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EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV
LAURE DENIS
Laboratoire d’Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS
DES/DESC Immunologie 15 Mars 2012
Les tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs) dans l’aide au diagnostic de tuberculose
Le test ELISPOT dans l’hypersensibilité retardée aux médicaments
LE TEST QUANTIFERON et T-SPOT-TB DANS L’AIDE AU DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE LATENTE
EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV
INTRODUCTION - RAPPELS
- Dans 90-95% des tuberculoses infection récentes, la prolifération de M. tuberculosisest contrôlée par les défenses immunitaires : tuberculose infection latente
- Dans 5 à 10% des cas, la TIL évolue en tuberculose active ou tuberculose maladie(pulmonaire dans ¾ des cas) dont 50% dans les 2 ans suivant l’infection.
Individus contagieux
BK Contamination
aérienne
Individu(s) contact(s)
Primo-infection
Tuberculose maladie
Forme pulmonaire
Forme extra pulmonaire
Tuberculose latente
Guérison apparente Réactivation
Immunodépression Sujets âgés
Jeune âge (<4 ans) Quantité importante de BK Immunodépression
Première cause de mortalité infectieuse dans le monde (1 à 2 millions de décès / an)
Incidence : 9 millions
Prévalence de la Tuberculose maladie > 14 M (1/3 de la population infectée susceptible de développer la maladie)
La France pays de faible endémie (Ile de France et Guyane +++)
REPONSE IMMUNITAIRE (2)LES CELLULES
- Immunité non spécifique : phagocytose des bacilles
formation d’un foyer infectieux local
- Immunité spécifique : présentation antigénique aux LyT dans les ganglions lymphatiques régionaux
réponse cellulaire Th1
Les monocytes - macrophages
Les lymphocytes
- Activation des Ly T CD4+ avec sécrétion d’IFN-γ et TNF-α
- Activation des Ly T CD8+ cytotoxiques (perforine, granzyme), sécrétion d’IFN-γ
- Ly γδ TCR+ limitent la multiplication précoces des bacilles (CK, cytotoxicité), jonction immunité naturelle et immunité spécifique
- Ly TCD1 restreints reconnaissent les Ag de nature lipidique (CK, cytotoxicité)
- Ly T mémoires centraux : mémoire immunitaire durable
REPONSE IMMUNITAIRE (3)LES CYTOKINES
sécrété par les LyT spécifiques – activation des macrophages
synthétisée par les macrophages activés. Orientation de la réponse T vers un profil Th1 (IFN-γ)
synthétisé par les macrophages, LyT, cellules dendritiques. Réaction inflammatoire responsable de la formation du granulome, activation des macrophages
TNF-α
IFN-γ
IL-12
LES OUTILS DE DIAGNOSTIC INDIRECT
-Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine
-Tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs Interferon-gamma-release Assays)
Measurement of induration and erythema
Measurement of IFN-γ production
INTRADERMOREACTION A LA TUBERCULINE (IDR)
Test cutané qui explore in vivo l’HSR par l’injection de composants antigéniques mycobactériens.
