EXPRESIN EN E. coli DEL DOMINIO AMINO-TERMINAL DEL NEURORRECEPTOR GABAC-1

Leija Izaguirre T. E. (1), Martnez Torres A. (2)(1) Facultad de Qumica

Universidad Autnoma de Quertaro (2) Instituto de Neurobiologa

Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Campus Juriquilla RESUMEN La inhibicin del sistema nervioso central (SNC) durante la transmisin sinptica est mediada principalmente por el cido -aminobutrico (GABA), responsable de la activacin de receptores especficos que reducen la excitacin neuronal. Los receptores GABAc estn formados por tres subunidades distintas: 1, 2 y 3, las cuales se localizan en la membrana plasmtica formando complejos homomricos y heteromricos. El presente trabajo pretende la expresin del dominio amino terminal de la subunidad 1 de H. sapiens en E.coli utilizando un plsmido diseado para este fin (pET28b) el cual porta dicha regin del gen GABA 1 bajo la regulacin del promotor transcripcional del fago T7 (Mora Jurez y col., 2007). Se transformaron bacterias de la cepa ER2566 por medio de choque trmico y se verific la identidad del plsmido por electroforesis en gel y anlisis con enzimas de restriccin. Las bacterias transformadas fueron expuestas a IPTG para la activacin transcripcional del promotor y se colectaron 24h despus para su anlisis por PAGE. Los resultados mostraron que el plsmido es sumamente inestable en la cepa de expresin utilizada, ya que no se encontr en las bacterias inducidas. En contraste, en otras cepas de E. coli que no tienen el gen de la RNA polimerasa T7 (tal como la cepa XL1-blue) el plsmido es estable. En conclusin, la aparente inestabilidad del DNA de pET281 en ER2566 ha impedido su expresin adecuada. Sin embargo, se deber intentar su expresin en otras cepas de E. coli para optimizar su produccin. INTRODUCCIN Los receptores a GABA se han clasificado segn sus propiedades farmacolgicas en GABAA, GABAB y GABAC (Kusama y col., 1993). Los receptores GABAA y GABAC son canales ionotrpicos selectivos a cloro pertenecientes a la familia de receptores nicotnicos; mientras que GABAB pertenece a la familia de receptores acoplados a la protena G, cuya accin es mediada por la apertura/cierre de otros canales. Por otro lado, los GABAA son blanco para muchos frmacos que ayudan a modular la accin directa de GABA sobre el SNC, tales como benzodiacepinas o barbitricos. Los receptores GABAC se expresan en gran cantidad en la retina de los vertebrados adultos en los axones terminales de las neuronas bipolares, sugiriendo un papel importante en los procesos de sealizacin en esta zona (McCall y col., 2002). Adems, se cree que median respuestas lentas y sostenidas de inhibicin y son insensibles a bicuculina, compuesto antagonista competente para los receptores GABAA (Kolb H., 1996). Actualmente, se han clonado tres subunidades distintas de GABAC: 1, 2 y 3 (Johnston G.A., 2002) de retina de mamfero. Algunos estudios farmacolgicos (Kusama y col, 1993) sugieren que la subunidad 1 es responsable de la resistencia de GABAC ante la bicuculina, mientras que estudios moleculares sugieren que sea probablemente la responsable de la expresin adecuada del receptor completo en las neuronas bipolares de la retina (McCall y col., 2002). Poco es lo que se sabe de la estructura tridimensional de protenas de membrana y particularmente de neurorreceptores. Esto se debe a la dificultad que se encuentran para producir a gran escala protenas de membrana. Una estrategia para comenzar a comprender su estructura es la expresin de mdulos funcionales de las protenas. Por ejemplo, la regin

