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ÁCIDO GIBERÉLICO (GAÁCIDO GIBERÉLICO (GA33) EN LAS FASES DE INDUCCIÓN, ) EN LAS FASES DE INDUCCIÓN, MULTIPLICACIÓN Y ENRAIZAMIENTO MULTIPLICACIÓN Y ENRAIZAMIENTO IN VITROIN VITRO A PARTIR DE A PARTIR DE

YEMAS APICALES DE YEMAS APICALES DE Valeriana scandensValeriana scandens

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITODEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

Previo a la obtención del título de:

INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

MARIA JOSE BASANTES MANTILLA

SANGOLQUÍ, NOVIEMBRE DE 2011

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 Valeriana scandens especies mas distintivas del género valeriana

extensivo uso en la elaboración de fitomedicinas

Ansiedad Insomnio

Tensión nerviosa (principalmente)

CONTROLCONTROL

INVIMAaprobadas 2

especies V. officinalis L. (origen europeo) V. scandens

abundantes en los Andes del Ecuador y Perú

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

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Tiempos memorables

Valerianarizoma

virtudes medicinales

ésteres de iridoides bicíclicos

valepotriatos (0,5-2 %)

reequilibradores generales del sistema nervioso

Páramo Andino

prácticas antropogénicas

afectado

QuemasSobrepastoreoIntroducción animales

deterioran la capa superficial del suelo

alto grado de vulnerabilidad ESPECIES

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Plantas

En la industria

Presentan características valiosas explotadas sin que

haya un control

VALERIANA

no cuenta con prácticas de cultivo programado

su distribución con los años ha llegado a ser

escasa

vital importancia Repoblarla Extraer sus metabolitos secundarios

Gran herramienta para la industria medicinal.

recuperarla

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Valeriana scandens: Características de la planta

Enredadera perenne

Muy ramificada, con presencia de entrenudos

Hojas: Opuestas y c/par en dirección perpendicular al par que sigue, compuestas de

folíolos

Flores: Pequeñas, numerosas, agrupadas en inflorescencias grandes, ramificadas, con

presencia de brácteas

Presentan dos tipos de flores, bisexuales y femeninas

Fruto: Aquenio oblongo-linear u oval, con segmentos largos y plumosos que representan

el cáliz desplegado

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PROPAGACION CLONAL

1 2 3

Preparación y selección de plantas donadoras

Establecimiento del cultivo aséptico Inducción de brotes

Multiplicación de brotes

4

Enraizamiento Aclimatación

5 6

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OBJETIVOSOBJETIVOS

Evaluar el efecto de ácido α naftalenacético (ANA), 6- bencilaminopurina (BAP) y ácido giberélico (GA3) en las fases de inducción, multiplicación y enraizamiento in vitro a partir de yemas apicales de Valeriana scandens

• Establecer un método de desinfección para las yemas apicales de Valeriana scandens a fin de controlar los agentes contaminantes.

• Evaluar la concentración de ANA y BAP adecuada para la inducción de brotes.

• Evaluar la concentración de ANA y BAP adecuada para la etapa de multiplicación.

•Evaluar el efecto de GA3 en el alargamiento de brotes previo al enaizamiento.

• Evaluar la concentración ideal de ANA para utilizarla como hormona de enraizamiento in vitro en los medios de cultivo M&S y B5

EspecíficosEspecíficos

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METODOLOGÍAMETODOLOGÍA

Tratamiento Concentración Cloro (%) Tiempo (min)

T1 0.5 3

T2 1 3

T3 1.5 3

T4 0.5 5

T5 1 5

T6 1.5 5

Contaminación.- ” 0” CONTAMINADO; “1” NO CONTAMINADO.

Necrosis.- “0” NECROSADO; “1” NO NECROSADO.

Muerte.- “0” MUERTO; “1” VIVO.

Fase de desinfección

Tratamientos aplicados para la desinfección de yemas apicales

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A

D E F

B C

Figura 1 (A) Yemas que van a ser sometidas a desinfección, (B) Lavado con detergente por 10 minutos (C) lavado con agua estéril por 5 minutos (D) Lavado con fungicida por 10 minutos (E) Inmersión en alcohol por 1 minuto (F)

Inmersión en hipoclorito de sodio por 5 minutos

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A B C

(A) Explante viable (B) Explante con contaminación fúngica (C) Explante con contaminación bacteriana

A B

Representación gráfica de las condiciones de necrosis y muerte del tejido (A) Explante muerto (B) Explante necrosado.

