Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus

subtilis

26 a 30 de Julho

Responsável: Ana

Melo

Monitores: Pedro

Sousa

Filipe

Santos

Participantes:

Carolina Camelo

Inês Santos

Magda Paiva

Sara Silva

2010

Cadeia respiratória de B. subtilis

Δ qoxB (1x)

H2O Milipore

Ferver 5 min.

1 min. a 12000 RPM

Lise celularDesnaturação DNAses

PCR de Colónias

DNA

H2O estéril

Tampão

dNTP

Primer Fw

Primer Rev

Taq Polimerase

Gel de agarose

qoxB(100 bp)

Wt (2x)

ΔqoxA (1x)

qoxA(100 bp)

Marcador gap (>100 bp)

Amplificação do gene codificante da subunidade A da citocromo c oxidase (qoxA) de B. subtilis.

WT

Colónia

Ligação do gene ao vector plasmídico (pSKEcoRV)

GTGATCCTCTTGTTCAGAGCATTTAAACCACTGATTATGCTGACTCTGCTTTCCTCCGTTTTTTTATTGGGCGGCTGCAGTCAAATCGCGGTATTGGAT

Ligação

H2O estéril

Tampão da ligase

pSKEcoRV (desfosforilado)

Produto de PCR (qoxA ou qoxB)

T4 DNA ligase22ºC

qoxA

Transformação do produto da ligação nas células de E. coli.

Produto da ligação:

pSK_qoxA

37ºC

Transformação

Ecoli XL1Blue

Incubar overnight

Colónias de bactérias com plasmídeo sem produto de ligação

Colónias de bactérias com plasmídeo com produto de ligação

NDH-2

SDH

Q

caa3

bd

aa3

bc1

cytc

Grupo prostético

Comprimento de onda

Hemo a 441

Hemo a 601

Hemo b 429

Hemo b 550

Hemo c 560

Hemo d 631

Podemos concluir que as oxidases terminais caa3 e bd da cadeia respiratória de B. subtilis estão presentes neste crescimento.

Cadeia respiratória de B. subtilis

Espectros de UV/Visível de B. subtilis

Actividade NADH:K3[Fe(CN)6] oxidorredutase= 110 nmol NADH min-1 mg-1

Actividade succinato:DCPIP oxidorredutase = 151,7 nmol DCPIP min-1 mg-1

Actividade succinato:oxigénio oxidoredutase

Após succinato 14,32 nmol min-1 mg-1

Após KCN 10,58 nmol min-1 mg-1

% (inibição) 26,12

Actividade NADH:oxigénio oxidoredutase

Após NADH 28,9 nmol min-1 mg-1

Após KCN 15,7 nmol min-1 mg-1

% (inibição) 45,7

Actividades enzimáticas

Supercomplexos identificados:

-(SDH)3

- NDH-2:(SDH)3

Massa Molecular dos complexos isolados

NDH-2 45 kDacaa3 145 kDaaa3 147 kDabc1 73 kDa

SDH 116 kDabd 218 kDa ou 90 kDa

BN-PAGE

Banda 7Bandas 2 e 6

Nota: É necessário confirmar os resultados

obtidos por Espectrometria de Massa