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EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV LAURE DENIS Laboratoire d’Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS DES/DESC Immunologie 15 Mars 2012 Les tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs) dans l’aide au diagnostic de tuberculose Le test ELISPOT dans l’hypersensibilité retardée aux médicaments

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EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV

LAURE DENIS

Laboratoire d’Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS

DES/DESC Immunologie 15 Mars 2012

Les tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs) dans l’aide au diagnostic de tuberculose

Le test ELISPOT dans l’hypersensibilité retardée aux médicaments

LE TEST QUANTIFERON et T-SPOT-TB DANS L’AIDE AU DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE LATENTE

EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV

INTRODUCTION - RAPPELS

- Dans 90-95% des tuberculoses infection récentes, la prolifération de M. tuberculosisest contrôlée par les défenses immunitaires : tuberculose infection latente

- Dans 5 à 10% des cas, la TIL évolue en tuberculose active ou tuberculose maladie(pulmonaire dans ¾ des cas) dont 50% dans les 2 ans suivant l’infection.

Individus contagieux

BK Contamination

aérienne

Individu(s) contact(s)

Primo-infection

Tuberculose maladie

Forme pulmonaire

Forme extra pulmonaire

Tuberculose latente

Guérison apparente Réactivation

Immunodépression Sujets âgés

Jeune âge (<4 ans) Quantité importante de BK Immunodépression

Première cause de mortalité infectieuse dans le monde (1 à 2 millions de décès / an)

Incidence : 9 millions

Prévalence de la Tuberculose maladie > 14 M (1/3 de la population infectée susceptible de développer la maladie)

La France pays de faible endémie (Ile de France et Guyane +++)

REPONSE IMMUNITAIRE (1)

REPONSE IMMUNITAIRE (2)LES CELLULES

- Immunité non spécifique : phagocytose des bacilles

formation d’un foyer infectieux local

- Immunité spécifique : présentation antigénique aux LyT dans les ganglions lymphatiques régionaux

réponse cellulaire Th1

Les monocytes - macrophages

Les lymphocytes

- Activation des Ly T CD4+ avec sécrétion d’IFN-γ et TNF-α

- Activation des Ly T CD8+ cytotoxiques (perforine, granzyme), sécrétion d’IFN-γ

- Ly γδ TCR+ limitent la multiplication précoces des bacilles (CK, cytotoxicité), jonction immunité naturelle et immunité spécifique

- Ly TCD1 restreints reconnaissent les Ag de nature lipidique (CK, cytotoxicité)

- Ly T mémoires centraux : mémoire immunitaire durable

REPONSE IMMUNITAIRE (3)LES CYTOKINES

sécrété par les LyT spécifiques – activation des macrophages

synthétisée par les macrophages activés. Orientation de la réponse T vers un profil Th1 (IFN-γ)

synthétisé par les macrophages, LyT, cellules dendritiques. Réaction inflammatoire responsable de la formation du granulome, activation des macrophages

TNF-α

IFN-γ

IL-12

LES OUTILS DE DIAGNOSTIC INDIRECT

-Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine

-Tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs Interferon-gamma-release Assays)

Measurement of induration and erythema

Measurement of IFN-γ production

INTRADERMOREACTION A LA TUBERCULINE (IDR)

Test cutané qui explore in vivo l’HSR par l’injection de composants antigéniques mycobactériens.

Source antigénique : > 200 protéines de M.tuberculosis

Lecture à 72h par mesure du diamètre d’induration en mm

Seuil de positivité

Virage tuberculinique

LES LIMITES DE L’IDR

• l'IDR présente des problèmes de performance et de logistique :– Subjectivité– Sensibilité moyenne– Effet “Booster”– Nécessité de 2 visites

• La faible spécificité :– Réaction croisée avec le BCG– Mycobactéries non tuberculeuses

(NTM)

TESTS DE SECRETION DE L’IFN-γ (IGRAs)

Détection in vitro de la production d’IFN-γ par les lymphocytes T spécifiques de M.tuberculosis après stimulation avec des protéines mycobactériennes

- Test ELISA QuantiFERON-TB Gold in tube (dernière version)

- Test ELISPOT T-SPOT-TB

• La production d’IFN- γ témoigne de la réponse cellulaire. • Les lymphocytes T produisent de l’IFN-γ lorsqu’ils sont stimulés par des antigènes• Sécrété, mesurable et stable• Dans la plupart des cas, absent de la circulation • Littérature démontrant le rôle important de l’IFN-γ dans l’infection tuberculeuse

