His/DlP5βR-Vektorkonstrukt, das in einer

Standard-PCR (II.2.1.4) mit den phosphorylierten Primern (KR_Mut30_Rev/KR_Mut30_For) bei

einer Annealing-Temperatur von 50 °C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse der PCRs wurden mit

Agarose-Gelelektrophorese ausgewertet (II.2.1.5; Abb. 45).

97

Abb. 45: Agarose-Gel der PCR zur Deletion von cDNA-Abschnitten am 5'-Ende des klonierten DlP5βR-ORFs (M =

Marker, 1 = KR_Mut30_Rev/KR_Mut30_ForMut).

Es konnte mit der Primer-Kombination ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von etwa 3,4

kb (Vektor + DlP5βR-Insert) nachgewiesen werden. Das PCR-Template wurde mit DpnI verdaut

(II.2.1.18) und in chemisch kompetente E. coli HI-Control BL21(DE3) Expressionszellen

transformiert (II.2.1.10). Bei der Sequenzierung der Plasmid-DNA dieser E. coli-Zellen, konnten

die Teile der pETite-Vektorsequenz und der Sequenzabschnitt des jeweiligen Forward-Primers der

Mutagenese-PCR wiedergefunden werden (Abb. 46).

5'-AACAGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTATAAGAAGGAGATATACATATGATAGTTGGGGTAACCG GAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAGGT ATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTG CGA...-3'Abb. 46: Nucleotid-Teilsequenz der DlP5βRcn-30 im pETite(R)C-His-Vektor (grau: Vektorsequenz; gelb: Startcodon;

blau: Sequenz des KR_Mut10_For-Primers).

Über Nukleotid-Alignments mit ClustalW, wurde die erfolgreiche Deletion des gewünschten

cDNA-Bereichs verifiziert. Diese Alignments finden sich bei Rudolph (2011): Die Analyse der

Sequenz zeigte einen Abschnitt der Vektorsequenz, in-frame gefolgt vom genutzen Forward-Primer

der Mutagenese-PCR und dem Rest des DlP5βR-Gens. Ein Vorteil des (vom Autor gewählten)

Vektors war, dass keine artifiziellen Aminosäuren während der Klonierung zwischen dem klonierten

cDNA-Abschnitt und dem His-tag eingeführt worden sind.

Die nachfolgende Erstellung von weiteren Deletionsmutanten, Versuche zu deren

Expression, der Nachweis der katalytischen Aktivität, die exakte biochemische Charakterisierung,

98

sowie die Bestimmung der (Co-)Substratspezifität und der Proteinfaltung mit CD-Messungen

erfolgte durch Frau Rudolph im Rahmen ihrer Masterarbeit (Rudolph et al., Manuskript in

Vorbereitung).

III.4.4 Mutagenese zur Änderung der Cosubstrat-Spezifität

Über die heterologe Expression rekombinanter Enzyme der Herzglykosid-Biosynthese

lassen sich (putative) Reaktionen der Biosynthese gut isoliert untersuchen. Daneben ergibt sich,

speziell durch die Verfügbarkeit der rekombinanten 3β-HSD und der P5βR aus verschiedenen Taxa,

die Option, mehrere rekombinante Enzyme der Biosynthese zu kombinieren, um nicht nur

Einzelschritte, sondern ganze Biosynthese-Sequenzen in vitro zu analysieren. Da die rekombinanten

3β-HSDs alle strikte NAD(H)-Spezifität aufweisen, sollte für diese Kombinationsversuche durch

SDM eine NADH-abhängige P5βR erzeugt werden.

III.4.4.1 In silico Analyse NADPH und NADH-spezifischer SDRs

Da sich die Cosubstrate NADPH und NADH einzig durch die negativ geladene

Phosphatgruppe am Ribose-Teil des Moleküls unterscheiden (Abb. 47, Abb. 68), wurde geprüft,

welche (basischen) Aminosäuren der DlP5βR (PDB 2v6g) mit dieser wechselwirken. Hierbei

fanden sich nur die beiden positiv geladenen Arginine Arg-63 und Arg-64. Diese befinden sich in

der Kristallstruktur in einem Abstand von 4,4 bzw. 5,0 Å zur Phosphatgruppe des Cosubstrats. Um

eine NADH-Spezifität zu erhalten, mussten an Stelle der basischen saure Aminosäure-Reste in der

Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR platziert werden. Um eine adäquate Position hierfür zu finden,

wurde die Phosphatgruppe in silico aus der Kristallstruktur 2v6g entfernt und gegen eine

Hydroxylgruppe ausgetauscht. In einer in silico-Mutagenese wurden alle Reste, die sich im Abstand

von 5 Å um diese befanden, gegen Asparaginsäure und Glutaminsäure ersetzt. Nur für

Asparaginsäure wurden Rotamere gefunden, die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden

Hydroxylgruppen der Ribose und der Carboxylgruppe der Seitenkette erlaubten. Dies erschien

möglich von den Positionen T35, A62, R63 und R64. Beispielsweise fanden sich im Falle der

DlP5βR T35D-Mutante für den eingeführten Asparaginsäure-Rest mögliche Rotamere, mit einem

Abstand der beiden Sauerstoffe der Carboxyl-Gruppe zu den Hydroxylgruppen der Ribose von 1,78

bzw. 2,58 Å (Abb. 47).

99

Abb. 47: A Durch in silico Mutagenese identifizierte Positionen zur Platzierung eines sauren Asp-Restes, der H-Brücken zur Ribose

ausbilden könnte, innerhalb der Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR B Darstellung der Lage des eingeführten Asp-Restes und

Messung der Abstände am Beispiel des DlP5βR T35D (in silico) Muteins.

Parallel wurden mit Hilfe der „Superposition“-Funktion der Wincoot Software (II.2.5) in

silico die Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR jeweils mit der von verschiedenen NADH-

abhängigen SDR-Enzymen überlagert (PDB: 2ztl, 3d3w, 3grk, 2zea, 2gng, 2gn5, 1x1t, 1xhl, 1mg5,

1I24), um die Konformation der Kohlenstoffketten und Aminosäure-Reste an den vier

identifizierten Positionen zu vergleichen. Tab. 19 zeigt die Ergebnisse dieser Überlagerung für

einige Enzyme, bei denen die Übereinstimmung der Kohlenstoffkette akzeptabel erschien.

Tab. 19: Vergleich der identifizierten Positionen zur Platzierung eines sauren Restes aus der Überlagerung der

Cosubstrat-Bindetasche NADH-spezifischer SDR-Enzyme mit der DlP5βR (2v2g).

Enzym (PDB) 35 62 63 64

2v2g (= Referenz T A R R

1zem G D M N

1iy8 G D V S

2hsd A D N L

1qrr - D N -

Die Xylitoldehydrogenase 1zem besaß die größte Übereinstimmung in der Konformation

der Kohlenstoffkette mit der DlP5βR. Für alle NADH-spezifischen Enzyme fand sich an der

Position des Alanin-62 der DlP5βR ein saurer Aspartat-Rest. Dies deckte sich mit den Ergebnissen

der in silico-Mutagenese, bei der ebenfalls diese Position für die SDM-Experimente identifiziert

wurde.

100

III.4.4.2 Mutagenese-Experimente

Die Mutagenese erfolgte analog zu III.2. Als Template für die PCR diente ebenfalls das

pQ30/DlP5βR-Konstrukt von Herl et al. (2006). In der Mutagenese-PCR (II.1.10) wurden

verschiedene Primer-Kombinationen genutzt für die unterschiedlichen Einzel- und

Mehrfachmutanten. Nach DpnI-Verdau der Template-DNA (II.2.1.18) und Transformation der

putativ mutierten Plasmide (II.2.1.10) wurde der Erfolg der Mutagenese mittels DNA-

Sequenzierung bestätigt (II.2.1.16). Neben der abgeleiteten Mutante, bei der A62 ausgetauscht

werden sollte, sollten auch die anderen möglichen Platzierungen für Asp getestet werden.

Auf diese Weise konnten zunächst die DlP5βR-Muteine T35D, A62D, R63D, R64D,

R63D_R64D hergestellt werden, deren Expression jeweils unter den Bedingungen des WTs erfolgte

(II.2.2.1). Es wurden P5βR-Standardassays mit 0,2 mg Protein bei 30 °C über 2 h durchgeführt

(II.2.3.6), wobei jeweils beide Cosubstrate getestet wurden (6,4 mM Endkonzentration). Die

Auswertung erfolgte mittels DC und GC-MS. Die Daten sind in Tab. 20 zusammengefasst:

Tab. 20: Screening der ersten Mutanten-Reihe auf P5βR-Aktivität mit NADH. (- = nicht nachweisbar; -/+ = geringe

Aktivität; + = aktiv; n. b. = nicht bestimmt).

Protein/Mutein Aktivität mit NADPH Aktivität mit NADH

DlP5βR WT + -

DlP5βR T35D n.b. -

DlP5βR A62D - -

DlP5βR R63D - -

DlP5βR R64D + -/+

Die Veränderungen der Cosubstrat-Bindetaschen führte in den meisten Fällen zu einem

kompletten Verlust der Aktivität mit NADPH, wobei auch mit NADH keine Umsetzung detektiert

werden konnte. Die Ausnahme stellte das Mutein R64D dar. Dessen Aktivität mit NADPH

entsprach etwa der des WTs und auch mit NADH konnte sowohl mit DC, als auch mit GC eine

Umsetzung von Progesteron beobachtet werden.

Jedoch wurde trotz dieser nachweisbaren Umsetzung die A62D Mutante für weitergehende

Mutagenese-Experimente ausgewählt, da die Position des Asparaginsäure-Restes auf Grund der

„Überlagerungsexperimente“ (III.4.4.1) ideal erschien. Eine weitergehende in silico Analyse (Abb.

48) zeigte als mögliche Erklärung für die Inaktivität dieses Muteins eine ionische Wechselwirkung

zwischen diesem eingeführten, negativ geladenen Rest und den positiven Resten Arg-64 oder Arg-

101

63 auf (Abb. 48; B). Aus diesem Grund sollten diese ebenfalls mutiert werden sollten. Als Basis

diente die bereits erwähnte, NADH-abhängige Xylitol-Dehydrogenase (PDB: 1zem), die eine

ähnliche Konformation der Kohlenstoffkette aufweisen konnte. In der Kristallstruktur fand sich an

der Stelle des Arginins, das benachbart zum Purin-Ringsystem des Cosubstrats liegt, ein Methionin-

Rest (Arg-63 bzw. Met-39). Anstelle des zweiten Arginins wurde ein Asparagin identifiziert (Arg-64

bzw. Asn-40; Abb. 52, C). Aus diesem Grund wurden weitere Mutagenese-Experimente

durchgeführt. Es konnten die DlP5βR A62D_R63D, A62D_R63M_R64N- (Abb. 48, D), sowie die

T35G_A62D_R63M_R64N-Muteine erfolgreich in E. coli überexprimiert (II.2.2.1) und über His-

tag-Affinitätschromatographie nativ gereinigt werden (II.2.2.2).

Abb. 48: A DlP5βR A62D-Mutein (in silico-Mutagenese; experimentell inaktiv); B Mögliche Wechselwirkung

zwischen D62 und R64; C Analoge Aminosäure-Reste in der Kristallstruktur der NADH-abhängigen Xylitol-

Dehydrogenase 1zem; D Re-designte DlP5βR (A62D_R63M_R64N).

Mit jeder dieser Mehrfachmutanten wurden erneut Standard-P5βR-Assays (II.2.3.6) bei 30

°C mit 0,2 mg Mutein und beiden Cosubstraten durchgeführt. Wie bereits A62D zeigte auch das

DlP5βR T35G_A62D_R63M_R64N-Mutein keine Progesteron-5β-Reduktase-Aktivität mit

NADPH. Die 3-fach Mutante A62D_R63M_R64N hingegen zeigte eine geringe Umsetzung von

Progesteron (Abb. 49):

102

Abb. 49: GC-Analyse des Standard-P5βR-Assays des DlP5βR A62D_R63M_R64N-Muteins (1 = Progesteron; 2 = 5β-

Pregnan-3,20-dion).

Diese Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass wirklich die beiden Arginine (Arg-63 und Arg-

64) für die Bindung und Umsetzung von NADH störend wirkten. Statt willkürlich und

unvorhersehbar andere Kombinationen von Aminosäuren für deren Substitutionen zu wählen (s.

Tab. 19), um die Aktivität des Muteins zu erhöhen, wurden die Ergebnisse aus III.4.2 zu Rate

gezogen und der Rest Asn-205, der als essentiell für die katalytische Effizienz definiert wurde (s.

III.4.2), gegen Methionin ersetzt (Substitution in Richtung der AtP5βR).

Mit 0,2 mg des gereinigten Muteins (DlP5βR A62D_R63M_R64N_N205M) wurden

Standard-P5βR-Assays bei 30 °C durchgeführt und die Umsetzung mittels DC und GC-MS

ausgewertet (Abb. 50).

103

Abb. 50: A Auswertung des Standard-P5βR-Assays mit 0,2 mg des DlP5βR A62D_R63M_R64N_N205M-Muteins mit

0,5 mM Progesteron durch Dünnschichtchromatographie (Ref: Progesteron, Rf = 0.5, 1; 5β-Pregnan-3,20-dion,

Rf = 0.6, 2). B Auswertung des Assays mittels GC-MS.

Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Steigerung der katalytischen Umsetzung des Muteins

durch die zusätzliche Substitution von Asn-205. Die Aktivität mit NADH entsprach in etwa der des

WTs mit NADPH (134 +/- 20 %; n = 3). Der Km-Wert des Muteins für NADH wurde

photometrisch mit 0,2 mg Protein und einem Überschuss an CH von 2,0 mM ermittelt (II.2.4.3). Er

lag bei 45,2 +/- 28,9 µM (n = 4), der des WTs mit NADPH bei 40,6 +/- 12,9 µM (s. Tab. 5). Diese

NADH-spezifische, funktionelle „Designer-P5βR“, konnte somit für weitere Versuche genutzt

werden.

III.4.4.3 Versuche zur in-vitro-Biosynthese

Ziel der Mutagenese der Cosubstrat-Bindung war, neben dem prinzipiellen Nachweis der

Machbarkeit, insbesondere eine NADH-spezifische rekombinate P5βR zu erhalten, um sie in vitro

mit den anderen verfügbaren, NADH-spezifischen Enzymen der Cardenolid-Biosynthese

kombinierbar zu machen. Hierzu wurden mit der mutierten rDlP5βR verschiedene Vorversuche

unternommen. Um einen geeigneten Puffer zu finden, wurden P5βR-Enzymassays mit 0,2 mg

Protein in P5βR-, und 3β-HSD-Puffer durchgeführt, um die Aktivitäten zu vergleichen. Die

Auswertung erfolgte mittels GC-MS. Es konnte im direkten Vergleich kein qualitativer Unterschied

104

bei der Reduktion von Progesteron detektiert werden. Die 3β-HSD war in den beiden Puffern

ebenfalls etwa gleich aktiv (Daten nicht gezeigt).

Des Weiteren wurde, da die Standard-3β-HSD-Assays nach Herl et al. (2007) bei 50 °C

durchgeführt werden, überprüft, ob unter diesen Bedingungen noch eine katalytische Aktivität der

P5βR zu erwarten ist. Standard-P5βR-Assays mit 0,2 mg Protein, die bei 50 °C inkubiert worden

waren, wurden mit GC-MS und DC ausgewertet, wobei jedoch keine Umsetzung von Progesteron

mehr nachweisbar war. Gleiches galt für Assays bei 45 °C. Die folgende Abbildung (Abb. 51) zeigt

einen Vergleich der Umsetzung des P5βR-Muteins bei 35 °C und 45 °C mit 6,4 mM und einer

reduzierten Menge von 1 mM NADH.

Abb. 51: DC von P5βR-Cosubstrat-Mutein-Assays mit 6,4 und 1,0 mM NADH bei 35 °C und 45 °C (Ref=Progesteron).

105

Die Ergebnisse legten nahe, dass die NADH-Menge nur einen geringen, die Temperatur aber

einen sehr entscheidenden Einfluss auf die Reaktion hatte. Aus diesem Grund wurde das

Temperatur-Optimum des Cosubstrat-Muteins mittels Standard-P5βR-Assays (II.2.3.6) und GC-

MS-Analytik (II.2.4.2) bestimmt (Abb. 52).

Abb. 52: Temperatur-Optimum der rDlP5βR A62D_R63M_R64M_N205M bestimmt über Standard-P5βR-Assay mit

Progesteron als Substrat, analysiert mittels GC-MS (Rel. Umsetzung nach II.2.4.2).

Das Temperatur-Optimum des Muteins lag deutlich niedriger als beim WT-Enzym, bei etwa

30-35 °C. Dies erklärte, dass bei 45 °C keine Umsetzung mehr erkennbar war.

