Estudo da diversidade comEstudo da diversidade com sequências de DNAq

estudo do DNA por sequenciação

extracção de DNAextracção de DNA

PCR do fragmento desejado

sequenciação

estudo do DNA por sequenciação

sequenciação

1 2 3

indivíduo A

1 3

indivíduo A

indivíduo B

indivíduo C

Alguns índices de diversidade:Alguns índices de diversidade:

π (diversidade nucleotídica):Número médio de diferenças (por site) entre duas sequências retiradas ao acasoNúmero médio de diferenças (por site) entre duas sequências retiradas ao acasode uma amostra.

H (diversidade haplotípica):Probabilidade de, retirando aleatoriamente dois haplótipos de uma amostra, estesserem diferentes

S (número de sítios variáveis)S (número de sítios variáveis)

θ (population mutation parameter)Nível esperado de variabilidade assumindo equilíbrio entre mutação e deriva eausência de selecção. Estabelece uma relação entre o efectivo populacional e ataxa de mutação.

θ = 4Neμ autossomasθ 4Neμ autossomasθ = 3Neμ cromossoma Xθ = Neμ cromossoma Y, mitocondrial

E d ó i d l l i dif i dEm vez de uma só maneira de o calcular, existem diferentes estimadores que aproximam este valor (exemplo: θ de Watterson (1975)). Usa-se este valor para estimar o Ne.

PROGRAMAS QUE CALCULAM PARÂMETROS DE DIVERSIDADE

DNAsp

Arlequin

SITESSITES

‐ A diversidade diminui nas populações mais a norte.

0.8

Hd

0.6

0.7

0.4

0.5

Hd

0.2

0.3

0

0.1

0 2 4 6 8 10 12 14

Construção de redes deConstrução de redes de haplótiposp p

3 52 41

A

3 52 41

3 5A B

3 5

3 52 41

C

3 52

A B3 5

3 52 41

C

3 52

A B

D

3 5

1D

E4

3 52 41

C

3 52

4

A B

D

3 5

1D

E4

3 52 41

C

3 52

4

1

A B

D

F3 5

12 D

E4

3 52 41

C

3 52

4

1

A

D

F B, G3 5

12 D

E4

3 52 41

C, H

3 52

4

1

A

D

F B, G3 5

12 D

Softwares que fazem redes de haplótipos:Softwares que fazem redes de haplótipos:

-Networket o-TCS-(Arlequin)…

( ét d dif t )(usam métodos diferentes)

h25

h24h19

h20h21

h26

h16h28

h24

h23

N t

h30

h22

h14h11 h29

h18

h17

h27

h15

NorteSul

h30

h4h1

h9h13

h10

h14h11 h29h17

h8

10

9

BU

Rede de haplótipos

h3

h7 h2

h4h12

h5

haplótipos

(700bp )h1h6Distribuição geográfica

dos grupos

Pi

0 008

0.009

0.01

0.006

0.007

0.008

B

0.003

0.004

0.005Pi

Buçaco

0

0.001

0.002

0 2 4 6 8 10 12 14

Subestruturação ao nível de çsequências do DNA

Distância entre populaçõesDistância entre populações

Dxy: distância média entre elementos dos         dois grupos.

Da: distância média entre elementos dos         dois grupos, corrigida para a distância observada dentro de cada grupo.

Grupo 1 Grupo 2

ResultadosResultados

Dxy = 1,268%Da =0,996%Nº de posições fixas 6Nº de posições fixas = 6

Etc. etc.  

RecapitulandoRecapitulando…

‐ Calculámos diferentes índices de diversidade para populações de C. lusitanica

‐ Verificámos que, tal como nos marcadores nucleares, a diversidade diminui nas populações mais a norte.

0 8

Hd

0.5

0.6

0.7

0.8

0.1

0.2

0.3

0.4Hd

0

0 2 4 6 8 10 12 14

‐ Verificámos que existem dois grandes grupos de‐ Verificámos que existem dois grandes grupos de haplótipos que ocupam áreas geográficas diferentes.

h25

h24h19

h20h21

h26

h16h28

h23

Norte

h30

h22

h14h11 h29

h18

h17

h27

h15

9

NorteSul

h3 h4h1

h9h13

h10h8

10

9

BU

Rede de haplótipos

h3

h7 h2

2

h5

ã áhaplótipos

(700bp )h1h6Distribuição geográfica

dos grupos

0 01

Pi

0.007

0.008

0.009

0.01

B

0.003

0.004

0.005

0.006

Pi

Buçaco

0

0.001

0.002

0 2 4 6 8 10 12 14

‐ Iniciámos ainda a análise de subestruturação‐ Iniciámos ainda a análise de subestruturação calculando a distância genética entre os grupos.

Subestruturação ao nível de çsequências do DNA

Diferenciação entre populações

Pop 1

As estatísticas F (Fst, Fit, Fis) foram desenvolvidas a pensar em dados alélicos (como proteínas), mas podemos fazer um paralelo com sequências de DNA.

Existem diversas medidas análogas ao Fst para sequências de DNA. Algumas incorporam informação

Pop 2

sobre o número de mutações (distância) entre alelos (ex. Fst de Hudson et al. (1992)), outras contemplam apenas frequências (como as medidas “clássicas”).

Pop 2

No fundo, o que estes valores nos medem é a proporção de variação que está entre as unidades que consideramos (ex populações) por oposição à proporção que está(ex. populações) por oposição à proporção que está dentro dessas unidades.

O DNAsp e o Arlequin calculam nos estes valores de FstO DNAsp e o Arlequin calculam-nos estes valores de Fst (mas para isto temos primeiro de definir populações).

Diferenciação entre populações

E se quisermos pensar a mais do que um nível?

Qual a % de variação explicada por diferenças:

q p q

Pop 1 Pop 3 diferenças:

entre grupos?entre populações dentro de cada grupo?

Grupo 2Grupo 1AMOVA – analysis of molecular variance (E coffier et al 1992)

entre populações dentro de cada grupo?dentro das populações?

Pop 2 Pop 4

Grupo 2Grupo 1 (Excoffier et al. 1992)

Pode ser feita não só para sequências de DNA mas também para outros dadosDNA mas também para outros dados (proteínas, microssatélites, etc.).

Software ArlequinSoftware Arlequin

Diferenciação entre populações

E se quisermos pensar a mais do que um nível?

Qual a % de variação explicada por diferenças:

q p q

Pop 1 Pop 3 diferenças:

entre grupos?entre populações dentro de cada grupo?

Grupo 1 AMOVA – analysis of molecular variance (E coffier et al 1992)

entre populações dentro de cada grupo?dentro das populações?

Pop 2 Pop 4

(Excoffier et al. 1992)

Pode ser feita não só para sequências de DNA mas também para outros dados

Grupo 2

DNA mas também para outros dados (proteínas, microssatélites, etc.).

Software ArlequinGrupo 2 Software Arlequin

Diferenciação entre populações

Output do Arlequin:

-% de variação em cada nível hierárquico

- índices de fixação

í i d i ifi â i- níveis de significância determinados por permutações

ResultadosResultados

AMOVA norte vs. sul(ignorando a população do Buçaco):

‐ % variação entre grupos: 77,91%‐ % variação entre pops dentro dos grupos: 12,07%‐% variação dentro das pops: 10,02%

(todos os valores estimados para os índices)de fixação são significativos)