Mesure de l’IFN-γ

Antigènes specifiques de M. tuberculosis

Codage par les gènes de la région RD-1

Antigènes communs

avec le BCG

Evolution du substrat antigénique grâce au séquençage complet de M.tuberculosis

SELECTION D’ANTIGENES SPECIFIQUES

• Codage par la région RD-1

• Absents du BCG

• Absents dans la plupart des MNT

• Induisent la sécrétion d’ IFN-γ

• Identifiés par immunologie, biologie moléculaire

Antigènes spécifiques : ESAT-6, CFP-10 et TB 7.7

Specificité d’ ESAT-6, CFP-10 et TB-7.7

Complex Tuberculosis

Antigènes

ESAT CFP

M tuberculosisM africanumM bovisSouches BCG

gothenburgmoreauticetokyodanishglaxomontrealpasteur

+ ++ ++ +

- -- -- -- -- -- -- -- -

Mycobactéries non -TB

Antigènes

ESAT CFPM abcessus - -M avium - -M branderi - -M celatum - -M chelonae - -M fortuitum - -M gordonii - -M intracellulare - -M kansasii + +M malmoense - -M marinum + +M oenavense - -M scrofulaceum - -M smegmatis - -M szulgai + +M terrae - -M vaccae - -M xenopi - -

TB-7.7

+++

--------

TB-7.7------------------

DIFFERENCES TESTS IGRAs / IDR

Avantages des tests IGRA sur l’IDR

Pas de seconde visite

Peu d’effet booster in vivo des réponses immunes

Reproductibilité des tests et réactifs

Résultat objectif

Spécificité +++ (BCG, Mb atypiques)

Contrôle + : mise en évidence des faux négatifs

Différence des cellules T détectées :

- IGRAs : T mémoires effectrices et T effectrices : infections récentes- IDR : T mémoires effectrices et T effectrices + T mémoires centraux

LE TEST QUANTIFERON-TB GOLD IN TUBE

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (1)

Le test QuantiFERON®-TB Gold IT

PRINCIPE

Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)

Dosage sur sang total (prélevé sur tubes héparinés)

Incubation des cellules mononucléées du sang périphérique avec les protéines mycobactériennes

Décantation du plasma

Dosage de l’IFN-γ par technique ELISA (UI/mL)

Validation du test avec un témoin négatif et un témoin positif

Stockage des tubes à température ambiante

PHASE PREANALYTIQUE (1)

Le prélèvement

-Prélèvement : 3 x 1 mL

- Agitation douce par retournements (x5)

- Incubation à 37°C 16 à 24h

Le test QuantiFERON®-TB Gold IT

Centrifugation des tubes : décantation

Réalisation du dosage ELISA immédiatement ou après conservation à 4°C pendant plusieurs jours (IFN-γ

stable)

PHASE PREANALYTIQUE (2)

Conservation

Après 16 à 24 H à 37°C

Le test QuantiFERON®-TB Gold IT

5. Calcul et impression des résultats

4. Lavage puis addition du substrat.Lecture des DO après

30mn.

3. Plasma +conjugué. Incubation 2Hà température ambiante.

1. 1mL de sang (X3) et incubation à 37ºC pdt 16-24 h.

2. Centrifugation pdt 15 minutes.

IFN-γ stable à 4°pdt au moins 4

semaines.

Etape 1: incubation sur sang total hépariné

Etape 2: Dosage ELISA de l’IFN-γ

ESAT-6CFP-10

QuantiFERON®-TB Gold IT

NilControl

Mitogen Control

RESULTATS ET INTERPRETATION

NulTémoin –Tube gris

TB Ag – NulTube patientTube rouge

Mit – NulTémoin +

Tube violet

Résultat

≤ 8 < 0.35 ≥ 0.5 NEGATIF

≤ 8 ≥ 0.35 ≥ 0.5 POSITIF

≤ 8 ≤ 0.5 ININTERPRETABLEAbs ctrl positif

≥ 8 ININTERPRETABLEActivation spontanée

CELLESTIS

Le test QuantiFERON®-TB Gold IT

LE TEST T-SPOT-TB

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (2)

Etape 1 Préparation des cellules

• Prélèvement de sang dans un tube Vacutainer CPT™

• centrifugation du tube• Pipetage de la bande correspondante aux

lymphocytes• Lavage et comptage cellulaire (cellule ou

automate d’hématologie)• Ajout des cellules aux plaques 96 pts• Ajout des antigènes dans les puits (ESAT-

6, CFP-10)• Incubation 16 à 24h

LE TEST T-SPOT-TB

PBMC après extraction Ficoll ou tubes BD CPT

Ajout des PBMC et Ags TB. Les Ly T spé sécrètent l’IFN-γ.