Daraufhin wurden Standard-P5βR-Assays über 2h bei 30 °C mit 0,2 mg Cosubstrat-Mutein

und 0,2 mg 3β-HSD aus D. lanata durchgeführt. Als Substrat dienten sowohl Progesteron, als auch

Pregnenolon. Die Auswertung erfolgte mittels DC (Abb. 53):

Abb. 53: Ausschnitt einer Dünnschicht-Chromatographie zur Auswertung eines Enzym-Assays mit Cosubstrat-Mutein

und D. lanata 3β-HSD. Progesteron wurde stereoselektiv zu 5β-Pregnan-3,20-dion (P1) und 5β-Pregnan-3α-ol,20-on

umgesetzt. (Referenzen: Isoprogesteron, 1; Progesteron, 2; Pregnenolon, 3; 5β-Pregnan-3,20-dion, 4; 5β-Pregnan-3β-

ol,20-on).

106

Diese Versuche belegten, dass es prinzipiell möglich ist, die Enzyme in vitro hintereinander

zu schalten. Progesteron wurde in zwei Stufen erwartungsgemäß über 5β-Pregnan-3,20-dion (P1)

stereoselektiv zu 5β-Pregnan-3α-ol-20-on (P2) umgesetzt. 5β-Pregnan-3β-ol-20-on war nicht

nachweisbar. Eine Umsetzung ausgehend von Pregnenolon konnte - auch bei KSI-Zugabe - nicht

analytisch eindeutig gezeigt werden. Die Versuche mit der NADH-spezifischen „Designer“-P5βR

werden - aufbauend auf den vorliegenden Ergebnissen - von Herr Daniel Geiger im Rahmen seiner

Masterarbeit fortgesetzt.

107

IV DISKUSSION

IV.1 Klonierung, Sequenz-Analyse, Expression und Verbreitung der P5βR

IV.1.1 Klonierung von orthologen P5βR

Trotz mehrerer Dekaden der Forschungen ist der exakte Ablauf der Cardenolid-Biosynthese

bis dato noch nicht exakt aufgeklärt (Kreis und Müller-Uri, 2009; Clemente et al., 2011). Während

seit Längerem klassische Versuche, wie die Fütterung mit markierten Vorstufen (s. Schütte, 1987;

Kreis et al., 1998) und die Reinigung von Biosynthese-Enzymen aus Proteinextrakten (z.B. Gärtner

et al., 1990), durchgeführt werden, sind molekularbiologische Experimente zur ihrer Erforschung

erst seit relativ kurzer Zeit beschrieben worden (z.B. Sales et al., 2003; Roca-Pérez et al., 2004;

Herl et al., 2006; Gavidia et al. 2007; Herl et al., 2009; Ernst et al., 2010; Pérez-Bermúdez et al.

2010; Munkert et al., 2011). Unter ihnen gab es bisher keine Veröffentlichung, die sich intensiv mit

der gerichteten oder ungerichteten Mutagenese von verfügbaren, rekombinanten Biosynthese-

Enzymen beschäftigt. Einzig Thorn et al. (2009) berichteten beiläufig über den Austausch eines

zentralen Tyrosin-Restes (Y179F bzw. Y179A), was zum kompletten Verlust der Enzymaktivität

führte. Im Rahmen dieser Arbeit stand deshalb die systematische Mutagenese der DlP5βR im

Mittelpunkt. Um diese Versuche sinnvoll und zielgerichtet betreiben zu können, sollten zunächst

weitere orthologe P5βR zur funktionellen Expression kloniert werden.

Ausgehend von der Nukleotid- und Aminosäurensequenz der D. lanata P5βR (Herl et al.,

2006) wurden die öffentlich zugänglichen Gen- und Proteindatenbanken mittels BlastN- und

BlastP-Algorithmus durchsucht, was eine große Anzahl von homologen Genen aus Bakterien und

verschiedenen pflanzlichen Taxa als Ergebnis lieferte (Gavidia et al, 2007, eigene Suche) - darunter

die zwei ebenfalls funktionell exprimierten, orthologen (Enon-)Reduktasen aus N. tabacum

(Matsushima et al., 2008) und A. thaliana (Herl et al., 2009). Mit Hilfe dieser Sequenzen wurden

Primer zur Klonierung von orthologen P5βR aus unterschiedlichen pflanzlichen cDNAs abgeleitet.

Mit den N. tabacum-Primern konnten erfolgreich PCR-Produkte aus den cDNAs aller getesten

Solanaceen amplifiziert werden (A. belladonna, N. tabacum, S. lycopersicon, S. tuberosum). Die A.

thaliana-Primer funktionierten bei einer Reihe von Brassicaceen (A. rusticana, E. crepidifolium, E.

rhaeticum, L. annua) und die D. lanata-Primer bei verschiedenen Vertretern der Gentianales (M.

piperita, P. major, A. curassavica, N. oleander, u.a.). Bei L. annua und W. somnifera konnte die

Existenz eines P5βR-Gens nur auf genomischer Ebene nachgewiesen werden. In allen anderen

Fällen wurde jeweils das mRNA-Transkript (in Form einer cDNA) kloniert. Über Alignments

konnte in den genomischen Sequenzen jeweils ein Intron identifiziert werden. Es handelt sich

jeweils um ein typisches GU-AG-Intron (Brown, 2007), wie es auch für die D. lanata P5βR

108

beschrieben wurde (Herl et al., 2006). Die Lage des Introns in allen bekannten Genen ist stark

konserviert, allerdings unterschiedet sich dessen Länge und Sequenz in den verschiedenen Arten

teils erheblich. Tarrìo et al. (2011) geben für alle pflanzlichen VEP1-Orthologe ein Intron, für alle

pilzlichen VEP1-Orthologe 1-4 Introns an, wobei die Position im Gen jeweils charakteristisch ist.

Sie nehmen dies als Hinweis darauf, dass die Gene nicht aus einem gemeinsamen eukaryontischen

Ur-Gen entstanden sind (s. IV.1.3). Fundierte Aussagen zur Nutzung der Intronsequenzen, z.B. für

taxonomische Analysen, lassen sich jedoch auf Grund der geringen Mengen an klonierten gDNAs

für P5βR kaum treffen.

Bei allen anderen, in dieser Arbeit klonierten (putativen) P5βR handelt es sich um Gene, die

von den Pflanzen aktiv transkribiert werden, da sie - wie die P5βR aus D. lanata, I./D. canariensis

und A. thaliana (Herl et al., 2006; Herl et al., 2006b; Herl et al., 2009) - jeweils aus der cDNA

junger Blätter kloniert werden konnten. Ernst et al. (2010) berichteten, dass auch von Cardenolid-

freien D. lanata-Zellkulturen das P5βR-Gen exprimiert wird, allerdings weniger stark als in den

Blättern. Dies deckt sich mit den Ergebnissen dieser Arbeit, da bei den Klonierungsexperimenten

ebenfalls keine Korrelation zwischen der Akkumulation von Herzglykosiden und der Expression

des P5βR-Gens beobachtet werden konnte (vergleiche hierzu IV.1.3). Um Daten für die Planung der

Mutagenese-Versuche, die sich mit der Erhöhung der enzymatischen Aktivität der rDlP5βR

befassten, zu erhalten, wurden die cDNAs direkt in den pQE30-UA Expressions-Vektor kloniert

(z.B. die cDNA der MpP5βR) bzw. anschließend an die TOPO-Klonierung aus dem

Klonierungsvektor in diesen subkloniert (z.B. die cDNA der AbP5βR). Die erfolgreiche Klonierung

der P5βR aus E. crepidifolium und E. rhaeticum soll besonders betont werden, da die Gattung

Erysimum Cardenolide bildet (z.B. Rodman et al., 1982; Hugentobler und Renwick, 1995) und

gleichzeitig nahe verwandt ist mit dem pflanzlichen Modellorganismus der Molekularbiologie A.

thaliana (Brown, 2007). Es besteht deshalb die Hoffnung, dass die etablierten

molekularbiologischen Methoden (z.B. Transformation der Pflanzen) von A. thaliana auf

Erysimum-Arten übertragen werden können (Munkert et al., 2012).

IV.1.2 Analyse der Proteinsequenzen und Strukturen

Um ein besseres Verständnis der Funktion der P5βR zu erhalten, wurde versucht, deren

räumliche Struktur über kristallographische Experimente aufzudecken. Egerer-Sieber et al. (2006)

veröffentlichten die erfolgreiche Kristallisation der rDlP5βR (genauer der DlP5βRnn-13). Bei der

ersten Analyse der Daten ergaben sich bereits Hinweise auf eine Rossmann-Faltung (Branden und

Tooze, 1998) innerhalb des Proteins. Die endgültige Aufklärung der Kristallstruktur, u.a. im binären

Komplex mit NADP(H), erfolgte durch Thorn et al. (2008). Bisher gelang es noch nicht einen

109

ternären Komplex mit Substrat und Cosubstrat zu kristallisieren (Yves Muller, mündliche

Mitteilung). Die Autoren konnten aus den Ergebnissen die DlP5βR - wie bereits von Gavidia et al.

(2007) auf Grund der Aminosäure-Sequenz vermutet – den kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase

(SDR)-Enzymen zuordnen, wobei ihre räumliche Faltung der eines „extended“ SDR-Proteins

entsprach (Kallberg et al., 2002). Die medizinisch wichtige, tierische Progesteron 5β-Reduktase

gehört im Gegensatz dazu in die Familie der Aldo-Keto-Reduktasen (AKRs), die eine andere

räumliche Struktur besitzen (Di Costanzo et al., 2009). Die Enzyme sind demzufolge einander nicht

homolog (Gavidia et al., 2007). Andere SDR-Enzyme aus dem Bereich des Sekundärstoffwechsels

findet man beispielsweise bei der Biosynthese der Lignane oder der Tropanalkaloide (Brock et al.,

2008).

In der Sequenz und der Struktur der rDlP5βR konnten drei SDR-Protein-Motive (Abb. 58/

bzw. Abb. 3, Motiv I-III), die für die Cosubstrat-Bindung innerhalb der Rossmann-Faltung

essentiell sind, identifiziert werden (Persson et al., 2003). Erstaunlicherweise stellte sich der Aufbau

des aktiven Zentrums deutlich anders dar als erwartet: Keine der für andere SDR-Enzyme

typischen, katalytischen Reste (i.d.R. katalytische Triade aus Tyrosin, Lysin und Serin bzw.

katalytische Tetrade aus Asparagin, Tyrosin, Lysin und Serin; Filling et al., 2002) war strukturell

konserviert. Es gibt zwar sowohl einen Tyrosin-, als auch einen Lysin-Rest, diese zeigten aber von

bisher unbekannten Positionen ins aktive Zentrum und wurden zu Bestandteilen von neuen, P5βR-

spezifischen Sequenz-Motiven erklärt (Abb. 58/ bzw. Abb. 3, Motiv IV-VI; Thorn et al., 2008). Die

DlP5βR wurde deshalb einer bisher nicht beschriebenen Klasse von SDR-Enzym zugeordnet. Die

Motive I-VI wurden auch in der funktionell exprimierten Progesteron 5β-Reduktase aus A. thaliana

beschrieben (AtStR; Herl et al., 2009).

Vergleicht man die Aminosäure-Sequenzen aller neu klonierten P5βR dieser Arbeit, konnten

in keiner größere Deletionen bzw. Insertionen mehrerer Aminosäuren gefunden werden. Sie

beschränken sich - falls vorhanden - auf einzelne Aminosäuren (Insertionen: z.B. GfP5βR-Tyr-19,

EcP5βR-Ile-195; Deletionen: z.B. Stelle 159 bei AtP5βR/EcP5βR). Jedes der beschriebenen

Sequenz-Motive ist in allen P5βR vorhanden und praktisch immer an derselben Position innerhalb

der Gesamtsequenz zu finden (Abb. 54). Für die Motive II (GxxRR), V (NFYYxxED) und VI

(WSVHRP) treten in keiner Sequenz Abweichungen in den vorgegebenen Aminosäure-Abfolgen

auf. In Motiv I (GxTGIxG) ist bei der EcP5βR das Threonin gegen Alanin ersetzt. Allerdings wird

dieses Motiv in anderen Veröffentlichungen vereinfacht mit GxxGxxG angegeben (Gavidia et al.,

2007, Kallberg et al., 2002), weshalb dieser Austausch nicht kritisch erschien. Die Aktivität dieses

rekombinanten Proteins konnte gezeigt werden. Bei Motiv IV (TGxKHYxGP) war ebenfalls in

einem Fall (AbP5βR) Threonin durch Alanin ersetzt. Der katalytische essentielle Lysin-Rest (K147;

110

Thorn et al., 2008) fand sich allerdings an der definierten Position. Obwohl keine Auswirkung auf

die Katalyse zu erwarten ist, lässt sich keine exakte Aussage treffen, da es bisher nicht gelungen ist,

das rekombinante Protein in E. coli zu exprimieren. Starke Unterschiede zeigen sich bei Motiv III

(DxxD), an dessen Stelle in etwa der Hälfte aller Fälle die Abfolge DxxN gefunden werden kann.

Dieses Motiv könnte deshalb richtiger mit DxxD/N angegeben werden. Diese konservative

Substitution hatte allerdings keinen Einfluss auf die Katalyse. Sowohl bei Enzymen mit dem DxxD-

Motiv, als auch bei Enzymen mit der DxxN-Variante, konnte die Funktionalität in vitro gezeigt

werden (z.B. rPmP5βR und rDlP5βR).

Spezies Motiv I Motiv II Motiv III Motiv IV Motiv V Motiv VI GxTGIxG GxxRR DxxD TGxKHYxGP NFYYxxED WSVHRP

A. belladonna 31GVTGIVG39 58GVARR64 79DISN84 142AGRKHYLGP152 174NFYYILED183 195WSVHRP202

A. curassavica 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DIAN85 143TGGKHYCGP153 175NFYYSLED184 196WSVHRP203

C. olitorius 32GVTGIVG40 59GLARR65 80DISD85 143TGRKHYLGP153 175NFYYTLED184 196WSVHRP203

C. procera 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DIAN85 143TGGKHYCGP153 175NFYYTLED184 196WSVHRP204

D. canariensis 32GVTGIIG40 59GVARR65 80DISD85 143TGRKHYMGP153 176NFYYDLED185 197WSVHRP204

D. lanata 32GVTGIIG40 59GVARR65 80DISD85 143TGRKHYMGP153 176NFYYDLED185 197WSVHRP204

E. crepidifolium 32GVAGIVG40 59GVARR65 80DVSN85 143TGTKHYLGP153 175NFYYTQED184 197WSIHRP204

E. rhaeticum 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DVSN85 143TGTKHYVGP153 176NFYYTQED185 197WSIHRP204

G. fruticosus 33GVTGIVG41 60GVARR66 81DIAN86 144TGGKHYCGP154 176NFYYTLED185 197WSVHRP204

H. carnosa 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DIGN85 143TGGKHYAGP153 175NFYYTLED184 196WSVHRP203

M. piperita 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DVSD85 143TGRKHYVGP153 176NFYYTLED185 197WSVHRP204

N. orleander 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DISD85 143TGLKHYLGP153 175NFYYTLED184 196WSVHRP203

P. major 32GVTGIVG40 59GVARR65 80DISD85 143TGRKHYVGP153 176NFYYTQED185 197WSVHRP204

Abb. 54: Alignment der charakteristischen P5βR-Sequenz-Motive einiger klonierter orthologen Enzyme (aus Bauer et

al., 2010).

Motiv II deutet an, dass es sich bei allen Proteinen - wie bei der rDlP5βR (Herl et al., 2006)

und der rAtP5βR (Herl et al., 2009) - um strikt NADPH-abhängige Enzyme handelt (Kallberg und

Persson, 2006). Die strikte NADPH-Spezifität der rekombinanten Proteine konnte in dieser Arbeit

experimentell bestätigt und für die rDlP5βR mittels gerichteter Mutagenese gezielt verändert

werden (vgl. IV.2.4).

Zusätzlich zur Analyse der Motive können die kompletten Proteinsequenzen der

beschriebenen, neuen P5βR genutzt werden, um eine phylogenetische Analyse durchzuführen. Es

wurde bereits anhand der cDNA-Sequenzen von 21 klonierten P5βR-Genen aus verschiedenen

Isoplexis- und Digitalis-Arten gezeigt, dass es möglich war, statt eines klassischen molekularen

Markers - wie z.B. ITS (Bräuchler et al., 2004) - die P5βR-Sequenzen zu nutzen, um die Phylogenie

dieser beiden Gattungen zu untersuchen. Im Zuge der erwähnten Studie wurden weitere molekulare

Belege erbracht, die es nahelegten, die Gattung Isoplexis wieder mit der Gattung Digitalis zu

vereinen (Herl et al., 2007). Nutzt man die beschriebenen P5βR dieser Arbeit und zusätzlich die

Proteine, die bei einer BlastP Homologie-Suche identifiziert werden (Identität min. 50 %; alle

111

P5βR-Motive vorhanden), zur Erzeugung eines Kladogramms, werden zwei getrennte Cluster

erkennbar (Abb. 55).

Abb. 55: Kladogramm der neuen P5βR und Proteinen aus den Datenbanken, die alle P5βR-Motive besitzen (Dreiecke

symbolisieren Spezies aus denen die P5βR kloniert wurde; schwarze Dreiecke stehen für eine funktionelle Expression

der rekombinanten Proteine; Bauer et al., 2010).

