Estudo comparativo dos efeitos do 17-β-estradiol, do ...ão de... · Tripsinização ..... 35 5.2.
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UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Cincias da Sade
Estudo comparativo dos efeitos do 17--estradiol,
do extracto de soja e dos fitoestrognios que o
integram em culturas de clulas humanas
Ana Lusa Baptista Arquilino
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em
Cincias Farmacuticas (Ciclo de estudos integrado)
Orientador: Professora Doutora Luza Augusta Tereza Gil Breitenfeld Granadeiro
Covilh, Outubro de 2011
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Folha em branco
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Agradecimentos
Durante os ltimos meses, vrias foram as pessoas que me apoiaram na realizao desta
dissertao de mestrado, e s quais no posso deixar de agradecer:
Em primeiro lugar, Professora Doutora Luza Granadeiro, minha orientadora, pelo apoio
que me proporcionou. O meu muito obrigado pela sua disponibilidade e partilha de
conhecimentos;
Ao Professor Doutor Miguel Freitas, pelo apoio, acompanhamento e dedicao;
Ao Professor Doutor Samuel Silvestre e Dra. Cristina Ramalhinho. A ajuda e companhia no
laboratrio so sempre bem recebidas;
s colegas de laboratrio, Ana Rebelo, Ana Dias, Eduarda, Joana Marques, Mrcio e Vernica.
O tempo convosco passou rapidamente, e as tarefas a realizar foram sempre mais fceis;
Aos meus pais, avs e minha irm Margarida por todo o amor, confiana e apoio
incondicional. O incentivo para melhorar a cada dia que passa, e a nunca desistir dos meus
sonhos e objectivos, ser um lema que ficar guardado para toda a vida;
Ao Joo, por todo o apoio, amizade, carinho, dedicao e disponibilidade, bem como todas as
longas conversas e desabafos, que muito me ajudaram, principalmente nas horas menos boas;
Agradeo Sofia e aos pais do Joo por todo o apoio e amizade;
No poderei deixar de me referir, por fim, a todos os meus amigos e colegas, que nos ltimos
meses me auxiliaram, e com quem convivi.
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Folha em branco
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Resumo
A soja tem vindo a adquirir uma posio de destaque no mercado ocidental, ao longo dos
ltimos anos, com o aumento da procura por este produto vegetal. Os fitoestrognios so
importantes constituintes da soja que se ligam a receptores de estrognio (ER), podendo
exercer alguns efeitos benficos no Homem. A aco anticarcinognica, a diminuio de
alguns sintomas associados menopausa, e a preveno da osteoporose e das doenas
cardiovasculares so alguns dos resultados positivos j evidenciados. Os fitoestrognios mais
estudados so as isoflavonas, onde se insere a genistena e a daidzena.
Os estudos realizados pretenderam estudar qual o efeito de diferentes concentraes dos
compostos estrognicos (extracto de soja, genistena, daidzena e 17--estradiol) em
fibroblastos saudveis da derme humana- NHDF e clulas epiteliais com carcinoma
mamrio-MCF7. Para alcanar este objectivo, optimizou-se o modelo de estudo,
determinaram-se os efeitos na viabilidade celular aps incubao e recuperao (ensaio de
MTT), e estudou-se a capacidade de induzir a apoptose (ensaios de citometria de fluxo).
Dos vrios protocolos testados na optimizao do modelo de estudo, foi escolhido o protocolo
que se baseou na aplicao de meio de cultura completo, e que usou tempos de incubao e
recuperao de 48 horas. Observou-se uma variao na viabilidade celular dependente da
concentrao aplicada, tendo as concentraes mais elevadas demonstrado uma diminuio
estatisticamente significativa da mesma, para as linhas celulares NHDF e MCF7. Registou-se
uma recuperao nas 2 linhas celulares, que foi superior nas MCF7. Os ensaios de citometria
de fluxo indicaram que os compostos estudados poderiam exercer uma aco protectora sobre
as clulas, no entanto, o nmero de ensaios realizados no foi suficiente para podermos tirar
concluses. Por fim, foram comparadas diluies semelhantes de 1 cpsula de extracto de
soja e de um comprimido de 17--estradiol, aconselhados na terapia hormonal de
substituio. Concluiu-se que a recomendao da administrao do extracto de soja deve ser
cuidadosamente avaliada, pois pode aumentar a proliferao celular em tecidos
cancergenos.