Source antigénique : > 200 protéines de M.tuberculosis
Lecture à 72h par mesure du diamètre d’induration en mm
Seuil de positivité
Virage tuberculinique
LES LIMITES DE L’IDR
• l'IDR présente des problèmes de performance et de logistique :– Subjectivité– Sensibilité moyenne– Effet “Booster”– Nécessité de 2 visites
• La faible spécificité :– Réaction croisée avec le BCG– Mycobactéries non tuberculeuses
(NTM)
TESTS DE SECRETION DE L’IFN-γ (IGRAs)
Détection in vitro de la production d’IFN-γ par les lymphocytes T spécifiques de M.tuberculosis après stimulation avec des protéines mycobactériennes
- Test ELISA QuantiFERON-TB Gold in tube (dernière version)
- Test ELISPOT T-SPOT-TB
• La production d’IFN- γ témoigne de la réponse cellulaire. • Les lymphocytes T produisent de l’IFN-γ lorsqu’ils sont stimulés par des antigènes• Sécrété, mesurable et stable• Dans la plupart des cas, absent de la circulation • Littérature démontrant le rôle important de l’IFN-γ dans l’infection tuberculeuse
Mesure de l’IFN-γ
Antigènes specifiques de M. tuberculosis
Codage par les gènes de la région RD-1
Antigènes communs
avec le BCG
Evolution du substrat antigénique grâce au séquençage complet de M.tuberculosis
SELECTION D’ANTIGENES SPECIFIQUES
• Codage par la région RD-1
• Absents du BCG
• Absents dans la plupart des MNT
• Induisent la sécrétion d’ IFN-γ
• Identifiés par immunologie, biologie moléculaire
Antigènes spécifiques : ESAT-6, CFP-10 et TB 7.7
Specificité d’ ESAT-6, CFP-10 et TB-7.7
Complex Tuberculosis
Antigènes
ESAT CFP
M tuberculosisM africanumM bovisSouches BCG
gothenburgmoreauticetokyodanishglaxomontrealpasteur
+ ++ ++ +
- -- -- -- -- -- -- -- -
Mycobactéries non -TB
Antigènes
ESAT CFPM abcessus - -M avium - -M branderi - -M celatum - -M chelonae - -M fortuitum - -M gordonii - -M intracellulare - -M kansasii + +M malmoense - -M marinum + +M oenavense - -M scrofulaceum - -M smegmatis - -M szulgai + +M terrae - -M vaccae - -M xenopi - -
TB-7.7
+++
--------
TB-7.7------------------
DIFFERENCES TESTS IGRAs / IDR
Avantages des tests IGRA sur l’IDR
Pas de seconde visite
Peu d’effet booster in vivo des réponses immunes
Reproductibilité des tests et réactifs
Résultat objectif
Spécificité +++ (BCG, Mb atypiques)
Contrôle + : mise en évidence des faux négatifs
Différence des cellules T détectées :
- IGRAs : T mémoires effectrices et T effectrices : infections récentes- IDR : T mémoires effectrices et T effectrices + T mémoires centraux
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT
PRINCIPE
Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)
Dosage sur sang total (prélevé sur tubes héparinés)
Incubation des cellules mononucléées du sang périphérique avec les protéines mycobactériennes
Décantation du plasma
Dosage de l’IFN-γ par technique ELISA (UI/mL)
Validation du test avec un témoin négatif et un témoin positif
Stockage des tubes à température ambiante
PHASE PREANALYTIQUE (1)
Le prélèvement
-Prélèvement : 3 x 1 mL
- Agitation douce par retournements (x5)
- Incubation à 37°C 16 à 24h
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT
Centrifugation des tubes : décantation
Réalisation du dosage ELISA immédiatement ou après conservation à 4°C pendant plusieurs jours (IFN-γ
stable)
PHASE PREANALYTIQUE (2)
Conservation
Après 16 à 24 H à 37°C
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT
5. Calcul et impression des résultats
4. Lavage puis addition du substrat.Lecture des DO après
30mn.
3. Plasma +conjugué. Incubation 2Hà température ambiante.
1. 1mL de sang (X3) et incubation à 37ºC pdt 16-24 h.
2. Centrifugation pdt 15 minutes.
IFN-γ stable à 4°pdt au moins 4
semaines.
Etape 1: incubation sur sang total hépariné
Etape 2: Dosage ELISA de l’IFN-γ
ESAT-6CFP-10
QuantiFERON®-TB Gold IT
NilControl
Mitogen Control
RESULTATS ET INTERPRETATION
NulTémoin –Tube gris
TB Ag – NulTube patientTube rouge
Mit – NulTémoin +
Tube violet
Résultat
≤ 8 < 0.35 ≥ 0.5 NEGATIF
≤ 8 ≥ 0.35 ≥ 0.5 POSITIF
≤ 8 ≤ 0.5 ININTERPRETABLEAbs ctrl positif
≥ 8 ININTERPRETABLEActivation spontanée
CELLESTIS
Le test QuantiFERON®-TB Gold IT
Etape 1 Préparation des cellules
• Prélèvement de sang dans un tube Vacutainer CPT™
• centrifugation du tube• Pipetage de la bande correspondante aux
lymphocytes• Lavage et comptage cellulaire (cellule ou
automate d’hématologie)• Ajout des cellules aux plaques 96 pts• Ajout des antigènes dans les puits (ESAT-
6, CFP-10)• Incubation 16 à 24h
LE TEST T-SPOT-TB
PBMC après extraction Ficoll ou tubes BD CPT
Ajout des PBMC et Ags TB. Les Ly T spé sécrètent l’IFN-γ.