Cluster II deckt sich gut mit der postulierten phylogenetischen Verwandtschaft der Arten

(Bauer et al., 2010). Dies zeigt einerseits, dass die P5βR nicht nur innerhalb der Gattung Digitalis

als molekularer Marker herangezogen werden können und spricht andererseits für die Evolution der

pflanzlichen P5βR-Gene aus einem gemeinsamen Vorfahren. Die Ergebnisse geben einen weiteren

Hinweis auf eine ubiquitäre Verbreitung der P5βR im Pflanzenreich. Cluster I ist zu klein, um

phylogenetische Aussagen treffen zu können. Interessanterweise besitzen alle Arten aus Cluster I

ebenfalls Paraloge in Cluster II (Bauer et al., 2010). In dieser Arbeit konnte die Liste der Gattungen

mit P5βR-Genen von ursprünglich 11 auf 21 erweitert werden. Mit Ausnahme der rAbP5βR konnte

für alle rP5βR, die in richtiger Orientierung in einen Expressionsvektor kloniert wurden, der

funktionelle Nachweis der katalytischen Aktivität erbracht werden (vgl. IV.2.1).

Wie dargelegt, konnten die Sequenzen aller funktionell exprimierten P5βR dieser Arbeit

genutzt werden, um Homologie-Modelle mit der DlP5βR als Template (PDB: 2v6g) zu erstellen

(II.3.1). Ein alternatives Template stand nicht zur Verfügung, da es sich wie beschrieben bei den

Enzymen um eine neue Art von SDR-Protein handelte (Thorn et al., 2008). Es wurde auf den

112

SWISS-MODEL-Server zurückgegriffen, da die automatisierten Server zur Erstellung von

Homologie-Modellen bei den CASP-Wettbewerben sehr gute, zuverlässige Ergebnisse erzielten

(Battey et al., 2007). Wegen der hohen Identität von mindestens 68 % der neuen Proteinsequenzen

zur DlP5βR, wurde der automatisierte Modus verwendet, um die Modelle zu erzeugen. Dies ist

sinnvoll bis zu einer Identität von etwa 50 % (Bordoli et al., 2009; Prof. Schwede, persönliche

Rücksprache). Man geht davon aus, dass Proteine ab einer Identität größer 40 % annähernd die

gleiche räumliche Struktur aufweisen (Petsko und Ringe, 2009). Die Qualität der Modelle wurde

mittels QMEAN-Server überprüft und war in allen Fällen sehr gut (Benkert et al., 2009). In

Einzelfällen (bei Deletionen/Insertionen einzelner Aminosäuren in kritischen Bereichen des

Proteins) wurden zusätzlich Modelle über den Alignment-Modus gemacht. Deren Qualität war

entweder etwas schlechter oder identisch (so dass keine Aussage getroffen werden konnte, welches

der Modelle das bessere war). Dies ist nicht problematisch, da im direkten Vergleich in keinem Fall

starke Abweichungen der Koordinaten der Seitenketten bzw. Hauptketten der Modelle auftraten.

IV.1.3 Vorkommen und Vergleich von homologen, funktionellen P5βR in Herzglykosid-

haltigen und Herzglykosid-freien Angiospermen

Herl et al. (2009) berichteten erstmalig über das Vorkommen eines Gens im

Modelorganismus A. thaliana (AtStR, VEP1-Gen), das für eine funktionelle P5βR codiert. Dies war

erstaunlich, da keine Akkumulation von Herzglykosiden für die Spezies beschrieben ist. Bereits

vorher wurden Vermutungen angestellt, dass die P5βR im gesamten Pflanzenreich ubiquitär

vorhanden ist (Gavidia et al., 2007; später Perèz-Bermùdez et al. 2010), wobei diese Annahme nur

auf reinen Sequenz-Vergleichen von Enzymen aus den Datenbanken mit größtenteils unbekannter

bzw. nicht nachgewiesener Funktion beruhte. Dies ist kritisch, da eine hohe Identität zweier

Gene/Proteine ein ungenügendes Kriterium zur Vorhersage der katalytischen Funktion sein kann

(Facchini et al., 2004; Facchini et al., 2006). Aus Mutagenese-Experimenten ist beispielsweise

bekannt, dass der Austausch einer einzigen Aminosäure (H117E) ausreichend war, um aus einer 3α-

HSD (AKR1C9) eine Steroid 5β-Reduktase zu machen (Jez und Penning, 1998). In einem anderen

Beispiel konnte durch die Substitution von zwei Aminosäuren aus einer Esterase eine funktionelle

Hydroxynitril-Lyase gewonnen werden (Padhi et al., 2010). Aus diesem Grund wurden in dieser

Arbeit, bei der Klonierung der P5βR, cDNAs aus dem Transkriptom von Cardenolid-

akkumulierenden und Cardenolid-freien Spezies gewonnen und auf das Vorhandensein von P5βR

hin untersucht, wobei das Ziel jedoch immer die funktionelle Expression, d.h. der Nachweis der

katalytischen Umsetzung von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion, war.

113

Abb. 56: Isolierte P5βR-Gene mit nachgewiesener Progesteron 5β-Reduktase Aktivität (aus Bauer et al., 2010).

Wie im Falle von A. thaliana, konnte das Vorhandensein von funktionellen P5βR, die lange

als Schlüsselenzyme der Herzglykosid-Biosynthese bezeichnet wurden (z.B. Herl et al., 2007), in

den 5β-Cardenolid-freien Spezies A. curassavica, G. fruticosus, H. carnosa, M. piperita und P.

major demonstriert werden (Bauer et al., 2010). Ein Vergleich der Aktivitäten zeigte, dass die P5βR

der Herzglykosid-bildenden Spezies, wie E. crepidifolium und E. rhaeticum, alle nur sehr geringe

Aktivitäten zeigten, während die P5βR aus M. piperita fast ähnlich effizient war wie die hoch-

aktive rAtP5βR (Herl et al., 2009; Munkert et al., 2011).

Das Vorkommen dieser Enzyme, unabhängig vom Sekundärstoffmuster der Pflanzen,

erscheint paradox. Eine Erklärung wäre, dass es sich bei dem von Gärtner et al. (1990) gereinigten

Enzym um eine unspezifische Reduktase handelt, die nicht in die Cardenolid-Biosynthese involviert

ist und falsch positiv identifiziert wurde. Perez-Bermudez et al. (2010) berichten von der Isolation

einer paralogen P5βR aus D. purpurea (P5βR2), die Stress-induziert ist und deren Expression mit

der Bildung der Cardenolide korreliert. Allerdings wird die Verbreitung dieses Enzyms von den

Autoren nicht genauer dargelegt.

Die momentan plausibelste Erklärung stützt sich auf die Beobachtung, dass es sich bei allen

getesteten P5βR um stark Substrat-promiske Enzyme handelt, die neben verschiedenen, aktivierten

Steroiden auch kleine zyklische und azyklische Substrate (stereoselektiv) umsetzen können

(Matsushima et al., 2008; Burda et al., 2009; Bauer et al., 2010; Munkert et al., 2011). Diese

Eigenschaft macht Enzyme, wie die P5βR, zu interessanten Biokatalysatoren für die Anwendungen

bei chemischen Synthesen (Bornscheuer und Kazlauskas, 2004) bzw. in der Industrie. Realisiert

114

werden kann eine solche Promiskuität auf molekularer Ebene wahrscheinlich vor allem durch

flexible, ungefaltete Bereiche im Protein (Chouard, 2011). Bei promisken SDR-Enzymen diskutiert

man eine strukturelle Flexibilität der Substratbindetasche, die von C-terminalen Loops der Proteine

ausgeht (Nobeli et al., 2009). Die modellierten Strukturen der exprimierten P5βR (z.B. von M.

piperita) lassen ebenfalls keine Adaption der Bindetasche für ein spezielles Substrat wie

Progesteron erkennen. Während die konservative Lehrmeinung davon ausgeht, dass bei der

Evolution von neuen „Sekundär-“Stoffwechselwegen i.d.R. für jeden Schritt eine Genverdoppelung

mit anschließender Sub- oder Neofunktionalisierung der beiden paralogen Gene durch natürliche

Mutationen stattfindet (Ober, 2005; Ober, 2010), mehren sich Stimmen, die den promisken

Enzymen eine zentrale Bedeutung für die Evolution von neuen Stoffwechselwegen zusprechen:

Nach der Screening-Hypothese (Firn und Jones, 1991; Firn und Jones, 2009; Firn, 2010) gelingt es

einem Organismus durch das Vorhandensein einer gewissen Anzahl an promisken Enzymen eine

größere chemische Vielfalt an Metaboliten zu synthetisieren. Hierdurch werden die Chancen des

Organismus, einen Naturstoff mit biologischer Aktivität zu synthetisieren - im Vergleich zu

Organismen, die nur spezifische Enzyme besitzen - statistisch stark erhöht (Abb. 57).

Abb. 57: Vergleich der Vielfalt an gebildeten Sekundärstoffen durch 3 Enzyme (roter Rahmen = Substrat-spezifische

Enzyme; grüner Rahmen = promiske Enzyme) (modifiziert nach Firn, 2010).

115

So lässt sich argumentieren, dass in der Evolution sogar eine positive Selektion auf promiske

Enzyme erfolgen kann. Der mögliche Stellenwert von promisken Enzymen bei der Etablierung

neuer Stoffwechselwege wird in ähnlicher Weise u.a. auch von Grotewold (2005) und Pichersky

und Gang (2000) vertreten.

Aufbauend auf diese Hypothese wäre eine Kombination möglich, bei der durch

Genduplizierung ein neues Enzym einem bestehenden Set an promisken Enzymen zugeführt wird,

wodurch ganz neue Produkte entstehen können. Sind diese nützlich, können sie in der Folge durch

Adaption, Mutagenese und Selektion (z.B. auch durch verstärkte Expression wichtiger Enzyme des

„neuen“ Weges) im Stoffwechsel „gefestigt“ werden (Pichersky und Gang, 2000). Für diese

Hypothese spricht, dass Substrat-Promiskuität eine Eigenschaft ist, die für viele rekombinante

Enzyme v.a. des „Sekundär-“, aber auch des „Primär“-stoffwechsels beschrieben wird: Die 12-

Oxophytodienoat Reduktase 1 und 3 aus L. esulentum reduziert (wie die getesteten rP5βR)

unterschiedlichste α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen und sogar analoge ungesättigte

Nitroverbindungen (Hall et al., 2007). Pflanzliche Prenyltransferasen, wie sie z.B. in der Shikonin-

Biosynthese vorkommen, besitzen ebenfalls häufig eine breite Substratspezifität für das Isoprenoid-

Substrat (Saleh et al., 2009). Viele Enzyme in den Biosynthesen flüchtiger pflanzlicher Naturstoffe

bilden mehr als ein Produkt aus einem Substrat oder setzen verschiedene Substrate um (Übersicht

bei Pichersky et al., 2006). So besitzen Petunien eine Carboxymethyl-Transferase, die in vitro

bevorzugt Salicylsäure methyliert, in vivo jedoch nur Benzoesäure umsetzt, da diese hier das

einzige verfügbare Substrat darstellt (Negre et al., 2003).

Da auch die 3β-HSD weit verbreitet ist und das rekombinante Enzym verschiedene

Substrate umsetzen kann, also promisken Charakter besitzt (Herl et al., 2007; Munkert et al.,

unveröffentlicht), lässt dies die Hypothese zu, dass zu diesen Teilreaktionen der Cardenolid-

Biosynthese prinzipiell verschiedenste Pflanzen in der Lage wären. Da Cardenolide allerdings nur

sporadisch auftreten, müsste für den Phänotyp „Cardenolid-Akkumulation“ ein anderes Schlüssel-

Enzym z.B. durch erfolgte Genduplizierung hinzukommen. Eine Möglichkeit hierbei wäre z. B.

eine Oxygenase, welche die charakteristische 14-Hydroxyl-Gruppe in β-Konfiguration an den

Steroid-Körper anfügen kann, wobei auch die obligatorische cis-Verknüpfung der Ringe C/D

entsteht (Luckner und Wichtl, 2000). Es wäre aber auch vorstellbar, dass die Expression der P5βR-

Gene in Cardenolid-freien und Cardenolid-akkumulierenden Pflanzen in unterschiedlichen

Geweben erfolgt. Die diskutierte Sonderstellung der P5βR, als Schlüsselenzym der Herzglykosid-

Biosynthese, kann mit den Ergebnissen dieser Arbeit nicht aufrecht erhalten werden. Hinzu kommt,

dass neben der P5βR auch endogenes Progesteron selbst in Cardenolid-freien Pflanzen

116

nachgewiesen werden konnte, z.B. in Junglans regia (Pauli et al., 2010), Nicotiana tabacum und

Inula helenium (Übersicht bei Janeczko, 2011). Seine physiologische Funktion in planta konnte

allerdings noch nicht aufgeklärt werden.

Falls es sich bei der Reduktion von Progesteron aber nur um eine unspezifische

Nebenreaktion handelt, stellt sich die Frage nach dem „physiologischen Hauptsubstrat“ bzw. der

eigentlichen Aufgabe der P5βR im pflanzlichen Stoffwechsel. Bekannt ist, dass bei A. thaliana die

Unterdrückung der Expression des VEP1-Gens (codiert für die AtP5βR) über Antisense-RNA die

Ausbildung von Gefäßen innerhalb der Blätter stark veränderte (Jun et al., 2002). Sowohl der

Stängel, als auch Wurzeln der transgenen Pflanzen waren weniger stark entwickelt und dünner

(Abb. 58).

Abb. 58: Vergleich von A. thaliana VEP1-Knock-down-Mutanten (A,B: rechts) mit dem WT (A,B: links). A = Ganze

Pflanze; B = Muster der Blattgefäße (aus Jun et al., 2002).

Versucht man über die Struktur des Proteins auf dessen Funktion zu schließen, kommt man

zu folgendem Ergebnis: Die Suche mit dem DALI-Server (Holm und Sander, 1995) gibt als

Strukturen, welche die größte Ähnlichkeit zur DlP5βR besitzen, verschiedene Enzyme aus dem

Zuckerstoffwechsel von E. coli aus: Eine GDP Mannose-4-6-Dehydratase (PDB 1DB3), eine UDP-

Galactose-4-Epimerase (PDB 1XEL) und eine dTDP-Glucose-4,6-Dehydratase, wobei die

Sequenzidentität jeweils nur 12-19 % beträgt (Thorn et al., 2008; eigene Suche). Diese bakteriellen

Gene scheinen aber einen gemeinsamen Ursprung mit den pflanzlichen P5βR zu haben. Eine

aktuelle Veröffentlichung geht davon aus, dass Pflanzen (und Pilze) das P5βR(VEP1)-Gen durch

einen lateralen Gentransfer von Proteobakterien erworben haben und dass dieses Ereignis in der

Evolution mehrfach stattgefunden hat. Während bei Pilzen die Tendenz sichtbar ist, das

aufgenommene Gen wieder zu verlieren, scheint es bei den Pflanzen eine wichtige Aufgabe

übernommen zu haben, weshalb es erhalten bleibt (Tarrío et al., 2011).

117

Um die weite Verbreitung einer unspezifischen Enon-Reduktase im Pflanzenreich, wie der

P5βR, erklären zu können, wäre es optimal, wenn es gelingen würde, ein physiologisches Substrat

mit α,β-ungesättigter Carbonylgruppe zu identifizieren, welches in einen grundlegenden,

pflanzlichen Stoffwechselvorgang involviert ist. Da einerseits, wie bereits erwähnt, für die P5βR2

aus D. purpurea eine Stress-Induktion nachgewiesen werden konnte (Perez-Bermudez et al., 2010)

und andererseits A. thaliana das P5βR/VEP1-Gen (das in der entsprechenden Veröffentlichung AWI

31 genannt ist) spezifisch nach Verwundung der Pflanze (Yang et al., 1997) exprimiert wird, ergab

sich der Verdacht, dass dieses Substrat im Jasmonat-Stoffwechsel zu finden wäre (Abb. 59). Bei

Methyljasmonat handelt es sich um ein pflanzliches (Stress-)Hormon, das als Antwort des

Organismus auf biotischen und abiotischen Stress durch eine Oxidation von Membranlipiden

gebildet wird (Abb. 59) und in der Folge zahlreiche Entwicklungsvorgänge auslöst (Cheong und

Choi, 2003).

Abb. 59: Haupt-Biosyntheseweg von Methyljasmonat aus Membranlipiden über Jasmonsäure. Das mögliche, α,β-

ungesättigte Substrat der P5βR, OPDA („12-oxo-phytodenoic acid“), wurde rot umrandet.

Die einzige mögliche Struktur aus diesem Stoffwechselzweig, OPDA („12-oxo-phytodenoic

118

acid“), wurde als Substrat der rAtP5βR und der rMpP5βR allerdings nicht akzeptiert (diese Arbeit).

Die Hypothese muss deshalb verworfen werden. Um das physiologische Substrat bzw. die Aufgabe

der P5βR aufzuklären, könnten deshalb (mit Hilfe der neuen Sequenzen aus dieser Arbeit) Versuche

unternommen werden, einen Knock-down der P5βR in weiteren, leicht-transformierbaren Pflanzen

wie N. tabacum oder A. belladonna zu erreichen, um die Phänotypen mit dem der bekannten A.

thaliana Knockdown-Mutante zu vergleichen. Interessant wäre der Knock-down in einer

Cardenolid-akkumulierenden Spezies. Ein funktionelles Transformationssystem ist jedoch bisher

nur für D. minor publiziert (Sales et al., 2003).