Capture de l’IFN-γ par les anticorps. Incubation.

Etape 2Révélation des spots

• Premier lavage des plaques• Addition de réactif de détection 1h• Deuxième lavage des plaques• Addition du substrat : les spots

apparaissent en 7 minutes• Dernier lavage des plaques et

séchage

-+

LE TEST T-SPOT-TB

Lavages et ajout de l’Ac conjugué

Ajout du substrat et comptage des spots

Chaque spot correspond à une cellule sécrétrice d’IFN-γ

Etape 3 Comptage des spots

- Comptage possible “à l’oeil” à l’aide d’une loupe binoculaire ou d’un microscope

- Comptage à l’aide d’un lecteur automatisé Elispot :

• Lecture automatisée des plaques• Calcul du nombre de spots par puits• Stokage des images sur PC• Paramétrage automatique de la caméra et de l’analyse

Validation :

nb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≥ 8 : POSITIFnb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≤ 4 : NEGATIFnb de spots panel A – Témoin nég et/ou panel B – Témoin nég ≥ 5 et ≤ 7 : DOUTEUX

LE TEST T-SPOT-TB

EXEMPLES SUJETS TEMOINS/ SUJETS TUBERCULOSE

Témoin négatif

Témoin positif

Panel A Panel B

LE TEST T-SPOT-TB

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (3)

INTERPRETATION CLINIQUE ET BIOLOGIQUE

INTERPRETATION D’UN TEST POSITIF

- fréquence élevée de Ly T effecteurs/ T effecteurs mémoires spécifiques de M. tuberculosis : rencontre de M. tuberculosisfaux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200 cas / an en France)

- Risque de réactivation M. tuberculosis si immunodépression (infection VIH, tt anti-TNF)

RESULTAT POSITIF =

Les IGRAs ne distinguent pas infection et maladiene sont pas des tests diagnostiques de la tuberculose maladie

Interprétation clinique et biologique

RESULTATS ININTERPRETABLES

• Absence d’activation dans le contrôle positif (PHA Phytohémagglutinine) :

– Indication sur la compétence immunitaire du patient (âge, déficit…) – Validation de la conservation des prélèvements avant incubation et de la

manipulation.

• Activation spontanée dans le contrôle négatif :

– Infection, inflammation…

Interprétation clinique et biologique

PERFORMANCES

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (4)

EVALUATION CLINIQUE DU QuantiFERON®-TB Gold

• Pas de “Gold Standard” pour l’ITL– Sensibilité calculée sur population de Tuberculose maladie non traitée.

• Confirmée par culture et/ou PCR (Gold Standard)– Spécificité estimée sur population à bas risque (personnes saines non

vaccinées)

• Détection de l’ITL– Corrélation avec facteurs de risque

• Etude autour d’un cas• Dépistage des personnels soignants

Performances

PERFORMANCES DIAGNOSTIQUES

Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis

R. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968

Etudes analysées :

676 citations

124 études retenues (exclusions : edito, medico-economique, revues, lettres, case report, données insuffisantes…)

Sensibilité : 40 études

Spécificité : 7 études

R. Indéterminés : 116 études

Performances

RESULTATS SENSIBILITE

Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968

Pays en développement

Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968

RESULTATS SPECIFICITE

Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968

RESULTATS INDETERMINES

Population immunodéprimée

Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A MetaanalysisR. Diel, R. Loddenkemper and A. NienhausChest 2010;137;952-968

CONCLUSIONS

Meilleure performance diagnostique des tests IGRAs par rapport à l’IDR (supériorité des IGRAs dans les pays développés)

Meilleure sensibilité du T-SPOT-TB par rapport au QFT TB Gold IT

Meilleure spécificité du QFT TB Gold IT par rapport au T-SPOT-TB

Résultats indéterminés T-SPOT-TB > QFT TB Gold IT

IDR avant IGRAs non recommandée

UTILISATIONS

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (5)