Capture de l’IFN-γ par les anticorps. Incubation.
Etape 2Révélation des spots
• Premier lavage des plaques• Addition de réactif de détection 1h• Deuxième lavage des plaques• Addition du substrat : les spots
apparaissent en 7 minutes• Dernier lavage des plaques et
séchage
-+
LE TEST T-SPOT-TB
Lavages et ajout de l’Ac conjugué
Ajout du substrat et comptage des spots
Chaque spot correspond à une cellule sécrétrice d’IFN-γ
Etape 3 Comptage des spots
- Comptage possible “à l’oeil” à l’aide d’une loupe binoculaire ou d’un microscope
- Comptage à l’aide d’un lecteur automatisé Elispot :
• Lecture automatisée des plaques• Calcul du nombre de spots par puits• Stokage des images sur PC• Paramétrage automatique de la caméra et de l’analyse
Validation :
nb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≥ 8 : POSITIFnb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≤ 4 : NEGATIFnb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≥ 5 et ≤ 7 : DOUTEUX
LE TEST T-SPOT-TB
EXEMPLES SUJETS TEMOINS/ SUJETS TUBERCULOSE
Témoin négatif
Témoin positif
Panel A Panel B
LE TEST T-SPOT-TB
INTERPRETATION D’UN TEST POSITIF
- fréquence élevée de Ly T effecteurs/ T effecteurs mémoires spécifiques de M. tuberculosis : rencontre de M. tuberculosisfaux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200 cas / an en France)
- Risque de réactivation M. tuberculosis si immunodépression (infection VIH, tt anti-TNF)
RESULTAT POSITIF =
Les IGRAs ne distinguent pas infection et maladiene sont pas des tests diagnostiques de la tuberculose maladie
Interprétation clinique et biologique
RESULTATS ININTERPRETABLES
• Absence d’activation dans le contrôle positif (PHA Phytohémagglutinine) :
– Indication sur la compétence immunitaire du patient (âge, déficit…) – Validation de la conservation des prélèvements avant incubation et de la
manipulation.
• Activation spontanée dans le contrôle négatif :
– Infection, inflammation…
Interprétation clinique et biologique
EVALUATION CLINIQUE DU QuantiFERON®-TB Gold
• Pas de “Gold Standard” pour l’ITL– Sensibilité calculée sur population de Tuberculose maladie non traitée.
• Confirmée par culture et/ou PCR (Gold Standard)– Spécificité estimée sur population à bas risque (personnes saines non
vaccinées)
• Détection de l’ITL– Corrélation avec facteurs de risque
• Etude autour d’un cas• Dépistage des personnels soignants
Performances
PERFORMANCES DIAGNOSTIQUES
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis
R. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968
Etudes analysées :
676 citations
124 études retenues (exclusions : edito, medico-economique, revues, lettres, case report, données insuffisantes…)
Sensibilité : 40 études
Spécificité : 7 études
R. Indéterminés : 116 études
Performances
RESULTATS SENSIBILITE
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968
Pays en développement
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968
RESULTATS SPECIFICITE
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968
RESULTATS INDETERMINES
Population immunodéprimée
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968
CONCLUSIONS
Meilleure performance diagnostique des tests IGRAs par rapport à l’IDR (supériorité des IGRAs dans les pays développés)
Meilleure sensibilité du T-SPOT-TB par rapport au QFT TB Gold IT
Meilleure spécificité du QFT TB Gold IT par rapport au T-SPOT-TB
Résultats indéterminés T-SPOT-TB > QFT TB Gold IT
IDR avant IGRAs non recommandée
RECOMMANDATIONS (1)
EN FRANCE
Recommandations de dépistage de l’infection tuberculeuse latente et de la tuberculose maladie dans certaines populations considérées à risque d’être
infectées, malades et/ou contagieuses :
Les personnes infectées par le VIH
Les sujets contacts d’un cas index contagieux
Les professionnels de santé et autres professionnels exposés
à l’embauche
en cours d’activité professionnelle selon le niveau de risque
Les populations migrantes originaires de pays d’endémie
Les patients avant mise sous traitement anti-TNF alpha