IV.2 Mutagenese-Experimente

Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der gerichteten Mutagenese

der DlP5βR, deren Eigenschaften gezielt verändert werden sollten. Die DlP5βR wurde als

Ausgangspunkt der Mutagenese gewählt, da von ihr (wie beschrieben) als einzigem Vertreter der

Enzymklasse eine experimentell aufgeklärte Kristallstruktur existiert (Thorn et al., 2008).

IV.2.1 Steigerung der enzymatischen Aktivität der rDlP5βR

Der umfangreichste Teil der Mutagenese-Experimente hatte zum Ziel, den quantitativen

Unterschied der katalytischen Aktivitäten der rP5βR zu erklären, wobei zu Beginn der Arbeit nur

die Aktivitäten der rekombinanten Enzyme aus D. lanata, I. canariensis und die, der etwa 50-fach

aktiveren Variante, aus A. thaliana bekannt waren (Herl et al. 2006; Herl et al., 2006; Herl et al.,

2009). Bei der Planung der Versuche wurde die rationale Mutagenese gewählt, obwohl allgemein

das Mittel der Wahl zur Verbesserung von Enzymeigenschaften die „Gerichtete Evolution“ (DE)

darstellt (Bornscheuer und Pohl, 2001). Dies gilt insbesondere für die Erhöhung der katalytische

Aktivität. So zeigte eine Analyse von durch DE erfolgreich mutierten Proteinen, dass in etwa der

Hälfte der Fälle Aminosäuren verändert wurden, die sich weit entfernt vom aktiven Zentrum

befanden (Morley und Kazlauskas, 2005) und i.d.R. zumindest nicht das primäre Ziel einer

rationalen Selektion gewesen wären.

IV.2.1.1 Ableitung von Mutagenese-Positionen durch „bioactivity guided“-Screening

Die Aminosäure-Sequenzen der rDlP5βR und der rAtP5βR sind zu etwa 70 % identisch, was

eigentlich eine solide Basis darstellt, um Hypothesen für die abweichenden enzymatischen

Eigenschaften der Proteine aufstellen zu können. So geben Herl et al. (2009) - abgeleitet aus

Sequenzvergleichen und einem Strukturmodell - für die signifikant stärkere Aktivität der rAtP5βR

119

folgende in silico Erklärung an: In den bekannten Standard-SDR-Enzymen findet man entweder

eine katalytische Triade aus Lysin, Tyrosin und Serin, oder eine Tetrade aus Lysin, Tyrosin, Serin

und Asparagin, die bis zur Entdeckung der Struktur der DlP5βR als essentiell galt (Filling et al.,

2002). In der neuen Struktur lagen, wie beschrieben, nur der konservierte Lysin- bzw. Tyrosin-Rest

vor (Thorn et al., 2008). Im Gegensatz dazu fand sich im Modell der AtP5βR ein Glutamin-Rest

(Gln-181) auf der räumlichen Position, die in den üblichen SDR-Proteinen von dem Asparagin der

katalytischen Tetrade eingenommen wird, und dieses - nach Meinung der Autoren - simulieren

kann. Bei der DlP5βR befindet sich an dieser Stelle dagegen ein Leucin, dessen Austausch gegen

Glutamin den „klassischen SDR-Charakter“ der DlP5βR erhöhen und dadurch die Aktivität des

rekombinanten Enzyms steigern sollte. Eine experimentelle Überprüfung der Theorie fand

allerdings nicht statt.

Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit zunächst die L182Q-Mutante der DlP5βR über

gerichtete Mutagenese erzeugt und das rekombinante Protein funktionell exprimiert. Die Aktivität

des Enzyms war jedoch nicht größer als die des WTs, wodurch die in silico-Hypothese von Herl et

al. (2009) widerlegt werden konnte. Ausgehend von den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt

sich zusätzlich auch retrospektiv erkennen, dass diese Hypothese mit größter Wahrscheinlichkeit

falsch sein musste, da sich in einigen nur sehr schwach aktiven P5βR (EcP5βR, ErP5βR) ebenfalls

ein Glutamin-Rest an der identifizierten Position befindet, während z.B. in der MpP5βR, dem

stärksten der neu exprimierten Reduktasen, ein Leucin zu finden ist.

Um eine alternative Hypothese für die Frage, ob es möglich wäre durch die Selektion und

Mutagenese einzelner Reste die Aktivität der rDlP5βR zu erhöhen, aufzustellen, wurde entschieden

weitere P5βR-Gene zu klonieren (vgl. IV.1). Dies war essentiell, da die beiden verfügbaren Enzyme

zwar zu fast 70 % identisch waren, sich ihre Aminosäure-Sequenzen aber absolut betrachtet an 118

Stellen unterschieden, wobei prinzipiell jede dieser Substitutionen für die Aktivität (und die

Stabilität) Bedeutung haben konnte (Morley und Kazlauskas, 2005). Um Aminosäure-Reste für die

Mutagenese abzuleiten, war die funktionelle Expression der cDNAs obligatorisch. Ausreichend war

bereits der Vergleich der Progesteron-Umsetzung unter den Bedingungen des Standard-P5βR-Assay

(Herl et al., 2006). Dies erlaubte eine grobe Kategorisierung der katalytischen Potenz der

rekombinanten Reduktasen in die Rubriken schwach, mittel [= etwa rDlP5βR] oder hoch aktiv.

Unerwarteter Weise besaßen die homologen P5βR aus den näher verwandten Organismen-Gruppen

mit jeweils größerer Identität der Aminosäure-Sequenzen (rMpP5βR/rDlP5βR bzw.

rAtP5βR/rEcP5βR/rErP5βR) auffallend unterschiedlich hohe enzymatische Aktivitäten. Dies war

für die Mutagenese-Planung jedoch vorteilhaft, da die Anzahl der relevanten Sequenz-Unterschiede

120

so (durch einen Vergleich der P5βR in diesen Gruppen) stark reduziert werden konnte auf 71

(innerhalb der „MpP5βR-Gruppe“) bzw. 26 (innerhalb „AtP5βR-Gruppe“). Unter der Prämisse, dass

die beobachteten Aktivitätsunterschiede in beiden Gruppen auf der gleichen Ursache beruhen,

wurde nach Überschneidungen bei den Sequenz-Unterschieden gesucht, wobei letztlich (von

ursprünglich 118 Substitutionen) die drei Aminosäuren Tyr-156, Asn-205 und Ser-248 als putative

„hot-spots“ identifiziert werden konnten. Diese Prämisse war zur Planung der Experimente

erforderlich, ist aber gleichzeitig ein möglicher Grund dafür, dass die Aktivität der rAtP5βR nicht zu

100 Prozent erreicht werden konnte, da viele der anderen Aminosäure-Substitutionen im D. lanata

Enzym die Aktivität zusätzlich modulieren werden. Wie und in welcher Weise ist im einzelnen nicht

vorhersehbar. Resümiert machte erst die grobe, vergleichende Analyse der in vitro-Aktivität über

GC-MS und DC in Verbindung mit den neuen Sequenzen die Ableitung der „hot-spots“ möglich,

weshalb der Ansatz als „bioactivity guided“ beschrieben wurde.

Obwohl es für das „bioactivity guided“-Screening nicht notwendig war, wurden zusätzlich

auch die exakten enzymkinetischen Konstanten (inklusive einiger anderer Enzym-Parameter) der

rMpP5βR, der rGfP5βR, sowie der rEcP5βR (Munkert et al., 2011) bestimmt. Hierzu wurde eine

photometrische Messmethode adaptiert (Burda et al., 2009). Der Methodenwechsel (Photometer

versus HPLC) machte es notwendig, die rAtP5βR und die rDlP5βR ebenfalls neu zu analysieren.

Neben dem (bisherigen) Standard-Substrat Progesteron (z.B. Herl et al., 2006; Herl et al., 2009)

wurde immer auch das kleine Substratmimetikum 2-Cyclohexen-1-on mitbestimmt, welches in

allen Fällen deutlich effizienter umgesetzt wurde. Generell verdeutlichten diese Experimente erneut

die promisken Eigenschaften der P5βR, da nie nur ein Substrat akzeptiert wurde. Besonders

auffällig war der Unterschied in der Substratpräferenz bei den rekombinanten Enzymen der

Gattungen Gomphocarpus und Erysimum, von denen 2-Cyclohexen-1-on jeweils sehr gut und

Progesteron kaum reduziert werden konnte (Bauer et al., 2010). Die rEcP5βR besitzt für 2-

Cyclohexen-1-on sogar den größten kcat-Wert aller bisher bekannten orthologen P5βR. Die

Effektivität reicht trotzdem nicht an die der AtP5βR heran, da die Affinität zum Enzym mit einem

Km-Wert von 912,4 sehr schlecht ist (Munkert et al., 2011). V.a. die neu bestimmten bzw. bereits

veröffentlichten kcat-Werte für die Progesteron-Umsetzung waren auffallend niedrig, verglichen mit

den Erwartungen, die sich für enzymatische Reaktionen nach Lehrbüchern der Biochemie ergeben,

z.B. 280.000 s-1 für eine Ketosteroid-Isomerase (Berg et al., 2003). Bar-Even et al. (2011) konnten

allerdings aus der systematischen Auswertung von ca. 5000 enzymatischen Reaktionen, an denen

etwa 2500 verschiedene Enzymen beteiligt sind, ableiten, dass die Enzyme des

„Sekundärstoffwechsels“ im Schnitt etwa 30-fach langsamer arbeiten als die des

121

„Primärstoffwechsels“ (Abb. 60) und außerdem häufig promiskes Verhalten zeigen. Zur Erklärung

des Phänomens dieser niedrigen kcat-Werte wird angenommen, dass das gemessene Substrat häufig

nicht das native ist. Alternativ kann es auch sein, dass Enzyme mit einem promisken Charakter in

ihrem metabolischen Netzwerk mehrere Substrate umsetzen müssen und so keine Optimierung auf

eines davon erfolgen kann. Insgesamt wird nach der Auswertung die Höhe der typischen kcat -Werte

von Enzymen weit überschätzt. Sehr starke Umsetzungen finden sich v.a. bei hoch-spezialisierten

Enzymen des essentiellen Primärmetabolismus.

Abb. 60: Systematischer Vergleich der kcat-Werte (A) und der katalytischen Effizienz (B) von Enzymen des Primär- und

Sekundärstoffwechsels (aus Bar-Even et al., 2011).

Die Werte der rekombinanten P5βR sind, verglichen mit diesen publizierten Daten, zwar an

der unteren Grenze, aber noch im typischen Bereich der bekannten Sekundärstoffwechsel-Enzyme.

Alle Enzyme waren, wie vorhergesagt (Kallberg und Persson, 2006; vgl. auch Motiv-Analyse unter

IV.1.2) strikt NADPH-spezifisch. Die Km-Werte für das NADPH lagen bei allen gemessenen

Proteinen im gleichen Größenordnungsbereich zwischen 20 und 55 µM, wobei auch die P5βR aus

A. thaliana und D. lanata wieder mitbestimmt wurden. Die Km-Werte waren insgesamt etwas höher

als die früher publizierten, was mit der stark unterschiedlichen Messmethode erklärt wird. Die

Kurven zur Bestimmung der Temperatur-Optima der rEcP5βR, rGfP5βR, rMpP5βR wiesen keine

nennenswerten Unterschiede auf. Alle zeigten ein Maximum bei etwa 50 °C, was sich gut mit den

publizierten Daten der rDlP5βR und rAtP5βR deckt (Herl et al., 2006; Herl et al., 2009). Eine

wesentliche Erkenntnis war, dass unter den Bedingungen des Photometer-Assays der Unterschied in

der katalytischen Effizienz dieser beiden Proteine für die Reduktion von Progesteron keinen Faktor

50 betrug, sondern lediglich 12. Dies erscheint plausibel, weil die beiden Proteine bisher niemals

122

unter identischen Bedingungen bestimmt wurden, da ihr Verhalten zu stark voneinander abweicht.

Der Vergleich der Daten war deshalb schwierig, weil immer mehrere Faktoren gleichzeitig

verändert wurden, wie z.B. Enzymmenge, Temperatur, Messmethode (Herl et al., 2006; Herl et al,

2009).

IV.2.1.2 Gerichtete Mutagenese und Charakterisierung der Muteine

Die DlP5βR wurde an den identifizierten „hot-spots“ mutiert, wobei die Aminosäuren gegen

diejenigen ausgetauscht wurden, die sich an den entsprechenden Positionen bei der AtP5βR bzw. der

MpP5βR befinden. Das Mutagenese-System wurde optimiert und der Erfolg konnte über

Sequenzierung des mutierten Gens im Expressionsvektor bestätigt werden. Um stichprobenartig zu

prüfen, ob bei dem beschriebenen Vorgehen wichtige Aminosäuren übersehen werden, wurden

Kontrollmutationen innerhalb der Protein-Motive (z.B. M150L, G204N) bzw. der putativen

Substrat-Bindetasche (z.B. F353M; F353P) realisiert, über die es aber in keinem Fall gelang, die

Aktivität des rekombinanten Enzyms signifikant zu steigern. In diesem Teil der Arbeit war das Ziel,

Mutagenese-Experimente durchzuführen und die korrespondierenden Muteine schnell auf erhöhte

Aktivität hin zu analysieren, um vielversprechende Kandidaten zu selektionieren – inspiriert von

der DE-Methode (Chica et al., 2005). Es wurde hierfür auf den Standard-P5βR-Assay, der für den

D. lanata WT publiziert wurde (Herl et al., 2006), zurückgegriffen, um die relativen Aktivitäten der

Muteine zu bestimmen. Diese Bedingungen wurden direkt übernommen und auch deshalb gewählt,

da die beobachteten Aktivitätsunterschiede der rekombinanten P5βR (Herl et al., 2006, Herl et al.,

2009, Munkert et al., 2011) unter genau diesen auftreten.

Es konnte festgestellt werden, dass die Mutation des Tyrosin-156 (Y156V) die Aktivität

etwa verdoppelte, die Mutation des Asparagin-205 (N205M bzw. N205A) erhöhte sie sogar noch

stärker, während die S248-Mutation zum kompletten Funktionsverlust führte, was mit

Sekundäreffekten, v.a. sterischen Behinderungen zwischen dem eingeführten Methionin-Rest und

anderen Aminosäuren nahe der Bindetasche erklärt werden kann. Die Tendenzen der

Aktivitätsänderung der Muteine im Vergleich zum WT waren deutlich sichtbar und quantitativ gut

reproduzierbar. Es muss betont werden, dass die absoluten Zahlenwerte deshalb nur apparente

relative Aktivitäten darstellen, weil nicht für jede Mutante ein optimaler Test aufgebaut werden

sollte. Von Bedeutung war im Screening einzig, den tendenziellen Einfluss der Substitutionen auf

die Enzymaktivität festzustellen.

Die im Screening identifizierten Muteine mit den verbesserten Eigenschaften wurden über

ihre kinetischen Konstanten genau charakterisiert. Vergleicht man die kinetischen Daten der Asn-

205-Muteine (Kcat 2,4 min-1 bzw. 1,8 min-1) mit denen von anderen Sekundärstoffwechsel-Enzymen

123

(Bar-Even et al., 2011; IV.2.1.1), fallen diese zwar absolut betrachtet noch immer sehr gering aus,

allerdings wurde die Affinität der Enzyme für das Substrat im Vergleich zum rDlP5βR Wildtyp

stark erhöht. Dieser stark verbesserte Km-Wert begründet die gemessene Aktivitätszunahme der

Muteine. Nimmt man den kcat/Km -Wert als Richtgröße für die Effektivität des Enzyms (Eisenthal et

al., 2007), konnte durch die Substitution eines einzelnen Restes verglichen mit den WT eine

Steigerung der Effizienz um den Faktor 9 erreicht werden. Dies ist sogar noch mehr, als durch die

relativen Aktivitäten im ersten Screening ermittelt wurde. Wie in diesem bereits ersichtlich, war die

Y156V-Substitution weniger effektiv. Sie steigerte den kcat/Km-Wert nur um den Faktor 2. Betrachtet

man die Werte für die Reduktion von 2-Cyclohexen-1-on erkennt man, neben der bereits

diskutierten Bevorzugung des kleinen Substrats gegenüber Progesteron, die von beiden Asn-205-

Muteinen gezeigt wurde, auch einen wesentlichen Unterschied: Zwar steigt in beiden Fällen die

katalytische Effektivität der Enzyme (verglichen mit dem WT) an, allerdings passiert dies bei der

N205A-Mutante parallel zur Verbesserung der Progesteron-Reduktion, während bei der N205M-

Mutante die relative Verbesserung nur etwa 66 % betrug. Es zeigt sich also, dass die

Punktmutationen nicht nur die katalytische Aktivität der rDlP5βR verbesserten, sondern, dass es bei

der N205M-Mutante zusätzlich zu einer Änderung der Substratpräferenz kommt: Während der

DlP5βR WT 2-Cyclohexen-1-on etwa 28 mal effektiver reduziert, betrug der Faktor nur noch 15 für

die N205A-Mutante und ungefähr 5 für die N205M und Y156V-Mutante. Eine Tendenz hin zur

starken Bevorzugung von kleinen Substraten zeigt sich dagegen bei der P5βR aus E. crepidifolium

(Munkert et al., 2011) und G. fruticosum. Dass sich bereits eine einzelne Mutation stark auf die

Substratpräferenz auswirken kann, wurde bereits bei anderen (Biosynthese-)Enzymen beschrieben.