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aminoterminal del receptor GABA 1 contiene el sitio de unin al agonista as como otros sitios importantes de modulacin. Por tanto el objetivo de este trabajo se centr en expresar en E. coli la regin extracelular del receptor, a la cual corresponde el dominio amino-terminal del mismo. EXPERIMENTAL 1. Transformacin bacteriana a partir del plsmido recombinante pET2811Se transformaron por shock trmico (Sambrook y col., 2001) 50L de bacterias E. coli 2566 en estado competente con 0.5L del plsmido pET281, sembrando 200L en una placa de agar-LB con kanamicina [10mg/mL]. Como controles negativos se usaron clulas competentes transformadas con el plsmido pET28b y clulas competentes sin plsmido; ambas sembradas en placas LB con kanamicina. Todas las placas se incubaron por 14 horas a 37C. 2. Induccin de la expresin de 1- NH2 La induccin de la expresin se realiz en medio LB, usando IPTG como promotor siguiendo el protocolo (Sambrook y col., 2001) y con Magic MediaTM (Invitrogen) un medio de expresin que no necesita adicin de promotor ni monitoreo de densidad ptica. Se inocul un tubo con 4mL de medio LB y kanamicina [10mg/mL] a partir de una colonia de las clulas transformadas con NH2-1, repitiendo la operacin para una colonia transformada con pET28b. Los tubos se incubaron por 12 horas a 37C en agitacin constante. Posteriormente se resuspendieron 2mL de cada cultivo en un matraz con 98mL de medio LB y kanamicina [10mg/mL] y se incubaron a 37C en agitacin constante hasta registrar una DO600 entre 0.4-0.5. Una vez alcanzado este rango, se aadi IPTG a una concentracin final de 0.1mM incubando posteriormente por 24 horas a 37C en agitacin constante. Aparte, se tom una colonia de la transformacin de pET281 para inocular un matraz con 100mL de MagicMediaTM, dejando incubar en las condiciones mencionadas. 3. Precipitacin de protenas Una vez terminadas las 24 horas de incubacin se registr la DO600 y se tom un duplicado de muestras de 2mL de cada cultivo, que posteriormente se centrifugaron a 13krpm a 4C por 2min y se congelaron a -20C. Despus de tomar las muestras, el contenido de cada matraz se centrifug a 9500rpm a 4C durante 20min. Las pastillas celulares obtenidas se resuspendieron en 10mL de agua destilada y se almacenaron a -80C 4. Extraccin de DNA plasmdico por lisis alcalina y electroforesis en gel de agarosa. Las pastillas celulares obtenidas de los 2mL tomados como muestras se colocaron en hielo y se sigui el protocolo para Miniprep por lisis alcalina (Sambrook y col.,2001), resuspendiendo la pastilla obtenida en 20L de agua miliQ estril. Una vez obtenidas las muestras, se corrieron 2L de cada una en un gel de agarosa al 0.8% durante 40min a 100V y 85mAmp usando como marcador de peso molecular DNA/pst. 5. Anlisis de protenas con SDS-PAGE Se sigui el protocolo (Sambrook y col., 2001) para la elaboracin de un gel Tris-Glicina de SDS- poliacrilamida al 15% para tincin con azul de Coomassie e identificacin de protenas. Una vez elaborado el gel, se cargaron 25L de cada muestra procesadas como se indica a continuacin: El segundo lote de pastillas celulares obtenidas de los 2mL tomados como muestras de los cultivos fueron resuspendidas respectivamente en buffer de carga (Tris-HCl pH=6.8 60mM, Glicerol 25%, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 14.4mM, azul de bromofenol 0.1%, agua) de acuerdo a la DO600 registrada por cada cultivo al trmino de las 24horas de incubacin. Una vez resuspendidas, se colocaron en bao mara a punto de ebullicin durante

1 Nota: pET281 es el plsmido construido en pET28b que porta el dominio amino-terminal del gen GABA1 bajo la regulacin del promotor transcripcional del fago T7 (Mora Jurez y col., 2007).

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5min para finalmente cargarse en el gel. Como marcador de peso molecular se emple Protein Ladder (Invitrogen). El gel se corri durante dos horas a 100V y 40mAmp. Una vez terminada la electroforesis, se ti con Azul de Coomassie por una hora y despus se desti con la solucin correspondiente (metanol, agua, cido actico) para observarlo en el transiluminador. 6. Caracterizacin del plsmido recombinante 1- NH2 en la cepa XL1-blue Debido a que en la primera induccin no se encontr la presencia de plsmido despus de la induccin (Resultados, Fig.1) se realiz una transformacin (siguiendo el protocolo mencionado en el paso 1) de la cepa de E.coli XL1-blue, para observar la estabilidad del plsmido pET281 en una cepa sin el gen de la RNA polimerasa T7. Posterior a la transformacin se levant una colonia para inocular un tubo de 4mL que se dej incubar por 12hrs. Despus se realiz una extraccin de DNA plasmdico con miniprep por lisis alcalina (Sambrook y col.,2001) y se corri un gel de agarosa al 0.8%. Finalmente, para la identificacin total del plsmido (caracterizacin) se realiz una digestin (Sambrook y col.,2001), usando como enzimas de restriccin NCoI y XhoI, obtenidas a partir del mapa de restriccin (Fig. 1) La digestin se incub 1hr a 37C y se corri en gel de agarosa al 1.2% usando como marcador de peso molecular DNA/pst. RESULTADOS

Despus de 24hrs de induccin, se verific la presencia del plsmido (Fig.2) en el cultivo, sin embargo no se obtuvo un resultado favorable ya que no apareci indicio alguno de DNA plasmdico despus del miniprep.

Por tanto, se realiz una transformacin en la cepa XL1-Blue, para observar la estabilidad del plsmido en una cepa distinta. Despus de realizar el miniprep, se puede observar que en la Fig.3, aparecen las bandas que sealan la presencia del plsmido despus de la transformacin, indicando la estabilidad del plsmido en esta la cepa.