RECOMMANDATIONS (2)
RECOMMANDATIONS HAS 2006
- Diagnostic de tuberculose-infection latente pour réaliser l’enquête autour d’un cas (sujet > 15 ans)
- Lors de l’embauche, pour les professionnels de santé et ceux qui travaillent dans un service à risque, c’est-à-dire dans les mêmes conditions que celles préconisées par les recommandations sur l’IDR
- Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de la tuberculose maladie
- Avant mise en route d’un traitement par anti-TNFα
RECOMMANDATIONS (3)
RECOMMANDATIONS HCSP (Haut Conseil de la Santé Publique) 2011
Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l’ITL et uniquement dans l’objectif de la traiter (sauf cas particulier)
- Diagnostic de TIL : réduire le réservoir de patients infectés :- Enquête autour d’un cas : prise en charge des sujets contacts
enfants > 5 anssujets âgé > 80 ans
- Patients infectés par le VIH (bilan initial)- Dépistage avant mise sous anti-TNF- Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) :
embauche (si IDR > 5 mm)cas contact
- Migrants entre 5 et 15 ans
- Diagnostic de tuberculose maladie :- Chez l’enfant
QFT-TB Gold IT chez les patients sous traitement immunosuppresseur
Matulis et al. American College of Rheumatology, San Diego, CA. November 2005
Comparison of in vitro-specific blood tests with tuberculin skin test for diagnosis of latent tuberculosis before anti-TNF therapy
Sellam J. et al. Ann. Rheum Dis. 2007;66(12):1610-5
Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases: performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen-specific interferon gamma assay
Matulis G. et al. Ann Rheum Dis. 2008;67(1):84-90
• Les anti TNF-α réduisent la réactivité avec le tube mitogène. Les autres traitements immunosuppresseurs n’ont pas ou peu d’effets (corticoides…)
• La performance du test QFT-TB Gold IT est meilleure que celle de l’IDR pour la détection des LTBI chez les patients sous immunosuppresseur
• Bonne performance des IGRAs dans le diagnostic de LTBI dans les IMID (Immune mediated inflammatory diseases)
• Le QFT-GIT peut être recommandé pour la détection de l’ITL avant traitement anti-TNF-α.
LES TESTS IGRA DANS LE DEPISTAGE DE LA TB LATENTE AVANT MISE SOUS ANTI-TNFETUDE ETAT
Objectif :
Evaluer l’impact thérapeutique (% de patients pour lesquels la décision thérapeutique antiTB a été modifiée par les résultats des tests in vitro par rapport aux recommandations de l’AFSSAPS) du dépistage de la TBIL par QFT ou T-SPOT-TB avant traitement par anti-TNF-α
20 centres, 400 patients, durée 24 mois / PR, spondylarthrite, maladie de Crohn
Résultats
31,8% PR, 45% SPA, 23,2% Crohn (60% immunosuppresseurs, 36,4% corticoides)
34,9% patients IDR > 5 mm / 16,7% patients IGRA positif
30,8% discordance IDR/IGRA (IDR+/IGRA- : 80% et IDR-/IGRA+ : 20%)
Bonne concordance pour les deux tests IGRA
Meilleure sensibilité du QFT/T-SPOT-TB
Résultats indéterminés : 7,3% T-SPOT-TB et 2,8% QFT (pas d’influence de la prise de corticoides ou d’immunosuppresseurs)
Conclusion
Les tests IGRA permettent de diminuer de 50% le nombre de patients « TBLI »Attention : cas de TB avec IGRA négatif
QFT-TB Gold IT chez les patients HIV positifs
• 599 HIV positifs
• 28 (4.8%) sont QFT-Gold positifs indiquant une ITL
• 87% ont au moins un facteur de risque de TB
• 22 (3.57%) ont un résultat indéterminé
• Forte corrélation entre le taux de CD4 et le taux de IFN-γ dans le tube mitogéne (P<0.01)
• 2 QFT-Gold positifs ont développé une tuberculose
Brock et al. Respiratory Research. 2006
Interferon gamma release assay in people infected with immunodeficiency virus
Bua A. Clinical microbiology and infection : The official publication of the european society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2010
Le nombre de TCD4, leur pourcentage et le stade de la maladie affectent les performances des tests IGRAs chez les patients HIV
Performance of a Whole-Blood Interferon-Gamma Release Assay with Mycobacterium RD1-Specific Antigens among HIV-infected Persons.