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Fase de inducción de brotes

Tratamiento BAP (mg L-1 ) ANA (mg L-1 )

Control 0 0

I1 1 0

I2 1 0.1

I3 1 0.5

I4 1 1

I5 2 0

I6 2 0.1

I7 2 0.5

I8 2 1

I9 3 0

I10 3 0.1

I11 3 0.5

I12 3 1

Aparecimiento de brotes.- “0” PRESENCIA; “1” AUSENCIA

Formación de callo.- Niveles 1 a 4

Tratamientos para inducción de brotes

Número de entrenudos.- Contabilizó el número de entrenudos que desarrolló c/ explante

Longitud de los brotes.- Longitud en centímetros que alcanzaron los nuevos brotes

BRA : 1mg L-1

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(A) Ausencia de callo (B) Poca formación de callo (C) Mediana formación de callo (D) Abundante formación de callo.

A B

C D

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Fase de multiplicación de brotes

Tratamiento BAP (mg L-1) ANA (mg L-1)

M1

M2

M3

M4

0

0,5

1

0,5

0

0,05

0,1

0,1

Número de entrenudos.- Contabilizó el número de entrenudos que desarrolló c/explante

Vigorosidad de los nuevos brotes.- Se estableció niveles del 1 al 4, siendo “1” un brote débil y “4” un brote vigoroso

Longitud de los brotes.- Se midió la longitud en centímetros

Tratamientos aplicados en la etapa de multiplicación

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Numero de entrenudos (A) Brote con 3 entrenudos (B) Brote con 4 entrenudos

Niveles que determina la vigorosidad de los nuevos brotes

Niveles Vigorosidad

1 Brote débil

2 Brote resistente

3 Brote firme

4 Brote vigoroso

A B

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A B

C D

Niveles de vigorosidad (A) Brote débil (B) Brote resistente (C) Brote firme (D) Brote vigoroso.

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Longitud de la planta tomada en centímetros

Subcultivos sucesivos

(A) Entrenudos obtenido después del primer subcultivo (B) y (C) Nuevos brotes generados en los subcultivos subsiguientes

A

B C

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Etapa de enraizamiento

Tratamiento GA3 (mg L-1 )

A1 1

A2 2

A3 3

Respuesta de crecimiento.- Se midió la longitud alcanzada por los brotes al cabo de dos semanas

Tratamientos para alargamiento de brotes

Elaboración de medios de cultivo con GA3

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Tratamiento Medio de cultivo ANA (mg L-1) Estado

R1 MS 0.1 Sólido

R2 MS 0.5 Sólido

R3 MS 1 Sólido

R4 MS 1.5 Sólido

R5 B5 0.1 Sólido

R6 B5 0.5 Sólido

R7 B5 1 Sólido

R8 B5 1.5 Sólido

Tratamientos para el establecimiento de la etapa de enraizamiento

Nivel de enraizamiento.- Longitud de raíz desarrollada mediante niveles del 0 al 4

Tiempo de enraizamiento.- Tiempo que tarda en aparecer la primera raicilla en el explante.

Variación de longitud de los brotes.- Longitud alcanzada por la plántula

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Niveles de enraizamiento (A) Sin raíz (B) Raíz desarrollada al 25% (C) Raíz desarrollada al 50% (D) Raíz desarrollada al 75% (D) Raíz desarrollada al

100%.

A B

C D

E

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RESULTADOSRESULTADOS

Fase de desinfección

Gráfico de las variables contaminación, necrosis y muerte con respecto a la interacción [NaClO] y Tiempo de inmerisón

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Gráfico de presencia/ausencia de brotes encontrados al usar la interacción ANA y BAP en el medio de cultivo

P / A de brotes vs interacción [BAP] * [ANA]P / A de brotes vs interacción [BAP] * [ANA]

Fase de inducción de brotes

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Longitud de los brotes vs [BAP] y [ANA]Longitud de los brotes vs [BAP] y [ANA]

Gráfico de longitud de los brotes con respecto a la interacción de las hormonas ANA y BAP

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Se rechaza la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos

Existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP y ANA

Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para la longitud de brotes con respecto a la interacción de las hormonas ANA y BAP

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Número de entrenudos vs [BAP] y [ANA]Número de entrenudos vs [BAP] y [ANA]

Gráfico del número de entrenudos con respecto a la interacción de hormonas ANA y BAP

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Rechazo de la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos

Existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP y ANA

Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para la variable número de entrenudos con respecto a la interacción hormonal ANA y BAP.

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1º SUBCULTIVO

Fase de multiplicación de brotes

P / A de brotes vs [BAP] y [ANA]P / A de brotes vs [BAP] y [ANA]2º SUBCULTIVO3º SUBCULTIVO

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Número de entrenudos vs [BAP] y [ANA]Número de entrenudos vs [BAP] y [ANA]

Gráfico del número de entrenudos con respecto a la interacción hormonal de ANA y BAP

1º SUBCULTIVO2º SUBCULTIVO3º SUBCULTIVO

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se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos.

existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP Y ANA

Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para variable número de entrenudos con respecto a la interacción hormonal.