Para asegurar la identidad del plsmido y descartar problemas del mismo en futuras transformaciones, se realiz una digestin usando enzimas de restriccin. La Fig. 4 muestra los fragmentos esperados para pET281 despus de ser tratados.

6 ApoI (2)78 CfrI (2)78 MscI (1)

105 HpaII (2)138 Cac8I (2)

163 TatI (2)

164 RsaI (2)167 MslI (2)

245 XmnI (1)248 AlwNI (2)249 AluI (2)

287 BsiYI (2)291 MwoI (2)

359 HincII (1)388 Bsu36I (1)

456 BceAI (1)457 BsiEI (1)457 CfrI (2)457 EagI (1)459 Cac8I (2)459 Cfr10I (1)459 NaeI (1)459 NgoMIV (1)460 HpaII (2)474 BglII (1)474 XhoII (2)475 DpnI (2)480 PpuMI (1)480 SanDI (1)489 AflIII (1)489 BspLU11I (1)489 NspI (1)500 ApaLI (1)500 BseSI (1)

553 MwoI (2)559 BstXI (1)

580 BfmI (1)596 HpyCH4III (1)597 AlwNI (2)

636 StyI (1)645 MslI (2)645 OliI (1)

671 AluI (2)702 TatI (2)703 RsaI (2)

728 MseI (1)

)

742 TspGWI (1)744 XhoII (2)745 DpnI (2)

763 BsiYI (2)763 EcoNI (1)773 ApoI (2)773 EcoRI (1

AMINO TER Rho-1.ape from 1 to 779

Fig. 1: Mapa de restriccin del plsmido 1- NH2 que indica elsitio donde cortan las distintas enzimas. Las seleccionadas para ladigestin fueron la NCoI y XhoI.

Fig. 2: Gel de agarosa al 0.8% quemuestra el DNA plasmdico obtenidodespus de 24hrs de induccin deE.coli 2566 transformadas.

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Una vez que se obtuvieron los resultados anteriores, se realiz nuevamente la transformacin de la cepa ER2566 y se verific la presencia del plsmido despus de 24hrs de induccin. (Fig. 4) Una vez que se observaron las bandas esperadas, se analiz la presencia de la protena de inters con electroforesis en gel de poliacrilamida (Fig. 5) en condiciones desnaturalizantes (SDS), en la cual se observan las bandas esperadas (~35KD) para am

Fig. 4: Digestin del plsmido pET281.Gel de agarosa al 1.2%. En otros carrilesaparecen como controles positivos losplsmidos ERW y Cwii.

Fig. 3: Gel de agarosa al 0.8% con muestras deDNA plasmdico obtenido de la transformacin deE.coli XL1-Blue con el plsmido pET281. Elrectngulo muestra la aparicin de las bandasesperadas (~1920pb), sealando la presencia delplsmido despus de la transformacin.

bos medios.

ONCLUSIONES var en los resultados, el plsmido es altamente inestable en la cepa de

EFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CONCLUSIONES

Fig. 5: Gel de agarosa al 0.8% con muestras de Fig. 6: SDS-PAGE al 15% que muestra la banda DNA plasmdico obtenido despus de 24hrs deinduccin. El recuadro marca las bandasesperadas de aprox. 1920pb para el plsmidopET281.

que indica la presencia de la protena esperada de aproximadamente de 35KD.

CComo se pudo obserexpresin utilizada inicialmente pues no se encontr su presencia en las bacterias inducidas en un principio. En cambio, en cepas de E. coli que no tienen el gen de la RNA polimerasa T7 (XL1-blue) se observa estabilidad del plsmido. En conclusin, la aparente inestabilidad del DNA del plsmido pET281 en ER2566 ha impedido su expresin adecuada, siendo necesario intentar su expresin en cepas de E. coli distintas a la ER2566 para optimizar su produccin y mantener estabilidad. R

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Artculos: Hanley J., Koulen P., Bedford F., Gordon-Weeks P., y Moss J.S. The proteinMAP-1B links GABAC receptors to the cytoskeletonat retinal synapses Nature 397 66-69, 1999. Johnston GA. Medicinal chemistry and molecular pharmacology of GABA(C) receptors Curr Top Med Chem. (8):903-1003, 2002 Kusama T., Spivak C.E., Whitingn T.P., Dawson V.L. y Schaeffer J.C. Pharmacology of GABA l and GABA / receptors expressed in Xenopus oocytes and COS cells Br. J. Pharmacol. 109, 200-206, 1993 McCall M., Lukasiewicz P.D., Gregg R. G., Peachey N.S., Elimination of the 1 Subunit Abolishes GABAC receptor expression and alters visual processing in the mouse retina The Journal of Neuroscience, 22(10):41634174, 2002. Libros:

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