Palavras-chave
Extracto de soja, 17--estradiol, daidzena, genistena, NHDF, MCF7, Terapia Hormonal de
Substituio
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Folha em branco
vii
Abstract
Over the past years, soy has gained a prominent position in the Western market, with the
increasing demand and supply for this plant. Phytoestrogens are important constituents of
soy. They bind to estrogen receptors (ER) and they are able to modify some physiological
processes, with benefits for humans. The anticarcinogenic action, the reduction of some
symptoms associated with menopause, and prevention of osteoporosis and cardiovascular
diseases are some of the positive outcomes. The most studied phytoestrogens are isoflavones,
which include genistein and daidzein.
The studies conducted sought to investigate the effect of different concentrations of
estrogenic compounds (a soy extract, genistein, daidzein and 17--estradiol) in human dermal
fibroblasts from healthy subjects NHDF and epithelial breast carcinoma cells MCF7. To
achieve the objectives, it was necessary to optimize the model of study, to determine de
effects on cells viability: after incubation and after recovery (MTT assay), and to study the
capacity of the induction of apoptosis (flow cytometry assays).
We tested different protocols, in the process of optimization of the model of study. The
chosen protocol was based on the application of complete culture medium, and incubation
and cells recoverys time was 48 hours. We checked a variation in cells viability, that was
concentration-dependent; the results for the highest concentration applied showed a
statistically significant decrease in cells viability for the MCF7 and NHDF cell lines. Both cell
lines recovered, but MCF-7 cells recovered more. The flow cytometry assays indicated that
the compounds studied may exert a protective action on cells, however, the number of tests
developed in our studies was not enough to draw conclusions. Finally, we compared a soybean
extract (capsules) and 17--estradiol (tablets), used on hormone replacement therapy. We
concluded that the recommendations about administering supplements or medicines based on
soybean extracts must be carefully evaluated, as it may increase cell proliferation in cancer
tissues.
Keywords
Soy extract, 17--estradiol, daidzein, genistein, NHDF, MCF7, Hormonal Replacement Therapy
viii
Folha em branco
ix
ndice
Introduo ........................................................................................ 1
1. O consumo de produtos naturais base de plantas ................................. 1
2. Soja (Glycine max) ........................................................................ 3
2.1. Caracterizao da soja ............................................................. 3
2.2. Diferenas no tratamento da soja ................................................ 4
2.3. Principais constituintes da semente de soja .................................... 4
2.3.1. Macronutrientes ................................................................. 4
2.3.2. Micronutrientes ................................................................. 5
2.4. Efeitos da soja e suas aplicaes ................................................. 6
3. Fitoestrognios ............................................................................. 9
3.1. Os fitoestrognios como constituintes da semente de soja .................. 9
3.2. Isoflavonas da soja ................................................................. 11
3.2.1. Genistena ....................................................................... 11
3.2.2. Daidzena ........................................................................ 13
3.3. Metabolismo das isoflavonas ...................................................... 13
3.4. Outros mecanismos de aco dos fitoestrognios............................. 16
4. Estrognios................................................................................. 17
4.1. Recursos endgenos de estrognios ............................................. 17
4.2. Sntese de estrognios ............................................................. 18
4.3. Transporte e Metabolismo dos estrognios .................................... 20
4.4. Receptores de estrognios ........................................................ 21
4.5. Mecanismo de aco dos estrognios ........................................... 22
4.5.1. Mecanismos de aco genmica ............................................. 22
4.5.2. Mecanismos de aco no genmica ou extranuclear ................... 23
5. Cultura de clulas: Modelo experimental para o estudo de compostos
estrognicos .................................................................................. 25
Objectivos ...................................................................................... 27
x
Material e Metodologia .......................................................................29
1. Material .................................................................................... 29
1.1