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Longitud de los brotes vs [BAP] y [ANA]Longitud de los brotes vs [BAP] y [ANA]

Gráfico de la longitud de brotes con respecto a la interacción hormonal de ANA y BAP

1º SUBCULTIVO2º SUBCULTIVO3º SUBCULTIVO

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se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos

existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP y ANA

Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para la variable longitud de brotes con respecto a la interacción hormonal de ANA y BAP.

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Alargamiento de brotes usando ácido giberélico (GA3)Alargamiento de brotes usando ácido giberélico (GA3)

1, 2 y 3 mgL-1 respuesta de crecimiento

Esta fitohormona no tuvo ningún efecto sobre los brotes,

es decir que no existe un efecto significativo.

Esta fitohormona no tuvo ningún efecto sobre los brotes,

es decir que no existe un efecto significativo.

Fase de enraizamiento

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Enraizamiento en medio Murashige y Skoog (M&S)

Longitud de los brotes vs [ANA]Longitud de los brotes vs [ANA]

Gráfico de longitud de brotes con respecto a la concentración de ANA en medio M&S

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Nivel de enraizamiento vs [ANA]Nivel de enraizamiento vs [ANA]

Gráfico del nivel de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA en el medio M&S.

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Tiempo de enraizamiento vs [ANA]Tiempo de enraizamiento vs [ANA]

Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA aplicada en el medio M&S.

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Enraizamiento en medio de cultivo B5

Longitud de los brotes vs [ANA]Longitud de los brotes vs [ANA]

Gráfico de longitud de brotes con respecto a la concentración de ANA en medio B5.

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Nivel de enraizamiento vs [ANA]Nivel de enraizamiento vs [ANA]

Gráfico del nivel de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA en el medio B5.

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Tiempo de enraizamiento vs [ANA]Tiempo de enraizamiento vs [ANA]

Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA aplicada en el medio B5.

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Enraizamiento con carbón activado

Longitud de los brotes vs [ANA]Longitud de los brotes vs [ANA]

Gráfica de la longitud de brotes con respecto al uso de carbón activado en el medio de cultivo M&S

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Nivel de enraizamiento vs [ANA]Nivel de enraizamiento vs [ANA]

Gráfica del nivel de enraizamiento con respecto al uso de carbón activado en el medio de cultivo M&S

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Tiempo de enraizamiento vs [ANA]Tiempo de enraizamiento vs [ANA]

Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto al uso de carbón activado en el medio de cultivo M&S

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Enraizamiento en medio líquido

Longitud de los brotes vs [ANA]Longitud de los brotes vs [ANA]

Gráfica de la longitud de brotes con respecto al uso de medio M&S líquido.

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Gráfica del nivel de enraizamiento con respecto al uso de medio M&S líquido.

Nivel de enraizamiento vs [ANA]Nivel de enraizamiento vs [ANA]

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Tiempo de enraizamiento vs [ANA]Tiempo de enraizamiento vs [ANA]

Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto al uso de medio M&S líquido.

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CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1.5% de hipoclorito de sodio por un tiempo de 5 minutos de inmersión permite obtener explantes libres de contaminación.

El medio de cultivo sin suplemento hormonal, presentó la mayor cantidad de brotes largos y la producción de un mayor número de entrenudos

La adición de brasinolida permitió un mejor desarrollo de los explantes, tanto en esa etapa como en las posteriores por la acción residual

El GA3 aplicado en la etapa previa al enraizamiento, no produjeron ningún efecto sobre el alargamiento de brotes.

Baja concentración de auxina o en su defecto, la no adición de la misma, si existe endógenamente, es suficiente para la generación de raíces.

El medio de cultivo B5 no es eficiente para la rizogénesis, debido a la reducción de la concentración de nitratos en su composición. 

El uso de carbón activado provee de un ambiente de oscuridad al medio de cultivo, aumentando en gran manera la rizogénesis

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RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES

Utilizar plantas jóvenes para iniciar con los procesos in vitro ya que estos tienen una mayor capacidad de regeneración

 Probar la utilización de otro componente para el alargamiento de tallos en la etapa previa al enraizamiento como la zeatina o el 2-iP.

 Utilizar una auxina débil como el AIA o en su defecto una combinación de auxinas (IBA y ANA) en las etapas para ver su respuesta in vitro.

 Evaluar el comportamiento de los explantes después del tercer subcultivo y de ser necesario añadir suplemento hormonal al medio de cultivo, de manera que se mantenga su capacidad de regeneración.

Realizar análisis de modelos de regresión logístico binomial y multinomial, según corresponda, para los datos obtenidos.

Continuar con la investigación, analizando más especies de esta familia, ya que este trabajo constituye una premisa para posteriormente crear bancos de germoplasma, estudios de genética poblacional etc.

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