RECOMMANDATIONS (1)

EN FRANCE

Recommandations de dépistage de l’infection tuberculeuse latente et de la tuberculose maladie dans certaines populations considérées à risque d’être

infectées, malades et/ou contagieuses :

Les personnes infectées par le VIH

Les sujets contacts d’un cas index contagieux

Les professionnels de santé et autres professionnels exposés

à l’embauche

en cours d’activité professionnelle selon le niveau de risque

Les populations migrantes originaires de pays d’endémie

Les patients avant mise sous traitement anti-TNF alpha

RECOMMANDATIONS (2)

RECOMMANDATIONS HAS 2006

- Diagnostic de tuberculose-infection latente pour réaliser l’enquête autour d’un cas (sujet > 15 ans)

- Lors de l’embauche, pour les professionnels de santé et ceux qui travaillent dans un service à risque, c’est-à-dire dans les mêmes conditions que celles préconisées par les recommandations sur l’IDR

- Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de la tuberculose maladie

- Avant mise en route d’un traitement par anti-TNFα

RECOMMANDATIONS (3)

RECOMMANDATIONS HCSP (Haut Conseil de la Santé Publique) 2011

Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l’ITL et uniquement dans l’objectif de la traiter (sauf cas particulier)

- Diagnostic de TIL : réduire le réservoir de patients infectés :- Enquête autour d’un cas : prise en charge des sujets contacts

enfants > 5 anssujets âgé > 80 ans

- Patients infectés par le VIH (bilan initial)- Dépistage avant mise sous anti-TNF- Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) :

embauche (si IDR > 5 mm)cas contact

- Migrants entre 5 et 15 ans

- Diagnostic de tuberculose maladie :- Chez l’enfant

BIBLIOGRAPHIE

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (6)

QFT-TB Gold IT chez les patients sous traitement immunosuppresseur

Matulis et al. American College of Rheumatology, San Diego, CA. November 2005

Comparison of in vitro-specific blood tests with tuberculin skin test for diagnosis of latent tuberculosis before anti-TNF therapy

Sellam J. et al. Ann. Rheum Dis. 2007;66(12):1610-5

Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases: performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen-specific interferon gamma assay

Matulis G. et al. Ann Rheum Dis. 2008;67(1):84-90

• Les anti TNF-α réduisent la réactivité avec le tube mitogène. Les autres traitements immunosuppresseurs n’ont pas ou peu d’effets (corticoides…)

• La performance du test QFT-TB Gold IT est meilleure que celle de l’IDR pour la détection des LTBI chez les patients sous immunosuppresseur

• Bonne performance des IGRAs dans le diagnostic de LTBI dans les IMID (Immune mediated inflammatory diseases)

• Le QFT-GIT peut être recommandé pour la détection de l’ITL avant traitement anti-TNF-α.

LES TESTS IGRA DANS LE DEPISTAGE DE LA TB LATENTE AVANT MISE SOUS ANTI-TNFETUDE ETAT

Objectif :

Evaluer l’impact thérapeutique (% de patients pour lesquels la décision thérapeutique antiTB a été modifiée par les résultats des tests in vitro par rapport aux recommandations de l’AFSSAPS) du dépistage de la TBIL par QFT ou T-SPOT-TB avant traitement par anti-TNF-α

20 centres, 400 patients, durée 24 mois / PR, spondylarthrite, maladie de Crohn

Résultats

31,8% PR, 45% SPA, 23,2% Crohn (60% immunosuppresseurs, 36,4% corticoides)

34,9% patients IDR > 5 mm / 16,7% patients IGRA positif

30,8% discordance IDR/IGRA (IDR+/IGRA- : 80% et IDR-/IGRA+ : 20%)

Bonne concordance pour les deux tests IGRA

Meilleure sensibilité du QFT/T-SPOT-TB

Résultats indéterminés : 7,3% T-SPOT-TB et 2,8% QFT (pas d’influence de la prise de corticoides ou d’immunosuppresseurs)

Conclusion

Les tests IGRA permettent de diminuer de 50% le nombre de patients « TBLI »Attention : cas de TB avec IGRA négatif

QFT-TB Gold IT chez les patients HIV positifs

• 599 HIV positifs

• 28 (4.8%) sont QFT-Gold positifs indiquant une ITL

• 87% ont au moins un facteur de risque de TB

• 22 (3.57%) ont un résultat indéterminé

• Forte corrélation entre le taux de CD4 et le taux de IFN-γ dans le tube mitogéne (P<0.01)

• 2 QFT-Gold positifs ont développé une tuberculose

Brock et al. Respiratory Research. 2006

Interferon gamma release assay in people infected with immunodeficiency virus

Bua A. Clinical microbiology and infection : The official publication of the european society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2010

Le nombre de TCD4, leur pourcentage et le stade de la maladie affectent les performances des tests IGRAs chez les patients HIV

Performance of a Whole-Blood Interferon-Gamma Release Assay with Mycobacterium RD1-Specific Antigens among HIV-infected Persons.