Fujita A. Clin. Dev. Immunol.2010
Correlation between CD-4 cellcount and response to PHA
0-99
100-1
99
200-3
00
>300
0.01
0.1
1
10
100
CD 4 cell count (cells/microliter)
Log
10 R
espo
nse
tom
itoge
n (I
U/m
l)
CONCLUSIONS (1)
INTERETS DES IGRAs
Tests diagnostiques de l’infection tuberculeuse latente (LTBI)
Excellente valeur prédictive négative dans les TB latentes (pas besoin de suivi)
Excellente spécificité / élimination des faux positifs liés au BCG préalable
Intérêt dans les formes extra pulmonaires
Chez les immunodéprimés, même si la sensibilité est modérée chez ce groupe de patients (ne peut exclure une TB ou LTBI)
CONCLUSIONS (2)
LIMITES DES IGRA
Les IGRAs :
ne sont pas des tests diagnostiques de la TB
Ne permettent pas de distinguer TB active et TB latente
Ne permettent qu’exceptionnellement d’exclure une TB active (recherches bactériologiques)
Ne sont pas validés chez le jeune enfant (< 5 ans)
Ont une sensibilité diminuée chez la personne âgée
Données insuffisantes pour suivre l’efficacité d’un traitement pour TB active ou latente
Ont une sensibilité diminuée chez les immunodéprimés
EVOLUTION DES PRESCRIPTIONS DU TEST QUANTIFERON TB GOLD IT DEPUIS 2008
1610
2265
3245
5344
134 189 270 445
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
2008 2009 2010 2011
Nom
bre
de te
sts
réal
isés
Total
Moyenne/mois
REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR HOPITAL
EN 2010
AUTRES1%
A. CHARIAL0%
HFME1%
PIERRE GARRAUD0%
(PNEUMO-CARDIOLOGIQUE
3%
NEUROLOGIQUE1%
HENRI GABRIELLE1%
CHARPENNES0%
LYON SUD37% HOTEL DIEU
16%
CROIX ROUSSE14%
EDOUARD HERRIOT
24%
LE VINATIER2%
REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR SERVICE AUX HCL
EN 2010
Néphrologie1%
Cardiologie1%
Gyneco Obstétrique1%
Neurologie1%
Pédiatrie1% Hématologie
1%
Autres4%
Ophtalmologie4%
Pneumologie4%
Maladies Infectieuses
11%
Rhumatologie14%
Allergologie2%
Hépato-Gastro-Entérologie
3%
Dermatologie5%
Médecine travail21%
Médecine Interne15%
Médecine statutaire
12%
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (1)
16,6
75,5
4,35,6
9,84
93,61
4,142,42
7,7
88,13
4,15
0%
20%
40%
60%
80%
100%
2749 579 337
Total Médecine travail Médecine statutaire
POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (2)
11,9
90,4
2,914,76
17,73
73,76
5,672,84
16,9
66,3
7,89
13,3
81,7
5
0%
20%
40%
60%
80%
100%
378 141 89 60
Rhumatologie Dermatologie Hépato-Gastro-Entérologie
Allergologie
POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (3)
14,99
67,57
5,89
11,55
33,9
53,1
3,79,2
32,17
49,56
9,56
8,7
14,42
82,7
2,88
0%
20%
40%
60%
80%
100%
407 292 115 104
MédecineInterne
MaladiesInfectieuses
Pneumologie Ophtalmologie
POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (4)
36,7
40
6,7
16,6
25
64,3
10,7
24
60
16
27,3
72,7
30
50
10
10
18,75
75
6,25
28,3
61,3
2,87,6
0%
20%
40%
60%
80%
100%
30 28 25 22 20 16 106
Néphrologie Cardiologie GynecoObstétrique
Neurologie Pédiatrie Hématologie Autres
POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE
LE TEST ELISPOT DANS L’EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS
EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV
Introduction (1)
HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS
Diagnostic : démonstration de la présence de lymphocytes T spécifiques dans la peau et le sang
• Tests in vivo cutanés : patch test et IDR à lecture retardée
• Tests biologiques in vitro :détection des LyT spécifiques du médicament