Durch den Austausch von Asp-177 gegen Alanin in der Strictosidin-Synthase von C. roseus, konnte

die Breite der akzeptierten Secologanin-Analoga stark vergrößert werden (Chen et al., 2006). Bei

Chalkon-Synthasen konnte durch die Variation von einer bzw. einigen wenigen Aminosäuren die

Substratpräferenz so stark verändert werden, dass neue Gruppen von Sekundärmetaboliten

entstanden (Abe und Morita, 2010). Die Dihydroflavonol 4-Reduktase (DFR) aus Petunia, die in

die Anthocyanin-Biosynthese involviert ist, kann Dihydrokaempferol nur sehr ineffizient

reduzieren, weshalb bei der Pflanze keine orangen Blüten vorkommen. Johnson et al. (2001)

konnten zeigen, dass die Substitution einer einzelnen Aminosäure innerhalb der putativen Substrat-

Bindetasche zu einer Enzym-Mutante führt, die nun präferenziell Dihydrokaempferol reduziert.

Zusammenfassend legen diese Beispiele und die Ergebnisse der Mutagenese-Experimente dieser

Arbeit nahe, dass in der Evolution des „Sekundärstoffwechsels“ - z.B. nach der Genduplizierung

(Ober, 2010) - nicht zwangsläufig eine größere Anzahl von Mutationen in einem Gen erfolgen

muss, um eine Sub- oder Neofunktionalisierung zu erreichen. Vielmehr sind bereits winzige

124

Veränderungen an geeigneten Positionen ausreichend, damit ein Protein grundlegend andere

Eigenschaften erhält, oder auch (nahezu) funktionslos wird (wie z.B. bei der DlP5βR G204N-

Mutante zu erkennen ist).

Als Ausblick machen die Identifizierung und der experimentelle Nachweis der Wichtigkeit

der „hot-spot“-Positionen innerhalb der Sequenz der rDlP5βR es nun möglich, in der Folge ein

sogenanntes „semi-rationales“ Proteindesign (d.h. eine Kombination von SDM- und DE-

Experimenten) durchzuführen (Chica et al., 2005; Lutz, 2011). Die rational identifizierten

Positionen in einer hoch-aktiven P5βR könnten ganz gezielt „erschöpfend“ mutiert werden, um eine

noch effizientere Enzym-Variante (mit promiskem Charakter und stereoselektiver Umsetzung), z.B.

zur industriellen Anwendung, zu erhalten (Kirk et al., 2002; Bornscheuer und Kazlauskas, 2004).

V.a. wenn kein high-throughput-Screening für die gerichtete Evolution im Labor vorhanden ist,

vereint dieses Vorgehen die Vorteile der SDM- und DE-Methoden und wurde bereits häufig

erfolgreich angewandt (Wilming et al., 2002, Santoro und Schulz, 2002; Peimbert und Segovia,

2003).

IV.2.1.3 Simulation der Molekül-Dynamik (MD)

Zusätzlich zu den Mutagenese-Experimenten wurden die beiden ursprünglich bekannten

funktionellen P5βR aus D. lanata (Herl et al., 2006) A. thaliana (Herl et al., 2009) in silico mittels

Molekül-Dynamik(MD)-Berechnungen simuliert (Bauer et al., Manuskript in Vorbereitung). Die

Messungen und Berechnungen wurden von Dr. H. Lanig, CCC Uni-Erlangen, durchgeführt. In die

Strukturmodelle wurden hierzu die beiden Standardsubstrate dieser Arbeit, Progesteron und 2-

Cyclohexen-1-on, innerhalb der putativen Bindetasche der Enzyme platziert und die Abstände

zwischen dem Donor-C-Atom des NADPH, von dem das Hydrid übergeht, und dem Akzeptor-sp2-

C-Atom des jeweiligen Substrats über die Zeit vermessen (Abb. 61).

125

Abb. 61: Molekül-Dynamik(MD)-Simulation der DlP5βR und der AtStR (CH = 2-Cyclohexen-1-on, PRO =

Progesteron; graue Linie = 5 Angstrôm-Linie) (nach Lanig, unveröffentlicht).

In den MD-Simulationen zeigte sich, dass die Bindetasche des A. thaliana Enzyms in silico

eine stark vergrößerte Affinität für beide Substrate besitzt. Sie blieben jeweils über die gesamte

Simulationszeit in der Bindetasche und zwar in einer Orientierung, in der eine Reduktion prinzipiell

möglich wäre. Währenddessen war das D. lanata Protein in silico nicht in der Lage die Substrate

lange in der Bindetasche zu halten. Das Enzym besaß also eine deutlich geringere Affinität zu

diesen, wobei solche Affinitäten zwischen Substraten und Bindetaschen häufig über hydrophobe

Wechselwirkungen unter Ausschluss von Wasser-Molekülen realisiert werden (Englert et al., 2010) .

Diese Berechnungen decken sich gut mit den experimentellen Ergebnissen der Mutagenese-

Versuche der vorliegenden Arbeit. Einerseits können alle über das entwickelte Screening

abgeleiteten Mutationen als sogenannte „close mutations“ (Morley und Kazlauskas, 2005)

eingestuft werden, d.h. die mutierten Aminosäuren sind Teil bzw. liegen im direkten Umfeld der

Bindetasche und sind somit wahrscheinlich an der Wechselwirkung mit den Liganden beteiligt.

Andererseits wurden - v.a. im Fall der Position 205 - Aminosäuren gegen andere mit größerer

Hydrophobizität ersetzt. Auch die kinetischen Daten zeigen, dass durch den Austausch der

Aminosäuren im Wesentlichen nicht die Geschwindigkeitskonstanten, sondern v.a. die Affinität

zwischen den Substraten und dem Enzym signifikant verbessert wurde. Dies wird durch die in

silico-Daten bestätigt. Abb. 62 zeigt die MD-Simulation des N205M-Muteins:

126

Abb. 62: MD-Simulation des DlP5βR N205M-Muteins mit Progesteron (PRO) und 2-Cyclohexen-1-on (CH). Graue

Linie = 5 Angstrôm-Linie) (Bauer et al., Manuskript in Vorbereitung).

Verglichen mit dem WT (Abb. 61) zeigen auch die MD-Daten des Muteins eine längere

Verweildauer beider Substrate in der Bindetasche. Dies untermauert die Hypothese der gesteigerten

Affinität der Muteine weiter.

Ausgehend von den MD-Berechnungen und den Ergebnissen der Mutagenese-Experimente

kann versucht werden, alle Proteine, die als Ergebnisse einer BlastP-Suche mit der Sequenz der

DlP5βR gefunden werden konnten, anhand ihres Aminosäure-Musters an den beiden „hot-spots“

prospektiv in „starke“ und „schwache“ Proteine einzuteilen, wobei die Aktivität der DlP5βR als

Referenzwert dient. Es wird vorhergesagt, dass beispielsweise die VEP1-Gene von Medicago

trunculata (ABD33275.2), Picea sitchensis (ABK24388.1) und Oryza sativa (NP_001050440.1) für

sehr aktive P5βR codieren. Als schwach eingestuft werden z.B. die P5βR aus Calotropis procera

(Bauer et al., 2010) und aus Arabidopsis lyrata (XM_002869685.1). Dieses Protein scheint für die

Argumentation besonders interessant. Es besitzt fast die identische Sequenz wie die A. thaliana-

Variante (Herl et al., 2009), entspricht aber an den „hot-spots“ den Enzymen aus der Gattung

Erysimum und stellt deswegen einen guten Prüfstein für die Validierung der Vorhersagen dar.

Ausgehend von den MD-Simulationen ergaben sich Hinweise auf das Vorhandensein einer

alternativen Bindetasche für CH. Diese Hypothese widersprach zunächst den Ergebnissen dieser

Arbeit, konnte jedoch nicht aufrecht erhalten werden.

127

IV.2.2 Konservierte Reste innerhalb der Bindetasche der P5βR

Ein Vergleich der erstellten Homologie-Modelle aller P5βR zeigt, dass die Gesamtfaltung

der Proteine in allen Fällen etwa identisch ist, wie dies auch aus der hohen Sequenz-Identität zu

erwarten ist (Petsko und Ring, 2009). Abweichungen ergeben sich jedoch bei der Betrachtung und

dem Vergleich der putativen Substrat-Bindetaschen. Die Bindetasche wird in diesem Rahmen als

putativ bezeichnet, weil der genaue Binde-Modus des Substrats bisher noch nicht experimentell

bestimmt werden konnte. Die Co-Kristallisation von Progesteron mit der rDlP5βR war nicht

erfolgreich (Thorn et al., 2008). Dies lässt sich v.a. mit der schlechten Wasserlöslichkeit des

Steroids begründen. Sein Bindebereich ist jedoch über in silico-Methoden (Docking-Experimente)

mit Hilfe der aufgeklärten DlP5βR-Kristallstruktur (PDB 2v6g), in der das Cosubstrat der binären

Reaktion (NADPH) mit aufgelöst wurde, gut abgeleitet worden (Thorn et al., 2008; Herl et al.,

2009). Hinzu kommt, dass das Progesteron-Molekül insgesamt wenig sterische Freiheitsgrade

besitzt. Dieser publizierte Bindungsmodus wurde auch für alle neu modellierten P5βR in dieser

Arbeit übernommen. Alle Reste, die (mit mindestens einem Atom) höchstens 4 Å vom Substrat

entfernt lagen, wurden als direkte Bestandteile der Substrat-Bindetasche gewertet.

Insgesamt war in allen Strukturen auffällig, dass keine speziell für die Bindung von

Progesteron adaptierte Tasche vorliegt. Neben den Unterschieden an den Positionen, die sich - wie

diskutiert - als essentiell für die Stärke der enzymatischen Aktivität und die Substratpräferenz

erwiesen haben, findet man noch eine Reihe von anderen Substitutionen, aber interessanterweise

auch einen Bereich der Bindetasche, der in allen funktionell exprimierten P5βR streng konserviert

vorliegt. Dieser umfasst die Aminosäuren Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-179, Met-215

und Phe-343, die den unteren Teil der „trichterförmigen“ Bindetasche bilden. In diesem Bereich

findet auch die eigentliche Katalyse in Form der Hydrid-Übertragung von NADPH auf das Substrat

statt (Thorn et al., 2008). Die Bindetasche reicht von der Oberfläche etwa 20 Å ins Proteininnere,

während Progesteron etwa 10 Å umfasst.

Während die räumliche Konservierung von Lys-147 und Tyr-179 einfach zu erklären ist, da

dies die beiden SDR-typischen katalytischen Reste sind (Kavanagh et al., 2008) und die absolute

Notwendigkeit von Tyr-179 bereits von Thorn et al., (2008) durch gerichtete Mutagenese gezeigt

werden konnte, führte der individuelle Austausch jedes der sieben Reste gegen Alanin zu einem

starken bis kompletten Funktionsverlust der rekombinanten Reduktase. Entgegen der Erwartung

war das Lys-147-Mutein nicht vollständig funktionslos. Die Ergebnisse des Versuchs zeigten, dass

dieses Lysin zwar sehr wichtig ist für die Effizienz des Proteins, aber im Gegensatz zu bisherigen

Annahmen nicht in dem Ausmaß obligatorisch ist wie Tyr-179 (Thorn et al., 2008). Ähnliche

128

Effekte wurden bei Mutagenese-Experimenten mit den katalytischen Resten Tyr-194 und Lys-198

eines anderen SDR-Enzyms beobachtet, bei denen gezeigt wurde, dass sowohl dessen Y194C-, als

auch das K198R-Mutein noch Restaktivität mit ausgewählten Substraten besitzt (Nakajin et al.,

1998).

Dass die G145A-Mutation die Katalyse-Fähigkeit des Proteins zerstört, konnte durch in

silico-Mutagenese weitgehend erklärt werden. Die Hauptkette des Proteins verliert einerseits an

Flexibilität, andererseits scheint die Einbringung einer voluminöseren Seitengruppe die

Orientierung von Tyr-179 zu stören.

Auffallend an den Mutagenese-Experimenten waren die ausgeprägten Effekte, die der

Austausch der beiden konservierten Phenylalanine auf das Enzym hatte. Besonders die

Auswirkungen der F153A-Mutation (= keine messbare Enzymaktivität mehr) wurden so nicht

vorhergesehen. In diesem Rahmen - und um eine mögliche Erklärung für den Stellenwert aller

konservierten Reste zu finden - wurden im Weiteren die Lage und Konformation aller sieben

Aminosäuren in den beiden aufgeklärten Kristallstrukturen der DlP5βR (PDB 2v6g/2v6f; mit und

ohne Cosubstrat) verglichen. Sie befanden sich alle an nahezu identischen Positionen, mit

Ausnahme von Phe-153. Diese Aminosäure ist Teil eines Protein-Abschnitts mit hoher Flexibilität

(s. auch B-Faktor der Kristallstrukturen; Thorn et al., 2008), der abhängig von der Bindung des

(Co-)Substrats herunter- oder hochgeklappt vorliegen kann. Zusammen mit den Resultaten der

Mutagenese-Versuche implizieren diese Ergebnisse eine wichtige Rolle des Phe-Restes bei der

Bindung der Substrate, z.B. in Form einer Phenylalanin-Klammer zusammen mit Phe-343 (dessen

Substitution gegen Alanin die Enzymaktivität ebenfalls dramatisch gesenkt hat). Diese Situation, in

welcher Substrat-Kanäle von Enzymen durch eine Kombination von zwei zusammen als „Pförtner“

fungierenden Phenylalanine verschlossen bzw. kontrolliert werden, wurde auch für die menschliche

CYP P450 3A4 Monooxygenease veröffentlicht (Fishelovitch et al., 2009). Analoges wurde auch

für andere CYP P450 Enyzme, wie z.B. für CYP 2B1 (PDB 1tqn), beschrieben (Li et al., 2005).

Beide Beispiele zeigen diesen „Gating“-Mechanismus an Hand von Testosteron als Substrat. Bei

den durchgeführten MD-Berechnungen mit der rAtP5βR (und der rDlP5βR) ist zu erkennen, dass

die beiden Phenylalanin-Reste (Phe-153 und Phe-343) das Steroid-Substrat durch ihren

hydrophoben Charakter in der richtigen Position stabilisieren (Abb. 63; Bauer et al., Manuskript in

Vorbereitung).

129

Abb. 63: Darstellung der beiden Phenylalanine (Phe-153 und Phe-342) mit putativer „Pförtner“-Funktion in der MD-

Simulation der AtP5βR (rot = Substrat; blau = Cosubstrat).

Die MD-Berechnung mit 2-Cyclohexen-1-on zeigte einen kompletten Verschluss der

Bindetasche. Das Substrat wird davon abgehalten, sich aus dieser zu entfernen. Ursprünglich wurde

dies als mögliche Erklärung herangezogen, dass das kleine 2-Cyclohexen-1-on bisher in allen

Fällen das bevorzugte Substrat der P5βR darstellt. Die MD-Berechnungen der beiden AtP5βR-

Muteine, bei denen jeweils Phe-153 oder Phe-342 durch Alanin ersetzt wurde, sagten eine deutliche

Änderung der Katalyse voraus, wobei die Substrate nicht mehr über die gesamte Dauer der

Simulation in der Bindetasche gehalten werden können.

Alle bei einer Blast-Suche gefundenen Gene bzw. Proteine, die als orthologe P5βR

identifiziert wurden, konnten die beschriebenen sieben konservierten Reste vorweisen. Bei den

Genen/Proteinen bakterieller Herkunft, wie z.B. aus Methylobacterium extorquens

(YP_001641399.1), ist der Phe-343-Rest durch ein (ebenfalls aromatisches) Histidin ersetzt.

Allerdings ist die Sequenz-Identität hier nur gering und es muss erst untersucht werden, ob es sich

bei den rekombinanten Enzymen überhaupt um Progesteron-Reduktasen handelt, da die Proteine in

den Datenbanken als Enzyme des Zuckerstoffwechsels geführt werden - in diesem speziellen Fall

als NAD-abhängige Epimerase.

Um die Ergebnisse aus der Mutagenese der konservierten Reste, v.a. die Hypothese einer

Phe-Klammer zur Bindung der Substrate, zu prüfen und weiter zu vertiefen, sollen nun aufbauend

auf diesen die entsprechenden, noch ausstehenden Reste der rAtP5βR substituiert werden.