Fujita A. Clin. Dev. Immunol.2010

Correlation between CD-4 cellcount and response to PHA

0-99

100-1

99

200-3

00

>300

0.01

0.1

1

10

100

CD 4 cell count (cells/microliter)

Log

10 R

espo

nse

tom

itoge

n (I

U/m

l)

CONCLUSIONS

LES TESTS DE SECRETION D’IFN-γ (7)

CONCLUSIONS (1)

INTERETS DES IGRAs

Tests diagnostiques de l’infection tuberculeuse latente (LTBI)

Excellente valeur prédictive négative dans les TB latentes (pas besoin de suivi)

Excellente spécificité / élimination des faux positifs liés au BCG préalable

Intérêt dans les formes extra pulmonaires

Chez les immunodéprimés, même si la sensibilité est modérée chez ce groupe de patients (ne peut exclure une TB ou LTBI)

CONCLUSIONS (2)

LIMITES DES IGRA

Les IGRAs :

ne sont pas des tests diagnostiques de la TB

Ne permettent pas de distinguer TB active et TB latente

Ne permettent qu’exceptionnellement d’exclure une TB active (recherches bactériologiques)

Ne sont pas validés chez le jeune enfant (< 5 ans)

Ont une sensibilité diminuée chez la personne âgée

Données insuffisantes pour suivre l’efficacité d’un traitement pour TB active ou latente

Ont une sensibilité diminuée chez les immunodéprimés

ETAT DES LIEUX DE LA PRESCRIPTION

DU TEST QUANTIFERON

AUX HOSPICES CIVILS DE LYON

EVOLUTION DES PRESCRIPTIONS DU TEST QUANTIFERON TB GOLD IT DEPUIS 2008

1610

2265

3245

5344

134 189 270 445

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

2008 2009 2010 2011

Nom

bre

de te

sts

réal

isés

Total

Moyenne/mois

REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR HOPITAL

EN 2010

AUTRES1%

A. CHARIAL0%

HFME1%

PIERRE GARRAUD0%

(PNEUMO-CARDIOLOGIQUE

3%

NEUROLOGIQUE1%

HENRI GABRIELLE1%

CHARPENNES0%

LYON SUD37% HOTEL DIEU

16%

CROIX ROUSSE14%

EDOUARD HERRIOT

24%

LE VINATIER2%

REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR SERVICE AUX HCL

EN 2010

Néphrologie1%

Cardiologie1%

Gyneco Obstétrique1%

Neurologie1%

Pédiatrie1% Hématologie

1%

Autres4%

Ophtalmologie4%

Pneumologie4%

Maladies Infectieuses

11%

Rhumatologie14%

Allergologie2%

Hépato-Gastro-Entérologie

3%

Dermatologie5%

Médecine travail21%

Médecine Interne15%

Médecine statutaire

12%

REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (1)

16,6

75,5

4,35,6

9,84

93,61

4,142,42

7,7

88,13

4,15

0%

20%

40%

60%

80%

100%

2749 579 337

Total Médecine travail Médecine statutaire

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (2)

11,9

90,4

2,914,76

17,73

73,76

5,672,84

16,9

66,3

7,89

13,3

81,7

5

0%

20%

40%

60%

80%

100%

378 141 89 60

Rhumatologie Dermatologie Hépato-Gastro-Entérologie

Allergologie

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (3)

14,99

67,57

5,89

11,55

33,9

53,1

3,79,2

32,17

49,56

9,56

8,7

14,42

82,7

2,88

0%

20%

40%

60%

80%

100%

407 292 115 104

MédecineInterne

MaladiesInfectieuses

Pneumologie Ophtalmologie

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (4)

