ESTUDIO EN MODELOS IN VITRO Y EX VIVO DE LOS EFECTOS ... · PDF file estudio en modelos in...

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  • ESTUDIO EN MODELOS IN VITRO Y EX VIVO DE LOS EFECTOS INMUNOMODULADORES DEL

    (1-3)-β-D-GLUCANO SUSTITUIDO EN POSICIÓN O-2 PRODUCIDO POR BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

    TESIS DOCTORAL

    Sara Notararigo Madrid, 2015

  • UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

    ESTUDIO EN MODELOS IN VITRO Y EX VIVO DE LOS EFECTOS INMUNOMODULADORES DEL

    (1-3)-β-D-GLUCANO SUSTITUIDO EN POSICIÓN O-2 PRODUCIDO POR BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

    Sara Notararigo

    Memoria para optar al Grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid

    DIRECTORA Dra. Paloma López García

    Madrid, 2015

  • La Dra. Paloma López García, del Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas,

    CERTIFICA:

    Que la presente Memoria titulada: “Estudio en modelos in vitro y ex vivo de los

    efectos inmunomoduladores del (1-3)-β-D-glucano sustituido en posición O-2

    producido por bacterias acido lácticas” ha sido realizada por la Doctoranda Dña. Sara

    Notararigo, bajo su dirección en el Laboratorio de Biología molecular de las bacterias

    gram positivas, y autoriza su presentación para que sea calificada como Tesis

    Doctoral dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa.

    En Madrid, a 21 de mayo de 2015

    Fdo.: Dra. Paloma López García

  • La realización de este trabajo ha sido posible gracias al disfrute de una ayuda para el

    desarrollo de tesis doctorales en el marco del programa “Junta para la Ampliación de

    Estudios” de la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Científicas,

    subprograma JAE-Predoc (referencia: JAEPre013, convocatoria del año 2009).

    Este trabajo también fue financiado con la subvención concedida por el Ministerio

    de Economía y Competitividad para la realización del Proyecto del Plan Nacional:

    “Identificación de polisacáridos prebióticos y bacterias probióticas con capacidad

    inmunomoduladora para su uso en nuevos alimentos funcionales” (referencia:

    AGL2012-40084-C03-01).

  • Alla mia Isola e al profumo di gelsomino, per ritornare sempre dove tutto è cominciato…

  • Ringraziamenti Questo lavoro no si sarebbe potuto portare a termine senza il prezioso aituo ricevuto dai gruppi collaboratori del CIB, che hanno partecipato nella fase sperimentale, di argomenti specifici e nell’interpretazione dei dati così ottenuti, ma soprattutto nel supporto che ho ricevuto.

    Una parte importante di questa tesi si è svolta a Barcellona, una cittá che avevo conosciuto molto tempo prima. L’incontro con l’equip del Vall d’Hebron non solo è stato importante dal punto di vista scientifico, ma anche dal punto di vista umano. Sono entusiasta della mia esperienza, che come sempre, mi ha arricchito da infiniti punti di vista

    Probabilmente chi leggerà queste parole dovrà fare uno sforzo enorme per capire, e magari comprenderà che fatica immane ci è voluta per scrivere tutto quello che viene di seguito. Forse anche per stanchezza mentale, preferisco esprimere la mia gratitudine nella lingua che mi permette farlo con più serenità.

    Mi è stato detto che sono stata un regalo, per me è stata una sfida, e posso dire che anche questa volta ce l’ho fatta. Ho ricevuto molta libertà, un’arma a doppio taglio, ma che si è rivelata una vera e propria ispirazione, un impeto che mi ricorda Alph the river.

    Adesso vorrei ricordate tutte le persone che ho incontrato durante questa esperienza madrileña, e che hanno lasciato un segno. Per scelta, preferisco farlo in modo discreto, poiché sono convinta che non sia necessario mettere in evidenza i nomi, bensì i fatti, le sensazioni e i vissuti che abbiamo condiviso.