130

IV.2.3 Einkürzungs-Mutagenese der rDlP5βR

Zur effektiven und schnellen Klonierung von orthologen P5βR wurde ein neues

Klonierungssystem mit dem pQE30-UA-Vektor etabliert, bei dem die „full-length“ cDNA direkt in

den Vektor kloniert wurde. Die von Herl et al. (2006; 2006; 2009) klonierten Gene liegen im

Gegensatz dazu im Standard-pQE30-Vektor vor. Dieser Unterschied sollte jedoch keine große Rolle

spielen, muss aber erwähnt werden, da durch die gewählte Klonierungsmethode unterschiedliche

artifizielle Reste zwischen dem N-terminalen His-tag und der ersten Aminosäure des rekombinanten

Proteins eingeführt werden. Im Falle des pQE30 UA-Vektors sind dies zehn Stück (Qia

Expressionist, 2003). Potentiell problematisch war aber, dass die rDlP5βR (Herl et al., 2006)

zusätzlich keine komplette P5βR darstellt, wie z.B. die rAtP5βR (Herl et al., 2009) und die in dieser

Arbeit neu klonierten und funktionell exprimierten P5βR (Bauer et al., 2010), sondern, dass es sich

dabei um ein rekombinantes Protein handelt, welches durch die Klonierung eines unvollständigen

ORFs N-terminal um 13 Aminosäuren verkürzt wurde („rDlP5βnn-13“; Erklärung der Nomenklatur

auch unter VII.1). Um die Auswirkungen solcher Proteinverkürzungen auf die P5βR zu analysieren,

wurde zunächst die vollständige cDNA aus frischem Pflanzenmaterial neu kloniert. Das etablierte

Mutagenese-System wurde modifiziert, um gezielte Deletionen am 5'-Ende des P5βR-Gens

durchführen zu können, wodurch rekombinante D. lanata-Muteine exprimiert werden sollten, deren

N-Terminus um eine definierte Anzahl an Aminosäuren verkürzt ist. Um beim anschließenden

Vergleich der Aktivität der WT-P5βR und deren Deletionsmutanten keine Komplikationen durch

sekundäre Effekte des His-tags mit dem Protein zu erhalten, z.B. wenn dieser durch ein fehlendes

Zwischenstück in die Lage versetzt wird, die Cosubstrat-Bindung zu behindern oder komplett

unmöglich zu machen, wurde entschieden, einen neuen Vektortyp mit C-terminalem His-tag zu

verwenden. Dass solche negativen Interferenzen zwischen dem Protein-Tag und der Substrat- oder

Cosubstrat-Bindung bei (SDR-)Enzymen möglich sind, wurde bereits am Beispiel einer Tropinon-

Reduktase aus S. dulcamara gezeigt (Freydank et al., 2008). Ob diese theoretische Möglichkeit

auch bei den P5βR besteht, kann aus der Struktur nicht abgeleitet werden, da die einzige

experimentelle Kristallstruktur erst mit dem Aminosäure-Rest Ser-26 beginnt (Thorn et al., 2008).

Der Versuch die fehlenden Reste 1-25 zu modellieren, gelang nicht, da es nicht möglich war, ein

geeignetes Template in der RCSB-Proteindatenbank zu finden. Ein weiterer Vorteil des neuen

Vektors ist, dass durch die Art der Klonierung über homologe Rekombination - mit Ausnahme des

His-tags selbst - keinerlei artifiziellen Aminosäuren mehr im rekombinanten Protein auftauchen.

Die Klonierung und die folgende erste Deletions-Mutagenese der klonierten cDNA

(Deletion von 30 Aminosäuren) konnte erfolgreich durchgeführt werden. Die Expression der „full-

131

length“-P5βR lieferte auch mit einem C-terminalen His-tag ein funktionelles Protein. Dies war nicht

selbstverständlich, da C-terminale His-tags häufig zu schlechter Löslichkeit der rekombinanten

Proteine führen (Busso et al., 2003). Auch Woestenenk et al. (2004) legten an Hand von 20

klonierten menschlichen ORFs systematisch dar, dass die Art des His-tags sich stark auf die

Eigenschaften des Proteins (Löslichkeit und Ausbeute) auswirken kann. Die Expression der

Deletionsmutante (rDlP5βRcn-30) und der Nachweis der Funktionalität erfolgte durch Rudolph

(2011). Die Autorin führte weitere Deletions-Experimente durch und beschrieb zusätzlich die

erfolgreiche Expression von rDlP5βR mit N-terminaler Deletion von 10, 20 und 40 Aminosäuren.

Sowohl die relativen Aktivitäten, als auch die kinetischen Konstanten der Muteine zeigten, dass

durch die Einkürzung des Proteins die enzymatische Aktivität erst zunimmt (-10 und -20

Aminosäuren) und dann verschwindet (-30 und -40 Aminosäuren). Gleichzeitig mit dem Verlust der

Aktivität nahm jedoch die Menge an rekombinant-exprimiertem Protein stark ab. Die Ursachen für

die schlechtere Expression können vielfältig sein und reichen von einer inkorrekten Faltung, über

eine gesteigerte Aggregationsrate, bis hin zur Bildung von „Inclusion-Bodies“ (Baneyx, 1999;

Baneyx und Mujucic, 2004). Da die Expressionsanalyse der rDlP5βRcn-30 auch einige

Verunreinigungen aufzeigte, wurden von allen Proteinen CD-Spektren (Cantor et al., 1980)

aufgenommen, um Hinweise zu erhalten, dass es sich bei den gereinigten Enzymen um rDlP5βR-

Muteine handelt. Die Faltungszustände der rekombinanten Proteine wurden mit „fernem“ UV-Licht

analysiert, um deren Sekundärstrukturgehalt zu quantifizieren (Abb. 64; Rudolph et al., Manuskript

in Vorbereitung).

132

Abb. 64: CD-Spektren der rDlP5βRnn-13 (F), rDlP5βRc (A) und deren Deletions-Muteinen (B = rDlP5βRcn-10, C =

rDlP5βRcn-20, D = rDlP5βRcn-30, E = rDlP5βRcn-40, G = überlagerte Spektren; nach Rudolph, 2011; zur Erklärung

der Nomenklatur der P5βR siehe auch VII.1)

Alle gemessenen CD-Spektren zeigten die Charakteristika eines α-helikalen Proteins mit β-

Faltblattanteil: zwei Minima bei etwa 208 nm und 222 nm und ein absolutes Maximum bei 193 nm

(Holzwarth et al., 1965; Greenfield und Fasmann, 1969). Dies entspricht den aus der Struktur der

rDlP5βR abgeleiteten Erwartungen (Abb. 3; Thorn et al., 2008). Aus der Tatsache, dass alle

Spektren nahezu identisch waren, kann abgeleitet werden, dass es sich bei den exprimierten

Proteinen um P5βR -Varianten (und nicht um Verunreinigungen) handelt, die unabhängig vom Grad

der N-terminalen Deletion gleich gefaltet vorliegen. Auch über Dot-Blots/Western-Blots der

133

rDlP5βRcn-30 (Rudolph und Kreis, unveröffentlicht) konnte gezeigt werden, dass trotz der Deletion

von 30 Aminosäuren noch gefaltetes Protein gebildet wird, welches aber ab dieser Stufe keine

Aktivität besitzt. Die enzymatische Aktivität der P5βR geht durch N-terminale Kürzung der

Proteine im Bereich von 21-30 Aminosäuren verloren. Eine plausible Erklärung hierfür ist, dass

durch die Deletion der Aminosäuren eines der sechs parallelen β-Faltblätter der Rossmann-Faltung

(Rossmann und Argos, 1976) betroffen ist, wodurch das Netzwerk von intramolekularen H-

Brücken, welches zwischen diesen β-Strängen besteht, gestört wird (Abb. 65, B). Bei der Kürzung

von 10 weiteren Resten auf '-40' wurden dieser erste β-Strang und zusätzlich der Loop, der das

zentrale Gx(x)Gx(x)G-Rossmann-Motiv beinhaltet, komplett entfernt (Abb. 65, C). Folglich fehlt

die Position, die wesentlich für die Cosubstrat-Bindung zuständig ist (Kallberg et al., 2002, Person

et al., 2003). Da die Proteine nach den CD-Messungen noch gefaltet vorliegen, sollten fehlerhafte

Bindungen des Cosubstrats, z.B. durch eine fehlerhafte Orientierung der Motive, für den

Aktivitätsverlust verantwortlich sein.

Abb. 65: Struktur der DlP5βR (PDB 2v6g) gefärbt nach Sekundärstruktur-Elementen (rot = α-Helix, gelb = β-Faltblatt;

grün = Loop; blau = Cosubstrat). Der Pfeil markiert jeweils den N-Terminus des Proteins (A = WT; B = DlP5βRn-30; C

= DlP5βRn-40).

Mit der CD-Methode wurden auch die Hitzestabilität der rDlP5βRc und der

Deletionsmutanten gemessen. Dies geschah über die Aufnahme von mehreren CD-Spektren eines

Proteins bei unterschiedlichen Temperaturen, zwischen 20 und 96 °C (Rudolph et al., Manuskript in

134

Vorbereitung). Es konnte keine vollständige, sondern immer nur eine teilweise Entfaltung

beobachtet werden. Es handelt sich bei allen rekombinanten Enzymen um sehr hitzestabile Proteine,

bei welchen die Hälfte der Protein-Moleküle erst bei 44 - 48°C entfaltet vorliegen (Rudolph, 2011).

Beispiele für andere pflanzliche Proteine, die ebenfalls sehr thermostabil sind, wären u.a. die

Peroxidasen aus der Sojabohne (Jones et al., 1998) und Meerrettich (Oppmann et al., 1990; Dunford

et al., 1991). Die Schmelztemperatur der SBP (Peroxidase der Sojabohne) ist mit 86 °C (Kamal et

al., 2002) ungefähr doppelt so hoch wie der Schmelzpunkt der rDlP5βRc.

Warum die Aktivität durch die Einkürzung zunächst steigt, lässt sich nicht beantworten, da

die Struktur dieser Reste - wie beschrieben - im Kristall fehlt. Eine Möglichkeit, eine Erklärung zu

finden, wären MD-Simulationen mit und ohne diesen Protein-Tag durchzuführen. Die Aktivität der

rDlP5βRcn-10 entspricht in etwa der der rDlP5βRnn-13 (Herl et al., 2006), allerdings ist der direkte

Vergleich nur bedingt zulässig, da sich der His-tag wie gesagt auf verschiedenen Seiten des Proteins

befindet. Dass dies nicht nur einen entscheidenden Einfluss auf Löslichkeit, sondern auch auf die

Aktivität eines rekombinanten Proteins haben kann, wurde am Beispiel der rekombinanten S.

dulcamara Tropinon-Reduktase gezeigt (Freydank et al., 2008). Auch bei rekombinantem humanem

Serum-Transferrin lassen sich je nach Platzierung des His-tags deutliche Unterschiede erkennen: So

war die Eisenfreisetzung bei C-terminalem His-tag signifikant verlangsamt im Vergleich zum

Protein ohne His-tag. Beim N-terminalen His-tag trat dieses Phänomen nicht auf (Mason et al.,

2002). Insgesamt sind jedoch beide Proteine, die um etwa 10 bzw. 13 Aminosäuren gekürzt sind,

aktiver als der ungekürzte Wildtyp. Ließe sich dies auch auf die „full-length“-DlP5βR mit N-

terminalem His-tag übertragen, müsste die Aktivität der D. lanata P5βR nach unten korrigiert

werden und auf eine Stufe mit der rGfP5βR oder rEcP5βR gestellt werden. Ob eine Kristallisation

der kompletten rDlP5βRc ähnlich schnell verlaufen würde, wie für die rDlP5βRn beschrieben

wurde (Egerer-Sieber et al., 2006), lässt sich nicht sagen. Einige Autoren gehen allgemein davon

aus, dass die Effekte von His-tags auf die Kristallisation sehr gering sind (Smyth et al., 2003). Qin

et al., (2006) geben an, dass die Kristallisation durch den Tag sogar erleichtert ist gegenüber

nativem Protein. Es gibt aber auch Beispiele, in denen Tags starke, negative Auswirkungen hatten

(Bucher et al., 2002).

Obwohl es aus den theoretischen Überlegungen und den Literaturangaben nicht sehr

wahrscheinlich ist (vgl. Diskussion zur Cosubstrat-Bindung unter IV.2.4) , wurde die Aktivität der

gekürzten Proteine auch mit dem alternativen Cosubstrat NADH getestet, da durch die Deletionen

Veränderungen am N-terminalen Cosubstrat-Bindebereich (Kavanagh et al., 2008) des SDR-

Proteins stattgefunden haben. Es konnte aber mit diesem Cosubstrat keine Aktivität gezeigt werden.

135

Mit dem entwickelten Photometer-Assay dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten

bestimmt, wobei die größte Auffälligkeit das Verhalten der rDlP5βRc (also der kompletten P5βR)

war, die mit 34,3 µM eine sehr starke Affinität zu Progesteron besaß (Rudolph, 2011). Dieser Wert

entspricht gut dem der nativen D. pupurea P5βR (Gärtner et al., 1994) und dem Km-Wert der D.

purpurea P5βR2 (Pérez-Bermúdez et al., 2010), ist aber um ein Vielfaches niedriger als die

publizierten und selbst gemessenen Werte der gekürzten DlP5βR (Herl et al., 2006). Um hier

Aussagen treffen zu können, müsste die „full-length“-P5βR mit N-terminalem His-tag zum

Vergleich ebenfalls kloniert und exprimiert werden. Die Km-Werte der Deletionsmutanten lagen

demgegenüber im typischen P5βR- Bereich (Herl et al., 2006; Munkert et al., 2011; diese Arbeit).

Sowohl die rDlP5βRc, als auch deren Deletions-Muteine, setzten bevorzugt das kleine Substrat-

Mimetikum 2-Cyclohexen-1-on um, wie es für alle rekombinanten P5βR beschrieben wurde (Burda

et al., 2009; Bauer et al., 2010; Munkert et al., 2011).

Die Ergebnisse der Deletionsmutagenese-Experimente erlauben es erneut, einen Bezug zur

Evolution von neuen Stoffwechselwegen zu machen. Ein verkürztes Gen könnte so z.B. die

Auswirkung einer (unvollständigen) Genduplizierung sein, wodurch ohne weitere Spezialisierung

und ohne weitere Mutation und Selektion (Ober et al., 2010) bereits Enzyme mit neuen

Eigenschaften, wie geänderter Substrat-Spezifität oder Aktivität erhalten werden könnten. Neue

Stoffwechselwege können durch diese Enzyme geöffnet oder gefestigt werden - z.B. durch die

Bevorzugung bisher nicht oder nur schlecht genutzter Substrate. Um die Existenz weiterer N-

terminal verkürzter P5βR-artiger Enzyme nachzuweisen, wurde eine Blast-Suche durchgeführt

(Rudolph 2011; eigene Recherche). Hier konnten mehrere N-terminal um13 Aminosäuren verkürzte

Proteine gefunden werden, u.a. aus Populus tremula (ACE96881; ACE96889; ACE96904) und Zea

mays (NP_001140307). Allerdings muss man hier Vorsicht walten lassen, da es sich jeweils um

hypothetische Proteine handelt und es sich um falsch-positive Treffer handeln könnte, da die Stelle,

an der das Protein beginnt, diejenige ist, die sich im Gen bei D. lanata direkt nach dem Intron

befindet. Die Lage und das Vorkommen eines Introns ist für die Gene zwar nicht gezeigt, wäre aber

zu erwarten, da ein solches in allen pflanzlichen VEP1-Genen streng konserviert zu sein scheint

(Tarrío et al., 2011). Evtl. handelt es sich also um fehlerhafte Vorhersagen in der Datenbank auf

Grund von Unkenntnis der Intron-Exon-Grenzen. Andere unterschiedlich verkürzte P5βR findet

man in Oryza sativa (AAP20856) und Sorghum bicolor (XP_002467669). Alle identifizierten

verkürzten Treffern war allerdings gemein, dass sie nicht der „sensu strictu“-Definition

entsprachen, da bestimmte charakteristische Protein-Motive fehlten (Persson et al., 2003; Thorn et

al., 2008).

136

IV.2.4 Änderung der Cosubstrat-Spezifität

Ein häufig beschriebenes Ziel von rationalen Mutagenese-Experimenten ist es, Enzym-

Varianten zu erzeugen, die ein anderes als das natürliche bzw. verschiedene Cosubstrate verwerten

können. Der erste publizierte Erfolg umfasst die Änderung der Cosubstrat-Spezifität einer

Glutathion-Reduktase, wobei das Verhältnis der katalytischen Effizienz der Reduktion im Vergleich

zum NADPH-spezifischen WT um den Faktor 18.000 in Richtung NADH-Spezifität geändert

werden konnte (Scrutton et al., 1990).

Die Begründung, weshalb diese Art von Experimenten oft durchgeführt werden, beinhaltet

neben einem allgemeinen Erkenntnisgewinn über die Art und Weise der Cosubstrat-Bindung bei

verschiedenen Enzym-Klassen auch Aspekte der biotechnologischen bzw. industriellen

Anwendung: Enzyme mit NAD(H)-Spezifität werden häufig bevorzugt, u.a. da NADPH zehnmal

teurer ist als (das stabilere) NADH.