Introduction (2)
TESTS BIOLOGIQUES UTILISEES DANS L’HSR AUX MEDICAMENTS
- Test de transformation lymphocytaire (TTL) : test de référenceSuivi de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine tritiée
- Test d’activation lymphocytaire en cytométrie
- Test ELISPOT (Enzyme-Linked-ImmunoSPOT assay)Dosage de la sécrétion de cytokines après activation des LyT spécifiques de ces médicaments
Tests Biologiques in vitro (1)
TEST DE TRANSFORMATION LYMPHOCYTAIRE
Index de stimulation (SI) = cpm avec l’antigène / cpm sans l’antigène
Avantages : Mesure de la prolifération cellulaire
Bonne spécificité 95%
Inconvénients : sensibilité 60-70% (β-lactames)
radioactivité
5 jours de culture
PBMCMilieu de cultureMédicaments à tester
PBMC
Culture Témoin positif
Témoin négatif
Sang héparinéFicoll
Ajout Thymidine tritiée5 j
Mesure de l’incorporation de thymidine
12 h
The Lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity.Pichler WJ et al, Allergy, 2004
Long-Lasting reactivity and high frequency of drug-specific T cells after severe systemic drug hypersensitivity reactions.Beeler A et al, J Allergy Clinical Immunol, 2006
Tests Biologiques in vitro (2)
TEST D’ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE EN CYTOMETRIE
Utilisation de marqueurs d’identification et/ou d’activation
Mise en évidence des marqueurs de cytotoxicité
CD69 up regulation on T cells as an in vitro marker for delayed-type drug hypersensitivityBeeler A et al, Allergy 2008
In vitro detection of cytotoxic T and NK cells in peripheral blood of patients with various drug-induced skin diseasesZawodniak A et al, Allergy, 2010
Tests Biologiques in vitro (3)
TEST ELISPOT - PRINCIPE -
Technique permettant la numération, même pour de très faibles fréquences, de cellules spécifiques, d’un haptène ou d’un peptide.
Ac capture spécifique de l’IFN-γ
Ajout des cellules (500000/pts) en présence ou absence d’un stimulus spécifique et incubation 15-20h
Activation des cellules et sécrétion d’IFN-γqui se lie aux Ac de capture
Elimination des cellules et ajout d’un Ac de détection biotinylé qui se lie à l’IFN-γ capturé
Ajout du conjugué streptavidin-enzyme
Ajout du substrat : précipité coloré insoluble
Formation d’un spot = cellule productrice d’IFN-γ
Détermination du nombre de spots/puits (106)
- contrôle négatif,
- positif (PHA et FRIS)
- antigène (3 dilutions du médicaments)
Tests Biologiques in vitro (3)
TEST ELISPOT - CONCLUSION -
Avantages :
Méthode rapide
Bonne sensibilité 91 %
Bonne spécificité 95 %
Quantification du nombre de cellules productrices d’une cytokine
Aide au diagnostic d’HSR
Discrimination des patients allergiques aux médicaments des patients non allergiques
Validation réalisée sur l’amoxicilline . Technique élargie aux autres médicaments.
Résultats en cours d’évaluation.
A. Rozieres et al. Allergy 2009:64:534-542
EXPLORATION DE L’HSR
- CONCLUSION -
Tests biologiques : mise en évidence de lymphocytes T spécifiques
Difficultés :
- Patients rares
- faible fréquence de lymphocytes spécifiques
- Tableaux cliniques variés
- Acheminements des prélèvements délicats
- Absence de gold standard pour définir la sensibilité et spécificité des tests
Interrogations (ELISPOT) :
- Délai entre réactions et tests
- durée de stimulation des cellules
- Présentation du médicament aux lymphocytes
- Molécules variées, formes pharmaceutiques, concentrations
- Reproductibilité