    Ho conosciuto molte persone in questi lunghi anni molte di loro se ne sono già andate ed è stato penoso che abbandonassero questa città che per me ha rappresentato un perfetto surrogato di casa mia. A queste persone dedico una parte importante in questo relato, perché mi hanno aiutato a sopportare i momenti difficili e con le quali ho passato molti attimi davvero unici!

    Ricordo chi in sordina, ha fatto più di quanto mi aspettassi e che mi ha voluto bene e mi ha dato sempre un motivo per andare avanti e lottare contro le avversità della vita e della scienza. Queste persone rimarranno per sempre nel mio cuore.

    La vita di laboratorio è stata complessivamente positiva e mi sono sempre circondata di persone che hanno creduto in me. Anche a loro va un grande grazie, specialmente per avere condiviso con me scienza e conoscenza, è sempre bello condividere il sapere, e non tenerselo per se.

    Ci sono anche quelle persone che pur lavorando insieme non si occupavano direttamente di alambicchi: i momenti più ilari li ho trascorsi proprio con loro. Attimi di veracità, fra un te, un caffè, immersi in un mondo pieno di scaffali colmi di tanto sapere che nemmeno una mente puó contenere, ma dove filosofare è ancora possibile.

    Il supporto l’ho ricevuto anche da una persona che non appartiene direttamente a questo intorno stretto. Ore e ore di duro lavoro, di litigi sul significato oscuro delle parole spagnole che assomigliano a quelle italiane, di crisi esistenziali, ora mi viene un po’ da ridere ma ho proprio desiderato scomparire, fuggire lontano, magari un isola, quella del sabato sera, o magari in un altro continente, uno nuovo e tutto da scoprire.

    Ai lontani che mi hanno ascoltato, voglio dire che anche questa volta è finita e anche se non so disegnare: QUESTO L’HO FATTO IO.

    Stretta la foglia, larga la via dite la vostra, che ho detto la mia.

  • ÍNDICE

  • RESUMEN ........................................................................................................................ I

    SUMMARY ..................................................................................................................... V

    ABREVIATURAS ............................................................................................................. IX

    INTRODUCCIÓN GENERAL

    1. Las bacterias ácido lácticas ................................................................................ 1

    1.1 Clasificación...................................................................................................... 2

    1.2 Metabolitos ...................................................................................................... 3

    2. Los exopolisacáridos microbianos ..................................................................... 4

    2.1 Clasificación de los exopolisacáridos ............................................................... 5

    2.2 Biosíntesis de los EPS de las BAL ...................................................................... 7

    2.3 Funciones y aplicaciones de los EPSs microbianos ........................................ 10

    3. Probióticos ....................................................................................................... 12

    4. Prebióticos, oligosacáridos y polisacáridos...................................................... 13

    4.1 Clasificación de los hidratos de carbono prebióticos .................................... 16

    5. Las BAL productoras de los (1-3)-β-D-glucanos sustituidos en posición O-2 .. 16

    6. El sistema inmune humano .............................................................................. 19

    6.1 La inmunidad innata ...................................................................................... 22

    6.2 La inmunidad adquirida ................................................................................. 24

    7. El sistema inmune intestinal ............................................................................ 25

    7.1 La tolerancia inmunitaria intestinal ............................................................... 27

    7.2 La regulación del sistema inmune por células epiteliales ............................. 29

    8. La inmunomodulación por los β-D-glucanos ................................................... 30

    8.1 Los receptores de los β-D-glucanos ............................................................... 33

    8.2 La transducción de señales específicas activadas por el reconocimiento de

    los β-D-glucanos ................................................................................................... 35

    OBJETIVOS .................................................................................................................... 39

  • CAPÍTULO 1

    Producción, aislamiento y purificación de (1-3)-β-D-glucanos

    sustituidos en posición O-2

    1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 41

    2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 42

    2.1 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento .......................................... 42

    2.2 Producción del EPS P por P. parvulus 2.6 ...................................................... 42

    2.3 Producción del EPS L por L. lactis NZ9000[pNGTF] ........................................ 43

    2.4 Aislamiento del EPS P a partir del sobrenadante del cultivo de P. parvulus

    2.6 .........................................................................