Auf dem Gebiet der rationalen Cosubstrat-Mutagenese ist die relative Häufung von

Veröffentlichungen auffällig, die sich mit dem Design von Enzymen des Xylitol-Abbaus

beschäftigen. D-Xylose stellt nach Glucose einen der am häufigsten in der Natur anzutreffenden

Zucker dar und ist wesentlicher Bestandteil von Hemicellulose(n). Es wird deshalb versucht,

nachhaltige Prozesse zu entwickeln, D-Xylose aus Abfällen in Form von pflanzlicher Biomasse in

Biotreibstoffe wie Bioethanol umzuwandeln und zur Energiegewinnung zu nutzen (Deluga et al.,

2004). Hierzu sollen biologische Organismen genutzt werden. Da jedoch die meisten Modell-

Organismen, wie die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) und das Bodenbakterium

Streptomyces coelicolor, D-Xylose nicht katabolisieren können, wurde versucht, die Gene des

Xylose-Metabolismus (Abb. 66, A) aus anderen Quellen, wie Pichia stipitis oder Gluconobacter

oxydans, in diesen ektopisch zu exprimieren (Übersicht z.B. Ostergaard et al., 2000; Jeffries und

Jin; 2004). Die genetisch veränderten Streptomyces-Stämme waren so in der Lage D-Xylose

abzubauen. Allerdings musste erst eine weitere Kohlenstoff-Quelle wie Glucose zugegeben werden.

Grund hierfür war wahrscheinlich ein Ungleichgewicht des intrazellulären Redoxpotentials,

welches durch die unterschiedlichen Cosubstrat-Spezifitäten der exprimierten Enzyme entsteht

(Ostergaard et al., 2000): Die Xylose-Reduktase (XR) ist NADPH-spezifisch, die Xylitose-

Dehydrogenase (XDH) NAD+-abhängig. Watanabe et al. (2005) umgingen dieses Problem durch

das rationale Design einer NADP+-abhängigen XDH aus einer NAD+-spezifischen XDH aus Pichia

(EC 1.1.1.9; MDR-Enzym). Hierzu waren 3-4 Substitutionen notwendig. Später gelang durch den

Austausch von zwei Aminosäure-Resten das rationale Design einer XDH, welche NADP+-

spezifisch war und deren Aktivität der des WT-Proteins aus Gluconobacter (E.C. 1.1.1.9; SDR-

137

Enzym) entsprach (Ehrensberger et al., 2006). Umgekehrt gelang es später Khoury et al. (2009) die

Cosubstrat-Spezifität der XR aus Candida boidinii von NADPH auf NADH zu ändern.

Diese Beispiele legen zum einen gut die Bedeutung dar, die Mutagenese-Experimente auch

für die anwendungsorientierte Forschung haben können. Zum anderen zeigen sie, dass die in vivo-

Kombination von Biosynthese-Enzymen mit unterschiedlichen Cosubstrat-Spezifitäten in einem

Organismus wie Saccharomyces cerevisiae möglich ist, aber zu Problemen führen kann.

Interessanterweise findet sich eine ähnliche Situation auch für die Biosynthese-Enzyme der

Cardenolide (Abb. 66, B).

Abb. 66: Analogie in den Reaktionen des biologischen Abbaus von D-Xylose in transgenen Hefen (A; nach

Ehrensberger et al., 2006 ) und in der Biosynthese der Cardenolide (B).

Da auch für die Cardenolid-Biosynthese das (mittelfristige) Ziel besteht, die verfügbaren

klonierten Biosynthese-Gene in vivo in Hefezellen zu kombinieren, erschien die Ableitung einer

NADH-spezifischen P5βR sinnvoll. Hinzu kommt, dass durch die Verfügbarkeit einer solchen

NADH-spezifischen P5βR zusätzlich eine in vitro-Kombination mit einer rekombinanten 3β-HSD

(Herl et al., 2007) und einer Cosubstrat-unabhängingen 3-Ketosteroidisomerase (Meitinger, 2011)

in Form eines sich selbst regenerierenden Systems möglich werden sollte (Abb. 67).

138

Abb. 67: Theoretisches System aus 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD), Ketosteroidisomerase (KSI) und

mutierter NADH-spezifischer P5βR, das sich in vitro selbst regenerieren könnte.

In diesem System ersetzt die 3β-HSD die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, die im

„regenerierenden System“ des Standard-P5βR-Assays genutzt wird (vgl. II.2.3.6), um das

Cosubstrat der Reaktion der P5βR (NADPH) zu regenerieren (Stuhlemmer und Kreis; 1996; Herl et

al., 2006; Herl et al., 2009; Bauer et al, 2010; Munkert et al., 2011). Da die beiden WT-Enzyme

unterschiedliche Cosubstrate nutzen, wird diese Kopplung erst durch die Cosubstrat-Mutagenese

eines der beiden Biosynthese-Enzyme möglich gemacht.

Auf Grund der aufgeklärten Kristallstruktur wurde die DlP5βR auch bei dieser

Versuchsreihe als Template für die Mutagenese-Experimente ausgewählt, v.a. auch deshalb, weil

hier eine Co-Kristallisation mit dem Cosubstrat gelungen ist (Thorn et al., 2008). Eine Änderung

der Cosubstrat-Spezifität zu erreichen, ist in manchen Fällen dadurch gelungen, dass Enzyme mit

ähnlicher Struktur und Funktion identifiziert und analysiert werden konnten, z.B. durch den

Vergleich einer typischen NADPH-spezifischen XR mit einer NADH-bevorzugenden XR aus

Candida sp (Lee et al., 2003). In der Gruppe der P5βR gibt es jedoch keine orthologen Enzyme mit

experimentell nachgewiesener Spezifität für NADH. Es konnte aber auf einen großen

Erfahrungsschatz zurückgegriffen werden, da es sich um ein Protein aus der SDR-Familie mit einer

charakteristischen Rossmann-Faltung handelt, welche in der Vergangenheit bereits sehr gut

untersucht wurde. Diese besteht aus sechs β-Faltblättern, die von α-Helices umgeben werden und

für die Cosubstrat-Bindung verantwortlich sind (Rossmann und Argos, 1976). In der Sequenz der

139

P5βR findet man hier das charakteristische, Cosubstrat-bindende Gx(x)Gx(x)G-Motiv, das für die

„extended SDR“-Enzyme typisch ist (Carugo und Argos, 1997; Kallberg et al., 2002). Weil sich

NADPH und NADH nur durch eine Phosphatgruppe, die als Ester an die Position 2´ der Adenosin-

Ribose gebunden vorliegt, unterscheiden und mit dieser Gruppe nur eine begrenzte Anzahl von

Aminosäuren interagieren können, existieren bestimmte „Marker-Aminosäuren“, die auf das

Rossmann-Motiv in der Aminosäure-Sequenz folgen (Baker et al., 1992; Persson et al., 2003).

Diese entsprechen in der D. lanata Struktur dem Motiv II (Thorn et al., 2008). In NADP+-

bevorzugenden Enzymen findet man hier basische (d.h. positiv geladene) Reste, die mit der negativ

geladenen Phosphatgruppe ionische Wechselwirkungen ausbilden können (Carugo und Argos,

1997). Es handelt sich hierbei i.d.R. um 1-2 Arginin-Reste (Scrutton et al., 1990), die auch in der

Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR zu finden sind (Arg-63 und Arg-64; Thorn et al., 2008; Abb.

68).

Abb. 68: Cosubstrat-Bindungetasche der rDlP5βR. Die beiden grün markierten Arginin-Reste sind wesentlich mit-

verantwortlich für die Diskriminierung zwischen NADPH und NADH (nach Thorn et al., 2008).

Über den Austausch dieser beiden Arginin-Reste (gegen Asparaginsäure) wurde in der

vorliegenden Arbeit gezeigt, dass v.a. der Rest Arg-63 die Bindung dieser Phosphatgruppe

übernimmt, da dessen Austausch einen vollkommenen Verlust der Funktion nach sich zieht, obwohl

die Kristallstruktur zeigt, dass beide Phosphatgruppen interagieren (Thorn et al., 2008). Im

Gegensatz zu den Aminosäuren mit basischen Seitenketten, findet sich bei den NAD+-

bevorzugenden Enzymen eine Wechselwirkung zwischen den beiden Hydroxlygruppen der

Adenosin-Riboseeinheit mit der Carboxyl-Seitengruppe einer sauren Aminosäure (Carugo und

140

Argos, 1997). Für NAD+-spezifische Enzyme handelt es sich fast ausnahmslos um einen

Asparaginsäure-Rest, bei Dehydrogenasen/Reduktasen mit FAD-Spezifität wurde eine ähnliche

Situation beschrieben, allerdings ist als saure Aminosäure i.d.R. ein Glutaminsäure-Rest vorhanden.

Kallberg und Persson (2006) entwickelten aus diesen Fakten einen Algorithmus, mit dem es

möglich war, zu 80 Prozent das richtige Cosubstrat (NAD+, NADP+, FAD) einer beliebigen

Dehydrogenase/Reduktase in silico zu bestimmen. Trotz all dieses Wissens ist der Erfolg einer

Mutagenese im allgemeinen nicht vorhersehbar, v.a. da die Diskriminierung zwischen NADH und

NADPH in der Praxis eine Konsequenz der gesamten Bindetasche ist und nicht nur von einzelnen

Resten. So besitzt NADPH viel größere Freiheitsgrade in seiner Konformation als NADH und

bedingt dadurch wurden - im Gegensatz zu NADH – sehr variable Protein-Cosubstrat-Interaktionen

beschrieben (Carugo und Argos, 1997). Vermutlich aus diesem Grund sind nicht viele Fälle

beschrieben, in denen eine vollständige Umkehr der Cosubstrat-Spezifität erfolgreich war, bei

denen die enzymatische Aktivität gleichzeitig vollständig erhalten blieb. Eine Tabelle mit einer

Zusammenfassung von erfolgreichen „Cofactor Engineering“-Arbeiten findet sich in Khoury et al.

(2009).

Im Falle der DlP5βR wurde über in silico-Mutagenese und Überlagerung der Cosubstrat-

Bindetasche der Kristallstruktur mit der von NADH-abhängigen SDR-Enzymen die Positionierung

des postulierten sauren Restes abgeleitet. Es konnte auf diese Weise eindeutig Ala-62 als Ziel der

Mutagenese identifiziert werden. Glutaminsäure konnte auf Grund ihrer Größe nicht in der

Bindetasche platziert werden. Die abgeleitete Substitution von Ala-62 deckt sich mit

Literaturangaben, die beschreiben, dass an der Position des sauren Asparaginsäure-Restes von

NAD+-spezifischen Enzymen in den NADP+-spezifischen Enzymen meist eine kleine, ungeladene

Aminosäure wie Alanin, Glycin oder Serin gefunden werden kann (Watanabe et al., 2005). Ein

analoges Vorgehen, das ebenfalls strukturelle Alignments von Enzymen unterschiedlicher Spezifität

beinhaltete, führte auch bei Mutagenese der XDH durch Ehrensberger et al. (2006) zum Ziel. Um

ein funktionelles Protein zu erhalten, mussten zusätzlich die beiden basischen Arginine aus der

Bindetasche entfernt werden. Da es hier keine Vorgaben in Form von streng konservierten Resten

gibt, wurde das Substitutionsmuster der Struktur mit der größten Übereinstimmung im Verlauf der

Kohlenstoffkette der Cosubstrat-Bindetasche gewählt (PDB 1zem): R63M_R64N. Die Substitution

des Arginin-63, das im Kristall benachbart zum Adenin-Ring des Cosubstrats gefunden werden

kann, gegen Methionin und umgekehrt, wurde bereits in mehreren anderen Arbeiten beschrieben

(Scrutton et al., 1990; Ehrensberger et al., 2006). Da das dreifach mutierte Protein wie sich zeigt

zwar nun NADH-spezifisch, aber noch nicht ausreichend aktiv war, wurden die Ergebnisse der

141

Aktivitätsmutagenese-Experimente hinzugezogen und zusätzlich Asn-205 gegen Methionin ersetzt.

Diese Vierfach-Mutante entsprach in ihrer Aktivität, bezogen auf die Reduktion von Progesteron,

etwa dem WT. Es steht damit nun ein rekombinantes Mutein der DlP5βR zur Verfügung, das

NADH-spezifisch ist und für die in vitro- und in vivo-Kombination mit anderen Biosynthese-

Enzymen optimale Voraussetzungen zeigt. Ob es in diesen Versuchen, nach strengen Maßstäben,

gelungen ist, die Cosubstrat-Spezifität im Vergleich mit dem WT ohne Aktivitätsverlust zu ändern,

lässt sich nicht eindeutig beantworten, da zusätzlich eine “hot spot“-Aminosäure mutiert wurde, um

die Aktivität zu verändern. Dies ist jedoch für die Praxis nicht von Bedeutung, da diese mehrfach

mutierte „Designer-P5βR“ alle Voraussetzungen erfüllte, um die ersten Kombinationsversuche

durchzuführen. Die erfolgreiche und stereoselektive Umwandlung von extern zugeführtem

Progesteron durch eine „Reihenschaltung“ des „Cosubstrat-Muteins“ der DlP5βR ( DlP5βRnn-13)

und der gereinigten D. lanata 3β-HSD (Herl et al., 2007) konnte in der vorliegenden Arbeit bereits

gezeigt werden. Ob sich dies auch auf kleine Substrate anwenden lässt, muss noch untersucht

werden. Dafür bestehen jedoch gute Chancen, da sowohl der WT der P5βR, als auch die

untersuchten 3β-HSDs stark promisken Charakter aufweisen (Herl et al., 2007; Burda et al., 2009;

Bauer et al., 2010). Damit würde sich dieses System sehr gut für biotechnologische Anwendungen

eignen (Bornscheuer und Kazlauskas, 2004). Während in der Biosynthese-Forschung nach

heutigem Stand i.d.R. nur einzelne Enzyme kloniert und getrennt charakterisiert bzw. analysiert

werden (z.B. Tropinon-Reduktasen durch Brock et al., 2008), entspricht das Vorgehen, einen Teil

der Cardenolid-Biosynthese(-reaktionen) mit Hilfe des Vierfach-Muteins in vitro ablaufen zu lassen,

den Ansätzen der „Kombinatorischen Biosynthese“-Forschung. Dabei sollen, wie in den

vorliegenden Experimenten, Chemikalien mit Zellen, Zellextrakten oder (gereinigten) Enzymen

verschiedener Organismen biotransformiert werden (Übersicht von Pollier et al., 2011), wobei es im

Bereich der Cardenolid-Biosynthese bisher keine derartigen Versuche gab.

Zusammenfassend konnte zusätzlich zur Analyse der Substrat-Bindetasche durch SDM, die

den Einfluss einzelner Reste auf die Aktivität der rekombinanten P5βR klären konnte, in diesem

Teil der Arbeit die Cosubstrat-Bindetasche durch in silico-Methoden analysiert und durch gezielte

Veränderungen von Aminosäure-Resten das Verständnis für die Struktur und Funktion der P5βR

weiter vertieft werden. Letztlich flossen die Ergebnisse aus diesen beiden Teilen der Arbeit im

Design des „Cosubstrat-Muteins“ zusammen und erlaubten so die Ableitung eines Enzyms, das nun

weiter gewinnbringend angewendet werden kann, um in letzter Konsequenz auch die Biosynthese

der Cardenolide besser zu verstehen.

142

V ZUSAMMENFASSUNG

Ein wesentlicher Schritt in der 5β-Cardenolid-Biosynthese besteht in der stereo-selektiven

Reduktion der Δ4,5-C=C-Doppelbindung der Steroidvorstufe (vermutlich Progesteron), da hierbei

die charakteristische cis-Verknüpfung der Ringe A/B ins Molekül eingeführt wird. Die Reaktion

wird katalysiert durch Progesteron 5β-Reduktasen (P5βR), die Gegenstand dieser Arbeit sind. Um

die Aktivitätsunterschiede der rekombinanten Enzyme aus der Cardenolid-führenden Art Digitalis

lanata (rDlP5βR) und der cardenolidfreien Art Arabidopsis thaliana (rAtP5βR) hinsichtlich der

Reduktion von Progesteron zu erklären und mit gezielter Mutagenese rational zu verändern, wurden

zunächst weitere orthologe P5βR-cDNAs aus verschiedenen Cardenolid-akkumulierenden und

Cardenolid-freien Spezies kloniert (u.a. aus A. belladonna, C. procera, S. lycopersicon, N.

tabacum). Im Vordergrund stand bei den Versuchen die funktionelle Expression dieser Enzyme in

E. coli. Diese gelang u.a. bei den cDNAs aus E. crepidifolium, E. rhaeticum, G. fruticosum und M.

piperita. Um die Enzymkinetik der rekombinanten Proteine in vitro zu bestimmen, wurde eine

photometrische Messmethode für P5βR adaptiert. Der promiske Charakter der P5βR wurde weiter

untermauert und dessen Bedeutung für die Biosynthese diskutiert.

Mit Hilfe von erzeugten Struktur-Modellen der funktionell exprimierten P5βR konnten

sieben Aminosäure-Reste identifiziert werden, die strukturell hoch konserviert im inneren Teil der

putativen Substrat-Bindetasche aller Proteine vorliegen (Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-

179, Met-215, Phe-343; Bauer et al., 2010). Von diesen Resten wurden bisher nur zwei als

katalytisch bedeutsam beschrieben. Die konservierten Reste in der DlP5βR wurden einzeln durch

Alanin ersetzt und die Aktivität der Muteine untersucht. Vor allem die essentielle Rolle von Phe-153

für die enzymatische Aktivität der DlP5βR konnte demonstriert werden. In Verbindung mit in silico-

Überlegungen wurden Phe-153 und Phe-343 eine zentrale Bedeutung für die Substrat-Bindung bei

den P5βR-artigen Proteinen zugesprochen.