36,7

40

6,7

16,6

25

64,3

10,7

24

60

16

27,3

72,7

30

50

10

10

18,75

75

6,25

28,3

61,3

2,87,6

0%

20%

40%

60%

80%

100%

30 28 25 22 20 16 106

Néphrologie Cardiologie GynecoObstétrique

Neurologie Pédiatrie Hématologie Autres

POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE

LE TEST ELISPOT DANS L’EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS

EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV

Introduction (1)

HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS

Diagnostic : démonstration de la présence de lymphocytes T spécifiques dans la peau et le sang

• Tests in vivo cutanés : patch test et IDR à lecture retardée

• Tests biologiques in vitro :détection des LyT spécifiques du médicament

Introduction (2)

TESTS BIOLOGIQUES UTILISEES DANS L’HSR AUX MEDICAMENTS

- Test de transformation lymphocytaire (TTL) : test de référenceSuivi de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine tritiée

- Test d’activation lymphocytaire en cytométrie

- Test ELISPOT (Enzyme-Linked-ImmunoSPOT assay)Dosage de la sécrétion de cytokines après activation des LyT spécifiques de ces médicaments

Tests Biologiques in vitro (1)

TEST DE TRANSFORMATION LYMPHOCYTAIRE

Index de stimulation (SI) = cpm avec l’antigène / cpm sans l’antigène

Avantages : Mesure de la prolifération cellulaire

Bonne spécificité 95%

Inconvénients : sensibilité 60-70% (β-lactames)

radioactivité

5 jours de culture

PBMCMilieu de cultureMédicaments à tester

PBMC

Culture Témoin positif

Témoin négatif

Sang héparinéFicoll

Ajout Thymidine tritiée5 j

Mesure de l’incorporation de thymidine

12 h

The Lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity.Pichler WJ et al, Allergy, 2004

Long-Lasting reactivity and high frequency of drug-specific T cells after severe systemic drug hypersensitivity reactions.Beeler A et al, J Allergy Clinical Immunol, 2006

Tests Biologiques in vitro (2)

TEST D’ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE EN CYTOMETRIE

Utilisation de marqueurs d’identification et/ou d’activation

Mise en évidence des marqueurs de cytotoxicité

CD69 up regulation on T cells as an in vitro marker for delayed-type drug hypersensitivityBeeler A et al, Allergy 2008

In vitro detection of cytotoxic T and NK cells in peripheral blood of patients with various drug-induced skin diseasesZawodniak A et al, Allergy, 2010

Tests Biologiques in vitro (3)

TEST ELISPOT - PRINCIPE -

Technique permettant la numération, même pour de très faibles fréquences, de cellules spécifiques, d’un haptène ou d’un peptide.

Ac capture spécifique de l’IFN-γ

Ajout des cellules (500000/pts) en présence ou absence d’un stimulus spécifique et incubation 15-20h

Activation des cellules et sécrétion d’IFN-γqui se lie aux Ac de capture

Elimination des cellules et ajout d’un Ac de détection biotinylé qui se lie à l’IFN-γ capturé

Ajout du conjugué streptavidin-enzyme

Ajout du substrat : précipité coloré insoluble

Formation d’un spot = cellule productrice d’IFN-γ

Détermination du nombre de spots/puits (106)

- contrôle négatif,

- positif (PHA et FRIS)

- antigène (3 dilutions du médicaments)

Tests Biologiques in vitro (3)

TEST ELISPOT - CONCLUSION -

Avantages :

Méthode rapide

Bonne sensibilité 91 %

Bonne spécificité 95 %

Quantification du nombre de cellules productrices d’une cytokine

Aide au diagnostic d’HSR

Discrimination des patients allergiques aux médicaments des patients non allergiques

Validation réalisée sur l’amoxicilline . Technique élargie aux autres médicaments.

Résultats en cours d’évaluation.

A. Rozieres et al. Allergy 2009:64:534-542

EXPLORATION DE L’HSR

- CONCLUSION -

Tests biologiques : mise en évidence de lymphocytes T spécifiques

Difficultés :

- Patients rares

- faible fréquence de lymphocytes spécifiques

- Tableaux cliniques variés

- Acheminements des prélèvements délicats

- Absence de gold standard pour définir la sensibilité et spécificité des tests

Interrogations (ELISPOT) :

- Délai entre réactions et tests

- durée de stimulation des cellules

- Présentation du médicament aux lymphocytes

- Molécules variées, formes pharmaceutiques, concentrations

- Reproductibilité