Für die rationale Mutagenese zur Steigerung der Enzymaktivität der rDlP5βR wurden drei

Positionen innerhalb der Aminosäure-Sequenz als „hot-spots“ identifiziert (Tyr-156; Asn-205; Ser-

248). Dies geschah über eine Kombination aus Sequenz- und Aktivitätsvergleichen der neu

exprimierten Enzyme („bioactivity guided“). Durch die einfache Mutagenese von zwei dieser

Positionen konnte die katalytische Aktivität der DlP5βR stark verbessert werden (bis Faktor 9,

bezogen auf kcat/Km). Dies wurde zurückgeführt auf eine größere Affinität der Bindetasche zum

Substrat. Der Aktivitätsunterschied der rDlP5βR und der rAtP5βR konnte somit erklärt werden.

Andere publizierte in silico-Theorien wurden überprüft und konnten experimentell widerlegt

143

werden.

Eine „full-length“ DlP5βR wurde kloniert und funktionell exprimiert. Das Gen wurde über

Deletionsmutagenese rational verkürzt.

Über einen rationalen Mutagenese-Ansatz konnte zusätzlich durch die Substitution von vier

Aminosäuren (Ala-62, Arg-63; Arg-64; Asn-205) die Cosubstrat-Spezifität der rDlP5βR von

NADPH auf NADH (ohne Verlust an Enzymaktivität) geändert werden, um ein Enzym für die

Kombination mit anderen NADH-spezifischen, rekombinanten Biosynthese-Enzymen zu besitzen.

144

V SUMMARY

A main step in the biosynthesis of 5β-cardenolides is the stereo-specific reduction of the Δ4,5-

C=C bond of the steroid precursor (progesterone), which introduces the characteristic cis-

connection between the rings A/B. This reaction is catalysed by progesterone 5β-reductases (P5βR),

which have been in the focus of this work. In order to find an explanation for the differences in the

activities of the recombinant enzymes from the cardenolide-containing Digitalis lanata (rDlP5βR)

and the cardenolid-free Arabidopsis thaliana (rAtP5βR) for the reduction of progesterone and to

change it by means of rational mutagenesis, an additional number of orthologous P5βR-cDNAs

from cardenolide-accumulation and cardenolide-free species have been cloned (e.g. from A.

belladonna, C. procera, S. lycopersicon, N. tabacum). The primary aim of these experiments,

however, was the functional expression of these enzymes. This was demonstrated for the cDNAs of

E. crepidifolium, E. rhaeticum, G. fruticosum and M. Piperita. For the in vitro determination of the

enzyme kinetics of the recombinant proteins, a photometric method has been developed.

Using the data of all functionally expressed P5βR for homology modeling experiments, a

number of seven highly-conserved amino acid residues could be deduced within the inner part of

the putative substrate binding-sites of all proteins (Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-179,

Met-215, Phe-343). Just two of these residues have been described to be catalytically important,

formerly. In the DlP5βR all of these conserved residues have individually been substituted against

alanine and the enzymatic activities of the muteins have been analysed. Especially the essential role

of the Phe-153 residue for the enzymatic activity of the DlP5βR could be demonstrated. In

combination with in silico methods Phe-153 and Phe-343 were identified to be important for the

substrat-fixation in P5βR-like enzymes.

Three „hot-spot“ positions (Tyr-156; Asn-205; Ser-248) for the site-directed mutagenesis

(SDM) experiments - in order to increase the enzymatic activity of the DlP5βR - were found within

its amino acid sequence. They were deduced by combining comparison of sequences and activities

of the newly expressed enzymes („bioactivity guided“). By substituting the residues at two of these

positions the catalytic activity of the rDlP5βR was highly increased (by a factor of 9; kcat/Km). This

was due to an increased affinity of the binding-site for the substrate. Hence, the observed

differences in the activity level of the rDlP5βR and the rAtP5βR could be explained. Other in silico

theories were tested and could experimentally be disproved.

A „full-length“ DlP5βR was cloned and functionally expressed. Subsequently, parts of the

ORF were deleted by rational mutagenesis.

145

With rational designed mutagenesis experiments the cosubstrate-specificity of the rDlP5βR

was „switched“ from NADPH to NADH by the substitution of four amino acid residues (Ala-62,

Arg-63; Arg-64; Asn-205) in order to gain an enzyme for the in vitro combination with other

NADH-specific recombinant biosynthesis-enzymes.

146

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Biochem J, Institut für Biologie I, Universität Tübingen, Federal Republic of Germany., 1990, Vol. 266(1), pp. 41-46

Wilming, M., Iffland, A., Tafelmeyer, P., Arrivoli, C., Saudan, C. & Johnsson, K.

Examining reactivity and specificity of cytochrome c peroxidase by using combinatorial mutagenesis.

Chembiochem, 2002, Vol. 3(11), pp. 1097-1104

Winnicka, K., Bielawski, K. & Bielawska, A.

Cardiac glycosides in cancer research and cancer therapy.

Acta Pol Pharm, Department of Pharmaceutical Technology, Medical University of Białystok, 1 Kilińskiego Str., 15-089 Białystok, Poland., 2006, Vol. 63(2), pp. 109-115

Woestenenk, E.A., Hammarström, M., van den Berg, S., Härd, T. & Berglund, H.

His tag effect on solubility of human proteins produced in Escherichia coli: a comparison between four expression vectors.

J Struct Funct Genomics, Department of Biotechnology, Royal Institute of Technology (KTH), AlbaNova University Center, Stockholm, Sweden., 2004, Vol. 5(3), pp. 217-229

Yang, K.Y., Moon, Y.H., Choi, K.H., Kim, Y.H., Eun, M.Y., Guh, J.O., Kim, K.C. & Cho, B.H.

Structure and expression of the AWI 31 gene specifically induced by wounding in Arabidopsis thaliana.

Mol Cells, College of Agriculture, Chonnam National University, Kwangju, Korea., 1997, Vol. 7(1), pp. 131-135

Ye, J., Chen, S. & Maniatis, T.

Cardiac glycosides are potent inhibitors of interferon-β gene expression.

Nat Chem Biol, Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA., 2011, Vol. 7(1), pp. 25-33

161

van Zeijl, C.M., van de Kamp, E.H., Punt, P.J., Selten, G.C., Hauer, B., van Gorcom, R.F. & van den Hondel, C.A.

An improved colony-PCR method for filamentous fungi for amplification of PCR-fragments of several kilobases.

J Biotechnol, TNO Nutrition and Food Research Institute, Department of Molecular Genetics and Gene Technology, Zeist, The Netherlands., 1997, Vol. 59(3), pp. 221-224

Europäisches Arzneibuch 7.Ausgabe: Amtliche deutsche Ausgabe

EU (ed.)

Deutscher Apotheker Verlag, 2011

162

VII ANLAGENVII.1 AbkürzungsverzeichnisAmp. Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäure(n)

AtStr Steroid-Reduktase

AUC Fläche unter der Kurve (area under the curve)

bidest bidestilliert

Carb. Carbenicillin

cDNA komplementäre DNA

DC Dünnschichtchromatographie

DE Gerichtete Evolution („directed evolution“)

DlP5βRnn-13 D. lanata P5βR mit N-terminalem Histag („n“), N-terminal um 13 Aminosäuren gekürzt [Herl et al., 2006]

DlP5βRc[n-x] D. lanata P5βR mit C-terminalem Histag („c“), N-terminal um x Aminosäuren gekürzt

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

DNase Desoxyribonuclease

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat (beinhaltet dATP, dCTP, dGTP und dTTP)

DOZ Desoxyzucker

EK Endkonzentration in der Lösung

EtOH Ethanol

FM Fließmittel

HPLC Hochdruckflüssigchromatographie

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactosid

Kan. Kanamycin

kb Kilobase (= 1000 Basenpaare)

Km Michelis-Menten Konstante

LB Luria Broth Bakterienmedium

mRNA Boten-RNA (messenger RNA)

NAD(P)H Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

neo Resistenzgen gegen Kanamycin

NT / nt Nucleotide

OD(260) Optische Dichte (bei einer Wellenlänge von 260 nm)

OPDA 12-Oxophytodien-Säure

163

http://de.wikipedia.org/wiki/Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

RNA Ribonucleinsäure

RNase Ribonuclease

RT Reverse Transkriptase

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

SDM ortsgerichtete Mutagenese („ “)

Taq-Polymerase Thermus aquaticus DNA-Polymerase

Tm Schmelztemperatur (melting temperature)

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Enzymeinheit (unit)

Upm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

UV Ultraviolett

vmax Geschwindigkeitskonstante bei enzymatischen Reaktionen

VT Volumenteile

P5βR Progesteron 5β-Reduktase

RL Reagenzlösung

X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indoyl-β-galactosid

164

VII.2 Publikationsliste

Bauer P., Munckert J., Bryzidium M., Burda E, Müller-Uri F., Gröger H, Mueller YA, Kreis W., 2010. Highly conserved progesterone 5β-reductase genes (P5βR) from 5β-cardenolide-free and 5β-cardenolide-producing angiosperms. Phytochemistry. 71(13), 225-231.

Munckert J., Bauer P., Burda E., Müller-Uri F., Kreis W., 2011. Progesterone 5β-reductase of Erysimum crepidifolium: cDNA cloning, expression in Escherichia coli, and reduction of enones with the recombinant protein. Phytochemistry 72(14-15):1710-7

Bauer P., Kreis W., 2011. Curcumin in der Krebstherapie . Deutsche Zeitschrift für Onkologie. 41, 144-149

Bauer P., K. Rudolph, F. Müller-Uri, Kreis, W., 2012. Vein Patterning 1-Encoded Progesterone 5β-Reductase: Activity-guided Improvement of Catalytic Efficiency. Phytochemistry 77, 53-59.

Weitere Manuskripte in Bearbeitung bzw. eingereichte Manuskripte

Bauer P., Lanig H., Müller-Uri F., Kreis W.; VEP1-encoded Progesterone 5β-Reductase: Involvement of Two Phenylalanines in a Putative Substrate-Trapping Mechanism“

Rudolph K., Bauer P., Schmid B., Müller-Uri F., Kreis W.; Truncation of N-terminal regions of Digitalis lanata progesterone 5β-reductase alters the catalytic efficiency and the substrate preference.

Budeanu O.A., Loebers A., Bauer P., Müller-Uri F., Kreis W.;Progesterone 5β-Reductase from horseradish (Armoracia rusticana Gaertn., Mey., & Scherb.): Cloning, Sequence Comparison and Molecular Modelling. (Manuskript eingereicht)

VII.3 Tagungsbeiträge und wissenschaftliche PreiseVII.3.1 Wissenschaftliche Kongresse mit Eigenbeitrag- Botanikertagung 2009, „Plants for the future“, 06.-11.09.2009 (Leipzig) (P. Bauer et al., „Altering efficiency and coenzyme specificity of recombinant progesterone 5β- reductase from Digitalis lanata by site-directed mutagenesis (SDM)“)

- Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 2009, „Biotechnologisch erzeugte Wirkstoffe – Konzepte, Erfolge, Erwartungen“, 28.09 - 01.10.2009 (Jena) (P. Bauer et al., „Altering efficiency and coenzyme specificity of recombinant progesterone 5β- reductase from Digitalis lanata by site-directed mutagenesis (SDM)“)

- 58th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (GA), 29.08-02.09.2010 (Berlin) (P. Bauer et al., „Cloning, functional expression, modelling and structural investigations on P5βR- like enone reductases from various pharmaceutically important angiosperms“)

165

(J. Munkert, P. Bauer, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Evolution and function of progesteron 5β-reductase genes in angiosperms“) - Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 2010, „Personalisierte Therapeutika - Traum oder Wirklichkeit“, 04.10-07.10.2010 (Braunschweig) (P. Bauer et al., „Cloning, functional expression, modelling and structural investigations on P5βR- like enone reductases from various pharmaceutically important angiosperms“)

- Terpnet 2011, 10th International Meeting, Biosynthesis and function of Isoprenoids in plants, mircoorganisms and parasites“, 22.05-26.05.2011 (Kalmar, Schweden) (P. Bauer, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Activity-Guided Design of Progesterone-5β-Reductase-Like Short- Chain Dehydrogenases/Reductases“)

- Emil-Fischer-School Research-Day; 28.07.2011 (Erlangen) (P. Bauer et al., „Cloning, functional expression, modelling and structural investigations on P5βR- like enone reductases from various pharmaceutically important angiosperms“)

- Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 2011, „Shaping the future-Trends and perspectives in pharmaceutical science“ (Innsbruck, Österreich) (P. Bauer, K. Rudolph, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Improvement of enzyme activity of recombinant DlP5βR by a ration, bioactivity-guided approach“)

(K. Rudolph, P. Bauer, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Truncation of N-terminal regions of Digitalis lanata progesteron 5β-reductase alters catalytic efficiency and substrate preference“)

VII.3.2 Preise während der Promotionsphase- Preisträger der Lesmüller-Stiftung im Fachbereich Pharmazeutische Biologie auf der DPhG Jahrestagung 2010 (Poster-Preis Pharmazeutische Biologie)

- 1. Platz (Kampf) / 3. Platz (Tul/Form) bei der badenwürttembergischen Taekwondo Meisterschaft 2011 (ITF) bis 73 kg

- Taekwondo-/Kickbox-Academy Fürth (größte Kampfsportschule Mittelfrankens): Schüler des Jahres 2011

166

VII.5 LEBENSLAUF

Persönliche DatenName: Peter Reinhard BauerGeburtsdatum: 17.06.1983 in NürnbergStaatsangehörigkeit: deutschFamilienstand: verlobtTitel / Berufsbezeichnung: Diplom Pharmazeut / Apotheker

Berufsausübung

Seit 02/2012 Mitarbeiter Bionorica AG in Neumarkt (Teamleiter Analytik/Präklinik) 03/2011-12/2011 Freier Mitarbeiter der Steigerwald AG (Arzneimittelschulungen)01/2009-12/2011 Wissenschaftlicher Mitarbeiter bei Prof. Dr. W. Kreis am Lehrstuhl für

Pharmazeutische Biologie der Universität Erlangen

Hochschulausbildung und Praktisches Jahr12/2008 Dritter Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung in Regensburg und

Approbation zum Apotheker05/2008 – 11/2008 Zweite Hälfte des praktischen Jahres in der Obertor – Apotheke in Esslingen

am Neckar13.06.2008 Diplomprüfung an der Universität Tübingen bei Prof. Dr. L. Heide und

Prof. Dr. P. Ruth11/2007 – 04/2008 Pharmaziepraktikant am LS Pharmazeutische Biologie der Universität

Tübingen. Dort Anfertigung einer Diplomarbeit (Antibiotikabiosynthese inStreptomyceten – Untersuchungen zur transkriptionellen Organisation der Chlorobiocin-Biosynthesegenclusters).

11/2007 Zweiter Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung (2.Staatsexamen)09/2005 Erster Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung (1. Staatsexamen)10/2003 – 11/2007 Studium der Pharmazie an der FAU Erlangen – Nürnberg.

Praktika während der Hochschulausbildung08/2006 – 09/2006 Wahlpflichtfach – Praktikum bei der Firma Bionorica AG in Neumarkt

(Herstellung, Analytik und Bewertung von Echinacea purpurea Presssäften und Entwicklung einer Arzneiform)

03/2006 Praktikum in der Kran Apotheke Lüneburg03/2005 – 04/2005 Praktikum in der Praxis Dr. Ehrmeier, Facharzt für Allgemeinmedizin02/2005 – 03/2005 Zweiter Teil der Famulatur in der Apotheke des Klinikums Nürnberg10/2004 Praktikum bei Dr. Aye und Partner; vereidigter Sachverständiger für

pharmazeutische Chemie und Arzneimittelzulassung. 03/2004 Erster Teil der Famulatur in der Kran Apotheke in Lüneburg

Schulausbildung09/1994 – 07/2003 Pirckheimer Gymnasium Nürnberg (LK Chemie und Wirtschaft/Recht) 09/1990 – 08/1994 Martin–Luther-King Grundschule Kornburg, Nürnberg

InteressenKlettern, Klettersteige, Traditionelles Bogenschießen und Bogenbau, Rennradfahren und Mountainbiken, Kampfsport (v.a. ITF Taekwondo / Kickboxen / Wing Tsun / JuJutsu), Literatur, Geschichte und Leben des Mittelalters, Filme, Gitarre spielen

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Befreie dich von deiner eigenen Kraft.

Befreie dich von der Kraft des Gegners.

Nutze die Kraft des Gegners gegen ihn selbst.

Füge zu der gegnerischen Kraft deine eigene Kraft hinzu.

Die vier Kraftprinzipien des Wing Tsun

Wenn der Weg frei ist, stoß vor.

Wenn der Weg nicht frei ist, bleib kleben.

Wenn die Kraft des Gegners größer ist, gib nach.

Wenn der Gegner zurück weicht, folge ihm nach

Die vier Kampfprinzipien des Wing Tsun

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Expression und Mutagenese von VEP1-kodierten Progesteron ... · Expression und Mutagenese von...

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